JP2005538065A - セロトニンファミリーの受容体および血液脳関門に関する免疫調節および細胞過程への影響 - Google Patents

セロトニンファミリーの受容体および血液脳関門に関する免疫調節および細胞過程への影響 Download PDF

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Abstract

本発明は、セロトニンタイプ１Ｂ、２、４および６受容体を介するシグナル伝達がＴ細胞活性化に重要であり、その結果フルフェナジンを使用することによるようなこうしたシグナル伝達を阻害することを、他の細胞過程のなかでも免疫応答、細胞増殖およびアポトーシスを調節するために使用し得るという発見に関する。この免疫調節は免疫疾患若しくは状態の治療およびこうした疾患若しくは状態のための潜在的治療薬の開発に有用である。細胞周期過程を進行する細胞において、セロトニンシグナル伝達の阻害が該過程を阻害しかつアポトーシスおよび細胞に対する形態学的変化を誘導することがさらに発見された。セロトニン作動性シグナル伝達を阻害することのこうした影響は、選択的細胞殺傷を遂げるためおよびシグナル伝達を阻害する化合物を同定するために有用であり得る。加えて、血液脳関門を実質的に横断しない阻害剤の使用、同定および製造方法もまた提供される。

Description

本出願は、合衆国法典第３５編第１１９条第（ｅ）項に従い、２００２年６月１７日出願の米国仮出願第６０／３８９，５７７号明細書および２００２年９月２７日出願の米国仮出願第６０／４１４，８３１号明細書（そっくりそのまま示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権を与えられている。
セロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンすなわち５−ＨＴともまた称される）は広範な神経精神病学的障害の病態生理学および処置に強く関与している神経伝達物質である。セロトニンは、セロトニン受容体分子（本明細書で「５−ＨＴ受容体」若しくは「５−ＨＴＲ」と称される）の多彩なファミリーによりその効果を発揮する。古典的に、セロトニン受容体ファミリーのメンバーは、薬理学的にすなわち多様なセロトニンアンタゴニストのそれらの特異性に従って７サブタイプにグループ分けされている。従って、全部の５−ＨＴ受容体がセロトニンと特異的に結合する一方、それらは薬理学的に別個でありかつ個別の遺伝子によりコードされている。今日までに１４種の哺乳動物のセロトニン受容体が同定かつシークェンシングされている。より具体的には、これら１４種の個別の５−ＨＴ受容体は５−ＨＴ１、５−ＨＴ２、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５、５−ＨＴ６および５−ＨＴ７と呼称される７種の薬理学的サブタイプにグループ分けされている。サブタイプのいくつかはさらに細分され、その結果受容体は後に続くとおりすなわち５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｅ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３Ａ、５−ＨＴ３Ｂ、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ６、５−ＨＴ７に薬理学的にグループ分けされる。しかしながら、該受容体の核酸およびアミノ酸配列を比較する場合に、サブタイプ間の同一性パーセントは薬理学的グループ分けと相関しない。
クローン化されている１４種の異なる哺乳動物セロトニン受容体のうち、１種を除く全部がＧタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーである。すなわち、それらは一般に、グアニンヌクレオチド調節（Ｇ）タンパク質により連結される多様なセカンドメッセンジャー経路に共役されている。例えば、セロトニン受容体５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂおよび５−ＨＴ１Ｄはアデニル酸シクラーゼを阻害し、また、５−ＨＴ２受容体はホスホリパーゼＣ経路を活性化してポリホスホイノシチドの分解を刺激する。５−ＨＴ２受容体は、それらの７個の膜貫通配置およびＧタンパク質へのそれらの機能的連結により識別されるロドプシン様シグナルトランスデューサーのファミリーに属する。
セロトニン受容体のサブタイプは、歴史的に、それらの薬理学的結合プロファイルに基づき、セカンドメッセンジャーの共役、およびより良好に特徴付けられたセロトニン受容体について既知の生理学的役割に基づいて識別されてきた。５−ＨＴ受容体を特徴付けるのに使用される該分野のデータの大部分は、単一の精製された受容体タンパク質若しくは遺伝子の特性に基づいておらず、しかしむしろモデル組織を使用する実験的観察結果に基づく。
本明細書の別の場所で以前に述べられたとおり、とりわけ構造的相同性、セカンドメッセンジャー系の活性化およびある種のリガンドに対する薬物親和性に基づく７サブタイプを包含する１４種の個別のセロトニン受容体が同定されている。分子クローニングは、５−ＨＴ受容体が少なくとも２種のタンパク質スーパーファミリー、すなわち７種の推定の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を有するＧタンパク質会合型受容体（５−ＨＴ１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｅ、５−ＨＴ２）、および４個の推定のＴＭＤを有するリガンド依存性イオンチャンネル受容体（５−ＨＴ３）に属することを示した。５−ＨＴ２サブファミリーは３クラスすなわち５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂおよび５−ＨＴ２Ｃにさらに分割される。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体アンタゴニストは、うつ、不安、精神病および摂食障害の治療において有用であると考えられている。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体は全体で約５１％のアミノ酸相同性および膜貫通ドメイン中でおよそ８０％の相同性を共有する。組換え哺乳動物細胞株における５−ＨＴ２Ａ受容体の研究は、該受容体が２種の親和性状態（高および低）を有したことを示した。
５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ双方の受容体はホスホリパーゼＣに共役され、そしてホスファチジルイノシトール経路により応答を媒介する。アゴニストおよびアンタゴニストを用いた研究は、受容体活性を支配する多彩な調節機構が存在することを示唆する広範な受容体応答を表す。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体は幻覚誘発薬物の作用部位としてもまた関与している。
中枢神経系（ＣＮＳ）において、セロトニンは、学習および記憶、睡眠、体温調節、運動活動、疼痛、性的および攻撃的挙動、食欲、神経内分泌調節ならびに生物学的律動に関与すると考えられている。セロトニンはまた不安、うつ、強迫性障害、統合失調症、自殺、自閉症、偏頭痛、嘔吐、アルコール症および神経変性性障害のような病態生理学的状態とも連結されている。
セロトニンは哺乳動物のＣＮＳ中の広範な感覚、運動および行動機能を調節する。この生体アミン神経伝達物質は、基底核および辺縁系構造で最高密度を伴うＣＮＳ全体に突起している脳幹のニューロンにより合成される（非特許文献１）。セロトニン作動性の伝達は不安、睡眠調節、攻撃、摂食およびうつを包含する多様な挙動および精神医学的障害に関与していると考えられている（非特許文献２；および非特許文献３）。５−ＨＴがその多彩な生理学的活動をどのように媒介するかを理解することは、適切な５−ＨＴ受容体の同定および単離を必要とする。
最近、研究は、セロトニンが免疫系において役割を演じているかもしれないことを示唆した。セロトニン受容体が免疫系の多様な細胞上に存在することをデータが示しているためである。「心／身体」の問題は何世紀にもわたって異種の専門分野の人々の興味をひいてきた。重度の感情若しくはストレスと免疫系との間に関連が存在することが常に理解されてきた。セロトニンは広範に流布している神経伝達物質でありかつ気分障害およびうつにおいて主要な役割を演じていることが知られている。免疫応答の調節におけるその役割はしかしながら認識されておらず、はるかにより少なく理解されている。
子宮内の胎児の生存が免疫学的逆説であることが長い間知られている。胎児は理論上、母体による同種移植片拒絶にさらされるはずである。大部分の場合、胎児は拒絶されず、従って逆説である。母体の免疫系が他の免疫応答の全部を無傷のまま残しつつ胎児に関して同種移植片拒絶をどのように選択的に抑制するかを理解することは免疫学の「聖杯」であった。該過程を理解しかつそれを治療で再現し得る場合、それは、自己免疫疾患に対する潜在的治療、ならびに移植処置に伴う拒絶症状の注目に値する新たな治療方法への基本的に新しい扉を開くであろう。しかしながら、本発明まで、自己免疫疾患および同種移植片拒絶のための改良された治療薬に対する必要性は満たされていない。本発明はこれらの必要性を満たす。
１９９８年に、Ｍｕｎｎら（非特許文献４）は難題の主要な片を解いた。この研究グループは、「全部の同種異系の受胎の産物の迅速なＴ細胞誘導性の拒絶は、栄養膜およびマクロファージにより発現されるトリプトファン異化酵素インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の薬理学的阻害剤で妊娠マウスを処理した場合に発生した、従って、異化するトリプトファンにより、哺乳動物の受胎の産物はＴ細胞の活性を抑制しかつそれ自身を拒絶に対して防禦する」ことを示した。言い換えれば、雌性が妊娠になった直後に彼女はナイアシンの産生に向かう代謝経路の第一段階にトリプトファンを送る酵素（ＩＤＯ）を産生する。これは、トリプトファンがどうにかして免疫応答の装備および維持において重要な役割を演じるに違いないこと、ならびに／若しくはキヌレニンを産生すること（ナイアシン経路の第一段階）が抑制的効果を有することを明らかに意味する。ＩＤＯの誘導がＴ細胞増殖を阻害することができかつ同種移植片の受容においてある役割を演じているかもしれないことが明らかになった（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）とは言え、トリプトファン異化作用がなぜ免疫応答を阻害するかは絶対的に不明であった。
トリプトファンは細胞中で新たなタンパク質を構成するために必要とされる１０種の必須アミノ酸の１種である。トリプトファンの異化作用が飢餓をもたらしかつ従って観察されたＴ細胞阻害の原因であることはありそうでないとは言え可能である。しかしながら、他の９種の必須アミノ酸のいずれもＴ細胞応答の制御に関与していない。にもかかわらず、トリプトファンレベルの局所枯渇とＴ細胞機能の阻害との間には強い相関が存在する（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献１０）。
トリプトファンは５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニンとしてもまた知られる）を産生するための唯一の既知の供給源である。局所トリプトファンレベルの調節がセロトニン作動性経路を介するＴ細胞反応性の観察された調節と関係しているはずである場合には、明らかに、セロトニンはＴ細胞活性化において中心的役割を演じているに違いない。しかしながら、セロトニンは生化学の歴史で最も広範に研究された生物学的に活性の分子の１つであるとは言え、Ｔ細胞活性化経路におけるその役割は本発明まで同定若しくは利用されていなかった。
マイトジェン刺激したリンパ球培養物にセロトニンを外因性に添加することの免疫調節効果について文献に報告が存在する。いくつかの環境下で、セロトニンが活性化されたＴ細胞を刺激することが示された（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）一方、大部分の研究室は高濃度の添加されたセロトニンが増殖を阻害することを報告している（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。従って、従来技術は、せいぜい、セロトニンがあったとしても何の役割を免疫応答の調節において演じうるかに関して不明確である。
介在する数年にわたって、１４種の既知の薬理学的に別個のセロトニン受容体のうち、リンパ球が休止期細胞上でタイプ２ａ、タイプ２ｂ、タイプ２ｃ、タイプ６およびタイプ７を発現すること（非特許文献１７；非特許文献１８）、ならびに、タイプ１ａおよびタイプ３受容体が活性化に際してアップレギュレートされること（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献１８）が示された。リンパ球上のこれらの受容体の機能的役割は明確に定義されていないとは言え、セロトニン受容体は、陽イオンチャンネルであるタイプ３受容体を除き７個の膜貫通ドメインのＧ共役受容体であることが公知である（総説については非特許文献２１を参照されたい）。より具体的には、タイプ１受容体はアデニル酸シクラーゼに作用してｃＡＭＰのダウンレギュレーションをもたらす（非特許文献２２）。例えばフォルスコリンはアデニル酸シクラーゼの薬理学的アゴニストかつｃＡＭＰのアップレギュレーターであり、そして従ってＴ細胞活性化の阻害剤である。Ｔ細胞のフォルスコリン阻害は、他方、セロトニンの添加によりレスキューされ得る（非特許文献２３；非特許文献１９）。
タイプ１ａ受容体と対照的に、休止期Ｔ細胞上に存在するタイプ６およびタイプ７受容体はセロトニンに応答してｃＡＭＰをアップレギュレートすることにより作用する（非特許文献２４；非特許文献２５）。それはほとんど反直感的配置であり、休止期細胞上に存在するタイプ６および７受容体がＴ細胞応答を遅らせるよう作用するはずである一方、タイプ１ａは６および７受容体から送られたシグナルを無効にするはずである。タイプ２ａおよび２ｃ受容体はホスホリパーゼＣと正に共役しかつイノシトールリン酸および細胞内Ｃａ２＋の増大された蓄積に至り、それによりプロテインキナーゼＣシグナル伝達カスケードのスイッチを入れる（総説については、非特許文献２６を参照されたい）。
免疫応答の機能的制御に関して、Ｇｅｒｓｈｏｎら（非特許文献２７）は、セロトニンがマウスにおいてＴ細胞媒介性の遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を装備するのに必要とされたと仮定した。しかしながら、この研究の著者らは、セロトニンに対するＤＴＨ応答の依存性をこの生体アミンの血管作用性の特性に起因すると考えた。
コネチカット州ウェストヘイヴンのｔｈｅ Ｍｉｌｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒからの一連の研究は、ヒトおよびマウスＴ細胞における５−ＨＴ １ａ受容体の存在および関与を示した（非特許文献２３；非特許文献１９；非特許文献２８）。これらの研究は、ＩＬ−２で刺激したヒトＴ細胞増殖がトリプトファン水酸化酵素すなわちトリプトファンのセロトニンへの転化に関与する最初の酵素の阻害により阻害され得ること、および、該阻害は５−ヒドロキシトリプトファン、すなわち阻害された酵素の代謝産物の添加により復帰させ得ることを確立した。さらに、彼らは５−ＨＴ １ａ特異的受容体アンタゴニストでヒトＴ細胞増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害し得た。マウスモデルにおいて、彼らは、タイプ１ａ受容体アンタゴニスト（しかしタイプ２受容体アンタゴニストでない）がオキサザロンに対するｉｎ ｖｉｖｏの接触感受性応答を阻害することが可能であったがしかし抗体応答は可能でなかったことを示した。
タイプ１ａおよびタイプ２双方の受容体アンタゴニストを使用して、Ｌａｂｅｒｇｅら（非特許文献２９）は、セロトニンがＣＤ８＋ Ｔ細胞から化学走性因子ＩＬ−１６を誘導し得、かつ、この活性はタイプ２受容体阻害剤の添加により特異的に阻害し得たがしかし１ａ受容体のアンタゴニストではし得なかった。従って、従来技術はセロトニンが免疫系においてある役割を担っていることを示したとは言え、その役割が何であるかは明確でなく、かつ、受容体アンタゴニストの使用により免疫系を調節し得ることを示唆するものは存在しなかった。
セロトニンが免疫応答においてある役割を担っているかもしれないことを示唆する少量の参考文献が存在する。１９８９年に、傑出した免疫学者Ｐｈｉｌｉｐ Ａｓｋｅｎａｓｅと彼の同僚は、５−ＨＴＲ２アンタゴニストがマウスにおいて遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を阻害し得たことを示した（非特許文献１７）。Ａｍｉｅｓｅｎらは、「後に作用する（ｌａｔｅ−ａｃｔｉｎｇ）ＤＴＨエフェクターＴ細胞が機能的５−ＨＴ２Ｒを発現しているかもしれないこと、および、これらの受容体はＴ細胞がＤＴＨの炎症性リンホカイン依存性の局面を局所で生じさせるためにｉｎ ｖｉｖｏ活性化を必要とするかもしれない」ことを論じた。これらのデータはその後、おそらくげっ歯類の肥満細胞がセロトニンを含有するがしかしヒト肥満細胞は含有せず、その結果該結果がヒトの免疫応答に応用可能でなかったために見捨てられた。後に、Ａｕｎｅら（非特許文献３０）は、５−ＨＴＲ１ａアンタゴニストがｉｎ ｖｉｖｏでマウスのＤＴＨ応答を阻害し得たことを示し、また、酵素トリプトファン水酸化酵素（トリプトファンのセロトニンへの転化に関与する最初の酵素）の阻害がＴ細胞増殖を阻害し得たことを示した。再度、これらの著者らは情報の重要な断片を提供したがしかしＴ細胞依存性応答の装備におけるセロトニンのより大きな役割を認識することに失敗した。
マクロファージおよびリンパ球が、セロトニンに応答することが可能な受容体を発現したことの最初の証拠は１９８４年（非特許文献３１）に提示された。介在する数年にわたって、１４種の既知の薬理学的に別個のセロトニン受容体のうちで休止期リンパ球が５−ＨＴ２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、６および７を発現すること（非特許文献１７；非特許文献１８）、ならびに５−ＨＴ１Ａおよび５−ＨＴ３受容体が活性化に際してアップレギュレートされること（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献１８）が示された。
リンパ球上のおよび免疫調節におけるセロトニン受容体の機能的役割が（もしあれば）定義されてはいないとは言え、セロトニン受容体は、陽イオンチャンネルであるタイプ３受容体を除き７個の膜貫通ドメインを含んでなるＧ共役受容体であることが公知である（総説については非特許文献２１を参照されたい）。より具体的には、タイプ１受容体はアデニル酸シクラーゼに作用してｃＡＭＰのダウンレギュレーションをもたらす（非特許文献２２）。
５−ＨＴ１Ａ受容体と対照的に、休止期Ｔ細胞上に存在する５−ＨＴ６および５−ＨＴ７受容体はセロトニンに応答してｃＡＭＰをアップレギュレートすることにより作用する（非特許文献２４；非特許文献２５）。見かけ上反直感的配置において、休止期細胞上に存在する５−ＨＴ６および５−ＨＴ７受容体はＴ細胞応答を遅らせるように作用するはずである一方、タイプ１ａは５−ＨＴ６および５−ＨＴ７受容体から送られたシグナルを無効にするはずである。５−ＨＴ２Ａおよび５−ＨＴ２Ｃ受容体はホスホリパーゼＣに正に共役しかつイノシトールリン酸および細胞内Ｃａ２＋の増大された蓄積に至り、それによりプロテインキナーゼＣシグナル伝達カスケードのスイッチを入れる（総説については非特許文献２６を参照されたい）。
セロトニンがマウスにおけるＴ細胞媒介性の遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答を装備するために必要とされたことが以前に仮定された（非特許文献２７）。セロトニンに対するＤＴＨ応答の依存性はこの生体アミンの血管作用性の特性によったと結論された。セロトニンの免疫調節効果について文献に種々雑多な報告が存在した。いくつかの環境下では、外因性５−ＨＴが活性化されたＴ細胞を刺激することが示された（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）一方、大部分の研究室は高濃度の外因性５−ＨＴが活性化されたＴ細胞の増殖を阻害することを報告している（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。従って、セロトニンが免疫系に対する何の効果を（もしあれば）有するかもしれないかは明確でない。研究は、この神経伝達物質が免疫応答をアップおよびダウンレギュレートの双方をすることを示唆しているからである。
免疫応答を調節するための治療法、とりわけ、他者に影響を及ぼさない一方で免疫応答のある局面を調節する治療法を開発することの長年感じられている必要性が存在する。従って、免疫応答を調節するための潜在的治療標的を同定することの大きな必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たす。さらに、好ましくは神経精神学的影響を媒介することなく免疫応答を調節することの必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を同様に満たす。
Ｓｔｅｉｎｂｕｓｃｈ、１９８４、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏａｎａｔｏｍｙ ３：６８−１２５中、Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｂ．Ｖ． Ｃｏｗｅｎ、１９９１、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｐｓｙｃｈ．、１５９：７−１４ Ｌｕｃｋｉ、１９９２、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．＆Ｂｉｏｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．、１６：８３−９３ Ｍｕｎｎら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１９１−１１９３ Ａｌｂｅｒａｔｉ−Ｇｉａｎｉら、１９９８、Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ １４：２５１−２５５ Ｍｕｎｎら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１３６２−１３７３ Ｗｉｄｎｅｒら、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２０：４６９−４７３ Ｐａｎら、２０００、Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：１８９−１９４ Ｍｅｌｌｏｒら、２００１、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６４−６８ Ｆｒｕｍｅｎｔｏら、２００１、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３３：４２８−４３０ Ｆｏｏｎら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：１５４５−１５５２ Ｋｕｔら、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｎｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．１４：７８３−７９６ Ｙｏｕｎｇら、１９９３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８０：３９５−４００ Ｓｌａｕｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８４：２４０−２５２ Ｋｈａｎら、１９８６、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：３７８−３８０ ＭｏｓｓｎｅｒとＬｅｓｃｈ、１９９８、Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２４９−２７１ Ａｍｅｉｓｅｎら、１９８９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：３１７１−３１７９ Ｓｔｅｆｕｌｊら、２０００、Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １４：２１９−２２４ Ａｕｎｅら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：１１７５−１１８３ Ｍｅｙｎｉｅｌら、１９９７、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１５１−１６０ ＢａｒｎｅｓとＳｈａｒｐ、１９９９、ＮｅｕｒｏＰｈａｒｍ．３８：１０８３−１１５２ Ｄｅ ＶｉｖｏとＭａａｙａｎｉ、１９８６、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２３８：２４８−２５２ Ａｕｎｅら、１９９０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：１８２６−１８３１ Ｒｕａｔら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９３：２６８−２７６ Ｒｕａｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８５４７−８５５１ ＢｏｅｓとＭａｒｔｉｎ、１９９４、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ３３：２７５−３１７ Ｇｅｒｓｈｏｎら、１９７５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４２：７３２−７３８ Ａｕｎｅら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１８２６−１８３１ Ｌａｂｅｒｇｅら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３１０−３１５ Ａｕｎｅら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：４８９−４９８ Ｒｏｓｚｍａｎら、１９８４、Ｓｏｃ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０：７２６
［発明の要約］
本発明は哺乳動物における免疫応答の調節方法を包含する。該方法は、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより該哺乳動物における免疫応答を調節することを含んでなる。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ４受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ６受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
一局面において阻害剤はフルフェナジンであり、また、別の局面において阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
なお別の局面において、阻害剤はそれが血液脳関門を実質的に横断しないように改変される。
さらなる一局面において、改変された阻害剤は阻害剤のフェノチアジン誘導体である。
なおさらなる一局面において、阻害剤はフルフェナジンでありかつそのフェノチアジン誘導体はＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される。
本発明は哺乳動物における免疫応答の阻害方法を包含する。該方法は、免疫応答阻害量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより該哺乳動物における免疫応答を阻害することを含んでなる。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ４受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ６受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
さらなる一局面において阻害剤はフルフェナジンである。
別の局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
なお別の局面において、阻害剤はそれが血液脳関門を実質的に横断しないように改変される。
さらなる一局面において、改変された阻害剤は阻害剤のフェノチアジン誘導体である。
なおさらなる一局面において、阻害剤はフルフェナジンでありかつそのフェノチアジン誘導体はＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される。
本発明は免疫細胞による免疫反応の阻害方法を包含する。該方法は、細胞上のセロトニン受容体により伝達されるセロトニンシグナルを阻害することを含んでなり、該シグナルを阻害することは細胞の活性化を阻害し、かつ、さらに、セロトニンシグナルを阻害することは、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と免疫細胞を接触させてそれにより該細胞による免疫反応を阻害することを含んでなる。
一局面において、免疫細胞はＴ細胞およびＢ細胞から選択される。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ４受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ６受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
さらなる一局面において、阻害剤はフルフェナジンである。
別の局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
なお別の局面において、阻害剤は、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変される。
さらなる一局面において、改変された阻害剤は該阻害剤のフェノチアジン誘導体である。
なおさらなる一局面において、阻害剤はフルフェナジンでありかつそのフェノチアジン誘導体はＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される。
本発明はまた、セロトニンシグナル伝達により活性化される免疫細胞により媒介される、自己免疫疾患を有する哺乳動物における免疫応答の調節方法も包含する。該方法は、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を該哺乳動物に投与してそれにより該哺乳動物における免疫応答を調節することを含んでなる。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
別の局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
さらなる一局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
なおさらなる一局面において、阻害剤はセロトニン受容体と特異的に結合する抗体である。別の局面において、該セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、自己免疫疾患は、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症よりなる群から選択される。
さらなる一局面において、調節は阻害である。
本発明は、哺乳動物におけるＴ細胞上のセロトニン受容体の活性化により媒介される免疫応答の阻害方法を包含する。該方法は、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤とＴ細胞を接触させてそれにより哺乳動物における免疫応答を阻害することを含んでなる。
一局面において、該方法は、阻害剤をボーラス注入として投与することをさらに含んでなる。
別の局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
さらなる一局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
別の局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、哺乳動物における免疫細胞上のセロトニン受容体の活性化により媒介される免疫細胞の活性化の阻害方法を包含する。該方法は、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与することを含んでなり、さらに、免疫細胞を該阻害剤と接触させてそれにより該免疫細胞の活性化を阻害する。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
さらなる一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明はまた、哺乳動物における二次的免疫応答の阻害方法も包含する。該方法は、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより哺乳動物における二次的免疫応答を阻害することを含んでなる。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、阻害剤は、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される。
なお別の局面において、阻害剤は、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである。
さらなる一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、セロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を必要とする哺乳動物中の細胞により媒介される疾患の治療方法を包含する。該方法は、細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害することを含んでなり、該阻害は細胞に対し有害でありその結果該細胞は疾患を媒介しない。
一局面において、セロトニン相互作用の阻害は、セロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と細胞を接触させることにより媒介される。
別の局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１受容体、セロトニンタイプ２受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
なお別の局面において、疾患は、多発性骨髄腫、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症よりなる群から選択される。
一局面において、セロトニン受容体はセロトニンタイプ１受容体でありかつさらに疾患は多発性骨髄腫である。
別の局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は細胞におけるアポトーシスの誘導方法を包含する。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、阻害はアポトーシスを誘導し、かつ、さらに、細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害することが、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と細胞を接触させてそれにより細胞におけるアポトーシスを誘導することを含んでなる。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明はまた細胞死の誘導方法も包含する。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、阻害は細胞の死を誘導し、さらに、阻害は、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と細胞を接触させてそれにより細胞の死を誘導することを含んでなる。
別の局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、哺乳動物における自己免疫疾患を治療するのに有用な化合物の同定方法を包含する。該方法は、セロトニン受容体を試験化合物と接触させること、および化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニンの結合のレベルを化合物と接触されないそれ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、化合物と接触されないそれ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較して化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニン結合のより低いレベルが、該化合物が哺乳動物における自己免疫疾患を治療するのに有用であることの指標となる。一局面において、哺乳動物はヒトである。
本発明は本方法により同定される化合物を包含する。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
別の局面において、該方法は、血液脳関門を横断する化合物の能力を評価すること、および血液脳関門を実質的に横断しない化合物を選択することをさらに含んでなる。本発明は本方法により同定される化合物を包含する。別の局面において、化合物はＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される。
本発明は、哺乳動物における同種異系移植応答を治療するのに有用な化合物の同定方法を包含する。該方法は、セロトニン受容体を試験化合物と接触させること、および化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニンの結合のレベルを化合物と接触されないそれ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、化合物と接触されないそれ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較して化合物と接触させたセロトニン受容体とのセロトニン結合のより低いレベルが、化合物が哺乳動物における同種異系移植片応答を治療するのに有用であることの指標となる。
本発明は本方法により同定される化合物を包含する。
別の局面において、該方法は、血液脳関門を横断する化合物の能力を評価すること、および血液脳関門を実質的に横断しない化合物を選択することをさらに含んでなる。本発明は本方法により同定される化合物を包含する。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
本発明は、Ｔ細胞上のセロトニン受容体とのセロトニンの結合により媒介されるＴ細胞の活性化を阻害するのに有用な化合物の同定方法を包含する。該方法は、Ｔ細胞を試験化合物と接触させること、および化合物と接触させたＴ細胞の活性化のレベルを化合物と接触されないそれ以外は同一のＴ細胞の活性化のレベルと比較することを含んでなり、化合物と接触されないそれ以外は同一のＴ細胞の活性化のレベルと比較して化合物と接触させたＴ細胞の活性化のより低いレベルが、化合物が、Ｔ細胞上のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニン結合により媒介されるＴ細胞の活性化を阻害するのに有用であることの指標となる。
別の局面において、該方法は、血液脳関門を横断する化合物の能力を評価すること、および血液脳関門を実質的に横断しない化合物を選択することをさらに含んでなる。本発明は本方法により同定される化合物を包含する。
なお別の局面において、該方法は、化合物をそれが血液脳関門を実質的に横断しないように改変することをさらに含んでなる。
本発明はまた、細胞上のセロトニン受容体を介してシグナル伝達に影響を及ぼす化合物の同定方法も包含する。該方法は、細胞を化合物と接触させること、および化合物と接触させる前の細胞の形態学と比較して該細胞における細胞の形態学のいかなる変化も評価することを含んでなり、化合物と接触させる前の細胞の形態学と比較した化合物と接触させた細胞の形態学の変化が、化合物が細胞上のセロトニン受容体を介するシグナル伝達に影響を及ぼしてそれにより細胞上のセロトニン受容体を介してシグナル伝達に影響を及ぼす化合物を同定することの指標となる。
本発明は本方法により同定される化合物を包含する。
別の局面において、該方法は、化合物をそれが血液脳関門を実質的に横断しないように改変することをさらに含んでなる。本発明は本方法により同定される化合物を包含する。
本発明は、細胞における細胞周期過程に影響を及ぼす方法を包含する。該方法は、細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、さらに、細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を阻害することが、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と細胞を接触させてそれにより細胞周期過程に影響を及ぼすことを含んでなる。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスに影響を及ぼす方法を包含する。該方法は該受容体を介して伝達されるシグナルを阻害することを含んでなり、さらに、阻害することは、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と細胞を接触させてそれにより細胞におけるアポトーシスに影響を及ぼすことを含んでなる。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、セロトニン受容体を介して伝達されるシグナルを阻害してそれにより細胞においてアポトーシスを誘導することを含んでなる、受容体を発現する細胞におけるアポトーシスの誘導方法を包含する。
本発明は哺乳動物における免疫応答を調節するためのキットを包含する。該キットは、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなる。該キットは、アプリケーターおよびそれの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
一局面において、セロトニン受容体は、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞における細胞周期過程に影響を及ぼすためのキットを包含する。該キットは、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなる。該キットは、アプリケーターおよびそれの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
本発明は、セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するためのキットを包含する。該キットは、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなる。該キットは、アプリケーターおよびそれの使用のための説明資料をさらに含んでなる。
一局面において、阻害剤は血液脳関門を実質的に横断しない。
［発明の詳細な記述］
セロトニンファミリーの受容体は、神経学的系、および本発明に開示されるとおり免疫系で重要な役割を演じる。本明細書に開示されるデータは、セロトニンタイプ２受容体の活性化に影響を及ぼすことが免疫応答を調節し得ることを示す。より具体的には、タイプ２Ｂ／２Ｃおよびより小さな程度までタイプ２Ａのセロトニン受容体とのセロトニンの結合の阻害が、Ｔ細胞活性化の減少若しくは阻害、およびとりわけ哺乳動物における一次および二次的双方のＴ細胞応答の阻害を媒介する。Ｔ細胞応答のこうした阻害は、とりわけ、それに対し現在効果的な処置が存在しない自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶の強力な治療的処置方法を提供する。
［定義］
本明細書で使用されるところの以下の用語のそれぞれは本節のそれに関連した意味するところを有する。
冠詞「ａ」および「ａｎ」は該冠詞の文法上の目的語の１つ若しくは１つ以上（すなわち最低１つ）を指すのに本明細書で使用する。例として「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（ある要素）」は１個の要素若しくは１個以上の要素を意味している。
該用語が本明細書で使用されるところのＴ細胞の「活性化」により、Ｔ細胞が、免疫応答を生成させることが可能な化合物、分子若しくは細胞（例えばＣｏｎＡ若しくはＰＨＡのようなマイトジェン）と接触される場合にＣＤ２５すなわちＩＬ２受容体のような表面マーカーを検出可能にアップレギュレートし、ｐ５６ｌｃｋを伴うリン酸化カスケードを開始し、サイトカインおよびインターロイキンの放出を引き起こし、とりわけ生来のＤＮＡ鎖への３Ｈ−チミジンの取込みのレベルを評価することにより評価し得るＤＮＡ合成を増大させ、かつ、細胞を増殖させることを意味している。
本明細書で使用されるところのセロトニン「アゴニスト」は、哺乳動物に投与される場合に物質の組成物の非存在下でのセロトニンの生物学的活性に比較してセロトニンのレベル若しくは存在に帰することができる生物学的活性を検出可能に高め、増大させ若しくは拡大する物質の組成物である。
セロトニン「アンタゴニスト」は、ヒトのような哺乳動物に投与される場合にセロトニンのレベル若しくは存在に帰することができる生物学的活性を検出可能に阻害する物質の組成物である。
セロトニン「インバースアゴニスト」は、哺乳動物に投与される場合にその基礎レベルより下にセロトニン作動性受容体に媒介されるシグナルを検出可能に阻害する物質の組成物である。例えば、アンタゴニストはリガンドが受容体に対するその正のシグナル伝達効果を発揮することを防止し得る一方、インバースアゴニスト（「ネガティブアンタゴニスト」としてもまた当該技術分野で既知）はそれらの平衡レベルより下へと、受容体に媒介されるシグナルを阻害することができる。すなわち、セロトニン作動性受容体を介するある基礎の検出可能なレベルのシグナル伝達がリガンドの非存在下でさえ存在し得、そしてインバースアゴニストは基礎より下にそのレベルを低下させ得る。
これらの用語が本明細書で使用されるところの「選択的アゴニスト」若しくは「選択的アンタゴニスト」という用語により、いかなる他のセロトニン受容体ファミリーメンバーに対してよりも標的セロトニン受容体型に対する最低約５倍より大きい親和性を有する化学的作用物質を意味している。
本明細書で使用されるところの疾患を「軽減する」ことは、該疾患の１種若しくはそれ以上の症状の重症度を低下させることを意味している。
本明細書で使用されるところの「同種異系移植片」という用語により、限定されるものでないが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）および／若しくはマイナー抗原を挙げることができる免疫学的マーカーのミスマッチが存在する種内のいずれかの組織の移植を意味している。
本明細書で使用されるところの「同種異系移植片応答」という用語は、レシピエントに移植された非自己組織に対し向けられるいかなる免疫応答も意味している。移植処置は、限定されるものでないが、例えば骨髄移植、臓器移植などの間に非自己の細胞、組織若しくは臓器を投与することを挙げることができる。
「アンチセンス」はタンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、若しくは該非コーディング鎖に実質的に相同である配列をとりわけ指す。本明細書で定義されるところのアンチセンス配列は、タンパク質をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列は、単にＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分に相補的であることが必要ではない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上の指定される制御配列に相補的であってもよく、この制御配列は該コーディング配列の発現を制御する。
「増幅」は、ポリヌクレオチド配列がコピーされかつ従って例えば逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびリガーゼ連鎖反応により多数のポリヌクレオチド分子に拡大されるいかなる手段も指す。
本明細書で使用されるところの「アポトーシス」という用語は、細胞外若しくは細胞内シグナルにより誘導されて細胞の死を引き起こす既存の細胞系路の活性化を伴う活動性の過程を意味している。とりわけ、細胞死は、無傷の膜を伴う細胞における核断片化、クロマチン凝集などを伴う。
該用語が本明細書で使用されるところの「アプリケーター」という用語により、本発明のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニン相互作用の阻害剤（例えばセロトニンタイプ２受容体アンタゴニスト）を哺乳動物に投与するための、限定されるものでないが皮下シリンジ、ピペットなどを挙げることができるいかなる装置も意味している。
本明細書で使用されるところの「細胞周期過程」は、細胞周期およびその多様な期と関連したいかなる細胞機能若しくは過程も意味している。従って、細胞周期過程は、細胞周期のある部分を進行する細胞と関連するかまたはそれを媒介若しくはそれに関与するものである。
セロトニンシグナル伝達の阻害は、該用語が本明細書で使用されるところの、阻害が細胞の生存率の検出可能な減少を媒介する細胞に対し「有害」である。細胞生存率は、限定されるものでないが、生体分子合成（例えばタンパク質合成、核酸合成など）、トリパンブルー排除、ＭＴＴ低下、ヨウ化プロピジウムの取込み、細胞表面上のホスファチジルセリンの露出、ＤＮＡ断片化および／若しくはラダー形成などのレベルを評価することを挙げることができる当該技術分野で公知である標準的方法を使用して評価し得る。
「疾患」は、動物が恒常性を維持し得ない、および該疾患が軽減されない場合には該動物の健康が劣化し続ける動物の健康の一状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することが可能であるがしかし該動物の健康状態が該障害の非存在下でそれがあるであろうより少なく好都合である健康の一状態である。治療されずに放置されれば、障害は必ずしも該動物の健康の状態のさらなる低下を引き起こさない。
本明細書で使用されるところの「血液脳関門を実質的に横断しない」という用語により、阻害剤が、本明細書で開示される、当該技術分野で既知のような標準的アッセイ、若しくは血液脳関門を横切る化合物の浸透性を測定するために将来開発されるようなアッセイを使用して評価されるように血液脳関門を検出可能に横断しないことを意味している。こうしたアッセイは、限定されるものでないが、動物に投与される場合の化合物の向精神性効果を評価することを挙げることができる。さらに、アッセイは、とりわけ、血液脳関門を通る化合物の浸透性を測定するための時間にわたる該関門を超える化合物の濃度若しくは該関門の技術に認識されているモデルを評価することを包含する。
阻害剤は最初から不浸透性であり得かつ検出可能なレベルで血液脳関門を横断し得ないことが当業者により理解されよう。さらに、目的の阻害剤は当該技術分野で公知の技術を使用して、それが血液脳関門を検出可能に横断しないか若しくはそれが改変される前にそれがした検出可能により低いレベルでそれを横断するように改変し得る。双方の例において、それが検出可能なレベルで血液脳関門を横断するその能力を喪失しようとそれが改変される前より低いレベルでそれを横断する能力を喪失しようと、該化合物は本節の目的上「血液脳関門を実質的に横断しない」とみなされる。
本明細書で使用されるところの「有効量」という用語により、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナル伝達の伝達における検出可能な減少を媒介するのに十分である阻害剤の量を意味している。セロトニンシグナルの伝達は、限定されるものでないが、例えば受容体とのセロトニンの結合のレベルを評価することおよび／若しくは細胞の活性化のレベルを評価することを包含する本明細書の別の場所で記述されるものを挙げることができる当該技術分野で公知の標準的方法を使用して評価し得る。
当業者は、該量が変動しかつ治療されている疾患若しくは状態、治療されている哺乳動物の齢ならびに健康および身体的状態、疾患の重症度、投与されている特定の化合物などのような多数の因子に基づき容易に決定し得ることを理解するであろう。一般に、投薬量は１ｍｇ／ｋｇと２５ｍｇ／ｋｇとの間で設定することができる。一態様において、薬物は静脈内ボーラス注入により投与される。この型のボーラス投与を使用して、免疫学的に関連する細胞の全部が、それらの受容体に媒介されるシグナルを遮断するために十分な量の薬物に遭遇することを確実にし得る。しかしながら本発明はこの投与方法に制限されない。
本明細書で使用されるところの「相同な」は、２種の多量体分子間、例えば２種の核酸分子、例えば２種のＤＮＡ分子若しくは２種のＲＮＡ分子間または２種のポリペプチド分子間のサブユニットの配列の類似性を指す。該２分子の双方中での１サブユニット位置が同一の単量体サブユニットにより占有されている場合、例えば２種のＤＮＡ分子のそれぞれ中のある位置がアデニンにより占有されている場合には、それらはその位置で相同である。２配列間の相同性は一致する若しくは相同な位置の数の直接の関数であり、例えば２種の化合物の配列中の位置の半分（例えば長さ１０サブユニットの多量体中の５位置）が相同である場合には該２配列は５０％相同であり、位置の９０％、例えば１０のうち９が一致する若しくは相同である場合は該２配列は９０％の相同性を共有する。例として、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’および３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
本明細書で使用されるところの「免疫反応」という用語により、免疫細胞を刺激かつ／若しくは活性化することの検出可能な結果を意味している。
該用語が本明細書で使用されるところの「免疫応答」は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／若しくは抗原提示細胞のいずれか中でのエフェクター機能の活性化および／若しくは呼び出しをもたらす過程を意味している。従って、当業者により理解されるであろうところの免疫応答は、限定されるものでないがヘルパーＴ細胞若しくは細胞傷害性Ｔ細胞応答のいかなる検出可能な抗原特異的若しくは同種異系の活性化、抗体の産生、アレルギー反応のＴ細胞媒介性の活性化なども挙げることができる。
該用語が本明細書で使用されるところの「免疫細胞」は免疫応答の装備に関与するいかなる細胞も意味する。こうした細胞は、限定されるものでないがＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、抗原提示細胞などを挙げることができる。
本明細書で使用されるところの「セロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤」という用語により、セロトニンタイプ２受容体を介するシグナル伝達を検出可能に阻害するいかなる化合物若しくは分子も意味している。こうした化合物はセロトニン受容体のアンタゴニスト、インバースアゴニストなどを包含する。
その用語が本明細書で使用されるところの「説明資料」は、本明細書に列挙される多様な疾患若しくは障害を軽減若しくは治療することを遂げるためのキット中の本発明の核酸、ペプチドおよび／若しくは化合物の有用性を伝えるのに使用し得る刊行物、録音・録画物、図表若しくはいかなる他の表現媒体も包含する。場合によっては、若しくは、あるいは、説明資料は哺乳動物の細胞若しくは組織における疾患若しくは障害の１種若しくはそれ以上の軽減方法を記述してよい。キットの説明資料は、例えば本発明の核酸、ペプチドおよび／若しくは化合物を含有する容器に固定されていても、または核酸、ペプチドおよび／若しくは化合物を含有する容器と一緒に発送されていてもよい。あるいは、説明資料は、受領者が説明資料および化合物を共同して使用するという意図を伴い容器と別個に発送してもよい。
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列と分離されている核酸セグメント若しくはフラグメント、例えば該フラグメントに通常隣接する配列、例えばそれが天然に存在するゲノム中のフラグメントに隣接する配列から取り出されているＤＮＡフラグメントを指す。該用語はまた、細胞中でそれに天然に付随する核酸に天然に付随する他の成分、例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製されている核酸にも当てはまる。該用語は、従って、例えば、ベクター中、自律性に複製するプラスミド若しくはウイルス中、または原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれている、あるいは他の配列と独立に別個の分子として（例えばＰＣＲ若しくは制限酵素消化により生じられるｃＤＮＡまたはゲノム若しくはｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換えＤＮＡを包含する。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも包含する。
本明細書で使用されるところの免疫応答を「調節すること」という用語により、処置若しくは化合物の非存在下での哺乳動物における免疫応答のレベルと比較して、および／またはそれ以外は同一のしかし未治療の動物における免疫応答のレベルと比較して哺乳動物における免疫応答のレベルの検出可能な増大若しくは減少を媒介することを意味している。該用語は、天然のシグナル若しくは応答を混乱させかつ／若しくはそれに影響を及ぼしてそれにより哺乳動物、好ましくはヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
「プライマー」は、指定されたポリヌクレオチド鋳型に特異的にハイブリダイズしかつ相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供することが可能であるポリヌクレオチドを指す。こうした合成は、合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型およびＤＮＡポリメラーゼのような重合化のための作用物質の存在下にポリヌクレオチドプライマーが置かれる場合に起こる。プライマーは典型的には一本鎖であるが、しかし二本鎖であってもよい。プライマーは典型的にはデオキシリボ核酸であるが、しかし広範な合成および天然に存在するプライマーが多くの応用に有用である。プライマーは、それがハイブリダイズして合成の開始の部位としてはたらくように設計されている鋳型に相補的であるが、しかし該鋳型の正確な配列を反映する必要はない。こうした場合には、鋳型へのプライマーの特異的ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば色素形成性、放射活性若しくは蛍光部分で標識し得、そして検出可能な部分として使用し得る。
「組換えポリヌクレオチド」は、天然に一緒に結合されていない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅された若しくは集成された組換えポリヌクレオチドを適するベクター中に包含してよく、そして該ベクターを使用して適する宿主細胞を形質転換し得る。
組換えポリヌクレオチドは非コーディング機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など）を同様に供するかもしれない。
組換えポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞は「組換え宿主細胞」と称される。遺伝子が組換えポリヌクレオチドを含んでなる組換え宿主細胞中で発現される遺伝子は「組換えポリペプチド」を産生する。
「組換えポリペプチド」は組換えポリヌクレオチドの発現に際して産生されるものである。
「ベクター」は、単離された核酸を含んでなりかつ該単離された核酸を細胞の内部に送達するのに使用し得る物質の組成物である。限定されるものでないが直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性若しくは両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを挙げることができる多数のベクターが当該技術分野で既知である。従って、「ベクター」という用語は自律性に複製するプラスミド若しくはウイルスを包含する。該用語はまた、例えばポリリシン化合物、リポソームなどのような細胞中への核酸の移入を助長する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を包含するようにも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定されるものでないがアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを挙げることができる。
「発現ベクター」は発現されるべきヌクレオチド配列に効果をもたらして連結された発現制御配列を含んでなる組換えポリヌクレオチドを含んでなるベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なｃｉｓに作用する要素を含んでなり；発現のための他の要素は宿主細胞により若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系で供給し得る。発現ベクターは、コスミド、プラスミド（例えば裸の若しくはリポソーム中に含有される）、および組換えポリヌクレオチドを組込むウイルスのような当該技術分野で既知のもの全部を包含する。
「セロトニンファミリー受容体」という用語により、セロトニン、アドレナリン作動性、ヒスタミン、メラトニン若しくはドーパミン作動性受容体として分類され得るいかなる受容体も意味している。すなわち、受容体はこれらの分子のいずれかと特異的に結合しかつサンプル中の他の分子と有意に結合しない。
「セロトニン受容体」はセロトニンと特異的に結合するポリペプチドを包含する。
該用語が本明細書で使用されるところの「セロトニンシグナル」は、変化をもたらすセロトニンとの受容体に媒介される相互作用、いずれかのセロトニン特異的受容体との特異的薬物の相互作用若しくは双方の結果としてのいずれかの細胞内生化学的経路の均衡の変化を意味している。
同様に、本明細書で使用されるところの「セロトニン」受容体「の活性化」は、細胞上のセロトニン受容体とのセロトニンの結合がこうした結合と関連する細胞内および細胞外事象の典型的カスケードを誘導することを意味している。
「受容体」はリガンドと特異的に結合する化合物である。
本明細書で使用されるところの「特異的に結合する」という用語により、サンプル中に存在するセロトニンファミリーのタンパク質（すなわちドーパミン作動性タンパク質、アドレナリン作動性タンパク質、ヒスタミン、メラトニンおよびセロトニン）を認識かつ結合するがしかしサンプル中の他の分子を実質的に認識若しくは結合しない受容体を意味している。
該用語が本明細書で使用されるところの疾患を「治療する」ことは、１種若しくはそれ以上の症状疾患若しくは障害の１症状が動物により経験される頻度を低下させる疾患若しくは障害の頻度を低下させることを意味している。
［記述］
本発明は哺乳動物における免疫応答の新規調節方法に関する。本発明は、特異的アンタゴニストを使用して細胞上のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用を阻害することおよび／またはインバースアゴニストを使用するセロトニンタイプ２受容体により伝達されるシグナル（１種若しくは複数）を阻害することがＴ細胞の活性化を阻害し得るという発見に関する。本発明は、とりわけ、セロトニン／受容体の相互作用を阻害することによりＴ細胞活性化を予防若しくは阻害してそれによりこうした相互作用によりそうでなければ媒介される免疫応答を阻害する既知の若しくは開発されるべきセロトニンタイプ２受容体アンタゴニストを使用するセロトニン／セロトニンタイプ２受容体の相互作用を阻害することによる、多様な免疫疾患、障害若しくは状態の阻害方法を開示する。
Ｉ．方法
Ａ．免疫応答の調節方法
本発明は哺乳動物における免疫応答の調節方法を包含する。該方法は、こうした処置の必要な哺乳動物にセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を投与することを含んでなる。これは、本発明の教示を装備した当業者により認識されるであろうとおり、セロトニンおよび５−ＨＴ受容体の相互作用を阻害することが該受容体を含んでなるＴ細胞の活性化を阻害若しくは予防するからである。Ｔ細胞の阻害は、順に、本明細書に開示されるデータにより詳細に示されるとおり免疫応答の生成を予防する。
より具体的には、本発明はこうした相互作用の多様な阻害剤を使用してセロトニンタイプ１Ｂ、タイプ２、タイプ４およびタイプ６受容体とのセロトニンの相互作用を阻害することに関する。すなわち、当業者は、本明細書に提供される開示に基づいて、セロトニンタイプ１Ｂ、２（Ａ、Ｂおよび／若しくはＣ）、４ならびに６受容体とのセロトニンの結合を阻害する化合物が、限定されるものでないがセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用を阻害する既知の若しくは開発されるはずであるのいずれかの抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、小分子、ペプチド模倣物および製薬学的化合物を挙げることができることを理解するであろう。
当業者は本明細書に提供される開示に基づき認識するであろう。当業者は、本発明の阻害剤が、セロトニン受容体が細胞表面上のセロトニンに接近可能になることを予防若しくは阻害する分子および化合物を包含することを認識するであろう。すなわち、本発明は、受容体が細胞の表面上に存在しないように受容体の発現を予防するアンチセンスおよび／若しくはアンチセンス分子が本発明の阻害剤であり得ることを企図している。
より好ましくは、セロトニンタイプ１Ｂ、２、４若しくは６受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤は、とりわけ、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１、メチオテピンなどのようなタイプ１、２、４および６受容体アンタゴニストである。さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、タイプ１Ｂ、２、４および６受容体アンタゴニストが将来発見されるようなアンタゴニストを包含することを認識するであろう。当該技術分野で既知の十分に確立した薬理学的基準に従ってそれであることが決定されるであろういかなるタイプ１Ｂ、２、４若しくは６受容体アンタゴニストも、本明細を通じて開示されるとおりまたその中に詳細に示されかつ例示されるとおり、Ｔ細胞活性化が阻害されてそれにより免疫応答を阻害するように受容体とのセロトニンの相互作用を阻害することが可能であるとして当業者により理解されるであろうからである。従って、本発明はいかなる方法でも本明細書に示される特定のタイプ１Ｂ、２（Ａ／Ｂ／Ｃ）、４および６受容体アンタゴニストに制限されず；むしろ本発明は当該技術分野で既知の若しくは将来開発されるはずであるアンタゴニストを包含する。
セロトニンタイプ２受容体アンタゴニストはタイプ２Ａ、タイプ２Ｂおよび２Ｃのそれぞれのいずれか１つまたはそれらのいかなる組合せにも特異的であり得る。あるいは、本発明は、特異的でなくかつタイプ２受容体のいずれかとセロトニンの結合に影響を及ぼすタイプ２受容体アンタゴニストを包含する。特異的および非特異的双方のセロトニンタイプ２受容体アンタゴニストは、限定されるものでないがリスペリドン、ミアンセリン、リタンセリン、ケタンセリン、メチセルギド、メトキシグラミン、シプロヘプタジン、クロザピン、ＳＢ ２０６５５３、ＬＹ ５３８５７、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２４２０８４、メテルゴリン、Ｎ−デスメチルクロザピン、ピレンペロン、クロザピンＮ−オキシド、オクトクロテピン、ロキサピン、メスレルギンなど、およびそれらのいかなる組合せも挙げることができる。
当業者はまた、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が血液脳関門を実質的に横断しない化合物を使用することを包含することも認識するであろう。これは、神経細胞上かつ今や開示されるとおりこうした細胞由来の腫瘍（例えば多発性骨髄腫など）を包含する免疫系の細胞上でセロトニン受容体が見出されるため、神経細胞上のセロトニン受容体を介するシグナル伝達に影響を及ぼさない一方で免疫細胞上のセロトニン受容体を介するシグナル伝達を阻害することが望ましいかもしれないがしかし必要でないかもしれないことを当業者が理解するであろうからである。こうした例において、シグナル伝達を阻害するがしかし神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達にそれが影響を及ぼさないとみられる血液脳関門を横断しない化合物を投与することが望ましい。
従って、本発明は、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナル伝達を阻害しつつ血液脳関門を実質的に横断しない化合物を使用することを包含する。こうした化合物は、最初から血液脳関門を実質的に横断せずかつ本明細書に開示されるところの他の望ましい特徴（セロトニンシグナル伝達に影響を及ぼす、ある種のセロトニン受容体のタイプ（１種若しくは複数）を特異的に阻害する、細胞中でアポトーシスを誘導する、細胞による免疫応答を調節する、など）を有するの双方である新規化合物であり得る。あるいは、当業者は、本明細書に提供される教示に基づき、セロトニンシグナル伝達を阻害するがしかし血液脳関門を横断しそしてその場合は改変された化合物の該関門を横断する能力が減少若しくは好ましくは消失されるように改変されている化合物を本発明が包含することを認識するであろう。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、血液脳関門を横断するその能力に影響を及ぼすように化合物を改変する方法が当該技術分野で公知であり、それはまたある物質の該関門を横断する能力を評価するための極めて多量のアッセイも教示することを理解するであろう。１つのこうした方法、すなわちフルフェナジンのような化合物に多様な側基を付加してそれにより改変フルフェナジンの血液脳関門を横断する能力を低下させることが本明細書に開示される。例えばＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２と呼称される改変フルフェナジン化合物が本明細書で開示されるが、しかし本出願はいかなる方法でもこれら若しくは既知のセロトニン阻害剤のいかなる他の特定の誘導体にも制限されない。代わりに、本発明は、血液脳関門を横断する所望の低下された能力もまた有しつつ本発明の阻害剤の所望の免疫調節性の特徴を有するいかなる化合物も包含する。これらの特徴を有する化合物の製造および同定は、血液脳関門を通る化合物の浸透性を評価するためのアッセイがそうであるように当該技術分野で慣例である。こうしたアッセイは、所望の特徴を有する目的の化合物の製造方法がそうであるように本明細書に例示される。にもかかわらず、本発明はいかなる方法でもとりわけこれら若しくはいずれかの他の方法に制限されず；むしろそれは本明細書に開示される、当該技術分野で既知の若しくは将来開発されるはずであるもののような血液脳関門を実質的に横断せずかつなおセロトニン受容体を介してセロトニンシグナル伝達を阻害する化合物の製造および同定方法を包含する。
さらに、本明細書に提供される開示に基づき、当業者は、血液脳関門を実質的に横断することなくセロトニンシグナル伝達を阻害する新規化合物を容易に製造かつ同定し得、また、こうした新規の有用な化合物を同定するためのアッセイが本明細書の別の場所に記述され、そして、限定されるものでないがフルフェナジンの正に荷電したフェノチアジン誘導体であるＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２のような化合物の同定および製造によりこうしたアッセイの実施への成功裏の低減が例示される。本明細書に提供される開示に基づき、当業者は、本発明の付加的な化合物、およびいかなる方法でも不適当でないと思われるこうした実験に典型的に関与する技術を同定することが可能であろう。
要するに、本発明は、セロトニンシグナル伝達を阻害しかつ加えて血液脳関門を実質的に横断しない化合物を使用および同定することを包含する。従って、下述される方法は全部こうした阻害剤を使用することを包含する。
加えて、当業者は、セロトニンシグナルを阻害することが細胞の増殖、分裂、生存率、アポトーシスなどに影響を及ぼしかつ細胞が免疫応答に関与若しくはそれを媒介する、既知の若しくは将来同定されるべきのいずれかの、いずれかのセロトニン受容体を介して伝達されるセロトニンに媒介されるシグナルの伝達を阻害することを本発明が包含することを認識するであろう。従って、本発明はタイプ１Ｂ、２、４および６セロトニン受容体を介するシグナル伝達の阻害に制限されず；むしろ、本発明は、限定されるものでないが阻害が免疫応答を阻害するセロトニン受容体を介するシグナル伝達を阻害することを挙げることができる。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、とりわけセロトニンタイプ１受容体とのセロトニン相互作用を阻害する既知の若しくは開発されるべきのいずれかの抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、小分子、ペプチド模倣物および製薬学的化合物を使用することによりこうした阻害が媒介され得ることを認識するであろう。すなわち、本発明は、限定されるものでないがタイプ１Ｂを優先的に阻害するＳＢ−２１６６４１およびタイプ１Ｄ受容体を選択的に阻害するＢＲＬ−１５５７２を挙げることができるタイプ１受容体を阻害する化合物を使用することを包含する（例えば、Ｐｒｉｃｅら、１９９７、Ｎａｕｎｙｎ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３５６：３１２−３２０を参照されたい）。これは、本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、タイプ１Ｂ受容体を介して媒介されるセロトニンシグナル伝達の阻害が細胞増殖の阻害、およびより好ましくは細胞の大きさの検出可能な増大と関連づけ得るＤＮＡラダーにより示されるところのアポトーシスを媒介するからである。
しかしながら本発明はこれら若しくはいずれかの他のセロトニン受容体の阻害剤に制限されない。より具体的には、本明細書の別の場所で以前に論考されたとおり、これらの化合物は既知の化合物およびセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用を阻害した将来開発される化合物を包含する。既知のセロトニン受容体アゴニストおよびアンタゴニストの一覧はＴｏｃｒｉｓＴＭの英国の商業的ウェブサイトで公的に入手可能であり、そのサイトはそれらの生物学的活性に影響を及ぼす多様な化合物を論考する多様なセロトニン受容体の既知特性のＧ．Ａ．Ｋｅｎｎｅｔによる広範囲の総説を含んでなる（Ｋｅｎｎｅｔ、１９９７年５月公開、英国・Ｔｏｃｒｉｓ ｃｏｍｐａｎｙのウェブサイトのＵＲＬ）。
当業者は、本明細書に開示される教示を一旦装備すれば、本発明がセロトニン受容体と特異的に結合する抗体を使用して該受容体とのセロトニンの結合を阻害することを包含することを理解するであろう。各受容体型と結合する抗体を包含するセロトニン受容体と特異的に結合する抗体は当該技術分野で公知でありかつ／若しくは当業者に既知の標準的方法を使用して製造し得る。
当業者は、タンパク質、タンパク質をコードする核酸若しくは双方として該抗体を投与し得ることをさらに認識するであろう。すなわち、抗体を包含するタンパク質を細胞若しくは組織に提供するための当該技術分野で公知の多数のベクターが存在する。従って、本発明は、セロトニン受容体と特異的に結合してそれにより該受容体とのセロトニンの結合を阻害する抗体を投与することを包含し、そして、該抗体は細胞に投与し得るか、若しくは該抗体は該抗体をコードする核酸を細胞に投与することにより投与し得、そして抗体のこうした投与は本発明に包含される。
典型的には、抗体は血液脳関門を容易に横断しない。従って、当業者は、抗体を使用することが、血液脳関門を超えて抗体に接近可能でない神経細胞中のシグナル伝達に検出可能に影響を及ぼすことなく免疫細胞上のセロトニンシグナル伝達を阻害し得るという利点もまた提供することを理解するであろう。
さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が、そうでなければセロトニン受容体を発現するであろう細胞上の該受容体の発現を予防することによりそうでなければセロトニン受容体を介して伝達されるセロトニンシグナルの伝達の阻害を包含することを認識するであろう。例えば、当業者は、本発明が、リボザイム若しくはアンチセンス核酸分子を細胞に投与してそれにより細胞中でのセロトニン受容体の発現を阻害することを包含し、ここで細胞中での目的のタンパク質の発現を阻害するこうした分子の設計および使用が簡潔に後に続くとおり当該技術分野で公知であることを理解するであろう。
アンチセンス分子および遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は当該技術分野で公知である（例えばＣｏｈｅｎ、１９８９、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ中を参照されたい）。アンチセンス核酸は特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的であるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６２：４０）。細胞中でアンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡにハイブリダイズして二本鎖分子を形成してそれにより遺伝子の翻訳を阻害する。
遺伝子の翻訳のアンチセンスの阻害方法の使用は当該技術分野で既知であり、そして例えばＭａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ（１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７２：２８９）に記述されている。こうしたアンチセンス分子は、Ｉｎｏｕｅ（１９９３、米国特許第５，１９０，９３１号明細書）により教示されるところのアンチセンス分子をコードするＤＮＡを使用する遺伝子発現を介して細胞に提供してよい。
あるいは、アンチセンス分子は合成で製造しかつその後細胞に提供し得る。約１０ないし約１００、およびより好ましくは約１５ないし約５０ヌクレオチドの間のアンチセンスオリゴマーが好ましい。それらは容易に合成されかつ標的細胞中に導入されるからである。本発明により企図される合成アンチセンス分子は、未修飾オリゴヌクレオチドに比較して向上された生物学的活性を有する当該技術分野で既知のオリゴヌクレオチド誘導体を包含する（Ｃｏｈｅｎ、上記；Ｔｕｌｌｉｓ、１９９１、米国特許第５，０２３，２４３号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
リボザイムおよび遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用もまた当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｅｃｈら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７４７９−１７４８２；Ｈａｍｐｅｌら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：４９２９−４９３３；Ｅｃｋｓｔｅｉｎら、国際公開第ＷＯ ９２／０７０６５号明細書；Ａｌｔｍａｎら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書（そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の様式で他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子中の特定のヌクレオチド配列を認識しかつそれを切断するように分子を工作し得る（Ｃｅｃｈ、１９８８、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０）。このアプローチの主要な一利点は、それらが配列特異的であるために特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
２種の基本的な型のリボザイム、すなわちテトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５）およびハンマーヘッド型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは長さが４塩基である配列を認識する一方、ハンマーヘッド型リボザイムは長さが１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、該配列が標的ｍＲＮＡ種中に独占的に存在するであろう見込みが大きくなる。結果、ハンマーヘッド型リボザイムは特定のｍＲＮＡ種を不活性化するためにテトラヒメナ型リボザイムより好ましく、そして、１８塩基の認識配列は多様な無関係のｍＲＮＡ分子内に無作為に存在しうるより短い認識配列より好ましい。
細胞に抗体を投与して細胞表面上のセロトニン受容体とのセロトニンの結合を阻害することに加え、本発明は、目的のセロトニン受容体と特異的に結合する抗体若しくは該抗体をコードする核酸を投与することを包含し、ここで該分子は、抗体がセロトニン受容体と結合しかつ細胞表面でのその発現を予防するような細胞内保持配をさらに含んでなる。頻繁に「イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）」と称されるこうした抗体は当該技術分野で公知でありかつ例えばＭａｒａｓｃｏら（米国特許第６，００４，４９０号明細書）およびＢｅｅｒｌｉら（１９９６、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ３８：１１−１７）に記述されている。従って、本発明は、細胞表面上に存在する目的の受容体とのセロトニンの結合を阻害することを含んでなる方法（例えば抗体、化合物、小分子、ペプチド模倣物、薬物など）、ならびに細胞表面上に存在している受容体を阻害することを含んでなる結合の阻害方法（例えばリボザイム、アンチセンス分子、イントラボディなど）、およびセロトニンとセロトニン受容体との間の細胞表面上でのリガンド：受容体の相互作用を阻害するための将来既知になるような方法を包含する。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、セロトニン（タイプ１Ｂ、２、４若しくは６）受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤をいずれかの他のこうした阻害剤とともに投与し得ることを認識するであろう。さらに、本発明は、限定されるものでないが遺伝子発現の調節物質（例えばインターロイキン２の発現を阻害するグルココルチコイドなど）、既知の変異原であるアルキル化剤（例えばシクロホスファミド）、カルシニューリンおよびＪＮＫ／ｐ３８キナーゼ経路ならびにサイクリンキナーゼカスケードに作用するキナーゼおよびホスファターゼの阻害剤（例えばシクロスポリンＡ、タクロリムス［ＦＫ５０６］およびラパマイシン）、グアノシンヌクレオチド合成の阻害剤として作用しかつ同種移植片拒絶を予防するおよび進行中の拒絶を治療するのに使用されるｄｅ ｎｏｖｏプリン合成の阻害剤（例えばミコフェノール酸モフェチル）、ならびに慢性関節リウマチに冒されている患者を治療するのに使用されるｄｅ ｎｏｖｏピリミジン合成の阻害剤（例えばレフルノミド）を挙げることができる別の免疫調節剤とともに（前、同時におよび／若しくは後に）投与し得るセロトニン阻害剤（例えば抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、ペプチド模倣物、セロトニン受容体アンタゴニストなど）の最低１種の阻害剤の投与を包含する。従って、本発明は、伝統的な免疫調節物質および化合物と同時にセロトニン（タイプ１Ｂ、２、４および６）受容体とのセロトニンの相互作用の最低１種の阻害剤を投与することを包含する。
加えて、血液脳関門を実質的に横断しない阻害剤を、該関門を横断する阻害剤とともに投与し得、そして、本発明は、血液脳関門を横断する若しくはしない阻害剤の組合せに関していかなる方法でも制限されない。
当業者は、本発明の教示を一旦装備されれば、免疫細胞（例えばリンパ球、より具体的にはＴ細胞、若しくは例えばＢ細胞のような抗原提示細胞、若しくはマクロファージ）上のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの結合が受容体活性化に必要とされ、それが順にＴ細胞活性化を媒介するために、セロトニン／受容体の相互作用を阻害することがこうした免疫細胞により媒介される免疫応答を調節することを理解するであろう。さらに、本明細書に開示されるデータは、セロトニンタイプ１Ｂ、タイプ４若しくはタイプ６受容体を介するセロトニンシグナルの伝達の阻害がその受容体を発現する免疫細胞の活性化もまた阻害し、それらのセロトニン受容体とのセロトニンの結合のその阻害が細胞の活性化もまた阻害し、そして従って該細胞による免疫反応もまた阻害し、そして順にその細胞により媒介される免疫応答を阻害することを示す。すなわち、免疫細胞上のセロトニン受容体に媒介される相互作用（１種若しくは複数）を阻害することが、影響を及ぼされた免疫細胞により生成される免疫応答（すなわち免疫反応）に影響を及ぼし（例えば受容体／リガンド結合により媒介されるマイトジェン応答が阻害され、その結果Ｔ細胞増殖が発生せずかつ／若しくはアポトーシスが起こり得る、など）、その結果、その細胞による応答、免疫若しくはそれ以外がアンタゴニストの非存在下でそれ以外は同一の細胞により生じられる免疫応答に関して検出可能に増大若しくは減少される。本明細書に開示されるデータは、同種異系刺激によろうがマイトジェン刺激によろうが活性化応答の間のいずれかの点で５ＨＴ １Ｂ、２、４および６受容体により媒介されるシグナルを阻害することが該応答の即座の停止をもたらすことをはっきりと示す。
従って、本明細書に開示されるデータは哺乳動物、好ましくはヒトにおける免疫応答の阻害方法を十分に支持する。セロトニン（タイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および／若しくは６）受容体でのセロトニン結合の阻害が免疫細胞の活性化を阻害してそれにより該細胞による免疫反応を阻害し、それが順にその細胞により媒介される免疫応答を阻害するからである。
同様に、本発明は免疫細胞による免疫反応の阻害方法を包含する。これは、本明細書の別の場所でより完全に示されるとおり、免疫細胞上のセロトニン受容体とのセロトニンの結合の阻害が該細胞の活性化を阻害し、それが順に、セロトニン結合の阻害の非存在下でのその細胞による免疫反応に比較した場合かつ／若しくはその受容体とのセロトニンの結合が阻害されないそれ以外は同一の細胞の免疫反応と比較した場合にその細胞による免疫反応を阻害するからである。
同一の証拠により、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がセロトニンシグナル伝達により活性化される免疫細胞により免疫応答が媒介される哺乳動物におけるその免疫応答の調節方法を包含することを認識するであろう。これは、本明細書の別の場所で以前に指摘されたとおり、免疫細胞の活性化がそのコグネイトのタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および／若しくは６受容体とのセロトニンの結合を必要とし、その結果こうした結合が活性化を阻害し、それが順に細胞が免疫応答を媒介することを予防するからである。従って、当業者は、本明細書の別の場所により完全に示されるところの多様な方法により達成し得るセロトニンシグナル伝達を阻害することが、こうしたシグナル伝達を必要とする免疫応答の生成を阻害することを理解するであろう。さらに、本明細書の別の場所に以前に開示されたとおり、該方法は、血液脳関門を実質的に横断しない阻害剤を使用することを包含する。
加えて、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がＴ細胞上のセロトニン受容体の活性化により媒介される免疫応答の阻害方法を包含することを認識するであろう。すなわち、本明細書の別の場所に以前に論考されたとおり、免疫細胞、好ましくはＴ細胞上のセロトニン受容体、例えばタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６とのセロトニンの結合の阻害が該細胞の活性化を阻害し、かつ、順にその細胞による免疫反応およびその細胞により媒介される免疫応答を阻害する。従って、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、こうした方法が本発明に包含されることを理解するであろう。
本発明はまた、免疫細胞上のセロトニン受容体の活性化により活性化が媒介される哺乳動物、好ましくはヒトにおける該細胞の活性化の阻害方法も包含する。再度、これは、本明細書の別の場所により完全に記述されるとおり、免疫細胞上のセロトニンタイプ１Ｂ、２（Ａ／Ｂ／Ｃ／）、４若しくは６受容体を介するセロトニンのシグナル伝達の阻害が該細胞の活性化を阻害し、そして従ってその細胞によりそうでなければ生じられるであろう免疫応答もまた阻害することを、本明細書に開示されるデータが初めて示すからである。本明細書の別の場所により完全に示されるとおり、セロトニンシグナル伝達の阻害方法は本明細書に記述されるか、若しくは当該技術分野で公知でありかつ本明細書に包含される。再度、本明細書に開示される方法のそれぞれは血液脳関門を実質的に横断しない阻害剤を使用することを包含する。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本明細書に開示される方法が哺乳動物に対し有益でないいかなる免疫応答も阻害するために有用であることを認識するであろう。こうした望ましくない免疫応答は、限定されるものでないが、二次的免疫応答、自己免疫応答、同種異系移植片拒絶応答などを包含する疾患、障害若しくは状態と関連する免疫応答を挙げることができる。
従って、本発明は哺乳動物における二次的免疫応答の阻害方法を包含する。すなわち、二次的免疫応答がセロトニンシグナルを介する活性化を必要とする細胞により媒介される場合、該セロトニンシグナルは、該細胞上のセロトニンタイプ１Ｂ、２、４および６受容体とのセロトニンの結合を阻害することにより、本明細書の別の場所でより完全に開示されるとおり阻害され得る。この阻害は順に該細胞の活性化を阻害し、それはその後、限定されるものでないが二次的免疫応答、ＣＤ８＋細胞により媒介される応答および／若しくはＣＤ４＋細胞により媒介される免疫応答を挙げることができる該細胞により媒介される免疫応答を阻害する。
セロトニン受容体に媒介されるシグナルを阻害する化合物若しくは分子（例えばセロトニン受容体のアンタゴニスト若しくはインバースアゴニストのような製薬学的化合物）は、細胞、組織若しくは動物に、または細胞、組織上の若しくは動物におけるセロトニンタイプ１Ｂ、２、４および／若しくは６受容体とのセロトニンの相互作用を阻害するために投与し得る。阻害剤が抗体であろうとセロトニンタイプ１Ｂ、２、４および／若しくは６受容体のアンタゴニストであろうと、本明細書に記述される阻害剤の安全かつ効果的な投与方法は当業者に既知である。例えば、セロトニンアンタゴニストの投与は標準的文献に記述されている。すなわち、多くのセロトニンに影響を及ぼす作用物質の投与は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９６年版、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏ．、ニュージャージー州モンベール）（その開示は本明細書にそっくりそのまま示されるかのように引用することにより組み込まれる）に示されている。
さらに、セロトニン受容体阻害剤を投与するためのパラメータは製薬学的技術分野で公知でありかつ本明細書で反復される必要はない。
該組成物はまた、細胞、組織若しくは動物における受容体発現若しくは該タンパク質のレベルを減少若しくは増大させることが該動物に有益であるような受容体の変えられた発現により媒介される疾患、障害若しくは状態を治療するのにも有用である。すなわち、動物における疾患、障害若しくは状態がセロトニン受容体の発現の変えられたレベル若しくはタンパク質のレベルにより媒介されるか若しくはそれと関連する場合に、該組成物を使用して受容体のこうした発現若しくはタンパク質レベルを調節し得る。
哺乳動物への投与のために、化合物、セロトニンタイプ１Ｂ、２、４および／若しくは６受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤、ポリペプチドまたはそれをコードする核酸、ならびに／あるいはその全部若しくは一部分に相補的なアンチセンス核酸は、いかなる製薬学的に許容できる担体、例えば約７．８のｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水に懸濁し得る。
有用である他の製薬学的に許容できる担体は、限定されるものでないが、グリセロール、水、生理的食塩水、エタノール、ならびにリン酸塩および有機酸の塩のような他の製薬学的に許容できる塩溶液を挙げることができる。これらおよび他の製薬学的に許容できる担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９１、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏ．、ニュージャージー）（その開示はそっくりそのまま本明細書に示されるかのように引用することにより組み込まれる）に記述されている。
製薬学的組成物は、滅菌の注入可能な水性若しくは油性懸濁剤若しくは溶液の形態で製造、包装若しくは販売してよい。この懸濁剤若しくは溶液は既知技術に従って処方してよく、そして、有効成分に加え、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤若しくは懸濁化剤のような付加的な成分を含んでよい。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水若しくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒を使用して製造してよい。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないがリンゲル液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成モノ若しくはジグリセリドのような不揮発性油を挙げることができる。
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬側、眼若しくは別の投与経路に適する製剤で投与、製造、包装および／若しくは販売してよい。他の企図される製剤は、突起付きナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球、および免疫学に基づく製剤を包含する。
本発明の組成物は、限定されるものでないが経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬側若しくは眼の投与経路を挙げることができる多数の経路を介して投与してよい。投与経路（１種若しくは複数）は当業者に容易に明らかであることができ、かつ、治療されている疾患の型および重症度、治療されている獣医学若しくはヒトの患者の型および齢などを包含するいかなる数の因子にも依存することができる。
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口の固体製剤、眼、坐剤、エアゾル剤、局所若しくは他の類似の製剤で全身に投与してよい。ヘパラン硫酸のような化合物若しくはその生物学的同等物に加え、こうした製薬学的組成物は製薬学的に許容できる担体、および薬物投与を高めかつ助長することが既知の他の成分を含有してよい。ナノ粒子、リポソーム、再封止赤血球、および免疫学に基づく系のような他の可能な製剤もまた、本発明の方法の受容体タンパク質および／若しくはそれをコードする核酸を投与するのに使用してよい。
本明細書に記述される方法のいずれかを使用して同定される化合物は、免疫系の状態（すなわち自己免疫疾患および同種移植片拒絶）の処置のため哺乳動物に処方しかつ投与してよい、を今や記述する。
本発明は、Ｔ細胞リンパ腫、自己免疫障害（下を参照されたい）、充実性臓器移植から生じる合併症、皮膚移植片拒絶、骨髄移植における対宿主性移植片病などのような広範な障害の処置に有用な化合物を含んでなる製薬学的組成物の製造および使用を包含する。
こうした製薬学的組成物は、被験体への投与に適する形態の該有効成分単独よりなり得るか、または、該製薬学的組成物は、有効成分および１種若しくはそれ以上の製薬学的に許容できる担体、１種若しくはそれ以上の付加的な成分、またはこれらの何らかの組合せを含んでよい。有効成分は、生理学的に許容できるエステルまたは当該技術分野で公知であるところの生理学的に許容できる陽イオン若しくは陰イオンと組合せのような塩の形態で製薬学的組成物中に存在してよい。
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」という用語は、有効成分をそれと組合せてよくかつ組合せ後に被験体に該有効成分を投与するのに使用し得る化学的組成物を意味している。
本明細書で使用されるところの「生理学的に許容できる」エステル若しくは塩という用語は、該組成物が投与されるべきである被験体に対し有害でない、該製薬学的組成物のいかなる他の成分とも適合性である、該有効成分のエステル若しくは塩の形態を意味している。
本明細書に記述される製薬学的組成物の製剤は、薬理学の技術分野で既知の若しくはこの後開発されるいずれの方法により製造してもよい。一般に、こうした調製方法は、有効成分を担体または１種若しくはそれ以上の他の補助成分と連合させる段階、およびその後必要な若しくは望ましい場合は該生成物を所望の単一若しくは複数用量単位に造形若しくは包装する段階を包含する。
本明細書に提供される製薬学的組成物の記述はヒトへの倫理的投与に適する製薬学的組成物に原則として向けられるとは言え、こうした組成物は一般に全部の種類の動物への投与に適することが当業者により理解されるであろう。製薬学的組成物を多様な動物への投与に適するようにするためのヒトへの投与に適する該組成物の改変は十分に理解されており、そして普通に熟練した獣医薬理学者はこうした改変を単なる通常の（あれば）実験で設計かつ実施し得る。本発明の製薬学的組成物の投与が企図されている被験体は、限定されるものでないがヒトおよび他の霊長類、蓄牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコおよびイヌのような商業的に関連する哺乳動物を包含する哺乳動物を挙げることができる。
本発明の方法で有用である製薬学的組成物は、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻内、頬側、眼、硬膜下腔若しくは別の投与経路に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。他の企図される製剤は、突起付きナノ粒子、リポソーム製剤、有効成分を含有する再封止赤血球および免疫学に基づく製剤を包含する。
本発明の製薬学的組成物は、バルクで、単一の単位用量として若しくは複数の単一単位用量として製造、包装若しくは販売してよい。本明細書で使用されるところの「単位用量」は予め決められた量の有効成分を含んでなる製薬学的組成物の個別の量である。有効成分の量は、一般に、被験体に投与されるであろう有効成分の投薬量または例えばこうした投薬量の半分若しくは１／３のようなこうした投薬量の便宜的画分に等しい。
本発明の製薬学的組成物中の有効成分、製薬学的に許容できる担体およびいかなる付加的な成分の相対量も、治療される被験体の正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、大きさおよび状態に依存してならびに該組成物が投与されるはずである経路にさらに依存して変動するであろう。例として、該組成物は０．１％と１００％（ｗ／ｗ）との間の有効成分を含んでよい。
有効成分に加え、本発明の製薬学的組成物は１種若しくはそれ以上の付加的な製薬学的有効成分をさらに含んでよい。とりわけ企図される付加的な作用物質は制吐薬、ならびにシアン化物およびシアン酸塩スカベンジャーのようなスカベンジャーを包含する。
本発明の製薬学的組成物の制御放出若しくは徐放性製剤は慣習的技術を使用して作成してよい。
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の製剤は、それぞれ予め決められた量の有効成分を含有する、限定されるものでないが錠剤、硬若しくは軟カプセル剤、カシェ剤、トローチ剤または舐剤を挙げることができる個別の固体の用量単位の形態で製造、包装若しくは販売してよい。経口投与に適する他の製剤は、限定されるものでないが、粉末または顆粒状の製剤、水性若しくは油性懸濁剤、水性若しくは油性溶液、または乳剤を挙げることができる。
本明細書で使用されるところの「油性」液体は、炭素含有液体分子を含んでなりかつ水より少なく極性の特徴を表すものである。
有効成分を含んでなる錠剤は、例えば、場合によっては１種若しくはそれ以上の付加的な成分とともに有効成分を圧縮若しくは成形することにより作成してよい。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、賦形剤、表面活性剤および分散剤の１種若しくはそれ以上と場合によっては混合される、粉末若しくは顆粒状調製物のような自由に流動する形態の有効成分を適する装置中で圧縮することにより製造してよい。成形錠剤は、有効成分、製薬学的に許容できる担体、および該混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を適する装置中で成形することにより作成してよい。錠剤の製造で使用される製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないが不活性希釈剤、顆粒化剤および崩壊剤、結合剤ならびに滑沢剤を挙げることができる。既知の分散助剤は、限定されるものでないがバレイショデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムを挙げることができる。既知の表面活性剤は限定されるものでないがラウリル硫酸ナトリウムを挙げることができる。既知の希釈剤は、限定されるものでないが炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムを挙げることができる。既知の顆粒化剤および崩壊剤は限定されるものでないがトウモロコシデンプンおよびアルギン酸を挙げることができる。既知の結合剤は、限定されるものでないがゼラチン、アラビアゴム、糊化済トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースを挙げることができる。既知の滑沢剤は限定されるものでないがステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクを挙げることができる。
錠剤はコーティングしなくてもよいか、若しくはそれらは被験体の胃腸管中での遅延崩壊を達成してそれにより有効成分の持続性の放出および吸収を提供するための既知の方法を使用してコーティングしてよい。例として、グリセリルモノステアレート若しくはグリセリルジステアレートのような物質を使用して錠剤をコーティングしてよい。さらに例として、錠剤は、米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６０，４５２号；および同第４，２６５，８７４号明細書に記述される方法を使用してコーティングして浸透圧制御放出錠剤を形成してもよい。錠剤は、製薬学的に洗練されかつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、着香料、着色剤、保存剤若しくはこれらの何らかの組合せをさらに含んでもよい。
有効成分を含んでなる硬カプセル剤はゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成してよい。こうした硬カプセル剤は有効成分を含んでなり、そして例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンのような不活性の固体の希釈剤を包含する付加的な成分をさらに含んでもよい。
有効成分を含んでなる軟ゼラチンカプセル剤はゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物を使用して作成してよい。こうした軟カプセル剤は、水またはラッカセイ油、流動パラフィン若しくはオリーブ油のような油媒体と混合されていてもよい有効成分を含んでなる。
経口投与に適する本発明の製薬学的組成物の液体製剤は、液体の形態で、または使用前に水若しくは別の適するベヒクルとの再構成に意図された乾燥生成物の形態でのいずれかで製造、包装かつ販売してよい。
液体懸濁剤は、水性若しくは油性ベヒクル中の有効成分の懸濁の慣習的達成方法を使用して製造してよい。水性ベヒクルは例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性ベヒクルは、例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油、分画植物油および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。液体懸濁剤は、限定されるものでないが懸濁化剤、分散助剤若しくは湿潤剤、乳化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、着香料、着色剤および甘味料を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分をさらに含んでもよい。油性懸濁剤は増粘剤をさらに含んでもよい。既知の懸濁化剤は、限定されるものでないがソルビトールシロップ、硬化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アラビアゴム、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース誘導体を挙げることができる。既知の分散助剤若しくは湿潤剤は、限定されるものでないがレシチンのような天然に存在するホスファチド、脂肪酸、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸およびへキシトール由来の部分エステル、若しくは脂肪酸およびへキシトール無水物由来の部分エステルとのアルキレンオキシドの縮合生成物（例えばそれぞれポリオキシエチレンステアレート、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を挙げることができる。既知の乳化剤は限定されるものでないがレシチンおよびアラビアゴムを挙げることができる。既知の保存剤は、限定されるものでないがパラヒドロキシ安息香酸メチル、エチル若しくはｎ−プロピル、アスコルビン酸およびソルビン酸を挙げることができる。既知の甘味料は例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ショ糖およびサッカリンを包含する。油性懸濁剤のための既知の増粘剤は例えばミツロウ、固形パラフィンおよびセチルアルコールを包含する。
水性若しくは油性溶媒中の有効成分の液体溶液は液体懸濁剤と実質的に同一の様式で製造してよく、主な差異は有効成分が溶媒に懸濁されるよりはむしろ溶解されることである。本発明の製薬学的組成物の液体溶液は液体懸濁剤に関して記述された化合物のそれぞれを含んでよく、懸濁化剤は溶媒中での有効成分の溶解を必ずしも補助するものではないことが理解される。水性溶媒は例えば水および等張の生理的食塩水を包含する。油性溶媒は例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはヤシ油のような植物油、分画植物油および流動パラフィンのような鉱物油を包含する。
本発明の製薬学的製剤の粉末および顆粒状製剤は既知の方法を使用して製造してよい。こうした製剤を被験体に直接投与してよく、例えば錠剤を形成するため、カプセルを充填するため、またはそれへの水性若しくは油性ベヒクルの添加により水性若しくは油性の懸濁剤若しくは溶液を製造するために使用してよい。これらの製剤のそれぞれは、分散助剤若しくは湿潤剤、懸濁化剤および保存剤の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。増量剤および甘味料、着香料若しくは着色剤のような付加的な賦形剤もまたこれらの製剤中に包含してよい。
本発明の製薬学的組成物は水中油型乳剤若しくは油中水型乳剤の形態で製造、包装若しくは販売してもまたよい。油相はオリーブ油若しくはラッカセイ油のような植物油、流動パラフィンのような鉱物油、またはこれらの組合せであってよい。こうした組成物は、アラビアゴム若しくはトラガカントガムのような天然に存在するガム、ダイズ若しくはレシチンホスファチドのような天然に存在するホスファチド、ソルビタンモノオレエートのような脂肪酸およびへキシトール無水物の組合せ由来のエステル若しくは部分エステル、ならびにポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキシドとのこうした部分エステルの縮合生成物のような１種若しくはそれ以上の乳化剤をさらに含んでもよい。これらの乳剤はまた、例えば甘味料若しくは着香料を包含する付加的な成分も含有してよい。
本発明の製薬学的組成物は直腸投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした組成物は例えば坐剤、保持浣腸製剤および直腸若しくは結腸灌注のための溶液の形態にあってよい。
坐剤製剤は、通常の室温（すなわち約２０℃）で固体でありかつ被験体の直腸温（すなわち健康なヒトで約３７℃）で液体である非刺激性の製薬学的に許容できる賦形剤と有効成分を組合せることにより作製してよい。適する製薬学的に許容できる賦形剤は、限定されるものでないがカカオバター、ポリエチレングリコールおよび多様なグリセリドを挙げることができる。坐剤製剤は限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的な成分をさらに含んでもよい。
保持浣腸製剤または直腸若しくは結腸灌注のための溶液は、製薬学的に許容できる液体担体と有効成分を組合せることにより作成してよい。当該技術分野で公知であるとおり、浣腸製剤は被験体の直腸の解剖学に適合された送達装置を使用して投与してよく、また、それ内に包装してよい。浣腸製剤は限定されるものでないが抗酸化剤および保存剤を挙げることができる多様な付加的な成分をさらに含んでもよい。
本発明の製薬学的組成物は膣投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした組成物は例えば坐剤、含浸若しくは被覆されたタンポンのような膣に挿入可能な物質、灌注製剤、またはゲル剤若しくはクリーム剤あるいは膣灌注のための溶液の形態にあってよい。
化学的組成物での物質の含浸若しくは被覆方法は当該技術分野で既知であり、そして、限定されるものでないが、その後の乾燥を伴う若しくは伴わない、表面上への化学的組成物の堆積若しくは結合方法、物質の合成の間の物質の構造中への化学的組成物の組込み方法（すなわち生理学的に分解可能な物質を用いるような）、および吸収素材中への水性若しくは油性の溶液若しくは懸濁液の吸収方法を挙げることができる。
膣灌注のための灌注製剤若しくは溶液は、製薬学的に許容できる液体担体と有効成分を組合せることにより作成してよい。当該技術分野で公知であるとおり、灌注製剤は、被験体の膣の解剖学に適応された送達装置を使用して投与してよく、また、それ内に包装してよい。灌注製剤は限定されるものでないが抗酸化剤、抗生物質、抗真菌薬および保存剤を挙げることができる多様な付加的な成分をさらに含んでもよい。
本明細書で使用されるところの製薬学的組成物の「非経口投与」は、被験体の組織の物理的断裂および組織中の該断裂を通る製薬学的組成物の投与を特徴とするいかなる投与経路も包含する。非経口投与は、従って、限定されるものでないが組成物の注入、外科的創を通る組成物の適用、組織浸透性の非外科的創傷を通る組成物の適用などによる製薬学的組成物の投与を挙げることができる。とりわけ、非経口投与は、限定されるものでないが皮下、腹腔内、筋肉内、胸骨内注入、および腎透析注入技術を挙げることができることを企図している。
非経口投与に適する製薬学的組成物の製剤は、滅菌水若しくは滅菌の等張の生理的食塩水のような製薬学的に許容できる担体と組合せられた有効成分を含んでなる。こうした製剤は、ボーラス投与若しくは連続投与に適する形態で製造、包装若しくは販売してよい。注入可能な製剤は、アンプル若しくは保存剤を含有する複数用量の容器中のような単位投与剤形で製造、包装若しくは販売してよい。非経口投与のための製剤は、限定されるものでないが油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、パスタ剤、および埋込可能な徐放性若しくは生物分解性の製剤を挙げることができる。こうした製剤は、限定されるものでないが懸濁化剤、安定剤若しくは分散助剤を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分をさらに含んでよい。非経口投与のための製剤の一態様において、有効成分は、再構成された組成物の非経口投与前に適するベヒクル（例えば滅菌の発熱性物質を含まない水）との再構成のための乾燥した（すなわち粉末若しくは顆粒状の）形態で提供される。
製薬学的組成物は滅菌の注入可能な水性若しくは油性の懸濁剤若しくは溶液の形態で製造、包装若しくは販売してよい。この懸濁剤若しくは溶液は既知技術に従って処方してよく、そして、有効成分に加え、本明細書に記述される分散助剤、湿潤剤若しくは懸濁化剤のような付加的な成分を含んでよい。こうした滅菌の注入可能な製剤は、例えば水若しくは１，３−ブタンジオールのような非毒性の非経口で許容できる希釈剤若しくは溶媒を使用して製造してよい。他の許容できる希釈剤および溶媒は、限定されるものでないがリンゲル液、等張の塩化ナトリウム溶液、および合成のモノ若しくはジグリセリドのような不揮発性油を挙げることができる。有用である他の非経口で投与可能な製剤は、微晶質の形態で、リポソーム製剤中に、若しくは生物分解性のポリマー系の一成分として有効成分を含んでなるものを包含する。持続放出若しくは埋込のための組成物は乳剤、イオン交換樹脂、わずかに溶解性のポリマー若しくはわずかに溶解性の塩のような製薬学的に許容できるポリマー性若しくは疎水性物質を含んでよい。
局所投与に適する製剤は、限定されるものでないが、リニメント剤、ローション剤のような液体若しくは半液体製剤、クリーム剤、軟膏剤若しくはパスタ剤のような水中油型若しくは油中水型乳剤、および溶液または懸濁剤を挙げることができる。局所で投与可能な製剤は例えば約１％から約１０％（ｗ／ｗ）までの有効成分を含んでよいが、とは言え有効成分の濃度は溶媒中の有効成分の溶解性の限界くらい高くてもよい。局所投与のための製剤は本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。
本発明の製薬学的組成物は頬腔を介する肺投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした製剤は、有効成分を含んでなりかつ約０．５から約７ナノメートルまで、および好ましくは約１から約６ナノメートルまでの範囲の直径を有する乾燥粒子を含んでよい。こうした組成物は、便宜的に、噴射剤の流れが粉末を分散するように向けられてよい乾燥粉末液溜めを含んでなる装置を使用する、または封止容器中の低沸点噴射剤に溶解若しくは懸濁された有効成分を含んでなる装置のような自己噴射性製溶媒／粉末分注容器を使用する投与のための乾燥粉末の形態にある。好ましくは、こうした粉末は、粒子重量の最低９８％が０．５ナノメートルより大きい直径を有しかつ粒子数の最低９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含んでなる。より好ましくは、粒子重量の最低９５％が１ナノメートルより大きい直径を有しかつ粒子数の最低９０％が６ナノメートルより小さい直径を有する。乾燥粉末組成物は、好ましくは糖のような固体の微細な粉末希釈剤を包含しかつ単位投与剤形で便宜的に提供される。
低沸点噴射剤は一般に大気圧で６５°Ｆより下の沸点を有する液体噴射剤を包含する。一般に、噴射剤は組成物の５０ないし９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し、そして有効成分は組成物の０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）を構成してよい。噴射剤は、液体の非イオン性若しくは固体の陰イオン性界面活性剤または固体の希釈剤（好ましくは有効成分を含んでなる粒子と同一の次数の粒子径を有する）のような付加的な成分をさらに含んでもよい。
肺送達のため処方される本発明の製薬学的組成物は溶液若しくは懸濁液の液滴の形態の有効成分もまた提供してもよい。こうした製剤は、有効成分を含んでなる場合によっては滅菌の水性若しくは希薄アルコール性の溶液若しくは懸濁剤として製造、包装若しくは販売してよく、そして、便宜的には、いかなる噴霧化（ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ）若しくは噴霧化（ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ）装置を使用して投与してもよい。こうした製剤は、限定されるものでないがサッカリンナトリウム、揮発性油のような着香料、緩衝剤、表面活性剤、若しくはヒドロキシ安息香酸メチルのような保存剤を挙げることができる１種若しくはそれ以上の付加的な成分をさらに含んでもよい。本投与経路により提供される液滴は、好ましくは約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均直径を有する。
肺送達に有用であるとして本明細書に記述される製剤はまた、本発明の製薬学的組成物の鼻内送達にも有用である。
鼻内投与に適する別の製剤は、有効成分を含んでなりかつ約０．２から５００マイクロメートルまでの平均粒子を有する粗い散剤である。こうした製剤は嗅剤が服用される様式で、すなわち鼻孔近くに保持された散剤の容器からの鼻通路を通る急速な吸入により投与する。
鼻投与に適する製剤は、例えば約０．１％（ｗ／ｗ）および約１００％（ｗ／ｗ）の有効成分からを含んでよく、そして、本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。
本発明の製薬学的組成物は頬側投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした製剤は、例えば慣習的方法を使用して作成される錠剤若しくは舐剤の形態にあってよく、かつ、例えば０．１ないし２０％（ｗ／ｗ）の有効成分よく、該均衡は経口で溶解可能な若しくは分解可能な組成物および場合によっては本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上を含んでなる。あるいは、頬側投与に適する製剤は、有効成分を含んでなる散剤、またはエアゾル化若しくは噴霧化される溶液若しくは懸濁剤を含んでよい。こうした粉末状、エアゾル化若しくはエアゾル化される製剤は、分散される場合に好ましくは約０．１から約２００ナノメートルまでの範囲の平均の粒子若しくは液滴の大きさを有し、また、本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上をさらに含んでもよい。
本発明の製薬学的組成物は眼投与に適する製剤で製造、包装若しくは販売してよい。こうした製剤は例えば、例えば水性若しくは油性の液体担体中の有効成分の０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）の溶液若しくは懸濁剤を包含する点眼剤の形態にあってよい。こうした滴剤は緩衝剤、塩、または本明細書に記述される付加的な成分の１種若しくはそれ以上の他者をさらに含んでもよい。有用である他の眼で投与可能な製剤は、微晶質の形態の若しくはリポソーム製剤中に有効成分を含んでなるものを包含する。
本明細書で使用されるところの「付加的な成分」は、限定されるものでないが以下すなわち賦形剤；表面活性剤；分散助剤；不活性希釈剤；顆粒化剤および崩壊剤；結合剤；滑沢剤；甘味料；着香料；着色剤；保存剤；ゼラチンのような生理学的に分解可能な組成物；水性ベヒクルおよび溶媒；油性ベヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散助剤若しくは湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；増量剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌薬；安定剤；ならびに製薬学的に許容できるポリマー性若しくは疎水性物質の１種若しくはそれ以上を挙げることができる。本発明の製薬学的組成物に包含されうる他の「付加的な成分」は当該技術分野で既知でありかつ例えばＧｅｎａｒｏ編（１９８５、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、フィラデルフィア州イーストン）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されている。
典型的には、動物、好ましくはヒトに投与してよい本発明の化合物の投薬量は、限定されるものでないが治療されている動物の型および疾患状態の型、動物の齢ならびに投与経路を挙げることができるいかなる数の因子にも依存して変動することができる。
該化合物は１日数回程度頻繁に動物に投与し得るか、あるいは、それは１日１回、週１回、２週ごとに１回、月１回のようにより少なく頻繁に、あるいは数ヶ月ごとに１回、または年１回若しくはより少なくさえのようななおより少なく頻繁に投与してよい。投与の頻度は当業者に容易に明らかであることができ、かつ、限定されるものでないが、治療されている疾患の型および重症度、動物の型および齢などを挙げることができるいかなる数の因子にも依存することができる。好ましくは、化合物は注入後少なくとも１日間持続する効果を提供するボーラス注入として投与されるがしかしそうである必要はない。ボーラス注入は腹腔内に提供し得る。
当業者は、Ｔ細胞応答の確立を予防することにより、本発明の方法が二次的応答の阻害方法もまた提供することを理解するであろう。初期応答を阻止する若しくは低下させることにより二次的応答の産生もまた阻害されるからである。
同様に、当業者は、細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を細胞が必要とする、細胞により媒介される疾患の治療方法を本発明が包含することを認識するであろう。これは、本明細書の別の場所により完全に示されるとおり、ある種の細胞は、シグナルの阻害がそうでなければその細胞により媒介されるであろうある種の過程を阻害するようなセロトニンシグナルを必要とするからである。細胞がセロトニンシグナルを受領することを必要とする疾患、障害若しくは状態に細胞が関与、それらと関連若しくはそれらを媒介する場合、該シグナルの阻害は、こうした疾患、障害若しくは状態における該細胞の参画を阻害する。こうした状態、障害および疾患は本明細書の別の場所に示されている。
本質的に、当該技術分野で公知の方法ならびに／または本明細書の別の場所に開示かつ／若しくは例示されているような方法を使用して、疾患、障害若しくは状態がセロトニンタイプ１Ｂ、２、４若しくは６受容体を介するセロトニンシグナル伝達を必要とする細胞により媒介されていることが一旦決定されれば、こうしたシグナル伝達は多様な方法により阻害し得、そして、該疾患、障害若しくは状態はそれにより治療かつ／若しくは軽減され得る。必須のセロトニンシグナル伝達が一旦阻害されれば、該細胞はもはや該疾患、障害若しくは状態を媒介せず、それによりその疾患、障害若しくは状態を治療かつ／若しくは軽減する。本発明の方法により治療し得る疾患は、限定されるものでないが重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症を挙げることができる。
従って、本発明は、自己抗原および／または移植された細胞若しくは組織上に存在する非自己抗原のいずれかに対する異常なすなわち増大された免疫応答により媒介される自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶の処置若しくは予防方法を包含する。さらに、例えば応答を媒介する細胞におけるセロトニンシグナル伝達を阻害することにより初期免疫応答を予防することにより、本発明は続いて起こりうるいかなる二次的応答もまた阻止する。
従って、当業者は、本明細書に提供される教示を一旦装備すれば、本発明がセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなるボーラスの投与を包含することを認識するであろう。より好ましくは、該受容体は５ＨＴ１Ｂ受容体でありかつ阻害剤はフルフェナジンである。いずれかの特定の論理により束縛されることを願わず、ボーラス用量の投与は、阻害剤の反復される投与が必要でないように、とりわけ、活性化されたＴ細胞若しくは癌性Ｂ細胞（例えば多発性骨髄腫細胞のような）のようなある種の細胞のアポトーシスを媒介し得る。移植された細胞若しくは組織がそうでなければ拒絶されることを引き起こしたであろう免疫応答をそうでなければ媒介するであろうメモリー若しくは他の細胞の死を該ボーラスが媒介するからである。この効果は５ＨＴＲ１Ｂ受容体でのフルフェナジンの局在化された濃度により媒介され得、この濃度はセロトニンシグナルの伝達を阻害してそれにより細胞死および／若しくは該細胞による免疫応答の阻害を媒介するのに十分である。
加えて、本発明は、二次的免疫応答が既に確立されたようになっている疾患の処置を包含する。これは、全部でない場合は大部分の自己免疫疾患が慢性状態であるからである。大部分の自己免疫疾患の病因は不十分に理解されているとは言え、ＣＤ４＋メモリーヘルパーＴ細胞および／若しくはＣＤ８＋メモリー細胞傷害性Ｔ細胞が関与していることが明らかである。これらの二次的Ｔ細胞は異なる細胞マーカーを有し、そして一次Ｔ細胞がすると質的に異なる様式で挙動する（総説については、Ｄｕｔｔｏｎら、１９９８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２０１−２２３を参照されたい）。従って、本発明は、細胞上のセロトニンタイプ２受容体の活性化により活性化が媒介される哺乳動物中の免疫細胞の活性化の阻害方法を包含する。該方法は、有効量のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を投与することを含んでなる。これは、本明細を通じて示されるとおり、免疫細胞（例えばＴ細胞）上のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用の阻害が免疫細胞の活性化を予防してそれにより該細胞による免疫応答を阻害するからである。
本発明の方法により治療し得る自己免疫疾患は、限定されるものでないが重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症を挙げることができる。
本発明はさらに、哺乳動物における二次的免疫応答の阻害方法を包含する。該方法は、有効量のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を投与することを含んでなる。これは、本明細書の別の場所に開示されるとおり、セロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用がとりわけセロトニンタイプ２受容体アンタゴニストにより阻害される場合は、一次および二次的双方の免疫応答が阻害されるからである。すなわち、本発明は、免疫細胞上のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用を阻害することが免疫応答を予防若しくは阻害することを初めて示す。従って、本発明は、セロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用を介するＴ細胞活性化により媒介される極めて多量の自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶の処置のための新規特異的免疫調節療法を提供する。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が劇症ＡＩＤＳを伴う患者を治療することを包含することを認識するであろう。これは、該疾患のこの最終期の間に、患者のＣＤ４細胞数が非常に低くなりかつ該人は一般に日和見感染により死につつあるからである。残存するＣＤ４細胞を見る場合、高度に異常な何かを見出す。すなわち残存するＣＣＤ４細胞の約５０％が活性化されている。これは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がそれ自身の複製を経験するためにＴ細胞の活発な増殖を必要とするからである。本明細書に開示されるデータに基づき、かつ、いずれかの特定の論理により束縛されることを願わず、該増殖は、ＡＩＤＳの終末段階ででさえ、セロトニンタイプ２受容体により媒介されるセロトニンシグナルを必要とすることがありそうである。細胞数および本明細書に開示される他のデータにより示されるとおり、５ＨＴ ２Ｃシグナルを遮断することが明らかに細胞死を誘導するため、その場合は例えばサンセルト（Ｓａｎｓｅｒｔ）のボーラス投与を終末段階の患者に投与し得る。従って、活性化されたＣＤ４細胞の誘発されたアポトーシスにより、ウイルスの貯蔵庫は該患者を効果的に排除されてそれにより感染していないＣＤ４細胞の再生を潜在的に可能にしかつ従って回復を達成し得る。
Ｂ．有用な化合物の同定方法
本発明は、セロトニンファミリー受容体とのセロトニンの相互作用を阻害する化合物の同定方法を包含する。当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、該化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞における同一のパラメータ（１種若しくは複数）と比較した場合にとりわけＴ細胞の活性化などを評価することにより、セロトニンおよびセロトニンファミリー受容体の相互作用のレベルを評価することを実施し得ることを認識するであろう。当業者は、こうした化合物が、セロトニン受容体とのセロトニンの相互作用により媒介されかつ／若しくはそれと関連する疾患、障害若しくは状態を阻害するために有用であり得ることを理解するであろう。当業者はさらに、本明細書に提供される開示に基づき、影響を及ぼされない他のセロトニン受容体型とのセロトニンの相互作用を残しつつセロトニンと特定のサブタイプ（１種若しくは複数）のセロトニン受容体との間の相互作用を減少させることが有用であるかもしれないことを認識するであろう。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が、哺乳動物における自己免疫疾患若しくは同種異系移植応答を治療するのに有用な化合物の同定方法を包含することを理解するであろう。該方法は、セロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの相互作用を阻害する物質若しくは化合物を同定することを含んでなる。これは、本明細書の別の場所に開示されるとおり、セロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの相互作用を阻害することが免疫細胞の活性化を阻害してそれにより免疫応答を阻害することが発見されたからである。従って、本発明の教示を装備した当業者は、こうした相互作用を阻害する化合物が、セロトニン／受容体の相互作用によりそうでなければ媒介される自己免疫疾患若しくは同種異系移植片応答を治療するための有用な潜在的治療薬であることを認識するであろう。
該方法は、セロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体を試験化合物と接触させること、ならびに、そのセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの結合のレベルを、試験化合物と接触されていないそれ以外は同一のセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの結合のレベルと比較することを含んでなる。当業者は、該化合物と接触されていないそれ以外は同一のセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの結合のレベルと比較して該化合物と接触された該受容体とのセロトニンの結合のより低いレベルが、該化合物がセロトニン／受容体の相互作用を阻害することの表示であり、そして従って哺乳動物における自己免疫疾患若しくは同種異系移植片応答を治療するのに有用であることを理解するであろう。当業者はまた、本明細書に提供される開示を鑑み、当該技術分野で既知の標準的結合アッセイ若しくは将来開発されるべきものを使用して、試験化合物の存在若しくは非存在下でセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの結合を評価して有用な化合物を同定し得ることも認識するであろう。従って、本発明は、本方法を使用して同定されるいかなる化合物も包含する。
本発明はまた、該化合物が血液脳関門に関してのその浸透性についてもまた選択される、本明細書の別の場所に以前に記述されたところのセロトニンシグナル伝達を阻害する化合物を同定することも包含する。より具体的には、本発明は、本発明の方法を使用して同定されるいかなる化合物も血液脳関門に関する化合物の浸透性を決定するためのアッセイにかけることを包含する。血液脳関門を横断する化合物の能力の評価方法は、本明細書に開示され、当該技術分野で公知でありかつ将来開発されるべき方法もまた包含する。従って、本発明は、目的の化合物の血液脳関門を横断する能力を評価すること、およびその後それを実質的に横断しない化合物を選択することを包含する。本化合物は、本明細書の別の場所に以前により完全に論考されたとおり、神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達に検出可能に影響を及ぼさない一方で非神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達を阻害することがときに望ましいかもしれないため、有用である。神経細胞への接近は血液脳関門により阻害されるため、該関門を横断しない阻害剤を使用して、神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達を少なくとも部分的に影響を及ぼされないままにしつつ目的の細胞におけるセロトニンシグナル伝達を阻害し得る。
加えて、本発明は、本明細書の別の場所に開示される方法のいずれかにより同定される有用な化合物を改変してそれにより該化合物の血液脳関門を横断する能力を低下させることを包含する。再度、これは、血液脳関門を実質的に横断しない化合物を、血液脳関門により保護されている神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達を影響を及ぼされないままにしつつ例えば免疫細胞におけるセロトニンシグナル伝達を阻害するのに使用し得るため、有用である。血液脳関門に関するその浸透性に影響を及ぼすような化合物の改変方法は当該技術分野で公知であり、本明細書で例示され、かつ、本明細書に提供される開示を一旦装備すれば当業者により理解されるであろうところの将来開発されるような方法もまた包含する。
本発明はまた、Ｔ細胞上のセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの結合により活性化が媒介されるＴ細胞の活性化を阻害するのに有用な化合物の同定方法も包含する。より具体的には、該方法は、試験化合物と接触させたＴ細胞の活性化状態を評価すること、および、Ｔ細胞の活性化のレベルを該化合物と接触されないそれ以外は同一のＴ細胞の活性化のレベルと比較することを含んでなる。該化合物と接触されないそれ以外は同一のＴ細胞の活性化のレベルと比較して該化合物と接触させたＴ細胞の活性化のより低いレベルは、該化合物がＴ細胞の活性化を阻害するのに有用であることの指標となる。これは、Ｔ細胞活性化が、Ｔ細胞の表面上のセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの相互作用を必要とし、その結果、活性化はセロトニン／受容体の相互作用が阻害される場合に阻害されてそれにより該細胞による免疫応答を阻害することを本発明が初めて開示するからである。明らかに、本明細書の別の場所で示されるとおり、Ｔ細胞上のセロトニンタイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４および６受容体とのセロトニンの相互作用を阻害する化合物は、自己免疫疾患および同種移植片拒絶の処置に有用な重要な潜在的治療化合物である。
再度、本発明は、血液脳関門を横断する化合物の能力をさらに評価することを包含し、その結果、所望の阻害効果を有しかつ血液脳関門を実質的に横断しない化合物を同定かつ／若しくは製造し得る。
セロトニンファミリー受容体に拮抗する化合物（すなわち受容体結合を阻害する化合物）の一例はＳＢ ２０６５５３であり、その構造はＦｏｒｂｅｓら、１９９３、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１１０４−１１０７）に示されている。本明細書に提供されるデータ中に提示されるとおり、該免疫応答は該受容体を発現するリンパ球への本アンタゴニストの投与で効果的に阻害される。当業者は、ＳＢ ２０６５５３のようなアンタゴニストが、自己免疫疾患若しくは高められた免疫応答が患者に対し有害である他の疾患を治療するためにセロトニンファミリー受容体結合を阻害することによる免疫応答の媒介において有用であろうことを認識するであろう：
Figure 2005538065
本化合物の特性はＦｏｒｂｅｓら、１９９６、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４９６６−４９７７により記述されかつ下に示されるところの多様な位置（Ｒ）により示される位置に対する改変により変えられかつ改良され得ることもまた理解される：
Figure 2005538065
本構造のなお別の態様において、より良好な効力を有するがしかし有効な経口活性を欠くエーテル含有誘導体がＦｏｒｂｅｓら（１９９６、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：４９６６−４９７７）により記述されている。本誘導体の構造を下に描く：
Figure 2005538065
加えて、本発明は、フルフェナジンの新規誘導体、とりわけ例えばＱＳＳ−１、ＱＳＳ−３、ＱＳＳ−５、ＱＳＳ−６およびＱＳＳ−１２を包含し、それらの構造はとりわけ図３９、４２および４４に提供される。
さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、下の実施例で開示されるとおり、内因性のセロトニン受容体発現を欠く細胞を、該受容体をコードする単離された核酸を含んでなるベクターでトランスフェクトしてそれにより該受容体の発現が該細胞中で遂げられ得ることを認識するであろう。該トランスフェクトされた細胞をその後、試験化合物と接触させ、それにより該試験化合物がセロトニン受容体との相互作用に影響を及ぼすかどうかの決定を可能にする。従って、本発明を装備された当業者は、受容体を発現するベクターを使用して検出可能なレベルの受容体を欠く細胞を選択的にトランスフェクトすることにより、セロトニン／受容体結合に選択的に影響を及ぼす化合物を同定することが可能であろう。
加えて、本発明は、セロトニン受容体を介するシグナル伝達を阻害する化合物についてのアッセイを包含し、ここでこうしたアッセイは細胞の物理的および／若しくは形態学的特徴（１種若しくは複数）の変化の検出に基づく。すなわち、本明細書に提供される開示に基づき、当業者は、セロトニンシグナル伝達の阻害が細胞中の検出可能な変化を媒介若しくはそれと関連することを認識するであろう。より具体的には、本明細書の別の場所に開示されるデータにより示されるとおり、細胞におけるセロトニン作動性シグナルを阻害することは細胞の大きさの増大および／若しくは形態学を媒介し、かつ、アポトーシス、細胞死および／若しくは壊死と関連する細胞の特徴の検出を媒介する。こうした変化は、限定されるものでないが顕微鏡検査（電子、光学など）、密度、形態学などを評価するいずれかの技術を挙げることができるきわめて多量の技術を使用して容易に検出かつ定量し得る。また、これらのアッセイ方法の全部は、将来開発されるべき方法がそうであるように本発明に包含される。
本明細書に開示される方法は、細胞中のセロトニン作動性のシグナル伝達を阻害するそれらの能力についての物質の迅速スクリーニングを可能にし、それらの化合物は、セロトニン作動性のシグナル伝達を阻害することが、限定されるものでないがうつ、嘔吐など、および本明細書の別の場所により完全に示されるところの限定されるものでないが自己免疫疾患、多発性骨髄腫、閉塞性気道疾患（例えば喘息）、同種異系移植片拒絶などを挙げることができる中枢神経系と関連しない疾患、障害若しくは状態を治療するのに有用な化合物の開発を挙げることができる治療的利益を提供する方法での使用のための重要な潜在的治療薬である。
Ｃ．Ｔ細胞上の異常なセロトニンタイプ２受容体により媒介される哺乳動物における疾患、障害若しくは状態の治療若しくは軽減方法
本発明は、セロトニンファミリー受容体の異常なすなわち異常発現（ｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）により媒介される疾患、障害若しくは状態の軽減方法を包含する。疾患、障害若しくは状態がセロトニン受容体の過剰若しくは過小発現と関連している場合、該方法は、それ以外は同一であるがしかし正常な組織、すなわち治療若しくは軽減されている疾患、障害若しくは状態に関連するいかなる検出可能な臨床パラメータも表さない組織中での受容体発現のレベルに比較して増大された受容体発現により媒介される疾患、障害若しくは状態に苦しめられている患者に適切な受容体をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を投与することを含んでなる。これは順に受容体発現の低下を媒介してそれにより受容体の異常発現により媒介される疾患、障害若しくは状態を軽減する。こうした疾患、障害若しくは状態は、限定されるものでないが重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症を挙げることができる。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が５ＨＴ受容体の過剰発現若しくは過小発現と関連する若しくはそれらにより媒介される状態を治療することを包含することを認識するであろう。当業者は、こうした処置が、限定されるものでないがとりわけ５ＨＴタイプ１Ａ受容体を過小発現する患者を治療することを挙げることができることを認識するであろう。これは、受容体刺激が５ＨＴタイプ６受容体のアップレギュレーションシグナルと競合する低下されたｃＡＭＰシグナルを引き起こすからである。従って、該状態は、とりわけ５ＨＴタイプ６受容体に対するアンチセンスを使用して細胞中での５ＨＴ ６受容体の発現を低下させて２種の受容体のシグナルの間の均衡を媒介してそれにより患者の状態を治療することにより治療し得る。
加えて、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明がセロトニンファミリー受容体の増大若しくは減少された発現により媒介される疾患の治療方法を包含することを理解するであろう。これは、増大若しくは低下されたレベルのセロトニン受容体発現と関連する／それらにより媒介される、ある種の疾患、障害若しくは状態が存在することを、本明細書に開示されるデータが示すからである。本明細書に開示されるデータは、５−ＨＴ２Ｂ／２Ｃ特異的アンタゴニストでセロトニンファミリー受容体の発現に拮抗することが免疫応答を阻害し、その結果リンパ球がさらに増殖しないことを示す。この阻害は、自己免疫疾患の処置、ならびに高められた免疫応答を伴う他の疾患の処置において有用である。従って、受容体発現を低下させること若しくは受容体結合を阻害することは、受容体の増大されたレベルと関連する若しくはそれにより媒介される状態を治療し得る。従って、セロトニンファミリー受容体のレベルを低下させる化合物の同定方法は、受容体の増大された発現と関連する疾患、障害若しくは状態を治療かつ／若しくは軽減するために有用である。
セロトニンファミリー受容体の発現を阻害するアンチセンス核酸は、従って、疾患、障害若しくは状態に苦しめられていない細胞および／若しくは患者における受容体の発現と比較した場合に受容体の増大された発現により媒介される該疾患、障害若しくは状態の処置のための医薬の製造にもまた使用し得る。
細胞中の核酸の発現を阻害するための技術は当該技術分野で公知でありかつ本明細書に開示されるような方法（例えば抗体、アンチセンス核酸、リボザイムなどを使用する阻害）を包含する。セロトニンファミリー受容体をコードする核酸の発現を阻害するのに有用な他の技術は、限定されるものでないが、受容体プロモーターの特定の配列を標的とするヌクレオチド試薬を使用することなどを挙げることができる。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、活性化されたＴ細胞上に存在するセロトニンタイプ２受容体の核酸発現を、該細胞中での該受容体をコードする核酸の発現を予防する核酸を使用して阻害若しくは阻止し得ることを理解するであろう。本明細書の別の場所により完全に示されるとおり、セロトニン受容体の核酸およびアミノ酸配列が一旦知られれば、当該技術分野で公知の多様な方法を使用して細胞表面上の該受容体の発現を阻害し得る。こうした方法は、限定されるものでないが抗体、リボザイムおよびアンチセンス分子を挙げることができる。こうした化合物の設計および使用は、当業者が受容体の治療標的をコードする核酸の配列を一旦装備すれば十分に確立され、そして、こうした方法は従ってそれらが当該技術分野で公知であるために本明細書で列挙されない。例えば、アンチセンス分子およびリボザイムを設計することは、必要とされうる他のセロトニンファミリー受容体の発現に影響を及ぼすことなくセロトニンタイプ２受容体の発現を阻害してそれにより必要とされうる他のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用を非特異的に阻害することのいかなる有害な影響も回避することにより、Ｔ細胞活性化を効果的に阻害し得る。
受容体タンパク質の発現、該ポリペプチドのレベル若しくはその活性が増大されようと減少されようと、当業者は、本開示に基づき、受容体発現の低下若しくは誘導方法が該受容体を発現するか若しくはその発現を欠くかのいずれかである組換え細胞を投与することを包含することを認識するであろう。
本発明の別の態様において、受容体発現と関連する若しくはそれにより媒介される免疫学に基づく疾患、障害若しくは状態に罹っている個体は、受容体発現を欠く細胞で不完全な細胞を補充、増強かつ／若しくは置換することにより治療し得る。細胞は、正常の同系のマッチさせたドナーから得た細胞若しくは治療されるべき個体から得た細胞由来であり得る。細胞は受容体発現を阻害するように遺伝子的に改変してよい。
修復された細胞若しくはマッチさせたドナーからの正常細胞で不完全な細胞を置換することに加え、本発明の方法はまた、動物中で分泌される場合に有益な効果を有する所望のタンパク質の発現を助長するのにも使用してよい。すなわち、細胞を単離し、セロトニンファミリー受容体をコードする遺伝子を供給し、そしてドナー若しくは同系のマッチさせたレシピエントに導入してよい。受容体の発現は治療効果を発揮する。
本発明の本局面は、治療量のセロトニンファミリー受容体を個体に投与する遺伝子治療に関する。
本発明のいくつかの局面において、本発明のセロトニンファミリー受容体をコードする核酸、アンチセンス核酸若しくはノックアウトターゲッティングベクターのいずれかでトランスフェクトした組換え細胞を、セロトニンファミリー受容体の発現若しくはその欠如を特徴とする疾患、障害若しくは状態を治療するための細胞治療薬として使用し得る。
本発明により、本発明のヌクレオチド配列を含んでなる遺伝子構築物を細胞中に導入する。すなわち、本明細書で「組換え細胞」と称される細胞を、セロトニンファミリー受容体をコードする核酸、若しくは該組換え細胞によりこうした受容体発現を阻害してそれにより該組換え細胞が投与されるレシピエントに対する有益な効果を媒介する核酸を導入するように遺伝子的に変える。本発明のいくつかの局面により、治療されるべき同一の個体、若しくは別の個体、または非ヒト動物から得た細胞を、不完全な遺伝子を置換しかつ／若しくはその発現が個体に対する有益な効果を有する遺伝子を導入するように、または該個体に対し有益な効果を有し得る受容体発現を阻害するように遺伝子的に変え得る。
本発明のいくつかの局面において、疾患、障害若しくは状態に罹っている個体を、セロトニン受容体をコードする核酸の正常な機能するコピーを包含する遺伝子構築物を含有する単離された組換え細胞を提供することによりセロトニンファミリー受容体をコードする不完全な若しくは不足した核酸を補充、増強かつ／若しくは置換することにより治療し得る。本発明の本局面は、それらが存在および／若しくは機能が不足しているセロトニンファミリー受容体をコードする核酸を個体に提供する遺伝子治療に関する。該細胞により提供されるセロトニンファミリー受容体をコードする単離された核酸は個体の不完全な受容体発現を補償する。該核酸が個体中で発現される場合に該個体における疾患、障害若しくは状態を軽減若しくは別の方法で治療するようにはたらくタンパク質が産生されるからである。
セロトニンファミリー受容体をコードする遺伝子構築物が細胞中にトランスフェクトされる全部の場合において、該核酸は、組換え細胞中での該核酸の発現を達成するのに必要とされる適切なプロモーター／制御配列に作動可能に連結される。こうしたプロモーター／制御配列は、限定されるものでないが構成的および誘導可能なかつ／若しくは組織特異的ならびに分化特異的プロモーターを挙げることができ、そして本明細書の別の場所で論考される。構成的プロモーターは限定されるものでないがサイトメガロウイルス前初期プロモーターおよびラウス肉腫ウイルスプロモーターを挙げることができる。加えて、ハウスキーピング遺伝子の発現を調節するもののようなハウスキーピングプロモーターもまた使用してよい。他のプロモーターは、限定されるものでないがグリア線維酸性蛋白をコードする遺伝子のプロモーターを挙げることができる中枢神経系の細胞中で優先的に発現されるものを包含する。加えて、遺伝子発現が誘導可能であるようなプロモーター／制御配列を選択してよい。例えばテトラサイクリンで誘導可能なプロモーターを使用してよい（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈら、１９９７、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８３：１５９−１７３）。
遺伝子構築物は、好ましくは、ベクターを細胞にトランスフェクトする場合にコーディング配列が該細胞により発現されるような必須のプロモーター／制御配列に作動可能に連結される本発明のセロトニンファミリー受容体のコーディング配列を包含する発現ベクターとして提供される。コーディング配列は細胞中での該配列の発現に必要なプロモーター／制御配列に作動可能に連結される。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ若しくはそれらのハイブリッドまたはｍＲＮＡのようなＲＮＡ分子であってよい。
プロモーター／制御配列に作動可能に連結される受容体をコードするヌクレオチド配列を包含する遺伝子構築物は、機能するエピソーム分子として細胞中に存在し続けてよいか、若しくはそれは該細胞の染色体ＤＮＡに組込んでもよい。遺伝物質を細胞中に導入してよく、そこでそれはプラスミドの形態で別個の遺伝物質として留まる。あるいは、宿主細胞の染色体中に組込み得る直鎖状ＤＮＡを細胞中に導入してよい。細胞中にＤＮＡを導入する場合、染色体中へのＤＮＡの組込みを促進する試薬を添加してよい。組込みを促進するのに有用であるＤＮＡ配列もまたＤＮＡ分子中に包含してよい。あるいはＲＮＡを細胞中に導入してもよい。
発現ベクター中の遺伝物質が発現されるためには、プロモーター／制御配列が該タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されなければならない。タンパク質産生を最大にするために、所望の細胞中での遺伝子発現に十分に適するプロモーター／制御配列を選択してよい。さらに、該細胞中で最も効率的に転写されるコドンを選択してよい。当業者は、所望の細胞中で機能的である発現ベクターとして組換え遺伝物質を調製し得る。
細胞中での遺伝的欠損を是正する、遺伝物質が個体中で遺伝的欠損を是正するように十分な量および／若しくは機能条件でそうでなければ存在しないタンパク質をコードする、かつ／またはそれと関連する特定の疾患、障害若しくは状態の処置若しくは予防において有益なように有用であるタンパク質をコードする、ならびに細胞上でセロトニン受容体の発現を阻害する（例えばノックアウトターゲッティングベクター、アンチセンス核酸など）のいずれかである組換え遺伝物質を含む細胞を提供することに加え、こうした終止が望ましいようになる場合は本発明で使用される組換え細胞中にもまた遺伝物質を導入してこうした細胞を選択的に終止させるための手段を提供もし得る。破壊のための組換え細胞のこうしたターゲッティング手段を組換え細胞に導入してよい。
本発明により、それらを破壊に対しとりわけ感受性にする遺伝物質を組換え細胞に供給し得る。例えば、組換え細胞は、細胞傷害性作用物質を用いて特異的に標的を定め得る受容体をコードする遺伝子とともに提供してもよい。選択的細胞死を誘導するのに使用し得る遺伝子の発現可能な一形態を組換え細胞中に導入し得る。こうした系において、該遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する細胞は特定の条件下すなわち特定の作用物質の存在若しくは非存在下で標的を定められた殺傷に対し感受性である。例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓ ｔｋ）遺伝子の発現可能な一形態を組換え細胞中に導入しかつ選択的細胞死を誘導するのに使用し得る。ｈｅｒｐｅｓ ｔｋ遺伝子を包含する導入された遺伝物質を個体に導入する場合にｈｅｒｐｅｓ ｔｋが産生されることができる。埋込まれた組換え細胞を殺すことが望ましい若しくは必要な場合は、ｈｅｒｐｅｓ ｔｋを産生するいかなる細胞の選択的殺傷も引き起こすことができる薬物ガンシクロビルを該個体に投与し得る。かように、埋込まれた組換え細胞の選択的破壊を見込む系を提供し得る。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が哺乳動物におけるセロトニンファミリー受容体を提供若しくは受容体発現を阻害するかのいずれかの組換え細胞の製造を包含することを理解するであろう。すなわち、細胞を使用して動物に受容体タンパク質を投与するか若しくは分子（例えば、ノックアウトターゲッティングベクター、アンチセンス核酸、リボザイム、および受容体と特異的に結合する抗体など）を送達させ得る。
本発明はさらに、免疫学的に関係する障害を治療するのに使用し得る新たなセロトニン受容体アゴニスト、インバースアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングのための標的として目的の受容体を発現する組換え細胞を使用することを包含する。従って、細胞を試験化合物と接触させ得、そして細胞の活性化を該化合物と接触されないそれ以外は同一の細胞の活性化と比較し得る。該化合物と接触されない細胞の活性化と比較して化合物と接触させた細胞のより高い若しくはより低いレベルの活性化は、該化合物がセロトニン受容体に媒介される活性化に影響を及ぼしかつ従って免疫学的に関係する障害を治療するのに使用し得る潜在的セロトニン受容体アゴニスト、インバースアゴニストおよび／若しくはアンタゴニストであることの指標となる。
動物へのセロトニンファミリー受容体の投与は、セロトニン若しくは該受容体の他のリガンドの作用機序を研究するためのモデル系として、または受容体発現と関連する疾患、障害若しくは状態のための診断薬および／若しくは治療薬の開発に有用なモデル系を開発するために使用し得る。
さらに、セロトニンファミリー受容体を発現する組換え細胞の投与により媒介される動物へのセロトニン受容体の送達もまた、セロトニン受容体のレベルを増大させることが治療効果を媒介する疾患、障害若しくは状態を治療若しくは軽減するのに使用し得る。
あるいは、その発現がセロトニン受容体の発現、活性および／若しくは細胞からの分泌を阻害する若しくは低下させる核酸を含んでなる組換え細胞の投与を、受容体の発現、活性および／若しくは分泌と関連する若しくはそれらにより媒介される疾患、障害若しくは状態に有用な診断薬および／若しくは治療薬の開発のためのモデルとして使用し得る。本発明は、該組換え細胞が受容体発現を阻害する分子を産生してそれによりこうした分子を動物に提供し得ることを包含する。あるいは、いずれかの特定の論理により拘束されることを願わずに、受容体を発現することの不能を除きそれ以外は機能的な細胞である該組換え細胞それら自身が、セロトニンシグナル伝達経路にさらされないそれ以外は同一のしかし非組換え細胞の機能を実施し得る。
動物、商業的に入手可能若しくは開発されるはずである樹立細胞株の双方から得られる細胞、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した初代細胞は、当業者に容易に利用可能な公知の技術を使用してトランスフェクトし得る。従って、本発明はドナー動物若しくは患者動物それ自身から細胞を得ることに制限されない。むしろ、本発明は、組換え細胞がセロトニン受容体を発現するかまたは組換え細胞がこうした受容体を発現しないか若しくはそれをより低レベルで発現するかのいずれかであるような、本発明の核酸を使用して工作し得るいかなる細胞も包含する。
核酸は、遺伝子によりコードされるタンパク質を発現するか若しくはセロトニン受容体発現を阻害する分子を発現する細胞中に遺伝子構築物を導入するために使用される標準的方法を使用して細胞中に導入し得る。いくつかの態様において、細胞は、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、電気穿孔法、微小注入法、リポソーム媒介性移入、化学物質媒介性移入、リガンド媒介性移入若しくは組換えウイルスベクター移入によりトランスフェクトする。
単離された受容体ポリペプチド、該受容体と特異的に結合する抗体、該受容体に対するアンチセンス核酸、および／若しくは本発明の組換え細胞が、動物中に存在する受容体のレベルを増大若しくは低下のいずれかをさせるために動物に投与される場合、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、該動物に投与されるべきポリペプチド、核酸、抗体若しくは細胞の量を、動物の組織中に存在する受容体の発現レベルまたは受容体ポリペプチド若しくは該受容体をコードする核酸のレベルを評価することにより滴定し（ｔｉｔｒａｔｅｄ）得ることを理解するであろう。
受容体発現のレベルの評価方法（例えばウェスタンブロット若しくはＥＬＩＳＡのような他の免疫に基づく分析において抗受容体抗体を使用する）ならびに／または細胞および／若しくは組織中での受容体発現のレベルの評価方法（例えばノーザンブロット分析などを使用する）は本明細書に開示されるか若しくは当業者に公知である。こうしたアッセイを使用して、受容体発現のレベルを低下若しくは増大させるために動物に投与されるべき受容体ポリペプチド、核酸、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、組換え細胞などの「有効量」を決定し得る。
Ｄ．セロトニン受容体を介するシグナル伝達を阻害することに関する方法
本発明は、セロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することによる細胞周期過程に影響を及ぼす方法を包含する。すなわち、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、５−ＨＴ受容体を介して伝達されるセロトニンシグナルの除去すなわち阻害が細胞周期過程に影響を及ぼすことを認識するであろう。これは、セロトニン作動性シグナルの阻害が、細胞周期を循環している細胞に対する大きな影響を有する、例えばシグナルの除去がアポトーシスを介する迅速な細胞死を媒介する（すなわち、細胞が細胞表面上のＰＩの曝露を示すアネキシンにより染色されるようになり、ＤＮＡ断片化が検出され、そして細胞の大きさが増大しかつ変えられた形態を示す、など）ことを、本明細書に開示されるデータが十分に示すからである。以前の研究は、多様な神経学的障害の処置のための細胞周期を耐えていなかった非分裂細胞すなわち神経若しくは筋細胞においてセロトニン作動性シグナルを阻害することに焦点をあてていたため、これらは驚くべき結果である。いずれかの特定の論理により拘束されることを願わずに、セロトニンシグナル伝達の多様な阻害剤の使用に関する従来技術の研究が、限定されるものでないがニューロンを挙げることができる細胞周期を通過していなかった非分裂細胞を接触させることを含んでいたという事実、細胞周期に対するセロトニンシグナル伝達の除去および／若しくは阻害の影響は観察、認識若しくは理解されておらず、かつ、実際のところされていた可能性はない。従って、本明細書に開示されるデータは、セロトニン受容体の阻害を介して細胞周期に影響を及ぼす新規方法を初めて示す。
本明細書に開示されるデータはまた、セロトニンシグナル伝達を阻害する化合物を製造かつ／若しくはそれが血液脳関門を実質的に横断しないように改変し得ることも初めて示す。セロトニン阻害剤を投与して、血液脳関門により隔離されている神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達に影響を及ぼさない一方で免疫応答を調節することが望ましいかもしれないため、こうした化合物は有用である。従って、本発明は、本明細書の別の場所に開示される方法の全部を実施するための血液脳関門を実質的に横断しない阻害剤の使用を包含する。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、ある種の細胞がセロトニン受容体を含んでなること、およびこうした受容体を介するシグナル伝達が細胞周期を進行する細胞において決定的に重要であることを理解するであろう。従って、本発明は、その受容体を介するセロトニン作動性シグナルの伝達を阻害することによる細胞周期過程に影響を及ぼす方法を包含する。当業者はさらに、限定されるものでないが本明細書の別の場所で論考されるアンタゴニストを挙げることができるセロトニン作動性シグナルの伝達を阻害するのに使用し得るきわめて多数の化合物が利用可能であることを理解するであろう。さらに、本発明は、セロトニン受容体を介して媒介されるセロトニン作動性シグナルの伝達を阻害する、将来開発されるような化合物を包含する。
該方法はさらに、細胞がそれを発現することが知られていない場合は目的の細胞上のセロトニン受容体の存在を同定すること、およびこうした受容体をさらに特徴付けしてどの化合物（１種若しくは複数）がその受容体を介するシグナル伝達を阻害するかを評価することを含んでなる。細胞上のセロトニン受容体の存在若しくは非存在の評価方法、ならびに薬理学的、組換え若しくは他の方法論を使用するその受容体を介してシグナル伝達を阻害する化合物の同定方法は当該技術分野で公知でありかつ本明細書の別の場所に例示される。本発明はまた、細胞上のセロトニン受容体の存在およびどの化合物（１種若しくは複数）が目的の受容体を介するシグナル伝達に影響を及ぼすかを同定するために将来開発されるような方法も包含する。
本発明はまた細胞におけるアポトーシスに影響を及ぼす方法も包含する。該方法は細胞上のセロトニン受容体を介してそうでなければ伝達されるシグナルの伝達を阻害することを含んでなる。これは、細胞周期を進行している、例えば増殖および分裂している細胞におけるセロトニン作動性シグナルの阻害がその細胞におけるアポトーシスを媒介することを本明細書の別の場所に開示されるデータが示すからである。従って、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、５−ＨＴ受容体を介するシグナルの伝達を阻害することがアポトーシスの新規誘導方法を提供することを認識するであろう。
本発明の方法は、分裂していないかまたは表面上にセロトニン受容体を有しないか若しくは異なるセロトニン受容体を有するかのいずれかである近くの細胞に影響を及ぼすことなく増殖している細胞の選択的アポトーシスをそれらが初めて可能にするために有用である。すなわち、本発明の方法は、細胞周期過程を進行していないか若しくは標的細胞と同一の型のセロトニン受容体をその表面上に発現しないかのいずれかである細胞に影響を及ぼさない。これは、該受容体を介するシグナル伝達に作動する（ａｇｏｎｉｚｅ）若しくは拮抗する多様な化合物に対するそれらの薬理学的特異性に基づく７種の異なるサブタイプを含んでなる１４種の別個のセロトニン受容体が存在することにおいてとりわけ真実である。従って、目的の細胞上に存在するセロトニン受容体が一旦同定されかつ特徴づけられていれば、当業者は、本明細書の別の場所に開示される驚くべきデータに基づき、その受容体を介するシグナル伝達が目的の細胞におけるアポトーシスを誘導するのに使用される化合物により影響を及ぼされないようなセロトニン作動性受容体を有しないか若しくは標的細胞と異なる薬理学的サブタイプの受容体を発現するかのいずれかである他の細胞中でのいかなるセロトニン作動性のシグナル伝達にも影響を及ぼすことなく、その標的細胞におけるセロトニン作動性のシグナル伝達を選択的に阻害することにより該細胞のアポトーシスを誘発し得ることを理解するであろう。
加えて、本発明は血液脳関門により保護されている神経細胞中でのセロトニンシグナル伝達に影響を及ぼさない、非神経細胞中でのセロトニンシグナル伝達を選択的に阻害することを包含する。すなわち、本発明は、血液脳関門を実質的に横断しない阻害剤を使用してそれにより該阻害剤の影響（１種若しくは複数）を非神経細胞に制限することを包含する。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が細胞におけるアポトーシスの誘導方法を包含することもまた認識するであろう。これは、本明細書の別の場所で以前に論考されたとおり、セロトニンシグナル伝達が細胞周期を通る細胞の進行に必要とされ、その結果該シグナルの阻害が細胞におけるアポトーシスを媒介し得ることが初めて示されたからである。より具体的には、セロトニンシグナル伝達を必要とする細胞上のセロトニンタイプ１Ｂ、２、４および／若しくは６受容体とのセロトニンの結合の阻害が、伝統的なアポトーシス経路を介して細胞死を媒介することが示された。
さらに、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が細胞死の誘導方法を包含することを認識するであろう。すなわち、本明細書に開示されるデータは、セロトニンタイプ１Ｂ、２、４若しくは６受容体を発現する細胞におけるセロトニンシグナル伝達の阻害が該細胞の死を媒介することを示す。従って、本明細書に提供される開示に基づき、当業者は、セロトニン（タイプ１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、４若しくは６）受容体とのセロトニンの結合を阻害することを含んでなる細胞死の誘導方法が本発明により包含されることを理解するであろう。
ＩＩ．キット
本発明はセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用を阻害することに関する多様なキットを包含する。本明細書の別の場所に開示されるとおり、この相互作用を阻害することが順に免疫細胞の活性化を阻害してそれにより免疫応答を阻害するからである。従って、一局面において、本発明は哺乳動物における免疫応答を調節するためのキットを包含する。該キットは、有効量のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなる。こうした阻害剤は好ましくはセロトニンタイプ２受容体アンタゴニストを包含する。また、該キットはさらにアプリケーターおよびその使用のための説明資料を含んでなる。
加えて、当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、該阻害剤が血液脳関門を横断しない化合物であり得ることを認識するであろう。これは、本明細書の別の場所により完全に論考されるとおり、血液脳関門を超えて保護されているとみられる神経細胞におけるこうしたシグナル伝達に影響を及ぼさない一方で非神経細胞におけるセロトニンシグナル伝達を阻害することが望ましいとみられるからである。
当業者は、本明細書に提供される開示に基づき、本発明が、哺乳動物における遺伝子治療へのアデノウイルスベクターに基づくアプローチの使用のためのアデノウイルスベクターの投与と関連するタイプ２受容体に媒介されるシグナルを阻害するのに有用なキットを包含することを認識するであろう。それは、遺伝子を送達するための最も効率的なベクターがアデノウイルスベクターであるとは言え、身体は該ベクターに対する免疫応答を行い、それが遺伝子送達ベクターにおけるその有用性を制限しかつ発現の喪失に至るからである。結果、数週間以内に、新たなベクター（およびその中に含まれるもの）を受領したすべての細胞が排除されて該技術を無効にする。本明細書に開示されるデータは、アデノ関連の免疫応答と同時に起こるためのタイプ２インバースアゴニスト／アンタゴニストの投与が、応答性細胞を効果的に排除し、該ベクターに対し向けられた免疫応答を阻止しかつそれにより遺伝子治療を可能にし得ることを示唆する。
本発明は、セロトニンファミリー受容体をコードする核酸、こうした受容体を特異的に結合する抗体、ならびにこうした抗体をコードする核酸、こうした受容体をコードする核酸に相補的なしかし転写に関してアンチセンスの向きの核酸のような化合物、ならびに／若しくは本発明の組成物、アプリケーター、および本発明の方法を実施するための該化合物の使用を記述する説明資料を含んでなる多様なキットを包含する。例示のキットを下述するとは言え、他の有用なキットの内容は本開示に照らして当業者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれが本発明内に包含される。
一局面において、本発明はセロトニンファミリー受容体の異常発現により媒介される疾患を軽減するためのキットを包含する。該キットは本発明に開示される方法に従って使用される。簡潔には、該キットを使用して、受容体の発現を低下させるために核酸が転写に関してアンチセンスの向きであるセロトニン受容体をコードする核酸に相補的な核酸、またはこうした受容体と特異的に結合する抗体若しくは該抗体をコードする核酸と細胞を接触させてよく、ここで該受容体の低下された発現、量若しくは活性が有益な効果を媒介する。さらに、該キットはアプリケーターおよび該キットの使用のための説明資料を含んでなる。これらの説明書は単に本明細書に提供される例を例示する。
該キットは製薬学的に許容できる担体を包含する。該組成物は本明細書の別の場所に示されるところの適切な量で提供される。さらに、投与経路および投与の頻度は本明細書の別の場所に以前に示されるとおりである。
本発明は今や以下の実施例に関して記述される。これらの実施例は具体的説明のみの目的上提供され、そして、本発明はいかなる方法でもこれらの実施例に制限されるとして理解されるべきでないが、しかし、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるいかなるおよび全部の変形を包含するように解釈されるべきである。
［実施例］
セロトニン受容体および免疫調節
トリプトファンは、細胞において新しいタンパク質を構築するために必要とされる１０個の必須アミノ酸の一つである。トリプトファンの異化は飢餓をもたらし、従って、認められるＴ細胞阻害を説明することは、ありそうにないが、可能である。しかしながら、他の９個の必須アミノ酸のいずれもＴ細胞応答の制御に関与するとされていない。
トリプトファンは、２つの代謝運命を有することが一般に知られている。１つ経路において、トリプトファンはニコチン酸に転化される。トリプトファンは、せいぜい、細胞において使用されるニコチン酸の５０％を占めるだけである（大部分は食事補給によってもたらされ、従って、それは律速ではない）。トリプトファンのもう１つの代謝運命は、セロトニンとしても知られている５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）へのその転化である（図１参照）。これは、他方では、セロトニンの唯一の既知の供給源である。セロトニンは、おそらく間違いなく、古今を通じての最も広く研究されている生物活性化合物である。これまで、免疫応答の増大におけるセロトニンの役割は、仮にあったとしても、ほとんど理解されていない。実際に、学部生および大学院生の免疫学コースを教えるための標準的な専門書として役立つ５つの主要な大学レベルの教科書は、血小板との関連におけるセロトニンおよび創傷の部位で血管収縮を誘導するその能力を記載するかもしくはそれがげっ歯類肥満細胞に含まれることを記載するだけである（Ｓｈａｒｏｎ，１９９８，Ｂａｓｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ；Ｋｕｇｙ，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ；Ｊａｎｅｗａｙ ＆ Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｓｂｙ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
胚発生の点で、全てのリンパ球は神経冠から得られる。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、最も初期の原始の免疫学的防御は、「神経インパルス」パラダイムに基づき、そしてその結果としてセロトニンにより制御されている可能性がある。時間とともに、自然はこの基本経路に対する調節の多数の素晴らしいそして複雑な層を与えている。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、本明細書に開示するデータは、ＩＤＯ異化に関連するトリプトファンの影響が、実際には、セロトニン経路へのその影響のためであることを示す。過去４０年にわたって生産された医学的に関連する文献の再調査により、セロトニンがいくつかのＴ細胞活性に影響を与え得るという散発的な文献はあるが、現在までのいかなる研究も、本発明まで、セロトニン受容体活性化をＴ細胞応答を高めるための基本的な律速の必要条件としてこれまで同定していないことが示される。
開示するデータは、Ｔ細胞により媒介される免疫応答の調整および絶対的制御における５−ＨＴの基本的な役割を示す。本明細書に開示する研究では、接着細胞集団から離して精製されているヒト一次末梢血リンパ球もしくは同様に接着細胞から分離されているマウス脾臓細胞のいずれかを用いた。従って、（ＣＤ３陽性）Ｔ細胞の半精製集団が得られ、そして次にこれらの細胞をマイトジェン、例えばフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）もしくはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のいずれかの添加により活性化した。これらの植物レクチンは、一次および二次活性化シグナルの両方に関与するＴ細胞表面受容体を架橋し、それにより非常に強力な刺激シグナルを引き出すことによって作用するのでそれらをマイトジェンとして用いた。従って、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、これらのレクチンへのＴ細胞応答を調節することができる場合に、該原理が他の免疫原に容易に適用可能であることを理解する。
本明細書の他の所ですでに指摘するように、ある状況下で、５−ＨＴは活性化Ｔ細胞を刺激することが示されており（Ｋｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．１４：７８３−７９６；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８０：３９５−４００）、一方、大部分の研究所は、高濃度の添加した５−ＨＴが増殖を阻害することを報告する（Ｍｏｓｓｎｅｒ ＆ Ｌｅｓｃｈ，１９９８，Ｂｒａｉｎ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２：２４９−２７１）。この明白な意見の相違を検討するために、Ｔ細胞の基本活性化経路へのトリプトファンおよび５−ＨＴの両方の影響を評価した。
供給品および試薬
以下の化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した：トリプトファン、５−ヒドロキシ−トリプトファン、セロトニン−塩酸塩、フェネルジン、２−アミノ−２−ノルボルナンカルボン酸（ＢＣＨ）、Ｌ−ｐ−クロロフェニルアラニン、フルオキセチン、ｍ−ヒドロキシベンジルヒドラジン２塩酸塩（ＮＳＤ−１０１５）、（Ｓ）−プロプラノロール、（Ｓ）−および（Ｒ）−８−ＯＨ ＤＰＡＴ−臭化水素酸塩、ＷＡＹ１００６３５、ＬＹ５３８５７、ＳＢ２０６５５３、ＳＢ２４２０８４、メチセルギド−マレイン酸塩、２−メチル−５−ＨＴ、Ｒｏ０４６７９０、リスペリドン、３−トロパニル−インドール−３−カルボキシレート、クロザピン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＳＤＺ２０５５５７、アルファ−メチル−ＤＬ−チロシン−メチルエステル塩酸塩。
以下の化合物は、Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した：ＭＤＬ１１，９３９。ストック溶液は、典型的には、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）において１ｍＭの濃度で作った。例外はリスペリドンおよびＭＤＬ１１，９３９であり、これらは最初に塩酸（最終容量の約１／１０）において可溶化し、次にＨＢＳＳで希釈し、そして水酸化ナトリウムでほぼ中性のｐＨに滴定した。Ｌ−ｐ−クロロフェニルアラニンは、その溶解度によって許容される最大濃度に達するように１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩにおいて５ｍＭの濃度で調製した。
ＲＰＭＩ培地はＧｉｂｃｏ ＲＢＬからであり、ＨＢＳＳ、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒトＡ／Ｂ血清、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７、Ｍ−ＣＳＦ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、フルオキセチンおよびＢＣＨ［２−アミノ−２ノルボルナンカルボン酸］はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からであった。全ての使い捨てプラスチックは、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）からであった。トリチウム化チミジンは、ＤｕＰｏｎｔ−ＮＥＮ（Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）から入手した。バキュテイナーコレクションセットおよびヘパリン添加コレクションバイアルは、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）からであった。全ての細胞は、他に示さない限り、５％ ＣＯ２において３７℃で培養した。
動物
６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪ（Ｈ−２ｄ）およびＣ５７／Ｂ６Ｊマウス（Ｈ−２ｂ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。
ＰＣＲプライマー
シーケンスプライマーは：Ｔ７ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号：１５）、Ｂｇｈ ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ（配列番号：１６）であった。特定の５−ＨＴ受容体増幅に用いるプライマーは、以下のとおりであった：１Ａ受容体：１ａｆ ＣＧＧＴＣＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧ（配列番号：１７）、１ａｒ ＧＡＧＧＣＡＡＧＴＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧ（配列番号：１８）、予想生成物サイズは２３４ｂｐである。２Ａ受容体：２ａｒ ＡＧＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＡＧＧ（配列番号：１９）、２ａｆ ＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣ（配列番号：２０）、予想生成物サイズは２４７ｂｐである。２Ｂ受容体：２ｂｆ ＡＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＣ（配列番号：２１）、２ｂｒ ＴＧＴＣＣＴＴＴＣＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣＣ（配列番号：２２）、予想生成物サイズは２０６ｂｐである。２Ｃ受容体：２ｃｆ ＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴＧＣ（配列番号：２３）、２ｃｒ ＴＴＣＣＡＴＧＣＴＴＡＣＴＧＣＣＡＴＧＡ（配列番号：２４）、予想生成物サイズは２５６ｂｐである。３Ａ受容体：３ａｆ ＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧ（配列番号：２５）、３ａｒ ＴＧＡＣＣＡＣＡＴＡＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣ（配列番号：２６）、予想生成物サイズは２１６ｂｐである。３Ｂ受容体：３ｂｆ ＡＣＡＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＡＣ（配列番号：２７）、３ｂｒ ＧＣＴＣＴＣＣＡＴＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣ（配列番号：２８）、予想生成物サイズは２７０ｂｐである。受容体４：４ｆ ＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＣ（配列番号：２９）、４ｒ ＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＧＡＣＡ（配列番号：３０）、予想生成物サイズは２８９ｂｐである。全てのプライマーは、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｔｈｅ Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＴＸ）により製造された。
逆転写およびＰＣＲ
健康なドナーからの全血をＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに記述されているようにフィコール勾配を用いて分画した。末梢血リンパ球を集め、そして６ウェルプレート上にウェル当たり２ｘ１０７個の細胞で平板培養した。細胞をプラスチックに１．５時間接着させ、そしてその時に懸濁細胞を取り除き、そして新しい６ウェルプレート上にウェル当たり１０７個の細胞で再び平板培養した。接着細胞および懸濁細胞の両方をＣｏｎＡで（５μｇ／ｍｌで）刺激するかもしくは未処理のままにしておいた。ＣｏｎＡ刺激後４８時間で、細胞を採取し、そして製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙミニプレップシステムを用いて全ＲＮＡを抽出した。（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）ＲＮＡサンプルをゲルの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色により定量し、そして約１μｇの各ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡ合成は、オリゴＴ１２−１８プライマーもしくは受容体特異的リバースプライマーのいずれかを用いて、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ逆転写キットで行った。得られるｃＤＮＡは、５−ＨＴ受容体特異的プライマーを用いる３５サイクルのＰＣＲ反応（ＳｉｇｍａからのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる）において鋳型として用いた。５０マイクロリットルのＰＣＲ反応には、２５ピコモルの各特異的プライマーを用いた。ＰＣＲ条件は：４５秒間９５℃、４５秒間６１．５℃、４５秒間７２℃であった。３５ＰＣＲサイクルの後に７２℃で１０分の伸長工程を続けた。最終ＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー）（ＢＭＡ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥからのＮｕＳｉｅｖｅ ３：１プレキャストアガロースゲル）を用いて分析した。
配列確認のために、ＰＣＲ生成物を製造業者の説明書に推奨されるようにＴＡ発現ベクター（ｐＣＲ３．１）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｔａｄ，ＣＡ）に直接クローン化した。ＰＣＲ生成物を含有するライゲーション混合物でＴＯＰ１０Ｆ’細胞を形質転換した後、細菌細胞を２５マイクログラム／ｍｌのアンピシリンを有する寒天プレート上で平板培養した。翌日、細菌クローンを迅速なＰＣＲに基づくスクリーニング方法によりインサートの存在に関してスクリーニングした。この方法は、１日当たり数百個のクローンのスクリーニングを可能にする。
簡潔に言えば、２００マイクロリットルのパイプチップで細菌クローンに触れ、次にチップを５０マイクロリットルの滅菌水に浸し、そして９５℃で５分間沸騰させた。２５マイクロリットルの沸騰サンプルをＴ７およびＢｇｈプラスミドプライマー（シーケンスプライマーを参照）を用いる３５サイクルのＰＣＲ反応の鋳型として用いた。次に、ＰＣＲ生成物をＴＡＥバッファーにおいて２％アガロースゲル上で分離した。陽性クローンを同定し、そして選択したクローンに対してのみプラスミドミニプレップを行った（製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎプラスミドミニプレップシステムを用いる）。ミニプレップから得られるプラスミドは、フォワード（Ｔ７）およびバックワード（Ｂｇｈ）プラスミドプライマーを用いてペンシルバニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）のシーケンス施設においてシーケンスした。
マクロファージ培地コンディショニング研究
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，１４．１．３−１４．１．６節；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４−１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１−３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．）から改変したプロトコルを用いて、Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスから得られる単球を単離した。６−８週齢のＣ５７／Ｂ６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）の後肢から大腿骨および頸骨を採取した。これらの骨の遠位端を取り除き、骨髄栓（ｍａｒｒｏｗ ｐｌｕｇ）を露出した。２２ゲージ針（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）を用いて、２％ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地で骨髄腔をフラッシした。次に、間質細胞を取り除くために細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３．１．５節）に記述されているようにＡＣＫ（塩化アンモニウムカリウム溶解バッファー；０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ，１０ｍＭ ＫＨＣＯ３，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファーを用いて赤血球を溶解した。
１０％ ＦＢＳ、５００ユニット／ｍｌのマウスＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ培地に細胞を１０７個の細胞／ｍｌで再懸濁し、そして３ｍｌ／ウェルの細胞懸濁液を６ウェル平底プレート上に平板培養した。２４時間後に、非接着細胞（単球）を採取し、そして２００ユニット／ｍｌのＭ−ＣＳＦおよび１５％のＦＢＳを補足した０．６５ｍｌのＲＰＭＩにおいて、２４ウェル平底プレート上にウェル当たり４０万個の細胞で平板培養した。細胞を４日間培養した。６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪの脾臓を採取し、そして単細胞懸濁液を作った。赤血球を上記のように取り除いた。接着細胞をナイロンウールカラム上で１．５時間のインキュベーションにより取り除き、そして懸濁細胞を集めた。次に、ＢＡＬＢ／ｃ細胞を０．６５ｍｌ（各ウェルの最終容量を１．３ｍｌにする）において、１．２ｘ１０６個の細胞／ウェルで、Ｃ５７／Ｂ６細胞（上記参照）上に平板培養した。細胞を２．５日間培養した。適宜、このインキュベーションの開始時にフルオキセチンもしくはＢＣＨを加えた。混合細胞培養物からの培地を採取し、細胞を除くために１２００ＲＰＭで遠心分離し、そして０．２２ミクロンシリンジフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて濾過した。この濾過した培地を別の回の細胞増殖をサポートするために用いた。
マウスＴ細胞の精製
ＢＡＬＢ／ｃもしくはＣ５７／Ｂｌａｃｋ６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から脾臓を採取した。単細胞懸濁液を得るためにこれらの脾臓をスピン培地（２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ならびに１％ Ｌ−Ｇｌｕ（グルタミン酸；ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補足したＲＰＭＩ１６４０倍地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））においてすりつぶした。細胞を１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、そして上清を取り除いた。赤血球（ＲＢＣ）をＡＣＫバッファーで溶解した（Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１．３−３．１．５節により記述されているように）。
残りの細胞をスピン培地に再懸濁し、そして接着細胞を取り除くためにナイロンウールカラム上に載せた。細胞をカラム上（５％ ＣＯ２、３７℃）で約２時間インキュベーションした。非接着細胞をスピン培地を用いてカラムから洗浄した。これらの細胞を遠心分離し、そして感作培地（１０％ウシ血清、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１％ Ｌ−Ｇｌｕ、ベータ−ＭＫＥを補足したＲＰＭＩ１６４０倍地）に再懸濁した。
マウスマイトジェン刺激
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，３．１．５および３．１２．２−３．１２．４節）に記述されているように６−８週齢のＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪマウスからの一次脾臓Ｔ細胞を得た。全ての薬剤は、細胞懸濁液の添加の前に、様々な濃度で９６ウェルＵ底プレート上で事前に平板培養した。全ての実験条件は、少なくとも三重反復でアッセイした。精製された一次細胞をウェル当たり１００，０００個の細胞で薬剤を含んでなるウェルにおいて平板培養した。他に示さない限り、ＣｏｎＡは１μｇ／ｍｌの最終濃度になるように細胞懸濁液に加えた。総容量は、ウェル当たり２００μｌであった。コントロールサンプルには、ＣｏｎＡ刺激を与えなかった。細胞を６０時間増やした。１μＣｉのトリチウム化チミジンを各ウェルに加え、そして１２時間後にプレートを半自動式ＰＨＤ（Ｂｒａｎｄｅｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）ハーベスターを用いてＣｏｎＡの添加後７２時間で採取した。
マウス混合リンパ球反応（ＭＬＲ）
ＭＬＲは、本質的にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，３．１２．６−３．１２．７節）に記述されているように行った。すなわち、Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスから得られる一次脾臓細胞を刺激物質として用いた。それらは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９，３．１．５節）に記述されているように精製し、そしてＨａｈｎｅｍａｎｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）血液銀行施設で放射線照射した（３５Ｇｙ）。ＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪから得られる一次脾臓細胞をナイロンウールカラムを用いて接着細胞から除去し、そしてレスポンダー（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）として用いた。
様々なインヒビターを９６ウェルＵ底プレート上に事前に平板培養し、そして全ての実験条件を少なくとも三重反復でアッセイした。１０％ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地中１００，０００個のＣ５７／Ｂ６細胞を各ウェルに平板培養した。２００，０００個のＢＡＬＢ／ｃ／ＢＹＪ細胞を２００μｌ／ウェルの最終容量になるように刺激物質細胞上に平板培養した。バックグラウンドコントロールには、ＢＡＬＢ／ｃ細胞もＣ５７／Ｂ６細胞も与えなかった。１μＣｉのトリチウム化チミジンを４日後に各ウェルに加え、そしてプレートを１２時間後に採取した。
ヒトＴ細胞の精製
全ての必要な説明同意書（ｉｎｆｏｒｍｅｄ ｃｏｎｃｅｒｎ ｆｒｏｍ）に記入した後に様々な健康なドナーから血液を得、標準方法に従ってフィコール−ヒパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｓｉｇｍａ）勾配を用いて末梢血単核細胞（ＰＢＭ）を単離した。細胞をフィコール−血清界面から集め、そして残りのフィコールを除くために十分に洗浄した。細胞を洗浄し、そして次にスピン培地（２％ウシ胎仔血清、１％ ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよび１％ Ｌ−Ｇｌｕを補足したＲＰＭＩ １６４０倍地）に再懸濁した。接着細胞を除くために細胞をフラスコにおいて３７℃、５％ ＣＯ２で約４時間インキュベーションした。懸濁細胞を集め、そして感作培地（１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、１％ ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐおよび１％ Ｌ−Ｇｌｕおよびベータ−ＭＫＥを補足したＲＰＭＩ １６４０倍地）に再懸濁した。
薬剤処理
２．０ｘ１０５個のＲＰＭＩ−８２２６細胞を１０％ ＦＢＳを補足した全部で５ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０中、示す薬剤濃度の存在下で、６ウェル培養プレートにおいて培養した。各ウェルをその全部を採取し、そしてサイトスピン用に２つの同一のサンプルに分けた。
サイトスピン
各処理群からの１．０ｘ１０５個のＲＰＭＩ−８２２６細胞をサイト漏斗（Ｃｙｔｏ−ｆｕｎｎｅｌ）に載せ、そして中程度の加速で５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。次に、スライドをＰＢＳにおける段階的メタノールによって固定し（１００％、５分；８０％、５分；５０％、５分）、ＰＢＳにおいて５分間洗浄し、そして染色するまで４℃でＰＢＳにおいて保存した。
組織化学
標準的な染色プロトコルに従って、サイトスピンしたスライドをヘマトキシリンおよびエオシン、続いて核染色液、ビス−ベンズアミドで染色し、すすぎ、そして標本にした。同じスライド視野の整合する像を作製するためにスライドを明視野および蛍光灯の両方の下で視覚化した（例えば、図２８および２９を参照）。
ヒトマイトジェン刺激
バキュテイナーコレクションセットおよびヘパリン添加コレクションバイアルを使用して、健康な志願者からの血液を静脈穿刺を用いて採血した。該血液を５０ｍｌのコニカルチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）において３０ｍｌの総容量までＨＢＳＳを用いて１：１に希釈した。単核細胞を単離するために、１０．５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を３０ｍｌの血液溶液の下に層にし、そしてチューブを室温で１２００ＲＰＭで４５分間回転させた。バフィーコートからの細胞を集め、そしてＨＢＳＳにおける反復遠心分離を用いて残りのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅを洗浄して除いた。洗浄後に、細胞を２％ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩにおいてｍｌ当たり５００万個の細胞で再懸濁した。接着細胞を除くために、懸濁液を６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）上に３ｍｌ／ウェルで平板培養し、そして３７℃、５％ ＣＯ２で２時間インキュベーションした。このインキュベーション後に非接着細胞を採取し、計数し、そして１０％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）を補足したＲＰＭＩに再懸濁した。
マイトジェン刺激は、本質的にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３．１２．２−３．１２．４節）に記述されているように行った。全ての薬剤は、細胞懸濁液を９６ウェル丸底プレートの各ウェル上に加える前に事前に平板培養した。全ての実験条件を少なくとも三重反復でアッセイした。１０％ヒト血清を補足したＲＰＭＩに懸濁した細胞を２００μｌの最終容量にウェル当たり１００，０００個の細胞で平板培養した。ＣｏｎＡを１μｇ／ｍｌの最終濃度になるように加えた。コントロールサンプルにはＣｏｎＡ刺激を与えなかった。プレートを３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。１マイクロキュリーのトリチウム化チミジンを６０時間後に各ウェルに加え、そして１２時間後にプレートを採取した。
ヒト混合リンパ球反応のプロトコル
二人の健康な関係のないドナーからの血液を上記のように採取した。他の所ですでに記述したように末梢血単核細胞を単離した。すでに記述したように両方のドナーで接着細胞を懸濁細胞から分離した。両方のドナー（ドナーＡおよびＢ）からの懸濁細胞をレスポンダーとして用いた。ドナーの各々からの残りの接着細胞を異なるドナーに対する刺激物質として用いた（接着Ｂに対して懸濁Ａおよび懸濁Ｂに対して接着Ａ）。刺激物質細胞を３５Ｇｙで放射線照射した。薬剤は、三重反復で９６ウェルＵ底プレート上に事前に平板培養した。次に、１０％ヒト血清を補足したＲＰＭＩ中２００，０００個の「刺激物質」細胞を各ウェルにおいて平板培養した。次に、同じ培地中２００，０００個の「レスポンダー」細胞を２００μｌ／ウェルの最終容量になるように刺激物質上に平板培養した。バックグラウンドコントロールには刺激物質細胞もレスポンダー細胞も与えなかった。プレートを３７℃および５％ ＣＯ２でインキュベーションした。１μＣｉのトリチウム化チミジンを４．５日後に各ウェルに加え、そして１２時間後にプレートを採取した。
マウス同種移植モデル
使用するインビボ検証スクリーニングは、Ｚｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００に記述されているような当該技術分野で認められているマウス同種異系拒絶モデルであった。このアッセイでは、５ｘ１０６個のＰ８１５細胞（［Ｈ−２ｄ］ＤＢＡ／２肥満細胞腫）を実験の０日目にＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ−２ｂ）マウスの腹腔に注射する完全なＭＨＣミスマッチ系を用いた。これらのマウスは、典型的には、Ｐ８１５細胞に応答して強い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を引き起こす。最初のＰ８１５細胞接種の後、マウスにＣＴＬ応答を発生させた（これは通常約１０〜１４日かかる）。研究の６および８日目に、試験薬剤のボーラス静脈内（ｉｖ）注射を投与した。次に、図に示すように実験の１４日目にマウスを殺し；そして同種異系ＣＴＬ応答を以前に記述されているようにアッセイした（Ｔｒｅｔｉａｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：９８４−９８８）。処理したおよび未処理の動物からの一次脾臓細胞を直接ＣＴＬ読み取りに用いた。新しく得た一次脾臓細胞を［３Ｈ］標識した標的細胞（Ｐ８１５細胞）と１００：１、５０：１、２５：１および１２．５：１の比率で３７℃で３．５時間インキュベーションし、そしてＰＨＤハーベスターを用いて採取した。％致死＝（Ｓ−Ｅ）／Ｓ（ここで、Ｓはエフェクター細胞のない場合に標的細胞により保持されるＤＮＡの量であり、そしてＥはエフェクター細胞の存在下で保持されるＤＮＡの量である（分当たりのカウント；ｃｐｍ単位で表される））の式を用いて特異的致死のパーセンテージを決定した。
本明細書に開示するデータは、免疫系へのトリプトファンにより媒介される影響が、セロトニンの代謝前駆体としてのトリプトファンの役割のためであることを初めて示す。さらに特に、トリプトファン輸送インヒビターもしくは選択的セロトニン再摂取インヒビター（ＳＳＲＩ）の影響を決定するために本明細書に開示するように一連の研究を行った。
トリプトファンもしくはセロトニンのいずれかのＩＤＯにより媒介される異化を阻害することは、Ｔ細胞増殖を与えるならし培地の能力に同等な影響を与えた。すなわち、研究の「コンディショニング」段階の間に活性化マクロファージへのトリプトファンの取り込みを阻害するために（２−アミノ２−ノルボルナンカルボン酸、トリプトファン輸送インヒビターを用いる）もしくは研究の「コンディショニング」段階の間にセロトニンの取り込みを阻害するために（フルオキセチン［ＰｒｏｚａｃＴＭ］、選択的セロトニン再摂取インヒビターを用いる）図１に示す実験を考案した。このアッセイは、多様な結果をもたらした：マクロファージは培地を枯渇させることもあり、そしてそうしないこともある（すなわち、時折、しかし常にとは限らないが、トリプトファンは、ならし培地において増殖する新しいＴ細胞の能力を回復させることができる）。この変動性にもかかわらず、認められる総合的なパターンは、マクロファージによるトリプトファンもしくはセロトニンのいずれかの取り込みを阻害する場合に培地の「コンディショニング」効果を防止できることである。図１に示すアッセイにおいて、トリプトファンの添加は影響がなく、そしてセロトニンの添加はアッセイをわずかに回復させただけである。それにもかかわらず、同様のアッセイは、トリプトファンおよびセロトニンの両方が、ならし培地において増殖するＴ細胞の能力を回復できることを示している。
Ｔ細胞において活性化応答を引き起こすことにおけるセロトニンの総合的な役割を検討するために次の一連の研究を考案した。最初に、活性化応答におけるセロトニンのデノボ合成の役割に関して、ならびにＴ細胞にセロトニンを外因的に加えることの影響を評価した。セロトニンへのトリプトファンの転化の代謝経路を図２に示す。この代謝転化に関与する第一の酵素は、トリプトファンヒドロキシラーゼである。理論的には、活性化応答を高めるためにセロトニンのデノボ合成が必要とされる場合、代謝転化経路における第一の酵素を阻害することは応答を抑制するはずである。さらに、欠けている酵素の最終生成物の添加により活性化応答を回復させることは、阻害の特異性を示すために用いることができる。
図３に示す実験は、トリプトファンヒドロキシラーゼの阻害が、マイトジェンシグナルに応答するＴ細胞の能力を損なうかどうかを評価するために考案した。パラ−クロロフェニルアラニン（ＰＣＰＡ）は、古典的に、この酵素を阻害するために用いられる。図３に示す研究は、ＰＣＰＡの添加がマイトジェン応答を用量に依存して阻害することおよびこの阻害は酵素の代謝最終生成物５−ヒドロキシ−トリプトファンの添加により取り消すことができることを示す。ＰＣＰＡのない場合に、２５μＭの５−ヒドロキシトリプトファンの添加は、増殖応答を有意に高めた。
これらのデータは、セロトニンのデノボ合成がＴ細胞活性化プロセスを前に進めることができることを示唆するが、ＰＣＰＡの阻害のメカニズムは解釈を困難にする。増殖する細胞に加えられるＰＣＰＡは、新たに生産されるタンパク質にアミノ酸アナログとしてタンパク質生合成によって組み込む。トリプトファンヒドロキシラーゼへのＰＣＰＡの取り込みは、明らかにその酵素活性を殺すが、細胞内の他のタンパク質へのその取り込みの付随効果を予測することは困難である。
次に、外因的に加えるセロトニンおよびトリプトファンの影響を評価し、そしてトリプトファン−セロトニン転化の異なる代謝阻害の影響を調べた。代謝阻害に関して、モノアミンオキシダーゼ酵素の阻害によって引き起こされる細胞内セロトニンの蓄積に応答して芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（セロトニンへの５−ＯＨトリプトファンの転化を触媒する酵素）の活性を止める非常に敏感なフィードバックメカニズムがある（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９７６）。この研究では、フェネルジン（Ｐｚ）をモノアミンオキシダーゼのインヒビターとして用いた。これらのデータを図４に示す。高用量のセロトニンおよびトリプトファン（４００μＭ）は細胞の最大刺激を高め、一方、モノアミンオキシダーゼインヒビター、Ｐｚの添加は刺激を完全に止めた。これらのデータは、セロトニンのデノボ合成が免疫応答を高めることおよび維持することに必要とされるという考えと一致する。いくつかの先行技術研究は、５−ＨＴが活性化Ｔ細胞を刺激することを示し（Ｋｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、一方、大部分の研究所は、高濃度の添加した５−ＨＴが増殖を阻害することを報告する（Ｍｏｓｓｎｅｒ ＆ Ｌｅｓｃｈ，１９９８）。従って、Ｔ細胞の基本活性化経路へのトリプトファンおよび５−ＨＴの両方の影響を調べた。
Ｔ細胞活性化および増殖は、非常に複雑なそして非常に調節されたプロセスである。Ｔ細胞活性化は、それがマイトジェンもしくは特定の抗原を用いて開始されようと、時間および活性化シグナル強度の関数として進む。活性化プロセスを細胞数（もしくはＤＮＡ合成活性）に対する時間の関数としてプロットする場合、グラフはベル形曲線に似ている。一般に、マイトジェン的に刺激した増殖アッセイは、開始シグナルの強さにより、４８〜６０時間の間にピークに達し、プラトーになり、そして次に元のベースラインまで急速に減少する。実際には、時間スケールを無視する場合、免疫応答を引き起こす曲線は、神経インパルスのものと非常に似ている。
マイトジェン刺激の実験設定は、通常、単一の最適化された濃度の活性化マイトジェンを使用しそしてデータをあらかじめ指定した終点で見直すように設計される。しかしながら、外因的に加える試薬が釣鐘曲線の形状を変えるが、ピーク活性化レベルを変えず、そして研究者が単一の時間点でアッセイを採取する場合、結果は誤解を招く恐れがあり得る。釣鐘曲線の幅を短くする試薬の添加を考えよ。採取の時点で、短縮された釣鐘曲線はすでにその終点に近づいており、一方、未処理の細胞はまだそれらのプラトー段階にある。研究者は、試験試薬がアッセイを阻害したと必然的に結論を下し、一方、細胞のピーク応答は同等であった可能性があり、応答の期間のみが変化した。
一定の時間点（７２時間）で採取しながら、異なる強度の活性化シグナル下での様々な化合物の影響を調べた。理論的には、最も強い開始シグナル強度、すなわち、使用する最も高い濃度のＣｏｎＡは、釣鐘曲線を時間において前方へシフトし、一方、より弱いシグナルは曲線を遅らせた。採取の時間を一定に保ちながら、Ｔ細胞を刺激するために異なる濃度のＣｏｎＡを用いることにより、化合物の影響を活性化の「釣鐘曲線」における異なる点で調べることができる。図５は、刺激したリンパ球への各試薬の影響を示す。最も弱いシグナル強度（０．１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡ）で、トリプトファンは増殖応答を増大させ、そして増大のレベルは、最も高いレベルで増大がないようにＣｏｎＡの増加する濃度とともに減少する。セロトニンは、「釣鐘曲線」の最後の部分に対応する、ＣｏｎＡの最も高い用量までアッセイには影響がない。従って、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、トリプトファンおよびセロトニンは、トリプトファンの活性がセロトニンのものに遅れを取ることを除いて、活性化細胞に同様の効果を有することは明らかである。
図５Ａおよび５Ｂにおけるフェネルジンの添加は、デカルボキシラーゼ酵素をフィードバック阻害することに予想されるように、使用する薬剤の最も高い濃度、すなわち、１０〜１００μＭの間で有意な阻害を示す。しかしながら、フェネルジン阻害曲線はより高いＣｏｎＡ刺激で右にシフトし、そして完全な阻害は１００〜４００μＭの間のフェニルジンで起こるので、最も高いＣｏｎＡ用量（１０μｇ／ｍｌ）では、いかなる阻害も認められなかった（図５Ｃ）。
認められる阻害が、Ｌ−芳香族酸デカルボキシラーゼを阻害し、それによりセロトニンへのトリプトファンの代謝転化を妨げるためである場合、アッセイへの外因性セロトニンの転化は阻害を取り除くが、トリプトファンはそうしないはずである。図６では、ヒトＴ細胞を１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡを用いて刺激し、そして認められる阻害をなくすトリプトファンもしくはセロトニンのいずれかの能力を調べた。このアッセイに用いる条件下で、ＣｏｎＡ刺激細胞に加えたトリプトファンは増殖応答を高めたが、セロトニンはそうしなかった。フェネルジンで阻害した細胞へのセロトニンの添加は、アッセイをベースラインレベルまで回復させ、一方、トリプトファンの添加はほとんど効果がなかった（図６）。総合すると、これらのデータは、セロトニンのデノボ合成がＴ細胞の機能的活性化に必要とされることと一致し、そしてそれを示す。
免疫応答におけるセロトニン作動性受容体シグナル伝達の役割を評価するために、５−ＨＴ受容体系の明確に定義されたアゴニストおよびアンタゴニストを用いて免疫応答を区別をつけて操作するように実験を行った。さらに特に、リンパ球活性化プロセスにおける１型受容体の役割を調べた。
これらのアッセイからのデータを図７Ａおよび７Ｂに示す。この図のパネルＡは、５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでのヒトリンパ球の刺激を示し、一方、パネルＢは、ヒトリンパ球の同種異系刺激、すなわち、混合リンパ球反応に関するデータを示す。これらのデータにおいて明らかに理解することができるように、化合物ＳＢ２１６６４１を用いる５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナルの非常に選択的な阻害は、活性化応答の完全な阻害をもたらす。
該データはさらに、選択的５−ＨＴ１Ｂアンタゴニスト（ＳＢ２１６６４１）の用量応答曲線が、ある程度、細胞活性化の方法のシグナル強度の強さに依存することを示す。すなわち、細胞外受容体を架橋するために植物レクチンＣｏｎＡを用いて、二次シグナル入力の必要性を回避すると、５−ＨＴ１Ｂ阻害は約２００ｎＭの見かけのＩＣ５０を有し、一方、同種異系刺激（より弱いシグナル強度の）を用いると、同じ化合物は約５０ｎＭの見かけのＩＣ５０を有する。選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニストは、薬理学的に関連する濃度でこれらのアッセイを有意に阻害したが、非常に選択的な１Ｄアンタゴニスト（ＢＲＬ１５５７２）は、増殖応答に影響がなかったことに注目すべきである。従って、本明細書に開示するデータは、免疫応答におけるヒト１Ｂおよび１Ｄ受容体間の機能的違いを区別し、そして５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナルの選択的取り消しがリンパ球活性化応答を完全に阻害することを示す。
この同じ研究方針において、免疫応答を調節する２型セロトニン作動性受容体を標的とするアゴニストおよびアンタゴニストの能力を評価した。これらのデータを図８Ａおよび８Ｂに示す。同様に、ヒトリンパ球のマイトジェン刺激（ＣｏｎＡ）への薬剤効果対ヒト混合リンパ球反応における同じ薬剤パネル（それぞれ、パネルＡおよびＢ）の比較があった。これらの研究において、試験した薬剤のいくつか、すなわち、メチオテピン（５−ＨＴＲ１、２、６および７の一般的なアンタゴニスト）、ＬＹ５３８５７（５−ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃ受容体の選択的なインヒビター）、ＳＢ２０６５５３（５−ＨＴ２Ｂ／２Ｃ受容体の選択的なインヒビター）およびＳＢ２４２０８４（５−ＨＴ２Ｃ受容体の非常に選択的なインヒビター）は、薬理学的に関連する濃度で活性化応答を阻害する。これらの様々な薬剤の間の唯一の共通点は、５−ＨＴ２Ｃ受容体シグナルを阻害するそれらの能力である。従って、これらのデータは、５−ＨＴ２Ｃ受容体シグナルの選択的取り消しがヒトリンパ球の活性化プロセスを完全に阻害することを示す。
図９Ａおよび９Ｂは、５−ＨＴＲ３、４、６および７からの受容体シグナル伝達を阻害することもしくは引き起こすことの影響を示す（５−ＨＴ５受容体は、この受容体系を標的とするために特異的に用いることができる利用可能なアゴニストもしくはアンタゴニストがないので調べなかった）。５−ＨＴ３受容体の作動作用（ａｇｏｎｉｓｍ）も拮抗作用も、マイトジェンもしくは同種異系刺激のいずれかに応答するこれらの細胞の増殖能力にいかなる影響も与えない。４型受容体の作動作用および拮抗作用は両方とも、応答を阻害する。これに関して、４型受容体に対するアゴニストは、受容体のダウンレギュレーションを誘導し、その後のこれらのシグナルの取り消しをもたらすことが一般に知られている。５−ＨＴ６および７受容体の特異的阻害は、これらのＣＤ４依存的アッセイに影響を与えなかった。
最も劇的な影響は、１型および２型アンタゴニストの使用で見られたが、５ＨＴ３型受容体を刺激することならびに５ＨＴ６受容体を選択的に阻害することの影響もまた調べた。さらに特に、影響を評価するためにマウス混合リンパ球応答アッセイ（ＭＬＲ）を用いた。選択的６型アンタゴニスト、Ｒｏ ０４６７９は、アッセイの結果に影響を与えず、一方、これまでは３型アゴニスト、５−メチルヒドロキシトリプタミンの使用でわずかな増大があり、マイトジェン刺激および同種異系刺激間のインヒビターのふるまいにおける定性的違いは、以前にもしくは本明細書の他の所に開示されていない。
アッセイは、ＤＮＡの伸長する鎖への３Ｈ−チミジンの取り込み、すなわち、ＤＮＡ合成を以前に開示した。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、ある化合物が細胞を生存可能であるが増殖できない状態にすることによって作用し、そして別の化合物がアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導することによって作用する場合、ＤＮＡ合成をアッセイの終点として用いると結果は同一である。
マイトジェン的に刺激されたリンパ球培養物へのプロパノロール（一般的な５−ＨＴＲ１アンタゴニスト）およびリスペリドン（一般的な５−ＨＴＲ２アンタゴニスト）の影響をさらに評価するために、アッセイが進むにつれて生存細胞の数を手動で計数した。これらの細胞計数を図１１に示す。細胞を刺激しない場合、生存細胞の数に検出可能な変化はなかった。細胞をＣｏｎＡで刺激する場合、わずかな遅延期間が認められ、そして増殖期の開始をインヒビターがない場合に認められる刺激応答曲線と比較した。５ＨＴ１型受容体アンタゴニストは、細胞が増殖するのを妨げる。明らかに、開始細胞数と比較して減少もしくは増加はない。これはアネルギー、活性化経路を開始することができないこと、もしくは両方のためであるかどうかは不明である。一方、リスペリドンは短時間の細胞増加、続いて培養における細胞の除去を引き起こした。これらのデータは、細胞数の手動計数によってのみ得ることができ；ＤＮＡ合成アッセイはこれら２つの化合物で同等な結果を示したことが強調されるべきである。従って、本明細書に提示するデータに基づいて、２型セロトニン受容体を阻害するアンタゴニスト類は、リンパ球活性化プロセスの律速であるようである。
本明細書に開示するデータは、Ｔ細胞活性化シグナルが５−ＨＴ１Ｂもしくは５ＨＴ２型受容体のいずれかを通して生成されるシグナルに最も応答したことを示すので、３種の２型受容体のいずれが免疫系に最も大きい影響を与えたかに関するデータを裏付けるために薬理学的研究を考案した。このため、任意の他の受容体系と交差反応しない様々な特異性を有する一連の５ＨＴ２アンタゴニストを評価した（図１２）。第一の化合物、ＬＹ５３８５７は、３種全ての２型受容体を標的とする。第二の化合物、ＳＢ２０６５５３は、５ＨＴ２Ｂおよび５ＨＴ２Ｃ受容体のみを選択的に標的とする。第三の化合物、ＭＤＬ１１９３９は、５ＨＴ２Ａ受容体のみを標的とする。第四の化合物、ＳＢ２４２０８４は、５ＨＴ２Ｃ受容体の非常に選択的なアンタゴニストである。全ての薬剤をアッセイの開示時（時間＝０）もしくは第二の活性化段階の開始時（時間＝４８時間）のいずれかで投薬した。該データは、５ＨＴ２Ｃ特異的アンタゴニストが完全な阻害プロファイルを保持していることを本明細書に開示した（例えば図１２を参照）。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、本明細書に開示するデータは、５ＨＴ２Ｃ受容体シグナルがリンパ球における活性化プロセスの間に見られる律速シグナルであることを示す。
従って、本明細書に開示するデータは、トリプトファンがＴ細胞活性化応答の間にセロトニンに活発に転化されることを示唆する。さらに、薬理学的プロファイルは、５ＨＴ１型受容体、最も顕著には１Ａ型受容体が、活性化応答を開始するようであることを示唆する。５ＨＴ１Ａ受容体は静止細胞上に存在せず、そしてＴ細胞活性化の際にのみアップレギュレーションされることを示す先行技術（ｐｒｉｏｒ ａｃｔ）を考慮に入れるとこの結果は驚くべきことである。１型受容体と異なり、５ＨＴ２型受容体は、活性化応答の初期および後期の両方でセロトニンにより媒介されるシグナル伝達を必要とするようである。応答の間の任意の時点でのこのシグナルの妨害は、活性化の即時の停止をもたらす。さらに特に、本明細書に開示するデータは、５ＨＴ２Ｃ受容体を通したシグナル伝達が免疫応答を高めることおよび維持することに絶対的に必要とされることを初めて示した。
Ｍｅｌｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１９１−１１９３）は、胎児がどのようにして同種移植片拒絶（胎児は半分母親であり、そして半分父親であると考える）をなんとか切り抜けるかという問題を調べた。受胎産物が子宮内に生じた約８日後に、酵素（インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ、ＩＤＯ）がアップレギュレーションされる。この酵素は、トリプトファンおよびセロトニンのようなインドールアミンを異化することが知られている。受精と酵素のアップレギュレーションとの間のこの時間的ずれは、Ｔ細胞応答の活性化を可能にするのに十分な時間である。言い換えれば、体は免疫応答が起こるのを可能にし、そして任意の損傷がなされ得る前に、ＩＤＯがアップレギュレーションされ、セロトニンの局所供給を突然取り消す。単一の仮説によって拘束されることを所望しないが、セロトニン作動性シグナルの突然の喪失は、細胞の活性化された組におけるアポトーシスを誘導し、従って、胎児に応答することができる細胞を機能的に取り除き、一方、静止細胞集団は任意の外来病原体に応答できる状態でそのままにしておく。インビトロデータのインビボ検証を提示するために、強力な当該技術分野で認められている同種移植片拒絶モデルを選択した。
本明細書に開示するデータは、妊娠中に受胎産物への望ましくない同種異系応答から防御するために生来用いられる潜在的メカニズムを示唆するので、同種移植片拒絶モデルにおける５−ＨＴＲ活性化の影響を調べ、Ｐ８１５細胞（ＤＢＡマウスにおける脂肪細胞腫から採取された迅速に増殖する細胞系）をＣ５７ＢＬ６マウスにおいて強力な拒絶応答を引き起こすために用いた。これは、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）により記述されているものに基づく同種移植片アレルギー専門医（ａｌｌｅｒｇｉｓｔ）拒絶の当該技術分野で認められているモデルである。このモデルでは、Ｐ８１５細胞（Ｈ−２ｄ）とＣ５７ＢＬ６マウス（Ｈ−２ｂ）との間に完全なＭＨＣミスマッチがあり、従って、攻撃的免疫応答を保証する。図１３に開示するデータは、各群が３匹のマウスからなる６つの処置群を含む実験の結果を示す。各マウスには、研究の０日目に腹腔に注入する５ｘ１０６個のＰ８１５細胞を与えた。第一の群は未処置のコントロール群であり、これは同種異系刺激に対するマウスのベースライン応答を定めるために用いた。これらのマウスは、任意のさらなる処置なしに、他の処置群がそうであるように、研究の１４日目に殺し、そしてそれらの脾臓細胞をＰ８１５細胞の標的特異的致死に関してアッセイした。
未処置の群で認められる平均致死は、１００：１のエフェクター：標的比で約４５％であった。第二の群は、研究の６および８日目に尾静脈ボーラス注射（２００μｇ／注射）によって投与する５ＨＴ−２アンタゴニスト、リスペリドンで処置した。薬剤投与のタイミングは、Ｔ細胞が薬剤処置の前に完全に活性化されたことを保証するように選択した。第三の群は、５ＨＴ−１アンタゴニスト、プロパノロールで処置した。全ての５ＨＴ受容体アンタゴニスト処置群は、リスペリドン処置群に記述するように処置した。第四の群は、シクロスポリンＡで慢性的に処置した。シクロスポリンＡは、研究の開始の２日前、すなわち、−２日目に開始する１００μｇ／注射の投薬量でｉｐ投与し、そして注射を研究の期間にわたって毎日続けた。
シクロスポリンＡは、Ｔ細胞が活性化応答を開始するのを効果的に防ぎ、そして現在、移植処置に起因する合併症を処置するための最適な薬剤の一つである。第五および第六の群は、それぞれ、一般的な５ＨＴ１および５ＨＴ２アンタゴニストであるＳＢ２０６５５３（非常に選択的な５ＨＴ−２Ｃアンタゴニスト）およびメチセルギド（ＳａｎｓｅｒｔＴＭとして臨床的に知られている）で処置した。本明細書に開示するデータにより示されるように、シクロスポリンＡで処置したマウスは、予想されるように、同種移植片に対する細胞傷害性応答を発生しなかった（図１３）。プロパノロールで処置した群は、同種移植片拒絶応答からマウスを防御しなかった。この結果は、５ＨＴ１受容体が主として活性化応答の初期をもたらすことを示すことと一致した。
リスペリドン、ＳＢ２０６５５３およびメチセルギドで処置した群は全て、同種移植片応答を様々な程度に阻害した。アンタゴニストで処置した群において認められる免疫調節の性質の説明として、図１４は、ＳＢ２０６５５３で処置した群内の各マウスの個々の応答を示す。３匹の処置したマウスのうち２匹は、シクロスポリンＡで処置した動物において認められるものと同等の程度に同種移植片応答を阻害した。薬剤処置に応答しなかった１匹のマウスは、尾静脈注射での最初の試みが失敗したので薬剤の複数回注射を必要とした。該データは、インビトロ用量阻害曲線が、ほとんどそれが「閾値タイプ」応答であるかのように、阻害なしから１００％阻害まで急速に進行することを示す。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、１匹の応答しないマウスは十分な用量の薬剤を与えられなかったこともしくは複数回注射のストレスがマウスにおけるセロトニン応答を誘導したことが可能である。
神経伝達物質として、セロトニンは、応答細胞の表面上に提示される５ＨＴ受容体のタイプにより既定細胞へのその差動効果を及ぼす。免疫応答は非常に調節されており、そして提示抗原の性質および状況によりその応答の発現における微妙な変化を受けやすい。従って、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、セロトニンは免疫応答を調節することにおいて重要な役割を果たすので応答細胞は差別的な一連のセロトニン受容体を発現するかどうかと推測することができる。単球およびリンパ球は両方ともセロトニン特異的受容体を発現することは明らかである。しかしながら、先行技術の再調査は、受容体発現パターンの混乱する見解を与える。表１は、セロトニン受容体および免疫系細胞に関する研究およびそれらの結論を示す。
Figure 2005538065
最も初期の研究は、Ｔ細胞上の５ＨＴ２受容体の薬理学的存在を示し、一方、Ｍｉｌｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒから公開されたその後の論文は、５ＨＴ１Ａ受容体は存在するが５ＨＴ２受容体は存在しないというＲＴ ＰＣＲ証拠を提示する。さらに、彼らは、５ＨＴ１Ａ受容体は活性化Ｔ細胞上にのみ存在することを見出した。セルビア・クロアチアの研究所からの研究（Ｓｔｅｆｕｌｊ ｅｔ ａｌ．，２０００）は、１４個の既知の薬理学的に異なる受容体のうち１３個に対するプライマーでの逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用い、そして５ＨＴ１Ａも５ＨＴ２Ｃも存在しないことを見出した。Ｍａｒａｚｚｉｔｉ ｅｔ ａｌ．によるピサ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｓａ）からの最近の論文（２００１，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ４３：１２３−１２６）は、５ＨＴ２Ｃの存在を示す。これらの研究は、明らかに相互に食い違っている。本明細書に開示するデータは、インビトロおよびインビボデータに関して一致している。従って、セロトニン受容体の配列特異的プライマーを用いて上記のアッセイに使用したヒト細胞上の５ＨＴ受容体発現を調べるために考案した一連の研究を行った。
これらの研究のために、５ＨＴ１Ａ、２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂおよび４受容体に特異的なＰＣＲプライマーを作製した（実験の詳細ならびに個々のプライマー配列の両方は、上記の方法の節を参照）。ヒト末梢血リンパ球をマイトジェン刺激およびヒトＭＬＲを行うために本明細書の他の所に開示するプロトコルに従って精製した。単球からなる抗原提示細胞をリンパ球から分離した。１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡでの刺激の前もしくは後のいずれかでこれらの細胞集団を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。個々の受容体の存在を調べるためにＲＴ ＰＣＲを用いた。
５ＨＴ１Ａ特異的プライマーを用いることで得られるデータは、予期しなかった。予想されるフラグメントサイズは２３４ｂｐであった。このバンドは、活性化リンパ球集団においてのみかすかに認められ、そして図１５に示す像を生成するためにゲルの写真を撮った後に検出することはできなかった。その代わりに、該プライマー対により増幅される主要生成物は、約３８７ｂｐに移動するバンドであり、一方、図１５に示す他の受容体からの他の増幅フラグメントは全て予想されるフラグメント長に正確に一致した。この３８７ｂｐのバンドは、既知の５ＨＴ１Ａ受容体多型のいずれかもしくは既知のスプライスバリアントのいずれかによって説明することができない。
図１５に示すＰＣＲ増幅と並行して、個々のｃＤＮＡライブラリーを受容体特異的プライマーでＰＣＲを用いて増幅し、そしてＤＮＡシーケンスのために発現ベクター、すなわち、ＴＡ発現ベクター、ｐＣＲ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。
本明細書に開示するＰＣＲデータは定量的ではないが、本明細書に示す全てのＰＣＲ反応にわたって条件を正規化しようと試みた。５ＨＴ１Ａ特異的プライマーを用いる図１５に示す主要バンドは、静止単球および活性化リンパ球におけるより静止リンパ球および活性化単球において定性的に強いようである。３８７ｂｐのバンドならびに予想されるサイズのフラグメントをＴＡベクターにクローン化した。シーケンスにより、これらのＰＣＲ生成物は同定される。
５ＨＴ２受容体に関して、５ＨＴ２Ａはリンパ球上に存在し、そしてバンドは、活性化細胞上より静止リンパ球において強いようである。５ＨＴ２Ｂ受容体は、静止単球およびリンパ球にのみ存在するようであり、そして細胞が活性化されるようになると消失する。５ＨＴ２Ｃ受容体は、静止および活性化リンパ球の両方の上に存在する。５ＨＴ３受容体の存在は、検出されなかった。これは、文献出典および本明細書に開示する実験において得られる薬理学的データを考慮すると驚くべき結果であった。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、本明細書において使用する設計プライマー対が対応するｃＤＮＡを増幅することができなかったように受容体ｍＲＮＡにおける予期せぬ多型もしくは他の相違がある可能性がある。このＲＴ ＰＣＲは、異なる一組のプライマー対を用いて繰り返される。
さらに、５ＨＴ４受容体の増幅における予想されるサイズの明らかなバンドは、このアッセイにおいて検出された。このバンドは、静止リンパ球においてそして活性化単球において出現する。上記のように、図１５に示すこれらのバンドの各々をクローン化し、そして真偽に関してシーケンスする。
セロトニン作動性に基づく免疫療法は、生来用いられる。この戦略は、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、ならびに多数の他の自己免疫疾患の処置を考案するために用いることができる。同じ薬剤戦略は、遺伝学的に不適合の実質臓器、血液学的および幹細胞移植の拒絶、並びに遺伝子治療ベクターに向けられる応答に関与する免疫応答を止めるために用いることができる。
これらの疾患状態を処置するために用いられる現在の治療は、有毒であるだけでなく、各日用量で患者の全免疫系も阻害し、生涯にわたって患者を免疫無防備状態にする。臓器は一時的に防御されたままであるかもしくは再発は短期間回避されるが、患者は日和見感染を受けやすい状態にされる。
従って、本明細書に開示するデータは、新規な特異的治療方法を可能にする。本質的に、胎児−母親境界面の細胞は、セロトニンおよびトリプトファンのようなインドールアミンを局所的に分解する酵素（ＩＤＯ）を発現する。免疫細胞は、それらの細胞表面上の特定の受容体を介したセロトニンシグナル伝達を必要とし、従って、セロトニンの除去は、重要な活性化シグナル（１つもしくは複数）の突然の喪失および結果として起こるＴ細胞の活性化組の機能的削除をもたらし、このようにして同種異系胎児を防御する。
関与する酵素は、妊娠期間の早期（おおよそ妊娠第一期）にのみ必要である。免疫応答の抑制は、酵素の活性の期間中に活性化される細胞にのみ限定されることに注目することは重要である。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、他の感染もしくは疾患のない妊娠中に、唯一活性化される細胞は胎児を標的とするものであり；従って、これらは阻害されるべき唯一の細胞である。セロトニンシグナル伝達の一時的な除去は、妊娠の残りの間に胎児に対する免疫応答を阻止するのに十分であるが、いったん酵素が働くのを止めそしてセロトニンレベルが局所的に回復されると、任意の他の通常の免疫応答は進行することができる。
いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、セロトニン受容体薬物治療は、セロトニンの除去を選択的に模倣することにより、同様に有効であることができる。セロトニンをその結合を防ぐために除く代わりに、受容体シグナルインヒビターは、同じ最終結果で、受容体結合部位で神経伝達物質を打ち負かすかもしくは受容体シグナルを非競合的に阻害することにより作用する。自己免疫疾患もしくは移植された状態は、そうでなければ健康なヒトにおいて、唯一の活性化免疫細胞が、「自己」組織もしくは外来臓器を標的とするものである点で妊娠と同様である。パルス療法において投薬することができるセロトニンに基づく治療は、いったん薬剤のパルスが循環から取り除かれると静止免疫系が応答できる状態にしておきながら、これらの患者における活性化細胞を同様に標的とすることができる。
治療処置処方計画を改善しようと試みて、新しい実験的治療が開発されそして試験されている。ＣＤ４０／ＣＤ１５４共刺激経路を阻害する生物学的応用は、おそらく、これまで評価されている実験系の全てのうち最も有望な活性を示している（Ｄｉｅｈｌ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｅｄ．７８：３６３−３６６）。枯渇しない抗ＣＤ１５４抗体は、アカゲザルにおける完全ＭＨＣ不適合の移植片生存を延長するために用いられている（Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ，，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５：６８６−６９３；Ｋｅｎｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：８１３２−８１３６）。該抗体処置は、明らかに、同種移植片生存を延長することへのその治療効果の重要な特徴として活性化により誘導される細胞死（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）（ＡＩＣＤ）を利用する（Ｍａｒｋｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２４４６−２４５２）。さらに、抗ＣＤ１５４抗体で誘導される寛容は、潜在的に攻撃的なＴ細胞の削除を伴うだけでなく、移植片反応性Ｔ細胞の新しいコホートも阻害することが示されている（Ｇｒａｃａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：４７８３−４７８６）。しかしながら、抗ＣＤ１５４抗体での研究の大部分は、同種移植片が、動脈硬化のために最終的に拒絶することを示す。実験動物において発生する移植片動脈硬化は、明らかに、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の浸入に起因する（Ｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４８０５−４８１０）。最近のデータは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞がＣＤ１５４妨害により効果的に標的とされないことを示唆する（Ｅｎｓｍｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６９：２６０９−２６１２）。たとえＣＤ８＋ ＣＴＬ応答がＣＤ４０リガンド妨害をすり抜け得るにしても、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体投与の治療効果は目覚しいにほかならず、そして任意の主要な都合の悪い副作用がないようである（Ｋｅｎｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８１３２−８１３６）。
モノクローナル抗体は、新規な治療処置計画として役割を果たしており、そして今後も果たし続ける。これらの抗体は、現在開発中である全てのバイオテクノロジー薬の約１／４、そして現在使用されているかもしくは調べられているほぼ３０の製品を占める（Ｂｒｅｅｖｅｌｄ，２０００，Ｌａｎｃｅｔ ３５５：７３５−７４０）。しかしながら、モノクローナル抗体は本質的にいくつかの制限を欠点として有する。任意の比較的大きなタンパク質に当てはまるように、ヒト治療用途のための商業生産および精製方法の費用は、（より伝統的な）小さな有機薬剤を製造する費用に対して、並外れて高い（Ｈｉｌｌｅｇａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．１３８：Ｓ２４−３２）。モノクローナルの短期間の副作用は許容可能でそして予測可能であるが、長期の安全性は明らかにされていない。１週もしくはそれ以上のインビボ半減期はまれではないが、モノクローナル抗体は、関節リウマチにおいて滑液組織に効率よく浸透することができないような、組織浸透と関連する問題を有することが多い（Ｃｏｌｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｑ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：２２５−２４１）。簡潔に言えば、モノクローナル抗体は、未解決の医学上の問題のいくつかに即座の解答を与えるが、長期の解答を意味しない。主要な製薬会社によってしばしば指摘されているように、最もよい薬剤は、依然として古典的な小有機分子である。
「移植研究の聖杯は、ショートパルスの治療によって寛容を誘導することである」と言われている。（Ｐｒｏｆ．Ｈｅｒｍａｎ Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｉｒ Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄｕｎｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫを参照）。ここで用いられる理論的説明は、活性化により誘導される細胞死、ＡＩＣＤを利用するショートパルス治療を設計するための戦略を考案することである。リンパ球上に存在する５−ＨＴ受容体の多様性は、活性化応答の正および負の調節の両方を与えるのに十分なはずである。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、セロトニン系は原始の防御系に相当し、そして免疫応答の複雑な調節要素を与える多様な細胞決定基の関与が時間とともにこの系に加えられたと推測することは魅力的である。実際、免疫応答の生成は、神経接合部と似ていなくもない、「免疫学的シナプス」を伴うという幅広い認識がある（Ｂｒｏｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３７５−３９６）。胎児拒絶を防ぐために生来用いられるメカニズムは、種の繁殖を維持するために進化的時間スケール上の初期の出来事でなければならなかった。セロトニン経路が原始の防御経路に相当する場合、妊娠中に胎児を防御するためにトリプトファン除去によってセロトニンレベルを制御することを自然が選択することは理にかなうかもしれない。
「望まれていない」炎症応答を制御するためにセロトニン作動性受容体シグナルを標的とすることは、セロトニン受容体系の薬理学的に製薬学的に選択的なアンタゴニストに関する情報の膨大なデータベースを利用することができるという利点を与える。モノクローナル抗体に基づく治療の使用と異なり、この戦略は、免疫応答を生成することに関与する活性化Ｔ細胞の全て（ヘルパーおよび細胞傷害性Ｔ細胞の両方）を機能的に取り除く手段を与える。
免疫を制御するために自然の経路を用いることの明らかな利点は、単一の処置が少なくとも数ヶ月の防御を与えることである。この防御の最終的な期間は分かっていない。同様に、明らかな治療標的には、多発性硬化症および関節リウマチのような病原性炎症応答を伴う多くの疾患が包含される。ＣＯＸ−２酵素インヒビター（ＣｅｌｅｂｒｅｘＴＭのような）の現在の使用と異なり、セロトニンに基づく治療は、応答を単に一時的に遅らせるのではなく疾患を引き起こす原因となる細胞を機能的に取り除くように設計される。
要約すると、セロトニン受容体アンタゴニストは、胎児生存の必要性のために考案されるかもしくはそれから生じる免疫防御の強力な自然の原始メカニズムを模倣するために用いることができる。自己免疫疾患および移植免疫学の分野における処置の目標は、将来の感染に必要とされる免疫細胞の静止集団を損なわずに望まれていない免疫応答を阻害しようと同じように試みることであるので、本明細書に開示するデータは、自己免疫疾患および移植免疫学の処置の方法の開発のための手段を提供する。この治療戦略は、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、クローン病および潰瘍性大腸炎、ならびに多数の他の自己免疫疾患の処置に意味合いを有する。この治療戦略はまた、遺伝学的に不適合の実質臓器、血液学的および幹細胞移植、ならびに遺伝子治療に現在用いられるベクターを防御するために用いることもできる。
５−ＨＴ受容体サブタイプｍＲＮＡの差別的発現
全細胞ＲＮＡを製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙミニプレップを用いて抽出した。ＲＮＡサンプルをゲルのＥｔＢｒ染色により定量し、そして約１μｇの各ＲＮＡサンプルをＤＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡ合成は、オリゴＴ１２−１８プライマーを用いて、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ逆転写酵素で行った。得られるｃＤＮＡは、５−ＨＴ受容体特異的プライマーを用いるＰＣＲ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｉｇｍａ）において鋳型として用いた。ＰＣＲ条件は：４５秒間９５℃、４５秒間６１．５℃、４５秒間７２℃であった。２５サイクルの後に１０分の伸長工程（７２℃）を続けた。ＰＣＲ生成物を３％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー）により分析した。さらなる確認のために、放射性標識した受容体特異的内部オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＰＣＲ生成物をサザンブロットハイブリダイゼーションに供した。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記述されているように、ＰＣＲ生成物をアガロースゲルからＨｙＢｏｎｄ膜に移し、そしてハイブリダイゼーションを行った。簡潔に言えば、１０Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌのポリＡおよび１００μｇ／ｍｌのＳＳ ＤＮＡを含有する６ＸＳＳＣにおいて膜をプレブロックした。ハイブリダイゼーション当たり２０ｐｍｏｌの放射性標識したプローブを加え、そして一晩インキュベーションした（７３℃で）。翌日に過剰のプローブを洗い流し、そして膜をＫｏｄａｋフィルムに感光させた。内部オリゴヌクレオチドは：１Ａ：ｃｔｇｃａｇａａｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔａｔｃｔｔａｔｔｇｇｃｔｃｔｔｔ（配列番号：１）；１Ｂ：ｇｔｇｇａｇｔａｃｔｃａｇｃｔａａａａｇｇａｃｔｃｃｃａａｇａｇｇｇ（配列番号：２）；１Ｄ：ｃｔｃｔｃｔｔｔｔｔｃａａｃｃａｃｇｔｇａａａａｔｃａａｇｃｔｔｇｃｔ（配列番号３：）；１Ｅ：ａｔｃｔａｇａｔｃａｃｃｃａｇｇａｇａａｃｇｔｃａｇｃａｇａｔｃｔｃｔａ（配列番号：４）；１Ｆ：ｇａｇｃａｇｃａａａｇａｃａｔｔａｔａｃｃａｃａａｇａｇａｃａａｇｃａａ（配列番号：５）；２Ａ：ｔｃｇｇｃｔｃｔｔｔｔｇｔｇｔｃａｔｔｔｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｔａａｃｃａ（配列番号：６）；２Ｂ：ｃｔｃａａｃｇｃｃｔａａｃａｔｇｇｔｔｇａｃｔｇｔｇｔｃｔａｃａｇｔｔｔ（配列番号：７）；２Ｃ：ｔａａｃｔｇａｃａｔｔｔｔｃａａｔａｃｃｔｃｃｇａｔｇｇｔｇｇａｃｇｃｔ（配列番号：８）；３Ａ：ｇｇｇａｇｔｔｃａｇｃａｔｇｇａａａｇｃａｇｔａａｃｔａｃｔａｔｇｃａｇ（配列番号：９）；３Ｂ：ｔｔｃａａｔｃｔａｔｃａｇｃａａｃｔａｃｃｔｃｃａａａｃｔｃａｇｇａｃｃ（配列番号：１０）；４：ｃａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｔｃａｃｃａａｔａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔｔｔｃ（配列番号：１１）；５：ｃｔｔｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａｇａｃｇｔａｃｔｃｔｇａｇｇ（配列番号：１２）；６：ａｔｃｃｔｃａａｃｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｃ（配列番号：１３）；７：ｔｇａａａｇｇａａａａａｃａｔｃｔｃｃａｔｃｔｔｔａａｇｃｇａｇａａｃａ（配列番号：１４）であった。
本明細書に開示する実験の結果は、下記のとおりである。
ヒトリンパ球における５−ＨＴ受容体特異的ｍＲＮＡの発現に関して、本明細書に開示するデータは、４８時間刺激した細胞に対する静止細胞における５−ＨＴ受容体のｍＲＮＡの有無を特性化する代わりに、活性化プロセスが進むにつれて受容体ｍＲＮＡレベルのキネティック調節があるかどうかを示す。これらの研究では、研究の開示時（時間＝０）に細胞を５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡで処理した。時間点は、０、０．５、２、４、６、１２、２４および４８時間で取った。各時間点で、オリゴ−ｄＴでプライミングしたライブラリーを作製するために１μｇの全細胞ＲＮＡを用いた。これらのオリゴ−ｄＴライブラリーは、１４個の５−ＨＴ受容体の各々を増幅するために鋳型として用いた。増幅生成物の各々をクローン化しそしてシーケンスする代わりに、生成物の真偽は、本明細書の他の所に開示するようにプローブとして受容体特異的内部オリゴヌクレオチドを使用して、サザンブロットハイブリダイゼーションを用いて確認した。ゲノムＤＮＡ増幅を陽性コントロールとして用い；陰性コントロールは、ＤＮＡ汚染を制御するために逆転写段階なしに増幅したＲＮＡであった。
この研究のデータを図１６に示す。様々なサンプルの時間点（刺激後の時間単位）をブロットの上下に示し、そして個々の５−ＨＴ受容体を各ブロットにおいて左側に示す。「Ｍ」は、マーカーレーンを示す。５−ＨＴ２Ｃ受容体に対して示すデータはサザンブロットではなく、それは陽性コントロールと一緒にＰＣＲ生成物が予測されるサイズで泳動することを示す臭化エチジウム染色したゲルであることに留意すべきである。
図１６に示すデータは、セロトニン受容体特異的メッセージの各々の独自に調整された発現パターンを示す。５−ＨＴ１Ｆもしくは３Ｂ受容体の発現の証拠はなく、そしてそれぞれのプライマーを再設計し、そしてそれでもやはりいかなる生成物も増幅されない。さらに長いブロット感光の際に、３Ａ受容体に対応するかすかであるが再現可能なバンドがある。
１Ａおよび２Ａ受容体に関するデータについて、様々な異なる個体から採血した血液を用いてそしてより長い期間スケールにわたって研究を繰り返した。５−ＨＴ１Ａは、刺激後約５４時間で現れる。この時間点は、アッセイのピークおよび活性の下降の開始と一致する。２Ａ受容体の２回のＰＣＲ増幅（各２５サイクル）を用いて、予想されるサイズのＲＴ−ＰＣＲ生成物が検出された；しかしながら、該ＰＣＲ生成物は、１回のみのＰＣＲ（２５サイクル）を行った場合にサザンブロッティングを用いて検出されなかった。他のアッセイデータにおいて、５−ＨＴ２Ａは調節されたバンドとして現れる（刺激の開始後すぐにアップレギュレーションされ、そして２回目の細胞分裂の直前に再び現れる）。これらのデータは、５−ＨＴ２Ａ ｍＲＮＡがリンパ球に存在することを示唆する。５−ＨＴ２Ａ生成物の同一性は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより確かめられている。
さらに、本明細書に開示するデータは、ヒトおよびマウスリンパ球の両方に対するセロトニン作動性受容体アゴニストおよびアンタゴニストの薬理学的ふるまいを示す。図１７は、ヒトリンパ球のマイトジェン刺激へのクラス１特異的薬剤のパネルの結果を示し、そして同等な結果がマウス系内で認められた。全体として、応答の最も著しい阻害は、５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナルの選択的取り消しに関して認められた。しかしながら、１Ｂおよび１Ｄシグナルの同時阻害は、両方の薬剤の１Ｂ受容体の結合キネティックスは同等であるが、同じ阻害曲線をもたらさない（５−ＨＴＲ薬剤に関する詳細は、ｗｗｗ．ｔｏｃｒｉｓ．ｃｏｍを参照）。
図１７に示すデータは、様々な薬剤の３Ｈ−チミジン取り込みに対する影響を示す。これは、細胞のＣＤ４＋サブセットにおいて起こるＤＮＡ合成を表すものであるはずである。従って、これらのデータは、ヘルパーＴ細胞へのインビトロ薬剤効果を表す。
最後に、ＣＤ８依存性同種移植片拒絶モデルを用いてインビボで研究を行い、ここで、Ｐ８１５細胞（ＤＢＡマウスにおける肥満細胞腫から採取された迅速に増殖する細胞系）を増やし、そしてＣ５７ＢＬ６マウスにおける強い拒絶応答を引き起こすために用いた。この研究では、マウスに研究の０日目にそれらの腹腔に注入する５ｘ１０６個のＰ８１５細胞を与えた。第一の群は、同種異系刺激に対するマウスのベースライン応答を得るために用いる、未処置のコントロール群（投薬を受けたことがない動物）であった。陽性コントロールは、任意のさらなる処置なしに同種異系細胞で処置した。これらのマウスは、Ｐ８１５細胞に対して誘導される同種異系応答を評価するために用いた。
全ての処置群を研究の１４日目に殺し、そしてそれらの脾臓細胞をＰ８１５細胞の標的特異的致死に関してアッセイした（陽性コントロール群で認められる平均全体致死は、１００：１のエフェクター：標的比で約４５％であった）。セロトニン特異的化合物を研究の５および７日目に尾静脈注射（３００μｇ／注射）によって投与した。薬剤投与のタイミングは、Ｔ細胞が薬剤処置の前に活性化されたことを保証するように選択した。
図１８Ａに示すデータは、処置したマウスの単一群を用いて得られる代表的な研究である。アッセイの読み取りは、標的細胞のトリチウム化チミジンのＣＰＭ保持である。言い換えれば、標的をチミジンで放射性標識し、そしてエフェクター細胞と一緒にインキュベーションする。これらの細胞が活性化ＣＴＬによりうまく溶解される場合、それらのＣＰＭは相応して減少される。本明細書に開示するデータにより示されるように（図１８Ａ）、メチセルギド処置は同種異系致死応答を妨げた。
全処置研究を図１８Ｂに示す。第一のコントロール群は、シクロスポリンＡで慢性的に処置した（ｎ＝３）。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、研究の開始の２日前に、すなわち、−２日目に開始する１００μｇ／注射の投薬量でｉｐ投与し、そして注射は研究の期間にわたって毎日続けた。シクロスポリンＡは、Ｔ細胞が活性化応答を開始するのを効果的に防ぎ、そして現在、移植処置に起因する合併症を処置するための最適な薬剤の一つである。賊形剤コントロールは、セロトニン作動性薬剤処置とまったく同じように処置する単にバッファーである。このグラフ上の各棒は、個々の動物から得られるデータを表す。このように、シクロスポリンＡ処置は同種異系応答を妨げ、一方、賊形剤処置は効果がない（予想されるように）ことを明らかに理解することができる。メチセルギド（１型部分アゴニスト／２型アンタゴニスト）阻害プロファイルは、２Ｂ／２Ｃ型選択的インヒビター（ＳＢ２０６５５３）のプロファイルがそうであるように顕著であった。
ヘルパーＴ細胞でのインビトロ結果に基づくこれらの驚くべきデータは、選択的１Ｂ／１Ｄインヒビターおよび選択的５−ＨＴ６インヒビターで得られるデータであった。１Ｂ／１Ｄインヒビターは、インビトロにおけるヘルパーＴ細胞の最も強力で且つ有効なインヒビターであったが、ＣＤ８依存性応答に関してインビボで認められる明らかな効果はなかった。１Ｂ／１Ｄアンタゴニストで適当な生物学的利用能があったかどうかは不明である。さらに、他のデータは、選択的１ＢアンタゴニストがＣＤ８依存性同種移植片応答の有効なインヒビターであることを示し、本明細書の他の所に開示するインビトロデータと一致する。一方、６型インヒビターはヘルパーＴ細胞のインビトロ増殖を高めたが、インビボＣＤ８依存性同種異系応答を妨げることができた。
喘息を包含する閉塞性気道疾患におけるセロトニンの役割
本明細書の他の所に開示するデータは、アレルギー喘息応答の免疫成分が既知の神経伝達物質、セロトニンにより調節されることを初めて強力に示唆する。免疫応答を調節することにおけるセロトニンの役割は、これまで未知であった。本明細書に開示するデータは、免疫応答におけるセロトニンの役割をヒト喘息患者を処置する新規な治療方法を開発するために使用できることを示す。
神経科学および免疫学の分野における最近の進歩は、神経および免疫系が進化の歴史の初期の時点で相互から分岐したと考える強力な根拠を提供する。さらに、本明細書の他の所にすでに開示するデータは、セロトニンが免疫応答を調節することにおいて重要な役割を果たすことを示す。これらのデータは、セロトニンにより媒介されるシグナルが、アレルギー喘息の免疫学的成分の生成における律速であることを示す。この発見は、ヒト喘息およびいくつかの他の閉塞性気道疾患の新規の有用な処置を示唆する。
一つの態様として、本明細書に開示する実験は、樹状細胞（ＤＣ）上およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット上に存在するセロトニン特異的受容体のパターンの同定を示す。これらは、アレルギー性免疫応答を高めることに関与する主要な細胞である。１４個の既知の薬理学的に異なるセロトニン作動性受容体のいずれがこれらの細胞上に存在するかを同定するためにＲＴ−ＰＣＲを用いる。セロトニンは、いくつかの精神疾患において、嘔吐の制御において、情緒的疾患の発生において、そして片頭痛と関連する疼痛の制御において主要な役割を果たすので、個々の５−ＨＴ受容体を選択的に調節する薬剤パネルを開発するために用いられる膨大な一団の製薬学的研究が当該技術分野においてこれまで実施されている。従って、活性化応答の生成において律速である特異的セロトニン作動性シグナルを同定する目的で樹状細胞により媒介されるＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化の機能性インビトロアッセイにおいて個々の受容体の役割を分析するために用いることができる十分に特性化されたセロトニン受容体特異的薬剤のこのパネルが利用可能である。さらに、該実験は、これまでのアッセイにより同定される潜在的治療薬の実用性を立証するために気道過敏性のインビボモデルの使用を示す。これらの実験は、アレルギー応答を高めることに関与する調節プロセスの基本的理解および閉塞性気道疾患を患っている患者を処置するための新しい治療戦略の開発に役立つはずである。本明細書に開示する戦略は、シグナルを阻害するように病的プロセスもしくは応答を媒介する細胞がセロトニンにより媒介されるシグナルを必要とする他の疾患もしくは症状を処置するための薬剤の同定に有用である。
本明細書の他の所に開示するデータは、セロトニンが喘息患者の肺における抗原提示の潜在的メディエーターであることを示す。さらに、免疫学における最近の進歩は、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の基本的相互作用／伝達が神経シナプス接合部と同様であることを該分野が理解するのに役立っている（最近の総説にはＢｒｏｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：３７５−９６を参照）。実際に、免疫系および神経系は、多数の独特な特徴を共有する。例えば、神経筋接合部に存在する十分に特性化された糖タンパク質、アグリンは、最近、免疫学的シナプスの重要なモジュレーターとして同定されている（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１６８１−１６８６）。Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．は、アグリンがＴ細胞抗原受容体複合体のクラスター化に関与できることを示唆する。
その一方で、免疫応答の生成における重要な糖タンパク質であることが知られているクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、最近、神経シナプスにおいて重要な役割を果たすことが示されている（Ｈｕｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：２１５５−２１５９）。Ｈｕｈ ｅｔ ａｌ．は、ＭＨＣクラスＩが発生中のおよび成熟した神経系における活動依存性リモデリングおよび接続の可塑性に関与することを示した。さらに、Ｌ１神経接着タンパク質は、現在、Ｔ細胞活性化応答における重要なタンパク質であることが示されている（Ｂａｌａｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：９３８−４３）。「闘争か逃避」応答のその寄与のために最初に特性化された、ドーパミンおよびノルエピネフリンのような主要な神経伝達物質もまた、リンパ球上のそれらのコグネイト受容体の発現を通して免疫応答を調節する（Ｓａｎｔａｍｂｒｏｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．４５：１１３−１１９；Ｋｏｈｍ ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ２１：５３９−５４２；Ｓａｈａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ９：２３−３３）。総合すると、これらのデータは、免疫系および神経系が進化の時間スケール上のある初期の時点で相互から分岐したことを示唆する。さらに、セロトニンが免疫応答を高めることにおいて律速的役割を果たすことを示す、本明細書の他の所に開示するデータは、肺樹状細胞の表面上のセロトニンに応答する受容体の存在および肺における喘息応答を開始することにおけるセロトニンの重要な調節的役割を示唆する。
吸入された抗原に遭遇すると、気道樹状細胞（ＤＣ）は肺の排出リンパ節に移動し、共刺激リガンドの発現をアップレギュレーションし、そしてナイーブＣＤ４＋ Ｔリンパ球と相互作用し、一次免疫応答を開始する（Ｗｉｌｌｓ−Ｋａｒｐ，１９９９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：２５５−８１）。該データは、樹状細胞／リンパ球の相互作用がセロトニン作動性シグナル伝達に応答して調節されることを示唆する。樹状細胞上の５−ＨＴ受容体の有無についてほとんど知られていないが、本明細書の他の所に開示するデータはそれらの存在を強く示唆する。従って、ＲＴ−ＰＣＲによって、樹状細胞をセロトニン作動性受容体の発現に関して調べる。本明細書に開示するデータは、初期研究用に未熟マウス骨髄樹状細胞の使用を示す。ＬＰＳおよびＩＬ−４の存在下で成熟している樹状集団に対する未熟細胞における様々な５−ＨＴ受容体のｍＲＮＡレベルを比較する。さらに、静止／ナイーブおよび活性化ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞集団上に存在する受容体アレイを検出する。ヒト末梢血リンパ球に関して本明細書の他の所ですでに開示するデータは、ＣｏｎＡのような活性化シグナルに応答してアップおよびダウンレギュレーションされる様々な異なる５−ＨＴ受容体の存在を示唆する。
細胞上に存在する５−ＨＴ受容体（１つもしくは複数）、次に樹状細胞およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット上に存在する５−ＨＴ受容体を選択的に標的とするための適切なセロトニン作動性受容体調節因子を同定する。ＤＣは、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における抗原提示細胞として用いる。３Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成をモニターすることに加えて、アッセイは１型および２型マーカー（それぞれ、ＩＬ−１２およびＩＬ−４）の生産に関してモニターする。
オボアルブミンにより誘発される気道過敏性（ＡＨＲ）のインビボマウスモデルを本明細書において用いる。このアッセイは、喘息の完全な動物モデルにおけるセロトニン作動性シグナルを選択的に阻害することの効果を特性化する。また、発現される５−ＨＴＲの異なる対立遺伝子を有するマウスを、最終的には重要な５ＨＴ受容体の共通遺伝子系統を用いることにより、異なるＡＨＲパターンに関して試験する。
本明細書の他の所ですでに開示するデータは、様々な異なるセロトニン特異的受容体が静止リンパ球上に存在することおよびそれらの発現パターンが活性化の際に変化することを示す。５−ＨＴ２Ｃ受容体から生成されるシグナルは、マウスおよびヒトＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方ならびにＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の律速であるようである。１Ｂ／１Ｄ受容体の選択的阻害は、ヒトおよびマウスヘルパーＴ細胞の両方の増殖に強力な効果を有するが、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化には効果がない。一方、５−ＨＴ６受容体の選択的阻害は逆の効果を有する。
喘息応答に関して、樹状細胞はアレルゲンの最も有望な抗原提示細胞である。次に、これらの細胞はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞を活性化し、Ｔｈ２型応答を誘導する。本明細書の他の所に開示する実験は、ＤＣおよびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方の上のセロトニン作動性受容体の発現パターンを特性化する。本明細書の他の所ですでに開示するのに基づくデータは、５−ＨＴ１Ｂおよび１Ｄ受容体がＣＤ４＋Ｔ細胞上に存在するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上に存在しないことを示す。該データは、Ｔ細胞性により媒介されるアレルギー応答の活性化および維持に絶対的に必要とされる特異的５−ＨＴシグナルがあることを示唆する。本明細書の他の所に開示するデータは、適切な受容体シグナルを選択的に取り消すことにより、活性化Ｔ細胞集団においてアポトーシスを誘導し、レパートリーからのこれらの細胞の機能的削除をもたらすことができることを示した。これは、好酸球および肥満細胞の脱顆粒につながるフィードバック経路を破壊し、そして喘息応答における「ショート」を引き起こすはずである。
喘息応答中にＩＬ−４およびＩｇＥの生産を導く原因となる、未熟および成熟ＤＣ上の５−ＨＴ受容体の分布ならびにＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞サブセット上の受容体の分布を特定する。現在、これらの細胞タイプのいずれかの上のセロトニン特異的受容体の分布に関する利用可能な情報はない。これは、本明細書の他の所に開示するデータの直接的拡張であり、そしてＣＤ８依存性免疫応答に対してＣＤ４依存性免疫応答を区別して導く原因となるシグナル伝達プロセスを理解するための基礎を提供する。
上記のように、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞において発現される受容体がそうであるように、未熟骨髄樹状細胞ならびにＬＰＳおよびＩＬ−４のいずれかの存在下でもしくはＬＰＳおよびＩＬ−１２の存在下で成熟している樹状細胞において発現される５ＨＴ受容体を同定する。これらの研究は、樹状細胞およびヘルパーＴ細胞の濃縮のために、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）により供給されるキットを使用して、負の選択技術を用いてＢＡＬＢｃマウスで行う。樹上細胞集団には、５％ ＦＢＳおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで洗浄する骨髄採取（大腿骨および頚骨を用いる）からマウス造血前駆体を単離する。遠心分離後に、有核細胞を５％正常ラット血清を加えたフラッシング培地において５ｘ１０７細胞／ｍｌで再懸濁する。４℃で１５分間のインキュベーション後に、細胞懸濁液を樹状細胞前駆体を濃縮するために（ＳｔｅｍＳｅｐＴＭキットを用いて）製造業者の説明書に従って処理する。樹状細胞前駆体をＰｕｌｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１０３６−１０４１）により記述されている方法に従って１０００ユニット／ｍｌのマウス組み換えＧＭ−ＣＳＦにおいて５日間培養する。これらの細胞の成熟は、Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９により記述されている方法に従って行う。
ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮には、ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ細胞分離システムもまた製造業者により提供されるプロトコルを用いて使用する。簡潔に言えば、全マウス脾臓細胞懸濁液をこの方法に用いる。Ｆｃ受容体への非特異的結合は、マウス細胞調製に正常ラット血清を用いて阻止する。ナイーブＴ細胞精製には、特異的ビオチニル化抗体を最初に加える。サンプルを氷上で１０〜３０分間インキュベーションした後、適切なリンパ球濃縮混合物（ＣＤ８＋、ＣＤ１９＋など）を加え（氷上で３０分）、続いて磁気コロイド懸濁液を加える（氷上で３０分）。このインキュベーション中に、望ましくない細胞は、磁気ビーズに連結したテトラマー抗体に結合する。次に、細胞−抗体複合体をあらかじめ洗浄した分離カラム（製造業者により提供される、磁石の内部に置く）上に載せる。カラムを３Ｘカラム容量で洗浄し、そしてここで所望の細胞集団を含有する素通り画分を集める。濃縮細胞の典型的な純度は、細胞サブタイプの大部分で９０〜９９％である。回収された濃縮細胞の純度は、必要に応じて、ＭＣＰ Ｈａｈｎｅｍａｎｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙでコアフローサイトメトリー設備を用いてＦＡＣＳ分析により確かめる。ＳｔｅｍＳｅｐＴＭ精製システムは、１．５ｘ１０１０個までの総細胞を分画するために用い、従って、サブセット特異的ｃＤＮＡライブラリーを製造するために必要な十分な量の細胞を提供する。
全細胞ＲＮＡは、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙミニプレップを用いて抽出する。ＲＮＡサンプルをゲルのＥｔＢｒ染色により定量し、そして約１μｇの各ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡ合成に用いる。ｃＤＮＡ合成は、オリゴＴ１２−１８プライマーを用いて、製造業者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ逆転写酵素で行う。得られるｃＤＮＡは、５−ＨＴ受容体特異的プライマーを用いるＰＣＲ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｉｇｍａ）における鋳型である。ＰＣＲ条件は：４５秒間９５℃、４５秒間６１．５℃、４５秒間７２℃である。３５サイクルの後に１０分の伸長工程（７２℃）を続けた。ＰＣＲ生成物は、３％アガロースゲル電気泳動（ＴＡＥバッファー）により分析する。さらなる確認のために、放射性標識した受容体特異的内部オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＰＣＲ生成物をサザンブロットハイブリダイゼーションに供する。
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記述されているようにＰＣＲ生成物をアガロースゲルからＨｙＢｏｎｄ膜に移し、そしてハイブリダイゼーションを行う。簡潔に言えば、膜を１０Ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、１μｇ／ｍｌのポリＡおよび１００μｇ／ｍｌのＳＳ ＤＮＡを含有する６ＸＳＳＣにおいてプレブロックする。ハイブリダイゼーション当たり２０ｐｍｏｌの放射性標識したプローブを加え、そして一晩インキュベーションする（７３℃で）。翌日に過剰のプローブを洗い流し、そして膜をＫｏｄａｋフィルムに感光させる。
典型的なｃＤＮＡライブラリーには、０．５〜２μｇの全細胞ＲＮＡが必要とされる。マウス脾臓細胞からのＲＮＡ回収は、１ｘ１０６個の細胞から約３．５μｇである（脾臓当たり３５０μｇ）。１個のマウス脾臓は、１つのサブセットの細胞の完成した１組のｃＤＮＡライブラリーを製造するのに十分である（これは、この実験の完了のために全部で少なくとも７〜１０匹のマウスの結果になる）。
選択的５−ＨＴ受容体シグナルの機能的依存性は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のインビトロ活性化において評価する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの成熟樹状細胞を上記のように精製し、そしてＢＡＬＢｃマウスから得られるリンパ球を同種異系的に刺激するために用いる、。細胞活性化は、新たに合成されるＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取り込みの結果として測定する。ＩＬ−４およびＩＬ−１２のレベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、製造業者の説明書に従う）により無細胞組織培養上清から決定する。
セロトニン作動性アゴニストおよびインヒビターを製造業者（Ｔｏｃｒｉｓ Ｃｏｏｋｓｏｎ Ｉｎｃ．，Ｅｌｌｉｓｖｉｌｌｅ，ＭＩ）から選択する。受容体特異的モジュレーターを時間０（アッセイの開始時）もしくは時間＝４８時間のいずれかでアッセイに加える。一般に、開始活性化シグナルの送達と１回目の細胞分裂の開始との間には２日の遅延がある。本明細書の他の所ですでに開示するデータは、薬剤をｔ＝０もしくはｔ＝４８時間で加えたかどうかによりそれらがアッセイの結果に根本的に異なる影響を有することを示す。検討する薬剤添加の他の変数は、時間０で加え、次に時間＝２時間で洗浄して除く薬剤の効果である。これは、５−ＨＴ特異的アゴニストの多くの効果を試験するために特に重要である。該アゴニストの大部分は、長時間接触したままである場合に受容体を脱感作する（見かけの阻害をもたらす）。薬剤は、最初に０．１、１、１０および１００マイクロモルの濃度範囲で試験する。
ＢＡＬＢｃリンパ球を得るために、脾臓をＢＡＬＢｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から採取する。単細胞懸濁液を得るために脾臓をスピン培地（２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｓｉｇｍａ）および１％ Ｌ−Ｇｌｕ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）を補足したＲＰＭＩ１６４０倍地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））においてすりつぶす。細胞を１２００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、そして上清を取り除く。赤血球（ＲＢＣ）をＡＣＫバッファーで溶解する（Ｃｏｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１．３−３．１．５節に記述されているように）。残りの細胞をスピン培地に再懸濁し、そして接着細胞を取り除くためにナイロンウールカラム上に載せる。細胞をカラム上（５％ ＣＯ２、３７℃）で約２時間インキュベーションする。非接着細胞をスピン培地を用いてカラムから洗浄して除き、遠心分離し、そして感作培地（１０％ウシ血清、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１％ Ｌ−Ｇｌｕ、ベータ−ＭＫＥを補足したＲＰＭＩ１６４０倍地）に再懸濁する。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）は、本質的にＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３．１２．６−３．１２．７節，１９９９）に記述されているように行う。すなわち、Ｃ５７／Ｂ６Ｊマウスからの濃縮した成熟樹状細胞を刺激物質として用いる。ＢａｌｂＣ／ＢＹＪからの一次リンパ球細胞をレスポンダーとして用いる。薬剤を９６ウェルＵ底プレート上に事前に平板培養する。全ての実験条件を少なくとも三重反復でアッセイする。１０％ ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ培地中１００，０００個のＣ５７／Ｂ６細胞を各ウェルに平板培養する。２００，０００個のＢａｌｂＣ／ＢＹＪ細胞を２００μｌ／ウェルの最終容量になるように刺激物質細胞上に平板培養する。バックグラウンドコントロールには、ＢａｌｂＣ細胞もＣ５７／Ｂ６細胞も与えなかった。１μＣｉのトリチウム化チミジンを４日後に各ウェルに加え、そしてプレートを１２時間後に採取した。
これらのアッセイから得られるデータ点は、ＪＭＰ統計ガイド（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いてマン・ホイットニーＵ検定、対応のあるデータのウイルコクソンの符号順位検定、スチューデント検定およびスピアマンのロー相関により評価する。
最後に、本明細書に記述するアッセイは、インビトロ同種異系刺激アッセイから得られるデータを立証する手段を提供する。ＢＡＬＢｃマウスにおける気道過敏性（ＡＨＲ）モデルを我々の薬剤活性を立証するために用いる。基本的な点として、このモデルは、マウスをミョウバン中のオボアルブミン（ＯＶＡ）で２週にわたって免疫性を与えることにより誘発される。これは、一次免疫応答を開始する。この応答のピーク時に、ＯＶＡのエアロゾルを用いて肺におけるＤＣによる抗原の提示を導き、そして該応答をＴｈ２型応答に向ける。いったんマウスが感作されると、喘息様応答を引き起こすためにメタコリンの１用量を投与する。
Ｒｏ ０４６７９０−５ＨＴ６受容体の選択的アンタゴニスト。この受容体を通して媒介されるシグナルは、アデニルシクラーゼに正に共役している。従って、５ＨＴ６受容体の刺激は、細胞ｃＡＭＰの増加をもたらし、それはＴ細胞活性化経路を阻害する。このシグナルに拮抗することは、この妨害を軽減し、そして免疫応答を促進することができる。
１−（１−ナフチル）ピペラジン−５ＨＴ１クラスの受容体の選択的アゴニスト。これらの受容体は、アデニルシクラーゼに負に共役している。これらの受容体の刺激は、ｃＡＭＰの細胞レベルの減少を引き起こし、そしてそれにより免疫応答を助長することができる。
トロポセトロン−５ＨＴ３受容体の選択的アンタゴニスト。この受容体の刺激は、細胞へのＣａ２＋の流動を助け、それにより免疫応答を促進するはずである。このシグナルの拮抗作用は、活性化応答を阻害することができる。
ＷＡＹ１００６３５−５ＨＴ１Ａ受容体の選択的アンタゴニスト。前述のように、１型受容体はアデニルシクラーゼに負に共役する。インビトロにおいて、この薬剤は活性化応答を有意に阻害する。この薬剤の阻害効果は、活性化応答の初期に投与する場合に最も顕著である。
ＳＢ２０６５５３−５ＨＴ２Ｂ／２Ｃ受容体の選択的アンタゴニスト。５ＨＴ２型受容体は、プロテインキナーゼＣの活性化に正に共役している。本明細書の他の所に開示するインビトロデータは、活性化応答の間の任意の時点での５ＨＴ２Ｂ／２Ｃシグナルの取り消しが、増殖の即時の停止をもたらすことを示す（明らかに、そしていかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、プログラム細胞死を誘導することによって）。
ＳＢ２４２０８４−５ＨＴ２Ｃ受容体の選択的アンタゴニスト。この化合物は、２Ｃ受容体単独よりむしろ２Ｂおよび２Ｃ受容体を阻害することによりなんらかの利点が得られるかどうかを決定するために選択されている。
薬剤は、尾静脈注射によってＰＢＳ中３００μｇ／用量で投与し、そしてこの用量および投与経路は、本明細書の他の所ですでに開示するデータに基づく。１組のマウスにはメタコリンの投与の３日前に薬剤を与え、そして１組のマウスにはメタコリンの投与の３時間後に薬剤を与える。薬剤添加の時間点は、Ｔ細胞が薬剤投与の時点で完全に活性化されたことを保証するように選択した。理想的には、活性化Ｔ細胞集団を取り除き、免疫学的レパートリーにおける機能的空きを作る。研究を４つの主要な群に分ける。各々３匹ずつのマウスからなる第一の２群は、賦形剤コントロールとして用いる。薬剤処置群には、薬剤当たり５匹のマウスを用いる。従って、各群は３０匹ずつのマウスからなる。各群におけるマウスの数は、ＪＭＰ統計ガイド（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いてマン・ホイットニーＵ検定、対応のあるデータのウイルコクソンの符号順位検定、スチューデント検定およびスピアマンのロー相関により評価し、それによりデータの統計的有意性を保証する。
Ｂｒｅｗｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１６０：１１５０−１１５６）により記述されているように、ＢＡＬＢｃマウスを０．２ｍｌの食塩水中の１ｍｇ Ａｌ（ＯＨ）３を加えたＯＶＡ（１０μｇ，Ｓｉｇｍａ Ｇｒａｄｅ ＩＩＩ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で２週にわたってｉ．ｐ．で２回免疫性を与える。二回目の免疫の７〜１０日後に、マウスを６％ ｗｔ／ｖｏｌのエアロゾル化したＯＶＡにさらす（超音波ネブライザーによって送達する）。マウスをエアロゾルアレルゲンに毎日６０分間７日にわたってさらすことは、気道感作をもたらす。
様々なセロトニン受容体サブタイプを検出するためのＲＴ−ＰＣＲプライマーは、本明細書の他の所に記述するとおりであり、そしてＲＴ ＰＣＲを本明細書の他の所に記述するように行う。
喘息罹患率および死亡率は、少数民族の子供において過度に高い。喘息の遺伝的および環境的要因について不適当な認識がある。ＥＴＳ（間接喫煙）は喘息の早期発症の一因となり、そして喘息の重症度の危険因子であることが知られている（Ｍａｌｖｅａｕｘ ａｎｄ Ｆｌｅｔｃｈｅｒ−Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，１９９５）。本明細書に開示するデータは、リンパ球へのアレルギーシグナルおよび肺平滑筋への気管支収縮シグナルの伝達において重要であることが知られているある種の遺伝子産物の役割を理解するために、ヒト喘息の特徴の多くを共有するヒト喘息の当該技術分野で認められているマウスモデルにおける遺伝因子の研究に寄与する。喘息のこのマウスモデル系は、マウスの遺伝的背景により強く影響され、そしてそのようなものとして、疾患がマウスそして最終的にはヒトの両方において起こるために必要な遺伝成分を解明することができる。
モデル系としてマウスを用いて、アレルゲンにさらすことのアレルギー性および閉塞性結果をいくつかの遺伝子的に操作した動物において評価することができる。得られるデータは、アレルゲン感作の初期におけるそしてまた長期の二次応答におけるヒスタミンの役割においてもヒスタミンの新たな役割を明らかにすることができる。子供における喘息の爆発的な割合、例えば、喘息は、現在、貧困にあえぐ都市近郊における有色人種の子供の間の欠席の主要原因である（Ｋｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ９２：２４−２６）ことを考えると、アレルゲン感作の初期および結果として起こる気道疾患の任意のより良い理解は、薬剤開発の新しい標的、もしくは少なくともそのような治療のタイミングにおける改善をもたらすことができる。抗ヒスタミン剤は、末期の喘息症状を改善することにおいて他の薬剤よりかなり弱いので、疾患の初期におけるそれらの役割はわずかであることができ；そのような効果は、遺伝子操作および誘導処方計画が制御される動物モデルにおいて最もよく研究される。
セロトニン受容体に関連する多発性骨髄腫細胞におけるアポトーシス誘導
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、毎年約１５，０００の新しい症例が診断される、米国における２番目に最も一般的な血液学的悪性腫瘍である。該疾患は進行性であり、そして典型的には命にかかわり、西洋諸国における悪性白血球疾患による全ての死亡の１５％そして全ての癌死亡の２％を占める。多発性骨髄腫の病態生理学の理解におけるかなりの進歩にもかかわらず、該疾患の分子的機序は依然として理解しにくいままである。
臨床的に、多発性骨髄腫は、モノクローナル免疫グロブリンフラグメントを分泌する、悪性形質細胞の骨髄浸潤を特徴とするＢ細胞新生物に相当する。患者は、典型的に、破骨細胞の骨再吸収を刺激し且つ骨芽細胞のリモデリングを阻害する骨髄腫細胞の能力のために、結果として起こる高カルシウム血症と一緒に多数の部位で溶解性骨病変を示す。該疾患自体は３つの異なる段階：成熟した非増殖性の悪性細胞が優勢である不活性期；わずかなパーセンテージの分化の程度が低い増殖性の形質芽球細胞が現れる活性期；および未成熟形質芽球細胞の髄外増殖が優勢である劇症期の過程をたどる。これらの異なる病期の存在は、多発性骨髄腫発病の間の段階的な悪性トランスフォーメーションの最近の提示を支持する。
核型変化は、最も一般的には様々なパートナー遺伝子と免疫グロブリン重鎖遺伝子座との不当なスイッチ再編成を伴う転座とともに、実質的に全てのＭＭ症例において検出される。癌遺伝子（ｃ−ｍｙｃ、ｒａｓ）、癌抑制遺伝子（ｐ１６、ｐ１５）およびアポトーシスの調節因子（ＢＣＬ−２、Ｆａｓ）の異常発現もまた、悪性形質芽球クローンへの濾胞中心Ｂ細胞のトランスフォーメーションに寄与すると考えられる事象の複雑なカスケードに関与していると関係づけられている。
骨髄腫細胞が由来する最初のクローンは、胚中心後（ｐｏｓｔ−ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ）Ｂ細胞であると考えられている。幅広く超突然変異を受けている再編成した免疫グロブリン遺伝子の発現は、最初の発癌性事象が、正常な長命の形質細胞分化の後に起こるかもしくはそれを妨げないことを示唆する。多発性骨髄腫の顕著な特徴は、トランスフォームされた形質芽球細胞が該疾患の主要な経過の間に骨髄に存在する傾向であり、ここで、該微環境は、ゆっくり分裂する腫瘍細胞集団の増殖および生存のために適切なサイトカイン（すなわち、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）および接着分子を提供することができる。しかしながら、該疾患の劇症期には、骨髄腫細胞は間質非依存性を生み出し、そして形質芽球の髄外増殖が結果として起こる。
ＭＭは、個々の患者において異なる生物学、予後、臨床経過および治療介入への応答を有する、不均一な疾患として最もよく考えられる。安定な悪性形質細胞集団の確立をもたらす事象だけでなく、この細胞集団がクローン的に増えることを促進するシグナルおよびこれらの細胞が髄外疾患を確立する際に間質依存性を免れるために必要な因子の理解は、疾患進行の基礎をなす中心的機序を理解するために重要である。
ＭＭ細胞が形質依存性を免れそして骨髄の外側でクローン的に増えることができる場合、これらの細胞は生存および増殖に必要とされる要素の全てを自己生産しなければならないことは理にかなっている。さらに、これらの細胞が依然としてセロトニン作動性シグナル伝達経路に依存する場合、ＭＭ細胞は、それら自身のセロトニンを合成しそして放出する能力を獲得している可能性が最も高い。本明細書に開示するデータは、ＭＭ細胞の構成的活性化に必要とされる必須シグナル（セロトニン作動性シグナル）を突然取り消しそしてそれによりアポトーシスを誘導するために５ＨＴアンタゴニスト（１つもしくは複数）を使用するＭＭ患者を処置するための新規な治療戦略を提供する。
要約すると、ＭＭは成熟した（最終分化した）Ｂ細胞の癌性症状である。このタイプのＢ細胞は、通常、循環系内に存在するはずである。ＭＭの顕著な特徴の一つは、これらの（癌性）Ｂ細胞が骨髄に戻り、そこでそれらが実質的な損傷を与えることである。いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、「完全に発達した」癌細胞になるプロセスは、別個の段階で起こる。Ｂ細胞癌が罹患個体において発達するにつれて、癌性Ｂ細胞は、それらの局所環境に依存しない生存形態を生み出す。現在、骨髄移植以外に、ＭＭ患者を処置する有効な手段はない。大部分の患者は、デキサメタゾンのようなコルチコステロイドの処置処方計画に最初は応答するが、ほとんど全ての症例において、疾患はこれらの薬剤に対する完全な抵抗性を発生する。ほとんどの場合、多発性骨髄腫の診断は、死期の告知と同義である。本明細書に開示する方法は、細胞の増殖非依存性およびシグナルが阻害される場合に細胞が死ぬように細胞周期応答がセロトニン受容体を介したシグナル伝達を必要とするという発見を利用する。
すなわち、この分野における最近の発展と総合して、本明細書の他の所に開示するデータは、免疫系および神経系が進化的発生の間に相互から分岐したことを強く示唆する。さらに、免疫学的に関連する細胞の活性化経路は、セロトニンによって誘導されるシグナル伝達に依存するようである。従って、これらのデータは、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、これらの癌細胞がセロトニンの外部供給源に依存することができず、従って、それら自身のセロトニン貯蔵を生成する合成機構を作動させているはずであることを示唆する。全ての活性化もしくは増殖細胞は、それらの完全な状態を維持するために増殖／活性化に関連するシグナルの正確さおよびタイミングに依存することが確立している。特に癌細胞における、律速シグナルの突然の取り消しは、プログラム細胞死経路（アポトーシス）の活性化をもたらす。本明細書に開示するデータに基づき、そしていかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、３つの最も可能性の高い律速シグナル源（従って、３つの最も可能性の高い標的）は、５ＨＴ１、５ＨＴ２および／もしくは５ＨＴ４受容体である。この研究は、これらの受容体シグナルの選択的な非競合的アンタゴニスト（もしくはアンタゴニストのカクテル）の使用によってこれらのシグナルを取り消すことのＭＭ細胞への効果を調べることを意図する。
以下の実験は、インビトロ系における、セロトニン（５−ＨＴ）によって誘導されるシグナルへの多発性骨髄腫細胞（悪性形質細胞）の依存性を示す。ヒト多発性骨髄腫細胞系、ＲＰＭＩ８２２６は、用いるインビトロ系であった。最初に、培養するＲＰＭＩ８２２６細胞への多数の５−ＨＴ受容体調節因子の効果をモニターするために細胞生存および細胞増殖のアッセイを用いた。骨髄腫細胞系の増殖および生存に影響を与えた化合物を同定した後に、受容体調節因子のいくつかがＲＰＭＩ８２２６細胞において細胞死を誘導したメカニズムを特性化するために実験を考案した。特に、影響を受けた細胞をアポトーシスの顕著な特徴（形態、ＤＮＡ断片化、および細胞外ホスファチジルセリン発現）に関してアッセイした。
本明細書に開示するデータが示すように、骨髄腫細胞がセロトニン受容体を通したシグナル伝達に依存することは明らかである。最も顕著であるのは、５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナルの取り消しの効果である。５−ＨＴ１Ｂ受容体からのシグナルがない場合、骨髄腫細胞は激しい細胞死を受けた。形態学的に、該細胞死は、細胞が核凝縮し、それらの核を凝縮し、そして膜気泡（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｌｅｂ）を形成する、伝統的なアポトーシスと異なった。その代わりに、５−ＨＴ１Ｂシグナルの取り消しの際に、細胞は大幅に膨張し、破裂し、そして培養物は３時間以内に実質的に１００％死亡した。しかしながら、さらなる特性化の際に、これらの細胞は、アポトーシスに典型的なそして／もしくはそれと関連するある種の特性を示した（すなわち、ヌクレオソーム間ＤＮＡ断片化および細胞表面上のホスファチジルセリン発現）。従って、これらのデータは、セロトニンシグナルの取り消しがアポトーシスおよび／もしくはアポトーシス様プロセスによって細胞死を媒介することを示す。
細胞系
ヒト形質細胞腫（多発性骨髄腫）細胞系、ＲＰＭＩ８２２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１．５ｇ／Ｌの重炭酸塩および２０％のＦＢＳ（熱不活性化していない）を補足したＲＰＭＩ１６４０において培養した。
細胞増殖アッセイ
細胞増殖は３つの方法によってアッセイし、トリパンブルー排除は培養における生存細胞の数を定量するために用い；３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）還元はミトコンドリア活性（従って、細胞の生存）をアッセイするために用い；そして３Ｈ−チミジンの取り込みは、有効なＤＮＡ合成をアッセイするために用いた。
５−ＨＴ受容体調節のインビトロ試験
下記の５−ＨＴ受容体調節化合物を記述する密度でそして示す濃度範囲にわたってインビトロ培養したＲＰＭＩ８２２６細胞へのそれらの効果に関して試験した。
表２
化合物 一次作用
ＷＡＹ１００６３５ ５−ＨＴ（１Ａ）受容体アンタゴニスト
８−ＯＨ−ＤＰＡＴ ５−ＨＴ（１Ａ）アゴニスト
ＳＢ２１６６４１ ５−ＨＴ（１Ｂ）受容体アンタゴニスト
Ｌ６９４２４７ ５−ＨＴ（１Ｂ／１Ｄ）受容体アゴニスト
ＧＲ５５５６７ ５−ＨＴ（１Ｂ／１Ｄ）受容体アンタゴニスト
ＢＲＬ５４４４３ ５−ＨＴ（１Ｅ／Ｆ）受容体アゴニスト
メチセルギド ５−ＨＴ（２）および５ＨＴ（１）アンタゴニスト
ＬＹ５３８５７ ５−ＨＴ（２Ａ／２Ｂ／２Ｃ）受容体アンタゴニスト
ＳＢ２０６５５３ ５−ＨＴ（２Ｂ／２Ｃ）受容体アンタゴニスト
ＭＤＬ１１９３９ ５−ＨＴ（２Ａ）受容体アンタゴニスト
ＳＢ２４２０８４ ５−ＨＴ（２Ｃ）受容体アンタゴニスト
ＤＯＩ ５−ＨＴ（２Ａ／２Ｃ）アゴニスト
ＲＯ０４６７９０ ５−ＨＴ（６）受容体アンタゴニスト
ＳＢ２６９９７０ ５−ＨＴ（７）受容体アンタゴニスト
ＨＭＢＡ 細胞における最終分化の誘導

ＤＮＡ断片化
実験処置の後に細胞（８ｘ１０５個）をよく冷えたＰＢＳで洗浄し、そして遠心分離（５００ｘｇ、５分）によりペレットにした。細胞ペレットを溶解バッファー（１％ ＩＧＥＰＡＬ−ＣＡ６３０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５）において氷上で５分間インキュベーションした。溶解物を約１，６００ｘｇで５分間遠心分離した。５０μＬの溶解バッファーを上清に加えた。抽出物を１％ ＳＤＳにし、そして５μｇ／μＬのＲＮアーゼＡで２時間処理し（５７℃）、続いて２．５μｇ／μＬのプロテイナーゼＫで２時間処理した（３７℃）。ＲＮＡおよびタンパク質の消化後、半分容量の１０Ｍ酢酸アンモニウムを加え、そして２．５容量のエタノールを用いてＤＮＡを沈殿させ、７０％エタノールにおいて洗浄し、風乾させ、そしてＴＥバッファーに溶解した。ＤＮＡフラグメントは、Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１６２−１６６）から適用したプロトコルを用いて１．５％アガロースゲルにおける電気泳動により分離した。
フローサイトメトリー
初期のアポトーシスを起こした細胞は、各実験条件にあらかじめさらした細胞を共染色することにより検出した。簡潔に言えば、細胞を本明細書の他の所に記載するような様々な濃度の各実験もしくはコントロールアポトーシス誘導因子の存在下で時間経過の間インキュベーションした。インキュベーションの後に、細胞をよく冷えたＰＢＳで洗浄し、アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ４８８およびヨウ化プロピジウム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で染色し、そして二色フローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ＋且つＰＩ―の細胞を初期のアポトーシスを起こした細胞とみなした。骨髄腫細胞の既知の最終分化因子、ＨＭＢＡ（ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド）、およびトポイソメラーゼインヒビター、カムトテシンをそれぞれ５ｍＭおよび２μＭでアポトーシスの陽性コントロールとして用いた。
ヒト多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６への５−ＨＴ受容体調節因子の効果を調べるために細胞増殖の３つの別個の指標を用いた。細胞を４つの別個の密度で平板培養し、そして各種濃度のＬＹ５３５８７（５−ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃ受容体のアンタゴニスト）で処理した。トリパンブルー色素の排除を細胞生存の指標として用いた。次に、加えた薬剤の濃度に対して細胞数をプロットした。
ＭＴＴ還元もまた細胞生存（さらに特に、ミトコンドリア活性）の指標として用いた。次に、ＯＤ５７０での吸光度値を薬剤濃度に対してプロットした。最後に、ＤＮＡ合成を３Ｈ−チミジンの取り込みの測定によってアッセイし、そして分当たりのカウント（ＣＰＭ）を薬剤濃度い対してプロットした。３つのアッセイは全て、明らかな用量応答曲線をもたらした。さらに、曲線の形状は、用いるアッセイに依存しなかった（すなわち、細胞集団への薬剤の効果をアッセイすることにおいていずれの方法も他のものと同じであった）（図１９Ａ、１９Ｂおよび２０Ａ〜Ｄを参照）。
５−ＨＴ２受容体の異なるサブタイプへのアンタゴニストの効果を３Ｈ−チミジンの取り込みによってＤＮＡ合成を測定することにより調べた（図２１）。
様々な他の５−ＨＴ受容体調節化合物もまた、ＲＰＭＩ−８２２６細胞へのそれらの効果に関してアッセイされている。細胞増殖は同様に、ＤＮＡ合成の代理マーカーとして、チミジンの取り込みのモニタリングによって測定した。図２２は、賦形剤処置コントロールに対する増殖パーセントとして表す、これらの５−ＨＴ受容体アンタゴニストもしくはアゴニストの各々の効果を示す。５−ＨＴ１Ｂ受容体での拮抗作用は、最も広い濃度範囲にわたって骨髄腫細胞の最も顕著な阻害を引き起こした。５−ＨＴ１Ｂ／Ｄ特異的アンタゴニストでの細胞の処置は、細胞増殖を阻害することにおいて５−ＨＴ１Ｂアンタゴニスト単独ほど効率よくなかった。
５−ＨＴ受容体の様々なアゴニストおよびアンタゴニストの低用量滴定をヒト多発性骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６細胞に対して試験した（図２３、２４および２５）。これらのデータから理解することができるように、低用量の非常に選択的な５−ＨＴ１Ｂアンタゴニスト（ＳＢ２１６６４１）は、癌細胞の増殖を完全に阻害した。さらに、増殖の強い阻害がメチオテピン（一般的な５−ＨＴＲ１、２、６および７アンタゴニスト）もしくは非常に選択的な５−ＨＴ２ＣアンタゴニストＳＢ２４２０８４で認められた。従って、本明細書に開示するデータは、多発性骨髄腫細胞の増殖を５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナルもしくは５−ＨＴ２Ｃ受容体シグナルのいずれかの選択的取り消しによって阻害できることを明らかに示す。
５−ＨＴ受容体シグナル伝達の取り消しがＲＰＭＩ８２２６細胞において細胞死を誘導するメカニズムをさらに探求した。特に、アポトーシスの顕著な特徴事象のいずれかが、５−ＨＴ１Ｂ／Ｄシグナルの取り消しの際に起こる細胞死の全体にわたって起こったかどうかを決定した。トリパン排除細胞計数データにより示されるように、ＲＰＭＩ８２２６細胞系において細胞死を誘導することが既知であった５−ＨＴ受容体アンタゴニストを瀕死の細胞においてヌクレオソーム間切断を誘導するそれらの能力に関してアッセイした。
この実験の結果を図２６に例示する。本明細書に開示するデータは、ある割合の骨髄腫細胞（約３０％）においてアポトーシスを誘導することが知られている最終分化因子（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）、ＨＭＢＡ（ヘキサメチレン−ビス−アセトアミド）が、非常に弱いＤＮＡラダーを示すことを明示する。しかしながら、１Ｂ／Ｄ、２Ａ／Ｂ／Ｃおよび２Ｂ／Ｃ受容体に特異的な薬剤での５−ＨＴ受容体シグナル伝達の取り消しは、いくつかの化合物で２４時間ほどの早期に明らかなＤＮＡラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）をもたらした。
５−ＨＴ（１Ａ）、５−ＨＴ（１Ｂ）および５−ＨＴ（１Ｂ／Ｄ）アンタゴニストでの処置後のアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムでの細胞の共染色もまた、シグナル取り消しの際に起こる細胞死を特性化するために用いた。アネキシンＶは、生存細胞の内膜リーフレット上にのみ発現される膜脂質、ホスファチジルセリンに特異的に結合する。しかしながら、アポトーシスの際に、ホスファチジルセリンはもはや内膜リーフレットに局在せず、そしてアポトーシスにおける非常に初期の事象の一つのマーカーとして用いることができる。一方、色素ヨウ化プロピジウムは、いったん膜が傷つけられて初めて細胞質および核に近づく（後期のアポトーシスもしくは壊死と関連する事象）。従って、起こっている細胞死がアポトーシスのためであったことを示すアネキシン＋であるがＰＩ―である細胞の集団を同定するために二色フローサイトメトリーを用いた。
本明細書に開示するフローサイトメトリーデータの分析は、アッセイした時間点で、５−ＨＴ（１Ｂ）アンタゴニストでのＲＰＭＩ−８２２６細胞の処置の際に細胞は用量および時間に依存してアポトーシスを起こすようになったが、５−ＨＴ（１Ａ）もしくは５−ＨＴ−（１Ｂ／Ｄ）特異的アンタゴニストを用いた場合にはそうではなかったことを明らかに示す（図２７）。すなわち、１Ｂ／Ｄ型アンタゴニストでの細胞の処置は、アネキシンにより染色される細胞のシフトを引き起こす。さらなる処置は、ヨウ化プロピジウムでの細胞の増加した染色を示し、細胞が死亡しているだけでなく、溶解されるかもしくは壊死していることを示した。
本明細書に開示するデータ（例えば、図２８および２９）は、多発性骨髄腫細胞における５−ＨＴ１Ｂ受容体シグナル（図２８）もしくは５−ＨＴ２Ｃ受容体シグナル（図２９）のいずれかを取り消すことが、これらの顕微鏡写真において示される凝縮しそして断片化したクロマチン構造から明らかなように古典的なアポトーシスをもたらすことを決定的に示す。これらの結果は、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の増殖が、５ＨＴ（１Ｂ）および５ＨＴ（２Ｃ）受容体の両方を通したシグナル伝達に依存し、そして使用する特定の５ＨＴ受容体アンタゴニスト、すなわち、ＳＢ２４２０８４（２Ｃ）もしくはＳＢ２１６６４１（１Ｂ）でのこれら２つの受容体のいずれかでのシグナルの取り消しが、トポイソメラーゼＩインヒビター、カンプトセシンにより誘導されるものと匹敵するプログラム細胞死を誘導したことを示唆する。しかしながら、これら２つの化合物により誘導されるアポトーシスの程度および時間経過は異なった。これらの結果は、いかなる特定の理論によっても拘束されることを所望せずに、２つのセロトニン受容体サブタイプのアポトーシス誘導における潜在的なメカニズムの相違を示唆する。
本明細書に開示するデータは、悪性形質細胞が５−ＨＴ受容体を通して伝達されるシグナルに依存すること、および個々の受容体でのシグナルの取り消しが顕著に異なる応答を引き起こすことを強く示唆する。さらに、単一の受容体シグナルの阻害は、受容体の組み合わせの阻害と異なる応答を引き起こす。悪性形質細胞におけるこれらの５−ＨＴ受容体によって伝達される必須シグナルの阻害は、本発明の前には、この疾患に対する有効な処置が当該技術分野において利用可能でなかった多発性骨髄腫の有効な処置に役立つことができる。
さらに、本明細書の他の所に開示するデータは、様々な細胞プロセスがセロトニン作動性シグナル伝達に関与するかもしくはそれにより媒介されることを明らかに示す。さらに特に、該データは、５−ＨＴＲ１Ｂもしくは１Ｂ／１Ｄ受容体の阻害が、多発性骨髄腫の当該技術分野で認められているモデルである細胞系（ＲＰＭＩ８２２６）においてアポトーシスを媒介することを示す。従って、本発明には、細胞増殖および細胞のアポトーシスのようなしかしこれらに限定されるものではない細胞プロセスに影響を与える方法が包含される。これは、本明細書に示すように、様々な非神経細胞がそれらの表面上にセロトニン受容体を含んでなり、そしてセロトニン作動性シグナルを細胞生存にとって不可欠であるシグナル伝達から阻害すると、該細胞は影響を受け、そして最終的に５−ＨＴＲシグナル伝達の欠如は細胞死を引き起こすからである。
従って、本発明は、細胞表面上のセロトニン受容体を介してそうでなければ伝達されるセロトニンシグナルの伝達を阻害することにより興味のある標的細胞における細胞死もしくは細胞増殖の阻害を媒介する有効な方法を提供する。従って、興味のある細胞上のセロトニン受容体の存在は、当該技術分野において周知でありそして／もしくは本明細書に教示する方法を用いて容易に決定することができる。さらに、ＲＰＭＩ８２２６細胞に関して本明細書において示すように、その細胞へのセロトニンシグナルの取り消しが、該細胞にとって有害であるかどうかを決定することができ、そしてシグナルを特異的に阻害し、それによりセロトニン受容体を発現しないかもしくは標的細胞の表面上に発現されるものと異なるセロトニン受容体を発現するいずれかの他の細胞には影響を与えずに、細胞を殺すかまたはその機能、増殖および／もしくは分裂を阻害するためにセロトニンシグナル伝達の様々なインヒビターを用いることができる。
いかなる特定に理論によっても拘束されることを所望せずに、おそらく、セロトニン作動性シグナル伝達の阻害に関する以前の研究は、細胞が増殖もしくは分裂せずそして細胞周期を本質的に経ていない神経および／もしくは筋肉細胞において行われたので、本明細書の他の所に開示する驚くべき結果は、先行技術により示唆されなかった。むしろ、筋肉および神経細胞を５−ＨＴＲアンタゴニストと接触させることは細胞脱分極を媒介し、そして免疫応答を調節する免疫細胞へのその効果を包含する、細胞周期プロセスへのセロトニン作動性シグナル伝達を阻害することの効果は、全く予期されず、前例がなく、そしてこれまで認められていなかった。従って、細胞上に存在するセロトニン受容体を介したシグナル伝達が細胞増殖および／もしくは生存に必要とされるという本発明の発見は、セロトニン受容体を含んでなる細胞の増殖を阻害することが治療利益を与えることができる疾患もしくは症状において使用する治療法の開発のための重要な新規の手段を提供する。
セロトニン受容体を介したシグナル伝達の阻害により媒介される細胞変化に関するアッセイ
本明細書の他の所に開示するデータは、セロトニン受容体を介したシグナルの伝達を阻害することが、細胞における検出可能な変化を誘導するか、媒介することができ、もしくはそれと関連することを初めて示す。さらに特に、ある種のセロトニンアンタゴニストと接触させた細胞は、変化した細胞形態および／もしくは光学顕微鏡検査を包含する当該技術分野において既知である様々な方法により検出可能な他の改変された物理的特性を示した。
簡潔に言えば、細胞を５−ＨＴアンタゴニスト（例えば、選択的１Ｂ型インヒビターＳＤ２１６６４１）とインキュベーションし、そして処置の効果を２４時間後に評価した。変化は細胞形態であり、例えば細胞サイズの増加が容易に検出された（図３０）。これらのデータは、セロトニンシグナル阻害の効果を当該技術分野において周知であるかもしくは将来に開発される方法を用いて、細胞形状、形態などの変化を評価することによりアッセイできることを示す。例えば、細胞変化の検出は、光学装置（電子および光学顕微鏡検査、ならびに蛍光活性化細胞分類法など）、もしくは細胞サイズ、密度、形態などの変化を評価しそして検出する任意の他の装置を用いて評価することができる。そのような装置は当該技術分野において周知であり、そして本明細書に詳述しない。
細胞増殖、アポトーシスなどへのセロトニン受容体アンタゴニストフルフェナジンの効果
本明細書の他の所に開示するデータにより示されるように、細胞の機能および活性は、セロトニン受容体を介したシグナルの伝達を阻害することにより検出可能に変えることができる。すなわち、セロトニン受容体を介したセロトニンシグナル伝達のインヒビターと接触させた細胞は、増殖およびアポトーシスのような、しかしこれらに限定されるものではない生理的プロセスにおける改変を示す。細胞の生理的プロセスにおけるそのような変化は、細胞増殖アッセイ、アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色、蛍光活性化細胞分類法、ＤＮＡラダリングなどが包含されるがこれらに限定されるものではない、本明細書に開示するもののような当該技術分野で認められている方法を用いて同定しそして評価することができる。
本明細書の他の所に記述するように、多発性骨髄腫（ＭＭ）は、コルチコステロイド療法のような、たとえあるとしても、多くの現在の処置を施行できない致死的疾患である。骨髄移植は唯一の望みのある処置を提供するが、全ての移植処置のように、ドナーの利用可能性および適合性が限定要因である。本明細書に開示するデータにより示されるように、５−ＨＴ（１Ｂ／１Ｄ）、５−ＨＴ（２Ｃ）およびＤ２セロトニン受容体に特異的なセロトニン受容体アンタゴニストフルフェナジンでのＭＭ細胞の処置は、ＭＭ細胞の増殖能力の著しい減少をもたらし、そして該化合物と接触していないコントロール細胞と比較した場合にアポトーシスの割合は増加する。従って、該データは、ＭＭ細胞を包含する、５−ＨＴ（１Ｂ／１Ｄ）、５−ＨＴ（２Ｃ）およびＤ２セロトニン受容体を含んでなる細胞の増殖を阻害しそしてアポトーシスを開始する新規な方法を示す。さらに、そのような効果は、動物における免疫応答を調節するために、そしてとりわけ、新生物形成、移植片拒絶、ならびに関節リウマチおよび多発性硬化症のような自己免疫疾患、ならびにある種のＢおよびＴ細胞のような、しかしこれらに限定されるものではない、５ＨＴ１Ｂ／１Ｃ受容体を含んでなる細胞により媒介される他の疾患を処置するために有用である。
フルフェナジンはまた、ＰｒｏｌｏｘｉｎもしくはＰｅｒｍｉｔｉｌとしても知られており、そして他の製造業者の中でも、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＭｙｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から市販されている。フルフェナジンは、最初に抗精神病薬として販売され、そして５−ＨＴ（１Ｂ／１Ｄ）、５−ＨＴ（２Ｃ）およびＤ２セロトニン受容体を遮断する。
ＲＰＭＩ−８２２６細胞は、患者由来の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞系である。全てのＲＰＭＩ−８２２６細胞は、本明細書の他の所に記述するようにして得て、そして細胞培養において増やした。
ＲＰＭＩ−８２２６細胞へのフルフェナジンおよび他の薬剤の抗増殖効果を決定するために、様々な薬剤の有無でトリチウム化チミジンの取り込みを測定する細胞増殖アッセイを用いた。簡潔に言えば、ＲＰＭＩ−８２２６細胞を平板培養し、そして０．１、１、５、１０、２５および５０μＭの濃度で、フルオキセチン、ブロモクリプチン、ブスピロン、クロルプロマジン、クロザピン、メシル酸エルゴロイド、メシル酸フェノルドパム、フルフェナジン、ハロペリドールおよびマレイン酸メチルエルゴノビンで処理した。培養ならびに薬剤および３Ｈ−チミジンの投与は、本明細書の他の所に記述するように実施した。
実験を三重反復で実施し、そして個々のデータ点を分当たりのカウント（ＣＰＭ）により測定されるようなＤＮＡ合成を決定するために平均し、そして次に薬剤濃度に対してプロットした。本明細書に開示するデータにより示されるように、フルフフェナジンは明らかな用量応答曲線をもたらし、そして約５〜約１０μＭの間のＥＣ５０でＲＰＭＩ−８２２６細胞の増殖を阻害する（図３１および３２）。
下記の実験は、インビトロにおけるＲＰＭＩ−８２２６細胞へのフルフェナジンのアポトーシス効果を示す。本明細書の他の所に記述するように、セロトニン受容体アンタゴニストがアポトーシスを誘導するかどうかを決定するためにアネキシンＶおよびヨウ化プロピジウム染色をＤＮＡラダリングアッセイと一緒に用いることができる。アポトーシスの顕著な特徴の２つは、細胞ＤＮＡのヌクレオソーム間切断および細胞表面上のホスファチジルセリンの外面化である。
本明細書の他の所に記述する方法を用いて、フルフェナジン、ＳＢ２１６６４１（５−ＨＴ−１ＢＲアンタゴニスト）およびカンプトセシン（トポイソメラーゼＩＩインヒビター；アポトーシスコントロール）での示した処理の後にＲＰＭＩ−８２２６細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。本明細書の他の所に記述するように、ＤＮＡラダリングの程度を当該技術分野において周知であるゲル電気泳動技術を用いて決定した。ＳＢ２１６６４１で処理したＲＰＭＩ−８２２６細胞およびフルフェナジンで処理した細胞は、コントロール細胞抽出物を越えるＤＮＡラダリングの増加を示した（図３５）。
当該技術分野において周知でありそして本明細書の他の所に記述するように、アポトーシスを起こした細胞の表面上のホスファチジルセリンの外面化は、細胞表面上のリン脂質へのアネキシンＶの結合により検出することができる。従って、細胞集団におけるアポトーシスの程度は、アネキシンＶ陽性細胞の存在およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色細胞（壊死細胞）の欠如を評価することにより確かめることができる。本明細書の他の所に詳述するように細胞を培養して染色し、示す濃度でそして時間にわたってフルフェナジンで処理した。アポトーシスの程度は、フローサイトメトリーデータを分析しそしてＦＡＣＳプロットを作製することにより決定し、次にそれからＰＩ陰性（非壊死）であった細胞の集団のみを含むように特定部分を選び出した。次に、アネキシンＶ陽性細胞の程度をアポトーシスの尺度としてこのＰＩ陰性細胞集団において測定した（図３４）。フルフェナジンで処理した細胞は、コントロール細胞集団のいずれかよりも有意に大きい程度のアポトーシスを受けることは明らかであり、そしてフルフェナジンでの患者由来の多発性骨髄腫細胞系（ＲＰＭＩ−８２２６）の処理は、細胞培養においてプログラム細胞死を誘導することにより細胞の増殖能力を減少すると結論を下すことができる。
本明細書に開示するデータにより示されるように、５−ＨＴ受容体アンタゴニストは、マイトジェン活性化Ｔ細胞の増殖を阻害する。簡潔に言えば、本明細書の他の所に記述するようにＴ細胞を単離し、そしてＣｏｎＡ刺激のために準備した。細胞を５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡならびに示す濃度の様々な５−ＨＴ受容体アンタゴニストおよびアゴニストで処理した。細胞増殖は、本明細書の他の所に記述するようにトリチウム化チミジンの取り込みにより測定した。データにより示されるように、フルフェナジンでのマイトジェン活性化Ｔ細胞の処理は、他の５−ＨＴアンタゴニストおよびアゴニストと比較した場合に増殖の劇的で且つ用量に依存する減少をもたらす（図３３）。
本明細書に開示するデータにより明らかであるように、５−ＨＴ１Ｂ受容体は、Ｔ細胞の活性化にならびに腫瘍性Ｂ細胞の細胞周期進行において重要である。さらに、５−ＨＴ１Ｂ受容体のシグナル伝達の伝達特性は、Ａｋｔ（プロテインキナーゼＢとしても知られている）の活性と共役している。５−ＨＴ１Ｂ受容体の活性化は、Ａｋｔタンパク質のリン酸化をもたらす。該タンパク質のこのホスホ形態（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｆｏｒｍ）は、今度は、カスパーゼ９をリン酸化し、そしてアポトーシス応答の抑制をもたらし、すなわち、それは細胞生存を誘導する。５−ＨＴ１Ｂシグナルの取り消しはＡＫＴをオフにし、そしてカスパーゼ系を活性化させてプログラム細胞死をもたらす（図３６）。
ＡＫＴのリン酸化における５−ＨＴ１選択的アンタゴニスト（ＳＢ２１６６４１）の役割を示すために、ＡＫＴの用量依存的阻害を決定した。５ｘ１０６個の細胞のＲＰＭＩ−８２２６細胞を０、６．２５、１２．５および２５μＭのＳＢ２１６６４１で３時間処理した。細胞を氷上で溶解バッファー（１％ ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＮａＦ、１μｇ／ｍＬのアプロチニン、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１ｍＭ Ｎａ２ＯＶａ、５ｍＭ ＢＧＰ）において１５分間溶解させ、続いて膜フラグメントの溶解物を取り除くために１０分間遠心分離した。上清を集め、そしてタンパク質濃度をＢｉｏＲａｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅキット（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で決定した。
１００μｇのタンパク質を各レーンに載せ、そして４％ ＳＤＡ−ＰＡＧＥスタッキングゲルおよび１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ゲルを通して分離した。タンパク質をトランスファーバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、０．１％ ＳＤＳ）において０．２μｍのニトロセルロース膜にエレクトロトランスファーした。膜をＡＫＴ活性化に必要なセリン−４７３リン酸化残基に対する抗ホスホＡｋｔ抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で免疫ブロットし、そして結合している任意の抗体を増強化学発光系を用いて視覚化した。ホスホル−（ｓｅｒ４７３）−ＡＫＴの用量依存的減少が検出された（図３７）。
本明細書に開示するデータは、活性化Ｔ細胞もしくは癌性Ｂ細胞（多発性骨髄腫細胞のような）において、５−ＨＴ１Ｂシグナルの取り消しが、ＡＫＴの活性をダウンレギュレーションし、そしてそれによりプログラム細胞死を誘導することを示す。フルフェナジンは、５−ＨＴ１Ｂ受容体へのその作用に基づいて、カスパーゼにより媒介されるアポトーシスを開始する治療手段である。
該データは、フルフェナジンがマイトジェン活性化Ｔ細胞を強力に阻害することができ、そしてそれ故に関節リウマチおよび多発性硬化症のような自己免疫疾患の処置において有用であることならびに同種移植処置により誘発される拒絶プロセスを調整することにおけるその使用を包含するいくつかの重要な治療的意味を有することを示す。さらに、本明細書に開示するデータは、多発性骨髄腫細胞がセロトニンにより誘導されるシグナルに依存することおよびこれらのシグナルの突然の取り消しがプログラム細胞脂の誘導をもたらすことを示す。本明細書に記述するこれらのデータは、フルフェナジンが多発性骨髄腫のようなＢ細胞新生物形成を処置する手段になることを示す。
セロトニンアンタゴニストおよび血液脳関門
これまでに、セロトニン作動性経路（１つもしくは複数）は免疫応答において重要な役割を果たすことおよびそのような免疫応答は様々なセロトニン受容体を介したシグナル伝達を阻害する化合物を用いて調節できることが示されている。例えば、国際公開第ＷＯ ０２／０７８６４３号および米国特許出願ＵＳ２００３／０１００５７０Ａ１を参照、これらの各々は、その全部が記載されているように本明細書に引用することにより組み込まれる。
本明細書に開示するデータは、セロトニン作動性経路がＴおよびＢ細胞の両方のリンパ球に存在し、そしてそれらの活性化経路に一体的に関与することを示す。さらに、５−ＨＴ受容体と選択的にそして非選択的に相互作用する薬剤は、活性化ＢおよびＴ細胞を治療的に調節するために用いることができ、そして多発性骨髄腫（ＭＭ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）のような血液学的悪性腫瘍の増殖を制御するために用いることができる。
当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、セロトニンシグナル伝達を介してＴおよびＢ細胞を調節するために用いる任意の薬剤は、その治療効果を及ぼすために血液脳関門を越えることができるが、そうしなくてもよいことを理解する。さらに、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるセロトニン作動性経路との薬剤相互作用に起因し得る任意の潜在的副作用は、薬剤が血液脳関門を越えるのを防ぐことにより弱めるかもしくは除くことができる。従って、本発明には、セロトニン受容体を介したシグナル伝達を阻害し、それにより本明細書に開示するような様々な細胞プロセスに影響を与える化合物を製造しそして同定する方法が包含され、ここで、該化合物は血液脳関門を有意には越えないか、もしくは血液脳関門を越えるそのほかの点では同一の化合物よりかなり少ない程度にそうする。従って、本発明には、本明細書の他の所にさらに十分に説明するような様々な細胞プロセスに影響を与えるために、セロトニン受容体を介したセロトニンシグナル伝達を阻害するが、血液脳関門を越えないかもしくはそれを低いレベルで越える化合物を用いることが包含される。
古典的な医薬品化学構造−活性関係研究は、改変された化合物がもはや血液脳関門を通過しないが、関連する５−ＨＴ受容体と相互作用する所望の能力を維持し、それにより所望の効果をもたらすように、この関門を越えることが既知である「親」化合物を改変するために用いることができる。この新しい種類の化合物のスクリーニングの一つの手段は、望まれていないＣＮＳ効果の喪失に関してスクリーニングする簡単なインビボ研究と一緒に関連するインビトロ細胞アッセイ（ヒト多発性骨髄腫細胞系の細胞増殖／アポトーシス読み取りのような、しかしこれらに限定されるものではない）を含む並行アッセイを用いることである。そのようなアッセイおよび研究を以下にさらに十分に記載する。
脳のニューロンは、それらの生理学的機能を維持しそして遂行するために非常に制御された環境を必要とする。血液脳関門は、血液中の有害物質から脳組織を保護し、そして脳毛細血管内皮細胞の輸送プロセスは、脳に適切な流動体環境を提供するのに役立つ。「血液脳関門」は、非常に小さい分子もしくは能動的に輸送される分子のみをこの「関門」を通過させる脳における毛細血管内皮細胞間に存在する密着結合を表すために用いる用語である。一般に、血液脳関門は、水、二酸化炭素、酸素およびエタノールのような大部分の脂溶性物質に非常に透過性である。該関門は、ナトリウム、塩化物およびカリウムのような電解質にわずかに透過性であり、そして血漿タンパク質および大部分の荷電した有機分子にほとんど不透過性である。従って、血液脳関門は、脳脊髄液および／もしくは脳の実質におけるタンパク質抗体もしくは荷電した薬剤のいずれかの有効濃度を得ることを不可能にすることが多い。
セロトニン作動性アゴニストおよびアンタゴニストを開発するための薬剤開発活動に従事している製薬会社は、ＣＮＳにおいて活性を及ぼさない先導化合物、すなわち、血液脳関門を越えないものを断念することが多い。ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓにより公開された最近の医薬品化学論文（Ｂｒｏｍｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０：１８６３−１８６６）は、この点を説明する。この研究の目的は、非常に選択的な５−ＨＴ２Ｃインヒビターとしてビスアクリルエーテルを開発することであった。この研究において開発された化合物のいくつかは、さらなる開発のために最終的に進められた化合物より２Ｃ受容体に対する有意に優れた親和性および選択性を有した。しかしながら、廃棄された化合物は、ＣＮＳに効果を及ぼさなかった。これらの化合物は抗鬱／抗不安活性を有すると立証し得ないが、それらは血液学的悪性腫瘍を処置するための非常に有効な免疫調整剤もしくは化学療法試薬であると立証し得る。すなわち、これらの「廃棄された」化合物は、５−ＨＴ２Ｃを阻害するので可能性のある治療法であり、そしてそれらは血液脳関門を越えずそしてそれ故に好ましくないおよび／もしくは望ましくない神経精神作用効果を媒介しないというさらなる利点を与える。
当業者は、本発明の開示に基づいて、化合物を脳血管関門を越えるその能力に影響を及ぼすように改変するために無数の方法があることを理解する。例えば、化合物の親油性を意図的に減少することは、化合物が血液脳関門を通過する可能性を有意に減少する手段である。従って、ＣＮＳ効果ならびにリンパ球に対する増殖抑制効果の両方を及ぼす化合物を、ＣＮＳ効果は減少され、一方、増殖抑制効果は維持されるかもしくは増加されるように容易に改変することができる。治療目標が免疫調節および血液学的悪性腫瘍の増殖阻害である場合、化合物の親油性を減少することは、所望の治療効果の効能を選択的に高めながら、（好ましくないおよび／もしくは不必要な）ＣＮＳ効果を選択的に減少させるかもしくはなくすために用いることができる。
本明細書に例示するように、本明細書に開示するデータは、フルフェナジンの成功した改変を示す。フルフェナジンは、ＦＤＡに認可された典型的な抗精神病薬であり（好ましくない／不必要なＣＮＳ効果）、最近、それは５−ＨＴ２Ｃ受容体の有効なインヒビター（逆アゴニスト）として作用する（所望の効果）ことが本明細書において示されている（図３８参照）。本明細書の他の所に開示するデータは、フルフェナジンがＴ細胞応答ならびに多発性骨髄腫細胞系の増殖を阻害し、そして慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者からの外移植した骨髄吸引物における腫瘍細胞負荷を減らすことを示す。さらに、フルフェナジンは強い鎮静剤であり、針を静脈から抜き出す前に動物において睡眠を誘導する。
フルフェナジン（ＰｒｏｌｉｘｉｎＴＭおよびＰｅｒｍｉｔｉｌＴＭとも呼ばれる）の親油性を減少することの効果を評価するために、図３９に示す化合物、すなわち、ＱＳＳ５およびＱＳＳ１２と称する化合物を当該技術分野において周知である標準的なプロトコルを用いて合成した。これらの化合物を一次同種異系細胞傷害性Ｔ細胞アッセイにおいて（図４０）そして２つの異なるヒト多発性骨髄腫細胞系において（図４１Ａおよび４１Ｂ）相互に対して試験した。すなわち、化合物を同種異系細胞傷害性Ｔ細胞アッセイの開始時に投与した。このアッセイでは、当該技術分野において既知である標準的な方法を用いて、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞を完全ＭＨＣミスマッチであるＰ８１５で刺激した。当該技術分野において周知である標準的な方法に従って、細胞を７日の期間にわたって一緒にインキュベーションし、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をＰ８１５標的細胞を溶解するそれらの能力に関して試験した。開示するデータは、未処理の細胞集団で検出される致死率に対して示す。
本明細書に開示するデータは、ＱＳＳ１２アナログが他のアナログに対してその活性プロファイルにおける有意な改善を一貫して示したことを明示する。これらの化合物の各々、フルフェナジン、ＱＳＳ５およびＱＳＳ１２をＢＡＬＢ／ｃマウスに１５ｍｇ／ｋｇでｉ．ｖ．注射した（尾静脈注射によって）。フルフェナジンを与えたマウスは、（予想されるように）即座に鎮静し、そして約１０時間眠った。ＱＳＳ５を注射したマウスもＱＳＳ１２を注射したマウスも、７２時間の期間にわたって観察した場合に鎮静作用もしくは異常行動のいかなる兆候も示さなかった。
親化合物（フルフェナジン）の親油性を単に増加することは、アナログの活性を改善するために十分ではない可能性がある。例えば、本明細書に開示するデータは、ヒト多発性骨髄腫から得られる細胞系の細胞増殖を減少することにおける様々なフルフェナジン誘導体の効能を示す。さらに特に、図４１Ａに示すように、ＲＰＭＩ−８２２６細胞の細胞増殖を阻害するＱＳＳ−５、ＱＳＳ−１２、フルフェナジン、ＳＢ２１６６４１およびＷＡＹ１００６３５の能力を評価した。該グラフはＤＮＡ合成、従って、増殖の尺度としてのトリチウム化チミジンの取り込みへの示す投与量での各化合物の効果を示す。
同様に、図４１Ｂは、ＤＮＡ合成の尺度であるトリチウム化チミジンの取り込みを評価することにより測定した場合のこれらの同じ化合物のＵ２６６細胞増殖への効果を示す。様々な投与量（μＭ単位）をグラフ上に示す。
さらに、図４３は、異なる改変を有する一連のフルフェナジンアナログの細胞増殖への効果を示す。化合物の様々なフェノチアジンＱＳＳシリーズの構造を図４２に示す。これらのアナログをＡＲＨ細胞（同様にヒト多発性骨髄腫から得られた細胞系）において試験した。本明細書に示すデータは、フルフェナジンのスルホン酸誘導体（ＱＳＳ１）およびエトキシド誘導体（ＱＳＳ３）の両方が、フルフェナジンに対してそれらの活性、すなわち、多発性骨髄腫細胞の増殖を阻害するそれらの能力を喪失していることを示す。スルホネート誘導体（ＱＳＳ６）と関連するいくらかの活性はあり得るが、ＱＳＳ５は活性を保持しているだけでなく、フルフェナジンを超える有意な改善も示す。
化合物のＱＳＳシリーズは、親に対するアナログの分極を増加することによってフルフェナジンの主要なインビボ副作用の一つを軽減するかもしくはなくそうとして合成した。すなわち、これらのアナログは親化合物フルフェナジンに対して改変され、フルフェナジンのセロトニン受容体インヒビター活性を維持しようとしながら、血液脳関門を通した透過性を減少した。ＱＳＳ５およびＱＳＳ６を両方とも即座の「睡眠」効果に関してインビボにおいてアッセイした。いずれの化合物も即座の睡眠を誘導せず、また１５ｍｇ／ｋｇ用量の薬剤の後の２４時間の期間にわたっていかなる明白な影響もなかった。ＱＳＳ６は、マウスの全身協調（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）へのいくらかのわずかな効果を有するようであった。
フルフェナジンはセロトニン作動性受容体と交差反応性を有したが、それはドーパミン作動性アンタゴニストとして最初に開発された。ＱＳＳシリーズの化合物をセロトニンもしくはドーパミンのいずれかと比較するための計算機化学／分子モデリング技術の使用により、ＱＳＳ５化合物がアミノ基（これは、セロトニンに含まれるアミノ基に類似する）の付加のためにセロトニンの最もよい模倣を有することが明らかになった。すなわち、図４４は、セロトニン、ドーパミンおよびＱＳＳ５の分子モデルを示す像である。これらの分子は、様々な分子の相対的なサイズおよびファンデルワールス原子半径の位置を示すＣＰＫモデルとして表される。コンピューターモデルは、ＱＳＳ５がドーパミンに対してセロトニンの強い模倣を示すことを明示する。本明細書の他の所に開示するインビトロデータは、このモデルと一致する。
従って、本明細書に開示するデータは、特定のセロトニン受容体、例えば５ＨＴ２Ｃ受容体を通したシグナル伝達を阻害する改変された化合物の能力を維持しながら血液脳関門を通したその透過性を減少するためのセロトニンインヒビター、例えばフルフェナジンの成功した改変を示す。当業者は、興味のある他のセロトニンインヒビターを受容体を介したセロトニンシグナル伝達を阻害するそれらの能力を維持するかもしくは増加しながら血液脳関門を越えるそれらの能力を同様に減少するように改変するために当該技術分野において周知であるかもしくは将来に開発される他の方法を使用できることを理解する。
本明細書に引用する一つ一つの特許、特許出願および公開の開示は、それらの全部が本明細書に引用することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は特定の態様に関して開示されているが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の精神および範囲からそれずに当業者により考案され得ることは明らかである。添付の請求項は、全てのそのような態様および同等なバリエーションを包含すると解釈されるものとする。
本発明を具体的に説明する目的上、図面に本発明のある態様が描かれる。しかしながら、本発明は図面に描かれる態様の正確な配置および手段に制限されない。
マイトジェン活性化シグナルに対するリンパ球の増殖応答に対するマクロファージ馴化培地の影響を描く図である。 セロトニン合成および分解の主代謝経路を描く図である。化合物名を構造の左に示す一方、個々の反応を触媒する酵素は右に示す。 ヒトリンパ球のマイトジェン刺激に対するトリプトファン水酸化酵素阻害剤（パラ−クロロフェニルアラニン、ＰＣＰＡ）の影響を描く図である。すなわち、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡの添加により刺激した。 ＣｏｎＡで刺激されたヒトＰＢＬの活性化に対するセロトニン、トリプトファン若しくはフェネルジンの影響を描く図である。アッセイはグラフ上で示す時間点で収集した。試薬は４００μＭの濃度で添加した。 ３図を含んでなる、多様な濃度のＣｏｎＡでのヒトＴ細胞のマイトジェン刺激に対するトリプトファン（ｔｒｐ）、セロトニン（５−ＨＴ）およびフェネルジン（Ｐｚ）の影響を描く図である。すなわち、図５Ａは０．１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡの影響を描き；図５Ｂは１μｇ／ｍｌのＣｏｎＡの影響を描き、そして図５Ｃは１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡの影響を描く。図のそれぞれ中の点線はいかなる添加される試薬も伴わないＣｏｎＡの基礎刺激レベルを指す。 活性化されたリンパ球のフェネルジンに誘導される阻害へのトリプトファンおよびセロトニン添加の影響を描く図である。個々の試薬（Ｐｚ、Ｔｒｐ、５−ＨＴ）は１００μＭの濃度で添加した。 ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）で刺激したヒトリンパ球の活性化に対する、５−ＨＴＲ １受容体に対し選択的であることが既知のアゴニストおよびアンタゴニストの一団の滴定（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ）の用量応答効果を描く図である。細胞はＣｏｎＡ刺激開始７２時間後に収集した。この研究に使用した薬物は、以下の十分に定義された属性を有する。すなわち（Ｒ）８−ＯＨ ＤＰＡＴ：５ＨＴ １Ａ受容体の選択的アゴニスト；ＷＡＹ １００６３５：５ＨＴ １Ａ受容体の選択的アンタゴニスト；プロプラノロール：一般的５ＨＴ １受容体アンタゴニストならびにβ−アドレナリン作動性アンタゴニスト；Ｌ ６９４２４７：選択的１Ｂ／１Ｄアゴニスト；ＧＲ ５５５６２：選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニスト；ＳＢ ２１６６４１：選択的１Ｂアンタゴニスト；およびＢＲＬ １５５２２：選択的１Ｄアンタゴニスト；ＢＲＬ ５４４４３：選択的１Ｅ／１Ｆアゴニスト。 ヒトリンパ球の同種異系刺激に対する、５−ＨＴＲ １受容体に対し選択的であることが既知の（でなければ混合型リンパ球反応として既知の）アゴニストおよびアンタゴニストの一団の滴定の用量応答効果を描く図である。細胞は刺激開始１２０時間後に収集した。この研究に使用した薬物は以下の十分に定義された属性を有する。すなわち（Ｒ）８−ＯＨ ＤＰＡＴ：５ＨＴ １Ａ受容体の選択的アゴニスト；ＷＡＹ １００６３５：５ＨＴ １Ａ受容体の選択的アンタゴニスト；プロプラノロール：一般的５ＨＴ １受容体アンタゴニストならびにβ−アドレナリン作動性アンタゴニスト；Ｌ ６９４２４７：選択的１Ｂ／１Ｄアゴニスト；ＧＲ ５５５６２：選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニスト；ＳＢ ２１６６４１：選択的１Ｂアンタゴニスト；ＢＲＬ １５５２２：選択的１Ｄアンタゴニスト；ＢＲＬ ５４４４３：選択的１Ｅ／１Ｆアゴニスト。 ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激されたヒトリンパ球の活性化に対する、５−ＨＴＲ ２受容体を標的とすることが既知のアゴニストおよびアンタゴニストの一団の滴定の用量応答効果を描く図である。細胞はＣｏｎＡ刺激開始７２時間後に収集した。この研究に使用した薬物は以下の十分に定義された属性を有する。すなわちＤＯＩ：５ＨＴ ２アゴニスト（この化合物への受容体の延長された曝露はそれらのダウンレギュレーションをもたらす）；ＬＹ ５３８５７：選択的５ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＭＤＬ １１９３９：選択的５ＨＴ ２Ａアンタゴニスト；ＳＢ ２０６５５３：選択的５ＨＴ２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＳＢ ２４２０８４：選択的５ＨＴ ２Ｃアンタゴニスト；メチセルギド：部分的タイプ１アゴニスト／タイプ２アンタゴニスト；メチオテピン：一般的タイプ１、２、６および７アンタゴニスト。 ヒトリンパ球の同種異系刺激に対する、５−ＨＴＲ ２受容体を標的とすることが既知の（でなければ混合型リンパ球反応として既知の）アゴニストおよびアンタゴニストの一団の滴定の用量応答効果を描く図である。細胞は刺激開始１２０時間後に収集した。この研究に使用した薬物は以下の十分に定義された属性を有する。すなわちＤＯＩ：５ＨＴ ２アゴニスト（この化合物への受容体の延長された曝露はそれらのダウンレギュレーションをもたらす）；ＬＹ ５３８５７：選択的５ＨＴ２Ａ／２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＭＤＬ １１９３９：選択的５ＨＴ ２Ａアンタゴニスト；ＳＢ ２０６５５３：選択的５ＨＴ２Ｂ／２Ｃアンタゴニスト；ＳＢ ２４２０８４：選択的５ＨＴ ２Ｃアンタゴニスト；メチセルギド：部分的タイプ１アゴニスト／タイプ２アンタゴニスト；メチオテピン：一般的タイプ１、２、６および７アンタゴニスト。 ＣｏｎＡ（５μｇ／ｍｌ）刺激されたヒトリンパ球の活性化に対する、５−ＨＴＲ ３、４、６若しくは７受容体のいずれかを標的とすることが既知のアゴニストおよびアンタゴニストの一団の滴定の用量応答効果を描く図である。細胞はＣｏｎＡ刺激開始７２時間後に収集した。この研究に使用した薬物は以下の十分に定義された属性を有する。すなわちＳＲ ５７２２２Ａ：選択的５ＨＴ ３アゴニスト；トロポセトロン：選択的５ＨＴ ３アンタゴニスト（制吐薬として臨床で承認されている）；ＲＳ ６７３３３：選択的５ＨＴ４アゴニスト（延長された接触に際して受容体をダウンレギュレートする）；ＳＢ ２０４０７０：選択的５ＨＴ ４受容体アンタゴニスト；Ｒｏ ０４７６９０：選択的５ＨＴ ６アンタゴニスト ＳＢ ２６９９７０：選択的５ＨＴ ７アンタゴニスト。 ヒトリンパ球の同種異系刺激に対する、５−ＨＴＲ ３、４、６若しくは７受容体のいずれかを標的とすることが既知の（でなければ混合型リンパ球反応として既知の）アゴニストおよびアンタゴニストの一団の滴定の用量応答効果を描く図である。細胞は刺激開始１２０時間後に収集した。この研究に使用した薬物は以下の十分に定義された属性を有する。すなわち、ＳＲ ５７２２２Ａ：選択的５ＨＴ ３アゴニスト；トロポセトロン：選択的５ＨＴ ３アンタゴニスト（制吐薬として臨床で承認されている）；ＲＳ ６７３３３：選択的５ＨＴ４アゴニスト（延長された接触に際して受容体をダウンレギュレートする）；ＳＢ ２０４０７０：選択的５ＨＴ ４受容体アンタゴニスト；Ｒｏ ０４７６９０：選択的５ＨＴ ６アンタゴニスト；ＳＢ ２６９９７０：選択的５ＨＴ ７アンタゴニスト。 ５ＨＴ１Ｒアゴニストの作用に関する５ＨＴ３Ｒアゴニストおよび選択的５ＨＴ６Ｒアンタゴニストの影響を検査するマウス混合型リンパ球反応アッセイ（ＢＡＬＢ／ｃ対Ｃ５７ＢＬ６）を描くグラフである。 ヒトリンパ球活性化のマイトジェン刺激の間に発生する細胞数に対する５ＨＴタイプ１受容体アンタゴニストおよび５ＨＴタイプ２受容体アンタゴニストの影響を描く図である。細胞は１０μｇ／ｍｌのＣｏｎＡで刺激した。細胞は阻害剤の添加前にＦｉｃｏｌｌ勾配で再精製した。トリパンブルー排除を使用して生存可能細胞をカウントした。 ヒトリンパ球のマイトジェン刺激に対する高度に選択的な５ＨＴタイプ２受容体アンタゴニストＬＹ ５３８５７の影響を描く図である（１μｇ／ｍｌでのＣｏｎＡ刺激、および細胞は７２時間に収集した）。結果は、時間＝０若しくはアッセイの開始後４８時間の阻害剤の添加の影響を描く。 ヒトリンパ球のマイトジェン刺激に対する高度に選択的な５ＨＴタイプ２受容体アンタゴニストＳＢ ２０６５５３の影響を描く図である（１μｇ／ｍｌでのＣｏｎＡ刺激、および細胞は７２時間に収集した）。該図は、時間＝０若しくはアッセイの開始後４８時間の阻害剤の添加の影響を描く。 ヒトリンパ球のマイトジェン刺激に対する高度に選択的な５ＨＴタイプ２受容体アンタゴニストＭＤＬ １１９３９の影響を描く図である（１μｇ／ｍｌでのＣｏｎＡ刺激、および細胞は７２時間に収集した）。データは、時間＝０若しくはアッセイの開始後４８時間の阻害剤の添加の影響を描いた。 ヒトリンパ球のマイトジェン刺激に対する高度に選択的な５ＨＴタイプ２受容体アンタゴニストＳＢ ２４２０８４の影響を描く図である（１μｇ／ｍｌでのＣｏｎＡ刺激、および細胞は７２時間に収集した）。該図は、時間＝０若しくはアッセイの開始後４８時間の阻害剤の添加の影響を描く。 シクロスポリンＡに対するセロトニン受容体アンタゴニストの影響を研究するためのマウス同種移植片モデルの結果を描くグラフである。本明細書に開示される日付は、ｐ８１５標的細胞に対する処理されたマウスからの脾細胞を使用する細胞傷害性Ｔ細胞殺傷アッセイ由来である。 マウス同種移植片モデルにおける５ＨＴ２Ｒ選択的アンタゴニストＳＢ ２０６５５３の影響を描く図である。３匹のＳＢ ２０６５５３処理したマウスをＳＢ＃２２６ｈ、ＳＢ＃２２６ｉおよびＳＢ＃２２６ｊと呼称した。処理したマウスのうち２匹は同種異系応答を完全に抑制させた。マウスの１匹（ＳＢ＃２２６ｊ）のみが、処置の結果として事実上免疫学的影響を示さなかった。しかしながら、ＳＢ＃２２６ｊは薬物を投与するために反復された尾静脈注入を必要とした。よく注意して注入した場合であっても尾静脈注入は技術上困難であり得、そして常に最初の試みで起こるわけではない。 休止期および活性化されたリンパ球および単球のＲＴ ＰＣＲプライミングを示すゲルを描く像である。（＋）レーンはｃＤＮＡライブラリーを創製する前にＣｏｎＡで４８時間マイトジェン刺激した細胞を示す。（−）レーンは休止期細胞を示す。 １４種の別個のセロトニン受容体のそれぞれの発現を示すサザンブロットを描く像であり、ここでブロットは後に続くような適切な内的オリゴヌクレオチドでプロービングした：１Ａ：ｃｔｇｃａｇａａｃｇｔｇｇｃｃａａｔｔａｔｃｔｔａｔｔｇｇｃｔｃｔｔｔ（配列番号１）；１Ｂ：ｇｔｇｇａｇｔａｃｔｃａｇｃｔａａａａｇｇａｃｔｃｃｃａａｇａｇｇｇ（配列番号２）；１Ｄ：ｃｔｃｔｃｔｔｔｔｔｃａａｃｃａｃｇｔｇａａａａｔｃａａｇｃｔｔｇｃｔ（配列番号３）；１Ｅ：ａｔｃｔａｇａｔｃａｃｃｃａｇｇａｇａａｃｇｔｃａｇｃａｇａｔｃｔｃｔａ（配列番号４）；１Ｆ：ｇａｇｃａｇｃａａａｇａｃａｔｔａｔａｃｃａｃａａｇａｇａｃａａｇｃａａ（配列番号５）；２Ａ：ｔｃｇｇｃｔｃｔｔｔｔｇｔｇｔｃａｔｔｔｔｔｃａｔｔｃｃｃｔｔａａｃｃａ（配列番号６）；２Ｂ：ｃｔｃａａｃｇｃｃｔａａｃａｔｇｇｔｔｇａｃｔｇｔｇｔｃｔａｃａｇｔｔｔ（配列番号７）；２Ｃ：ｔａａｃｔｇａｃａｔｔｔｔｃａａｔａｃｃｔｃｃｇａｔｇｇｔｇｇａｃｇｃｔ（配列番号８）；３Ａ：ｇｇｇａｇｔｔｃａｇｃａｔｇｇａａａｇｃａｇｔａａｃｔａｃｔａｔｇｃａｇ（配列番号９）；３Ｂ：ｔｔｃａａｔｃｔａｔｃａｇｃａａｃｔａｃｃｔｃｃａａａｃｔｃａｇｇａｃｃ（配列番号１０）；４：ｃａｃｃａｔｔｃｔｔｔｇｔｃａｃｃａａｔａｔｔｇｔｇｇａｔｃｃｔｔｔｃ（配列番号１１）；５：ｃｔｔｔｔｔｇｇｃｔｇｇｇｇａｇａｇａｃｇｔａｃｔｃｔｇａｇｇ（配列番号１２）；６：ａｔｃｃｔｃａａｃｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｇａｃ（配列番号１３）；７：ｔｇａａａｇｇａａａａａｃａｔｃｔｃｃａｔｃｔｔｔａａｇｃｇａｇａａｃａ（配列番号１４）。 多様な５−ＨＴクラス１選択的薬物の機能的挙動を描くグラフである。８−ＯＨ ＤＰＡＴは１Ａ選択的アゴニストであり；ＷＡＹ １００６３５は選択的１Ａアンタゴニストであり；プロプラノロールは一般的タイプ１受容体アンタゴニスト（ならびにβ−アドレナリン作動性アンタゴニスト）であり；ＳＢ ２１６６４１は選択的１Ｂアンタゴニストであり；Ｌ６９４２４７は選択的１Ｂ／１Ｄアゴニストであり；ＧＲ ５５５６２は選択的１Ｂ／１Ｄアンタゴニストであり；ＢＲＬ ５４４４３は選択的１Ｅ／１Ｆアゴニストである。薬物は、本明細書の別の場所で記述されるとおりヒトリンパ球の５ｍｇ／ｍｌのＣｏｎＡ刺激の時間＝０で添加した。 本明細書の別の場所で記述されるマウス同種移植片モデルを使用して得たデータを描くグラフである。簡潔には、描かれるデータは単一の代表的研究を使用して得た。示される２種の陽性対照は観察された誘導された細胞傷害性殺傷活性を示す一方、ナイーブな対照はＰ８１５を受領したことがなく、そして結果として該アッセイのバックグラウンドの尺度を提供する。メチセルギド処理した（ＭＳ）マウスは誘導された殺傷応答の完全な阻害を示す。 本明細書の別の場所で記述されるところのマウス同種移植片モデルを使用して得たデータを描くグラフである。描かれるデータは複数のアッセイのプールした結果を表し、ここで、１００：１のエフェクター：標的比のデータを使用して阻害パーセントを計算した。各個別の棒は単一マウスから収集したデータを表す。 １６時間でのＲＰＭＩ ８２２６細胞の生存率に対する５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストＬＹ５３５８７に対する影響を描くグラフである。 ４８時間でのＲＰＭＩ ８２２６細胞の生存率に対する５−ＨＴ２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストＬＹ５３５８７に対する影響を描くグラフである。 １６時間でのＲＰＭＩ ８２２６細胞におけるミトコンドリア活性の５ＨＴ−２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を描くグラフである。 ４８時間でのＲＰＭＩ ８２２６細胞におけるミトコンドリア活性の５ＨＴ−２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を描くグラフである。 １６時間でのＲＰＭＩ ８２２６細胞におけるＤＮＡ合成の５ＨＴ−２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を描くグラフである。 ４８時間でのＲＰＭＩ ８２２６細胞におけるＤＮＡ合成の５ＨＴ−２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を描くグラフである。 ＲＰＭＩ ８２２６細胞におけるＤＮＡ合成の５ＨＴ−２Ａ／Ｂ／Ｃ受容体アンタゴニストの影響を描くグラフである。 ＲＰＭＩ ８２２６細胞の増殖に対する多様な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を描くグラフである。 ５−ＨＴＲ １受容体に標的を向けられた多様な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を描くグラフである。アッセイの読み出しはＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞の細胞増殖である。 ５−ＨＴＲ ２受容体に標的を向けられた多様な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を描くグラフである。アッセイの読み出しはＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞の細胞増殖である。 ５−ＨＴＲ ３、４、６若しくは７受容体のいずれかに標的を向けられた多様な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの影響を描くグラフである。アッセイの読み出しはＲＰＭＩ ８２２６多発性骨髄腫細胞の細胞増殖である。 ５−ＨＴＲ ２Ａ／２Ｂ／２Ｃを包含する多様な作用物質で処理したＲＰＭＩ ８２２６細胞におけるアポトーシスと関連する古典的ＤＮＡ断片化を示すゲルを描く像である。 図Ａ〜Ｆを含んでなる、全部アネキシン（縦座標に沿って）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（横座標に沿って）で染色された、多様な濃度のカンプトテシン（選択的５−ＨＴＲタイプ１Ｂ／Ｄアンタゴニスト）で処理したＲＰＭＩ ８２２６細胞若しくは未処理の対照細胞のＦＡＣＳプロファイルを描く像である。 ２μＭのカンプトテシンでの９時間処理後（左）および５−ＨＴ １Ｂ受容体シグナルを阻害するために５０μＭのＳＢ ２１６６４１処理した（右）ＲＰＭＩ−８２２６細胞のマッチさせたヘマトキシリンおよびエオシン（上）ならびにビス−ベンズアミド（下）染色した像を描く４つの像である。広範囲のクロマチン凝集および核断片化が双方の処置群で明白であり、広範なアポトーシスを暗示する。 ５−ＨＴ ２Ｃ受容体シグナルを阻害するため５０μＭのＳＢ２４２０８４処理した９時間後（右）およびベヒクル対照（左）のヘマトキシリンおよびエオシン（上）ならびにビス−ベンズアミド（下）で染色したＲＰＭＩ−８２２６細胞のマッチさせた像を描く。均一なクロマチン染色が対照サンプル中で明らかであり生存可能な細胞を暗示する一方、ＳＢ２４２０８４で処理した細胞は凝集かつ断片化されたクロマチンを示し、アポトーシス細胞を暗示した。 図Ａ〜Ｄを含んでなる、セロトニン作動性シグナル伝達の阻害に際しての細胞中の検出可能な変化を示す顕微鏡写真を描く像である。細胞は選択的タイプ１Ｂアンタゴニスト（ＳＢ ２１６６４１）の存在下でインキュベートし、そして細胞の形態学の変化を処置の２４時間後に描く。 フルフェナジンおよびマレイン酸メチルエルゴノビンに対するＲＰＭＩ−８２２６細胞の用量依存性の細胞増殖応答を描くグラフである。アッセイの読み出しは、細胞ＤＮＡ中へのトリチウム化チミジンの取込みの１分あたりカウント（ＣＰＭ）である。 多様な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストに対するＲＰＭＩ−８２２６細胞の用量依存性の細胞増殖応答を描くグラフである。アッセイの読み出しは、細胞ＤＮＡ中へのトリチウム化チミジンの取込みの１分あたりカウント（ＣＰＭ）である。 マイトジェン誘導性のＴ細胞増殖アッセイにおける多様な５−ＨＴ受容体アゴニストおよびアンタゴニストの用量依存性の機能的挙動を描くグラフである。細胞は本明細書の別の場所で記述されたとおり５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡで刺激し、そして示度を７２時間後に測定した。 図３４Ａから３４Ｉを含んでなる、多様な濃度のフルフェナジンで処理しかつヨウ化プロピジウムおよびアネキシン−Ｖで染色したＲＰＭＩ ８２２６細胞を使用するフローサイトメトリーデータから生成されるＦＡＣＳプロファイルを描く一連の像である。ＦＡＣＳプロットは、ヨウ化プロピジウム陰性細胞（非壊死性）のみを包含するようにフローサイトメトリーをゲートした後に生成した。その後、アネキシン−Ｖ染色の程度をアポトーシスの尺度として測定した。プロットの暗い領域は未処理の対照細胞を示し、そしてより明るい領域はフルフェナジン処理した細胞を示す。 図３５Ａから３５Ｄを含んでなる、細胞ＤＮＡのヌクレオソーム間切断（アポトーシスの特質）を示す一連のゲルを描く像である。ＲＰＭＩ−８２２６細胞を、示された濃度のフルフェナジン、ＳＢ２１６６４１（５ＨＴ−１ＢＲアンタゴニスト）およびカンプトテシン（トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、アポトーシス対照）で処理し、そしてゲノムＤＮＡを示された時間点で抽出した。 いずれかの特定の論理により束縛されることを願わず、Ｔ細胞および腫瘍性Ｂ細胞上の５−ＨＴ １Ｂ受容体とのセロトニンの相互作用から生じるシグナル伝達経路を示すモデルを描く。５−ＨＴ １Ｂ受容体のシグナル伝達の伝達特性はＡＫＴ（プロテインキナーゼＢとしてもまた知られている）の活性と共役される。５−ＨＴ １Ｂ受容体の活性化はＡＫＴタンパク質のリン酸化をもたらす。このホスホ形態のタンパク質は順にカスパーゼ９をリン酸化しかつアポトーシス応答の抑制をもたらす。限定されるものでないが薬物フルフェナジンを使用することによるような５−ＨＴ １Ｂシグナルの除去はＡＫＴのスイッチを切り、そしてカスパーゼ系を活性化させてプログラムされた細胞死をもたらす。 図３７Ａおよび３７Ｂを含んでなる、示された濃度の５−ＨＴ １の選択的アンタゴニスト（ＳＢ ２１６６４１）の滴定を示す２枚のゲルの像を描く。本明細書の別の場所で記述されるとおり、該データは、５−ＨＴ １Ｂシグナルの除去がＡＫＴの活性をダウンレギュレートしかつそれによりプログラムされた細胞死を誘導することを示す。 フルフェナジンによる細胞増殖の典型的な阻害を描くグラフである。典型的な抗精神病薬フルフェナジンはＨＥＫ−２９３細胞で発現されるヒト５ＨＴ２Ｃ−ＩＮＩ受容体アイソフォームの強力なインバースアゴニストである。描かれる結果は、ＨＥＫ−２９３細胞で発現されるヒト５ＨＴ２Ｃ−ＩＮＩ受容体の構成的ＰＩ加水分解活性を阻害するフルフェナジンの能力を評価した、３回複製した実験からである。データは三重の測定の平均ｄｐｍ±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表し、そしてＲａｕｓｅｒら（２００１、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９９：８３−８９）から得た。 フルフェナジン、ならびにＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１３と呼称されるその２種の正に荷電したフェノチアジン誘導体の化学構造を描く。ＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２へのアミノ基の付加は双方とも親化合物フルフェナジンに関して該化合物の親油性を減少させるよう作用する。 フルフェナジン、ＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２による細胞傷害性Ｔ細胞アッセイでの細胞殺傷の相対的効果を描くグラフである。このアッセイのために、完全なＭＨＣミスマッチを表すＰ８１５によりＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞を刺激した。標準的手順に従い、アッセイ細胞を一緒に７日間インキュベートし、そしてＰ８１５標的細胞を溶解するそれらの能力についてＣＴＬを試験した。データは未処理細胞集団を使用して検出された殺傷率に関して示す。 図４１Ａおよび４１Ｂを含んでなる、ヒト多発性骨髄腫由来の細胞株からの細胞の増殖の低下における多様な化合物の有効性を描くグラフである。図４１ＡはＲＰＭＩ−８２２６細胞の増殖に対するフルフェナジンのＱＳＳ誘導体の力価測定を描く。図４１ＢはＵ２６６細胞の増殖の低下におけるフルフェナジンおよびＱＳＳ誘導体の有効性を描く。双方の細胞株はヒト多発性骨髄腫由来であった。多様な投薬量の多様な化合物をμＭで提供する。細胞増殖は、ＤＮＡ合成の尺度としてのトリチウム化チミジンの取込みとして表す。 フルフェナジンの多様なフェノチアジン誘導体すなわちＱＳＳ−１、ＱＳＳ−３、ＱＳＳ−５およびＱＳＳ−６の化学構造を描く。 多様な濃度のフルフェナジン、ＱＳＳ−１、ＱＳＳ−３、ＱＳＳ−５およびＱＳＳ−６の細胞増殖に対する影響を描くグラフである。変動する濃度の示される化合物のヒト多発性骨髄腫細胞株ＡＲＨ−７７での細胞増殖に対する影響（ＤＮＡ合成の尺度としてのトリチウム化チミジンの取込みにより測定されるところの）を評価した。 セロトニン、ドーパミンおよびＱＳＳ−５の分子モデルを描く像である。分子は多様な化合物のファンデルワールス原子半径の相対的大きさおよび位置を示すＣＰＫモデルとして提示する。

Claims (93)

  1. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより前記哺乳動物における免疫応答を調節することを含んでなる、前記哺乳動物における前記免疫応答の調節方法。
  2. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ４受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ６受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記阻害剤がフルフェナジンである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項３に記載の方法。
  7. 前記阻害剤が、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変される、請求項２に記載の方法。
  8. 前記改変された阻害剤が前記阻害剤のフェノチアジン誘導体である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記阻害剤がフルフェナジンであり、かつ、前記フルフェナジンの前記フェノチアジン誘導体がＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
  10. 免疫応答阻害量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより前記哺乳動物における前記免疫応答を阻害することを含んでなる、哺乳動物における免疫応答の阻害方法。
  11. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ４受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ６受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記阻害剤がフルフェナジンである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記阻害剤が、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変される、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記改変された阻害剤が前記阻害剤のフェノチアジン誘導体である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記阻害剤がフルフェナジンであり、かつ、前記フルフェナジンの前記フェノチアジン誘導体がＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 免疫細胞上のセロトニン受容体により伝達されるセロトニンシグナルを阻害することを含んでなり、前記シグナルを阻害することが前記細胞の活性化を阻害し、かつ、さらに、セロトニンシグナルを前記阻害することが、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と前記免疫細胞を接触させてそれにより前記細胞による免疫反応を阻害することを含んでなる、前記細胞による前記免疫反応の阻害方法。
  20. 前記免疫細胞がＴ細胞およびＢ細胞から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ４受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ６受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４、ＭＤＬ １１９３９、ＳＢ ２１６６４１およびメチオテピンよりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記阻害剤がフルフェナジンである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項１９に記載の方法。
  26. 前記阻害剤が、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変される、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記改変された阻害剤が前記阻害剤のフェノチアジン誘導体である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記阻害剤がフルフェナジンであり、かつ、前記フルフェナジンの前記フェノチアジン誘導体がＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
  29. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を自己免疫疾患を有する哺乳動物に投与してそれにより前記哺乳動物における免疫応答を調節することを含んでなる、セロトニンシグナル伝達により活性化される免疫細胞により媒介される自己免疫疾患を有する哺乳動物における免疫応答の調節方法。
  30. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記自己免疫疾患が、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  34. 前記調節が阻害である、請求項２９に記載の方法。
  35. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤とＴ細胞を接触させてそれにより哺乳動物における免疫応答を阻害することを含んでなる、前記哺乳動物における前記Ｔ細胞上のセロトニン受容体の活性化により媒介される前記免疫応答の阻害方法。
  36. 前記阻害剤をボーラス注入として投与することをさらに含んでなる、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  38. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項３８に記載の方法。
  41. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与することを含んでなり、さらに、免疫細胞が前記阻害剤と接触されてそれにより前記免疫細胞の活性化を阻害する、前記哺乳動物における前記免疫細胞上のセロトニン受容体の活性化により媒介される免疫細胞の前記活性化の阻害方法。
  42. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニストおよび選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項４４に記載の方法。
  46. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を哺乳動物に投与してそれにより前記哺乳動物における二次的免疫応答を阻害することを含んでなる、前記哺乳動物における前記二次的免疫応答の阻害方法。
  47. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体およびセロトニンタイプ２Ｃ受容体よりなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記阻害剤が、リスペリドン、フルフェナジン、ケタンセリン、ミアンセリン、ＬＹ ５３８５７、ＳＢ ２０６５５３、ＳＢ ２４２０８４およびＭＤＬ １１９３９よりなる群から選択されるセロトニン受容体アンタゴニストである、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項４９に記載の方法。
  51. 哺乳動物中の細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を阻害することを含んでなり、前記阻害が前記細胞に対し有害でありその結果前記細胞が疾患を媒介しない、セロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を必要とする前記細胞により媒介される前記疾患の治療方法。
  52. セロトニン相互作用の前記阻害が、セロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と細胞を接触させることにより媒介される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１受容体、セロトニンタイプ２受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記疾患が、多発性骨髄腫、重症筋無力症、特発性炎症性ミオパシー、慢性好中球減少症、慢性関節リウマチ、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性症候群、抗リン脂質抗体症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、心筋炎、ギラン・バレー症候群、脈管炎、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ドヴィック症候群）、リンパ球性下垂体炎、グレーヴズ病、アジソン病、副甲状腺機能低下症、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、子宮内膜症、自己免疫性精巣炎、自己免疫性勃起不全、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫、自己免疫性難聴、シェーグレン病、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、間質性膀胱炎、グッドパスチャー症候群および線維筋痛症よりなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記セロトニン受容体がセロトニンタイプ１Ｂ受容体でありかつさらに前記疾患が多発性骨髄腫である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項５５に記載の方法。
  57. 細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、前記阻害がアポトーシスを誘導し、かつ、さらに、前記細胞上のセロトニン受容体とのセロトニン相互作用を前記阻害することが、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と前記細胞を接触させてそれにより前記細胞におけるアポトーシスを誘導することを含んでなる、前記細胞におけるアポトーシスの誘導方法。
  58. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項５７に記載の方法。
  59. 細胞上のセロトニン受容体を介するセロトニンシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、前記阻害が前記細胞の死を誘導し、さらに、前記阻害が、有効量の前記セロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と前記細胞を接触させてそれにより前記細胞の死を誘導することを含んでなる、細胞死の誘導方法。
  60. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項５９に記載の方法。
  61. セロトニン受容体を試験化合物と接触させること、および前記化合物と接触させた前記セロトニン受容体とのセロトニンの結合のレベルを前記化合物と接触されないそれ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、前記化合物と接触されない前記それ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合の前記レベルと比較して前記化合物と接触させた前記セロトニン受容体とのセロトニン結合のより低いレベルが、前記化合物が哺乳動物における自己免疫疾患を治療するのに有用であることの指標となる、前記哺乳動物における前記自己免疫疾患を治療するのに有用な化合物の同定方法。
  62. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  63. 請求項６１に記載の方法により同定される化合物。
  64. 血液脳関門を横断する前記化合物の能力を評価すること、および前記血液脳関門を実質的に横断しない化合物を選択することをさらに含んでなる、請求項６２に記載の方法。
  65. 請求項６４に記載の方法により同定される化合物。
  66. 前記化合物がＱＳＳ−５およびＱＳＳ−１２よりなる群から選択される、請求項６５に記載の化合物。
  67. セロトニン受容体を試験化合物と接触させること、および前記化合物と接触させた前記セロトニン受容体とのセロトニンの結合のレベルを前記化合物と接触されないそれ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合のレベルと比較することを含んでなり、前記化合物と接触されない前記それ以外は同一のセロトニン受容体とのセロトニン結合の前記レベルと比較して前記化合物と接触させた前記セロトニン受容体とのセロトニン結合のより低いレベルが、前記化合物が哺乳動物における同種異系移植片応答を治療するのに有用であることの指標となる、前記哺乳動物における前記同種異系移植片応答を治療するのに有用な化合物の同定方法。
  68. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
  69. 請求項６７に記載の方法により同定される化合物。
  70. 血液脳関門を横断する前記化合物の能力を評価すること、および前記血液脳関門を実質的に横断しない化合物を選択することをさらに含んでなる、請求項６７に記載の方法。
  71. 請求項７０に記載の方法により同定される化合物。
  72. 同定された前記化合物を、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変することを含んでなる、請求項６７に記載の方法。
  73. Ｔ細胞を試験化合物と接触させること、および前記化合物と接触させた前記Ｔ細胞の活性化のレベルを前記化合物と接触されないそれ以外は同一のＴ細胞の活性化のレベルと比較することを含んでなり、前記化合物と接触されない前記それ以外は同一のＴ細胞の活性化の前記レベルと比較して前記化合物と接触させた前記Ｔ細胞の活性化のより低いレベルが、前記化合物が、前記Ｔ細胞上のセロトニンタイプ２受容体とのセロトニン結合により媒介されるＴ細胞の活性化を阻害するのに有用であることの指標となる、前記Ｔ細胞上のセロトニン受容体とのセロトニンの結合により媒介されるＴ細胞の活性化を阻害するのに有用な化合物の同定方法。
  74. 血液脳関門を横断する前記化合物の能力を評価すること、および前記血液脳関門を実質的に横断しない化合物を選択することをさらに含んでなる、請求項７３に記載の方法。
  75. 請求項７３に記載の方法により同定される化合物。
  76. 同定された前記化合物を、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変することを含んでなる、請求項７３に記載の方法。
  77. 細胞を化合物と接触させること、および前記化合物と接触させる前の前記細胞の形態と比較して前記細胞における細胞の形態のいかなる変化も評価することを含んでなり、前記化合物と接触させる前の前記細胞の前記形態と比較した前記化合物と接触させた前記細胞の前記形態の変化が、前記化合物が前記細胞上のセロトニン受容体を介するシグナル伝達に影響を及ぼしてそれにより細胞上のセロトニン受容体を介してシグナル伝達に影響を及ぼす化合物を同定することの指標となる、細胞上のセロトニン受容体を介してシグナル伝達に影響を及ぼす化合物の同定方法。
  78. 請求項７７に記載の方法により同定される化合物。
  79. 同定された前記化合物を、それが血液脳関門を実質的に横断しないように改変することを含んでなる、請求項７７に記載の方法。
  80. 請求項７９に記載の方法により同定される化合物。
  81. 細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を阻害することを含んでなり、さらに、前記細胞上のセロトニン受容体を介するシグナルの伝達を前記阻害することが、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と前記細胞を接触させてそれにより細胞周期過程に影響を及ぼすことを含んでなる、前記細胞における細胞周期過程に影響を及ぼす方法。
  82. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項８１に記載の方法。
  83. セロトニン受容体を介して伝達されるシグナルを阻害することを含んでなり、さらに、前記阻害することが、有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤と前記受容体を発現する細胞を接触させてそれにより前記細胞におけるアポトーシスに影響を及ぼすことを含んでなる、前記細胞におけるアポトーシスに影響を及ぼす方法。
  84. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項８３に記載の方法。
  85. セロトニン受容体を介して伝達されるシグナルを阻害してそれにより前記受容体を発現する細胞においてアポトーシスを誘導することを含んでなる、前記細胞におけるアポトーシスの誘導方法。
  86. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなり、アプリケーターおよびそれの使用のための説明資料をさらに含んでなる、哺乳動物における免疫応答を調節するためのキット。
  87. 前記セロトニン受容体が、セロトニンタイプ１Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ａ受容体、セロトニンタイプ２Ｂ受容体、セロトニンタイプ２Ｃ受容体、セロトニンタイプ４受容体およびセロトニンタイプ６受容体よりなる群から選択される、請求項８６に記載のキット。
  88. 前記阻害剤が、選択的セロトニンタイプ１Ｂ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ａ受容体アンタゴニスト、選択的セロトニンタイプ２Ｂ受容体アンタゴニスト、および選択的セロトニンタイプ２Ｃ受容体アンタゴニストよりなる群から選択される、請求項８７に記載のキット。
  89. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項８８に記載のキット。
  90. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなり、アプリケーターおよびそれの使用のための説明資料をさらに含んでなる、前記セロトニン受容体を発現する細胞における細胞周期過程に影響を及ぼすためのキット。
  91. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項９０に記載のキット。
  92. 有効量のセロトニン受容体とのセロトニンの相互作用の阻害剤を含んでなり、アプリケーターおよびそれの使用のための説明資料をさらに含んでなる、前記セロトニン受容体を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導するためのキット。
  93. 前記阻害剤が血液脳関門を実質的に横断しない、請求項９２に記載のキット。
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