JP2005535305A - ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法、並びに、診断におけるその使用 - Google Patents
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Abstract
少なくとも1種の核酸、及び、性質の異なる少なくとも1種の他のリガンドからなる対象検体を含む可能性のある試料中でハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法であって、
以下の段階:
(i)反応バッファー中に希釈した既知容量の試料を、上記対象検体を捕獲するためのパートナーであらかじめ被覆した捕獲表面上に配置する段階であって、
上記捕獲するためのパートナーは、少なくとも1種の核酸プローブ及び少なくとも1種の抗リガンド(antiligand)からなる段階、
(ii)15℃〜60℃の温度で反応させる段階、並びに、
(iii)起こったハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する段階:
を含む
ことを特徴とする方法、並びに、
伝染性疾患又は代謝由来疾患又はウイルス性疾患を検出するための、並びに、細菌の存在を工業的に診断するための、並びに、生物分子を同定及び/又は定量するための、この方法の使用
に関する。
また、本発明は、
診断におけるこの方法の使用、及び、
本発明の方法の実施に有用な、生物学的な、又は、診断用の試験キット
にも関する。
Description
少なくとも1種の核酸、及び、性質の異なる少なくとも1種の他のリガンドからなる対象検体を含む可能性のある試料中でハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法であって、
以下の段階:
(i)反応バッファー中に希釈した既知容量の試料を、上記対象検体を捕獲するためのパートナーであらかじめ被覆した捕獲表面上に配置する段階であって、
上記捕獲するためのパートナーは、少なくとも1種の核酸プローブ及び少なくとも1種の抗リガンド(antiligand)からなる段階、
(ii)15℃〜60℃の温度で反応させる段階、並びに、
(iii)起こったハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する段階:
を含む
ことを特徴とする方法、並びに、
(例えばウイルス性等の)伝染性疾患及び代謝由来疾患を検出するための、並びに、細菌の存在を工業的に診断するための、並びに、生物分子を同定及び/又は定量するための、この方法の使用
である。
本発明の方法の実施に有用な、生物学的な、又は、診断用の試験キット
である。
(i’)上記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、上記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階:
を更に含む。
(ii’)上記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、上記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階、及び、
(ii’’)15℃〜60℃の温度で反応させる段階:
を更に含む。
−例えば比色定量、蛍光又は発光によって検出可能なシグナルを発する、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ又はグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素、
−発光又は染料の化合物等の発色団、
−32P、35S又は125I等の放射性物質、
−フルオレセイン、ローダミン、アレクサ(alexa)又はフィコシアニン等の蛍光性物質、及び、
−金粒子若しくは磁気ラテックス粒子等の粒子、又は、リポソーム
が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
−捕獲表面、
−少なくとも1種の核酸プローブ、及び、性質の異なる少なくとも1種の他の抗リガンドからなる対象検体を捕獲するためのパートナー、
−反応バッファー、
−任意に、標的リガンドに特異的なパートナーをあらかじめ標識したもの、又は、試験する試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したもの、並びに、
−任意に、標的核酸に特異的なパートナー:
からなるキットを使用できる。
1つめは、ヒト血清中の、p24タンパク質/VEMAポリマー捕獲パートナーと抗p24タンパク質抗体との間の免疫反応を示す蛍光の放出を、血清の希釈度に対して示すグラフである(図1A)。
2つめは、適切であれば、核酸プローブ捕獲パートナーC+(HIVウィルスDNAターゲットと反応できる)及びC−(HIVウィルスDNAターゲットと反応できない)及びHIVウィルスDNAターゲットの間のハイブリダイゼーション反応を示す、又は、この反応が存在しないことを示す蛍光の放出を、PCR産物の希釈度に対して示すグラフである(図1B)。
・ウェル1、9及び17中;HIVウィルスに対する核酸捕獲パートナー(CHIV)、
・ウェル3及び11中;B型肝炎ウィルスHBVに対する核酸捕獲パートナー(CHBV)、
・ウェル7及び15中;C型肝炎ウィルスHCVに対する核酸捕獲パートナー(CHCV)、
・ウェル5及び13中;HIVウィルスに対するタンパク質捕獲パートナー(gp160エンベロープタンパク質)、
・ウェル4及び12中;HCVウィルスに対するタンパク質捕獲パートナー(コアタンパク質)、
・ウェル8及び16中;HBVウィルスに対するタンパク質捕獲パートナー(1ウェル当たり異なる2種のHBAg表面抗原)、及び、
・ウェル2、6、10及び14中;この研究に対して特異的でないタンパク質捕獲パートナー、すなわち抗TSH抗体(NSP1、ウェル2及び10)、及び、抗HCG抗体(NSP2、ウェル6及び14)。
1.1.抗p24タンパク質抗体を認識できる捕獲パートナーの調製
DMSO(ジメチルスルホキシド)/水の90/10(V/V)混合物中に1g/Lで溶解した無水マレイン酸ビニルエーテルポリマーMAVE−67(67000g/mol)の溶液を、フラスコ中で調製した。この混合物を37℃で48時間インキュベートした。その後、組み換えp24タンパク質36μg(pmR K24H、ビオメリュー社、Marcy l’Etoile、フランス)を、ポリマー溶液100μLと混合した。この混合物を37℃で3時間インキュベートした。
次のオリゴヌクレオチド2種(DNAターゲットとハイブリダイズできるC+、及び、ハイブリダイズできないC−、)をそれぞれ、濃度10μMになるように3×PBSバッファー(0.45M塩化ナトリウム、0.15Mリン酸ナトリウム、pH6.8)−EDTA10mM中に希釈した。
C+:NH2−CGC TTC GAC AGC GAC GTG GGG
C−:NH2−TAT GAA ACT TAT GGG GAT AC
上記フランス特許出願FR00/14691中に記載される方法に従って、微量滴定用プレート(Nunc社、Maxisorb)の各ウェル中にスポット4つを接触させずに配置した。スポット2つはp24タンパク質−MAVEポリマーコンジュゲートからなり、スポットの一方はC+プローブ、他方はC−プローブからなる。スポットを配置した後、プレートをすぐに4℃のチャンバー中に移して2時間静置し、その後、60℃で30分間インキュベートした。
2.1.対象検体の調製
DNAターゲット(200bp)を、細胞培養物から抽出したウイルス遺伝子の一部からRT−PCRによって作成した。これらを、5’位をビオチンで標識した下記プライマーA及びBを使用してビオチン化した:
プライマーA:CAT gTg CTA CTT CAC CAA Cgg
プライマーB:CTg gTA gTT gTg TCT gCA CAA
希釈した患者の血清30μL、反応バッファーA30μL、及び、変性させたDNAターゲット3μLを混合し、この混合物を各ウェル中に注入した。これを37℃で1時間反応させた。その後、0.15M塩化ナトリウム及び0.05%tween20を含む50mMリン酸ナトリウムバッファー(PBS−tween)でウェルを洗浄した。
混合物(反応バッファーA30μL、ペルオキシダーゼ結合抗ヒト抗体(ヤギ)10ng(Jackson ImmunoResearch社)、ターゲットDNAと相補的なオリゴヌクレオチド0.07pmol)を各ウェル中に注入することにより、プレート底に固定した捕獲プローブと検出プローブとの間に上記ターゲットを挟むことができた。このオリゴヌクレオチドの5’位をペルオキシダーゼであらかじめ標識した。37℃で1時間反応させた後、ウェルをPBS−tweenで洗浄した。
DNAターゲットの濃度及びHIV+血清の希釈度を変える以外は実施例1及び2に記載の操作を繰り返して行った。その後、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を以下のように検出した。
160mMのHEPES、0.5M塩化リチウム及び0.05%tween20からなるpH7.5の反応バッファーBを更に使用し、かつ、温度を41℃とする以外は実施例4の操作を繰り返して行った。この実験において、血清はウィルス(HIV+)を含み、ウイルスのDNAを認識しないターゲット(C−)は含まない。結果を下記表2中に示す。
6.1.結合した核酸及びタンパク質パラメーターを調べるための生物学的ツール
6.1.1.ハイブリダイゼーション反応
Ambion社(オースティン、テキサス、アメリカ)から入手したHIV RNAターゲットを使用した。ビオチン化プライマー(SK431 TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT、及び、SK462 AGTTGGAGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT)、及び、PCR産物を捕獲するためのアミノ化した捕獲プローブ(CHIV:GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT)をEurogentec社(スラン、ベルギー)において合成した。
HCVコアタンパク質(HCVコア)及びHIVエンベロープタンパク質(gp160)は、本出願人が作成した。2種の異なるHBV表面抗原(HBAgs)、すなわち、サブタイプAy抗原(Hytest社、トゥルク、フィンランド)及びCliniqa社製血漿サブタイプAd抗原(Fallbrook、カリフォルニア州、アメリカ)を使用した。
6.2.1.捕獲パートナーの配置
オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド吸着用反応バッファー(150mMリン酸塩、450mMのNaCl、1mMのEDTA;pH7.4)中に10μMに希釈した。非特異的なIgGを、pH9.3の50mM炭酸塩バッファー中に50μg/mLに希釈した。gp160、HBAg及びHCVコアタンパク質を、PBS中に10μg/mLに希釈した。
検体を、下記のように様々に組み合わせて使用した。
I:HBVターゲット
II:HIVターゲット
III:HBV血清
IV:HIV血清
V:HBV+HIVターゲット
VI:HBV+HIV+HCVターゲット
VII:HBV+HIV+HCVターゲット+HBV血清
VIII:HBV+HIV+HCVターゲット+HBV血清+HIV血清
プレートを0.2μMのDHBV溶液と共に37℃で30分間インキュベートした後(HBV検出)、洗浄した。その後、これを、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ(0.5μg/mL)及びアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト抗体(ヤギ)(μg/mL)の溶液の存在下でインキュベートした。続いてプレートをPBS−tween0.05%で洗浄し、アルカリフォスファターゼに対する沈殿性基質を各ウェル中に添加した(BM purple、ロシェ社、バーゼル、スイス)。画像処理ソフトに連結したCCDカメラを使用してプレートを撮影することによって、各スポットに結合している灰色部分の平均値を測定できた。結果を下記表3中に示す。
Claims (23)
- 少なくとも1種の核酸、及び、性質の異なる少なくとも1種の他のリガンドからなる対象検体を含む可能性のある試料中でハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を同時に検出する方法であって、
以下の段階:
(i)反応バッファー中に希釈した既知容量の試料を、前記対象検体を捕獲するためのパートナーであらかじめ被覆した捕獲表面上に配置する段階であって、
前記捕獲するためのパートナーは、少なくとも1種の核酸プローブ及び少なくとも1種の抗リガンド(antiligand)からなる段階、
(ii)15℃〜60℃の温度で反応させる段階、並びに、
(iii)起こったハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する段階:
を含む
ことを特徴とする方法。 - 段階(i)と段階(ii)の間に以下の段階(i’):
(i’)前記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、前記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階:
を更に含む
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 段階(ii)と段階(iii)の間に以下の2つの段階(ii’)及び段階(ii’’):
(ii’)前記対象検体に特異的な結合パートナーを添加する段階であって、前記パートナーはあらかじめ標識と結合させたものである段階、及び、
(ii’’)15℃〜60℃の温度で反応させる段階:
を更に含む
ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 生物試料中に含まれる標的核酸があらかじめ標識されていて、段階(i’)又は段階(ii’)で添加する結合パートナーは、リガンドに特異的なパートナーをあらかじめ標識したもののみである
ことを特徴とする請求項2又は3に記載の方法。 - 段階(i’)及び段階(ii’)において、リガンドに特異的な結合パートナーの代わりに、生物試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したものを添加する
ことを特徴とする請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 標識に特異的な基質を段階(iii)の前に添加して、ハイブリダイゼーション反応及び免疫反応を視覚化する
ことを特徴とする請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 捕獲表面を段階(ii)及び/又は段階(ii’’)の後に洗浄する
ことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 反応温度が35〜45℃である
ことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。 - 反応温度が37〜41℃である
ことを特徴とする請求項8に記載の方法。 - 反応温度が37℃又は41℃である
ことを特徴とする請求項9に記載の方法。 - 反応バッファーは、イオン強度0.4〜1Mであり、pH7〜8であり、界面活性剤を含む
ことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 核酸特異的結合パートナー、リガンド特異的結合パートナー、請求項4に記載の標的核酸、及び、請求項5に記載のリガンドを、同じ標識で標識する
ことを特徴とする請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 捕獲パートナーは同一の疾患に対するマーカーである
ことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 捕獲パートナーは異なる疾患に対するマーカーである
ことを特徴とする請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 伝染性疾患又は代謝由来疾患を検出するための請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法の使用。
- ウイルス性疾患を検出するための請求項15に記載の使用。
- 細菌の存在の工業的な診断における請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 生物分子を同定及び/又は定量するための請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 細胞又は組織のトランスクリプトーム及びプロテオームを同時に検出するための請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法の使用。
- 捕獲表面;少なくとも1種の核酸プローブ、及び、性質の異なる少なくとも1種の他の抗リガンドからなる対象検体を捕獲するためのパートナー;並びに、反応バッファーを含む診断用キット。
- 標的リガンドに特異的な結合パートナーをあらかじめ標識したものを更に含む
ことを特徴とする請求項20に記載の診断用キット。 - 試験する試料中に含まれている可能性のあるリガンドをあらかじめ標識したもの、及び、反応バッファーを更に含む
ことを特徴とする請求項20に記載の診断用キット。 - 標的核酸に特異的な結合パートナーを更に含む
ことを特徴とする請求項21又は22に記載の診断用キット。
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