JP2005525813A

JP2005525813A - 細胞培養装置

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Publication number: JP2005525813A
Application number: JP2004506447A
Authority: JP
Inventors: オジル，ジャン−ピエール
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2003-05-16
Publication date: 2005-09-02
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Abstract

本発明は、細胞（１０）を入れるための容器（１００）を備える、とりわけ細胞（１０）培養のための装置であり、前記容器（１００）は、一種類目の流体（Ｍ１）のための少なくとも一つの第一の注入導管（１３１、１４１、１５１，１６１、１３３、１４３、１５３、１６３）と、二種類目の流体（Ｍ２）のための少なくとも一つの第二の注入導管（１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）とを有するものであり、一端が第一の注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３）に横方向に接続し他端が汲み上げ手段に接続している逆注入導管（１８１、１８２）をさらに備え、汲み上げ手段が、第二の導管（１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）による流体注入の際に、逆注入導管（１８１、１８２）を介して第一の導管内の流体を吸引するのに適しており、それによって第一の導管内の流体（Ｍ１）が容器（１００）に注入された流体（Ｍ２）の中に拡散しないことを特徴とする装置に関するものである。

Description

本発明は、手で取り扱うことなく、さまざまな培地での細胞の処理を可能にする細胞培養装置に関するものである。

仏国特許発明第２６５９３４７号明細書（１９９１年９月１３日公開）には、細胞を入れるための容器を備えた細胞培養装置について記載されている。容器は、細胞の直径よりも小さな幅を有する溝をその間に形成するよう間隔を置いて並置された二枚のガラス板から形成された水平壁を備えている。処理される細胞は溝に置かれる。この容器は、培養培地または刺激培地を入れるためのものである。さまざまな培地が、細胞を支える壁に位置づけられた個別の管によって容器に順次注入される。それはさらに、壁の下に位置する一本または複数本の管によって排出される。

この装置において細胞は、一本または複数本の排出導管による培地の吸引によって引き起こされる低圧によって溝に維持される

かかる装置はとくに卵母細胞、受精卵または胚の培養のためのものである。

とくに、該装置は実験用の卵母細胞の活性化に用いることができ、この活性化は胚のその後の良好な発生に必要なものである。この活性化を引き起こすために、容器に培養培地を注入し、活性化させる細胞をこの培養培地の中に置く。次に、イオンが豊富な培地を排出し、また同時にＣａ²⁺イオンを含む刺激培地に置換する。培養培地が完全に排出され、刺激培地に置換されると、細胞は、該細胞の細胞膜の一時的な電気透過化と細胞内へのＣａ²⁺イオンの透過を引き起こす、電界刺激にかけられる。ついで、今度は刺激培地が排出され、培養培地に置換される。これらの過程は、細胞が、それらの活性化を引き起こす一連の制御されたカルシウム刺激の影響を受けやすくするために、複数回繰り返される。

この装置の利点は、それらを手で取り扱うことなく、さまざまな培地での細胞の処理を可能にすることである。

しかしながら、この種の装置が有する問題は、ある培地から別の培地への置換にかかる時間が比較的長く、容器内の培地の交換頻度が制限されることである。

例えば、細胞活性化に装置が使用される場合、培養培地を刺激培地に置換するために刺激培地を注入する最低時間（約４０秒）が必要である。実際、この最低時間は刺激培地による細胞の十分な洗浄を保証するものである。

洗浄の最低時間が守られない場合、刺激培地は培養培地に由来する残留イオンを含むこととなる。電界をかけると、これらのイオンは膜貫通型のイオン電流を誘導し、細胞破壊が引き起こされる。

洗浄に関連するもう一つの問題は、細胞をイオン力の小さい刺激培地に長時間晒すと、細胞の平衡を乱し、該細胞を有害作用に晒すこととなるということである。細胞の生存を守るには、したがって、細胞の洗浄時間の短縮が必要となる。
仏国特許発明第２６５９３４７号明細書

本発明の一つの目的は、細胞が置かれている培地の迅速な交換を可能にする細胞培養装置を提供することである。

刺激培地の注入の際に、培養培地を注入するための導管に存在するイオンは容器に向けて移動し、刺激培地を汚染する傾向があることがわかった。この現象は、容器内のイオン濃度を十分に低下させるために必要な洗浄時間を増大させる。

したがって、本発明は、細胞を入れるための容器を備える、とりわけ細胞培養のための装置を提案するものであり、前記容器は、一種類目の流体のための少なくとも一つの第一の注入導管と、二種類目の流体のための少なくとも一つの第二の注入導管とを有するものであり、当該装置は、一端が第一の注入導管に横方向に接続し他端が汲み上げ手段に接続している逆注入導管をさらに備え、汲み上げ手段は、第二の導管による流体注入の際に、逆注入導管を介して第一の導管内の流体を吸引するのに適しており、それによって第一の導管内の流体が容器に注入された流体の中に拡散しないことを特徴とする。

この装置において、汲み上げ手段は作動していない注入導管において流体の流れを逆転させることを可能にする。この流体の一時的な「逆注入」は、容器内へのイオンの受動拡散を防ぐ。

この特徴は容器の流体の他の流体による置換の速度を大幅に向上させ、それにより置換時間は約１秒となる。

本発明の推奨実施態様によれば、装置は同一種の流体のための複数の注入導管を備え、前記注入導管の口が、容器の壁に沿って規則的な間隔で配置されている。

装置は、それぞれの流体のための複数の注入導管を備えることが可能であり、
一種類目の流体の注入導管はそれぞれ、二種類目の流体の注入導管に重なっている。

装置は、それぞれの流体のための複数の注入導管を備えることが可能であり、
一種類目の流体の注入導管はそれぞれ、二種類目の流体の注入導管と向かい合っている。

好適には、容器内の流体の他の流体による置換時間は、約１秒である。

本発明の実施態様において、装置は、容器内の流体に最大約１０ｋＶ／ｃｍの電界をかけることに適した電極を備えている。

本発明はまた、以下の過程：
・細胞を培養するために容器内に置く過程と、
・少なくとも一つの第一の注入導管を介して、一種類目の流体を所定の時間、容器に注入する過程と、
・一種類目の流体を排出し、少なくとも一つの第二の注入導管を介して、二種類目の流体を容器に同時に注入する過程、
とから成る細胞培養方法を提案するものでもあり、二種類目の流体の注入過程の間、第一の導管内の流体が容器に注入された流体に拡散しないように、第一の導管内の流体を吸引することを特徴とする。

この方法の一つの推奨実施態様によれば、その一端が第一の注入導管に横方向に接続し他端が汲み上げ手段に接続した逆注入導管を介して、第一の導管内の流体を吸引する。

この方法は、二種類目の流体を排出し、第一の注入導管を介して一種類目の流体を容器に再度注入する過程をさらに備えており、細胞が複数の種類の流体に順次浸されるように、これに続く過程を繰り返す。

この方法の一つの実施態様によれば、流体の一つを注入する間に、細胞に電界をかける。

その他の特徴と利点は付属の図面を参照に、非制限的な例として挙げられた下記の説明を読むことによって明らかになるだろう。

図１は、本発明の一つの実施態様にかなった細胞培養装置の一つの実施例を表す図である。

図２と図３は、装置が細胞の活性化に用いられる場合の、図１の装置の作動過程を示す図である。

図４は、本発明の他の実施態様にかなった細胞培養装置の一つの実施例を表す図である。

図５は、容器において処理される細胞の支持に用いることができる支持体要素の一つの実施例を示す図である。

図６は、容器において処理される細胞の支持に用いることができる支持体要素の他の実施例を示す図である。

図７は、気泡による細胞処理の妨害を避けることを可能にする装置の一つの実施例を表す図である。

図１において図示された細胞培養装置は、流体培地を入れるための室を画定する壁を備えた容器１００を備えている。この装置はこの実施例においては卵母細胞の活性化に用いられる。室には、並置された二枚のガラス板１０１と１０２によって形成された水平支持体要素がある。ガラス板１０１と１０２は、容器の側面の壁１１と１２に嵌め込まれて維持されている。これらのガラス板１０１と１０２は、互いの間に間隔があいており、処理する卵母細胞１０の直径より小さい幅を有する直線的な溝１０３が規定されるようになっている。

容器１００はまた、溝１０３の両方向に縦に延びた電極１１１と１１２を備えている。

イオンの豊富な培養培地Ｍ１は、溝１０３の両側にある室の側壁１１と１２にそれぞれ開口している二組の平行な導管１３１、１４１、１５１、１６１と１３２、１４２、１５２、１６２によって、室の上部に運ばれる。導管１３１、１４１、１５１、１６１の口は、導管１３２、１４２、１５２、１６２の口にそれぞれ向かい合っている。これらの口は、培地Ｍ１が室の上部にほぼ均一に注入されるように、容器１００の壁１１と１２に沿って規則的に配置している。

Ｃａ²⁺イオンを含む刺激培地Ｍ２も同様に、二組の平行導管１３３、１４３、１５３、１６３と１３４、１４４、１５４、１６４によって室の上部に運ばれるものであり、該平行導管は、培地Ｍ１を運ぶ導管の束と類似のものであり、またそれに重なっている。

容器内の、処理中の相に対応する培地は、支持体要素よりも低いところに位置する排出導管１０４によって排出される。液体の流れは、卵母細胞１０を低圧によって溝１０３に貼り付いた状態で維持する。

平行導管１３１、１４１、１５１、１６１は、横断注入導管１７１に接続している。横断導管１７１は、その一端が、培地Ｍ１を構成する流体の注入手段に接続している。この導管１７１は、その他端が、この図には図示されていない汲み上げ手段に接続された逆注入導管１８１となって延びている。

対称的に、平行導管１３２、１４２、１５２、１６２は、横断注入導管１７２に接続している。横断導管１７２は、その一端が、培地Ｍ１の注入手段に接続している。この導管１７２は、その他端が、汲み上げ手段に接続された逆注入導管１８２となって延びている。

同様に、平行導管１３３、１４３、１５３、１６３は、その口と反対の端が、横断注入導管１７３に接続している。横断導管１７３は、その一端が、培地Ｍ２を構成する流体を入れたタンクに接続している。この導管１７３は、その他端が、同様に汲み上げ手段に接続した逆注入導管１８３となって延びている。

最後に、対称的に、平行導管１３４、１４４、１５４、１６４は、その口と反対の端が、横断注入導管１７４に接続している。横断導管１７４は、その一端が、培地Ｍ２を入れたタンクに接続している。この導管１７４は、その他端が、汲み上げ手段に接続した逆注入導管１８４となって延びている。

室内の、処理中の相に対応する培地は、卵母細胞１０よりも低いところに位置する排出導管１０４によって排出される。液体の流れは、卵母細胞を低圧によって溝１０３に張り付いた状態で維持する。

次に、この装置によって実施可能な処理例の過程を説明する。

室は、培養培地Ｍ１に対応する流体であらかじめ満たされているものとする。

図２において、培養培地Ｍ１が刺激培地Ｍ２に置換される第一の処理過程を示した。この過程では、矢印で示したように、導管１７１と１７２による培地Ｍ１の注入を停止し、導管１７３と１７４によって培地Ｍ２を注入する。培地Ｍ１は、排出導管１０４によって排出される。

導管１３１、１４１、１５１、１６１と１３２、１４２、１５２、１６２に満たされている培養培地Ｍ１に含まれるイオンは、イオン濃度が高い区域からイオン濃度が低い区域、すなわち室内の流体に向かって移動する傾向を当然有する。なぜなら、培地Ｍ１が培地Ｍ２に置換されるにつれて室内の流体はイオンが乏しくなり、培地Ｍ１から培地Ｍ２に向かうイオンの拡散を招くためである。

この現象に対処するために、注入導管１３１、１４１、１５１、１６１と１３２、１４２、１５２、１６２内の流れを逆転させるように、導管１８１と１８２に接続した汲み上げ手段を作動させる。

この一時的な逆注入は、培養培地Ｍ１から室へのイオンの拡散を防ぐものである。

毎時１００ｍＬの非イオン性流体の室への定格注入量に対し、定格流量よりわずかに低い毎時７．９ｍＬの逆注入流によって、１秒未満でイオン拡散を停止させることができる。

注入導管が側壁に沿って配置しているため、室の各所において培地Ｍ２による培地Ｍ１の置換速度を向上させることが可能となる。

この第一過程である培地Ｍ２による培地Ｍ１の置換の後、卵母細胞１０は、刺激培地によって完全に洗浄される。該卵母細胞は、最大約１０ｋＶ／ｃｍに達する電界をかけられる。電界は、卵母細胞１０の細胞膜の電気透過化と該細胞の中へのＣａ²⁺イオンの透過を引き起こす。

図３において、刺激培地Ｍ２を培養培地Ｍ１によって置換する第二の処理過程を示した。この課程によれば、矢印で示したごとく、導管１７３と１７４による培地Ｍ２の注入を停止し、導管１７１と１７２によって培地Ｍ１を注入する。培地Ｍ２は、排出導管１０４によって排出される。

第一の過程と同様に、注入導管１３３、１４３、１５３、１６３と１３４、１４４、１５４、１６４内の流れを逆転させるように、導管１８３と１８４に接続した汲み上げ手段を作動させることができる。

二つの種類の異なる流体の注入の枠内で、図１の装置の使用を説明した。この注入は、順次または同時に行うことが可能であるため、このタイプの装置はＮ種の流体の注入に応用できることが理解される。

流体の注入量の比例調節は、イオン、粒子あるいは分子の一つのまたは複合的な濃度の一時的な変動を室内で制御することを可能にする。

この装置は、これらの変動の頻度を正確に調節することも可能にする。卵母細胞の活性化において、カルシウムの刺激頻度は、活性化させる卵母細胞のタイプに応じて調節することが可能である。

図４において図示した培養装置は、二本の注入導管１３１と１３４を有する点を除いて図１から３のものと類似しているが、これらの導管はそれぞれ流体Ｍ１とＭ２を注入するためのものである。それぞれの注入導管１３１、１３４は全体的に三角形の形状を有し、その頂点はそれぞれ横断導管１７１、１７４に接続し、その底辺は室の側壁１１と１２の中に注入口を形成している。

注入導管１３１と１３４の口は、培地Ｍ１とＭ２が室の上部にほぼ均一に注入されるように容器１００の壁１１と１２に沿って延びている。

この実施態様はとくに有利であるが、なぜなら、それはほぼ層流である注入流を発生させ、結果、室の壁に沿ってほぼ均一な注入流を保証することができるためである。

その他に、容器内の培地の注入と排出によって発生した流体の流れの影響で細胞が移動する傾向があり、この移動がとりわけそれらの凝集を引き起こすことができることがわかった。

図１に示した装置の場合、流体の流れは、支持体要素の溝に沿った、室の中心への細胞の移動を引き起こし、細胞は室の中心で一つにまとまる。細胞は互いに押し付けられる。細胞間の空間の減少は、それぞれの細胞の周縁での洗浄の効率を変化させる。

この不都合を解消するために、本発明はまた、細胞が置かれる容器を備える、とりわけ細胞培養のための装置を提案するものであり、該容器は、少なくとも一つの流体注入導管と流体吸引導管、ならびにその上に細胞が置かれる孔を備えた支持体要素を備えており、そして該装置は、細胞を入れるための孔を有する支持体要素を備え、それぞれの孔は、単一の細胞を入れるためのものであり、細胞の直径より小さい少なくとも一つの最小寸法と、孔の最小寸法より大きい少なくとも一つの最大寸法を有しており、それにより孔が流体の通過を可能にしつつも細胞の支持体要素の通過を不可能にし、そして容器内の流体が、孔の上への細胞の固定を保証する低圧を生じさせるように、孔を通って取り除かれることを特徴とするものである。

この装置の原理は、細胞がその位置に維持されなければならない一方で流体が循環する、あらゆるタイプの容器に適用することが可能である。

この装置において、それぞれの孔は一つだけ細胞を入れられる。この特徴は、容器内の液体の注入と排出によって生ずる流体の流れによる細胞の移動を防ぐことを可能にする。

さらに、これらの孔は細胞が互いに凝集することを防ぎ、このことが優れた洗浄を保証する。実際、洗浄流体は細胞の周縁全体を回り、孔から排出される。細胞の洗浄は効果的であり、それによって先行技術の装置よりも必要な洗浄時間が短縮される。

好適には、孔の最大寸法は最小寸法の２倍より大きい。

さらに、孔の最大寸法は好適には８０μｍより大きい。

さらに、孔の最小寸法は４０μｍ未満である。

この特徴は、孔の中の細胞の壁の一部が塞がれることを防ぐことを可能にする。このことは、処理培地による細胞の効率的な洗浄または細胞の壁全体に電界をかけることを可能にする。

本発明の一つの実施態様において、孔の形は長円形である。

本発明の他の実施態様において、孔は全体的に十字の形状を有する。

典型的には、孔同士の間には１２０μｍと２４０μｍの間に含まれる間隔がある。

図５に、第一のタイプの支持体要素１０５を示した。この支持体要素は、図１に示したように、容器の側壁に嵌め込まれる二枚のガラス板１０１と１０２が並置されて形成されている。これらのガラス板１０１と１０２は、互いの間に間隔があいており、幅ｌ＝２０μｍを有する直線的な溝１０３が規定される。

処理される細胞の直径は細胞の種類によって変化する。これらの細胞は、一般的に約８０μｍと１６０μｍの間の直径を有する。したがって、処理される細胞１０の種類を問わず、溝の幅は常に細胞の直径Ｄより小さい（これらの細胞は点線で示した）。

ポリマー製のパッキング１１５が、溝１０３に規則的な間隔で設けられ、上に細胞１０が置かれる小空間１１６を形成する。小空間１１６は、長さＬ＝２×ｌ＝４０μｍの長円形の形状を有する。

小空間１１６は、それぞれ細胞１０を一つ入れるためのものである。小空間の幅ｌは細胞の直径より小さく、細胞はガラス板１０１と１０２に張り付けられた状態で維持される。小空間の長さはその幅ｌより大きく、細胞は小空間を完全には塞がない。この特徴は、細胞の両側を流体の流れが通過することを可能にする。したがって、細胞の効率的な洗浄が維持される。

さらに、細胞１０を離れた小空間で維持することにより、その凝集が阻止される。

一つの変型例において、図５の支持体要素は単一のガラス板で形成され、小空間１１６はガラス板に空けられた長円形の孔である。

小空間は、好適には１２０μｍと２４０μｍの間に含まれる規則的な間隔で、ガラス板上に位置している。

図６において、第二のタイプの支持体要素１０６を図示した。この支持体要素は単一のガラス板で形成され、該支持体要素の中に小空間１１７が形成されている。小空間１１７は、全体的に十字の形状をした孔である。十字の腕の幅ｌは細胞の直径Ｄより小さく、十字の各腕の長さＬは、幅ｌより大きいものである。

もちろん、他の形状の小空間も実現可能である。細胞を支持体要素上に保持するために、これらの小空間は、最大でも細胞の直径より小さい寸法ｌを有する。細胞の周囲の流体の循環を保証するために、これらの小空間は少なくとも幅ｌより大きい寸法Ｌを有する。

しかしながら、寸法ｌは最小の細胞の寸法に近すぎてはならない。例えば、支持体要素よりも高い位置での細胞の維持を保証するためには、寸法ｌは好適には４０μｍ未満である。なぜなら、寸法ｌが細胞の直径に近すぎる場合、小空間を通過する流体の流れによって生じた低圧により、直径の小さい細胞が小空間を通って部分的に吸引されるためである。その結果、これらの細胞の壁の一部が塞がれることになる。したがって、細胞の壁のこの塞がれた部分は、処理培地による洗浄または電界の印加を受けなくなる。施された処理の効率は、低下することになる。

同じくその他に、細胞培養装置の流体回路の壁に気泡の形成が認められた。これらの気泡は導管内に自然発生し、流体の流れによって運ばれた。気泡は細胞に衝突し、該細胞を固定位置から移動させる。

とくに図１の培養装置の場合、細胞は運ばれて、電極の間で重なる。それらは、電気的刺激の瞬間に、電極の間に伝導性のブリッジを生成する可能性がある。それらの細胞は時に液体の流れによって室外に排出されることもある。

気泡による細胞処理の妨害は、処理の成功を決定的に損なうものである。

この不都合を解消するために、本発明は、その中に細胞が置かれる容器を備え、該容器が少なくとも一つの流体注入導管と流体吸引導管を備える、とりわけ細胞培養のための装置において、注入導管の口の前に位置する格子をさらに備えることを特徴とする装置を提案する。

この格子は、細胞がその位置に維持されなければならない一方で流体が循環する、あらゆるタイプの容器において使用することができる。

この装置において、格子は注入導管の出口で気泡を回収することを可能にする。格子に誘導された気泡は、このとき室の流体の表面に集まる傾向がある。したがって、細胞はその場に留まる。

典型的には、格子はそのパターンが約１００μｍの寸法を有する網目を有する。

好適には、格子は注入導管の口から約十分の数ミリメートルから１ミリメートルの距離に置かれる。

同様に好適には、格子は水平に対してほぼ７０度に等しい角度で傾けられる。

本発明の実施態様において、格子は、流体表面の気泡が格子を迂回するのを防止するために、流体の自由表面の上に横に伸びた邪魔版を備えている。

好適には、一つまたは複数の格子は、それぞれの流体注入導管の口の前に延びている。

他方で、導管の口が容器の相対する二つの側壁上にあるため、装置は、それぞれが側壁の一方に面して延びている二つの格子を備えることができる。

図７に示した、図１に示したものに類似の装置では、気泡を回収するために、束になっている導管の口１３１、１３３、１４１、１４３、１５１、１５３、１６１、１６３および１３２、１３４、１４２、１４４、１５２、１５４、１６２、１６４に、それぞれ向かい合って二つの格子１９１と１９２が対称に位置している。各格子１９１、１９２の網目は、約１００μｍ×１００μｍの寸法を有する。かかる網目を有する格子１９１、１９２は、注入された流体の流れを変えることなく、注入導管から発生する気泡を逃がす。

格子１９１の下部は、下側の導管１３３、１４３、１５３、１６３の口から約１ｍmの距離に位置している。さらに、水平に対して約７０度の角度で傾けられている。

同様に、格子１９２の下部は、下側の導管１３４、１４４、１５４、１６４の口から約１ｍmの距離に位置している。また、水平に対して約７０度の角度で傾けられている。

格子の傾きは、気泡の流れを容器内の流体Ｍの自由表面に向かって方向付ける。

一部の気泡は流体の表面に達して破裂する。

より安定した他の気泡は集まる。これらの気泡は融合して、より大きい気泡を形成することがある。

表面張力は、気泡が流体の自由表面上に上昇することを可能にする。

格子１９１、１９２は、さらに流体Ｍの自由表面の上に横に伸びた邪魔板１９３と１９４を備えている。これらの邪魔板は、容器１００の壁の付近で表面張力によって生じた流体のブリッジを気泡が辿って細胞１０が置かれている室の中心部分に達することを避ける。

これらの格子は、金属またはプラスチックで実現することが可能である。

本発明の一つの実施態様にかなった細胞培養装置の一つの実施例を表す図。装置が細胞の活性化に用いられる場合の、図１の装置の作動過程を示す図。装置が細胞の活性化に用いられる場合の、図１の装置の作動過程を示す図。本発明の他の実施態様にかなった細胞培養装置の一つの実施例を表す図。容器において処理される細胞の支持に用いることができる支持体要素の一つの実施例を示す図。容器において処理される細胞の支持に用いることができる支持体要素の他の実施例を示す図。気泡による細胞処理の妨害を避けることを可能にする装置の一つの実施例を表す図。

符号の説明

１０細胞
１１、１２壁
１００容器
１０１、１０２ガラス板
１０３溝
１０４排出導管
１０６支持体要素
１１１、１１２電極
１１５パッキング
１１６、１１７小空間、孔
１３１〜１３４、１４１〜１４４、１５１〜１５４、１６１〜１６４注入導管
１７１〜１７４横断注入導管
１８１〜１８４逆注入導管
１９１、１９２格子
１９３、１９４邪魔版
Ｍ１培養培地
Ｍ２刺激培地

Claims

細胞（１０）を入れるための容器（１００）を備える、とりわけ細胞（１０）培養のための装置であり、前記容器（１００）は、一種類目の流体（Ｍ１）のための少なくとも一つの第一の注入導管（１３１、１４１、１５１，１６１、１３３、１４３、１５３、１６３）と、二種類目の流体（Ｍ２）のための少なくとも一つの第二の注入導管（１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）とを有するものであり、一端が第一の注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３）に横方向に接続し他端が汲み上げ手段に接続している逆注入導管（１８１、１８２）をさらに備え、汲み上げ手段が、第二の導管（１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）による流体注入の際に、逆注入導管（１８１、１８２）を介して第一の導管内の流体を吸引するのに適しており、それによって第一の導管内の流体（Ｍ１）が容器（１００）に注入された流体（Ｍ２）の中に拡散しないことを特徴とする装置。
同一種の流体のための複数の注入導管を備え、前記注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３；１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）の口が、容器（１００）の壁（１１、１２）に沿って規則的な間隔で配置されていることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
口が容器（１００）の壁（１１、１２）の一つに沿って延びている注入導管（１３１、１３４）を備えていることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
全体的に容器（１００）に向けて口が広がっていっている形状を有する注入導管（１３１、１３４）を備えていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つに記載の装置。
容器（１００）の向かい合う二つの壁（１１，１２）に、口が互いに向かい合って配置された複数の注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３、１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）を備えていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一つに記載の装置。
容器中の流体が他の流体に置換される時間が約１秒であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つに記載の装置。
容器内の流体に最大約１０ｋＶ／ｃｍの電界をかけることに適した電極（１１１、１１２）を備えていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一つに記載の装置。
細胞（１０）を入れるための孔（１１６、１１７）を有する支持体要素（１０５、１０６）を備え、それぞれの孔（１１６、１１７）が単一の細胞（１０）を入れるためのものであり、細胞（１０）の直径（Ｄ）より小さい少なくとも一つの最小寸法（ｌ）と、孔の最小寸法（ｌ）より大きい最大寸法（Ｌ）を有しており、それにより、孔（１１６、１１７）が、流体の通過を可能にしつつも細胞（１０）の支持体要素（１０５、１０６）の通過を不可能にし、そして容器（１００）内の流体が、孔の上への細胞（１０）の固定を保証する低圧を生じさせるように、孔（１１６、１１７）を通って取り除かれることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つに記載の装置。
孔（１１６、１１７）の最大寸法（Ｌ）がその最小寸法（ｌ）の２倍より大きいことを特徴とする、請求項８に記載の装置。
孔の最大寸法（Ｌ）が８０μｍより大きいことを特徴とする、請求項８または９のいずれか一つに記載の装置。
孔の最小寸法（ｌ）が４０μｍ未満であることを特徴とする、請求項８から１０のいずれか一つに記載の装置。
孔（１１６、１１７）が長円形の形状を有することを特徴とする、請求項８から１１のいずれか一つに記載の装置。
孔（１１６、１１７）が全体的に十字の形状を有することを特徴とする、請求項８から１３のいずれか一つに記載の装置。
孔同士の間には１２０と２４０μｍの間に含まれる間隔があることを特徴とする、請求項８から１２のいずれか一つに記載の装置。
注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３；１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）の口の前に位置する格子（１９１、１９２）をさらに備えることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一つに記載の装置。
格子がそのパターンが約１００μｍの寸法を有する網目を有することを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
格子（１９１、１９２）が注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３；１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）の口から０．５ｍｍと１ｍmの間に含まれる距離に設置されていることを特徴とする、請求項１５または１６のいずれか一つに記載の装置。
格子（１９１、１９２）が水平に対してほぼ７０度に等しい角度で傾けられることを特徴とする、請求項１５から１７のいずれか一つに記載の装置。
格子（１９１、１９２）が、流体表面の気泡が格子（１９１、１９２）を迂回するのを防止するために、流体の自由表面の上に横に伸びた邪魔板（１９３、１９４）を備えていることを特徴とする、請求項１５から１８のいずれか一つに記載の装置。
一つまたは複数の格子が、それぞれの流体注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３；１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）の口の前に延びていることを特徴とする、請求項１５から１９のいずれか一つに記載の装置。
導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３；１３２、１４２、１５２、１６２、１３４、１４４、１５４、１６４）の口が容器（１００）の相対する二つの側壁（１１、１２）上にあるため、それぞれが側壁（１１、１２）の一方に面して延びている二つの格子（１９１、１９２）を備えることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
一つまたは複数の格子が金属製またはプラスチック製であることを特徴とする、請求項１５から２１のいずれか一つに記載の装置。
・細胞（１０）を培養するために容器（１００）内に置く過程と、
・少なくとも一つの第一の注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３２、１４２、１５２、１６２）を介して、一種類目の流体（Ｍ１）を所定の時間、容器（１００）に注入する過程と、
・一種類目の流体（Ｍ１）を排出し、少なくとも一つの第二の注入導管（１３３、１４３、１５３、１６３、１３４、１４４、１５４、１６４）を介して、二種類目の流体（Ｍ２）を容器（１００）に同時に注入する過程とから成り、
二種類目の流体（Ｍ２）の注入過程の間、第一の導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３２、１４２、１５２、１６２）内の流体（Ｍ１）が容器（１００）に注入された流体（Ｍ２）に拡散しないように、第一の導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３２、１４２、１５２、１６２）内の流体を吸引することを特徴とする、細胞（１０）の培養方法。
その一端が第一の注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３３、１４３、１５３、１６３）に横方向に接続し他端が汲み上げ手段に接続した逆注入導管（１８１、１８２）を介して、第一の導管内の流体（Ｍ１）を吸引することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
二種類目の流体（Ｍ２）を排出し、第一の注入導管（１３１、１４１、１５１、１６１、１３２、１４２、１５２、１６２）を介して一種類目の流体（Ｍ１）を容器（１００）に再度注入する過程をさらに備え、細胞（１０）が複数の種類の流体に順次浸されるように、これに続く過程が繰り返されることを特徴とする、請求項２３または２４のいずれか一つに記載の方法。
一つの流体を注入する間に、細胞（１０）に電界をかけることを特徴とする、請求項２３から２５のいずれか一つに記載の方法。
容器中の流体が他の流体に置換される過程が約１秒かかることを特徴とする、請求項１から２６のいずれか一つに記載の方法。