JP2005523314A5

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Publication number: JP2005523314A5
Application number: JP2003585668A
Authority: JP
Filing date: 2003-04-18
Publication date: 2006-04-20

Description

電位依存性イオンチャンネル（Voltage-gated ion channel）は、古典的には、興奮性組織におけるインパルス伝導と関連づけられたものであるが、様々な上皮細胞型においても見いだされ、それらの機能はよく知られていない。９つの哺乳類ナトリウムチャンネル遺伝子が同定されており、発現され、かつ機能性であることがわかった。これらの遺伝子は、膜内外および細胞外ドメイン中のアミノ酸配列の同一性が５０％を超える。近年、数種の電位依存性イオンチャンネルが、ラットおよびヒト前立腺ガン細胞において発見された。幾つかの独立して行われた研究が、前立腺の電位依存性ナトリウム(Ｎａ^＋)チャンネルのαサブユニットを、ＬＮＣａＰおよびＰＣ-３を包含するヒト前立腺細胞系の侵襲性と関連づけた(参照、Diss、et al.,The plostate,48:165-178、2001およびSmith et al., FEBS Letters,423:19-24,1998.)。さらに、全細胞のパッチ・クランプを用いる電気生理学試験から、その同定された前立腺細胞ナトリウムチャンネルが、６００ｎＭでのテトロドトキシン(ＴＴＸ)に感受性であることが示唆され、該チャンネルを電位依存性のＴＴＸ感受性Ｎａ^＋チャンネルタンパク質として同定した。

前立腺新生物は、最も一般的なガンの要因、アメリカ合衆国の男性のガンによる死亡に関する第２の主要原因である。２００２年においては、約１８９０００の人は、前立腺ガンとして診断されており、約３００００人がこの疾患により死亡している。ヒト前立腺ガン細胞は、電位依存性ナトリウムチャンネル、ニューロンのサブタイプと類似する２６０Ｋｄの膜内外タンパク質を発現する。全細胞のパッチクランプ実験は、前立腺電位ナトリウムチャンネル(ＰＶＳＣ)が、ニューロンのサブタイプと類似した機能であることを示唆する。顕著に、前立腺ガン細胞におけるＮａ^＋チャンネルの発現は、高度な転移性の細胞系ＭＡＴ−ＬｙＬｕ(ラット)における侵襲性に対して正の相関を示していた。ＰＶＳＣは、テトロドトキシン（ＴＴＸ)に感受性であることが見いだされ、ＴＴＸがＰＣ-３細胞（ヒト)の侵襲性を３１％（Ｐ＝０.０２）阻害することを報告された（Laniado, et al. American Journal of Pathology,150(4):1213 21,1997）。さらに、ＴＴＸ（６ｍＭ）は、前立腺ガン細胞形態（細胞突起長および場直径の低下、細胞体直径および突起高の増加を包含する）の変化を生じた［S.P. Fraser,Y. Ding, A. Liu,C.S. Foster M.B.A. Djamgoz. Cell Tissue Research. 295: 505 512,1999およびGrimes JA. Djamgoz MB. Journal of Cell Physiology. 175(1):50 8,1998］。そのため、ＰＶＳＣは、潜在的な前立腺ガン治療のための有効な標的となり、そのため、このナトリウムチャンネルの新規阻害剤に対する必要性を示す。

本明細書中で使用される用語「医薬的に許容し得る担体」は、任意の標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば、油／水または水／油型エマルジョン、および様々な型の湿潤剤を包含する。該用語は、ＵＳ連邦政府の規制機関によって承認されているか、またはヒトを含む動物において使用するためにＵＳ薬局方に掲載されている、いずれかの薬剤を包含する。

本明細書中で使用される用語「抗腫瘍剤」は、新生物疾患を処置するための有用性を持つことが証明された、当業者に既知の薬剤に関する。例えば、抗腫瘍剤には、これらに限定されないが、抗体、毒素群、化学療法剤、酵素、サイトカイン、放射性核種、光力学的剤および血管形成阻害剤が包含される。毒素には、レシチンＡ鎖、変異Pseudomonas菌体外毒素、ジフテリア変性毒素、ストレプトニグリン、ボアマイシン（boamycin）、サポリン（saporin）、ゲロニンおよびヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が包含される。化学療法剤には、５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)、ダウノルビシン、シスプラチン、ブレオマイシン、メルファラン、タキソール、タモキシフェン、マイトマイシン-Ｃおよびメトトレキサートが包含される。放射性核種には、放射性金属（radiometal）が包含される。光力学的薬剤は、ポルフィリンおよびそれらの誘導体を包含する。血管形成阻害剤は、当業者には既知であり、天然および合成バイオ分子、例えば、パクリタキセル、Ｏ−(クロロアセチル-カルボミル)フマジロール（fumagillol）(「ＴＮＰ−４７０」または「ＡＧＭ１４７０」)、トロンボスポンジン-１、トロンボスポンジン-２、アンギオスタチン、血管形成のヒト軟骨細胞-誘導阻害剤（「hＣＨＩＡＭＰ」)、軟骨誘導性血管新生阻害剤、血小板ファクター−４、グロベータ、ヒトインターフェロン誘導性タンパク質１０(「ＩＰ１０」)、インターロイキン１２、Ｒｏ318220、トリシクロデカン-９-イル、キサンタン(「Ｄ６０９」)、イルソグラジン（irsogladine）、８,９-ジヒドロキシ-７-メチル-ベンゾ[ｂ]キノリジウム臭化物(「ＧＰＡ１７３４」)、メドロキシプロゲステロン、ヘパリンおよびコルチゾンの組合せ、グルコシダーゼ阻害剤、ゲニステイン、サリドマイド、ジアミノ-アントラキノン、ハービマイシン（herbimycin）、ウルソール酸（ursolic acid）およびオレアノール酸を包含する。

本発明のひとつの態様は、新生物細胞を標的とし、また転移を阻害する新規方法として、電位依存性ナトリウムチャンネル群の阻害を指向する。いくつかの研究が、前立腺ガン細胞においてナトリウムチャンネルアイソタイプの存在を同定した。２つの高転移性前立腺上皮腫瘍細胞系ＭＡＴＬｙＬｕ(ラット)およびＰＣ-３(ヒト)由来のナトリウムチャンネルｍＲＮＡが完全長の骨格筋型１(ＳｋＭ１)として同定された。イン・シチュ・ハイブリダイゼーションデータから、ｒＳｋＭ１ｍＲＮＡ発現のレベルおよびパターンは、著しく異なる転移能を示すDunning 細胞において違っていることが示唆された。興味深いことに、ｍＲＮＡの同じ型が、ＡＴ２(ラット)およびＬＮＣａＰ(ヒト)ＰＣａ細胞の低転移性対応細胞においても検出された。Dissら(The Prostate, 48:165-178、2001)は、いくつかの前立腺ガン(ＰＣａ)細胞系におけるナトリウムチャンネルｍＲＮＡの発現プロファイルを決定するために半定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法(ＲＴＰＣＲ)を用いた。これらの結果は、ＬＮＣａＰ細胞において、４種の異なるＶＧＳＣ遺伝子が９種類の組換え変異体を発現し、一方ＰＣ-３が同じｍＲＮＡの１１種の組換え変異体を有するということを示す。これらの組換え変異体の多くは、ＶＧＳＣの胎児形態をコードする。最近、前立腺ガン細胞が、電位依存性ナトリウムチャンネル（ＶＧＳＣ）を発現し、そして該チャンネルタンパク質の活性が細胞の侵襲性と相関するということが報告された。

ウエスタンブロッティングおよびフローサイトメトリーによるＬＮＣａＰおよびＰＣ-３のヒト前立腺ガン細胞系におけるＶＧＳＣの研究から、このチャンネルがαサブユニットの代表的な２６０ｋｄのタンパク質であることが明らかとなった(Komuro, et al., Science,257:806-809,1992)。全細胞のパッチクランプ技術を用いた電気生理学試験で、このチャンネルによって励起された電流が、６００nmol/Lでテトロドトキシン(ＴＴＸ)によって阻害されたことが示され、このことから、Ｎａ^＋チャンネルとして該サブユニットが同定された。さらに、ラット前立腺ガンのDunningモデルから誘導された高転移性（ラット)_ｍＡＴＬｙＬｕのＰＣａ細胞系はＶＧＳＣを発現し、一方低転移性(ラット)ＡＴ２ＰＣａ細胞系では発現しないことが報告された。ＴＴＸによるＮａ^＋電流の遮断は、イン・ビトロでのＭＡＴＬｙＬｕ細胞の侵襲性を顕著に低下させ、そのことは発現されたチャンネルが転移において機能的役割を果たすことを示唆している。さらに、イン・ビトロでのＭＡＴＬｙＬｕ細胞の侵襲性は、特異的なＶＧＳＣ阻害剤であるＴＴＸ６μＭによって５０％まで阻害された。ＴＴＸ暴露(２４時間、６μＭＴＴＸ、ＭＡＴＬｙＬｕのインキュベーション)は、また、攻撃的または大きな運動性表現型と関連のあるいくつかの形態的特徴を変化させた（特に、ＴＴＸへの暴露は、細胞突起長および場直径を低下させ、細胞体直径および突起高を増加させた）。

近年、Abdulらは、ＰＣａ試料が正常な前立腺と比較して非常に高レベルのナトリウムチャンネル発現を有することを示した(参照、Anticancer Research, 21(3B):2045-8, 2001)。さらに、彼らは、ＶＧＳＣ開放剤［ベラトリン]が増殖を増加させるのに対して、ＶＧＳＣ遮断剤［フルナリジンおよびリルゾール］がマイクロモル範囲でＰＣａ細胞増殖の用量依存的阻害を起こすことも示した。まとめると、これらの研究は、ラットおよびヒト由来の両方のＰＣａ細胞系が、これらの細胞系の腫瘍発生挙動の一部分であるＶＧＳＣを発現することを確立している。

本発明のひとつの実施態様に従って、新生物疾患、例えば、前立腺ガンに罹患しているヒトを包含する恒温脊椎動物対象を処置するための方法を提供するものである。該方法は、一般構造式:

［式中、Ｒが、Ｃ_１-Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２-Ｃ_８アルケニル、Ｃ_２-Ｃ_８アルキニル、-(ＣＨ_２)_ｎＣ_３-Ｃ_６シクロアルキル、

（式中、ｎは０−４の範囲の整数である。）からなる群から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、Ｃ_１-Ｃ_８アルキル、-(ＣＨ_２)_ｎＣＯＯＨ、-(ＣＨ_２)_ｎＮＨ_２、-(ＣＨ_２)_ｎＮＨＣＨ_３および-(ＣＨ_２)_ｎＣＯＮＨ_２からなる群から選択され、
Ｒ_４およびＲ_５は、独立して、Ｈ、ハロ、Ｃ_１-Ｃ_４アルキル、Ｃ_２-Ｃ_４アルケニル、Ｃ_２-Ｃ_４アルキニル、-ＣＯＲ_１１および(Ｃ_１-Ｃ_４)アルコキシからなる群から選択され、そして
Ｒ_６は、Ｈ、ハロ、

（式中、Ｒ_１１は、Ｈ、Ｃ_１-Ｃ_４アルキル、ＮＨ_２およびＯＨからなる群から選択される。）からなる群から選択される。］によって示されるナトリウムチャンネル遮断化合物を含む、有効量の組成物を、そのような患者に投与する過程を含む。ひとつの好ましい実施態様において、該患者は、式ＩＩＩまたはＩＶの一般構造式［式中、Ｒは、Ｃ_１-Ｃ_１２アルキルからなる群から選択され、Ｒ_２はＨであり、Ｒ_４およびＲ_５は、独立して、Ｈ、ハロおよびＣ_１-Ｃ_４アルキルからなる群から選択され、そしてＲ_６は、Ｈ、ハロ、

（式中、ｎは１または２である。）
からなる群から選択される。］によって示される化合物で処置される。

これらのナトリウムチャンネル遮断化合物は、ガン患者を効果的に処置するために、その他既知の抗腫瘍剤または治療法、例えば化学療法剤または照射治療と組合せ得るか、または同時に使用され得る。

本明細書中に開示しているように、２つのクラスのナトリウムチャンネル遮断剤は、前立腺ガン細胞増殖の有効な阻害剤であると示されてきた。一般構造式ＩＩＩのヒドロキシアミドおよび一般構造式ＩＶのヒダントインの両方は、イン・ビトロで、アンドロゲン依存性および非依存性細胞系を阻害することが示された。ヒダントインアナログ４４を使用したＰＣ-３細胞中のトリチウム化したチミジン取込みアッセイは、４０μＭ(参照、実施例４に記載の表３)でＤＮＡ合成５５％の阻害を示した。さらに、これらのアナログは、処置２４時間後の細胞生存性に対して、単に微小な影響を示したにすぎなかった(実施例４中の表４)。本発明のナトリウムチャンネル化合物は、数種以上の細胞系で長期増殖アッセイにおいて選択的な増殖阻害も示した。前立腺新生物の発達において、腫瘍初期時から侵襲性癌腫への転換期は、４０および５０代の男性で発症することが多く、何十年にもわたって悪化する。この疾患の遷延的進行のため、化学的予防ストラテジーまたは細胞増殖抑制ストラテジーは前立腺ガンの処置において理想的であろう。

スキームＩＩ

実施例２
３ＨＢＴＸＢ結合に対する合成化合物の効果
ナトリウムチャンネル活性のモジュレーターのための、化合物のスクリーニングに使用したアッセイは、放射性リガンド３[Ｈ］ＢＴＸ-Ｂアッセイの使用に基づく。ＢＴＸは、チャンネルタンパク質上のサイト２に結合し、その結果、ナトリウムチャンネルに結合するＢＴＸと競合するか、阻害し得る化合物が、潜在的なナトリウムチャンネル阻害剤である。このアッセイは、より厳格な機能的アッセイ、例えば電気生理学により化合物を評価する前にナトリウムチャンネルの結合をプレスクリーンするための有用な手段である。化合物２および４４は、フェニトインと比べて、３Ｈ-ＢＴＸ-Ｂ結合の効果的な阻害を示す (表１を参照)。
表１：３Ｈ-ＢＴＸ-Ｂ阻害データ

実施例３
電気泳動：ナトリウム電流に対する合成化合物の効果
いくつかの合成化合物の機能的ナトリウムチャンネル遮断能力を、電気生理学的に測定した。ナトリウムチャンネルアイソフォームを安定に発現するチャイニーズハムスターの卵巣細胞(ＣＨＯ細胞)を用いて、Ｎａｖ１.５、ナトリウム電流を、２５ｍｓ、５ｍＶの過程で、−１２０ｍＶの保持電位から−８０ｍＶ〜＋６０ｍＶの連続した電圧の範囲に励起した。これらの電流−電圧の記録を、薬物の非存在下および存在下およびウォッシュアウト後において行った。全ての効果は、ウォッシュアウトで完全に可逆的であり、これは、該化合物が細胞に毒性でなかったことを示唆するものである。表２に、全ての試験化合物について得られたＩＣ_５０を列記した。これらの試験結果は、本発明の化合物がＮａチャンネル電流を遮断することを直接的に示すものである。
表２

新規ナトリウムチャンネル遮断剤が細胞増殖抑制性または細胞毒性阻害剤であるかを決定するために、ＭＴＴを用いて該アナログによるＰＣ-３細胞処置後に試験を行った。これらアッセイにおいて、該ＭＴＴ化合物は、培養物中の生存細胞に取り込まれ、呼吸ミトコンドリアによって不溶性ホルマザン結晶に変換された。次いで、これらの結晶を、ＤＭＳＯまたは酸ＥｔＯＨ中に溶解し、該吸収を５７０ｎＭで測定し、培養物中の生存細胞の相対数を決定した。これらの試験の結果は、該化合物が、２４時間の処置後の細胞の生存に対して殆ど影響しないことを示した。生存性の低下は、試験した最も高い用量の１００μＭで唯一見られた。この用量は、阻害性化合物に対する３０μＭの見かけのＩＣ_５０を大幅に超えている。

ソフトアガロースコロニー形成(ＳＡＣＦ)は、３次元(３Ｄ)の半固体培地中に懸濁した細胞を増殖するための技術である。アガロースを用いるこの方法においては、増殖する単層細胞は、接着する基盤から剥がれる。ガン細胞の１つの特徴は、基盤非依存性の態様で増殖能力である。ソフトアガロース上のコロニー形成は、３Ｄの、基盤非依存性の腫瘍増殖をシミュレートする。正常細胞を類似条件下で増殖させた場合、それらは急速なアポトーシスを起こす。これら化合物の腫瘍形成を阻害する潜在的な効果を測定するために、いくつかの化合物をＳＡＣＦによりスクリーニングした。該ナトリウムチャンネル遮断化合物は、フェニトインＩＣ_５０のモル等量を用いて試験した場合に、２Ｄ増殖アッセイに見られるものに比べて３Ｄ増殖における阻害活性が増加した。２Ｄ増殖アッセイ(６６.３％および４２.３％阻害)において最良の化合物であった化合物１および２は、フェニトインと比較した場合、３Ｄ増殖において同濃度で約８７.２％および６２％の阻害に増加した。フェニトインと比較した場合に、試験化合物プレートよりも、形成するコロニーが小さいことを強調すべきであろう。ゆえに、コロニー形成の低下は、剪断数（shear numbers）単独で示されるよりも劇的であった。第二に、２Ｄにおいて細胞増殖に対する限界的影響を示した化合物、すなわち化合物２は、ＳＡＣＦを用いると、阻害(フェニトインの４１.５％)が劇的に増強した。これらのデータは、いくつかの化合物が、イン・ビボでの腫瘍増殖を阻害する可能性を示す。興味深いことに、フェニトインそれ自身は、これらの３Ｄアッセイにおいてある意味で阻害剤である。フェニトインは、ＤＭＳＯ／ＥｔＯＨ対照プレートと比較して２５.７％のＳＡＣＦを阻害した。

まとめると、チミジン取込み、ＭＴＴ、クリスタルバイオレットアッセイ、ＰＳＡ、ソフトアガーコロニー形成およびパッチクランプ法を今日まで用い、本発明の化合物の活性に関する洞察的情報を提供する。さらに、マウスで得られた予備的毒性データから、化合物１は、３０分のバランス障害を伴って３００mg/kgまで耐容性があることが明らかとなった。急性の毒性効果［死亡、心臓発作、運動失調、心停止または呼吸活動の喪失］は見られなかった。あわせて考えると、これらの予備試験は、２つのクラスの化合物、すなわちヒドロキシアミドおよびヒダントインに向けられ、これらはＰＣａ細胞増殖を活発に阻害する。