JP2005534328A - 微生物の好気性発酵によるl−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが、L−チロシン−3−ヒドロキシ−モノ−オキシゲナーゼ活性及び少なくとも代謝経路:グリコリシス、ペントースホスフェート経路、芳香族アミノ酸経路、又はそれらの派生経路を有する組み換え微生物の好気性発酵により、発酵培地中で製造されるところのL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法であって、(i)L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが発酵培地において製造されるところの成長相及び製造相、及び(ii)ダウンストリームプロセッシング相を含む方法に関し、該方法においてL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが炭素源から製造され、製造相及び/又はダウンストリームプロセッシング相の少なくとも一部の間、pHが1〜7の範囲である。
Description
1.安定なL−ドーパが、炭素源としてのグルコースからグリセロールのない状態において製造される、
2.リー等の方法において使用されていた、高価なL−チロシンの代わりに、安価で容易に入手可能な炭素源、例えばグルコースが使用され得る
ことである。
一般的手順
標準的な分子クローニングテクニック、例えばDNA単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素制限修飾、Escherichia coliの形質転換等は、サムブルック(Sambrook)等著、1989年、「分子クローニング:実験室のマニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークにより記載されたように行われた。合成オリゴデオキシヌクレオチドは、MWG−バイオテックAG、エバースベルグ、から得られた。DNA配列解析は、染料でラベルされたジデオキシ−ターミネーターを用いる鎖停止法を用いて行われた。
フィードバック耐性の(DAHP)合成酵素(aroFfbr)及びコリスメートムターゼ/プレフェネートデヒドロゲナーゼ(tyrA)をコードする人工オペロンの発現ベクター、及びオペロン3−ヒドロキシフェニルアセテート−4−ヒドロキシラーゼ(hpaB)及びフラビンNADHオキシドレダクターゼ(hpaC)を構築するベクターとしてプラスミドpJF119EHが選択された。このベクターは、フェルステ(Fuerste)ら(1986年、遺伝子(Gene)、第48巻、119〜131ページ)により構築され、このベクターは種々のグラム陰性菌におけるたんぱく質の発現に適する。pJF119EH系はイソプロピル−ベータ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導性tacプロモーター及びlacリプレッサー系(laclQ遺伝子)を使用し、これはクローン化された外部遺伝子の発現をインデューサーの不存在下において非常に低く保つことを許す。プラスミドpJF119EHは起点colE1を有し、これはプラスミドpACYCtacの起点p15aと矛盾しない。フィードバック耐性DAHP合成酵素をコードする遺伝子aroFfbrは、ジョッセク等により2001年、FEMS Microbiol. Lett第202号、145〜148ページに述べられているプラスミドpJFaroFfbrから由来する。
フィードバック耐性(DAHP)合成酵素(aroFfbr)及びコリスメートムターゼ/プレフェネートデヒドロゲナーゼ(tyrA)をコードする発現ベクターとして、プラスミドpACYCtacが使用された。プラスミドpACYCtacは、種々のグラム陰性菌におけるたんぱく質発現に適するベクターpACYCtac184(チャン(Chang)及びコーエン(Cohen)、1978年J. Bacteriol.第134巻、1141〜1156ページ)に基づく。pACYCtac184は、イソプロピル−ベータ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘発性tacプロモーター及びlacリプレッサー系(laclQ遺伝子)を使用し、このことは、クローン化された外部遺伝子の発現をインデューサーの不存在下で、非常に低く保つことを許す。プラスミドpACYCtac184は起点p15aを有し、それはpJF119EHのcolE1の起点と矛盾しない。
pACYCtacの構築のため、pACYCtac184が、製造業者(インビトロジェン社)の指示に従って、Hindlll及びNrulで消化された。ゲル電気泳動により、3300塩基対フラグメントが約940塩基対から分離され、該3300塩基対フラグメントは、製造業者(キアゲン社)の指示に従ってアガロースゲルから精製された。
Escherichia coliコリスメートムターゼ/プレフェネートデヒドロゲナーゼ(アクセション番号AE000346のヌクレオチド5877〜4740によりコードされている)をコードするtyrAのオープン・リーディング・フレーム(ORF)が、プライマーとして、(アンダーラインされたXbal制限サイトを有する)5'−CTGACGGCTCTAGAGGCTTAAGTGATTTATTATGG−3'及び(アンダーラインされたSphl制限及び開列サイトを有する)5'−ATCAGCATGCACTGAATTCTTACTGGCGATTGTC−3'(供給者MWGにより提供された)を、及び鋳型として野生型Escherichia coli株W3110の染色体DNAを使用して増殖された。ゲノムDNAは商業的供給者(マシェルリ(Macherery)及びナーゲル(Nagel))のマニュアルに従って単離された。
プラスミドpJF119EH aroFfbrtyrAが、Mlul及びSphlで開かれ、約3000の塩基対フラグメントがゲル電気泳動により単離され、次に精製された。プラスミドpACYCtacはMlul及びSphlで製造者(インビトロジェン社)の指示に従って処理され、4100の塩基対フラグメントを与え、該フラグメントは(供給者ロシュの指示に従って)Mlul及びSphlで処理されたpJF119EH aroFfbrtyrAの3000の塩基対と連結された。成功したクローニングは正しい挿入サイズを測定することにより検出された。正しい挿入サイズを明らかにするプラスミドはpACYCtac aroFfbrtyrAと呼ばれた。
Escherichia coli株ATCC11105は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(マナサス、バージニア州、アメリカ合衆国)から得られた。Escherichia coli ATCC11105の培養の為に、以下の培地成分、2.0gの酵母エキス、2.0gのカゼイン加水分解物、7.0gのK2HPO4、3.0gのKH2PO4、0.5gのクエン酸ナトリウム・3H2O、0.1gのMgSO4・7H2O、1.0gの(HH4)2SO4、2.0gのグルコース(濾過滅菌されたもの)が1リットルの蒸留水中に添加された。最終的なpHが7.0に調節された。Escherichia coli ATCC11105のゲノムDNAが市販のゲノム精製キット(マシェルリ及びナーゲル)の指示に従って単離された。
L−ドーパ生産のホストとして、W3110と表示されるEscherichia coli K12が選択された(ATCC27325)。プラスミドpACYCtac aroFfbrtyrA(実施例2)上に付与された遺伝子aroFfbr及びtyrAの複製のW3110株への導入及び発現は、L−ドーパ、L−チロシンの前駆体の生産をもたらす。
鉱物性培地は、クエン酸ナトリウム・3H2O(1.0g・l−1)、MgSO4・7H2O(0.3g・l−1)、KH2PO4(3.0g・l−1)、K2HPO4(12.0g・1−1)、NaCl(0.1g・l−1)(NH4)2SO4(5.0g−l)、CaCl2・2H20(15.0mg・l−1)、FeS04・7H2O(75.0mg・l−1)、チアミン・HCI(ビタミンB1)(5.0mg・l−1)から構成された。追加の鉱物が、微量元素溶液の形(1ml・l−1)で添加され、該溶液は、Al2(SO4)3・18H2O(2.0g・l−1),CoCl2・6H2O(0.7g・l−1),CuSO4・5H2O(2.5g・l−1)、H3BO3(0.5g・l−1)、MnCl2・4H2O(20.0g・l−1)、Na2MoO4・2H2O(3.0g・l−1)、NiSO4・6H2O(2.0g・l−1),ZnSO4・7H2O(15.0g・l−1)から構成されていた。グルコースの一水和物のストック溶液(500g・l−1)は独立してオートクレーブ処理に付され、4g・l−1グルコースの最終濃度まで滅菌された培地に添加された。
鉱物性培地は、クエン酸ナトリウム・3H2O(1.5g・l−1)、MgSO4・7H2O(0.9g・l−1)、KH2PO4(3.0g・l−1)、NaCl(1g・l−1)、(NH4)2SO4(5.0g・l−l)、CaCl2・2H2O(15.0mg・l−1)、FeSO4・7H20(112.5mg・l−1)、チアミン・HCI(ビタミンB1)(7.5mg・l−1)から構成された。
追加の鉱物が、微量元素溶液の形(1.5ml・l−1)で添加され、該溶液は、Al2(SO4)3・18H2O(2.0g・l−1),CoCl2・6H2O(0.7g・l−1)、CuSO4・5H2O(2.5g・l−1)、H3BO3(0.5g・l−1)、MnCl2・4H2O(20.0g・l−1)、Na2MoO4・2H2O(3.0g・l−1)、NiSO4・6H2O(2.0g・l−1),ZnSO4・7H2O(15.0g・l−1)から構成されていた。グルコースの一水和物のストック溶液(500g・l−1)は独立してオートクレーブ処理に付され、20g・l−1グルコースの最終濃度まで滅菌された培地に添加された。
以下の相違点をもって実施例6のように発酵が行われた:
・pHは低下されなかった
・OD620nm5(7時間後に到達された)において、IPTGが添加された。
実施例6に記載されたように製造され、pH7.5に調節された、L−ドーパが存在するところの発酵ブロスの試料(試料A)が使用された。10%のD2EHPA(pH酸性)を含む5mlのケロセンが、同じ体積の試料Aとボルテックスミキサーで30秒間激しく混合された。2相の分離後(約10分後)、L−ドーパ抽出培地(試料B)を含む水相が室温において貯蔵された。有機相に溶解されたL−ドーパは、2mlの有機相を1MKCl(pH=6.3)と30秒間激しく振とうして混合することにより再抽出された。2つの相の分離後(約10分)、L−ドーパを含む水相、再抽出培地(試料C)が室温において貯蔵された。試料A,B,Cは室温において600時間、貯蔵され、L−ドーパの濃度が、(600時間までの)時間の数点において測定された。L−ドーパ濃度はHPLC分析により時間の関数として測定された(表3を参照のこと)。
pH7.5(試料1)、pH6.5(試料2)、pH5.5(試料3)、及びpH4.5(試料4)に調節された、実施例6に記載されたように製造された、L−ドーパが存在するところの発酵ブロスの試料が使用された。
Claims (10)
- L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが、L−チロシン−3−ヒドロキシ−モノ−オキシゲナーゼ活性及び少なくとも代謝経路:グリコリシス、ペントースホスフェート経路、芳香族アミノ酸経路、又はそれらの派生経路を有する組み換え微生物の好気性発酵により、発酵培地中で製造されるところのL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの製造方法であって、
(i)L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが発酵培地において製造されるところの成長相及び製造相、及び
(ii)ダウンストリームプロセッシング相
を含む方法において、
L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが炭素源から製造されること、及び製造相及び/又はダウンストリームプロセッシング相の少なくとも一部の間、pHが1〜7の範囲であることを特徴とする方法。 - 製造されたL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが、ダウンストリームプロセッシング相において発酵培地から抽出され、そして再抽出混合物中へと再抽出されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 発酵の全製造相の間、及び/又は全ダウンストリームプロセッシング相の間、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを含む発酵培地のpH及び/又はL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを含む再抽出混合物のpHが、1〜7であることを特徴とする、請求項1又は2のいずれか1項に記載の方法。
- L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが、疎水性相互作用できる表面を有する吸着樹脂により、及び次に、結合されたL−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンの該樹脂からの再抽出混合物を用いる溶出により発酵培地から回収されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンが、インシチュー製造物回収により発酵培地から抽出されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- インシチュー製造物回収が、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニン及び微生物の細胞を含む発酵培地をフィルター上にポンプ輸送して、発酵培地から細胞を分離する工程、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを反応抽出により発酵培地から抽出し、L−3,4−ジヒドロキシフェニルアラニンを再抽出により再抽出混合物中に移す工程、及び細胞及び残った発酵培地を発酵にリサイクルさせる工程を含むことを特徴とする、請求項5に記載の方法。
- 組み換え微生物が、4−ヒドロキシフェニルアセテート3−ヒドロキシラーゼを発現する、好ましくは過剰発現することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 組み換え微生物が、FADH2−NAD−オキシドリダクターゼをコードする遺伝子を発現する、好ましくは過剰発現することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 炭素源がグルコースであることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 微生物がEscherichia coli W3110/pACYCtac aro FFBR tyrA/pJF119EHaro FFBR tyrAであることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
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