JP2006003149A

JP2006003149A - Ｓｐｒセンサーおよび屈折率測定方法

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Publication number: JP2006003149A
Application number: JP2004178110A
Authority: JP
Inventors: Gen Iwasaki; 弦岩崎; Osamu Niwa; 修丹羽; Akiyuki Tate; 彰之館
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2006-01-05
Anticipated expiration: 2024-06-16
Also published as: JP4156567B2

Abstract

【課題】ＳＰＲ現象を用いる、免疫、ＤＮＡファイブリダイゼーション、レセプター・リガンドの特異的結合反応用いるセンサー、およびＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング法による免疫測定において、高感度化を図るために、小型装置で複雑化することなく測定ノイズの低減を提供する。
【解決手段】表面プラズモン共鳴効果を有する金属薄膜の複数のドットを周期的に配置して形成したクラスターを透明基板に周期的に配置するとともに、前記クラスターの中心間距離である周期は前記ドットの中心間距離である最小周期より長周期であることを特徴とする。
【選択図】図７

Description

本発明は、医療診断や環境分析、菌・ウィルス検査、創薬スクリーニングを行うセンサーにおいて、抗原抗体反応を用いる抗原やホルモンを検出するセンサー、またはＤＮＡの配列を識別するセンサー、および酵素と基質の結合を利用し、対象分子の濃度を測定する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサー及びそのＳＰＲセンサーを使用した屈折率測定方法に関する。

（免疫測定法）
抗体の抗原分子認識機能を使った免疫測定法は、複雑な生体分子を分離操作することなく検出できるため臨床検査、環境汚染物質の測定、生化学分野での測定で広く使われている。比較的感度の低い測定では、簡便な測定法が開発され、例えば、個人で行なうことのできる妊娠検査などに使われている。

また、特に低濃度の抗原が測定できることから、高感度測定が必要なインシュリン、ＢＮＰ（ＢｒａｉｎＮｅｕｔｒｉｕｓＰｅｐｔｉｄｅ）、カテコールアミン、サイトカインなどの疾病マーカ、環境ホルモン、ウィルス・病原菌の測定に利用される。測定対象の分子に対する特異的抗体は安価に人工的に産生することができるので、多くの天然分子や、環境ホルモンなど生体に影響のある非天然分子を測定できる対象分子の広い測定法である。

抗体と抗原の結合が極めて特異的で結合定数も大きいことから、測定対象が低濃度である場合にも抗体は抗原に高い割合で結合し、より高い濃度で存在する夾雑分子の影響を受けにくい。このような特徴から、免疫測定法は液体クロマトグラフィーなどの分離操作を必要としない、特定の分子を高感度に測定する方法である。

（ラベル化誘起蛍光法）
抗原抗体反応を使って特定の分子を高感度に測定する場合には、蛍光分子で抗原分子を標識し、基板に固定化した抗体と反応させ、洗浄後、誘起蛍光法で抗体と結合した抗原分子を検出する方法が一般的である。このような特異的結合を利用する生体分子の測定法としては、抗原抗体反応のほかに、相補する配列を持つＤＮＡ、酵素と基質、レセプター分子とリガンド分子があり、結合する組み合わせも、１対１だけではなく多数の分子の複合体を形成する場合もあり、免疫測定法と同様に、蛍光分子によるラベル化と誘起蛍光法で測定されている。

高感度を測るためには、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ法）があるが、結合反応を検出する方法では、誘起蛍光法が一般的である。ラベル化試薬を用いる場合は、煩雑なラベル化操作が必要である（非特許文献１）。

（ＳＰＲ法）
そこで、ラベル化試薬を用いずに特異的反応を検出する方法が開発されている。この中で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使った屈折率の測定から特異的結合を検出する方法は実用化され、広く使われている（非特許文献２）。

ＳＰＲ法を利用する測定法では抗原または抗体を金薄膜に固定し、これと被測定分子が特異結合すると、金属薄膜表面の屈折率が大きくなるのを利用して検出する。ＳＰＲ法では、金や銀などの基板表面から数百ｎｍの範囲の屈折率変化を選択的に検出するので、金属薄膜表面に数百ｎｍ分子認識膜があると、その薄膜の屈折率を選択的に測定できる。また微小体積の測定でもバルク測定と同じ感度で測定できる利点がある。

（簡易測定）
ＳＰＲ法の光学系は、金薄膜を形成した高屈折率透明材料に単色光を照射し、全反射光を受光素子で測定する。光源からの強い全反射光を測定するので、安価な受光素子を用いることができる。単純な光学系で実現でき、光源には安価なＬＥＤを、検出にはＣＣＤカメラを使うことができる。このような特徴から、ＳＰＲ法は小型の測定器にも適している。

（ＳＰＲの感度）
ＳＰＲ法では、金などの薄膜からのＰ偏光反射光強度の入射角度依存性から屈折率を求める。反射光の入射角度依存性と屈折率の関係は、フレネルの多層膜反射率式から、一意に求められる。したがって、高感度化を測るためには、ノイズの少ない、Ｐ偏光反射光強度の入射角度依存性を測定する必要がある。

もっとも広く使われているクレッチェマン光学系と楔形の入射光束とＣＣＤのような２次元のイメージング素子を用いる装置系では、画像の強度データから反射率最小入射角度（ＳＰＲ角度）を求め、ＳＰＲ角度から屈折率を決定する。この場合、図８のように入射角度を表す軸と、反射面上で入射面に垂直な方向な線上の反射位置を表す軸が画素のＸ、Ｙ方向にならび、反射強度が画素の値になる画像が得られる。高感度測定のためには、反射率が最小になる入射角度をこの画像から高精度に求める必要がある。しかし、光源、ＣＣＤ、光学系のずれ、ごみによって生じるノイズがあるために、反射率が最小になる入射角度にもノイズが現れる。

低ノイズ化を測るためには、フレームの異なる画像を加算し時間的に平均化するか、同じ屈折率を取ると考えられる反射点からのデータを加算し空間的に平均化する。ＣＣＤや、ＣＭＯＳカメラ素子のひとつの画素は、ノイズを含むが、これを平均化すると、極めて安定した測定ができる。しかし、前者の場合には時間分解能が、後者の場合には空間分解能が低下する。また、ＳＰＲ効果のないＳ偏光の反射光強度を測定し、Ｐ偏光を規格化することによってノイズを低減される。この場合は光学系が複雑になる。

しかし、図８のようにＳＰＲ角度に相当する画像データの部分は、画像の暗い部分であり、ＳＰＲ角度の決定するに大きく寄与するのは、暗くダイナミックレンジの小さな部分である。また、ＳＰＲ角度は、屈折率の変化に伴って画像の入射角度軸方向に平行移動するので、角度方向にはＳＰＲ角度の決定に寄与しない部分も測定する必要がある。さらに、フレネル反射式を使って高精度に反射率最小角度を求めるには、反射率の絶対値を測定する必要があり、このためにはできるだけ広い入射角範囲の反射率測定が必要で、角度方向の分解能と両立しない。

（ナノドットＳＰＲ）
またナノサイズの金微粒子を含む溶液の吸収スペクトルが、金微粒子に付着する物質の屈折率によってシフトする効果を利用するセンサーが知られている。また、基板上に銀のパターンをリソグラフィーで形成し、この基板の透過スペクトルの測定から、同様な測定が可能である（非特許文献３）。この方法では、透過スペクトルを測定する代わりに、特定波長の透過強度を測定して、屈折率を測定することができるので、簡便な測定装置に用いることができる。

（位相検出ＳＰＲ）
一方、ＳＰＲ測定法として、ＳＰＲ効果により屈折率の変化が反射光の位相を大きく変化させる現象を利用した測定法がある（非特許文献４，５）。この方法では、２方向に分割したコヒーレント光の一方を、プリズムまたは回折格子カップラーまたは、コアに金薄膜をつけた導波路を介して金薄膜に照射し、他方との干渉による光強度の変化から金薄膜からの反射波の位相差を測定する。この方法では、高精度に光を分割する素子や合波する光学系が必要になる。また、温度や、機械的変形による影響を受けやすく、ノイズを小さくするのに特別な装置や、構造を必要とする。

（活性維持）
一方、特に免疫測定においては、固定化された抗体の活性の保持が感度と分子の特異性に影響する。抗体は、基板上に固定された場合、密集して固定化されると活性を失うことがあり、適当に分散させる必要がある。このために、
（１）基板上に形成した高分子の３次元網目構造に抗体を固定化し、相互の距離が大きくなるようにする、
（２）基板上に形成した白己集積膜に規則的に固定するなどの方法が知られている。
「超高感度酵素免疫測定法」、石川栄治著、学会出版センタ、１９９３年１２月１９日発行、ｐ．１３１〜１３２。ビアコア株式会社、［ｏｎｌｉｎｅ］、２００４年３月３０日検索、インターネットＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉａｃｏｒｅ．ｃｏ．ｊｐ／３＿１＿３．ｓｈｔｍｌ。Ａ．Ｊ．Ｈａｅｓ，Ｒ．Ｐ．ＶａｎＤｕｙｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４、１０５９６−１０６０４。Ａ．Ｂｒｅｃｈｔ，Ｇ．Ｇａｕｇｌｉｔｚ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ１０（１９９５）９２３−９３６。Ｓ．Ｇ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｓ．Ｓ．Ｙｅｅ，ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓＢ３５−３６，（１９９６）１８７−１９１。

（低ノイズ測定）
しかしながら、高い屈折率感度を必要とする低濃度の物質の測定や、検出反応のインキュベーションに時間を掛けられない迅速な測定を安価に行う必要がある場合には、簡単な装置でノイズレベルを低く抑える必要がある。すなわち、ＳＰＲ現象を用いる、免疫、ＤＮＡファイブリダイゼーション、レセプター・リガンドの特異的結合反応用いるセンサー、およびＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング法による免疫測定において、高感度化を図るために、小型装置で複雑化することなく測定ノイズを低減することが課題である。

（抗体の活性保持）
さらに、ＳＰＲ測定で抗体による分子認識に用いる場合には、抗体の活性を保ったまま固定化する必要がある。しかし、ＳＰＲ測定では、感度が基板表面から数百ｎｍに限られているために、高分子膜を用いた場合には、必ずしも十分な密度の抗体を固定化できない問題があった。

上記課題を解決するため、本発明によるＳＰＲセンサーは、表面プラズモン共鳴効果を有する金属薄膜の複数のドットを周期的に配置して形成したクラスターを透明基板に周期的に配置するとともに、前記クラスターの中心間距離である周期は前記ドットの中心間距離である最小周期より長周期であることを特徴とする。

また、本発明による屈折率の測定方法は、請求項１記載のＳＰＲセンサーを使用し、前記ドットに測定すべき物質を接触させ、前記ドットの薄膜に単一波長の光を照射し該ドットからの反射回折光または、透過回折光を２次元アレイ状の受光素子で観測し、該ドット上の屈折率変化を、該ドットからの回折光の結像パターンから測定することを特徴とする。

以上説明したように、本発明による生体分子相互作用測定に利用するＳＰＲセンサー及び屈折率測定方法では、
（１）簡便な装置で、安定した屈折率の変化の測定ができる。
（２）表面プラズモン共鳴効果を持つドットの配列を最適化することにより、高感度な屈折率測定ができる。
（３）表面プラズモン共鳴効果を持つドットに固定された抗体の活性の維持を図ることができる、という効果を有する。

本発明者らは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）効果を有する薄膜の複数のドットを周期的に配置した繰り返しパターンを形成する。そしてこの繰り返しパターンの一単位をクラスターとする。

図１に、このような構造のＳＰＲセンサーを模式的に示す。図１（ａ）は前記ナノサイズのドット１が規則的に全体的に配列されたもので、単周期構造を示している。すなわち、前記ドット１が繰り返しパターンで配置された前記パターンの一単位であるクラスター２を備えていない。

図１(ｂ）は２重周期構造であり、ドット１が繰り返しパターンで配置された前記パターンの一単位であるクラスター２を備えている。そして前記クラスター２は正方格子状に所定間隔で周期的に配置された(繰り返しパターンで配置された）構造になっている(図２も参照）。

図１(ｃ）は３重周期構造を示すものであり、クラスター２が繰り返しパターンで配置されたクラスター群２１が形成されており、このクラスター群２１が更に繰り返しパターンで配置された構造になっている。図１(ｄ）は多重周期を示すものであり、クラスター２が複数の繰り返しパターンで配列された状態を示している。

この場合、ドットの最小周期（ドットの中心間距離；図２におけるｄ１＋ａ）よりクラスターの周期（クラスターの中心間距離；図２における（ａ＋ｄ１）ｎ１−ｄ１＋ｄ２））は大きく(より長周期）、クラスターの周期よりクラスター群(クラスター群の中心間距離）の周期は大きい（より長周期）。すなわち、ドットよりクラスター、クラスター群にかけて（２重、３重、多重周期にかけて）順次周期は大きくなる。

本発明者らは、このような構造において２重周期以上の周期を持つものが、特異的結合反応検出する測定法において、きわめて分解能の高い安定した測定が可能であることを見いだした。

本発明者らは、特異的結合反応検出する測定法において、ＳＰＲ効果のある材料を、特に２重周期配列したナノサイズのドットで作製し、その透過光または反射光の像を画像処理して屈折率を求めると、きわめて分解能の高い安定した測定が可能であることを見いだした。より詳しくは、入射光を回折させるための周期のパターン(クラスターパターン）と、抗体などの分子を効率的に固定化するためのナノサイズのドットのドットパターンを組み合わせて作製すると、高感度な屈折率測定が可能であり、抗体が高い活性を保ったまま、固定化されることを見出し本発明にいたった。

本発明による典型的な構造は、上述のように２重周期構造である。後述の図２を参照して説明すると、ＳＰＲ効果を示す金属薄膜のドット１は正方格子状に所定間隔で（繰り返しパターンであるいは周期的配置で）ドットが形成されている。好ましくは、この繰り返しパターンの最小周期（ドットの中心間距離；図２におけるｄ１＋ａ）は３０〜１１０ｎｍである。更に好ましくは、８０〜１１０ｎｍである。実施例１で示したように３０μｍ未満であると作製が困難であり、一方最小周期が１１０ｎｍを超えると、ドット間の距離が長くなりＳＰＲ効果が弱くなるからである。

また、ドットの最大幅（図２のように正方形の場合、１辺の長さ；円形状、星形状などの場合などは最大外径を示す）ａは、好ましくは６０ｎｍ以下である。実施例２より明らかなように、６０ｎｍ以下であると、繰り返しによる、回折パターンの回復が良好で、この条件が抗体の活性維持に好ましい条件であることがわかる。

さらに、クラスター間隔ｄ２は、好ましくは１６００ｎｍ以下、４００ｎｍ以上である。１６００ｎｍ以下で回折強度が大きく、画像のコントラストが大きくなるからである。また４００ｎｍ未満であるとクラスターを構成する最小周期のパターン個数が少なくなる（クラスターの周期よりドットの最小周期が小さいため）。すなわち２重周期性が失われる恐れを生じる。

本発明においては、ＳＰＲ効果を発揮するドットに特異的結合反応を起こす生体分子を含む膜を修飾することができる。たとえば金ドットにカルボキシル基で終端された自己集積膜を介して抗ＩｇＧを修飾することができ、あるいはＦ（ａｂ’）２または、Ｆａｂフラグメントを用いてスルフィド基で直接抗ＩｇＧを修飾することができる。

さらに、従来のＳＰＲ測定では、ＳＰＲによる反射光の入射角度依存性を反射光束の一部を用いて測定していた。

これに対し、本発明では、前記ドットに測定すべき物質を接触させ、前記ドットの薄膜に単一波長の光を照射し該ドットからの反射回折光または、透過回折光を２次元アレイ状の受光素子で観測し、該ドット上の屈折率変化を、該ドットからの回折光の結像パターンから測定する。

ＳＰＲよる反射または透過光の位相変化による回折像を用いることにより、被測定物の屈折率情報は、回折像全体に反映され、平均化の効果が大きく、安価な装置でも低いノイズで測定でき、高感度化を図ることができる。

以下に図面を参照して本発明を実施例により詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

図２のように、厚さ４５ｎｍ、最大幅（図２のように正方形の場合、１辺の長さ；円形状、星形状などの場合などは最大外径を示す）ａｎｍの金薄膜のドット１が、間隔ｄ１ｎｍで正方格子状にｎ１×ｎ１個並んだクラスター２を、間隔ｄ２ｎｍで正方格子状に並んだパターンをＢＫ７の透明ガラス基板３上に作製し、ＳＰＲセンサーＳとした。種々のａ，ｄ１，ｄ２，ｎ１の組み合わせのパターンを作製した。このＳＰＲセンサーＳは、電子線リソグラフィーとドライエッチング法で作製された。全クラスター２の占有部分は約１．４×１．４ｍｍである。まず、この金ドット基板（ＳＰＲセンサー）の透過スペクトルを測定したところ、５７５ｎｍに吸収が現れ、金ドット１が、表面プラズモン共鳴効果を示すことがわかった。

次に、図３のような測定装置で、ＳＰＲセンサーＳに半導体レーザ４より波長６７０ｎｍのレーザを照射し、反射側で回折像をＣＣＤカメラ５で撮影し、図４の像を得た。図４の縦縞は、空気に接する金ドット１のクラスター２がカメラの方向に回折したものである。この回折パターン(結像パターン）は、空気の屈折率（１．０００４）に対応する。

次に金ドット１のパターン面が水に接した状態で同様に回折パターンを測定し、別の回折パターンを得た。水の屈折率は、１．３３なので、この屈折率差が、回折パターンに大きな変化を与えていることがわかる。この場合、回折パターンの縦縞の間隔と、位置が屈折率の変化に伴い移動することから、平均間隔と、回折パターンの重心計算する、などの方法で、回折パターンから、金ドット１に接する物質の屈折率を測定することができる。

図４の様に、ＳＰＲ現象による、金ドット１上の屈折率の情報は画像全体に現れ、この画像を時間的に加算するとひとつの画素の情報は安定した値をとることがわかった。また、縞の周期と位置を計算する場合に、すべての画素が同等の重みを持つので、屈折率を決定するために、画像の全情報を効率的に利用できる。

次に、ドット１及びクラスター２の正方格子状パターンの配置を決めるａ，ｄ１，ｄ２，ｎ１を変えて、前記パターンを作製する時間、ＳＰＲセンサーチップの収率、安価に入手できる波長のレーザを用いて屈折率変化で変化する回折パターンを得られるかを検討した。

この結果を図５に示す。図５より明らかなように、前記ドット１の最小周期(ドットの中心距離）は作製の容易さから、３０ｎｍ以上、好ましくは８０ｎｍ以上が適している。３０ｎｍ未満では、安定したドットパターンを形成するのが困難でドット欠けが発生するなど、ドットパターン収率が低かった。８０ｎｍ以上では安定して作製することができた。

一方、最小周期の最大値については、最小周期１１０ｎｍを超えると、ドット間の距離が長くなりＳＰＲ効果が弱くなった。また、ドットの占有面積を大きくすると、抗体の活性維特効果が弱くなり、適さなかった。

クラスター間隔ｄ２（周期は（ａ＋ｄ１）ｎ１−ｄ１＋ｄ２））は、回折強度が大きく、画像のコントラストが大きくなる１６００ｎｍ以下で、好ましくは８００ｎｍ以下が適する。８００ｎｍ以下では十分に大きなコントラストが得られた。一方、クラスター周期が短くなると、クラスターを構成する周期のパターンの個数が少なくなリ、２重周期性が無くなるので、４００ｎｍ以上の周期である必要がある。

このような回折パターンの変化は、変化量を大きくするために、金ドットの配置をあらかじめ設計することができ、正方格子状以外の周期的配置でもよい。ドットの形状も任意の形状を用いることができる。

実施例１の金ドット１に図６のように、金にカルボキシル基で終端された自己集積化膜を作製し、この上に、シグマ社製抗ＩｇＧを共有結合で固定化した（特異的結合反応を起こす生体分子を含む膜）。抗体の固定化法ではＦ（ａｂ’）２または、Ｆａｂフラグメントを用いて、スルフィド基で直接固定化してもよい。次に、この抗ＩｇＧで修飾した金ドットチップ（ＳＰＲセンサ）Ｓを、図７のように、金ドット１が形成された金ドットパターン面１１が接触するようにマイクロ流路６に接着した。この流路６は、流路高さ０．０２ｍｍで、貫通する穴７があいている。

次に、この金ドットチップ（ＳＰＲセンサ）付マイクロ流路６と、導入、排出用の溝８１の開いたガラス基板８とを接着した。送液口８２、排出口８３に、パイプを接続して、送液口８２から、シリンジポンプを使って、送液を行った。液は送液口８２より溝８１を通り、穴７よりマイクロ流路６に入り、前記ＳＰＲセンサーＳの金ドットパターン面１１に接触して、穴７、溝８１を通り排出口８３より排出されるようになっている。ＳＰＲセンサーＳに半導体レーザよりレーザを照射し、反射側で回折像をＣＣＤカメラ５撮影し回折を測定する。

まず、シグマ社製牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸バッファーを流し、金ドットパターン面１１にリン酸バッファーが接するように送液しながら、金ドットパターン１１からの回折を測定した。

次に、抗ＩｇＧに対する、抗原である、シグマ社製ＩｇＧを含む溶液を送液すると、回折パターンの間隔と位置が連続して変化し、ＩｇＧの送液をやめ、ＢＳＡを含むリン酸バッファーの送液に切り替えると、回折パターンは一定となった。

さらに、ｐＨ５のグリシンバッファーを送液した後に、ＢＳＡを含むリン酸バッファーを送液したところ、最初の回折パターンが回復した。この実験をａの値が異なる金ドットパターンについて繰り返したところ、ａが６０ｎｍ以下のときに、繰り返しによる、回折パターンの回復が良好で、この条件が抗体の活性維持に好ましい条件であることがわかった。この実験は、抗ＩｇＧとＩｇＧのような抗原抗体反応以外にも、相補する一本鎖ＤＮＡ同士や、ＤＮＡ−ＲＮＡの組み合わせでも、同様に作用し、ＤＮＡセンサーとしても利用できる。

本発明は、特異的結合反応検出の際に、ＳＰＲ効果のある材料を２重周期で配列したナノサイズのドット上に抗体などの分子を固定化し、その透過光や反射光の像を画像処理して屈折率を測ることにより、対象分子の濃度を測定する。このため、
（１）簡便な装置で、安定した屈折率の変化の測定ができる。
（２）表面プラズモン共鳴効果を持つドットの配列を最適化することにより、高感度な屈折率測定ができる。
（３）表面プラズモン共鳴効果を持つドットに固定された抗体の活性の維持を図ることができる、という利点がある。

本発明のドット及びクラスターの周期を説明する説明図。本発明の実施例のドット及びクラスターの周期を説明する説明図。本発明の実施例の測定系を説明する概略図。実施例で得られた回折パターンを示す図。実施例のドットの最小周期とクラスター間隔との関係を示す図。実施例２で使用されたＳＰＲセンサーの説明図。実施例で使用された測定系の説明図。従来の回折パターンを示す図。

符号の説明

１ドット
１１金ドットパターン面
２クラスター
２１クラスター群
３透明基板
４半導体レーザ
５ＣＣＤカメラ
６マイクロ流路
７穴
８ガラス基板
８１溝
８２送液口
８３排出口

Claims

表面プラズモン共鳴効果を有する金属薄膜の複数のドットを周期的に配置して形成したクラスターを透明基板に周期的に配置するとともに、前記クラスターの中心間距離である周期は前記ドットの中心間距離である最小周期より長周期であることを特徴とするＳＰＲセンサー。
前記複数のドットが正方格子状に所定周期で配置されている前記クラスターを、前記透明基板に正方格子状に所定周期で配置したことを特徴とする請求項１記載のＳＰＲセンサー。
前記ドットの最小周期は、３０〜１１０ｎｍであることを特徴とする請求項２記載のＳＰＲセンサー。
前記ドットの最小周期は、８０〜１１０ｎｍであることを特徴とする請求項３記載のＳＰＲセンサー。
前記クラスターの間隔は、４００〜１６００ｎｍであることを特徴とする請求項２から４のいずれか１項記載のＳＰＲセンサー。
前記クラスターの間隔は、４００〜８００ｎｍであることを特徴とする請求項５記載のＳＰＲセンサー。
前記ドットの最大幅は６０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項２から６のいずれか１項記載のＳＰＲセンサー。
前記ドットの全部または一部を、特異的結合反応を起こす生体分子を含む膜で修飾したことを特徴とする請求項２から７のいずれか１項記載のＳＰＲセンサー。
請求項１記載のＳＰＲセンサーを使用し、前記ドットに測定すべき物質を接触させ、前記ドットの薄膜に単一波長の光を照射し該ドットからの反射回折光または、透過回折光を２次元アレイ状の受光素子で観測し、該ドット上の屈折率変化を、該ドットからの回折光の結像パターンから測定することを特徴とする屈折率測定方法。
請求項８記載のＳＰＲセンサーを使用し、前記膜に特異的に分子が結合することによって起こる屈折率変化を測定することを特徴とする屈折率測定方法。