JP2005535317A - Ｇｒｋ６調節活性について化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）６を変更することによって疾患を治療する方法に関する。これは、例えば、タンパク質の発現または活性を変更することによって行なわれてもよい。本発明は、ＧＲＫ６の発現または活性を検出することによって、疾患診断のために用いることができる。本発明は、ＧＲＫ６欠失マウス、ＧＲＫ６スプライス変異体および使用方法に関する。本発明はまた、ＧＲＫ６活性を変更する化合物を同定する方法に関する。本発明は、ＧＲＫ６の発現または活性を変更することによる疾患治療に関する。

Description

本出願は、その内容が参照することにより全体として本明細書に組み込まれる、２００２年７月３日に提出された米国特許出願第６０／３９３，７８９号に対する優先権を主張する。
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（アメリカ国立衛生研究所）助成金ＤＡ−０６０２３、ＮＳ−１９５７６、ＭＨ−４０１５９およびＨＬ−１６０３７によって支援され、従ってアメリカ政府は本発明に対して一定の権利を有し得る。
本発明は、ＧＲＫ６を調整する化合物を同定すること、および疾患を治療することにおけるＧＰＫ６の使用の分野にある。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ホルモンまたはリガンドの結合を細胞内シグナルへ変換する細胞表面タンパク質である。ＧＰＣＲは、全ての動物、昆虫および植物において見出される。ＧＰＣＲシグナル伝達は、光伝達、嗅覚、神経伝達、血管緊張、心拍出量、消化、疼痛、ならびに体液および電解質の平衡を含む種々の生理学的機能において中心的な役割を果たす。それらは、多くの生理学的機能に関与するが、ＧＰＣＲは、多数の共通の構造的特徴を共有する。それらは、交互に位置する細胞内および細胞外のループ、ならびに種々の長さの細胞内カルボキシ末端テールによって架橋された７つの膜ドメインを含有する。
ＧＰＣＲは、以下が挙げられるが、それらに限定されない、多数の疾患状態に関与している。心臓の兆候、例えば、狭心症、本態性抗血圧、心筋梗塞、上室性不整脈および心室性不整脈、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、腎不全、糖尿病、呼吸器の兆候、例えば、喘息、慢性気管支炎、気管支痙攣、肺気腫、気道閉塞、上気道兆候、例えば、鼻炎、季節性アレルギー、炎症性疾患、傷害応答性の炎症、間接リウマチ、慢性炎症性腸疾患、緑内障、高ガストリン血症、胃腸の兆候、例えば、酸性／消化性障害、びらん性食道炎、胃腸管分泌過多、肥満細胞症、胃小腸反射、消化性潰瘍、ゾリンジャー・エリソン症候群、疼痛、肥満症、神経性過食症、抑うつ、強迫性障害、内臓奇形（例えば、心臓奇形）、神経変性疾患、例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー疾患、多発性硬化症、エプスタイン・バー感染、ならびに癌。
ＧＰＣＲによって制御される生理学的応答の大きさは、ＧＰＣＲシグナル伝達とシグナル終結との間のバランスに関連する。ＧＰＣＲのシグナル伝達は、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）およびアレスチンと呼ばれる細胞内タンパク質の２つのファミリーによって制御される。アレスチンは、アゴニストにより活性化されているＧＰＣＲ、および特にＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化されているＧＰＣＲを含む、活性化されたＧＰＣＲに結合する。複数のＧＰＫ酵素が脳領域で見出されるが、任意の所与の神経伝達物質レセプターの機能に対する各々のＧＲＫの相対的な生理学的重要性は不明であって、薬物乱用または常用の感受性におけるＧＲＫの明確な役割は実証されていない。
本発明の目的および利点は、以下の詳細な説明を添付の図面と組み合わせて読み取ることによって理解される。
本発明者らは、ＧＰＣＲの脱感作におけるＧＲＫ６の役割を決定して、ＧＲＫ６遺伝子を機能的に破壊しているトランスジェニックマウスを構築した。本発明者らは、ＧＲＫ６がＧＰＣＲの脱感作を調節するための標的であることを確認して、ＧＲＫ６をターゲッティングし、かつＧＰＣＲ脱感作を変更する化合物の同定のための方法を設計した。本発明者らは、疾患の処置のための化合物を評価する方法を記載しており、そして疾患の治療のためのこのような化合物の使用を記載する。
本発明によれば、当分野内において従来の分子生物学、微生物学、免疫学および組み換えＤＮＡ技術を使用してもよい。このような技術は文献中に詳細に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）］；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，編（１９９４））］；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，編（１９９４）］；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ「（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ「［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」［Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（２０００）］；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ「（１９８４）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．１，Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）を参照のこと。
他に言及しない限り、本明細書および特許請求の範囲で用いる以下の用語は、以下に示される意味を有する。
「レプリコン」とは、インビボにおいてＤＮＡ複製の自律性単位として機能する、すなわち、その自己の制御下で複製できる任意の遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）である。
「ベクター」とは、別のＤＮＡセグメントが結合し得、それによってこの結合したセグメントの複製をもたらす、プラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。
「ＤＮＡ分子」とは、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態であって、一本鎖型または二本鎖らせんのいずれかであるポリマー形態をいう。この用語は、この分子の一次構造および二次構造についてのみ言及し、いずれの特定の三次構造にも限定しない。従って、この用語は、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）で見出される二本鎖ＤＮＡ、ウイルス、プラスミドおよび染色体を包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の考察において、ＤＮＡの未転写の鎖にそって５’から３’方向の配列（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有する鎖）のみを示すという通常の慣習に従って、配列は、本明細書において記載され得る。
「複製起点」とは、ＤＮＡ合成の開始に関与するＤＮＡ配列をいう。
ＤＮＡ「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、インビボで転写されてポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、原核生物の配列、真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、さらに合成ＤＮＡ配列を挙げることができるがこれらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列は通常、コード配列に対して３’側に位置する。
転写および翻訳の制御配列とは、宿主細胞においてコード配列の発現をもたらす、ＤＮＡ調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどである。
「プロモーター配列」とは、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、その３’末端に転写開始部位が隣接しており、そして上流（５’方向）に延びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく規定される）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物プロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターは、−１０および−３５のコンセンサス配列に加えて、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含む。
「発現コントロール配列」とは、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御しかつ調節するＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡ（これは次にコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される）に転写するとき、細胞中の転写および翻訳の制御配列の「制御下」である。
「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれてもよい。この配列は、シグナルペプチドをコードし、これは、ポリペプチドに対してＮ末端で、宿主細胞に対して連絡して、細胞表面に対してポリペプチドを指向するか、または培地中にポリペプチドを分泌する。そしてこのシグナルペプチドは、タンパク質が細胞から離れる前に宿主細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物により作られる種々のタンパク質と関連して見出され得る。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明のプローブに関して本明細書において用いる場合、２つ以上のリボヌクレオチド、好ましくは３つより多いリボヌクレオチドから構成される分子として規定される。その正確なサイズは、多くの要因に依存し、これは次にそのオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する。
「プライマー」という用語は本明細書において用いる場合、精製された制限消化物として天然に生じるかまたは合成的に生成されるかにかかわらず、オリゴヌクレオチドであって、ある核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドおよび誘導因子、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下に、かつ適切な温度およびｐＨに置かれるとき、合成の開始点として機能し得るオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、この誘導因子の存在下で所望の伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。このプライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および使用方法を含む多くの要因に依存する。例えば、診断適用のためには、標的配列の複雑性に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは代表的には、１５〜２５以上のヌクレオチドを含むが、それより少ないヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書におけるプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に対して「実質的に」相補的であるように選択される。このことは、このプライマーがそれらの各々の鎖とハイブリダイズするために実質的に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列はテンプレートの正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントは、プライマー配列の残りがこの鎖に対して相補的であれば、このプライマーの５’末端に連結され得る。あるいは、このプライマー配列がその鎖の配列とハイブリダイズするのに十分な相補性を有し、それによって伸長産物の合成のためのテンプレートを形成する条件であれば、このプライマーには、非相補的な塩基またはさらに長い配列が分散されてもよい。
本明細書において用いる場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、細菌の酵素であって、その各々が特定のヌクレオチド配列またはその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する酵素をいう。
細胞は、このようなＤＮＡが細胞の内側に導入される場合、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ中に取り込まれ（共有結合され）てもよいし、取り込まれなくてもよい。例えば、原核生物、酵母および哺乳動物の細胞では、形質転換ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソームエレメント上に維持され得る。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体に組み込まれており、その結果、染色体の複製を通じてこのＤＮＡが娘細胞によって遺伝される細胞である。安定性は、原核生物細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンを樹立する能力として示される。「クローン」は、有糸分裂による、単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」とは、多くの継代にインビトロで安定に増殖できる初代細胞のクローンである。
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドのうち少なくとも約６５％（好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）がＤＮＡ配列の規定の長さにわたってマッチする場合、「実質的に相同」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的ソフトウェアを用いて配列を比較することによって、またはサザンハイブリダイゼーション実験下で、例えば、その特定のシステムのために規定されたストリンジェントな条件下で規定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは当分野の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻およびＩＩ巻，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
配列番号７、９、１１、１３、１５または１７と同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列であって、配列番号７、９、１１、１３、１５または１７に縮重されるＤＮＡ配列も本発明の範囲内であることが理解されるべきである。「縮重する」とは、特定のアミノ酸を特定するのに異なる３文字コドンが用いられることを意味する。
「アレスチン」とは、アレスチンの全てのタイプの天然に存在する変異体および操作された変異体を意味し、これには、可視的なアレスチン（時に、アレスチン１と呼ばれる）、錘状（ｃｏｎｅ）アレスチン（時に、アレスチン−４と呼ばれる）、βアレスチン１（時にアレスチン２と呼ばれる）、およびβアレスチン２（時にアレスチン３と呼ばれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
「βＡＲＫ１」は、βアドレナリン受容体キナーゼ１と称されるＧＲＫであって、ＧＲＫ２とも呼ばれる。
「βＡＲ」は、βアドレナリン受容体と呼ばれるＧＰＣＲである。
ＧＰＣＲの「内在化」とは、ＧＰＣＲの細胞表面膜から細胞内小胞膜への移行であって、これによってＧＰＣＲは、細胞の外側に残る物質に接近できなくなり得る。
「カルボキシル末端テール」とは、膜スパン７つ後のＧＰＣＲのカルボキシル末端テールを意味する。多くのＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは、７つの膜貫通ドメインの終わりをマークする保存されたＮＰＸＸＹモチーフの直後にはじまる（すなわち、ＮＰＸＸＹモチーフに続くのがＧＰＣＲのカルボキシル末端テールである）。カルボキシル末端テールは比較的長く（約１０個から数百個のアミノ酸）てもよいし、比較的短く（約１０個のアミノ酸）てもよいし、または事実上存在しなくても（約１０個未満のアミノ酸）よい。本明細書において用いる場合、「カルボキシル末端テール」とは３つ全ての変異体（比較的長いか、比較的短いか、または実質的に存在しない）を意味しており、（単数または複数の）パルミトイル化システイン残基を含んでも含まなくてもよい。
「クラスＡレセプター」は好ましくは、ＨＥＫ−２９３細胞において、アレスチンタンパク質と一緒になって、アレスチン−ＧＦＰと会合して細胞内小胞またはエンドソームへ転位しない。
「クラスＢレセプター」は好ましくは、ＨＥＫ−２９３細胞において、アレスチンタンパク質と一緒になって、アレスチン−ＧＦＰと会合して細胞内小胞またはエンドソームへ転位する。
「ＤＡＣ」とは、任意の脱感作活性化合物を意味する。脱感作活性化合物とは、ＧＰＣＲ脱感作機構に対して、そのプロセスを刺激または阻害することによって影響する任意の化合物である。ＤＡＣは、このプロセスの任意の細胞成分、およびこのプロセスに関与する任意の細胞構造に対して作用することによってＧＰＣＲ脱感作経路に影響し得、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ホスホイノシチド３−キナーゼ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、タンパク質ホスファターゼ、などが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＣとしては、ＧＰＣＲへのアレスチンの転位を阻害する化合物、ＧＰＣＲに対するアレスチンの結合を阻害する化合物、ＧＰＣＲに対するアレスチンの転位を刺激する化合物、ＧＰＣＲに対するアレスチンの結合を刺激する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を阻害する化合物、ＧＰＣＲのＧＲＫリン酸化を刺激する化合物、ＧＰＣＲに対するＧＲＫ結合を刺激または阻害する化合物、ＧＰＣＲのタンパク質ホスファターゼ脱リン酸化を阻害する化合物、ＧＰＣＲのタンパク質ホスファターゼ脱リン酸化を刺激する化合物、細胞表面に対するＧＰＣＲ内在化または再循環を妨げる化合物、ＧＰＣＲからのアレスチンの遊離を調節する化合物、ＧＰＣＲのアンタゴニスト、インバースアゴニストなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＡＣは、ＧＰＣＲ脱感作プロセスを阻害または刺激し得、そしてＧＰＣＲの伝統的なアゴニストおよびアンタゴニストと同じＧＰＣＲのリガンド結合部位には結合し得ない。ＤＡＣは、ＧＰＣＲとは独立して機能し得、すなわち、それらは、１つの特定のＧＰＣＲまたは１つの特定のタイプのＧＰＣＲについて高い特異性を有することはない。ＤＡＣは、アゴニストまたはアンタゴニストと同じ（単数または複数の）部位に結合し得るが、レセプターを脱感作することはない（おそらく、適切にリン酸化されるか、またはアレスチンもしくは任意の他のタンパク質に結合するようにレセプターを変更しないことによる）。ＤＡＣは、レセプターのアロステリック部位に結合して脱感作を阻害または増強し得る。
「検出可能な分子」とは、蛍光、リン光、および生体発光および放射性崩壊を含むがこれらに限定されない、分光学的な手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、放射性手段および光学的な手段によって検出可能である任意の分子を意味する。検出可能な分子としては、限定はしないが、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ローダミンコンジュゲート抗体などが挙げられる。検出可能な分子としては、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基、化学発光基などが挙げられる。検出可能な分子としては、（単数または複数の）他の分子との相互作用の関数として直接または間接的に検出可能な分子が挙げられる。
「ＧＦＰ」とは、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を意味し、これは、天然の供給源から単離され得る種々の天然に存在する形態のＧＦＰ、または遺伝子操作されたＧＦＰ、ならびに人為的に改変されたＧＦＰをいう。ＧＦＰは当分野では周知である。例えば、米国特許第５，６２５，０４８号；同第５，７７７，０７９号および同第６，０６６，４７６号を参照のこと。ＧＦＰが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質、ルシフェリン、ＵＶ励起性蛍光タンパク質または間の任意の波長を含むがこれらに限定されない、天然の供給源から単離されるかまたは遺伝子操作された他の蛍光タンパク質と容易に互換可能であることが当分野では十分理解される。本明細書において用いる場合、「ＧＦＰ」は、当分野で公知の全ての蛍光タンパク質を意味する。
「未知またはオーファンのレセプター」とは、その機能および／またはリガンドが未知であるＧＰＣＲを意味する。
「下流」とは、アミノ末端に対してアミノ酸配列のカルボキシル末端へ向かうことを意味する。
「上流」とは、カルボキシル末端に対してアミノ酸配列のアミノ末端へ向かうことを意味する。
アミノ酸置換はまた、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するためにも導入することができる。例えば、別のＣｙｓとのジスルフィド結合の形成を可能にするために見込みのある部位にＣｙｓを導入してもよい。Ｈｉｓは、特に「触媒性」の残基として導入され得る（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として機能し得、そして生化学的な触媒において最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質構造においてβターンを誘導するというその特に平坦な構造のおかげで導入されてもよい。
２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）が同一であるか、または保存的な置換基に相当する場合、「実質的に相同である」。
ＤＮＡ構築物の「異種」領域とは、それより大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントであって、この大きい分子と関連しては天然には見出されないセグメントである。従って、この異種領域が哺乳動物の遺伝子をコードする場合、この遺伝子は一般に、供給源の生物体のゲノムにおいては哺乳動物のゲノムＤＮＡに隣接しないＤＮＡに隣接する。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、ゲノムコード配列がネイティブな遺伝子とは異なるコドンを有するイントロンまたは合成配列を含むｃＤＮＡ）。対立遺伝子改変または天然に存在する変異性事象は、本明細書に規定されるようにＤＮＡの異種領域では生じない。
「免疫グロブリン」は、免疫原性活性を有する抗体および抗体フラグメントを包含する。好ましい免疫原性活性では、免疫グロブリンは改変されたＧＰＣＲに結合する。さらに好ましい免疫グロブリンは、改変されたＧＰＣＲと野生型ＧＰＣＲとの間で識別され得る免疫グロブリンである。「抗体」という用語は、抗体全体および特定のエピトープを認識するか結合するそのフラグメントを含む、免疫グロブリンをいう。抗体という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびキメラ抗体を包含する。このキメラ抗体は、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号にさらに詳細に記載される。「エピトープ」という用語は、抗体または他の免疫系の成分によって認識されるかまたは認識可能である抗原または免疫原の１つ以上の部分を同定するために用いられる。
例示的な免疫グロブリンは、インタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、およびパラトープを含む免疫グロブリン分子の一部である。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（Ｖ）およびｓｃＦｖのような当分野で公知の部分であって、本明細書に記載される治療方法における使用のために好ましい部分を含む。
抗体フラグメントのＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2部分は、周知の方法によって、実質的にインタクトな抗体上で、それぞれパパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，３４２，５６６号を参照のこと。Ｆａｂ’抗体部分はまた周知であって、Ｆ（ａｂ’）2部分から生成されて、その後にメルカプトエタノールのように２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合の還元、その後にヨードアセトアミドのような試薬を用いたアルキル化を行なう。インタクトな抗体部分を含む抗体が本明細書においては好ましい。
「抗体結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変領域および超可変領域からなる抗体の構造部分である。
「モノクローナル抗体」という用語は、種々の文法的形態で、抗原上のある特定のエピトープと免疫反応し得る抗体結合部位を１種類しか有さない抗体をいう。従ってモノクローナル抗体は、異なる抗原について各々免疫特異性である、複数の抗体結合部位を含んでもよい（例えば、二価特異的（キメラ）モノクローナル抗体）。
「薬学的に許容可能な」という句は、ヒトに投与された場合、生理学的に耐容性であって、かつアレルギー反応も類似の望ましくない反応、例えば、異常亢進、眩暈なども代表的には生じない、分子実体および組成物をいう。
「治療上有効な量」という句は、例えば、血圧上昇、呼吸出力などのような病理状態のいくつかの特徴を妨げ、かつ好ましくは軽減するのに十分な量を意味するように本明細書で用いられる。
ＤＮＡ配列は、そのＤＮＡ配列の転写および翻訳を発現制御配列が制御しかつ調節する場合、発現コントロール配列に「作動可能に連結されて」いる。「作動可能に連結される」という用語は、発現されるべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、ならびに発現制御配列の制御の下でのＤＮＡ配列の発現およびこのＤＮＡ配列によってコードされる所望の産物の生成を可能にさせる正しいリーディングフレームを維持することを包含する。組み換えＤＮＡ分子に挿入されることが望ましい遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合、このような開始シグナルをこの遺伝子の前に挿入してもよい。
「ハイブリダイゼーション」とは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基の間の水素結合を意味し、これは、ワトソンクリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合、または逆フーグスティーン型水素結合であってもよい。例えば、アデニン（Ａ）およびチミン（Ｔ）は相補的な核酸塩基であって、水素結合の形成によって対になる。
「標準的なハイブリダイゼーション条件」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に等しい塩および温度の条件をいう。しかし、当業者は、このような「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、緩衝液中のナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、ミスマッチのパーセント、ホルムアミドのパーセントなどを含む特定の条件に依存することを理解する。また、「標準的なハイブリダイゼーション条件」の決定において重要なのは、ハイブリダイズする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡか、ＤＮＡ−ＤＮＡか、ＲＮＡ−ＤＮＡかということである。このような標準的なハイブリダイゼーション条件は、周知の式に従って当業者によって容易に決定されるが、ここではハイブリダイゼーションは、必要に応じて、さらに高いストリンジェンシーの洗浄で予測または決定されたＴｍを代表的には１０〜２０℃下回る。
「動物」とは、脊椎動物（例えば、カエル、サンショウウオ、ニワトリまたはウマ）および非脊椎動物（例えば、ぜん虫など）を含む任意の多数の動物を意味する。「動物」はまた、「哺乳動物」を含むことを意味する。好ましい哺乳動物としては、家畜（例えば、ウシ、バッファロー、ウマ、ヒツジ、ブタおよびヤギなどの有蹄動物）、ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ハムスター、ラットおよびモルモット）、イヌ、ネコ、霊長類、オオカミ、ラクダ科、シカ科、げっ歯類、鳥類、魚類が挙げられる。
「（単数または複数の）アンタゴニスト」とは、アゴニストに対する野生型および／または改変されたＧＰＣＲの結合、野生型および／または改変されたＧＰＣＲの脱感作、野生型および／または改変されたＧＰＣＲ結合アレスチン、野生型および／または改変されたＧＰＣＲのエンドソーム局在化、内在化などに干渉する全ての因子を包含し、これには野生型および／または改変されたＧＰＣＲに影響する因子、ならびに野生型および／または改変されたＧＰＣＲシグナル伝達、脱感作、エンドソーム局在化、再感作などに関与する他のタンパク質に影響する因子が挙げられる。
「ＧＰＣＲ」とは、Ｇタンパク質共役受容体を意味しており、これには天然に存在するＧＰＣＲ、および改変されているＧＰＣＲが挙げられる。このような改変されたＧＰＣＲは、米国特許出願第０９／９９３，８４４号および米国特許出願第１０／０５４，６１６号に記載される。
「異常なＧＰＣＲ脱感作」および「異常な脱感作」とは、ＧＰＣＲ脱感作経路が破壊されて、その結果、活性なレセプターと脱感作されたレセプターとの間のバランスが野生型の状態に対して変更されるということを意味する。正常よりも活性なレセプターが存在するか、または野生型状態よりも脱感作されたレセプターが存在する。異常なＧＰＣＲ脱感作は、構成的に活性であるかまたは構成的に脱感作されるＧＰＣＲの結果であるかもしれず、これによって、そのレセプターのシグナル伝達において正常を上回る増大、またはそのレセプターのシグナル伝達における正常を下回る減少がもたらされる。
「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織、細胞および生物学的液体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞および液体を含むことを意図する。ここでこのようなサンプルは、血液、血清、尿素サンプル、糞便サンプル、腫瘍サンプル、細胞洗浄、経口サンプル、喀痰、生物学的液体、組織抽出物、新鮮に回収された細胞、または組織培養中でインキュベートされた細胞であってもよい。
「同時投与（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「併用投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」、「同時投与（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、または「同時に投与した（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」とは、この化合物が同時の時点で、またはそれに十分に近い時点で投与され、その観察される結果が本質的に、この２つ以上の化合物が同時の時点で投与される場合と同じであるということを意味する。
「保存された異常性」とは、ＧＰＣＲ経路における異常性を意味しており、これには、異常なＧＰＣＲシグナル伝達を生じ得るＧＰＣＲ、ＧＲＫ、アレスチン、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、タンパク質ホスファターゼなどにおける異常性が挙げられるがこれらに限定されない。この異常なＧＰＣＲシグナル伝達は、ＧＰＣＲ関連の疾患に寄与し得る。
「脱感作されたＧＰＣＲ」とは、アゴニストに対して応答して従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力を現在有さないＧＰＣＲを意味する。
「脱感作経路」とは、アレスチン、ＧＲＫ、ＧＰＣＲ、ＡＰ−２タンパク質、クラスリン、タンパク質ホスファターゼ、などが挙げられるがこれらに限定されない、脱感作プロセスの任意の細胞成分、ならびに脱感作プロセスおよび引き続くプロセスに関与する任意の細胞構造を意味する。本発明のアッセイの方法においては、ポリペプチドは、例えば、細胞質において、細胞膜において、クラスリン被覆ピットにおいて、細胞内小胞、エンドソーム、間の任意の段階などにおいて検出され得る。
「ＧＰＣＲシグナル伝達」とは、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ誘導性活性を意味する。これは、例えば、ｃＡＭＰの産生を生じ得る。
「Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ」（ＧＲＫ）は、ＧＰＣＲをリン酸化する能力を有する任意のキナーゼを包含する。
「ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＧＰＣＲ」とは、ホモ・サピエンスにおいて天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
「インバースアゴニスト」とは、ＧＰＣＲに対する結合の際に、ＧＰＣＲの基礎的な内因性活性を阻害する化合物を意味する。インバースアゴニストはアンタゴニストのタイプである。
「改変されたＧＲＫ」とは、脱感作を変更するように改変されたＧＲＫを意味する。
「天然に存在するＧＰＣＲ」とは、天然に存在するＧＰＣＲを意味する。
「臭気物質リガンド」とは、レセプターに対する結合の際、アゴニストおよびアンタゴニスト分子を含む、合成化合物および／または組み換え生成された化合物を含む臭気の知覚をもたらす、リガンド化合物を意味する。
「臭気物質レセプター」とは、活性化された場合（通常は臭気物質リガンドを結合することによって）臭気の知覚をもたらす、嗅覚ニューロンの表面において正常に見出されるレセプタータンパク質を意味する。
「薬学的に許容可能なキャリア」という用語は、本明細書において用いる場合、化学的な因子を担持するかまたは輸送することに関与する、薬学的に許容可能な物質、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化物質を意味する。
「霊長類化された抗体」とは、霊長類の可変配列または抗原結合部分、およびヒト定常ドメイン配列を含む組換え抗体を意味する。
「感作されたＧＰＣＲ」とは、アゴニストに応答して、従来のＧタンパク質シグナル伝達を活性化する能力を現在有するＧＰＣＲを意味する。
「ＧＲＫ６」としては、ＧＲＫ６スプライス変異体が挙げられ、これには、ヒト、霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、または他の動物のＧＲＫ６ａ、ＧＲＫ６ｂ、ＧＲＫ６ｃおよびＧＲＫ６ｄおよびＧＲＫ６が挙げられる。
「調節」とは、発現の少なくともアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーション、またはタンパク質の活性の増大もしくは減少を包含する。タンパク質の調節とは、タンパク質またはタンパク質を調節する化合物の活性のアップレギュレーション、ダウンレギュレーション、増大または減少が挙げられる。調節とはまた、目的のタンパク質の合成における、遺伝子、ｍＲＮＡまたは任意の他のステップの調節が挙げられる。
「ＧＲＫ６関連疾患」とは、ＧＲＫ６、特にＧＲＫ６発現または活性によって影響される疾患をいう。ＧＲＫ６関連疾患としてはまた、ＧＲＫ６、例えばドーパミンレセプターによってリン酸化されるかおよび／または調節され得る、ＧＰＣＲによって影響される疾患が挙げられる。このような疾患としては、パーキンソン病、統合失調症、抑うつ、トゥーレット症候群および薬物常用が挙げられる。
「ＧＲＫ６関連脱感作」とは、ＧＲＫ６が脱感作に影響するＧＰＣＲ脱感作をいう。ＧＲＫ６は、ＧＰＣＲを直接リン酸化するか、さもなければＧＰＣＲの脱感作に影響し得る。
「過剰発現された」タンパク質とは、野生型発現レベルよりも大きいレベルで発現されるタンパク質をいう。
［ＧＰＣＲおよび脱感作］
アゴニストに対するＧＰＣＲの曝露によって、その同族のヘテロ三量体Ｇタンパク質からのレセプターの脱共役に関与する、そのシグナル伝達能力の急速な低下が生じる。アゴニスト特異的脱感作または相同な脱感作を媒介する細胞機構は、２段階のプロセスであって、アゴニストに占有されたレセプターは、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）によってリン酸化され、次いでアレスチンタンパク質に結合する。
アゴニストがＧＰＣＲに結合した後、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）は、ＧＰＣＲの細胞内ドメインをリン酸化することが知られている。リン酸化後、アレスチンタンパク質は、ＧＲＫリン酸化レセプターと会合して、その同族のＧタンパク質からレセプターを非共役する。アレスチンとリン酸化ＧＰＣＲとの相互作用によって、ＧＰＣＲシグナル伝達が終わり、非シグナル伝達脱感作レセプターが生じる。
脱感作されたＧＰＣＲに対して結合したアレスチンは、ＧＰＣＲをエンドサイトーシスの機構の成分に連結させるアダプタータンパク質、例えば、アダプタータンパク質−２（ＡＰ−２）およびクラスリンとして機能することによって、ＧＰＣＲをクラスリン被覆ピットまたはエンドサイトーシス（すなわち、内在化）のための他の細胞機構に標的する。内在化されたＧＰＣＲは、脱リン酸化されて、脱感作された細胞表面に再循環して戻されるか、または細胞内で保持されて分解される。アレスチンとＧＰＣＲとの相互作用の安定性は、ＧＰＣＲ脱リン酸化、再循環および再感作の速度を決定付ける要因の１つである。脱感作プロセスにおけるＧＰＣＲリン酸化および脱リン酸化の関与は、その開示の全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、２００１年１１月５日提出の米国特許出願第０９／９３３，８４４号に例示されている。
３つの別個の群に分類された、ＧＲＫ１〜ＧＲＫ７と名付けられた、７個の別個のＧＲＫ遺伝子が知られている。ＧＲＫ６は、ＧＲＫ４およびＧＲＫ５をも含む、ＧＲＫのＧＲＫ４サブファミリーのメンバーである。複数のＧＲＫ酵素が脳領域で見出されているが、本発明以前には、いずれの所与の神経伝達物質に対しても各々のＧＲＫの相対的な生理学的重要性は未解明であった。
脳のドーパミン作用性の伝達は多くの生体機能、例えば、移動制御、情動および感情に決定的に関与しており、その機能不全は、嗜癖を含むいくつかの生理学的条件において中心的であると考えられる。ドーパミンに対する生理学的な応答は、特定の脳領域において発現される、Ｇタンパク質共役ドーパミンレセプター（Ｄ１〜Ｄ５を含む）のファミリーによって制御される。内因性および外因性のリガンドに対するドーパミンレセプターの感受性は、生理学および病理学においてドーパミン関連機能の重要な調節因子であることが知られている。ドーパミンシグナル伝達の過敏性は、嗜癖を含むいくつかの脳障害において記載されている。詳細には、嗜癖をもたらす、感作、細胞の可塑性の早期の生化学的および挙動の兆候は、ドーパミンレセプター応答性の長期の変化に関連すると考えられる。
ドーパミンレセプターは、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーの他のメンバーと同様に、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）のファミリーによる活性化依存性のリン酸化を介して調節される。いくつかのインビトロ研究はドーパミンレセプター調節におけるＧＲＫの役割に集中していたが、この調節の生理学的重要性およびドーパミンレセプター／ＧＲＫ相互作用のインビボ特異性に対して現在利用可能なデータはない。
本発明者らは、ＧＲＫ−６欠損マウスが、コカインおよびアンフェタミンを含む精神刺激薬の運動性刺激効果に対して過敏であり、コカインでの慢性処置に対してさらなる感作はほとんど示さないことを実証した。さらに、これらのマウスによって、ドーパミン枯渇動物における、Ｇタンパク質に対する線条体ドーパミンレセプターの結合の増強、およびドーパンミンアゴニストであるアポモルフィンに対する運動性応答の強化が実証された。これらの結果によって、シナプス後ドーパミンレセプターがＧＲＫ６の生理学的標的であることが示され、そしてこれらの調節機構が薬物乱用および他の病理的な状態、例えばパーキンソン病で観察される中枢性ドーパミン過敏に寄与することが示唆される。ＧＲＫ６の発現および活性を変更することは、ドーパミンレセプター過敏に関連する疾患、例えば、統合失調症、抑うつ、トゥーレット症候群およびパーキンソン病の処置において有用である。
この過敏は、ドーパミンレセプター脱感作の減少によって生じる、Ｇタンパク質に対するドーパミンレセプターの結合の増大に相関している。これらの結果によって、ＧＲＫ６によるドーパミンレセプター調節が線条体におけるドーパミンシグナル伝達の基礎的な緊張を設定するのに重要な役割を果たすこと、ならびにＧＲＫ６機能の低下が薬物感度に影響する素因の因子であり得ることが示される。
ＧＲＫ６のレベルまたは活性の低下は、パーキンソン病の動物モデルにおいてＤＡアゴニストの挙動的な効果を増強し得る。従って、これらのデータによって、薬理学的または遺伝子的なアプローチのいずれかによりＧＲＫ６の量または活性を調節することがパーキンソン病において、内因性のドーパミンまたは外因性のドーパミン模倣性薬剤、例えばＬ−ＤＯＰＡの有効性を向上するのに有用であることが実証される。
［ノックアウトされたマウスおよび動物］
疾患モデルとしての使用のため、および本明細書で同定される化合物を試験するため、改変されたＧＲＫ６トランスジェニックおよびノックアウトのマウスおよび動物を作成して利用する。疾患モデルとしての使用のため、本明細書で同定される化合物を試験するため、およびＧＲＫ６によってリン酸化されたＧＰＣＲを同定するため、本明細書に記載された脱感作経路の改変された成分を含むトランスジェニックおよびノックアウトのマウスおよび動物を作成して利用してもよい。例えば、この動物は、マウスであっても本明細書に記載されるような動物であってもよい。ノックアウト動物に関連する実施例は本明細書に記載されている。特定の非限定的な実施形態は特にノックアウトマウスに言及しているが、本明細書に記載されるような動物を包含することを意図している。
少なくとも１つの不活性な内因性ＧＲＫ６遺伝子を含むマウスの細胞。マウスは、不活性な内因性ＧＲＫ６遺伝子について完全なノックアウトであっても、もしくはホモ接合性であってもよく、またはこのマウスは不活性な内因性ＧＲＫ６遺伝子について部分的なノックアウトであってももしくはヘテロ接合性であってもよい。
ノックアウトマウスは、ある化合物が実際にＧＲＫ６調節因子であることの確証のために有用であり得る。例えば、本発明のノックアウトマウスは、ＧＲＫ６修飾因子を用いて処置されている野生型マウスとの比較のためのモデルとして用いることができる。この比較を行って、野生型マウスに投与された化合物がＧＲＫ６修飾因子であることを確証することができる。
ノックアウトマウスはまた、ある化合物が実際にＧＲＫ６活性化因子であるかまたはインヒビターであるかの確証のために有用であり得る。例えば、ＧＲＫ６活性化因子またはインヒビターを用いて処置されている部分的ノックアウトマウスは、野生型マウスおよび完全なノックアウトマウスとの比較のためのモデルとして用いることができる。この比較を行って、投与された化合物がＧＲＫ６活性化因子であるかまたはインヒビターであるかを確証することができる。
ＧＲＫ６ノックアウトマウスの作成は、本明細書に提供される開示の観点から、そして当業者に公知の技術に照らして、例えば、１９９９年１２月２２日提出の米国特許出願第０９／４６９，５５４号、Ｒｏｓｅｓ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，７６７，３３７号；Ｋｅｓｓｏｕｓ−Ｅｌｂａｚ ｅｔ ａｌ．の同第５，５６９，８２７号；およびＤｏｎｅｈｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．の同第５，５６９，８２４号（それらの開示は、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる）；およびＡ．Ｈａｒａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６９，４８８（１９９４）に記載のように行なうことができる。本発明を行なうためのマウスの例は以下に開示される。図１０に記載される配列は、トランスジェニック動物の破壊されたＧＲＫ６、およびこのトランスジェニック動物を作成するために用いた構築物を含む。
［ＧＲＫ６を調節する能力について化合物を試験する方法］
本発明はまた、ＧＲＫ６を調節する能力について化合物を試験する方法に関する。例えば、試験化合物は、野生型非ヒト動物に投与されてもよい。この化合物に曝された野生型非ヒト動物の運動性応答を、ＧＲＫ６遺伝子が破壊された非ヒトトランスジェニック動物の運動性応答と比較する。運動性応答の試験は、実施例に記載のとおり実施する。他の身体的応答および細胞性の応答は、実施例に記載のとおりモニターできる。
［ＧＲＫ６関連脱感作を調節する化合物についてのスクリーニングの方法］
本発明は、ＧＲＫ６関連脱感作を調節する化合物についてのスクリーニングの方法に関する。ＧＲＫ６およびＧＰＣＲを含む細胞が提供される。この細胞を、候補の修飾因子と接触させる。この細胞をＧＲＫ６関連脱感作についてモニターする。脱感作をモニタリングする方法は、本明細書、ならびにその全体が本明細書において参照することによって組み込まれる、２００１年１１月５日提出、米国特許出願第０９／９９３，８４４号、２００２年１月２２日提出、米国特許出願第１０／０５４，６１６号、および２００２年３月１９日提出、米国特許出願第１０／１０１，２３５号に記載される。ＧＲＫ６関連脱感作は、化合物の非存在下における細胞分布と比較した、この化合物の存在下におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を決定することによってモニターできる。この（単数または複数の）化合物の有無におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布の間の相違は、ＧＲＫ６活性の調節に相関し得る。
候補修飾因子は、純粋な化合物であってもよいし、または化合物の異種混合物であってもよい。この混合物は、ＧＲＫ６を調節する特定の化合物およびＧＲＫ６を調節しない他の化合物を含んでもよい。ＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布は決定され得る。
［化合物を同定する方法］
本発明は、ＧＲＫ６関連脱感作を調節する化合物を同定する方法に関する。分子の１つが検出可能に標識されてＧＲＫ６が過剰発現される、ＧＲＫ６、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供する。この細胞を候補修飾因子と接触させる。化合物の存在下におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を、化合物の非存在下での細胞分布と比較する。この（単数または複数の）化合物の有無におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布の間の相違は、ＧＲＫ６活性の調節に相関する。このような方法は、本明細書、ならびにその全体が本明細書において参照することにより組み込まれる、２００１年１１月５日提出、米国特許出願第０９／９９３，８４４号、２００２年１月２２日提出、米国特許出願第１０／０５４，６１６号、および２００２年３月１９日提出、米国特許出願第１０／１０１，２３５号に記載される。
ある実施形態では、ＧＲＫ６が過剰発現される。この標識分子は、細胞質ゾル、原形質膜、クラスリン被覆ピット、細胞内小胞またはエンドソームに局在してもよい。この検出可能な分子は、同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基、または化学発光基であってもよい。この分子は、検出可能に標識できる別の分子との相互作用に起因して検出可能に標識され得る。
本発明はさらに、細胞におけるドーパミンレセプターの脱感作を阻害する方法に関する。これらの方法は、この細胞と化合物とを接触させるステップを包含し得る。この化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または本明細書に記載されるような別の化合物であってもよい。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＧＲＫ６をコードする核酸、またはＧＲＫ６活性に影響する別の遺伝子の発現を阻害し得る。
［検出の方法］
検出可能に標識されたアレスチンの細胞内位置、検出可能に標識されたＧＰＣＲの細胞内位置、検出可能に標識されたＧＲＫの細胞内位置、またはこの検出可能に標識された分子とＧＰＣＲもしくは任意の他の細胞構造との相互作用（例えば、細胞膜におけるアレスチン、ＧＲＫもしくはＧＰＣＲの濃度、エンドソームにおけるＧＰＣＲとのアレスチンの同時局在、およびクラスリン被覆ピットにおけるアレスチンもしくはＧＰＣＲの濃度などを含む）を決定する方法は、用いられる検出可能な（単数または複数の）分子に依存して変化する。
当業者は、用いられる（単数または複数の）検出可能な分子に適切な検出方法を容易に考案することができる。光学的に検出可能な分子については、蛍光、生体発光またはリン光における変化が照射光の再分布または再配向に起因して測定できる、任意の光学的方法を用いてもよい。このような方法としては、例えば、偏光顕微鏡、ＢＲＥＴ、ＦＲＥＴ、エバネッセント波励起顕微鏡および標準的な共焦点顕微鏡が挙げられる。
ある実施形態では、アレスチンは、ＧＦＰにコンジュゲートしてもよく、そしてアレスチン−ＧＦＰコンジュゲート体は、共焦点顕微鏡によって検出され得る。別の好ましい実施形態では、アレスチンは、ＧＦＰにコンジュゲートされてもよく、そしてＧＰＣＲまたはＧＲＫは、免疫蛍光分子にコンジュゲートされてもよく、そしてこのコンジュゲート体は、共焦点顕微鏡によって検出されてもよい。さらなる好ましい実施形態では、アレスチンは、ＧＦＰにコンジュゲートされてもよく、そしてＧＰＣＲのカルボキシ末端は、ルシフェラーゼにコンジュゲートされてもよく、そしてこのコンジュゲート体は、生体発光共鳴放射技術（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出されてもよい。さらに好ましい実施形態では、アレスチンはルシフェラーゼにコンジュゲートされてもよく、そしてＧＰＣＲは、ＧＦＰにコンジュゲートされてもよく、そしてこのコンジュゲート体は、生体発光共鳴放射技術によって検出されてもよい。本発明の方法は、ＧＰＣＲ活性を検出することに関する。本発明の方法によって、ＧＰＣＲ経路のリアルタイムのモニタリングの強化が可能になる。
ある実施形態では、検出可能な分子の局在パターンを決定する。さらに好ましい実施形態では、検出可能な分子の局在パターンの変更が決定され得る。局在パターンは、検出可能な分子の細胞局在を示し得る。検出の特定の方法は、その内容が全体として本明細書において参照することにより組み込まれる、２００１年３月１３日提出、米国仮特許出願第６０／２７５，３３９号に対する優先権を主張する、２００２年３月１２日提出、米国特許出願第１０／０９５，６２０号に記載される。
分子はまた、別の検出可能に標識された分子、例えば、抗体との相互作用によって検出され得る。
［コンジュゲート体］
本発明のアッセイの方法において用いられる細胞は、ＧＲＫタンパク質のコンジュゲート体および検出可能な分子などを含んでもよい。この検出可能な分子によって、この検出可能な分子と相互作用する分子、およびその分子自体の検出が可能になる。
天然に存在する、ＧＲＫの全ての形態、および操作された変異体を本発明に用いてもよい。ＧＲＫはＧＰＣＲの全ての形態と検出可能なレベルまで相互作用し得る。
用いることができる検出可能な分子としては、生体発光、リン光および蛍光を含むがこれらに限定されない、分光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法、電気的方法、放射性活性の方法および光学的方法によって検出可能である分子が挙げられるがこれらに限定されない。これらの検出可能な分子は、生理学的に適合する分子でなければならず、そして分子の生物学的機能を損なってはならず、そしてこの検出可能な分子が検出される能力を損なってはならない。好ましい検出可能な分子は、光学的に検出可能なタンパク質を含む、光学的に検出可能な分子であり、その結果それらは、化学的に、機械的に、電気的に、または放射性に励起されて、蛍光、リン光または生体発光を放射し得る。より好ましい検出可能な分子は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む蛍光タンパク質のような固有の蛍光分子である。この検出可能な分子は、Ｂａｒａｋ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，８９１，６４６号および同第６，１１０，６９３号）に記載のような方法によってＧＲＫタンパク質にコンジュゲートされ得る。この検出可能な分子は、前部で、後部で、または中央でコンジュゲートされてもよい。
ＧＰＣＲはまた、検出可能な分子とコンジュゲートされてもよい。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端は、検出可能な分子とコンジュゲートされる。ＧＰＣＲが検出可能な分子とコンジュゲートされる場合、ＧＰＣＲとＧＲＫとの接近は容易に検出され得る。さらに、ＧＰＣＲが検出可能な分子とコンジュゲートされる場合、ＧＰＣＲとＧＲＫとの区画化は容易に確認され得る。ＧＰＣＲとコンジュゲートするために用いられる検出可能な分子は、例えば光学的に検出可能な分子を含む、上記のような分子を含んでもよく、その結果、それらは化学的に、機械的に、電気的に、または放射性に励起されて、蛍光、リン光または生体発光を放射し得る。好ましい光学的に検出可能な分子は、免疫蛍光、発光、蛍光およびリン光によって検出され得る。
例えば、ＧＰＣＲは、免疫蛍光分子にコンジュゲートされた抗体で標識された抗体であってもよく、またはＧＰＣＲは、発光ドナーとコンジュゲートされてもよい。詳細には、ＧＰＣＲは、例えば、ルシフェラーゼ、例えばＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、またはローダミンコンジュゲート抗体、例えば、ローダミンコンジュゲート抗ＨＡマウスモノクローナル抗体とコンジュゲートされてもよい。好ましくは、ＧＰＣＲのカルボキシル末端テールは、発光ドナー、例えばルシフェラーゼとコンジュゲートされてもよい。ＧＰＣＲ、好ましくは、カルボキシル末端テールはまた、Ｌ．Ｓ．Ｂａｒａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ Ｉｎｔａｃｔ β２−Ａｄｒｅｎｅｒｇｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．（１９９７）５１，１７７〜１８４に記載されるようなＧＦＰとコンジュゲートされ得る。
［細胞タイプおよび基質］
本発明の細胞は、少なくとも１つのＧＲＫおよびＧＰＣＲを発現し得るが、この分子の少なくとも１つは検出可能に標識される。本発明において有用な細胞としては、真核生物細胞および原核生物細胞が挙げられ、これには、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、線虫細胞、植物細胞および動物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。適切な動物細胞としては、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞および種々の初代哺乳動物細胞が挙げられるがこれらに限定されない。その組織全体を通じて、または特定の器官もしくは組織型内でＧＲＫ６および検出可能な分子のコンジュゲート体を発現する動物モデルがまた、本発明において用いられ得る。
基材の上に、本発明の複数の細胞が沈着され得る。この基材は、ガラス、プラスチック、セラミック、半導体、シリカ、光ファイバー、ダイアモンド、生体適合性モノマー、または生体適合性ポリマー物質が挙げられるがこれらに限定されない、任意の適切な生物学的基材であってもよい。
［タンパク質の発現］
本発明の別の特徴は、本明細書に開示されるＤＮＡ配列の発現である。当分野で周知のとおり、ＤＮＡ配列は、それらを適切な発現ベクター中で発現制御配列に作動可能に連結させること、およびその発現ベクターを使用して適切な単細胞宿主を形質転換することによって発現され得る。
当然ながら、発現制御配列への本発明のＤＮＡ配列のこのような作動性の連結には、このＤＮＡ配列の既に一部でない場合、このＤＮＡ配列の正確なリーディングフレーム上流に開始コドンＡＴＧの供給を含む。
広範な種々の宿主／発現ベクターの組み合わせを、本発明のＤＮＡ配列を発現することに使用してもよい。例えば、有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成のＤＮＡ配列のセグメントから構成され得る。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド ｃｏｌ Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、プラスミド、例えば、ＲＰ４；ファージＤＮＡＳ、例えば、λファージの多くの誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３および糸状一本鎖ファージＤＮＡ；酵母プラスミド、例えば、２μプラスミドまたはその誘導体；真核生物細胞において有用なベクター、例えば、昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクター；プラスミドおよびファージのＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、例えばファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を使用するために改変されているプラスミドなどが挙げられる。
任意の広範な種々の発現コントロール配列−それに作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現を制御する配列−これは、本発明のＤＮＡ配列を発現するためにこれらのベクターにおいて用いられ得る。このような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルスの初期プロモーターまたは後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ＬＴＲシステム、λファージの主要なオペレータおよびプロモーターの領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α接合因子（α−ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）のプロモーター、および原核生物または真核生物の細胞の遺伝子またはそれらのウイルスの発現を制御することが公知の他の配列、ならびにそれらの種々の組み合わせが挙げられる。
広範な種々の単細胞宿主細胞がまた、本発明のＤＮＡ配列を発現するのに有用である。これらの宿主としては、周知の真核生物および原核生物宿主、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、真菌、例えば、酵母、植物細胞、線虫細胞、および動物細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ、ＲＩ．Ｉ、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、Ａｆｒｉｃａｎ Ｇｒｅｅｎ Ｍｏｎｋｅｙ（アフリカミドリザル）腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、ならびにヒト細胞および植物細胞（組織培養）の株を挙げることができる。
全てではないが、ベクター、発現制御配列および宿主は、本発明のＤＮＡ配列を発現するために十分同等に機能することが理解される。全ての宿主が同じ発現系で同等に十分に機能することはない。しかし、当業者は、適切なベクター、発現制御配列および宿主を、本発明の趣旨から逸脱せずに、所望の発現を達成するために過度の実験なしに選択することができる。例えば、ベクターを選択するのには、宿主を考慮しなければならない。なぜなら、そのベクターはその宿主中で機能しなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびこのベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現も考慮される。
発現コントロール配列を選択するのにおいて、通常は種々の要因が考慮される。これらとしては、例えば、システムの相対的な強度、その制御性、および発現される特定のＤＮＡ配列または遺伝子との適合性（特に潜在的な二次構造に関して）が挙げられる。適切な単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとの適合性、それらの分泌特徴、それらがタンパク質を正確に折り畳む能力、およびそれらの発酵要件、ならびに発現されるＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、およびその発現産物の精製の容易さを考慮することによって選択される。
これらおよび他の要因を考慮すれば、当業者は、発酵において、または大規模な動物培養において本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現コントロール配列／宿主の組み合わせを構築することができる。
改変されたＧＲＫ６アナログは、本発明の範囲内に由来するタンパク質複合体／サブユニットのヌクレオチド配列から調製できることがさらに考えられる。アナログ、例えば、フラグメントは、例えば、ＧＲＫ６物質のペプシン消化によって生成できる。他のアナログ、例えば、ムテインは、ＧＲＫ６コード配列の標準的な部位特異的突然変異誘発によって生成できる。小分子のような「ＧＲＫ６活性」を示すアナログは、プロモーターとして機能するかまたはインヒビターとして機能するかにかかわらず、公知のインビボおよび／またはインビトロのアッセイによって同定され得る。
上記のように、改変ＧＲＫ６をコードするＤＮＡ配列はクローニングではなく合成的に調製され得る。このＤＮＡ配列は、ＧＲＫ６アミノ酸配列の適切なコドンで消化され得る。一般に、発現に配列を用いる場合、意図される宿主に好ましいコドンを選択する。完全な配列を標準的方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドからアセンブルして、完全なコード配列を組み立てる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）を参照のこと。
合成ＤＮＡ配列によって、ＧＲＫ６アナログまたは「ムテイン」を発現する遺伝子の簡便な構築が可能になる。あるいは、ＤＮＡコードムテインは、ネイティブまたは改変されたＧＲＫ６遺伝子もしくはｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって作製可能であり、そしてムテインは、従来のポリペプチド合成を直接用いることによって作製できる。
天然でないアミノ酸のタンパク質への部位特異的な取り込みの一般的方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２〜１８８（１９８９年４月）に記載される。この方法を用いて、天然でないアミノ酸でアナログを作製することができる。
［ＧＲＫ６関連疾患の処置を評価する方法］
本発明において提供されるのは、ＧＲＫ６関連疾患の処置を評価する方法である。ＧＲＫ６を調節する化合物を、野生型非ヒト動物に投与する。この動物の運動性応答を、機能的に破壊されたＧＲＫ６遺伝子を有するトランスジェニック動物の運動性応答と比較する。運動性応答を評価する手段は、本実施例に記載される。
［疾患を処置または診断する方法］
本発明は、疾患を処置するかまたは診断する方法に関する。この疾患処置は、ＧＲＫ６を調節する化合物を投与するステップを包含し得る。この化合物はＧＲＫ６を直接または間接的に調節し得る。この化合物は、アンチセンス分子であっても、または免疫グロブリンであってもよい。この疾患は、パーキンソン病、統合失調症、抑うつ、トゥーレット症候群または薬物常用によるものであってもよい。疾患診断の方法は、サンプルにおけるＧＲＫ６のタンパク質、核酸または活性の検出に関する。このような方法は、免疫グロブリン、核酸、およびアンチセンス分子を用いる検出を包含する。
本発明の疾患処置の方法は、さらなる化合物を用いてＧＲＫ６を調節する化合物の同時投与を包含する。さらなる化合物はドーパミンレベルに間接的に影響してもまたは直接的に影響してもよい。このような化合物としては、Ｌ−ＤＯＰＡ、コカイン、およびモルフィンが挙げられる。ＧＲＫ６を調節する化合物は、さらなる化合物の有効性を増大し得る。ＧＲＫ６を調節する化合物の同時投与は、患者に必要なさらなる化合物の量を減少させ得る。
［疾患処置］
本発明は、ＧＰＣＲ関連疾患、例えば、心血管系疾患、心不全、喘息、腎性尿崩症、高血圧、パーキンソン病、統合失調症、抑うつ、トゥーレット症候群または薬物常用に罹患しているヒトまたは非ヒト被験体を処置する方法に関する。このような処置は、このような処置の必要な被験体に、ＧＰＣＲ関連疾患を処置するか、またはその症状を少なくとも軽減させるのに十分な量の本発明の方法によって同定された化合物を投与することによって行なうことができる。
処置はまた、本発明の裸の改変された核酸配列を被験体に投与することによって、例えば、直接注射、微粒子銃、リポソームもしくは他の小胞を介した送達、または前述の方法のうちの１つによって投与できるベクターによって、達成されてもよい。この方式での遺伝子送達は、遺伝子治療と考えられ得る。好ましくは、裸の改変された核酸配列は、本発明の改変されたＧＲＫ６タンパク質を含む。
［診断および治療の処置］
ＧＰＣＲの存在によって向上される診断および治療の処置の両方の見込みは、この要因がそれに対するリガンドの間のタンパク質間相互作用に直接および偶然に関与するらしいという事実、ならびにその後に細胞内シグナルを開始するという要因に由来する。初期に考察され、そして本明細書においてさらに詳細に記載されたとおり、本発明は、ＧＲＫまたはＧＰＣＲが、ＧＲＫによって開始された活性を調節することに関わっている反応のカスケードにおける薬学的介入を意図する。
従って、特定の刺激または要因から生じる活性を軽減または阻害することが所望される場合、ＧＲＫの適切なインヒビターは、ＧＲＫによるＧＰＣＲのリン酸化をブロックするために導入され得る。対応して、Ｇタンパク質または二次メッセンジャーの不十分な活性化が行なわれている状況は、ＧＲＫまたはその化学的なもしくは薬学的な同族、アナログ、フラグメントなどの追加量の導入によって改善され得る。Ｇタンパク質または二次メッセンジャーの過剰な活性化が行なわれている状況は、ＧＲＫまたはその化学的なもしくは薬学的な同族、アナログ、フラグメントなどの導入量の低下によって改善され得る。
本発明はさらに、本発明の治療方法を実施するのに有用な治療組成物を意図する。被験体治療組成物としては、活性成分として本明細書に記載されるような、混合物中の、薬学的に許容可能な賦形剤（キャリア）およびＧＲＫを調節する化合物が挙げられる。ある実施形態では、この組成物は、ＧＲＫによるＧＰＣＲのリン酸化を調節し得る薬物を含む。
［薬学的組成物］
活性成分としてポリペプチド、アナログまたは活性なフラグメントを含む治療組成物の調製は、当分野で十分理解される。代表的には、このような組成物は、注射可能である液体溶液または懸濁物のいずれかとして調製されるが、注射の前に液体中において溶液または懸濁物に適切な固体形態がまた調製されてもよい。調製物は乳化され得る。活性な治療成分はしばしば、薬学的に許容可能であり、そして活性な成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、この組成物は、活性成分の有効性を強化する少量の補助物質、例えば、保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤を含んでもよい。
本明細書に開示される方法によって得られたＧＲＫ６調節化合物は、中和された薬学的に許容可能な塩型として治療組成物に形成されてもよい。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体の遊離のアミノ基で形成された）が挙げられるが、これは例えば、塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸などから形成される。遊離のカルボキシル基から形成された塩はまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは鉄の水酸化物のような無機の塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインのような有機の塩基などに由来し得る。
この治療組成物は、例えば、単位用量の注射によって、静脈内に慣習的に投与される。「単位用量」という用語は、本発明の治療組成物に関して用いられる場合、ヒトの単位用量として適切な物理的に別個の単位であって、各々の単位が必要な希釈剤（すなわち、キャリアまたはビヒクル）と関連して所望の治療効果を生じるように算出された所定の量の活性物質を含む単位をいう。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投薬の範囲を策定するのに用いることができる。このような組成物の投薬量は好ましくは、毒性をほとんど有さないかまたは全く有さないＥＤ５０を有する循環濃度の範囲内に位置する。投薬量は、使用される投薬形態および利用される投与の経路に依存してこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において用いられる任意の組成物について、治療上有効な用量は最初に、細胞培養アッセイから評価され得る。細胞培養中で決定されるようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大半分阻害を達成する試験組成物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて用量を策定することができる。このような情報を用いて、ヒトでの有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。
組成物は、投与量策定に適合する方式で、かつ治療上有効な量で投与される。投与されるべき量は、処置されるべき被験体、被験体の免疫系が活性成分を利用する能力、および所望されるＧＰＣＲ活性の調整の程度に依存する。投与されるのに必要な活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、かつ各々の個体に固有である。しかし、適切な投薬量は、１日あたり個体の体重１キログラムあたり約０．００１〜３０、好ましくは約０．０１〜約２５、さらに好ましくは約０．１〜２０ミリグラムの活性成分の範囲であってもよく、そして投与の経路に依存し得る。初回の投与およびブースターショットの適切な投与計画はまた可変であるが、最初の投与、その後の引き続く注射または他の投与による１時間以上の間隔での反復用量として類型化される。あるいは、血液中で１０ナノモルから１０マイクロモルの濃度を維持するのに十分な連続的な静脈注入が意図される。
当業者は、処置前の疾患もしくは状態、障害、または疾患の重篤度、被験体の一般的健康度および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験体を有効に処置するのに必要な用量に影響し得ることを理解する。さらに、治療上有効な量の（単数または複数の）組成物を用いた被験体の治療としては、単回の処置を挙げることが可能であり、また好ましくは一連の処置を挙げることが可能である。好ましい実施例では、被験体は、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは３〜７週間、そしてさらに好ましくは約４、５または６週間の間、１週間あたり、体重１ｋｇあたり、約０．１〜２０ｍｇの間の範囲の組成物を用いて治療される。治療のために用いられる組成物の有効量は、特定の治療の経過にわたって増大または減少し得ることがまた理解される。用量の変化は、本明細書に記載されるような診断アッセイの結果から得られて明白になり得る。
治療組成物はさらに、有効量のＧＲＫ６調節化合物および１つ以上の以下の活性成分を含んでもよい。抗生物質、ステロイドなど。
「プロドラッグ」という用語は、治療剤であって、不活性型で調製されており、内因性の酵素または他の化学物質および／または条件の作用によってその身体または細胞内で活性型（すなわち、薬物）に変換される治療剤を示す。詳細には、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグバージョンは、例えば、ＷＯ９３／２４５１０およびＷＯ９４／２６７６４に開示される方法に従ってＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート）誘導体として調製され得る。
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的にかつ薬理学的に受容可能な塩：すなわち、親の化合物の所望の生物学的活性を保持して、それに対して所望されない毒性学的効果を与えない塩をいう。任意の開示される遺伝子、遺伝子転写またはそれによってコードされるタンパク質を調節するための化合物としては、アンチセンス化合物および他の調節性化合物が挙げられる。
アンチセンスとの使用のための薬学的に許容可能な塩基付加塩、ならびに他の調節性化合物は、金属またはアミン、例えば、アルカリおよびアルカリ土類金属または有機アミンを用いて形成される。陽イオンとして用いられる金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどである。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインである（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，」Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６：１〜１９を参照のこと）。酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態と、十分な量の所望の塩基とを接触させて塩を従来の様式で生成することによって調製される。この遊離酸の形態は、塩の形態と酸とを接触させることおよび遊離酸を従来の様式で単離することによって再生できる。この遊離酸の形態は、特定の物理的特性、例えば、極性溶媒中での溶解度においていくらか、その各々の塩の形態とは異なるが、そうでなければこの塩は本発明の目的について、その各々の遊離酸と等価である。本明細書において用いる場合、「薬学的な付加塩」とは、本発明の組成物の成分のうちの１つの酸形態の薬学的に許容可能な塩を包含する。これらとしては、アミンの有機または無機の酸塩が挙げられる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩およびリン酸塩である。他の適切な薬学的に許容可能な塩は、当分野で公知であって、これには種々の無機および有機の酸の塩基性塩、例えば無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）などとの塩；有機カルボキシル酸、スルホン酸、スルホ酸もしくはホスホ酸、またはＮ置換スルファミン酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボニック酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ニコチン酸またはイソニコチン酸との塩；ならびにアミノ酸、例えば天然にタンパク質の合成に関与する２０個のαアミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸との塩、そしてまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラミン酸塩の形成を伴う）との塩、あるいはアスコルビン酸のような他の酸有機化合物との塩が挙げられる。
化合物の薬学的に許容可能な塩はまた、薬学的に許容可能な陽イオンを用いて調製され得る。適切な薬学的に許容可能な陽イオンは、当分野で周知であり、そしてこれには、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウムおよび四級アンモニウム陽イオンが挙げられる。炭酸塩または炭酸水素塩もまた可能である。
オリゴヌクレオチドについては、薬学的に許容可能な塩の好ましい例としては、（ａ）陽イオン、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えば、スペルミンおよびスペルミジンなどと形成される塩；（ｂ）無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸塩、硫酸、リン酸、硝酸などと形成される酸付加塩；（ｃ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などと形成される塩；ならびに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの陰イオン元素から形成される塩が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるアンチセンス化合物および他の調節性化合物は、有効な量のアンチセンス化合物または他の調節性化合物を、適切な薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアに添加することによって、薬学的組成物中で利用できる。本発明の化合物および方法の使用は、予防的に有用であり得る。
本発明のアンチセンス化合物は、研究および診断のために有用である。なぜなら、これらの化合物は、体系的な開発技術を使用して同定された遺伝子をコードする核酸またはそのｍＲＮＡ転写物にハイブリダイズするからである。このようなハイブリダイゼーションによって、サンドイッチおよび他のアッセイの使用を容易に構成して、この事実を活かすことが可能になる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、体系的な開発方法によって同定された遺伝子または遺伝子転写物をコードする核酸とのハイブリダイゼーションは、当分野で公知の手段によって検出され得る。このような手段としては、例えば、オリゴヌクレオチドに対する酵素のコンジュゲート、オリゴヌクレオチドの放射性標識、または任意の他の適切な検出手段を挙げることができる。サンプル中の遺伝子の転写物のレベルを検出するためにこのような検出手段を用いるキットもまた調製され得る。
本発明はまた、アンチセンス化合物および他の調節性化合物および本発明の組成物を含む、薬学的なアンチセンス組成物および処方物を包含する。本発明の薬学的組成物は、局所的な処置が所望されるか、または全身的な処置が所望されるかに依存して、そして処置されるべき領域に依存して、多数の方法で投与され得る。
特定の実施形態では、本発明の薬学的組成物を処置の必要な領域に局所的に投与することが所望され得る。これは、例えば、限定はしないが、外科手術中の局所注入、局所的適用、例えば、外科手術後の創傷の包帯と組み合わせて、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって達成され得る。このインプラントは、シアラスチック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）メンブレンのような膜を含む、多孔性、非多孔性、またはゼラチン状の物質、またはファイバーのインプラントである。１つの実施形態では、投与は、悪性腫瘍または新生物または新生物発生前の組織の部位（または以前の部位）で直接注射によって行なわれ得る。
局所的な適用のために、所望の活性に基づいて、有効な投薬量が送達されるように、この組成物をキャリアと組み合わせてもよい。
薬学的組成物および局所的な投与のための処方物としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体および粉末を挙げることができる。従来の薬学的キャリア、水溶性の、粉末のまたは油状の基剤、増粘剤などが必須であるかまたは所望され得る。
経口投与のために、薬学的組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石またはシリカ）；錠剤分解物質（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または保湿剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に許容可能な賦形剤を用いた従来の手段によって調製された、例えば、錠剤またはカプセルの形態をとってもよい。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁物の形態をとってもよく、またはそれらは使用の前の水または他の適切なビヒクルでの構成のための乾燥生成物として提示されてもよい。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような薬学的に許容可能な添加物を用いて従来の手段によって調製されてもよい。この調製物はまた、必要に応じて、緩衝液、塩、香味料、着色料および甘味料を含んでもよい。
経口投与のための調製物は、活性な組成物の制御放出が得られるように適切に処方され得る。
この組成物は、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による、非経口投与のために処方され得る。注射のための処方物は、保存剤を添加されて、単位投薬形態で、例えば、アンプルまたは複数用量の容器で提示されてもよい。この組成物は、油状または水性のビヒクル中で、懸濁物、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、そして懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤のような製剤化剤を含んでもよい。あるいは、この活性化成分は、使用の前の適切なビヒクルとの、例えば、滅菌の発熱物質を含まない水との構成のために粉末形態であってもよい。
吸入による投与のために、本発明による使用のための組成物は、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガスの使用によって、加圧パックまたはネブライザーから得られるエアロゾルスプレーの形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬単位は、一定量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。この組成物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含む、吸入器または注入器における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが処方されてもよい。
この組成物はまた、デポ調製物として処方されてもよい。このような長時間作用性の処方物は、移植物（例えば、皮下にまたは筋肉内に）によって、または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、この組成物は、適切なポリマーまたは疎水性材料（例えば、受容可能なオイルにおけるエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂と共に、または溶解度の乏しい誘導体として、例えば溶解度の乏しい塩として処方され得る。
この組成物は、必要に応じて、活性成分を含む１つ以上の単位投薬形態を含み得るパックまたはディスペンサーデバイスで与えられてもよい。このパックは、例えば、金属またはプラスチックのホイル、例えば、ブリスターパックを含んでもよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための装置を付随してもよい。
本発明の薬学的組成物（例えば、本明細書に記載されるような遺伝子、遺伝子転写物またはタンパク質産物の調節因子）としては、溶液、エマルジョンおよびリポソーム含有処方物が挙げられるがこれらに限定されない。これらの組成物は、事前に形成された液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられるが、これらに限定されない種々の成分から生成され得る。
単位投薬形態で都合よく与えることができる本発明の薬学的処方物は、製薬産業において周知の従来の技術に従って調製され得る。このような技術は、活性な化合物と、薬学的な（単数または複数の）キャリアまたは（単数または複数の）賦形剤との会合をもたらすステップを包含する。一般に、この処方物は、活性成分と液体キャリアもしくは微細に粉砕された固体キャリアまたはその両方との会合を均一にかつ緊密に行ない、次いで、必要に応じてこの生成物を成形することによって調製される。
本発明の１つの実施形態において、薬学的組成物は、泡状物として処方され用いられ得る。薬学的な泡状物としては、例えば、エマルジョン、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリーおよびリポソームが挙げられるがこれらに限定されない処方物が挙げられる。基本的には本質的に同様であるが、これらの処方物は最終生成物の成分および粘度が変化する。このような組成物および処方物の調製は一般に薬学的分野および製剤の分野の当業者に公知であって、本発明の組成物の処方に適用することができる。
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製され処方されてもよい。例えば、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ １巻，ｐ．１９９（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，２巻，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３０１（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５）を参照のこと。エマルジョンはしばしば、２つの緊密に混合され、お互いに分散された不混和性の液相からなる二層の系である。一般に、エマルジョンは、種々の油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれであってもよい。水相が微細に分割されてバルクの油状相に微細な液滴として分散される場合、得られた組成物は油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油状相が微細に分割されてバルクの水相に微細な液滴として分散される場合、得られた組成物は水中油型（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンは、分散された層および活性な薬物に加えて、分離相として水相、油相またはそれ自体において、溶液として存在し得る、さらなる成分を含んでもよい。薬学的な賦形剤、例えば、乳化剤、安定化剤、色素、および抗酸化剤がまた、必要に応じてエマルジョンに存在してもよい。薬学的エマルジョンはまた、例えば、油中水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）（ｏ／ｗ／ｏ）エマルジョンおよび水中油中水型（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合のように、２つ以上の相から構成される複数のエマルジョンであってもよい。このような複合処方物ではしばしば、簡単な二成分エマルジョンでは得られない特定の利点が得られる。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さい水滴を含む複数エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、連続的なオイル中に安定化された水の小球に含まれる油滴の系によってｏ／ｗ／ｏエマルジョンが得られる。
エマルジョンは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことで特徴付けられる。しばしば、エマルジョンの分散した、または不連続な相は、外部または連続的な相に十分分散されて、乳化剤またはその処方物の粘性によってその形態で維持される。エマルジョンのいずれの相も、エマルジョン型の軟膏基剤およびクリームと同様に、半固体であっても、固体であってもよい。エマルジョンを安定化させる他の方法は、このエマルジョンのいずれかの相に取り込まれ得る乳化剤の使用を包含する。乳化剤は概して、４つの範疇に分類できる。合成サーファクタント、天然に存在する乳化剤、吸着基剤、および微細に分散した固体（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ １巻，ｐ．１９９（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ編，１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
合成サーファクタントはまた、界面活性剤としても公知であるが、エマルジョンの処方に広範な適用性が見出されており、文献中で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻，ｐ．１９９）。サーファクタントは代表的には、両親媒性であり、そして親水性および疎水性の部分を含む。サーファクタントの疎水性の性質に対する親水性の比は、親水性物質／親油性物質バランス（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ／ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ）（ＨＬＢ）と名付けられており、処方物の調製においてサーファクタントを分類し選択するのにおける有用なツールである。サーファクタントは、親水性基の性質に基づいて異なるクラスに分類されてもよい。非イオン性、陰イオン性、陽イオン性および両親媒性（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）。
エマルジョン処方において用いられる天然に存在する乳化剤としてはラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レクチンおよびアカシアが挙げられる。吸着塩基は、疎水性の特性を保有し、その結果それらは、無水ラノリンおよび親水性ワセリンのように、その半固体としての一貫性を保持したままで、水を吸い上げてｗ／ｏ乳化剤を形成し得る。微細に分割された固体はまた、良好な乳化剤として、特にサーファクタントと組み合わせて、および粘稠性の調製物中で用いられている。これらは、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土（例えば、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウム）、ピグメントおよび非極性固体（例えば、炭素または三ステアリン酸グリセリル）を含む。
広範な種々の非乳化物質がまた、エマルジョン処方物に含まれて、エマルジョンの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、オイル、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水性コロイド、防腐剤および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻、ｐ．３８５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ編，１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、天然に存在するガムおよび合成ポリマー、例えば、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアールガム、カラヤゴム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは、水中に分散または膨潤して、コロイド状の溶液を形成し、これが分散した相の液滴の周囲に強力な界面のフィルムを形成することによって、および外側の相の粘性を増大することによって、エマルジョンを安定化する。
エマルジョンはしばしば多数の成分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロールおよびリン脂質を含み、これが微生物の増殖を容易に支持し得るので、これらの処方物はしばしば防腐剤を組み込む。エマルジョン処方物中に含まれる一般に用いられる防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルおよびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤がまた、処方物の変質を防ぐためにエマルジョン処方物に共通して添加される。用いられる抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン）であっても、または還元剤（例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム）であっても、そして抗酸化共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン）であってもよい。
皮膚科学的、経口的、および非経口的経路を介したエマルジョン処方物の適用、およびそれらの製造のための方法は、文献中に概説されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻，ｐ．１９９）。経口送達のためのエマルジョン処方物は、処方が容易であること、吸収の有効性およびバイオアベイラビリティーの観点の理由によって、極めて広範に用いられている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻，ｐ．２４５（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ編，１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）。鉱物油ベースの下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物はとりわけ、ｏ／ｗエマルジョンとして一般に経口的に投与される材料である。
本発明の１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドおよび核酸の組成物はマイクロエマルジョンとして処方される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的に等方性および熱力学的に安定な液体溶液である、水、オイルおよび両親媒性物質の系として規定され得る（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，１巻，ｐ．２４５）。代表的には、マイクロエマルジョンは、透明な系を形成するために、水性サーファクタント溶液中にオイルを最初に分散すること、次いで十分な量の４つの成分、一般には中間の鎖長のアルコールを添加することによって調製される系である。従って、マイクロエマルジョンはまた、界面活性分子の界面フィルムによって安定化される、熱力学的に安定であり、等方性に透明な分散の２つの不混和性の液体として記載されている（ＬｅｕｎｇおよびＳｈａｈ，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１８５〜２１５（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，編，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。マイクロエマルジョンは、一般に、オイル、水、サーファクタント、コサーファクタントおよび電解質を含む３〜５個の成分の組み合わせによって調製される。マイクロエマルジョンが、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）であるか否かは、用いられるオイルおよびサーファクタントの特性に、そしてこのサーファクタント分子の極性ヘッドおよび炭化水素テールの構造および幾何的な充填に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２７１（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５）。
マイクロエマルジョンの調製に用いられるサーファクタントとしては、限定されないが、イオン性サーファクタント、非イオン性サーファクタント、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレアート（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレアート（ＤＡＯ７５０）が単独またはコサーファクタントと組み合わせて挙げられる。このコサーファクタント、一般には、短鎖アルコール、例えばエタノール、１−プロパノールおよび１−ブタノールは、サーファクタント分子の間で生成された空隙のおかげで、サーファクタントフィルムへの浸透によって、そして引き続きフィルム障害を作製することによって、界面の流動性を増大するように働く。
しかし、マイクロエマルジョンは、当分野で公知のコサーファクタントおよびアルコールなしの自己乳化マイクロエマルジョン系の使用なしに調製されてもよい。この水相は代表的には、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびエチレングリコールの誘導体であってもよいがこれらに限定されない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油のような物質を挙げることができるがこれらに限定されない。
マイクロエマルジョンは、薬物可溶化および薬物の増強された吸着の観点から特に興味深い。脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方とも）が、ペプチドを含む薬物の経口のバイオアベイラビリティーを増強するために提唱されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１９９４，１１：１３８５〜９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３：２０５）。マイクロエマルジョンによって、改善された薬物可溶化、酵素加水分解からの薬物の保護、膜の流動性および透過性におけるサーファクタント誘導性の変更に起因する薬物吸着の潜在的な強化、調製の容易さ、固体投薬型を上回る経口投与の容易さ、臨床能力の改善、および毒性の低下という利点が得られる（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５：１３８〜１４３）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その成分が外界温度におかれた場合、自然に形成され得る。これは、易熱性薬物、ペプチドまたはオリゴヌクレオチドを処方する場合、特に有利である。マイクロエマルジョンはまた、美容上の適用および薬学的適用の両方における活性な成分の経皮的な送達に有効であった。本発明のマイクロエマルジョン組成物および処方物は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドおよび核酸および他の活性成分の全身的吸着の増大を容易にし、そして胃腸管、膣、口腔および他の投与の領域内でのオリゴヌクレオチドおよび核酸および他の活性成分の局所細胞取り込みを改善する。
本発明のマイクロエマルジョンはまた、処方物の特性を改善するため、および本発明のオリゴヌクレオチドおよび核酸の吸着を増強するために、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透増強剤のようなさらなる成分および添加物を含んでもよい。本発明のマイクロエマルジョンにおいて用いられる浸透増強剤は、５つの広い範疇のうちの１つに属すると分類できる−サーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤および非キレート化非サーファクタント（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスの各々が上記で考察されている。
薬物の処方について研究されかつ用いられているマイクロエマルジョン以外に組織化されたサーファクタント構造が多く存在する。これらとしては、単層、ミセル、二層および小胞が挙げられる。作用の特異性および期間のおかげで、リポソームのような小胞は有用である。本発明において用いられる場合、「リポソーム」という用語は、球状の二層に配置された両親媒性脂質からなる小胞を意味する。
リポソームは、親油性の物質および水性内部から形成された膜を有する単層または多層の小胞である。水性部分は、送達される組成物を含む。陽イオン性リポソームは細胞壁に融合することができるという利点を有する。非陽イオン性リポソームは、細胞壁内と効率的に融合することはできないが、インビボにおいてマクロファージによって取り込まれる。カプセル化されるべき因子に依存する適切なリポソームの選択は、当分野で公知であることを考慮すれば明白になる。
インタクトな哺乳動物の皮膚を横切るために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響下で、各々が５０ｎｍ未満の直径を有する、一連の微細な細孔を通過しなければならない。従って、高度に変形可能であってこのような微細な細孔を通過できるリポソームを使用することが所望され得る。
リポソームのさらなる利点としては、以下が挙げられる。（ａ）天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性であって生体分解性である；（ｂ）リポソームが広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込み得る；（ｃ）リポソームが、代謝および分解から、その内部区画にカプセル化された薬物を保護し得る（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ）。リポソーム処方物の調製における重要な考慮は、脂質表面荷電、小胞サイズおよびリポソームの水性容積である。
リポソームは、作用の部位に対して活性成分を移動および送達するのに有用である。リポソーム膜は生物学的膜に対して構造的に類似であるので、リポソームが組織に加えられたとき、リポソームは細胞膜との結合を開始する。リポソームおよび細胞の結合が進行するにつれて、リポソーム内容物は、この活性剤が作用し得る細胞に出される。
別の実施形態はまた局所投与のためのリポソームの使用を意図する。このような利点としては、投与される薬物の高い全身的吸着に関する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増大、および皮膚に対して親水性および疎水性の両方の広範な種々の薬物を投与する能力が挙げられる。いくつかの報告は、リポソームが皮膚への高分子量ＤＮＡを含む薬物を送達する能力を詳細に記載している。鎮痛薬、抗体、ホルモンおよび高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。多くの適用によって表皮上層の標的化が得られた。
リポソームは、２つの広範なクラスにおさまる。陽イオンリポソームは正に荷電されたリポソームであって、安定な複合体を形成する負に荷電されたＤＮＡ分子と相互作用する。正に荷電されたＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電された細胞表面に結合して、エンドソーム中に内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂して、これによってその内容物を細胞質中に遊離させる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９８７，１４７：９８０〜９８５）。
ｐＨ感受性または負に荷電されたリポソームは、ＤＮＡとの複合体ではなくＤＮＡを取り込む。ＤＮＡおよび脂質の両方が同時に荷電されるので、複合体形成ではなく反発作用が生じる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡがこれらのリポソームの水性内装内に捕獲される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの培養中の細胞単層への送達のために用いられる。内因性遺伝子の発現を標的細胞において検出した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９：２６９〜７４）。
別の意図されるリポソーム組成物としては、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。天然のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。陰イオン性リポソーム組成物は一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるが、陰イオン性融合誘導因子リポソームは主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えば、ダイズＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプがリン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
「立体的に安定化された」リポソームとは、リポソームに取り込まれた場合、専門化された脂質を欠くリポソームに対して循環寿命の延長を生じる、１つ以上の専門化された脂質を含むリポソームをいうが、このようなリポソームもまた意図される。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が（Ａ）１つ以上の糖脂質、例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１を含むもの、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されるものである。いかなる特定の理論によっても束縛されることは望まないが、当分野では、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリンまたはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の延長が細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの低下から誘導されることが考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８７，２２３：４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｒｅｓ．，１９９３，５３：３７６５）。
１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびそれらの調製の方法は、当分野で公知である。例えば、以下を参照のこと：Ｓｕｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３：２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む、非イオン性界面活性剤２Ｃ１２ １５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７：７９）は、ポリマー性グリコールを有するポリスチレン粒子の親水性コーティングが有意に延長された血中半減期を生じることに気付いた。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって改変された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号および同第４，５３４，８９９号）に記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＥＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８：２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の有意な延長を有するということを実証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９：９１）は、このような観察を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組み合わせから形成された、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧに広げた。その外部表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、欧州特許第０ ４４５ １３１ ＢＩおよびＷＯ９０／０４３８４（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載される。ＰＥＧで誘導体化された、１〜２０モルパーセントのＰＥを含むリポソーム組成物、およびその使用の方法は、例えば、Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号および同第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第０ ４９６ ８１３ Ｂ１）によって記載される。多数の他の脂質ポリマーコンジュゲート体を含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎら）に、そしてＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）において開示される。ＰＥＧ改変セラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉら）に記載される。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、その表面上の官能性部分とさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載する。
リポソーム中に核酸をカプセル化する方法はまた、当分野で公知である。リポソーム中に高分子量核酸をカプセル化するための方法を開示しているＴｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９６／４００６２を参照のこと。Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合したリポソームを開示し、このようなリポソームの内容物がアンチセンスＲＮＡを含み得ることを主張している。Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法を記載する。
サーファクタントは、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームのような処方物において広範な適用を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なるタイプのサーファクタントの特性を分類してランク付けする最も一般的な方法は、親水性物質／親油性物質バランス（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（「ヘッド」としても公知）の性質によって、処方中で用いられる異なるサーファクタントを分類するために最も有用な方法が得られる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，ｐ．２８５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５））。
サーファクタント分子は、イオン化されない場合、非イオン性サーファクタントとして分類される。非イオン性サーファクタントは、薬学的および美容的な製品において広範な適用を見出し、そして広範なｐＨ値にわたって使用可能である。概してそれらのＨＬＢ値は、その構造に依存して２〜約１８に及ぶ。非イオン性サーファクタントとしては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセロールエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックコポリマーもまたこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレンサーファクタントは、非イオン性サーファクタントのクラスの最も一般的なメンバーである。
サーファクタント分子が水に溶解されるかまたは分散される時、負の電荷を担持する場合、このサーファクタントは、陰イオンとして分類される。陰イオン性サーファクタントとしては、カルボン酸塩、例えば、せっけん、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキル硫酸塩およびエトキシル化アルキル硫酸塩、スルホン酸塩、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウレート、およびスルホスクシネートおよびリン酸塩が挙げられる。陰イオン性サーファクタントのクラスの最も重要なメンバーはアルキル硫酸塩および石鹸である。
サーファクタント分子が、水に溶解されるかまたは分散される時、正の電荷を担持する場合、このサーファクタントは、陽イオンとして分類される。陽イオン性サーファクタントとしては、四級アンモニウム塩、およびエトキシル化アミン挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスの最も用いられるメンバーである。
サーファクタント分子が、正の電荷または負の電荷のいずれかを担持する能力を有する場合、このサーファクタントは両親媒性に分類される。両親媒性サーファクタントとしては、アクリル酸誘導体、置換されたアルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびリン脂質が挙げられる。
製剤、処方物およびエマルジョンにおけるサーファクタントの使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，２８５（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）。
１つの実施形態では、本発明は、種々の浸透増強剤を使用して、動物の皮膚に対する核酸および他の因子、特にオリゴヌクレオチドの効率的な送達を発効する。ほとんどの薬物はイオン化型および非イオン化型で溶液に存在する。しかし、通常、脂溶性または親油性の薬物のみが容易に膜を横切る。非リン脂質薬物は細胞膜を、この横切られる膜が浸透増強剤で処理される場合に、横切ることができるということが発見されている。細胞膜を横切る非リン脂質薬物の拡散を補助することに加えて、浸透増強剤はまた、脂肪親和性薬物の浸透性を増強する。
浸透増強剤は、５つの大まかな範疇、すなわちサーファクタント、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非サーファクタントのうちの１つに属するとして分類できる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透増強剤の上述のクラスの各々は、以下にさらに詳細に記載される。
本発明の別の実施形態は、サーファクタントを含む薬学的組成物を意図する。サーファクタント（または、「界面活性剤」）は、化学的実体であり、これは水溶液に溶解された場合、この溶液の表面張力、またはこの水溶液と別の液体との間の界面張力を低下して、これには、粘膜を通じたオリゴヌクレオチドの吸着が増強されるという結果を伴う。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透増強剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，９２）；およびペルフルオロ化合物のエマルジョン、例えば、ＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０：２５２）が挙げられる。
別の実施形態は、浸透増強剤として作用する種々の脂肪酸およびその誘導体の使用を意図しており、これには例えば、オレイン酸、ラウリル酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノ−グリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノレン酸塩など）が挙げられる）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１〜３３；ＥＩ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４：６５１〜４）。
本発明の活性因子を含む組成物はさらに胆汁酸塩を含んでもよい。胆汁の生理学的な役割としては、脂質および脂溶性のビタミンの分散および吸収を容易にすることが挙げられる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，Ｈａｒｄｍａｎら編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９６，ｐｐ．９３４〜９３５）。種々の天然の胆汁酸塩およびその合成の誘導体は、浸透増強剤として作用する。従って、「胆汁酸塩」という用語は、胆汁の任意の天然に存在する成分およびそれらの任意の合成誘導体を含む。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）グリコデオキシコリン酸（グリコデオキシコリン酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編、，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，７８２〜７８３頁；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３：２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９：５７９〜８３）。
本発明はさらに、キレート剤を含む組成物を意図する。キレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通じたオリゴヌクレオチドの吸着が増強されるという結果を伴う化合物として規定され得る。活性因子がアンチセンス因子である場合の使用について浸透増強剤としてのそれらの使用に関して、キレート剤はＤＮａｓｅインヒビターとしても機能するというさらなる利点を有する。なぜならほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価の金属イオンを要し、従ってキレート剤によって阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８：３１５〜３９）。本発明のキレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびβジケトンのＮアミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられるがこれらに限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９１；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４：４３〜５１）。
本発明はまた、活性因子および非キレート化非サーファクタントを含む薬学的組成物を意図する。非キレート化非サーファクタント浸透増強化合物は、キレート剤としてまたはサーファクタントとしては意味のない活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器系粘膜を通じたオリゴヌクレオチドの吸収を増強する化合物として規定され得る（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０）。このクラスの浸透増強剤としては、例えば、不飽和の環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．１９９１）；および非ステロイド抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９：６２１〜６）が挙げられる。
オリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物については、細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを増強する因子をまた、本発明の薬学的組成物および他の組成物に添加してもよい。例えば、陽イオン性脂質、例えばリポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，７０５，１８８号）、陽イオン性グリセロール誘導体およびポリカチオン分子、例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９７／３０７３１）がまた、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増強することが公知である。
投与された核酸の浸透を増強するために他の因子を利用してもよいが、これにはグリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば、２−ピロール、アゾおよびテルペン（例えば、リモネンおよびメントン）が挙げられる。
本発明の特定の組成物はまた、処方物中にキャリア化合物を取り込む。本明細書において用いる場合、「キャリア化合物」または「キャリア」とは、核酸またはそのアナログであって、不活性である（すなわち、それ自体生物学的活性を保有しない）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、または循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させるインビボプロセスによって、核酸として認識される、核酸またはそのアナログをいってもよい。核酸およびキャリア化合物の同時投与（これは代表的には、後者の物質が過剰である）は、キャリア化合物と核酸との間の共通のレセプターに関する競合におそらく起因して、肝臓、腎臓または他の細胞外リザーバにおいて回収される核酸の量の実質的な減少を生じ得る。例えば、肝臓組織におけるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの部分的な回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジル酸または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２−ジスルホン酸との同時投与の場合、低下され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５：１１５〜１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６：１７７〜１８３）。
本明細書において開示される薬学的組成物はまた賦形剤を含んでもよい。上記のキャリア化合物と対照的に、これらの賦形剤としては、動物へ１つ以上の核酸または他の活性因子を送達するための薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤または任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルが挙げられる。この賦形剤は、液体であっても固体であってもよく、そして核酸または他の活性因子および所与の薬学的組成物の他の成分と組み合わせた場合、所望のバルク、一貫性などが得られるように、計画された投与様式を考慮して選択される。代表的な薬学的キャリアとしては、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；錠剤分解物質（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および保湿剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
核酸と有害に反応しない、非経口的な投与に適切な、薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤はまた、本発明の組成物を処方するために用いられ得る。適切な薬学的に許容可能なキャリアとしては、水、塩、溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミラーゼ、ステアリン酸マグネシウム、滑石、ケイ酸、粘稠性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるがこれらに限定されない。
核酸および他の意図される活性因子の局所的な投与のための処方物は、滅菌および非滅菌の水溶液、非水溶液を一般的な溶媒、例えば、アルコールに、または核酸の溶液を液体または固体オイル基剤中に含んでもよい。この溶液はまた緩衝液、希釈剤および他の適切な添加物を含んでもよい。核酸または他の意図される活性因子と有害に反応しない、非経口投与のために適切な薬学的に許容可能な、有機または無機の賦形剤をまた用いることができる。
本発明の組成物は、当分野で確立された用法レベルで、薬学的組成物において慣習的に見出される他の補助成分をさらに含んでもよい。従って、例えば、この組成物は、さらなる、適合性の薬学的に活性な物質、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬もしくは抗炎症剤などを含んでもよいし、または本発明の組成物の種々の投薬形態を物理的に処方するのに有用なさらなる物質、例えば、色素、芳香剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤および安定化剤を含んでもよい。しかし、このような物質は、添加された場合、本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に干渉してはならない。この処方物は、滅菌され得、そして所望の場合、補助剤、例えば、潤滑剤、防腐剤、安定化剤、保湿剤、乳化剤、浸透圧に影響する塩、緩衝液、着色料、香味料および／または芳香物質など（処方物の（単数または複数の）核酸と有害に相互作用されない）と混合され得る。
水性懸濁物は、この懸濁物の粘性を増大させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含んでもよい。この懸濁物はまた安定化剤を含んでもよい。
別の関連の実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上のアンチセンス化合物または他の活性因子を含んでもよい。２つ以上の合わされた化合物が一緒にまたは連続して用いられてもよい。
［アンチセンス］
本発明はさらに、翻訳レベルでＧＲＫ６などの発現に干渉するように用いることができるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの調製を包含する。好ましくは、アンチセンスおよびリボザイムを用いて、疑わしい標的細胞においてアレスチンについてその親和性を増大する別個の点突然変異を有する、ＧＲＫ６などの発現を干渉することができる。このアプローチは、アンチセンス核酸およびリボザイムを利用して、アンチセンス核酸を用いてｍＲＮＡをマスクすること、またはそれをリボザイムで切断することのいずれかによって、その特定のｍＲＮＡの翻訳をブロックする。
アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｓｃｉ Ａｍ．１９９０ Ｊａｎ；２６２（１）：４０〜６；Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８ Ａｕｇ １；１７２（２）：２８９〜９５を参照のこと）。細胞では、それらは、そのｍＲＮＡにハイブリダイズして、二本鎖分子を形成する。細胞はｍＲＮＡをこの二本鎖型で翻訳しない。従って、アンチセンス核酸は、タンパク質へのｍＲＮＡの発現を干渉する。ＡＵＧ開始コドンにハイブリダイズする約１５ヌクレオチドのオリゴマーおよび分子は、特に有効である。なぜなら、それらは合成することが容易であり、それらを細胞に導入した場合にそれより大きい分子よりも生じる問題が少ないと考えられるからである。アンチセンス方法は、インビトロにおいて多くの遺伝子の発現を阻害するために用いられている（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓｅｋｕｒａ，１９８８；Ｈａｍｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９８８ Ｏｃｔ １；１６８（４）：１２３７〜４５）。
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに対してある程度類似の様式で他の一本鎖ＲＮＡ分子を特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。リボザイムは、特定のｍＲＮＡがそれ自体のイントロンを切除する能力を有するという観察から発見された。これらのＲＮＡのヌクレオチド配列を改変することによって、研究者らは、ＲＮＡ分子における特定のヌクレオチド配列を認識する分子を操作して、それを切断することができた（Ｃｅｃｈ，Ｇｅｎｅ．１９８８ Ｄｅｃ ２０；７３（２）：２５９〜７１）。それらは配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活性化される。
研究者らは、２つのタイプのリボザイムである、テトラヒメナ型および「ハンマーヘッド」型を同定した。（ＨａｓｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，１９８８）テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基配列を認識するが、「ハンマーヘッド」型は、１１〜１８の塩基配列を認識する。認識配列はそれが長いほど、標的ｍＲＮＡ種において排他的に存在する可能性が高くなる。従って、ハンマーヘッド型リボザイムは好ましくは、特定のｍＲＮＡ種を不活性化することに関してテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、そして１８塩基の認識配列は短い認識配列よりも好ましい。
従って、本明細書に記載されるＤＮＡ配列を用いて、ＧＲＫ６およびそのリガンドのｍＲＮＡを切断するリボザイムおよびそれに対するアンチセンス分子を分離し得る。詳細には、アンチセンス分子およびリボザイムは、ＧＰＣＲについてのＧＰＫ６の親和性を変更する変異を有するＧＲＫ６に特に有用であり得る。
［抗体］
本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供する。宿主動物において抗体を生成するための方法も提供される。本発明の方法は、少なくとも１つのＧＲＫ６由来免疫原成分を用いて動物を免疫するステップを包含し、ここでこの免疫原性成分は、配列番号１〜配列番号３、またはその保存的配列もしくは機能保存的変異体のいずれか１つにコードされるポリペプチド；あるいは完全なタンパク質コード配列を含む、任意のＯＲＦ内に含まれるポリペプチドであって、配列番号１〜配列番号３のいずれかが一部を形成するポリペプチド；あるいは配列番号１〜配列番号３のいずれかに含まれるポリペプチド配列；あるいは配列番号１〜配列番号３のいずれかが一部を形成するポリペプチドのうちの１つ以上を含む。宿主動物としては、限定はしないが哺乳動物および鳥類を含む、任意の温血動物が挙げられる。このような抗体は、ＧＲＫ６抗原の量および分布を評価するためのイムノアッセイのための試薬として有用性を有する。
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む抗体、ならびにＧＲＫ６および／またはそれらの生物学的活性フラグメントもしくはサブユニットの生成または活性を調節する薬物は、特定の診断または治療適用を有し得る。例えば、ＧＲＫ６ａ、ＧＲＫ６ｂ、ＧＲＫ６ｃ、ＧＲＫ６ｄまたはそれらのフラグメントもしくはサブユニットを用いて、例えば、融合されたマウス脾臓リンパ球および骨髄細胞を利用するハイブリドーマ技術のような公知の技術によって、種々の細胞媒体において、ＧＲＫ６またはそのサブユニットに対する、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を生成することができる。同様に、本発明の（単数または複数の）ＧＲＫ６の活性を模倣するかまたはアンタゴナイズする小分子を発見または合成することができ、そしてこれは診断および／または治療用のプロトコールにおいて有用であり得る。ＧＲＫ６配列のフラグメントは、ペプチドとして合成的に調製され、そしてキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）に共有結合されてもよいし、またはキャリアタンパク質のコード領域（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ）に直接融合されて、ユニットとして発現されてもよい。このようなコンジュゲートされたキャリアを、抗体を生成することを可能にするために宿主に注射する。この方法を使用して、ＧＲＫ６Ｂスプライス変異体の最後の３０個の固有の残基に対する抗体を作製した。
本発明は同様に、天然に惹起される抗体および組み換え的に調製される抗体を含む、ＧＲＫ６に対する抗体の開発に伸展する。例えば、この抗体を用いて、ＧＲＫ６のサブユニットをコードする（単数または複数の）遺伝子を得るための発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。このような抗体としては、公知の遺伝子技術によって調製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびに二価特異的（キメラ）抗体およびＧＲＫ６活性を調節する能力と組み合わされたさらなる診断用途に適合させる他の機能を含む抗体を挙げることができる。好ましくは、本発明の診断方法において用いられる抗ＧＲＫ６抗体は、アフィニティー精製されたポリクローナル抗体である。さらに好ましくは、この抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。さらに、本明細書において用いられる抗改変ＧＰＣＲ抗体フラグメントについてはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ｖ）またはｓｃＦｖの形態が好ましい。
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製する一般的な方法論は周知である。モノクローナル抗ＧＲＫ６抗体を作成する方法も当分野では周知である。Ｎｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９〜４９５３（１９８３）を参照のこと。代表的には、ＧＲＫ６またはペプチドアナログを、単独で用いるか、または抗ＧＲＫ６モノクローナル抗体を生成するために前に記載された手順において免疫原として、免疫原性キャリアにコンジュゲートさせる。培地への抗体の分泌のためにハイブリドーマについて十分な条件下および時間で培養物を維持する。ＧＲＫ６またはペプチドアナログと免疫反応する抗体を生成する能力についてハイブリドーマをスクリーニングする。次いで抗体含有培地を収集する。次いで、この抗体を周知の技術によってさらに単離してもよい。不死の抗体産生細胞株はまた、融合以外の技術、例えば、発癌性ＤＮＡを用いたＢリンパ球の直接形質転換、またはエプスタイン−バーウイルスを用いたトランスフェクションによって作製できる。例えば、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）を参照のこと。
これらの組成物の調製のために有用な培地は、当分野で周知であり、かつ市販されており、これには合成培養培地、近交系マウスなどを含む。例示的な合成培地は、４．５ｇｍ／ｌグルコース、２０ｍＭ グルタミンおよび２０％ウシ胎仔血清を補充されたダルベッコ最小基本培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．８：３９６（１９５９））である。好ましい近交系マウス株はＢａｌｂ／ｃである。
ポリクローナル抗ポリペプチド抗体を生成するための方法は、当分野で周知である。Ｎｅｓｔｏｒ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，４９３，７９５号を参照のこと。モノクローナル抗体およびその免疫学的に活性なフラグメントは、参照することにより本明細書に組み込まれるＵｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｄ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄａｖｉｄ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）に記載されたハイブリドーマ技術を用いて調製され得る。要するに、モノクローナル抗体組成物が生成されるハイブリドーマを形成するために、骨髄腫または他の自己増殖性の細胞株を、ＧＲＫ６を用いて過免疫された哺乳動物の脾臓から得られたリンパ球と融合する。脾細胞を代表的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００ＭＷを用いて骨髄腫細胞と融合する。融合されたハイブリッドを、ＨＡＴ（ハイポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）補充培地に対するその選択性によって選択する。本発明を実施するのに有用なモノクローナル抗体を生成するためのハイブリドーマを、存在するＧＲＫ６と免疫反応する能力、および標的細胞における指定のＧＲＫ６活性を阻害する能力によって同定する。
［マウスＧＲＫ６遺伝子座の標的化欠失］
ＧＲＫ５ノックアウトについて記載された３つのトリプルロックス（Ｔｒｉｐｌｅ−Ｌｏｘ）ベクターを改変して新しいマルチクローニング部位を得て、１２９／ＳｖＪ株からのマウスＧＲＫ６遺伝子のフラグメントを担持するファージを記載のとおり入手して配列決定した。標的化ベクター（図２Ａ）は、７ｋｂ ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメント（エキソン１０〜１５）、ｌｏｘＰ部位、２．７５ｋｂ ＸｂａＩ−ＮｈｅＩフラグメント（エキソン３〜９）、ｌｏｘＰ部位、ＴＫ−ＮＥＯマーカー遺伝子カセット、ｌｏｘＰ部位および１．３ｋｂ ＸｂａＩ遺伝子フラグメント（エキソン２）を含んだ。
標的されたＥＳ細胞の増殖および選択、ならびにキメラマウスの作製を、Ｂ．Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９４）に記載のとおり行なった。標的化ＤＮＡをＮｏｔＩを用いた消化によって直線化して、ＡＫ７ ＥＳ細胞中にエレクトロポレートした。正常な核型を有する標的化細胞クローンを増殖させて、３．５日目にＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス胚盤胞にマイクロインジェクションして、これを次に、２．５日目に偽妊娠Ｂ６ＳＪＬＦ１／Ｊマウスの子宮に注射した。キメラ創始動物をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させて、標的された「ｌｏｘ」ＧＲＫ６遺伝子を担持するアグーチな仔を作製した。Ｆ１ヘテロ接合体動物を、ＣＭＶ−Ｃｒｅを保有するトランスジェニックマウスと交配した（フロックスド（ｆｌｏｘｅｄ）カセットの欠失を誘導するＣ５７ＢＩ／６Ｊ遺伝子バックグラウンドに戻し交配された。これらの交配の子孫、ＧＲＫ６ノックアウト（ＧＲＫ６−ＫＯ）動物を得て、ここでエキソン３〜９カセットおよびＴＫ−ＮＥＯマーカー遺伝子カセットの両方を欠失させた。エキソン３〜９の欠失によってアミノ末端ＧＲＳ様ドメインのほとんどを欠失するＧＲＫ６、および保存された触媒性ドメインエレメントの半分がもたらされる（すなわち、この遺伝子は不活性である）（図２Ａ）。遺伝子型同定は、野生型および変異体遺伝子座を同時に検出する３つのプライマーを利用するＰＣＲ方法を用いてテールチップＤＮＡにおいて慣用的に行なわれた（図２Ｂ）。
細胞培養およびトランスフェクション：１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＭＥＭ中で、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を３７℃で５％ＣＯ2／９５％空気中で培養した。リン酸カルシウム同時沈殿を用いて適切な発現プラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトした。
ウエスタンブロット。マウス脳領域を氷上で解剖して、液体窒素中で直ちに凍結させた。緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣＩ、ｐＨ ７．４）中でのポリトロンホモジナイゼーション、続いて２００×ｇ２分間その後の２１，０００×ｇ３０分間の遠心分離によって、マウス脳領域から粗膜を調製した。各々のサンプルのアリコート（６０μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液の添加によって可溶化して、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。トランスファーされたタンパク質をポリクローナル抗ＧＲＫ６と共にブロットして、高感度化学発光発色（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）（ＥＣＬ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて可視化した。
免疫組織化学。野生型またはＧＲＫ６−ＫＯマウス（ｎ＝３）を抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）を用いて麻酔して、０．９％生理食塩水を用い、続いて４％パラホルムアルデヒド含有０．１Ｍ ホウ砂緩衝液（４℃でｐＨ９．５）を用いて心臓を経由して灌流させた。脳を１〜３日間の固定後に１０％スクロース中で凍結保護した。遊離の浮遊する冠状または矢状部分の２５μｍを、ＤＡＲＰＰ−３２に対する抗体（マウス，１：５０００，Ｄ９７５２０，ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋ）およびＧＲＫ６に対する抗体（ウサギ，１：５０，ｓｃ−５６６，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）の混合物と４℃で３２時間インキュベートした。第二の免疫反応ステップを、以下の各々の抗体とのインキュベーション（室温で１時間）によって行なった：フルオレセイン−イソチオシアネート標識ヤギ抗ウサギＩｇＧおよびＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣｏｏｌｅｄのＣＣＤデジタルカメラ（Ｃｏｏｌｓｎａｐ−ＦＸ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ，ＰＡ）および画像処理のためのＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ｖ３．０のＩＰＬａｂソフトウェア（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いてレーザー走査Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡（ＬＳＭ−５１０）上でスライドを可視化した。各々のチャネル（デュアルスキャンモード）で画像を別々に得て、１つのチャネルから他方へのシグナル流れ出し（ｂｌｅｅｄ−ｏｖｅｒ）の可能性を排除した。
動物の処置／薬物／挙動。３〜４ヶ月齢の同腹仔野生型（ＷＴ）およびＧＲＫ６変異マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ×１２９／ＳｖＪ）をこれらの実験に用いた。全ての実験において、野生型同腹仔を、変異体マウスのコントロールとして使用して、全ての遺伝子型を同時に評価し、そして各々の動物を単一の試験でだけ用いた。同腹仔野生型、ヘテロ接合体およびノックアウトのマウスの両性についての水平方向および垂直方向の活動度を、Ｏｍｎｉｔｅｃｈ Ｄｉｇｉｓｃａｎ 活性モニター（４２ｃｍ2）で測定した。運動性活動度を５分間隔で測定して、データ解析のために累積的カウントをとった。コカイン、モルフィンおよびβ−フェニルエチルアミンの運動性挙動に対する効果を評価するために、マウスを活動度モニターに入れて、３０〜６０分後に、それらのマウスに薬物またはヒビクルをｉ．ｐ．（腹腔内）注射し、運動性活動度をその後９０分間モニターした。コカイン感作実験では、コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いてマウスを５日間、慢性的に処置し、コカインのチャレンジ用量に対するそれらの応答を７日目に解析した。ドーパミン枯渇マウスにおける直接ドーパミンアゴニストの効果を解析するため、レセルピン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．実験の２０時間前）およびβメチル−ｐ−チロシン（２５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．実験の１時間前）の組み合わせを用いて動物を事前処置した。この処置によって、野生型およびＧＲＫ６−ＫＯマウスの両方において、線条体ドーパミンの０．７５％未満までの枯渇が得られた。マウスをこの処理によって完全に免疫した。ドーパミン枯渇マウスを、ビヒクルまたはＤ１／Ｄ２ドーパミンレセプターアゴニストであるアポモルフィン（０．２〜１ｍｇ／ｋｇ，ｓ．ｃ．）を用いて処置して、運動性活動度を上記のように直ちに解析した。全ての正確な実験において、各々の動物には試験薬物を１回注射だけ投与した。この試験で提示された全てのデータは平均±ＳＥＭとして表している。
神経化学的アセスメント。モノアミン解析のために、脳領域を解剖し、モノアミンを抽出して、記載のように電気化学的検出を備えた高処理能力液体クロマトグラフィーを用いて、ドーパミン、セロトニン（５−ヒドロキシトリプトアミン、５−ＨＴ）および代謝物３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）、ホモバニリン酸（ＨＶＡ）および５−ヒドロキシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）のレベルを解析した。インビボ微小透析実験を行なうために、マウスを麻酔して透析プローブを右の線条体に移植した。外科手術の２４時間後、この透析プローブをシリンジポンプに接続して、人工的なＣＳＦで灌流させた。自由に運動しているマウスにおいて、線条体における基礎的な細胞外ドーパミンレベルの決定のために、定量的な「低灌流」速度（７０ｎｌ／分）の微小透析実験を行なった。線条体における細胞外ドーパミンレベルに対するコカインの効果の解析のために、自由に運動している動物において、「従来の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）」微小透析法（灌流速度１μｌ／分）を使用した。
線条体スナプトソームにおける［3Ｈ］−ドーパミン取り込みを測定するために、野生型マウスおよびＧＲＫ６−ＫＯマウス由来の線条体組織をスクロース緩衝液（０．３２Ｍスクロース、４．２ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中でホモジナイズした。ホモジネートを１，５００×ｇで１５分間遠心分離して、上清を収集して１０，０００×ｇで１５分間再遠心分離した。得られたペレットを洗浄して、緩衝液（０．０２％アスコルビン酸、５０μＭパーギリン、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１２５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭグルコース；ｐＨ ７．４）中で再懸濁した。シナプトソームサンプルを３７℃で２分間、２０ｎＭの［3Ｈ］ドーパミン（３１．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と共にインキュベートした。５μＭマジンドールの存在下で非特異的取り込みを行なった。次いで、３ｍｌの冷却洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ2、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ グルコース，ｐＨ ７．４）を添加することによってインキュベーションを停止して、ガラスマイクロファイバーフィルターを通して減圧濾過した。次いで、このフィルターを、冷却洗浄緩衝液を用いて２回洗浄して、シンチレーションカクテルを含むバイアル中に入れた。
インビボおよびインビトロにおける［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合によるドーパミンレセプター結合の解析。インビボ実験において、ＧＲＫ６−ＫＯマウスおよび野生型マウス由来の線条体膜に対するＤ２／Ｄ３ドーパミンレセプターアゴニストであるキンピロール刺激［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を以前に記載のとおり評価した。Ｄ２およびＤ３ドーパミンレセプター調節におけるＧＲＫ６のインビトロの役割を直接評価するため、培養した細胞膜に対するドーパミン刺激［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いた。ＧＲＫ６の有無において、Ｄ２ＲまたはＤ３Ｒ／Ｇｏαを用いてＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトした。Ｄ２Ｒについては、２０μｇの細胞膜タンパク質を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３μＭ ＧＤＰ、および０．１ｎＭ［35Ｓ］ＧＴＰγＳを含有する緩衝液中において室温で１時間インキュベートした。Ｄ３Ｒについては、２０μｇの細胞膜タンパク質を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１．８ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０μＭ ＧＤＰ、０．２ｎＭ［35Ｓ］ＧＴＰγＳ、および１ｍＭデオキシコール酸ナトリウムを含有する緩衝液中において３０℃で２時間インキュベートした。インキュベーション混合物をＧＦ／Ｂフィルターで濾過して、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を用いて洗浄した。
［重要なドーパミン作動性シグナル伝達分子を含むニューロン集団で発現されたＧＲＫ６］
薬物の乱用に対する感作におけるＧＰＣＲ脱感作機構の役割を理解するために、本発明者らは、コカイン応答およびドーパミンレセプター機能における変化について不活性なＧＲＫ遺伝子を保有するマウスを試験することを開始した。以前の組織学的検査では、ＧＲＫ６ ｍＲＮＡが、主なドーパミン作動性領域、例えば、黒質線条体ならびに背側および腹側の線条体を含む多くの脳領域で発現されることが示されている。線条体におけるＧＲＫ６ ｍＲＮＡの発現レベルは、他のＧＲＫ（ＧＲＫ２、ＧＲＫ３およびＧＲＫ５）のレベルより高いことが見出されており、これによって、ＧＲＫ６が、この脳領域では優先的なレセプターキナーゼであり得ることが示唆された。免疫組織化学を用いるＧＲＫ６タンパク質の発現パターンの詳細な検討によって、背側および腹側の両方の線条体におけるほとんどの細胞においてこのキナーゼの発現が明らかになった（図１）。詳細には、ＧＲＫ６タンパク質は、ＤＡＲＰＰ−３２（ドーパミンおよびサイクリックＡＭＰで調節されるリンタンパク質、見かけの分子量３２，０００Ｄａ）、Ｄ１様およびＤ２様ドーパミンレセプターの両方によって媒介されるドーパミン作動性シグナル伝達に関与する重要な分子、ならびに哺乳動物線条体の中度のサイズの突起状ＧＡＢＡニューロンの表現型マーカーを発現する同じニューロン集団において見いだされた（図１）。これらのニューロンはドーパミン作動性入力を受ける主な線条体細胞群に相当しており、嗜癖の細胞機構に決定的に関与すると考えられる。さらに、ＧＲＫ６タンパク質の濃密な発現が、ドーパミン受容性線条体細胞の別の主な群に相当する、大型の突起状コリン作動性介在ニューロンの集団において検出された。
図１は、ＧＲＫ６がＤＡＲＰＰ−３２を発現する線条体ニューロンに存在することを図示する。上部左側：免疫蛍光解析によって、ＷＴマウスの線条体ニューロンにおけるＧＲＫ６免疫反応性が明らかになる（十字縫合から＋０．７４）。上部右側：ＧＲＫ６−ＫＯマウスの線条体ニューロンにおけるＧＲＫ６免疫反応性の欠失。下部左側：ＷＴマウスの線条体ニューロンにおけるＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性。下部右側：ＧＲＫ６およびＤＡＲＰＰ−３２は、ＷＴマウスの線条体において同じニューロン集団に同時局在する。市販の抗ＧＲＫ６抗体（ウサギ、１：５０、ｓｃ−５６６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を用いてＧＲＫ６免疫反応性を検出した。別の抗ＧＲＫ６抗血清を用いて同様の観察が得られた。ＧＲＫ６はまた、ＤＡＲＰＰ−３２を発現しないが、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体で標識され得る大型のコリン作動性線条体細胞で発現されることに注目のこと。目盛りのバーは５０μｍに等しい。
［野生型マウスと比べたＧＲＫ６トランスジェニックマウスのドーパミン誘導性の運動性応答を解析する方法］
マウスＧＲＫ６遺伝子を、胚性幹細胞における相同組み換えによって標的した（図２Ａ〜Ｃ）。ヘテロ接合体およびホモ接合体のＧＲＫ６−ＫＯマウスは生存可能であって、全体に解剖学上も挙動上も異常を示さないが、ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、リンパ球走化性の低下を示した。運動性活動度試験において、チャレンジしていないノックアウトマウスは、水平方向（図３Ａ、Ｂ）でも垂直方向でも活動度において、野生型同腹仔と相違はなかった。しかし、急性のコカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）投与によって、ＧＲＫ６変異マウスでは顕著に増大した運動性応答が生じた（図３Ａ、Ｂ）。このパラダイムでは、ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、野生型同腹マウスにおいてよりも、コカイン（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に対する応答において、水平（図３Ａ、Ｂ）および垂直方向の活動度で測定した場合、さらに顕著でかつ長時間作用性の運動性活動度を示した。興味深いことに、ＧＲＫ６欠失についてのマウスヘテロ接合性は、ＧＲＫ６「ヌル（ｎｕｌｌ）」マウスと同程度にコカインに対して応答性であった（図３Ａ、Ｂ）。このことは、ＧＲＫ６レベルまたは活性におけるわずかな変化でさえ、有意な挙動変化を生じ得ることを示唆した。ヘテロ接合性マウスおよびノックアウトマウスの両方において、コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）によって誘導された活性化の程度は、同腹仔野生型マウスに対してだけでなく、変異体を生成するために用いた両方の親系統（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊおよび１２９／ＳｖＪ）の両方のマウスに対しても、実質的に高かった。重要なことに、コカインに対するこのような過敏はＧＲＫ５−ＫＯマウスでは観察されなかった。
図２。マウスＧＲＫ６遺伝子の標的化不活性化。野生型ＧＲＫ６遺伝子座、ＧＲＫ６／ｌｏｘ標的化ベクター、組み込まれた標的構築物、およびＣｒｅリコンビナーゼ欠失ＧＲＫ６遺伝子座（ＧＲＫ６−ＫＯ）の模式図である。ＧＲＫ６エキソンを白抜きの枠囲みとして示しており、第一のコードエキソンから番号付けしている。ＬｏｘＰ部位を、黒い三角として、そしてサザンブロットプローブの位置を斜線の枠囲みとして示す。関連のＮｈｅＩ制限部位を示す。Ｂは、標的化ＧＲＫ６−ＫＯマウスの遺伝子型同定。野生型およびＧＲＫ６−ＫＯ遺伝子座を、「方法」に記載されるとおり三重鎖ＰＣＲ増幅によって識別した。示されるとおり、ＷＴ ＧＲＫ６遺伝子座によって４６０ｂｐのバンドが得られるが、ＧＲＫ６−ＫＯ遺伝子座によっては６１０ｂｐのバンドが得られる。Ｃは、ウエスタンブロットによるＧＲＫ６タンパク質発現。野生型およびＧＲＫ６−ＫＯ動物の脳幹および線条体由来の膜タンパク質を、抗ＧＲＫ６抗血清を用いてイムノブロットに供した。ＧＲＫ６−ＫＯホモ接合体動物は、野生型動物に比べて６８−ｋＤａの免疫反応性のバンドの欠失を示す（矢印）。６９−ｋＤａのバンドは、非特異的相互作用である。なぜなら、そのバンドは、ＧＲＫ５およびＧＲＫ４ホモ接合体動物に存在して、かつ他のＧＲＫ６抗血清によっては認識されないからである。
図３。ＧＲＫ６変異体マウスにおけるコカイン過敏性。Ａは、コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））投与に対するＧＲＫ６変異体（ＷＴ：ｎ＝２４；ＧＲＫ６ヘテロ接合性：ｎ＝２１；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝１５）マウスの運動性応答。ＧＲＫ６ヘテロ接合性マウスおよびＧＲＫ６−ＫＯのマウスは、コカインに対する応答において、ＷＴコントロールから有意に異なる（ｐ＜０．００１、二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）。Ｂは、ＧＲＫ６−ＫＯマウス、ヘテロ接合性マウスおよびＷＴのマウス（１群あたりｎ＝８〜２４）の水平方向の活動度に対するコカイン（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の効果の用量応答曲線である。ＧＲＫ６ヘテロ接合性マウスおよびＧＲＫ６−ＫＯのマウスの両方とも、コカインに対する応答ではＷＴコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ）。Ｃは、ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおけるコカイン感作。マウス（ＷＴ：ｎ＝１６；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝１４）に５日間、毎日コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射して、最終の注射の４８時間後にこの動物に同じ用量の薬物をチャレンジした。運動性活動度の測定を、１日目（上部左側）および７日目（上部右側）に行なった。二元ＡＮＯＶＡによって、７日目対１日目のＷＴマウスの応答の間の有意差（ｐ＜０．００１）が明らかになったが、ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおいてはこのような相違は観察されなかった。さらに、感作されたＷＴマウスにおける応答（７日目）は、１日目または７日目のいずれかにおけるＧＲＫ６−ＫＯマウスの応答とも異なっていた。１日目および７日目のコカイン投与後の９０分間にマウスが移動した累積距離を下部のパネルに示す。１日目の群についてのＷＴ同腹仔に対して、**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。コカイン投与後、１５分、３０分または６０分にわたる累積距離の解析によって、解析されたいずれの期間でも１日目のＷＴマウスとＧＲＫ６−ＫＯマウスとの間の有意な相違（ｐ＜０．００１）が明らかになるが、このような相違は１日目でも７日目でもＷＴ感作されたマウスとＧＲＫ６−ＫＯマウスとの間では観察されなかった。感作されたＧＲＫ６−ＫＯマウスでは（７日目）、コカインに応答する運動性は、注射後３０分、６０分または９０分の期間で解析した場合、１日目の運動性に比較して増強されなかった。しかし、コカイン後最初の１５分間の解析によって、７日目対１日目ではＧＲＫ６−ＫＯマウスが移動した総距離の適度の増大が明らかになった（ＧＲＫ６−ＫＯ、１日目：３７８６±４５９ｃｍ／１５分；７日目：５３８６±５７１ｃｍ／１５分、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定；比較として、ＷＴマウスの移動距離、１日目：１６８６±２５２ｃｍ／１５分；７日目：４０７７±４４３ｃｍ／１５分、ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。
［反復性のコカイン投与に対する野生型およびＧＲｋ６トランスジェニック動物の応答］
コカインの反復性投与は、精神運動応答の進行性の増強を生じることが知られている。この現象は、「行動感作」または「逆耐性」と称されているが、薬物常用に関連するニューロン適応に関連すると考えられる。動物実験では、これはしばしば、同じ用量のコカインを用いた反復性の間欠処置に対する運動性応答を解析することによってモデル化される。ＧＲＫ６−ＫＯ動物がコカインに対してさらに感作され得るか否かを決定するために、このようなコカイン感作パラダイムを使用した。マウスには５日連続して毎日コカインを注射して、７日目にこの薬物に対するそれらの応答について試験した。処置の１日目に比べて、７日目には、野生型動物は、コカインに対して運動性応答の増強（約２倍）を示した（図３Ｃ）。対照的に、ＧＲＫ６−ＫＯ動物は、感作プロトコール後の野生型マウスと同じ程度、１日目にコカインに対して応答性であった（図３Ｃ）。予想どおり、ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、この感作領域によって実質的に影響が少なかった。実際、９０分間の総移動距離の解析は、１日目と７日目との間で有意な相違を示さなかった（図３Ｃ）。それにもかかわらず、コカイン投与後最初の１５分には、感作されたＧＲＫ６−ＫＯマウスは、わずかな応答の増強を示した（図３Ｃ、説明文）。まとめると、これらのデータによって、薬理学的処理のない条件ではＧＲＫ６−ＫＯマウスは、コカインに対して既に本質的に「事前感作（ｐｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ）」されているかもしれないということが示される。
［ドーパミンの増大に対するＧＲＫ６調節増強応答］
ＧＲＫ６トランスジェニックマウスの運動性応答は、アンフェタミンおよびβ−フェニルエチルアミンによって誘導された、ドーパミン増大の存在下で増強された。コカインの運動性刺激作用はドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）の遮断によって媒介され、結果として線条体および関連の脳領域における細胞外ドーパミンの上昇が生じることは、十分証明されている。ＤＡＴとの複雑な相互作用を介して中枢性のドーパミン作動性の伝達を顕著に増強することが公知の別の精神刺激薬はアンフェタミンである。コカインと同様に、アンフェタミン誘導性の運動性活動度は、ＧＲＫ６ヘテロ接合性マウスおよび「ヌル（ｎｕｌｌ）」マウスの両方で有意に増強される（図４Ａ）。さらに、ヘテロ接合性およびホモ接合性のＧＲＫ変異マウスの両方において、内因性「微量アミン（ｔｒａｃｅ ａｍｉｎｅ）」β−フェニルエチルアミンが投与された場合、運動性応答の増強が観察された（図４Ｂ）。β−フェニルエチルアミンの刺激作用の機能および機構は完全には決定されていないが、β−フェニルエチルアミンは主に、ニューロン内の貯蔵から細胞外空隙へのドーパミンのＤＡＴ媒介性流出を介して「内因性アンフェタミン」として作用する。従って、インビボの微小透析実験によって、ＧＲＫ６−ＫＯおよび野生型マウスの両方において、β−フェニルエチルアミン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）が強力であるが一過性の線条体細胞外ドーパミンの上昇を、同じ程度まで（６倍）誘導することが明らかになった。さらに、運動性活性および細胞外ドーパミンの対応する上昇は、ＤＡＴを欠くマウスでは観察されなかった。従って、β−フェニルエチルアミンに対するＧＲＫ６変異体の運動性応答の増強はまた、ドーパミン作動性活性に対する応答性の増大と一致している。
図４。ＧＲＫ６変異体マウスにおける、ｄ−アンフェタミンおよびβ−フェニルエチルアミンの運動性効果の増強。Ａは、ｄ−アンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に対する応答における、ＷＴ（ｎ＝１０）およびＧＲＫ６変異体（ＧＲＫ６ヘテロ接合性：ｎ＝１５；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝９）の水平方向の運動性応答の時間経過。ＧＲＫ６ヘテロ接合性およびＧＲＫ６−ＫＯのマウスは、ｄ−アンフェタミンに対する応答においてＷＴコントロールとは有意に異なる。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。Ｂは、β−フェニルエチルアミン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に応答する、ＷＴ（ｎ＝６）およびＧＲＫ６変異体（ＧＲＫ６ヘテロ接合性：ｎ＝１１；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝６）の水平方向の運動性応答の時間経過。ＧＲＫ６ヘテロ接合性およびＧＲＫ６−ＫＯのマウスは、β−フェニルエチルアミンに対する応答においてＷＴコントロールとは有意に異なる。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。
［ＧＲＫ６トランスジェニックマウスは、測定された神経化学的パラメーターにおいて野生型マウスとは異なった］
精神刺激薬に対する挙動上の過敏性は、細胞外ドーパミンレベルの増大をもたらす、これらのマウスにおけるシナプス前ドーパミン作動性機能の変更によって、または変更されたシナプス後レセプター応答性のいずれかによって説明できる。変異体マウスにおける線条体シナプス前ドーパミン作動性伝達の状態を試験するために、１セットの神経化学アプローチを用いた（図５）。ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、試験したいずれの神経化学パラメーターにおいても野生型コントロールと異なることはなかった。詳細には、組織ドーパミンおよび代謝内容物、シナプトソームドーパミン取り込み速度、ならびに基礎的なおよびコカイン刺激細胞外ドーパミンレベルは、インビボの微小透析によって評価される場合、変異体マウスにおいて影響されなかった（図５Ａ〜Ｄ）。従って、ＧＲＫ６変異における精神刺激薬に対する顕著な運動性過敏性は、シナプス前ドーパミン機能における測定可能な変更を伴わずに生じる。
図５。ＷＴマウスおよびＧＲＫ６−ＫＯのマウスにおける、シナプス前ドーパミン機能の解析。Ａは、ＨＰＬＣ−ＥＣによって測定した、ＧＲＫ６−ＫＯのマウスおよびＷＴの同腹仔マウスにおける、ドーパミン、５−ＨＴおよびその代謝物の線条体組織レベル（ＷＴ：ｎ＝５；ＧＲＫ６：ｎ＝７）。Ｂは、ＧＲＫ６−ＫＯマウスおよびＷＴマウス由来の線条体シナプトソームにおける［3Ｈ］ドーパミン取り込み（ＷＴ：ｎ＝４；ＧＲＫ６：ｎ＝４）。Ｃは、定量的な低灌流速度微小透析を用いて測定された、自由運動マウスの線条体における細胞外ドーパミンレベル（ＷＴ：ｎ＝６；ＧＲＫ６：ｎ＝９）。Ｄは、自由運動マウスの線条体における細胞外ドーパミンレベルに対する、生理食塩水およびコカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の効果。データは、薬物投与の前に収集した少なくとも３つのサンプルにおいて測定されたドーパミンの平均レベルの割合として示す（生理食塩水、ＷＴ：ｎ＝５；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝４；コカイン，ＷＴ：ｎ＝７、ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝６）。
［ＧＲＫ６調節によって、そのＧタンパク質にさらに効率的に結合されるドーパミンレセプターが得られる］
ＧＲＫ６の非存在下における基礎的なドーパミンレセプター感受性における潜在的な変化を評価するため、［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合アッセイを用いてＧタンパク質に対するドーパミンレセプター結合の解析を行なった。Ｄ２／Ｄ３ドーパミンレセプターアゴニストであるキンピロールを用いる線条体ドーパミンレセプター結合の直接評価によって、ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおいて、これらのレセプターは、そのＧタンパク質にさらに効率的に結合されることが明らかになった（図６Ａ）。
従って、これによって、インタクトな動物における基本的な条件下では、ドーパミンレセプターはＧＲＫ６作用によって持続性に阻害され、ＧＲＫ６−ＫＯ動物におけるこの阻害の欠失によって直接、レセプター過敏症（さらに高い結合）がもたらされることが示唆される。重要なことに、リガンド結合研究では、Ｄ２様ドーパミンレセプター（［3Ｈ］ラクロプリド）結合において任意の遺伝子型の相違を実証することはできなかった（ＷＴにおけるＢｍａｘ：１２３±１８、ＧＲＫ６−ＫＯ：タンパク質１ｍｇあたり１１１±１９フェントモル）。さらに、ＧＲＫ６−ＫＯマウスのＧαタンパク質（Ｇi/o/z）レベルは、イムノブロットアッセイによって評価した場合、変更されなかった。インビトロ系におけるドーパミンレセプターの調節におけるＧＲＫ６の役割を確認するために、ＨＥＫ２９３細胞においてＤ２またはＤ３ドーパミンレセプター（Ｄ２ＲまたはＤ３Ｒ）のいずれかと共にＧＲＫ６を同時発現して、ドーパミン刺激性［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の解析を行なった。インビボ観察と一致して、これらのレセプターをＧＲＫ６と同時発現した場合、実質的に障害されたＧタンパク質結合が観察された（図６Ｂ、Ｃ）。さらに、ＧＲＫ６の同時発現は、Ｄ２ＲまたはＤ３Ｒに対するβアレスチン２の基礎的な（未刺激の）転位を増強した。従って、インビトロ系では、ＧＲＫ６は、βアレスチン２結合の増大を伴うＤ２／Ｄ３ドーパミンレセプターの脱感作の基礎的なレベルを誘導すると思われる。これは、膜会合ＧＲＫ６が基礎的な（活性化依存性）レセプターリン酸化を誘導する他のレセプター系において示された多くの以前の研究と一致しており、そしてこの基本的なレセプターリン酸化のトーンが、少なくともドーパミンレセプターについては生理学的に重要であることを示唆する。
図６。ＧＰＫ６レベルの変更は、Ｇタンパク質に対するドーパミンレセプター結合を調節する。Ａは、変異体および野生型マウス由来の線条体膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＰ結合。総［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、各々のポイントから未刺激の［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を差引きした後に表現する。キンピロールを用いた刺激後、線条体膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を決定した。刺激された［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合のパーセントを、未刺激の［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を各々のアゴニスト刺激ポイントへ分割することによって算出した。非線形回帰を用いて、ＥＣ50パラメーターを算出した（ＷＴ：２．０±０．５μＭ；ＧＲＫ６−ＫＯ：１．９±０．６μＭ）。アゴニスト刺激のない場合、基礎的な［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、遺伝子型の間で異なった。ＷＴおよびＧＲＫ６−ＫＯの線条体組織を同時に解析する実験を三連で実施した（１群あたりｎ＝８）。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ、ＧＲＫ６−ＫＯ対ＷＴコントロール。Ｂは、Ｄ２Ｒを発現するＨＥＫ−２９３細胞膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、ドーパミンでの刺激後に決定した。少なくとも２つの独立した実験を三連で行なった。データ処理のために同じ手順を使用した。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。Ｃは、Ｄ３Ｒ／Ｇｏαを発現するＨＥＫ−２９３細胞膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、ドーパミンでの刺激後に決定した。少なくとも２つの独立した実験を三連で行なった。データ処理のために同じ手順を使用した。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。
［ＧＲＫ６調節はドーパミンの挙動上の効果を増強する。ドーパミンレセプター応答性は、ＧＲＫ６変異体マウスにおいて増強される］
線条体Ｄ２／Ｄ３ドーパミンレセプターは、シナプス前ドーパミン神経末端およびシナプス後線条体細胞の両方に局在している。ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおけるシナプス後ドーパミンレセプター応答性を直接評価するため、非選択性ドーパミンアゴニストアポモルフィンの効果を、内因性のドーパミン神経伝達が存在しないドーパミン枯渇マウスにおいて試験した（図７）。顕著なことに、用いられるパラダイムは、ドーパミン神経支配の顕著な損失が生じる、パーキンソン病において有効な薬物を試験する動物モデルとして、元来開発された。野生型マウスおよびＧＲＫ６−ＫＯマウスを、レセルピン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で処置してドーパミンを含むモノアミンの神経細胞内貯蔵を枯渇させ、αメチル−ｐ−チロシン（２５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いてドーパミン合成を阻害した（それぞれ、実験の２０時間および１時間前）。変異体およびコントロールのマウスの両方を、この処置によって完全に固定した。ドーパミン枯渇の野生型マウスおよび変異体マウスにおける運動性は、Ｄ１／Ｄ２ドーパミンレセプターアゴニストであるアポモルフィン（０．２〜１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の投与によって回復された（図７Ａ〜Ｃ）。ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、野生型同腹仔に比較してアポモルフィンに対する運動性応答の顕著な増強を示し、このことはシナプス後ドーパミンレセプター応答性がＧＲＫ６変異マウスで増強されることを直接実証する。さらに、これらのデータによって、ＧＲＫ６レベルまたは活性における低下が、この動物モデルにおけるドーパミンアゴニストの挙動上の効果を増強し得ることが示唆される。
図７。ドーパミンアゴニスト効果は、ドーパミン欠失されたＧＲＫ６−ＫＯマウスにおいて増強される。脳のドーパミンを枯渇させるために、「材料および方法」に記載されるとおり、レセルピン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）およびα−メチル−ｐ−チロシン（２５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）の組み合わせを用いて動物を処置した。Ａは、ドーパミン枯渇された野生型マウス（ｎ＝１１）およびＧＲＫ６−ＫＯマウス（ｎ＝７）の水平方向の活動度（カウント）に対するアポモルフィン（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の効果の時間経過。ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、ＷＴコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．００１、２次元ＡＮＯＶＡ）。ＢおよびＣは、ドーパミン枯渇された野生型マウスおよび変異体マウス（１群あたりｎ＝６〜１１）の運動性に対するアポモルフィン（０．２〜１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の効果の用量反応。ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、水平方向の活動度カウント（Ｂ）および総移動距離（Ｃ）の両方に関して、アポモルフィンによってさらに影響を受けたことに注目のこと。水平方向の活動度カウント（Ｂ）について、野生型群に対して、ｐ＜０．００１、そして総移動距離（Ｃ）測定について、ｐ＜０．０５、２元ＡＮＯＶＡ。
［ＧＲＫ６調節は、パーキンソン病を処置する化合物の有効性を増大した］
ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおけるシナプス後ドーパミン（ＤＡ）レセプター応答性を直接評価するために、非選択性のＤＡアゴニストであるアポモルフィンの効果を、内因性の神経伝達のないＤＡ枯渇マウスで試験した。用いたパラダイムはＡ．Ｃａｒｉｓｓｏｎによって、パーキンソン症における薬物、例えば、ドーパミン前駆体Ｌ−ＤＯＰＡまたは直接のドーパミンレセプターアゴニスト、例えばアポモルフィンの有効性を試験するためのモデルとして開発された（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。マウス（１群あたりｎ＝７〜１２）を、レセルピン（５ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）で処置して、ＤＡを含むモノアミンの神経内貯蔵を枯渇させ、αメチル−ｐ−チロシン（２５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を用いてＤＡ合成を阻害させた（それぞれ、実験の２４時間および１時間前）。マウスを、この処置によって完全に固定した。ＤＡ枯渇の野生型マウスにおける運動性は、アポモルフィン（０．２〜０．５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の投与によって回復された（図８および図９）。ＧＲＫ６−ＫＯおよびヘテロ接合性マウスの両方は、アポモルフィンに対する運動性応答の顕著な増強を示し（０．２および０．５ｍｇ／ｋｇの両方、ｓ．ｃ．（皮下注射）アポモルフィンについて、ｐ＜０．０１（対野生型群））、このことはＧＲＫ６レベルまたは活性における低下が、パーキンソン病の動物モデルにおけるＤＡアゴニストの挙動上の効果を増強し得ることを示唆した。従って、これらのデータによって、薬理学的アプローチまたは遺伝子的アプローチのいずれかによってＧＲＫ６の量または活性を調製することが、パーキンソン病において、内因性ドーパミンまたは外因性ドーパミンの模倣性因子、例えば、Ｌ−ＤＯＰＡの有効性を増大するために有用であることが実証される。
まとめると、これらの結果によって、シナプス後Ｄ２／Ｄ３ドーパミンレセプターがＧＲＫ６の生理学的標的であること、およびアゴニスト刺激に対する過敏性は、ＧＲＫ６の存在において線条体ニューロンで生じ得ることが示される。しかし、シナプス前Ｄ２／Ｄ３ドーパミンの「自己受容体」および／または他のサブタイプのドーパミンレセプターがまた、ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおいて影響され得るということが考えられるはずである。さらに、脳におけるＧＲＫ６の広範な発現によって、複数のレセプタータイプがこのキナーゼの生理学的標的であり得ることが示唆される；ＧＲＫ６変異体マウスにおいて影響されたレセプターのポートフォリオを確立するためには詳細な検討が必要である。
本研究において、本発明者らは、ＧＰＣＲ特異的キナーゼのうちの１つであるＧＲＫ６によるドーパミンレセプターの直接調節が、薬物の乱用に対するレセプターの感受性および応答が制御され得る重要な決定要因であることを見出す。マウスにおけるＧＲＫ６の単一対立遺伝子不活性化が遺伝子の完全なノックアウトに対して同一の表現型を生じるという観察によって、ヒトＧＲＫ６遺伝子におけるわずかな対立遺伝子の変動または変化したＧＲＫ６活性でさえ、ドーパミン作動性機能に影響する精神刺激薬および他の薬物に対する個々の感受性に寄与し得るという可能性が高まる。さらに、ドーパミン機能不全に関連する他の脳障害における、ＧＲＫ６媒介性ドーパミンレセプター調節についての役割は、検討する関心となるものである。詳細には、パーキンソン病についての新規な処置ストラテジーの発達についてのこれらの知見の可能性は注目に値する。
本発明は、種々の特定の物質、手順および実施例を参照して本明細書において記載および図示されているが、本発明は、その目的のために選択された物質の特定の物質の組み合わせおよび手順には限定されないことが理解される。このような詳細な説明の多くのバリエーションは、当業者によって理解されるとおり暗示され得る。
以下は、上記の開示、そして詳細には実験手順および考察に関連する書類の列挙である。以下の書類、ならびに前述のテキストに参照される任意の文書は、その全体が参照することにより組み込まれるとみなされるべきである。
Figure 2005535317
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ＧＲＫ６が、ＤＡＲＰＰ−３２を発現する線条体ニューロンに存在することを実証する。上部左側：免疫蛍光解析によって、ＷＴマウスの線条体ニューロンにおけるＧＲＫ６免疫反応性が明らかになる（十字縫合から＋０．７４）。上部右側：機能的なＧＲＫ６遺伝子を欠くマウス（ＧＲＫ６−ＫＯマウス）の線条体ニューロンにおけるＧＲＫ６免疫反応性の欠失。下部左側：ＷＴマウスの線条体ニューロンにおけるＤＡＲＰＰ−３２免疫反応性。下部右側：ＧＲＫ６およびＤＡＲＰＰ−３２が、ＷＴマウスの線条体において同じニューロン集団に同時局在することが、２つの左パネルのカラー画像のオーバーレイによって明らかになる。 マウスＧＲＫ６遺伝子の標的活性化を示す。図２Ａは、野生型マウスＧＲＫ６遺伝子座、ＧＲＫ６／ｌｏｘ標的化ベクター、組み込まれた標的構築物、およびＣｒｅリコンビナーゼ欠失ＧＲＫ６遺伝子座（ＧＲＫ６−ＫＯ）の模式図である。ＧＲＫ６エキソンを白抜きの枠囲みとして示しており、第一のコードエキソンから番号付けしている。ＬｏｘＰ部位を、黒い三角として、そしてサザンブロットプローブの位置を斜線の枠囲みとして示す。関連のＮｈｅＩ制限部位を示す。図２Ｂは、標的化ＧＲＫ６−ＫＯマウスの遺伝子型同定を示す。野生型およびＧＲＫ６−ＫＯ遺伝子座を三重鎖ＰＣＲ増幅によって識別した。示されるとおり、ＷＴ ＧＲＫ６遺伝子座によって４６０ｂｐのバンドが得られるが、ＧＲＫ６−ＫＯ遺伝子座によっては６１０ｂｐのバンドが得られる。図２Ｃは、ウエスタンブロットによってＧＲＫ６タンパク質発現を図示する。野生型およびＧＲＫ６−ＫＯ動物の脳幹および線条体由来の膜タンパク質を、抗ＧＲＫ６抗血清を用いてイムノブロットに供した。ＧＲＫ６−ＫＯホモ接合体動物は、野生型動物に比べて６８−ｋＤａの免疫反応性のバンドの欠失を示す（矢印）。６９−ｋＤａのバンドは、非特異的相互作用である。なぜなら、そのバンドは、ＧＲＫ５およびＧＲＫ４ホモ接合体動物に存在して、かつ他のＧＲＫ６抗血清によっては認識されないからである。 ＧＲＫ６変異体マウスにおけるコカイン過敏性を図示する。図３Ａは、コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．））投与に対するＧＲＫ６変異体（ＷＴ：ｎ＝２４；ＧＲＫ６ヘテロ接合性：ｎ＝２１；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝１５）マウスの運動性応答を示す。ＧＲＫ６ヘテロ接合性およびＧＲＫ６−ＫＯのマウスは、それらの野生型同腹仔よりも大きい運動性挙動を示し、ＷＴコントロールから有意に異なる（ｐ＜０．００１、二元分散分析（ＡＮＯＶＡ）。図３Ｂは、ＧＲＫ６−ＫＯ、ヘテロ接合性マウスおよびＷＴマウス（１群あたりｎ＝８〜２４）の水平方向の活動度に対するコカイン（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の効果の用量応答曲線である。ＧＲＫ６ヘテロ接合性およびＧＲＫ６−ＫＯのマウスの両方とも、コカインに対する応答ではＷＴコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ）。図３Ｃは、ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおけるコカイン感作を図示する。マウス（ＷＴ：ｎ＝１６；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝１４）に５日間、毎日コカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を注射して、最終の注射の４８時間後にこの動物に同じ用量の薬物をチャレンジした。運動性活動度の測定を、１日目（上部左側）および７日目（上部右側）に行なった。二元ＡＮＯＶＡによって、７日目対１日目のＷＴマウスの応答の間の有意差（ｐ＜０．００１）が明らかになったが、ＧＲＫ６−ＫＯマウスにおいてはこのような相違は観察されなかった。さらに、感作されたＷＴマウスにおける応答（７日目）は、１日目または７日目のいずれかにおけるＧＲＫ６−ＫＯマウスの応答とも異なることはなかった。１日目および７日目のコカイン投与後の９０分間にマウスが移動した累積距離を下部のパネルに示す。１日目の群についてのＷＴ同腹仔に対して、**ｐ＜０．０１；***ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。 コカイン投与後、１５分、３０分または６０分にわたる累積距離の解析によって、解析されたいずれの期間でも１日目のＷＴマウスとＧＲＫ６−ＫＯマウスとの間の有意な相違（ｐ＜０．００１）が明らかになるが、このような相違は１日目でも７日目でもＷＴ感作されたマウスとＧＲＫ６−ＫＯマウスとの間では観察されなかった。感作されたＧＲＫ６−ＫＯマウスでは（７日目）、コカインに応答する運動性は、注射後３０分、６０分または９０分の期間で解析した場合、１日目の運動性に比較して増強されなかった。しかし、コカイン後最初の１５分間の解析によって、７日目対１日目ではＧＲＫ６−ＫＯマウスが移動した総距離の適度の増大が明らかになった（ＧＲＫ６−ＫＯ、１日目：３７８６±４５９ｃｍ／１５分；７日目：５３８６±５７１ｃｍ／１５分、ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定；比較として、ＷＴマウスの移動距離、１日目：１６８６±２５２ｃｍ／１５分；７日目：４０７７±４４３ｃｍ／１５分、ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）。 ＧＲＫ６変異体マウスにおける、ｄ−アンフェタミンおよびβ−フェニルエチルアミンの運動性効果の増強を図示する。図４Ａは、ｄ−アンフェタミン（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に応答する、ＷＴ（ｎ＝１０）およびＧＲＫ６変異体（ＧＲＫ６ヘテロ接合性：ｎ＝１５；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝９）の水平方向の運動性応答の時間経過を示す。ＧＲＫ６ヘテロ接合性およびＧＲＫ６−ＫＯのマウスは、ｄ−アンフェタミンに対する応答においてＷＴコントロールとは有意に異なる。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。図４Ｂは、β−フェニルエチルアミン（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）に応答する、ＷＴ（ｎ＝６）およびＧＲＫ６変異体（ＧＲＫ６ヘテロ接合性：ｎ＝１１；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝６）の水平方向の運動性応答の時間経過を示す。ＧＲＫ６ヘテロ接合性およびＧＲＫ６−ＫＯのマウスは、β−フェニルエチルアミンに対する応答においてＷＴコントロールとは有意に異なる。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。 ＷＴマウスおよびＧＲＫ６−ＫＯのマウスにおける、シナプス前ドーパミン機能の解析を示す。図５Ａは、ＨＰＬＣ−ＥＣによって測定した、ＧＲＫ６−ＫＯおよびＷＴの同腹仔マウスにおける、ドーパミン、５−ＨＴおよびその代謝物の線条体組織レベルを図示する（ＷＴ：ｎ＝５；ＧＲＫ６：ｎ＝７）。図５Ｂは、ＧＲＫ６−ＫＯマウスおよびＷＴマウス（ＷＴ：ｎ＝４；ＧＰＫ６：ｎ＝４）由来の線条体シナプトソームにおける［3Ｈ］ドーパミン取り込みを示す。図５Ｃは、定量的な低灌流速度微小透析を用いて測定された、自由運動マウスの線条体における細胞外ドーパミンレベルを図示する（ＷＴ：ｎ＝６；ＧＲＫ６：ｎ＝９）。図５Ｄは、自由運動マウスの線条体における細胞外ドーパミンレベルに対する、生理食塩水およびコカイン（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）の効果を示す。データは、薬物投与の前に収集した少なくとも３つのサンプルにおいて測定されたドーパミンの平均レベルの割合として示す（生理食塩水、ＷＴ：ｎ＝５；ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝４；コカイン，ＷＴ：ｎ＝７、ＧＲＫ６−ＫＯ：ｎ＝６）。 ＧＰＫ６レベルの変更が、Ｇタンパク質に対するドーパミンレセプター結合を調節することを図示する。図６Ａは、ＧＲＫ６変異体および野生型マウス由来の線条体膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＰ結合を示す。総［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、各々のポイントから未刺激の［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を差引きした後に表現する。Ｄ２ドーパミンアゴニストであるキンピロールを用いた刺激後、線条体膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を決定した。未刺激の［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を各々のアゴニスト刺激ポイントへ割ることによって、刺激された［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合のパーセントを算出した。非線形回帰を用いて、ＥＣ50パラメーターを算出した（ＷＴ：２．０±０．５μＭ；ＧＲＫ６−ＫＯ：１．９±０．６μＭ）。アゴニスト刺激のない場合、基礎的な［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、遺伝子型の間で異なることはなかった。ＷＴおよびＧＲＫ６−ＫＯの線条体組織を同時に解析する実験を三連で実施した（１群あたりｎ＝８）。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ、ＧＲＫ６−ＫＯ対ＷＴコントロール。図６Ｂは、Ｄ３ドーパミンレセプターサブタイプ（Ｄ２Ｒ）を発現するＨＥＫ−２９３細胞膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、ドーパミンでの刺激後に決定したことを示す。少なくとも２つの独立した実験を三連で行なった。データ処理のために同じ手順を使用した。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。図６Ｃは、Ｄ３ドーパミンレセプターサブタイプ（Ｄ３Ｒ）に加えてＧタンパク質サブユニットＧｏ−αを発現するＨＥＫ−２９３細胞膜に対する［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を、ドーパミンでの刺激後に決定したことを示す。少なくとも２つの独立した実験を三連で行なった。データ処理のために同じ手順を使用した。ｐ＜０．００１、二元ＡＮＯＶＡ。 ドーパミンアゴニスト効果が、ドーパミン欠失されたＧＲＫ６−ＫＯマウスにおいて強化されることを図示する。脳のドーパミンを枯渇させるために、レセルピン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）およびα−メチル−ｐ−チロシン（２５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）の組み合わせを用いて動物を処置した。図７Ａは、ドーパミン枯渇された野生型マウス（ｎ＝１１）およびＧＲＫ６−ＫＯマウス（ｎ＝７）の水平方向の活動度（カウント）に対するアポモルフィン（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の効果の時間経過を示す。ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、ＷＴコントロールと有意に異なる（ｐ＜０．００１、２次元ＡＮＯＶＡ）。図７Ｂおよび図７Ｃは、ドーパミン枯渇された野生型マウスおよび変異体マウス（１群あたりｎ＝６〜１１）の移動運動に対するアポモルフィン（０．２〜１ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）の効果の用量反応を示す。ＧＲＫ６−ＫＯマウスは、水平方向の活動度カウント（７Ｂ）および総移動距離（７Ｃ）の両方に関して、アポモルフィンによってさらに影響を受けたことに注目のこと。水平方向の活動度カウント（７Ｂ）について野生型群に対して、ｐ＜０．００１、そして総移動距離（７Ｃ）測定について、ｐ＜０．０５、２元ＡＮＯＶＡ。 ＤＡ枯渇野生型マウスおよびＧＲＫ６−ＫＯマウスにおける移動運動は、アポモルフィンの投与（０．２ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）によって回復されたことを図示する。 ＤＡ枯渇野生型マウスおよびＧＲＫ６−ＫＯマウスにおける移動運動は、アポモルフィンの投与（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）によって回復されたことを図示する。 本発明の核酸およびタンパク質の配列を示す。配列番号１は、図２に示されるとおり、ｐＢＳベクター中に挿入された核酸配列である。配列番号２は、図２に示されるとおり、Ｃｒｅ枯渇された遺伝子座の核酸配列である。配列番号３、４および５は、ＧＲＫ６枯渇の構築を確認するために用いたプライマーの核酸配列である。配列番号６、８および１０は、マウスＧＲＫ６Ａ、ＧＲＫ６ＢおよびＧＲＫ６ｃスプライス変異体の核酸配列である。配列番号７、９および１１は、マウスＧＲＫ６Ａ、ＧＲＫ６ＢおよびＧＲＫ６ｃスプライス変異体のアミノ酸配列である。配列番号１２、１４および１６は、ヒトＧＲＫ６Ａ、ＧＲＫ６ＢおよびＧＲＫ６ｃスプライス変異体の核酸配列である。配列番号１３、１５および１７は、ヒトＧＲＫ６Ａ、ＧＲＫ６ＢおよびＧＲＫ６ｃスプライス変異体のアミノ酸配列である。

Claims (38)

  1. その体細胞または生殖系列細胞が、破壊されたＧＲＫ６遺伝子を含み、野生型動物に対してＧタンパク質共役受容体脱感作の低下を示す、非ヒトトランスジェニック動物。
  2. 前記動物がマウスである、請求項１に記載の動物。
  3. 前記非ヒトトランスジェニック動物が霊長類、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギまたはヒツジである、請求項１に記載の動物。
  4. ＧＲＫ６活性を調節する能力について化合物を試験する方法であって、（ａ）野生型非ヒト動物に対して該化合物を投与するステップと、（ｂ）該化合物に曝された該野生型非ヒト動物の運動性応答を、請求項１の非ヒトトランスジェニック動物の運動性応答に対して比較するステップとを含む、方法。
  5. ＧＲＫ６関連脱感作の修飾因子についてのスクリーニングの方法であって、（ａ）ＧＲＫ６およびＧＰＣＲを含む細胞を提供するステップと、（ｂ）該細胞と候補修飾因子とを接触させるステップと、（ｃ）該細胞をＧＲＫ６関連脱感作についてモニタリングするステップとを含む、方法。
  6. 前記モニタリングステップがＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を決定するステップを含む、請求項５に記載の方法。
  7. ＧＲＫ６関連疾患の処置を評価する方法であって、（ａ）ＧＲＫ６およびＧＰＣＲを含む非ヒト動物を提供するステップと、（ｂ）予め選択された処置を用いて該動物を処置するステップと、（ｃ）該動物をアゴニストに曝すステップと、（ｄ）該動物の運動性応答を、請求項１のトランスジェニック非ヒト動物の運動性応答に比較してモニタリングするステップとを含む、方法。
  8. ＧＲＫ６を調節する化合物を同定するための方法であって、
    （ａ）ＧＲＫ６、ＧＰＣＲおよびアレスチンを含む細胞を提供するステップであって、該分子の少なくとも１つが検出可能に標識されているステップと、
    （ｂ）該細胞を（単数または複数の）化合物に曝すステップと、
    （ｃ）ＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を決定するステップと、
    （ｄ）（単数または複数の）該化合物の存在下におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布を、（単数または複数の）該化合物の非存在下におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布と比較するステップと、
    （ｅ）ＧＲＫ６活性の調節のために（１）（単数または複数の）該化合物の存在下におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布の間の相違を（２）（単数または複数の）該化合物の非存在下におけるＧＲＫ６、ＧＰＣＲまたはアレスチンの細胞分布の間の相違に相互に関連させるステップと
    を含む、方法。
  9. 前記ＧＲＫ６が過剰発現される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記標識された分子が、サイトゾル、原形質膜、クラスリン被覆ピット、細胞内小胞またはエンドソームに局在する、請求項８に記載の方法。
  11. 前記検出可能な分子が、放射性同位体、エピトープタグ、アフィニティー標識、酵素、蛍光基または化学発光基である、請求項８に記載の方法。
  12. 前記分子が、検出可能に標識され得る別の分子との相互作用に起因して、検出可能に標識される、請求項８に記載の方法。
  13. ＧＲＫ６活性またはＧＲＫ６をコードする核酸の発現を低下させる化合物に、細胞を接触させるステップを含む、該細胞中のドーパミンレセプターの脱感作を阻害する方法。
  14. 前記化合物が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＧＲＫ６をコードする核酸の発現を阻害する、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記内因性ドーパミンの有効性が、ＧＲＫ６の活性または発現を変更することによって増大される、ドーパミンレセプターに関与する疾患を治療するための方法。
  17. 前記疾患がパーキンソン病、統合失調症、トゥーレット症候群、抑うつまたは薬物常用である、請求項７に記載の方法。
  18. 細胞におけるドーパミンレセプターの脱感作を調節する方法であって、
    （ａ）ドーパミンレセプターおよびＧタンパク質共役受容体キナーゼ（ＧＲＫ）を発現する細胞を提供するステップと、
    （ｂ）ＧＲＫの活性を調節するステップと、
    （ｃ）該細胞をアゴニストに曝すステップと
    を含む、方法。
  19. 前記ＧＲＫがＧＲＫ６である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ＧＲＫ６の発現が増大される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＧＲＫ６の発現が減少される、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記ＧＲＫ６の活性が増大される、請求項１９に記載の方法。
  23. 前記ＧＲＫ６の活性が減少される、請求項１９に記載の方法。
  24. （ａ）ＧＲＫ６の発現または活性を調節する化合物を提供するステップと、（ｂ）宿主に対して該化合物を投与するステップとを含む、宿主細胞におけるドーパミンレセプターの脱感作を調節することによって疾患を治療する方法。
  25. 前記方法が、ＧＲＫ６の発現または活性を調節する化合物と、Ｇタンパク質共役受容体を調節する化合物との共同作用を含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 配列番号１〜３からなる群より選択される核酸。
  27. 配列番号４〜５からなる群より選択される核酸。
  28. 配列番号１〜３の核酸を含むベクター。
  29. 前記核酸がｌｏｘＰ部位に隣接される、請求項２８に記載のベクター。
  30. 配列番号１９の核酸を含む宿主細胞。
  31. ＧＲＫまたはそのフラグメントを認識して結合する単離された免疫グロブリン。
  32. 前記ＧＲＫ６が、ＧＲＫ６ａ、ＧＲＫ６ｂ、ＧＲＫ６ｃまたはＧＲＫ６ｄである、請求項３１に記載の免疫グロブリン。
  33. 前記ＧＲＫフラグメントが配列番号３の配列を有する、請求項３１に記載の免疫グロブリン。
  34. 前記抗体フラグメントがＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）およびｓｃＦｖである、請求項３１に記載の免疫グロブリン。
  35. （ａ）請求項３１の免疫グロブリンに対して生物学的サンプルを曝すステップと、
    （ｂ）該免疫グロブリンが該生物学的サンプルのタンパク質に結合したか否かを決定するステップと
    を含む、生物学的サンプルにおいてＧＲＫ６を検出する方法。
  36. 前記タンパク質に対する免疫グロブリンの結合が、疾患の存在または疾患に対する素因を示す、請求項３５に記載の方法。
  37. 請求項２６の単離されたポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップであって、これによってＧＲＫ６遺伝子の機能および／または構造が調節されるステップを含む、ＧＲＫ６遺伝子を含む細胞を調節する方法。
  38. 前記単離されたポリヌクレオチドが、ノックアウト構築物またはノックイン構築物である、請求項３７に記載の方法。
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