JP2005537037A - 流体の蓚酸塩濃度を減少させる物質および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2001年10月5日に出願された米国特許仮出願第60/327544号の利益を主張する。
蓚酸(蓚酸塩)は、脊椎動物および多くの食用植物における代謝過程の天然副産物である。残念ながら、蓚酸塩は、かなり高い割合の人において充分に分解されず、結果としてのそれらの人において腎臓の結石の形成を生じうる。全ての腎臓の結石の70%は、蓚酸塩から構成されると推定される。米国人口の約12%は、生涯のある時期に腎臓結石に罹患する。進行中の腎臓結石に罹患している人、およびそのリスクを有する人、ならびに脂質吸収不良の問題(例えば、スプルー、膵臓不全、炎症性腸疾患、腸切除など)を有する患者は、高濃度の尿蓚酸塩を有する傾向がある。
より親水性の表面(Urban、M.W.、M.T.Stewart、1990、“ATR FT−IR studies of gas plasma modofied silicone elastomer surfaces” J Appl Polym Sci.39:265−283;Howard I.H.1991、“Surface modification of polymers by radio frequency plasma、Ph.D.論文、フロリダ大学、p.76;およびLee、S.D.、G.H.Hsiue、C.Y.Kao、1996、”Preparation and characterization of a homobifunctional silicone rubber membrane grafted with acrylic acid via plasma−induced graft copolymerization“ J.Polym Sci Pol Chem 34:141−148);
官能化された表面(Mutlu、M.ら、1991、“Matrix surface modification by plasma polymerization for enzyme immobilization” J.Mater Chem 1:447−450;Gaboury、S.R.、M.W.Urban、1993、“Analysis of gas plasma−modified poly−(dimethylsiloxane)elastomer surfaces−attenuated−total−reflectance Fourier−transform infrared−spectroscopy) Adv Chem Ser 777−790;およびRau、K.R.、2000、”Surface modification of biomaterials by pulsed laser ablation deposition and plasma/gamma polymerization“ Ph.D.論文、フロリダ大学、Gainesville、FL);または、
グラフト重合された表面(Lee、S.D.、G.H.Hsiue、C.Y.Kao、1996、“Preparation and characterization of a homobifunctional silicone rubber membrane grafted with acrylic acid via plasma−induced graft copolymerization” J.Polym Sci Pol Chem 34:141−148;Lee、S.D.、G.H.Hsiue、C.C.Wang、1994、“Characterization of plasma−induced graft−polymerization of 2−hydroxyethyl methacrylate onto silicone rubber” J.Appl Polym Sci 54:1279−1287;Lee、S.D.ら、1996、“Plasma−induced grafted polymerization of acrylic acid and subsequent grafting of collagen onto polymer film as biomaterials” Biomaterials 17:1599−1608;Ksiue、G.H.ら、1998“Surface characterization and biological properties study of silicone rubber membrane grafted with phospholipid as biomaterial via plasma induced graft copolymerization” J Biomed Mater Res 42:134−147;およびLangefeld、S.ら、1999、Functionally adapted surfaces on a silicone keratoprosthesis“ Int.J.Artif Organs 22:235−241)。表面改質は、化学反応、UV照射、γ線照射および高周波プラズマ放電(RFPD)を包含する種々の方法で行われている。RFプラズマ放電は、タンパク質吸着の変化のような生物適合性を促進するために、大半の特性を改質せずに材料の表面特性を変化させるのに有用な技術であり、またはそれを使用して、生体材料表面への所望の細胞付着および生育を増加させることができる(Lee、S.D.、G.H.Hsiue、C.C.Wang、1994、”Characterization of plasma−induced graft−polymerization of 2−hydroxyethyl−methacrylate onto silicone rubber“ J.Appl Polym Sci 54:1279−1287;Ksiue、G.H.ら、1998、”Surface characterization and biological properties study of silicone rubber membrane grafted with phospholipid as biomaterial via plasma induced graft copolymerization“ J Biomed Mater Res 42:134−147;Langefeld、S.ら、1999、Functionally adapted surfaces on a silicone keratoprosthesis” Int.J.Artif Organs 22:235−241;およびMason、Mら、2000、“Attachment of hyaluronic acid to polypropylene、polystyrene、and polytetrafluoroethylene” Biomaterials 21:31−36)。
本発明は、流体における蓚酸塩濃度を減少させる物質および方法を提供する。好ましい実施形態において、蓚酸塩分解酵素を表面に固定し、表面に接触する流体における遊離蓚酸塩を減少させる有効な方法を提供する。本明細書に例示する特定の実施形態においては、生物学的流体に接触する表面に、蓚酸塩分解酵素を付着させる。これらの表面は、例えば、カテーテル、ステントまたは透析膜の表面である。
本発明は、流体における蓚酸塩濃度を減少させる物質および方法を提供する。この蓚酸塩濃度の減少は、蓚酸塩の分解かそうでなければ流体からの蓚酸塩の除去によって達成できる。好ましい実施形態において、蓚酸塩を生物学的流体中で分解させる。本明細書において特に例示するものは、ステントおよびカテーテル、周囲流体中の蓚酸塩濃度を減少させて外被の形成を減少するかまたは除去するように改質したカテーテルである。
3種類の主要な蓚酸塩分解酵素が存在する。蓚酸塩オキシダーゼは高等植物において産生され、それは、H2O2の付随生成を伴う蓚酸塩のCO2への酸素依存性酸化を触媒する。大麦の根から蓚酸塩オキシダーゼを得る急速三段階精製法が開発された(Kotsira VPおよびYD Klonis、1997、Arch.Biochem.Biophys.340:239−249)。大麦の根の蓚酸塩オキシダーゼをコードする遺伝子をクローン化し、配列し、発現させている(Thompson Cら、1995、Euphytica 85:169−172)。
シリコーンエラストマー
シリコーンエラストマー(MDX4−4210、医療グレードのエラストマー、Dow Corning、Midland、MI、Factor II、Inc.、Lakeside、AZによって供給)を、製造会社の指示に従って製造した。簡単に言えば、エラストマーを、2mmのスペーサーによって分離したアクリル板の間で樹脂を硬化することによって、厚さ2mm厚のシートに流延した。製造したシートを室温で48時間硬化させた。コルクボーリング器(Boekel、Feasterville、PA)を使用して、直径10mmのディスクを硬化シートからカットした。ディスクをHPLCグレードヘキサン(Fisher Scientific Co.、Pittsburgh、PA)中で48時間抽出して、未反応種を除去した。
高周波(RF)プラズマ放電装置は、ベルジャー型反応室、試料台、蒸気入口、液体窒素コールドトラップを有する真空系、13.56MHzの固定周波数で稼働する最大出力500WのRF電力発生器(RF Plasma Products、Inc.、HFS 401 S型)、およびプラズマ放電のインピーダンスとPF電力発生器とを整合させる整合回路網から成っていた。シリコーンエラストマーディスクを反応室に入れ、次に、反応室を40ミリトルの真空にし、1000標準cm3/分で15秒間にわたってArガスで5回パージした。最後のArガスパージを点火してプラズマを形成して、シリコーンディスクを50ミリトル、50ワット電力で15分間にわたって清浄にし活性化した。ニードル弁を使用して超純粋水蒸気を反応室にゆっくり添加して、プラズマ中のArガスと交換した(50ミリトル、50ワット電力で15分間)。プラズマ処理に続いて、ディスクを100%エタノールで15分間濯ぎ、次に、95%エタノール中の3−アミノプロピルトリエトキシシラン(AMEO;Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)の2%(v/v)溶液と45分間反応させ、次に、100%エタノールで濯いだ。ディスクを周囲条件下で16〜24時間硬化させた。
水中捕捉空気接触角度測定およびX線光電子分光分析法(XPS)を使用して、プラズマ処理ディスクの表面を特性決定した。接触角測定は、超純水中でRame’−Hart A−100角度計を使用して行った。ほぼ同じ大きさの3つの気泡を、ベントミクロシリンジを使用して、シリコーン表面に下から導入した。それぞれの接触角を、気泡と改質シリコーンディスクとの角度として、直ぐに測定した。同じプラズマ処理をした7つのディスクについて合計21の測定を行い、その測定値から平均接触角を求めた。非改質、プラスマ処理、およびプラズマ処理−AMEO被覆シリコーンエラストマーの、表面元素化学の変化を、XPSを使用して測定した。Kratos Analytical XSAM 800およびDS800データ取得システムを使用して、各試料についての低解像検査スキャンおよび高解像元素スキャンを行った。Kratosは、15kVおよび9mA電流を使用して1253.6eVのパスエネルギーにおいて稼働するMg Kα X線源を備えていた。試料表面に対して90°のテークオフ(take−off)角でスペクトルを得た。相対原子濃度を与える元素分析を、炭素(C1s)、酸素(O1s)、珪素(Si2p)、および窒素(N1s)ピークの相対ピーク領域から行った。炭素ピークを使用して、高解像スキャンのピークを校正した。
大麦苗からの蓚酸塩分解酵素、蓚酸塩オキシダーゼ(OXO)(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)を使用した。0.01M燐酸緩衝溶液(PBS)、pH7.4において、2.5%(v/v)グルタルアルデヒド(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)を使用して、酵素を活性シリコーンエラストマーディスクに共有結合的に結合させた。プラズマ処理ディスクを、24穴組織培養皿の分離穴に入れた。ロッカーベッド上で、軽微な撹拌下に、ディスクをPBSで2回洗浄した(各5分)。2.5%グルタルアルデヒド溶液を穴中の各ディスクに添加し、軽微な撹拌下に培養皿を室温で1時間インキュベーションした。次に、ディスクを、PBSで3回洗浄し(各5分)、続いて45mMコハク酸ナトリウム緩衝液でpH4.0において2回(各5分)洗浄した。次に、ディスクを清浄な組織培養皿に移した。45mMコハク酸ナトリウム緩衝液、pH4.0において調製した100μg/mL蓚酸塩オキシダーゼ溶液1mLを、各ディスクに添加した。ディスクを含有しない穴に同量の酵素を添加し、これは酵素活性分析における対照反応であった。組織培養皿を、ローカーベッドで4℃で48時間にわたって20rpmでインキュベーションした。インキュベーション後、酵素溶液を吸引し、ディスクをコハク酸ナトリウム溶液で洗浄した(5分)。結合タンパク質および酵素活性の推定のために、ディスクを試験した。
OXO活性アッセイを、RequenaおよびBornemannの方法によって行った(Requena、L.ら、1999.Biochem J 343:185−190)。アッセイは、OXOによる蓚酸塩の分解の間に生成されるH2O2の比色定量測定に基づく。清浄な24穴組織培養皿の各穴において、固定酵素および遊離培養酵素10μgを有するディスクを、コハク酸ナトリウム緩衝液、pH4.0中の40mM蓚酸カリウム1mLを使用して、37℃(30分間)、100rpmでインキュベーションした。試料を取り出し、煮沸して酵素的反応を停止し、室温に冷ました。0.5mLの10mM ABTS(2−2’−アジノビス−3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)および10μLの2400U/mlホースラディッシュペルオキシダーゼ(両方とも45mMコハク酸ナトリウム緩衝液、pH4中)を含有する1mLの使い捨てキュベットに、前記反応混合物0.5mLを添加した。キュベットに蓋をし、室温で15分間インキュベーションした。Shimadzu UV160分光光度計を使用して、緩衝蓚酸カルシウム、ABTSおよびホースラディッシュペルオキシダーゼのブランクに対して、吸光度を650nmで測定した。モル吸光係数10、000M−1cm−1を使用して、蓚酸塩オキシダーゼの活性を算出した。活性1単位は、1分間に蓚酸塩1μmolを分解するのに必要な酵素の量として定義した。
蓚酸カルシウム外被形成を防止するOXO被覆シリコーンエラストマーの能力を、連続流外被形成モデル、改変ロビンズ装置(MRD)を使用して、擬似尿環境において評価した。装置は、各末端にチューブコネクターを有する1.0×1.5cmチャンネルを囲む23cmアクリルブロックから成る。前もって開けた直径1cmの10個の穴を有する厚さ0.5cmのアクリルシートを、アクリルブロックにネジで固定し;漏れを防ぐために、ゴムガスケットを2つのアクリル部分の間に配置する。深さ2mmの窪みをそれぞれ有し、1cmの穴に挿入されたプラグにディスクを配置し、挿入したディスクがアクリル上部部分と同じ高さに維持されるようにし、層流を装置内に維持する。成分を表Iに示す人工尿(AU)を、0.8ml/分の速度で改変ロビンス装置によって注入した。1つは蓚酸ナトリウムを含有し、もう1つは塩化カルシウムを含有する2つのAU溶液を調製して、蓚酸カルシウム結晶化を防止した。人工尿をMRDに注入すると共に、2つの溶液を混合して、pH6.0およびEQUIL(Werness、P.G.ら、1985、J.Urol 134:1242−1244)によって算出される最終相対過飽和8を有する混合溶液を得た。
ディスクを脱イオン水で濯ぎ、1mlの0.05M HClを使用して4℃で一晩(15〜20時間)処理して、外被形成物質を溶解した。Sigma Diagnostics(登録商標)Kit(登録商標)for Oxalate(Sigma Chemical Co.、St.Louis、MO)を使用して、溶解蓚酸塩を含有するそのHCl溶液を蓚酸塩濃度について検査した。蓚酸塩濃度を使用して、ディスク表面における外被形成の程度を定量化した。走査電子顕微鏡検査法(SEM)およびエネルギー分散性X線分光分析法(EDS)を使用して、ディスク外被の構造分析および元素分析も行った。シリコーンエラストマー試料を、5/8インチのアルミニウムスタブに1本の導電性テープで取り付けた。標準条件を使用して、試料およびスタブを金/パラジウムで被覆した。15kV加速電圧、口径設定2〜3、および集光レンズ電流範囲9〜10nAで稼働するJEOL 6400顕微鏡を使用して、試料を分析した。デジタル画像取得は、Link ISISTMソフトウエアパッケージを有する付随Oxford微量分析ハードウエアを使用して行った。EDSは、JEOL 6400 SEMに関連した同じハードウエアおよびソフトウエアを使用して、表面外被の組成分析を行った。
本発明に使用される蓚酸塩分解酵素は、基質を、タンパク質を含有する溶液に、37℃で数時間にわたって緩やかに撹拌しながら浸漬することによって、SR表面に吸着させることができる。SRへのタンパク質吸着は、可能であるが、この方法によって高濃度のタンパク質を得ることは期待できない。Ruggieriら(81)は、イオン界面活性剤、トリドデシル−メチル−アンモニウムクロライド(TDMAC)を使用して、ヘパリンを疎水性カテーテル表面(ラテックス、PVCおよびPTFE)に結合させている。この方法は、カテーテル表面への細菌の付着を減少させることに成功しているが、ヘパリンは、約1週間後に浸出することがわかった。これらの簡単な酵素固定法に固有のこれらの問題の故に、他の、より恒久的な酵素固定法を使用しうる。代替的方法は下記の方法を包含する:
1) SRを、プラズマ室で活性化し、超純水アンモニアガスで処理することができる。次に、グルタルアルデヒドまたはトリス(ヒドロキシメチル)ホスフィン(THP)のようなカップリング剤を含有する溶液に、活性SRを浸漬することができる。THPは、アミン官能性に極めて有効なカップリング剤であり、グルタルアルデヒドより加水分解を受けにくいことが示されている(Oswald、P.R.ら、1998、Enzyme and Microbial Technology、23:14−19)。最後に、改質シリコーンを、酵素を含有する溶液に浸漬して、そのアミン塩基性残基を介してそれをカップリング剤に共有結合的に結合させることができる(アミノ酸分析は、蓚酸塩分解酵素が、多くのそのようなアミン残基を含有することを示す)。リシン、アルギニンおよびヒスチジンのようなアミン含有側鎖を一般に、タンパク質の表面に暴露し、通常、たやすく誘導することができる。
シリコーンエラストマー表面を、Arガス下、次に水蒸気下に、RFプラズマで改質した。接触角およびXPS分析によって測定したところ、Arプラズマは、表面親水性および相対酸素含有量をかなり増加させた。水蒸気プラズマは、Arプラズマ処理と比較して、表面親水性および酸素含有量をさらに増加させた。プラスマ処理シリコーンエラストマーへのAMEO被覆物の適用は、表面親水性の相対的減少を生じた。XPSによって測定したAMEO被覆表面の増加した窒素含有量は、表面アミノ化を示していた。
表IVは、MRDで6日間インキュベーションしたシリコーンエラストマーディスクの、外被形成の程度を表す再溶解化蓚酸塩の量を示す。MRDで2日間のインキュベーション後に、対照またはOXO被覆ディスクのいずれにおいても、極めて少ない外被沈着であった。たった4日後で、OXO被覆シリコーンエラストマーディスクは外被の付着を有意に阻害し、6日目でより顕著な作用を示した。
Claims (22)
- 蓚酸塩含有流体の蓚酸塩濃度を減少させる方法であって、前記方法は表面に固定した少なくとも1つの蓚酸塩分解酵素に流体を接触させることを含んでなる方法。
- 流体が生物学的流体である請求項1に記載の方法。
- 生物学的流体が、血液および尿から成る群から選択される請求項2に記載の方法。
- 蓚酸塩分解酵素を、内在型医療装置の表面に固定する請求項1に記載の方法。
- 蓚酸塩分解酵素を、カテーテル、ステントまたは透析膜の表面に固定する請求項4に記載の方法。
- 蓚酸塩濃度を、発酵過程の流体において減少させる請求項1に記載の方法。
- 蓚酸塩濃度の減少が、スケールの発生を減少させる請求項6に記載の方法。
- 酵素を固定する表面が高分子材料である請求項1に記載の方法。
- 酵素を固定する表面がシリコーンエラストマーである請求項1に記載の方法。
- リンカーを介して、蓚酸塩分解酵素を表面に結合させる請求項1に記載の方法。
- 表面が抗菌性化合物をさらに含んでなる請求項1に記載の方法。
- 前記酵素が、蓚酸塩オキシダーゼ、蓚酸塩デカルボキシラーゼ、オキサリル−CoAデカルボキシラーゼおよびホルミル−CoAトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項1に記載の方法。
- 多数の蓚酸塩分解酵素を表面に固定する請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物の生体内で行われる請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである請求項14に記載の方法。
- 少なくとも1つの蓚酸塩分解酵素を結合させる表面であって、前記表面が透析膜、内在型医療装置、または発酵システムにおける表面。
- 前記内在型医療装置が、ステントおよびカテーテルからなる群から選択される請求項16に記載の表面。
- 高分子材料である請求項16に記載の表面。
- シリコーンエラストマーである請求項18に記載の表面。
- リンカーを介して、蓚酸塩分解酵素を表面に結合させる請求項16に記載の表面。
- 抗菌性化合物をさらに含んで成る請求項16に記載の表面。
- 前記酵素が、蓚酸塩オキシダーゼ、蓚酸塩デカルボキシラーゼ、オキサリル−CoAデカルボキシラーゼおよびホルミル−CoAトランスフェラーゼからなる群から選択される請求項16に記載の表面。
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