JP2005535303A - 質量分析検出と併せた連続フロー酵素アッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、分画ステップの流出物を制御量の酵素と接触させるステップと、この酵素を流出物中に存在することが考えられる検体と相互に作用させるステップと、前記酵素に対する制御量の基質を添加するステップと、この酵素を基質と反応させて、１種又は複数の修飾基質生成物を提供するステップと、質量分析計を使用して、未反応の基質又は修飾基質生成物を検出するステップとを含む、オンライン検出方法に関する。

Description

本発明は、酵素活性の測定と、その改変、特にその阻害の測定に関する。詳細には本発明は、連続フロー酵素アッセイに関する。さらに本発明は、特定の酵素との相互作用をもたらす新たに検出された化合物の使用に関する。

酵素アッセイは、変換生成物の検出によって酵素と基質の両方を特徴付けるのに使用することができる、高感度検出技法である。一般に、酵素とその基質を一緒に、例えば補因子と適切な緩衝条件下で混合し、あるインキュベーション時間を経た後に反応を停止させ、その反応中に形成された生成物の量を測定する。

測定は、一般に基質の検出特性の変化に基づく。例えば測定は、蛍光検出用のシグナルとして使用することができる蛍光特性を有する反応生成物中の、非蛍光基質の変換に基づくものでよい。同様に、無色の基質を着色生成物に変換し、これをＵＶ−ＶＩＳ検出によって測定することができる。

時間の経過と共に形成された生成物の量から、酵素−基質反応の速度論に関して結論を引き出すことができる。

物質は、ある濃度の前記物質を酵素−基質反応混合物に添加し、物質を添加しなかった場合の測定と比較した生成物形成の変化を検出することによって、阻害活性に関する物質の試験をすることができる。

酵素アッセイは様々なフォーマットで実施することができる。一般的なフォーマットは、マイクロタイタープレートで実施されるバッチアッセイに関する。阻害の試験をする酵素、基質、及び物質を、マイクロタイタープレートのウェルにピペット分注し、形成された生成物の量を、所定時間後に測定する。

別の手法では、例えばクロマトグラフ粒子の固体表面に酵素の固定化を行う。次いで固定化した酵素物質を反応器内に詰め、この反応基を通して基質をポンプ送出する。生成物の検出は、適切な検出器を使用して固相反応器の下流で行う。物質の阻害活性は、その物質を酸素反応器に導入する前に基質に添加することによって試験をする。酵素阻害を示す物質により生成物形成の減少は、反応器の下流で測定する。この観点から、質量分析計に結合された連続フローシステム内でのいわゆる固定化酵素反応（ＩＭＥＲ）の使用について記述している、いくつかの文献を参照することができる。この点に関し、例えばＡｍａｎｋｗａ他のタンパク質の科学（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ）４（１９９５）１１３〜１２５；Ｊｉａｎｇ他のＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ９２４（２００１）３１５〜３２２；Ｍａｏ他のＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７４（２００２）３７９〜３８５；及びＲｉｃｈｔｅｒ他のＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、６８（１９９６）１７０１〜１７０５を参照されたい。これらのＩＭＥＲは主に、基質変換反応と、酵素変換反応の程度に影響を及ぼす物理化学パラメータの研究に使用された。ＩＭＥＲによる酵素阻害剤の研究については言及されていない。そのようなＩＭＥＲは、主としてオンラインで液体クロマトグラフィーなどの分画法と連関させることができるが、その操作性能は、不可逆阻害剤の溶出によってＩＭＥＲ全体が容易に阻止され、それによってその他のどのような測定も妨げられる可能性があるので、非常に不利なものになる。使用者は、その他のサンプルのスクリーニングを続ける前に、反応器を交換しなければならなくなる。

さらに別の既知のフォーマットでは、酵素反応を連続フロー反応システム内で行う。連続フロー反応システム内での反応時間は一定であり、反応器の容積及び総流量によって決定される。酵素及び基質は別々にポンプ送出し、試験がなされる物質を含有した担体流と混合する。阻害活性がない場合、最大量の生成物が、利用可能な一定の反応時間中に形成される。阻害剤が存在すると、連続フロー反応システムの下流で適切な検出器により検出することのできる生成物の形成が低下する。

現況技術において記述されるそのような連続フローアッセイの例は、Ｉｎｇｋａｎｉｎａｎ他のＪ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ、８７２（２０００）、６１〜７３に示されている。これは、読出しとしてＵＶ−ＶＩＳ検出を使用する特定の連続フロー酵素アッセイの構成について述べている。特に、アセチルコリン−エステラーゼ及びその基質を連続フロー反応検出システム内で混合し、担体流体中の阻害剤の存在を、酵素基質反応の着色生成物を４０５ｎｍで測定することにより検出したことを述べている。

このタイプの連続フローアッセイにはいくつかの主な欠点があり、そのいくつかについて以下の段落で述べる。

まず、Ｉｎｇｋａｎｉｎａｎ他の方法は、基質の特定の要件に依拠するものであり、すなわちＵＶ−ＶＩＳ検出に適した生成物に変換することのできる適切な基質を見出さなければならない。そのような基質のいくつかは、様々な酵素系に関連した技術分野で知られているが、非常に大きい酵素群、特にＩｎｇｋａｎｉｎａｎ他によって記述されている検出原理に従い作用する適切な基質に欠けた、キナーゼなどの医薬品として適切な酵素の群がある。この問題は原則として、より複雑なアッセイプロトコル、例えば酵素基質反応で形成された生成物に対する標識抗体を用いなければならないようなプロトコルを使用することによって、克服することができる。しかしこれは、アッセイの展開及びこのアッセイを分画ステップと共にオンラインで使用する可能性を、非常に困難にする。

対応する短所は、基質と変換基質とのシグナルの相違に依拠するその他の検出方法で生じる。周知の例は、蛍光を用いた検出である。

さらにＵＶ−ＶＩＳは、いくぶん感度の低い検出方法である。したがってＩｎｇｋａｎｉｎａｎ他によって記述されたタイプのアッセイは、比較的低い検出感度により特徴付けられる。

さらに、Ｉｎｇｋａｎｉｎａｎ他により記述されたアッセイフォーマットは、単一酵素のアッセイ方法として述べられていることに留意されたい。

本発明の根元的な主要目的は、既存のバッチ式及び連続式フローアッセイの欠点の、少なくとも１つを克服する方法又はアッセイを提供することである。特に適切な基質の不完全な要件に関連した短所に鑑み、本発明のアッセイ又は方法を、特に蛍光又はＵＶ−ＶＩＳ検出に基づく酵素アッセイに比べてよりフレキシブルなものにすることを目的とする。蛍光又はＵＶ−ＶＩＳ検出に使用される基質は、一般に天然酵素基質の化学誘導体であり、本来の基質は、それぞれの検出方法によって直接的に又は酵素切断後に検出することのできる化学的部分に共有結合している。検出可能な基質の合成は、本来の基質の化学変化によって基質特異性が低下し、したがって非常に感度の低いアッセイになるので、アッセイの展開時間が引き延ばされる。

さらに、本発明のアッセイフォーマットは、液体クロマトグラフィーなどの分画方法と組み合わせることができなければならない。

さらに、複数酵素の組合せのアッセイ方法を利用可能にすることが望ましいと考えられる。

本発明は、質量分析法を用いた酵素−基質反応の変換生成物の検出を利用することによって、既知の酵素活性の測定アッセイに関する問題のいくつか又は複数を解決し、且つ／又は上述の要望を満たすものである。

検出技法として質量分析法を使用することによって、基質変換生成物を直接検出することができ、アッセイの展開に天然基質の化学誘導体を必要としない。

さらに本発明は、酵素動態の研究と、酵素を阻害し又は活性化し又はそうでない場合には酵素活性を変化させる活性リガンドのスクリーニングとの両方を可能にする。

特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、これまでに知られていない基質活性を持つ酵素をスクリーニングする。

本発明は、変換生成物の１つ又は複数がエレクトロスプレイ質量分析法などの質量分析法によってオンラインで検出される、連続フロー酵素反応システムに関する。連続フロー酵素反応システムの読出しは、化合物の混合物をスクリーニングするために、液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動法などの個別の方法に連関させることができるような方法で発生させることができる。

より詳細には本発明は、分画ステップの流出物と制御量の酵素とを接触させるステップと、この酵素を、流出物中に存在することが考えられる検体と相互に作用させるステップと、前記酵素に対して制御量の基質を添加するステップと、酵素と基質とを反応させて１つ又は複数の修飾基質生成物を提供するステップと、質量分析計を使用して未反応の基質又は修飾基質生成物を検出するステップとを含む、オンライン検出方法に関する。

酵素検出の際の質量分析法の使用について記述するいくつかの方法は、現況技術として述べてきたことに留意されたい。しかし本発明で主張する方法は、開示も提示もなされていない。

例えば、Ｇｅ他のＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３（２００１）５０７８〜５０８２の論文を参照することができる。Ｇｅ他は、酵素動態の決定のために質量分析法を使用することを提案している。特に、酵素グルタチオンＳ−トランフェラーゼをグルタチオン及び１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼンと共にインキュベートすることについて述べており、ある時間間隔の後に、酵素反応で形成された生成物の量をエレクトロスプレイイオン化質量分析によって測定する。この既知の方法では、酵素の本来の基質又は天然の基質を使用することにより、酵素反応のモニタが可能になる。Ｇｅ他はバッチ式適用例について教示するだけであり、すなわちサンプル、酵素、及び基質のインキュベーションと、その後に行われる反応生成物の質量分析計への注入である。したがってこの方法は、酵素動態の決定と純粋な基質のスクリーニングでのみ有用である。Ｇｅ他の方法は、オンラインで分画ステップと連関させることができず、本発明により可能になった混合物のスクリーニングは、例えば液体クロマトグラフィーを使用してサンプルの分画を行った後に、オフラインの画分収集によって実施することができるだけである。

同様の方法がＮｏｒｒｉｓ他（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３（２００１）６０２４〜６０２９）によって提案されており、これは、フコシルトランスフェラーゼのある特定の阻害剤の動態特性研究にバッチ式インキュベーションを使用している。

また上記特定したＩｎｇｋａｎｉｎａｎ他の論文には、ＵＶ分光法を使用するオンラインシステムがさらに質量分析ユニットを利用して、前記オンライシステムにより見出された特定の成分を同定する実施形態についても記載されている。すなわちＵＶ測定に基づいて活性に注目する場合、エレクトロスプレイイオン化分光法を使用して、活性化合物の分子質量に関する情報を得ることができる。本発明の方法のように、未知の化合物とスクリーニングされる酵素との相互作用があるか否かを決定する装置として質量分析計を使用することに関し、いかなる提示もなされていない。

Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ他のＲａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、７（１９９３）２９３〜３０３は、連続フロー高速原子衝撃質量分析を使用した特定酵素の分析について教示している。この論文は、技法の確立とその感度及び再現性に焦点を当てている。分画ステップとの連関に関するいかなる参考文献もなく、酵素反応はオンラインでモニタされる。

Ｂｏｙａｎ他は、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９９（２００１）の第１７３〜１８２頁で、ＭＳに連関させたフロンタルアフィニティクロマトグラフィーによる酵素阻害剤混合物のスクリーニングについて述べている。この論文は、酵素基質の動力学的パラメータと結合定数の調査を目標としている。それに加え、基質測定を実施して、アフィニティカラムに固定化した後の酵素の質を決定する。連続フロープロセスについては述べられていない。

要約すれば、酵素アッセイを読出し技法として質量分析法と併せて行う上記全ての従来技術の方法は、バッチ式に又は固定化酵素反応器（ＩＭＥＲ）に関連付けて実施する。どちらの手法も、主に酵素の動態を調査するために且つ単一の純粋な成分をスクリーニングするために使用することができる。本発明の方法とは対照的に、これらの方法は、インキュベーション及び検出が不連続なプロセスであるので、液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの分離方法に直接連関させることができない。酵素アッセイフォーマットのどちらのタイプに混合物を適用しても、阻害活性を引き起こした混合物中の化合物の性質が明らかにされない。さらに本発明の方法は、生理活性化合物の検出のために、合成した蛍光標識又は放射性標識を実現することを必要としない。

本発明は、読出し技法として連続フロー酵素アッセイと質量分析法とを組み合わせたものに基づく。このオンライン検出法の第１のステップでは、分画ステップの流出物を、少なくとも１種の制御量の酵素に接触させる。本発明の方法で使用すべき適切な分画方法は、液体クロマトグラフィー分離又はキャピラリー電気泳動のステップを含む。しかし、当業者に知られ且つ比較的連続した出力流を可能にするその他の分離技法又は分画技法も同様に使用することができる。

分画ステップは、液体クロマトグラフィー分離やキャピラリー電気泳動ステップだけでなく、コンビナトリアルケミストリシステムでもよい。

好ましい液体クロマトグラフィー分画ステップには、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、又はミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）が含まれ、これらの技法全ては当業者に知られるものである。好ましい実施形態では、液体クロマトグラフィー分離ステップが逆相ＨＰＬＣステップである。

本発明によれば、分画ステップの流出物は、異なる成分の混合物が注入されるフローインジェクション分析システムの流出物であるとも理解されることが、理解されよう。フローインジェクション技法はフレキシブルで高速のスクリーニング方法を提供するので、本発明の好ましい実施形態である。

次のステップでは、酵素を、流出物中に存在することが考えられる検体と相互に作用させる。この記述及び添付の特許請求の範囲において、「検体」という用語は、酵素の特性が影響を受けるように酵素に結合することが可能であり又はそうでない場合は酵素と密接に相互に作用することが可能な、任意の化合物に関して使用する。「検体」という用語は、酵素に対して既知の又は新しい基質を含むが、酵素阻害剤又は酵素変性剤も含む。検出方法を実時間で使用することができるようにするには、相互作用の持続時間は短めであり、最長で約５分、好ましくは約３分である。最小限の相互作用時間は、使用される酵素に若干左右されるが、一般に少なくとも３０秒、好ましくは少なくとも１分である。良好な結果は、相互作用時間が２〜３分の本発明によって得られた。

次のステップでは、使用される酵素に対して制御量の既知の基質を添加し、前記量を酵素と反応させることによって、１種又は複数の修飾基質生成物が得られる。最後に、未反応の基質又は修飾基質生成物の１つを、質量分析法を使用して読み出す。

本発明の方法は、修飾基質生成物の検出を含むことが好ましい。

反応混合物の全ては、基質及び修飾基質生成物を前もって分離することなく、質量分析計に導入することができる。ＭＳによって検出される既知の化合物の量の変化は、流出物中に少なくとも１種の検体が存在し、これが酵素と相互に作用することを示している。

変性され且つ一般には比較的小さい基質生成物をＭＳ検出ステップで使用する好ましい実施形態では、分析すべき反応混合物の高分子質量画分を除去するために、質量分析計の前に中空糸モジュールを挿入することが好ましい。特に反応混合物は中空糸モジュールを通過し、質量分析計に入る前に、前記修飾基質生成物よりも高い分子量を有する分子を分離する。中空糸モジュールは、使用される基質も含めた修飾基質生成物よりも大きいサイズを有する全ての化合物を分離することが、より好ましい。当然ながら、より大きい分子を分離することが可能なその他の装置も使用することができる。

本発明の方法の好ましい実施形態では、質量分析計に導入する前に、基質との反応から得られた反応混合物に補給流を添加する。この補給流は、酵素基質反応で形成された生成物の検出感度を改善する成分を含有する。そのような成分の例は、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒、並びに酢酸やギ酸などの酸である。これらの溶媒及び酸は、検出すべき化合物と相互に作用し、そのような化合物を、例えばより容易にイオン化させる。

必要とされる選択性は、ＭＳの選択的追跡が得られるようにＭＳを操作することによって、得ることができる。

フローインジェクションモードでは、ＭＳ操作の全モードが可能であるが、より高いバックグラウンドであるので、選択された単一のｍ／ｚ痕跡又は選択された複数のｍ／ｚ痕跡のイオンを検出することを含む非常に選択的なモードが、特に適している。

ＭＳは、エレクトロスプレイイオン化タイプ、大気圧イオン化タイプ、４重極タイプ、扇形磁場タイプ、飛行時間タイプ、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^ｎ、ＦＴＭＳタイプ、イオントラップタイプ、及びこれらの組合せからなる群から選択されたタイプのものが好ましい。実施例３で例示される非常に適切な方法は、電子スプレイ飛行時間型質量分析（ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）である。

例えば、化合物を追跡する走査モードでは、ＭＳに関する全ての可能な機器設計を持った低分解能ＭＳを使用することができ、特に４重極、扇形磁場、飛行時間、ＦＴＭＳ、及びイオントラップを使用することができる。これは一般に、公称的な質量精度で分子量データを生成する。

全ての可能な高分解能機器設計、特に扇形磁場、飛行時間、ＦＴＭＳ、及びイオントラップ設計の高分解能ＭＳを利用する場合、化合物の元素組成と組み合わせた高い質量精度での分子量データを得ることができる。

その他の知られているＭＳ技法には、ＭＳ／ＭＳやＭＳ^ｎ（例えばＭＳ^３）などのタンデム型ＭＳが含まれる。これらの技法を利用することによって、本発明の好ましい実施形態である、リガンドの構造的情報の収集が可能になる。走査モードでのデータはデータ依存型モードで獲得することができるが、これは、自動的に観察されるピークごとにタンデム型ＭＳ測定を行うことを意味する。この他、タンデム型ＭＳ測定で引き起こされた断片化は、例えば広帯域励起などのより高度な手順により連関させることができるが、これは、天然産物のスクリーニングにおける［プロトン化分子−Ｈ_２Ｏ］^＋ピークなどの、それほど重要ではない予測される断片も断片化するものである。

ＭＳは、非常に選択的な検出で使用することができる単一／複数イオンモニタリングモードで操作することもできる。

単一／複数イオンモニタリングモードは、非常に選択的な検出で使用することができる。特に４重極、扇形磁場、飛行時間、ＦＴＭＳ、及びイオントラッップなど、全ての可能な低分解能機器設計を有する単一／複数イオンモニタリングモードの低分解能ＭＳを使用して、事前に決定されたｍ／ｚ痕跡のモニタリングに基づく選択的検出を得ることができる。高分解能ＭＳを利用する場合、ＭＳに関する全ての可能な機器設計を使用することができ、特に４重極、扇形磁場、飛行時間、ＦＴＭＳ、及びイオントラップを使用することができる。これにより典型的な場合、事前に決定されたｍ／ｚ痕跡を高分解能でモニタすることに基づいて、非常に選択的な検出が可能になる。タンデム型ＭＳを利用する場合、全ての可能な機器設計、特にイオントラップ、４重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）、３連４重極（ＱＱＱ）、ＦＴＭＳ、扇形磁場と４重極及びイオントラップとの組合せを使用することができる。これにより、ＭＳ／ＭＳ及び／又はＭＳ^ｎ測定で得られる１つ又は複数のピークをモニタすることに基づいて、非常に選択的な検出が可能になる。

また、ＭＳを走査モードで操作することも可能である。このように、所定シグナルの低下はその他のシグナルの増大と相互に関係し、活性化合物を同じサイクルで特徴付けることが可能になる。

本発明によるアッセイでは、複雑な性質の溶液、例えば生物流体又は抽出液、天然産物抽出物、コンビナトリアルテクノロジー及びプロセスなどの化学実験から得られるバイオテクノロジープロセスからの溶液又は抽出液中で、特定の酵素と相互に作用する（生理）活性化合物の追跡を、より高い効率、選択性、及びフレキシビリティで行うことができる。さらに本発明は、バックグラウンド化合物の妨害を制限する可能性をもたらす。

本発明によればさらに、従来の質量スペクトル、高分解能データ、又はＭＳ^ｎベースのスペクトルに基づいて、化合物の同定が可能になる。

本発明の方法によれば、複数化合物の完全な同定を必要とすることなく、大量のサンプルをスクリーニングすることが可能であり且つこれらを類似する活性化合物に基づいて種類ごとに分類する様々な質量分光分析実験に基づいて、ライブラリ探索を行うことも可能である。

本発明のアッセイ方法は、例えばチップ技術ベースのスクリーニングシステムを有するような、アッセイベースシステムの小型化フォーマットで利用することができる。

上述の既知の方法とは対照的に、本発明の方法によれば、２種以上の異なるタイプの酵素の混合物を使用することが可能になる。この好ましい実施形態でも異なる基質の混合物を使用すべきであり、これら基質のそれぞれは、前記酵素の１つに特異的である。混合物中で酵素の１つに対して相互作用をもたらす活性化合物の存在は、既知の基質又は修飾基質生成物の濃度の変化を、その特定の質量と電荷との比でモニタすることによって知ることができる。さらに活性化合物の分子質量は、既知のリガンドのピーク最大値が生ずる時点で全イオン電流クロマトグラムをモニタすることにより、同時に測定することができる。

実施例でも詳述される別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、酵素又は酵素の１種としてプロテインキナーゼを使用する。この実施形態では、キナーゼ触媒反応のリン酸化生成物に関して検出を行ったときに、非常に良好な結果が観察される。検出は、酵素阻害剤の存在を示すのに十分使用することができる。

別の態様では、本発明はオンラン検出法に関し、この方法は、多重インレットユニットの種々の分画ラインが接続されている多重インレットユニットを備えた質量分析計を使用し、各分画ラインは、本発明の説明で記述される本発明の方法の実施形態のそれぞれで述べるように、制御量の酵素及び既知の基質が添加される流出物を含むものである。

また本発明は、本発明の方法によって検出される新しい化合物にも関する。そのような化合物には、アッセイ方法において添加された酵素との相互作用をもたらす可能性がある。

本発明の方法について、本発明の方法の非限定的な３つの実施形態を概略的に示す図１〜３に記載される実施形態を参照しながら、より詳細に述べる。特に、図に示す３つの実施形態のそれぞれに関していくらか詳細に記述される、本発明の方法で使用される装置は、一般にその他の図に示される実施形態で使用することもできる。

図１〜３では、酵素と基質との反応が、開管状編込み型反応器１からなる連続フロー反応検出システム内で進行する。最大感度を実現するために、アッセイをシーケンシャルモードで行う。第１のステップでは、試験すべき化合物を含有する担体流フロー１を、酵素溶液フロー２と混合する。担体流は、例えばフローインジェクション分析（ＦＩＡ）システムの担体又はＨＰＬＣやＣＥなどの連続フロー分離技法の出口でよい。反応器１の容積と、液体流フロー１及びフロー２の総流量が、インキュベーション時間を決定する。インキュベーション時間は、反応器の容積又は流量を変えることによって容易に変えることができ、したがって酵素阻害の動態を見抜くことができる。

第２のステップでは、基質フロー３を、反応器１から出て来た液体流と混合し、基質変換反応を開始させる。管状反応器２の容積と液体流フロー１，２、及び３の総流量とが、基質のインキュベーション時間を決定する。この場合も、インキュベーション時間は、反応器の容積又は流量を変えることによって容易に変えることができ、したがって酵素基質反応の動態を見抜くことができる。

反応器２の出口は、例えば質量分析計のエレクトロスプレイインターフェースに、３つの異なる方法で接続することができ、すなわちその方法とは、（ｉ）反応混合物にさらなる変更を加えることなく直接接続し（図１）、（ｉｉ）典型的な場合にはメタノールと酢酸又はギ酸を合わせたものと内部標準物質とからなる補給流をさらに添加した後に直接接続し（図２）、（ｉｉｉ）中空糸インターフェースを介して接続する（図３）方法である。後者の場合、低分子質量反応生成物を含有する中空糸モジュールの浸透液だけが質量分析計へと向かい、一方、中空糸の濃縮液中の高分子質量画分は廃棄される。

図１では、酵素反応の反応生成物（Ｐ_１．．．Ｐ_ｎ）を、その分子質量で直接測定する。酵素反応は、例えば酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、又は炭酸アンモニウムからなるＭＳ適合性の揮発性緩衝液中で行う。阻害物質が存在しない場合、酵素−基質反応の明確な一定の反応時間が原因となって、一定量の生成物が連続フロー反応系内で形成される。一定の生成物濃度が形成されると、酵素基質反応の程度の指標として選択される生成物の特定のｍ／ｚ値で、一定のＭＳシグナルが生じる。阻害剤（又は酵素−基質の相互作用に影響を及ぼす別の化合物）を、担体流又は分離方法からの阻害剤の溶出液に注入すると、酵素活性に低下が生じ（反応器１内の反応）、その結果、反応器２内で形成される生成物濃度が低下する。内部標準物質、すなわち典型的な場合には酵素反応生成物と同様の化学特性を有する低分子質量有機化合物を基質溶液に添加することは、エレクトロスプレイインターフェース状態の安定度を制御するのに使用される。生成物シグナルの低下は固有のもので、内部標準物質のシグナルが測定期間中一定のままである場合は、その生成物シグナルの低下は阻害剤によって引き起こされたと見なすほかない。生成物と内部標準物質との両方のシグナルが同時に低下する場合、そのシグナルは、おそらく、例えば母材成分に起因するが酵素の特異的阻害には起因しないイオン化条件の変化によって引き起こされると思われる。

図２は、反応生成物を質量分析計に導入する前に、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒と、ギ酸や酢酸などの揮発性有機酸と、内部標準物質とを含有する補給流を添加する他は、図１と同一である。図２に示すスキームは、酵素−基質反応の程度の指標としての役割をする酵素反応生成物が弱いイオン化効率を示し、その結果、比較的高い濃度でしか測定することができない場合に使用する。有機溶媒及び揮発性酸を添加すると、エレクトロスプレイ質量分析における有機分子の検出感度が改善されることが周知である。図１に示す方法と同様に、内部標準物質は、エレクトロスプレイイオン化条件の安定性をチェックするのに使用する。

図３に略述した方法は、酵素そのものや酵素生成からのタンパク質不純物などの高分子画分が存在することによって、大量のイオン抑制が引き起こされる場合に利用する。反応生成物を中空糸モジュールに導入することにより、高分子質量画分が除去され、低分子質量反応生成物を含有する浸透液だけが質量分析計へと向かう。図２に示す実施形態と同様に、補給流は、イオン化効率を高め、したがって反応生成物の検出感度を高めるために、ＭＳに導入する前に浸透液に添加することができる。

適切な分画技法からオンラインで担体流又は溶出液に直接注入される、試験又はスクリーニングすべき物質は、酵素基質反応の反応生成物と共にＭＳに向けられるので、本発明の方法は、この物質の生化学特性、すなわち酵素を阻害する潜在能力とその分子質量を同時に決定することができる。後者の情報は、試験すべき物質の構造を解明するのに使用することができる。

本発明の酵素アッセイ法は、酵素を担体流に連続的に添加するので、適切な分画技法にオンラインで連関させることができる。これは、酵素をサンプルのバッチ溶液に添加し又は固相物質に固定化する上記従来技術方法で述べた短所を克服するものである。

バッチ式インキュベーションでは、反応時間を注意深く制御しなければならない。さもなければ異なるサンプル同士の比較を行うことができないからである。さらにバッチ式インキュベーションは、分画技法にオンラインで連関させることができず、分画技法の溶出液のオフライン式画分収集を行う必要がある。

固定化酵素反応器を使用することの主な欠点とは、活性化合物又は母材構成成分が固定化酵素を不活性にし、新鮮なＩＭＥＲカラムの導入が必要になる可能性があることである。可能性ある失活を予測することはできないので、ＩＭＥＲを使用する方法は、ＩＭＥＲの活性を試験するために頻繁な制御測定が必要である。本発明の方法では、新鮮な酵素タンパク質を、低流量で連続的に担体流に添加する。したがって活性阻害剤又は妨害母材成分を注入すると、酵素の一時的な失活が生じるだけである。

上記論じた従来技術で述べた方法は、分画にオンラインで連関させることができず、したがって化合物の混合物のスクリーニングに適していない。

酵素基質反応の生成物の検出方法として質量分析を使用することにより、本発明は、Ｉｎｇｋａｎｉｎａｎ他によって記述されたＵＶ−ＶＩＳ検出を使用するオンライン酵素アッセイと比較して、いくつかの利点を有する。最も重要なことは、アッセイの展開で、検出可能な部分と既存基質との化学（共有）結合を必要としないことである。そのような化学的変化によって基質が不活性化することは周知である。本発明では、酵素に対して天然の基質を使用することが可能である。アッセイの展開中、酵素基質反応の生成物に特異的なＭＳ検出条件が確立され、最適化される。これらの条件を、引き続き酵素阻害剤のスクリーニングで使用する。

Ｉｎｇｋａｎｉｎａｎ他により記述されたＵＶ−ＶＩＳ検出に基づくアッセイにも優る別の利点とは、本発明ではいくつかの酵素を同時にスクリーニングできることである。この場合、酵素とその特異的基質とは、それぞれ単一の成分としてよりも混合物として使用される。質量分析計は、各酵素アッセイごとに別々の反応生成物を、その特定のｍ／ｚ値で同時に検出する。これらの多酵素アッセイは、例えばＵＶ−ＶＩＳ検出でのその吸収波長又は蛍光検出でのその励起波長及び放射波長に基づいて区別することができる特異的に標識した基質を設計することなく、実施することができる。質量分析計によって生成された全イオン電流データから、これらの質量痕跡を分離して、特異的反応生成物を表す個々の酵素アッセイの解釈を行う。

したがって分画技法にオンラインで連関させることにより、バッチ式アッセイ又は固定化酵素反応器を使用して行うアッセイとは異なって、化合物の混合物のスクリーニングが可能になる。混合物をスクリーニングする好ましい方法は、以下のステップからなる。混合物、例えば天然産物抽出物、コンビナトリアルケミストリからの反応生成物、又はメタボリックプロファイリング実験からの反応生成物を、適切な分画技法、例えばＨＰＬＣ分離カラムに注入する。ＨＰＬＣカラムから溶出する化合物は、混合ユニット内で酵素を添加することによって、酵素と混合する。反応器１では、ＨＰＬＣの流量及び酵素フロー流によって決定された明確な時間にわたり、ＨＰＬＣカラムから溶出する化合物を酵素と相互に反応させる。その後、第２の混合ユニットを介して基質を添加し、反応器２の容積とＨＰＬＣの総流量によって決定された第２の反応時間の後、酵素及び基質フロー流、すなわち混合物は、例えば図１〜３に示した方法を使用して質量分析計へと向かう。ＨＰＬＣカラムから活性化合物が溶出すると、その阻害定数に応じて、酵素の部分又は完全失活など酵素の振舞いに変化が生じる。活性物質と接触するようになった酵素分子の阻害により、例えばエレクトロスプレイＭＳによって検出される反応器２内の生成物形成が低下する。活性物質が反応器２を離れた後、シグナルはその当初の値のままである。活性化合物の存在により、酵素反応生成物の質量痕跡に負のピークが生ずる。

検体を注入したときに得られたＭＳデータと、制御量の基質又は修飾基質生成物だけを連続フローシステムに導入したときに得られたシグナルとの比較により、分画ステップの溶出液中に存在する検体と酵素との相互作用のパーセンテージに関する情報が提供される。当業者なら、この検出方法から得られたデータを処理し評価するための知識を持っている。溶出液中に存在する検体による相互作用のパーセンテージは、特定酵素との相互作用を示す新しい化合物を見出すのに使用することができる。この情報は、例えば薬物発見において本発明のオンライン式分離／親和性分子検出プロセスが実施される可能性をもたらす。

溶出液に添加される「制御量」の酵素及び基質とは、濃度がわかっており且つ流量がわかっている量と理解されたい。

本発明の説明及び特許請求の範囲で使用される「既知の基質」という用語は、酵素と相互に作用し又は反応することが可能であり且つＭＳによって検出することのできる基質を指す。

本発明の方法で使用されるようにオンラインで連関させるには、過剰なカラムバンドの広がりを最小限に抑えるため、高速の反応時間が必要である。これは、時間単位よりも分単位の反応時間を有する相互作用であると見なすべきことを意味する。酵素が検体に結合する適切な結合条件には、同程度の長さの接触時間が含まれる。適切な結合条件は、酵素分子と検体との間に最適な結合をもたらす条件である。温度や滞留時間、化学組成などの精密な条件は、アッセイのタイプ及びそこで使用されるタンパク質に大きく左右されることが理解されよう。バックグラウンド緩衝溶液が主に不揮発性のリン酸緩衝液又はＴｒｉｓ緩衝液からなる蛍光標識、放射性標識、又は酵素標識に基づく生化学アッセイとは対照的に、本明細書で示す質量分析アッセイは、ｐＨが中性であるギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなどの揮発性緩衝液を使用して行う。さらに、既知のリガンドのイオン化特性を改善するには、少量のメタノール（２．５〜１０％）を補給流としてバックグラウンド緩衝液に添加する。

本発明について、以下の非限定的な実施例を参照しながらより詳細に記述する。

本発明の実現可能性を、プロテインキナーゼアッセイに関して実証する。キナーゼは、ＡＴＰの存在下で特定のペプチド基質のリン酸化を触媒する。この実施例では以下の試薬を使用した。
酵素：プロテインキナーゼＡ（ウシ心臓から；８０％タンパク質；リン酸化活性：タンパク質１μｇ当たり１〜２ｕｎｉｔ）
基質：マランチド（Ｈ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−ＯＨ；＞９７％；ＦＷ １６３３．９Ｄａ）
補因子：アデノシン３’：５’−環状一リン酸（遊離酸；＞９９％；ｃＡＭＰ）、アデノシン５’−三リン酸（マグネシウム塩；９５〜９８％；ＭｇＡＴＰ）、Ｐ０３００（Ｈ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＯＨ；ＦＷ ２２２２．４Ｄａ；Ｉｎｈ）をＳｉｇｍａ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ）から得た。
内部標準物質：ＰＰ６０ｃ−ｓｒｃ（リン酸化）（Ｈ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＯＨ；＞９９％；ＦＷ １５４３．５Ｄａ；ＩＳ２）がＢａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）から供給された。
阻害剤：Ｐ０３００（Ｈ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−ＯＨ；ＦＷ ２２２２．４）をＳｉｇｍａ（Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ；オランダ）から得た。

１０．０μＬ／分の流量で動作する担体フローは、２０ｍＭ重炭酸アンモニウムを含有する水溶液からなるものであった。試薬送達は、１０ｍＬのスーパーループ（Ｓｕｐｅｒｌｏｏｐ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して行った。スーパーループの入力フローは、長さ０．５ｍ及び内径０．０６４ｍｍのピーク（Ｐｅｅｋ）管材によりスーパーループの入口に接続した株式会社シコー技研（大和市、日本）のＨＰＬＣポンプを使用して発生させた。スーパーループの出口は、逆Ｙ字形混合ユニオンと、内容積がそれぞれ１００μＬ又は２００μＬの編込み型ポリ（テトラフルオロエチレン）反応コイル（内径が０．３ｍｍであり、長さがそれぞれ１．４１ｍ及び２．８２ｍ）とからなる反応検出システムに接続した。反応温度を４５℃に調節した。どちらのスーパーループも１０．０μＬ／分の流量で動作した。質量分析計に注入する前に、メタノール／１％酢酸を含有する補給流を、２．０μＬ／分の流量で逆Ｙ字形混合ユニオンを介して添加した。補給溶液を、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ２２、Ｈａｒｖａｒｄ、ＭＡ、米国）によりシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ、米国）を介して送出した。全体の流れを、エレクトロスプレイインターフェースを介してＱ−ＴＯＦ２（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）質量分析計へと向けた。

典型的な設定では、酵素が入っているスーパーループ１に、２０ｍＭ重炭酸アンモニウム、１００μＭ ＭｇＳＯ_４、１ｎＭ ｃＡＭＰ、２０μＭ ＭｇＡＴＰ、及びプロテインキナーゼＡ（２２４〜４４８ユニット）を含有する２ｍＬの水溶液を充填した。基質溶液が入っているスーパーループ２には、２０ｍＭ重炭酸アンモニウム、１００μＭ ＭｇＳＯ_４、２μＭペプチド（マランチド）を含有する２ｍＬの水溶液を充填した。補給流用のシリンジには、１％酢酸及び１０μＭ内部標準物質を含有するメタノールを充填した。

ＭＳ測定は、エレクトロスプレイインターフェースに結合したＱ−ＴＯＦ２質量分析計で実施した。測定は、供給源温度３５３Ｋ、脱溶媒和温度４２３Ｋ、溶媒和ガス流２５０Ｌ／時、コーンガス流１００Ｌ／時、気体セル圧１６ｐ．ｓ．ｉ．、毛管電圧２５００Ｖ、コーン電圧３３Ｖの陽イオン化モードで行った。質量範囲を３００〜１１００ｍ／ｚに設定し、データ獲得パラメータは５．０秒／走査であり、滞留時間は０．１秒、完全ＴＯＦ ＭＳは走査モードで継続し、任意選択の「ＭＳプロファイル」は使用しなかった。窒素（純度５．０；Ｐｒａｘａｉｒ、Ｏｅｖｅｌ、ベルギー）及びアルゴン（純度５．０；Ｐｒａｘａｉｒ）を、脱溶媒和／コーンガス及び衝突ガスとしてそれぞれ使用した。

典型的な実験では、マランチド基質とプロテインキナーゼＡとの混合により、ｍ／ｚ５７１．９というｍ／ｚ値で検出することのできるリン酸化マランチドが形成される。４５℃の反応温度では、阻害剤の２μＭ溶液を注入することにより、３７００カウント（任意の単位）から１２３０カウント（任意の単位）までシグナルの変化が生じるが、内部標準物質のカウント数は一定のままであり、これはリン酸化マランチドのシグナル変化が阻害剤注入によるプロテインキナーゼＡの失活によって引き起こされることを示している。反応温度がアッセイに及ぼす明らかな影響が観察された。２５℃で、阻害剤の２μＭ溶液を注入することによって１９３０カウント（任意の単位）から６３４カウント（任意の単位）までシグナル変化が生じるが、内部標準物質のカウントは一定のままである。

実施例１と同じ条件を使用したが、今度はマランチドの代わりにケンプチドを基質として使用した。ケンプチド基質とプロテインキナーゼＡとの混合により、ｍ／ｚ４２６．７というｍ／ｚ値で検出することのできるリン酸化ケンプチドが形成される。４５℃の反応温度では、阻害剤の２μＭ溶液を注入することにより、１２４０カウント（任意の単位）から３３５カウント（任意の単位）までシグナルの変化が生じるが、内部標準物質のカウント数は５０３０カウントという値で一定のままである。マランチドのリン酸化と同様に、反応温度がアッセイに及ぼす明らかな影響が観察された。２５℃で、阻害剤の２μＭ溶液を注入することによって１９３０カウント（任意の単位）から８２０カウント（任意の単位）までシグナル変化が生じるが、内部標準物質のカウントは５７９０カウントという値で一定のままである。

この実施例では、酵素活性及び酵素阻害をモニタするために検出技法としてＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（電子スプレイ飛行時間質量分析法）を使用することに関して実証する。ホモジニアスな基質変換ベースのバイオアッセイをモデルシステムとして選択したが、この場合、Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣをカテプシンＢの基質として使用した。この酵素、すなわちカテプシンＢはシステインプロテアーゼであり、細胞内タンパク質代謝回転や癌の侵襲及び転移など数多くの生理学的及び病理学的プロセスに関与する酵素の重要な群に属する。

酵素アッセイは、連続フローＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムで行い、酵素カテプシンＢ及び基質Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣを、ＬＣカラムの溶出液をシミュレートするフローインジェクションシステムの担体溶液に続けて添加した。その結果、カテプシンＢが連続的にＺ−ＦＲ−ＡＭＣと共にインキュベートされ、変換された基質の連続供給が行われた。生成物を質量分析計にポンプ送出し、モニタした。様々な化合物を連続フローシステムに注入し、酵素と共に反応コイル内でインキュベートし、引き続き質量分析計にポンプ送出した。これにより、その阻害能の決定並びに注入した化合物の特徴付けが可能になった。抽出物のスクリーニングでは、化合物のオンラインでの分離が必要であるが、これはＬＣカラムをバイオアッセイの前に連関させることによって、すなわちＬＣ連続フローＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムによって得られた。天然産物の抽出物は、しばしば新規薬物開発の出発点になるので、そのような抽出物をスクリーニングできることは医薬品産業において特に重要である。オンライン式連続フローＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳシステムを使用することにより、活性化合物に関して混合物をスクリーニングすることが可能になり、一次検出での価値ある手法としてＥＳＩ−ＭＳが利用可能であることが実証された。

より詳細には、２つの異なる連続フロー（ＣＦ）システム、すなわちどちらもホモジニアスバイオアッセイをＭｉｃｒｏｍａｓｓ（Ｗｙｔｈｅｎｓｈａｗｅ、英国）Ｑ−Ｔｏｆ微量質量分析計に連関させたものからなるシステムによって分析した。ＦＩ−ＣＦシステムと名付けられた第１の連続フローシステム（図４）は、反応物を送出する３つのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）１１００ポンプからなるものであった。ポンプの後に配置されたＰｈａｒｍａｃｉａ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）製スーパーループ（１０ｍＬ）を使用して、試薬溶液を連続フローシステムに導入し、それによって化合物とポンプ表面との非特異的な結合を防止し、高価な化学物質の使用を低減させた。Ｒｈｅｏｄｙｎｅ（Ｃｏｔａｔｉ、ＣＡ、米国）６ポート注入弁を備えたギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ、米国）モデル２３４自動注入器を使用して、化合物を注入した。２つの反応コイル（Ａ、体積２０μＬ；Ｂ、体積３０μＬ）は、ラジアルミキシングが行われるように編み込まれたテフロン（登録商標）管材（ポリテトラフルオロエチレン、ＰＴＦＥ、０．２５ｍｍＩＤ）からなるものであった。反応物を、温度３０１Ｋで両方のコイルでインキュベートした。酵素のスーパーループは、その酵素の分解が最小限に抑えられるようにＳｐａｒｋ（Ｅｍｍｅｎ、オランダ）Ｍｉｓｔｒａｌサーモスタットを使用して２８５Ｋに保ち、一方、基質のスーパーループは３０１Ｋに保った（冷却は必ずしも必要ではない）。形成された生成物の量は、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｚ−ｓｐｒａｙエレクトロスプレイイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＭＳによって決定した。機器の制御、データ獲得、及びデータ処理は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、米国）Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＮＴで実行されるＭａｓｓＬｙｎｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｖ４．００．００）ソフトウェアを使用して行った。

ＬＣ−ＣＦシステムと名付けられた第２の連続フローシステム（図５）は、大部分がＦＩ−ＣＦシステムと同じであった。違いは、ポンプ１及び自動注入器のＬＣシステムによる置換えであった。図５の左の部分にあるこのＬＣシステムは、バイナリーグラジェントを送出する２つのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００ポンプ（図５；６及び７）からなるものであった。このグラジェントを、Ｐｅｌｔｉｅｒ冷却器で温度制御された（２８５Ｋ）Ｒｈｅｏｄｙｎｅ ６ポート注入弁と、島津（京都、日本）ＣＴＯ−１０ＡＣ ＶＰカラムオーブンで温度制御された（３０３Ｋ）Ｚｏｒｂａｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＳＢ−Ｃ１８（５μＭ、２．１×１５０ｍｍ）カラムとを備えた自動注入器（Ｇｉｌｓｏｎ、モデル２３５ｐ）を通してポンプ送出した。カラム溶出液を補給流と混合し、２つのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １１００ポンプ（図２；３及び４）で送出して、ＬＣ分離に必要なメタノールの量を減少させるようにした。グラジェント及び補給流は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００で実行されるＫｉａｄｉｓ（Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）Ｓｃｒｅｅｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２．９ｈソフトウェアにより制御した。Ｕｎｉｆｌｏｗｓ（東京、日本）製Ｄｅｇａｓｙｓ Ｕｌｔｉｍａｔｅ、真空脱気装置を使用して、システム内にポンプ送出された溶液を脱気した。増大する流量を低下させるため、ＬＣシステムとバイオアッセイ質量分析計との間に手製のスプリッタを組み立て、廃棄物に９５％、バイオアッセイ質量分析計に５％という比で分けた。

ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ検出は、シリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ、米国）及びｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ、ＰＡ、米国）シリンジポンプ（モデルＫＳＤ１００）でＺ−ＦＲ−ＡＭＣ溶液を１０μＬ／分の流量で連続注入することにより最適化した。Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣに対する感度の最良の設定は、毛管３３００Ｖ、サンプルコーン３０Ｖ、抽出コーン３Ｖ、脱溶媒和温度４４８Ｋ、供給源温度３５３Ｋ、及び走査範囲ｍ／ｚ１５０〜６５０であった。測定は、陽イオン化モードと１００〜２００Ｌ／時のコーンガス流及び４００〜６００Ｌ／時の脱溶媒和ガス流とを組み合わせてで行った。窒素（純度９９．９９９％）をガスとして使用した。

カテプシンＢ（Ｅ．Ｃ．３．４．２２．１、ウシ脾臓から、活性：１９ユニット／ｍｇタンパク質、ユニットの定義：１ユニットは、ｐＨ５．０及び２９８Ｋで、１分当たり１マイクロモルのＮ−α−ＣＢＺ−リジンＰ−ニトロフェニルエステルを加水分解させる）、アンチパイン（Ｎ−（Ｎα−カルボニル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ａｌ）−Ｐｈｅ、Ｍ_ｒ ６０４．７）、Ｅ６４（ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミド−（４−グアニジノ）ブタン、Ｍ_ｒ ３５７．４）、ｃＡＭＰ（内部標準物質１、アデノシン３’，５’−環状一リン酸、Ｍ_ｒ ３２９．２）、ビオチン（内部標準物質２、Ｍ_ｒ ２４４．３）、及びＤＴＥ（１，４−ジチオエリスリトール、Ｍ_ｒ １５４．３）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から購入した。ＣＡ−０７４（Ｌ−ｔｒａｎｓ−エポキシスクシニル−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−ＯＨプロピルアミド、Ｍ_ｒ ３８３．５）、Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣ（ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリン塩酸塩、Ｍ_ｒ ６４９．２）、オボキニン（Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｍ_ｒ １００２．１）、及びｐｐ６０ ｃ−ｓｒｃ（リン酸化、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ（ＰＯ_３Ｈ_２）−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ、Ｍ_ｒ １５４３．５）は、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）から得た。メタノール及び水酸化アンモニウムはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）から、酢酸はＲｉｅｄｅｌ−ｄｅ Ｈａｅｎ（Ｓｅｅｌｚｅ、ドイツ）から、ギ酸アンモニウムはＡｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）から、高純度水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、米国）から得た。

反応物及び内部標準物質は、水酸化アンモニウムでｐＨ７．０に設定された、２０ｍＭギ酸アンモニウムを水に溶かしたものからなる担体流体に溶解した。ＤＴＥをこの担体に添加して、ＦＩ−ＣＦシステムでは濃度１５．０μＭで、またＬＣ−ＣＦシステムでは濃度２２．５μＭで酵素活性が増大するようにした。ＤＴＥは、分離の妨害が最小限に抑えられるようにＬＣカラムを通してポンプ送出された溶液中には存在せず、また補給流溶液中にも存在しなかった。

２０ｍＭギ酸アンモニウム、様々な濃度のオボキニン（０．１０〜２．０μＭ）、及びｐｐ６０ｃ−ｓｒｃ（０．２０〜４．０μＭ）、１０％（ｖ／ｖ）メタノール、０．１％（ｖ／ｖ）酢酸を含有するバッチを調製し、ｐＨ４．３の水溶液を得た。調製したサンプルを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により流量１０μＬ／分で質量分析計に注入した。

フローインジェクション分析では、反応物及び内部標準に関して述べたように溶液を調製し、これをスーパーループに入れる。使用した濃度は、スーパーループ１及びスーパーループ２のそれぞれについて、カテプシンＢ ３０ｎＭ及び内部標準物質１ ６μＭ、及びＺ−ＦＲ−ＡＭＣ ５０μＭ及び内部標準物質２ ６μＭであった。

２種の阻害剤、Ｅ６４及びアンチパインを選択し、これ（１μＬ）を様々な濃度で２回注入した（Ｅ６４：０．５０、１．０、及び２．５μＭ；アンチパイン：０．１０、０．２５、及び０．５０μＭ）。

２０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ７．０）、様々な量のＺ−ＦＲ−ＡＭＣ（０、０．５０、１．０、２．５、５．０、及び７．５μＭ）、７．５ｎＭカテプシンＢ、１．５μＭ内部標準物質１、１．５μＭ内部標準物質２を水に溶解したものを含有するバッチを調製した。シリンジポンプを使用して流量１０μＬ／分で注入することにより、３０１Ｋで６０分間インキュベートした後、これらバッチのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った。

２０ｍＭギ酸アンモニウムと様々な濃度のｃＡＭＰ及びビオチン（０．５０〜５．０μＭ）を含有するバッチを調製し、ｐＨ４．３の水溶液を得た。これらバッチのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析を、シリンジポンプを使用して流量１０μＬ／分で注入することにより行った。

ＨＰＬＣスクリーニングでは、溶液を上述のように調製し、スーパーループに充填した。使用した濃度は、スーパーループ１及びスーパーループ２のそれぞれについて、カテプシンＢ ３０ｎＭ及び内部標準物質１ ６μＭ、及びＺ−ＦＲ−ＡＭＣ ５０μＭ及び内部標準物質２ ６μＭであった。注入した阻害剤：Ｅ６４及びＣＡ０７４は、これらを混合して注入した（Ｅ６４：４０μＭ；ＣＡ−０７４：９０μＭ）。勾配溶離に関するクロマトグラフィー条件は、流量２００μＬ／分、注入体積２０μＬ、カラム温度２９８Ｋ、及び自動注入器温度２８３Ｋであった。移動相は、２０ｍＭギ酸アンモニウムをｐＨ７．０で水に溶かしたものとメタノールとのバイナリーグラジェント混合物であった。勾配は３０％メタノール（ｖ／ｖ）で始まり、１２分で３５％に増加した。

アッセイの設定
ホモジニアスバイオアッセイを質量分析計に連関させて、図４に示すように一緒にＦＩ−ＣＦシステムを形成した。反応コイルＡ内では、担体溶液（２０μＬ／分）を連続的にカテプシンＢ溶液（１０μＬ／分）と４０秒間混合し、反応コイルＢ内では、担体／カテプシンＢ溶液をＺ−ＦＲ−ＡＭＣ溶液（３０μＬ／分）と４５秒間混合した。結果的に生ずる反応コイルＢから出て来た流れ（４０μＬ／分）を質量分析計へとポンプ送出し、形成された生成物の量を、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより直接モニタした。自動注入器を介して担体流に注入された化合物を、カテプシンＢと４０秒間反応させた（図４、反応１）。反応コイルＡ内で混合した後、阻害剤と酵素の両方を反応コイルＢにポンプ送出し、これらを基質と混合した。阻害剤がないと、第１の反応コイルでＺ−ＦＲ−ＡＭＣの連続的な切断が生じる。しかし、阻害剤が第１の反応コイルで酵素をブロックした場合、切断された基質の一時的な減少が生じた（図４、反応２及び３）。

使用した第２のシステムは、大部分がＦＩ−ＣＦシステムと同様の、図５に示すＬＣ−ＣＦシステムであった。自動注入器を介して注入された化合物を、担体溶液とメタノールからなるバイナリーグラジェントシステムを使用して、ＬＣカラムにより分離した。分離に必要なメタノールの量を減少させるため、補給溶液をカラム溶出液添加し、１０％という一定濃度のメタノールを得た。メタノールの濃度を低下させることは、酵素分解を防止するのに必要であった。このカラムでの流量は２００μＬ／分であり、補給流を添加した後に９６０μＬ／分まで増大した。この流れ（９６０μＬ／分）を、廃棄物に９５％、バイオアッセイ質量分析計に５％（４８μＬ／分）という比で分けた。この点から、ＦＩ−ＣＦシステムはＬＣ−ＣＦシステムと多かれ少なかれ同じであり、流量が異なるだけであった。ＬＣ−ＣＦシステムでは、酵素溶液と基質溶液の両方を５０μＬ／分の流量で送出し、質量分析計への総流量は１００μＬ／分になった。その結果、反応時間は、反応コイルＡ及びＢでそれぞれ１６秒及び１８秒に短縮された。反応時間が短縮されたことによって生成物の量が低下したが、ＬＣ−ＣＦシステムの良好な性能には依然として十分なものであった。

この連続フローシステムで使用されるバイオアッセイとＭＳとの組合せは、どちらにも適合性のある溶媒組成物を必要とする。酵素アッセイの大部分は、ＨＥＰＥＳやＴＲＩＳ、ＰＢＳなどの不揮発性緩衝塩と、酵素活性及び表面への非特異的結合を維持する添加剤とを含有する溶液中で行われる。しかし不揮発性の塩は質量分析計のイオン源を汚染し、ＭＳ性能を低下させる。さらに添加剤の量は、ＥＳＩでシグナルの抑制を引き起こすので、できる限り低く保たなければならない。このため、一般的に使用される添加剤及び不揮発性緩衝塩を、この研究では省略した。バイオアッセイとＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳの両方に適していることがわかっている揮発性の塩（ギ酸アンモニウム）を選択した。担体溶液はＤＴＥのみ含有しており、これはカテプシンＢの活性化に必要である。さらに、多くの質量分光分析実験では、有機改質剤を添加して検体の溶解度を高め、エレクトロスプレイプロセスにより形成された帯電した液滴の脱溶媒和を促進させる。さらに、陽イオン（質量分析計の陽イオンモードで検出された）は酸性溶液中でより容易に形成されるので、より低いｐＨ値によっても質量分光分析性能が高まることになる。しかし多くの場合、有機改質剤と酸性ｐＨの両方は、酵素反応に適合性がない。このため中性ｐＨ（７．０）と、バイオアッセイに適合した濃度の有機改質剤を担体溶液に溶かしたものを選択した。

カテプシンＢの基質として、Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣ、蛍光標識化合物を選択した。図６は、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによりモニタされた、カテプシンＢによる切断後のＺ−ＦＲ−ＡＭＣのスペクトルである。このスペクトルは、Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣの酵素切断によって２つの生成物、すなわちｍ／ｚ １７６及びｍ／ｚ ４５６が得られたことを示している。さらに、切断されていない基質（ｍ／ｚ ６１３；塩酸塩なし）と２つの内部標準物質（ビオチン、ｍ／ｚ ２２７、プロトン化分子−水；ｃＡＭＰ、ｍ／ｚ ３３０）を示している。システムの感度に関する重要な情報（内部標準物質）と、基質及び形成された生成物の量は、容易に決定された。２つの内部標準物質は、それぞれのスーパーループごとに１つずつ使用し、それらの強度の比に従って流量を制御した。

ＲＳＤで表されるＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳの精度は、化合物であるオボキニンとリン酸化ｐｐ６０ｃ−ｓｒｃとの５つの異なる濃度を使用して調査した。これらの化合物は、先の調査で使用したようにどちらのＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ情報も存在するという理由で選択した。

日差（ｎ＝９）精度測定値は、オボキニン及びｐｐ６０ｃ−ｓｒｃに関してそれぞれ５．１％及び５．５％であった。両方の化合物同士の比も制御され、４．８％（ＲＳＤ）だけ変動した。これらのパーセンテージは、ＭＳ検出システムの安定性を実証している。しかし感度の変動は、内部標準物質の使用に応じて容易に補正することができる。

フローインジェクション分析は、ＦＩ−ＣＦシステムを使用して、２つの化合物の阻害能を決定するために行った。非選択的セリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤であるＥ６４及びアンチパインという２つの阻害剤を選択した。どちらの阻害剤も、自動注入器を介してＦＩ−ＣＦシステムに注入した。阻害剤がカテプシンＢをブロックする場合、活性酵素の量が一時的に減少する結果、負のピークが出現する。

このフローインジェクション分析の結果を図７に示す。３つの質量痕跡の全ては抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）であり、問題になっているイオンを、検出されたイオンの量全体から抽出したものである。最初の質量痕跡はＥＩＣがｍ／ｚ ４５６．０（形成された生成物）であり、第２の質量痕跡はｍ／ｚ １９０．７（アンチパインの断片）、第３の質量痕跡はｍ／ｚ ３５８．２（Ｅ６４）である。

阻害剤の注入により、生成物の質量痕跡に負のピークが生じた。これら負のピークは、イオン形成を大幅に抑制する成分によって、又は生成物の量を低下させる酵素を阻害する成分によって生ずる可能性がある。この第１の選択肢は、内部標準物質を使用することによって制御される。負のピークが選択的抑制に起因するものではないことを確実にするために、両方の生成物の質量痕跡（ｍ／ｚ １７６及びｍ／ｚ ４５６）を比較し、これらが異なるものではないことを示す。さらに、ブランクの注入とｃＡＭＰの注入（１０μＭ）は、負のピークにならなかった（データは図示せず）。これはさらに、較正曲線の直線性によって確認される（定量化参照）。生成物がシグナル抑制に敏感であったなら、両方の質量に関して直線（ｍ／ｚ １７６及びｍ／ｚ ４５６に関してそれぞれＲ^２＝０．９９６４及びＲ^２＝０．９９７２）は得られなかったであろう。化合物がイオン化プロセスを抑制していたなら、内部標準物質（又はその他の化合物）に関して同様のイオン電流の低下が観察されるであろう。しかし内部標準物質の強度は、負のピークの間は変化しないままであったので（データは図示せず）、シグナルの抑制については除外できると考えられる。第２の選択肢が真実であるかどうかを決定するために、バックグラウンドのイオンを負のピークから差し引き（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓソフトウェアを使用して）、阻害剤に属するスペクトルを得た。この事実と、負のピークがイオン抑制の結果ではないという知見とを組み合わせることにより、注入された阻害剤が第１の反応コイルで酵素をブロックしたという結論に至った。阻害剤の分子質量の決定は、阻害剤化合物の総量の一部だけがカテプシンＢに結合しているので、可能であった。しかし、有用な質量スペクトルを得ることは、阻害剤がイオン化可能である場合にのみ可能である。

どの成分が阻害剤をブロックしたのか決定する他に、阻害剤の結合強度を決定することも可能である。負のピークの面積は、化合物の阻害能の指標であり、言い換えれば、阻害剤が強力であるほど負のピークの面積が大きくなる。これは、阻害剤化合物の濃度がわかっていない天然産物の抽出物では不可能である。図７を検討すると、０．１０μＭアンチパインにより生じたピークの面積が０．５０μＭ Ｅ６４により生じたピークの面積と多かれ少なかれ同様であるので、アンチパインはＥ６４よりも強力な阻害剤であることが明らかである。また、阻害剤の濃度が高いほどより多くの酵素をブロックし、その結果、負のピークがより大きくなることも、非常に明白である。

生成物のＥＩＣを見ると（最上部の質量痕跡）、ＭＳ強度が時間と共に低下することがわかる。これは、同じ効果が内部標準物質では観察されなかったので、酵素と管材との非特異的結合の結果である。

まとめると、抽出し又は合成した化合物の親和定数は、このシステムにより決定することができる。内部標準物質を使用することによって、シグナル抑制の制御が可能になる。検出限界が５０〜２５０ｎＭ程度である場合は蛍光検出に一致しており、検出限界が２５〜１００ｎＭ程度の場合は（データは図示せず）、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳモードが適切であることを実証している。

重要な要素は、形成された生成物の定量化であり、それによって阻害剤の強度を示すことが可能になる。定量化は、必要な反応物及び内部標準物質と様々な濃度のＺ−ＦＲ−ＡＭＣとを含有するバッチを調製することによって開始した。これらのバッチは、全てのＺ−ＦＲ−ＡＭＣがカテプシンＢによって確実に切断されるように、６０分間インキュベートした。インキュベーション後に直接行ったＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、サンプルを質量分析計に注入することによって（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃシリンジポンプ）行った。全てのＺ−ＦＲ−ＡＭＣが切断されるように制御した後、形成された生成物の量を、獲得したスペクトルを平均することによって決定した。得られたシグナル強度をシグナル抑制に合わせて補正し、Ｚ−ＦＲ−ＡＭＣの濃度に対してプロットし（データは図示せず）、ｍ／ｚ １７６（生成物１；Ｒ^２＝０．９９６４）及びｍ／ｚ ４５６（生成物２；Ｒ^２＝０．９９７２）に関して直線のグラフを作成した。このプロットから、補間法によって、各分析ごとに、形成された生成物の濃度を得ることができた。負のピークが生じるにつれて生成物の強度は低下し、その結果、補間法によって計算された濃度は低下した。濃度の差を計算し、他のピークと比較することにより、注入された化合物の酵素に対する親和性を示すことができる。実際の定量データでは、より多くの測定を行うべきである。

シグナル抑制又はＭＳ感度の差は、内部標準物質を使用することによって制御することができる。この調査では、内部標準物質ｃＡＭＰ（Ｒ^２＝０．９９３５）及びビオチン（Ｒ^２＝０．９９６２）の較正曲線を、質量分析計への連続注入によって得た。

ＲＰ分離は、水及びメタノールを使用して、バイナリーグラジェントシステムにより行った。しかし、有機改質剤は酵素の活性を低下させる。このため、ＬＣカラム（図５参照）の後に補給流を添加して、メタノールの濃度を下げた。この結果、カラム後の流量が増加し（９６０μＬ／分）、希釈が原因で検体の濃度が低下した。バイオアッセイ及び質量分析計には高すぎる流量を低下させるため、ＬＣカラムとバイオアッセイとの間にフロースプリッタを配置することにより、その流れを４８μＬ／分に低下させた。この流れは、連続フローシステムにポンプ送出される担体溶媒として使用した。

記述したＬＣ−ＣＦシステムは、化合物Ｅ６４及びＣＡ−０７４の阻害能の決定に使用した。ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳはこの分析に使用し、ＥＩＣによって、形成された生成物の量を追跡した（図８、Ａ）。最初の３分間は、生成物の質量痕跡が安定していた（内部標準物質により制御された）３．８分と４．８分で、生成物の質量痕跡に負のピークが出現した。先に述べたように、これは、溶出された成分によるシグナル抑制の結果、又はカテプシンＢの阻害の結果と考えられる。内部標準物質の質量痕跡は、負のピークが阻害によって生じたことを示した。次のステップは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓソフトウェアを使用したバックグラウンドの除去によって、酵素に結合した化合物を決定することであった。抽出されたｍ／ｚ値は、ピーク１及びピーク２に関してそれぞれ３５８．２及び３８４．２であり、化合物Ｅ６４（図８、Ｃ）及びＣＡ−０７４（図８、Ｂ）のプロトン化分子に対応していた。これを締めくくると、注入した検体をＬＣカラムによって分離し、バイオアッセイで酵素と十分に混合し、その後、質量分析計にポンプ送出する。このアッセイは、２成分を含有する混合物に限定するものではなく、それらの成分が分離している限り、より多くの複合混合物でもよい。このため、抽出物及びその他の混合物の一次スクリーニングにおいて、ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳに基づくオンライン式連続フロースクリーニングアッセイは、蛍光及び放射性に基づく検出方法に代わる良好な検出技法である。

オンライン酵素ＭＳアッセイ−システム１を示す。酵素と基質との反応が、開管状編込み型反応器１からなる連続フロー反応検出システム内で進行する。最大感度を実現するために、アッセイをシーケンシャルモードで行う。第１のステップでは、試験すべき化合物を含有する担体流フロー１を、酵素溶液フロー２と混合する。担体流は、例えばフローインジェクション分析（ＦＩＡ）システムの担体又はＨＰＬＣやＣＥなどの連続フロー分離技法の出口でよい。反応器１の容積と、液体流フロー１及びフロー２の総流量が、インキュベーション時間を決定する。インキュベーション時間は、反応器の容積又は流量を変えることによって容易に変えることができ、したがって酵素阻害の動態を見抜くことができる。第２のステップでは、基質フロー３を、反応器１から出て来た液体流と混合し、基質変換反応を開始させる。管状反応器２の容積と液体流フロー１，２、及び３の総流量とが、基質のインキュベーション時間を決定する。この場合も、インキュベーション時間は、反応器の容積又は流量を変えることによって容易に変えることができ、したがって酵素基質反応の動態を見抜くことができる。反応器２の出口は、例えば質量分析計のエレクトロスプレイインターフェースに、反応混合物にさらなる変更を加えることなく直接接続する。 オンライン酵素ＭＳアッセイ−システム２を示す。反応器２の出口は、例えば質量分析計のエレクトロスプレイインターフェースに、典型的な場合にはメタノールと酢酸又はギ酸を合わせたものと内部標準物質とからなる補給流をさらに添加した後に直接接続する。 オンライン酵素ＭＳアッセイ−システム３を示す。反応器２の出口は、例えば質量分析計のエレクトロスプレイインターフェースに、中空糸インターフェースを介して接続する。 ＦＩ−ＣＦシステムと名付けられた第１の連続フローシステムを示す。 ＬＣ−ＣＦシステムと名付けられた第２の連続フローシステムを示す。 ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳによりモニタされた、カテプシンＢによる切断後のＺ−ＦＲ−ＡＭＣのスペクトルを示す。 阻害剤アンチパイン及びＥ６４についてのフローインジェクション分析の結果を示す。３つの質量痕跡の全ては抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）であり、問題になっているイオンを、検出されたイオンの量全体から抽出したものである。最初の質量痕跡はＥＩＣがｍ／ｚ ４５６．０（形成された生成物）であり、第２の質量痕跡はｍ／ｚ １９０．７（アンチパインの断片）、第３の質量痕跡はｍ／ｚ ３５８．２（Ｅ６４）である。 記述したＬＣ−ＣＦシステムは、化合物Ｅ６４及びＣＡ−０７４の阻害能の決定に使用した。ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳはこの分析に使用し、ＥＩＣによって、形成された生成物の量を追跡した（図８、Ａ）。最初の３分間は、生成物の質量痕跡が安定していた（内部標準物質により制御された）３．８分と４．８分で、生成物の質量痕跡に負のピークが出現した。先に述べたように、これは、溶出された成分によるシグナル抑制の結果、又はカテプシンＢの阻害の結果と考えられる。内部標準物質の質量痕跡は、負のピークが阻害によって生じたことを示した。次のステップは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓソフトウェアを使用したバックグラウンドの除去によって、酵素に結合した化合物を決定することであった。抽出されたｍ／ｚ値は、ピーク１及びピーク２に関してそれぞれ３５８．２及び３８４．２であり、化合物Ｅ６４（図８、Ｃ）及びＣＡ−０７４（図８、Ｂ）のプロトン化分子に対応していた。

Claims (13)

1. 分画ステップの流出物を制御量の酵素と接触させるステップと、該酵素を該流出物中に存在することが考えられる検体と相互に作用させるステップと、前記酵素に対する制御量の基質を添加するステップと、該酵素を該基質と反応させて、１種又は複数の修飾基質生成物を提供するステップと、質量分析計を使用して、未反応の基質又は修飾基質生成物を検出するステップとを含む、オンライン検出方法。
2. 修飾基質生成物の検出を含む、請求項１記載の方法。
3. 質量分析計に入る前に、前記反応混合物を中空糸モジュールに通し、高分子量を有する分子と前記修飾基質生成物とを分離する、請求項２記載の方法。
4. 前記検出が、前記基質又は前記修飾基質生成物に固有のｍ／ｚ値に基づく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. エレクトロスプレイイオン化質量分析法を使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 質量分析計に導入する前に、前記基質との反応によって得られた反応混合物に補給流を添加する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記分画ステップが、液体クロマトグラフィー分離、キャピラリー電気泳動ステップ、又はコンビナトリアルケミストリシステムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記液体クロマトグラフィー分離ステップが、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ＣＥ、ＣＥＣ、ＩＥＦ、又はＭＥＫＣステップである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. エレクトロスプレイイオン化タイプ、大気圧イオン化タイプ、４重極タイプ、扇形磁場タイプ、飛行時間タイプ、ＭＳ／ＭＳ、ＭＳ^ｎ、ＦＴＭＳタイプ、イオントラップタイプ、及びこれらの組合せからなる群から選択された質量分析計を使用する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記酵素が２種以上の異なるタイプの酵素の混合物であり、前記基質が異なる基質の混合物中に存在し、該基質のそれぞれが前記酵素の１つに特異的である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記酵素又は前記酵素の１つがプロテインキナーゼであり、前記検出が、キナーゼ触媒反応のリン酸化生成物に関して実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 多重インレットユニットを備え、そこに多重インレットユニットの異なる分画ラインが接続されている質量分析計を使用し、各分画ラインが、請求項１〜１１のそれぞれに記載されるように制御量の酵素及び既知の基質が添加される流出物を含む、オンライン検出法。
13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって検出された化合物。