JP2005522995A - 哺乳動物色素沈着を調節するためのrab38の機能の変更 - Google Patents
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Abstract
本発明は、メラノサイトを含む組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節において使用するため、ならびに色素沈着における障害関連状態を診断および/または処置するための手段を決定する際に使用するために適切な、RAB38および変異体RAB38を含む組成物および方法を提供する。配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸。前記核酸が、デオキシリボ核酸である。
Description
(関連出願へのクロスリファレンス)
本出願は、2002年1月18日に出願された米国仮特許出願第60/349,929号から優先権を主張し、そしてその内容を援用する。
本出願は、2002年1月18日に出願された米国仮特許出願第60/349,929号から優先権を主張し、そしてその内容を援用する。
(連邦政府によって後援を受けている研究または開発下で行われた発明についての権利に関する陳述)
適用しない。
適用しない。
(「配列表」、表、またはコンパクトディスク上に提出されたコンピュータープログラムリスト添付物についての参照)
適用しない。
適用しない。
(発明の分野)
本発明は、メラノサイトに関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節での使用に適した、ならびに色素沈着についての障害に関連のある状態を診断および/または処置する手段を決定する際の使用のために適切なRAB38および変異体RAB38に関する組成物および方法を提供する。
本発明は、メラノサイトに関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節での使用に適した、ならびに色素沈着についての障害に関連のある状態を診断および/または処置する手段を決定する際の使用のために適切なRAB38および変異体RAB38に関する組成物および方法を提供する。
(発明の背景)
メラノサイトは、皮膚、眼および髪の呈色を担う特殊色素作製細胞である。メラノサイトの欠損から生じる被毛色の変化は、マウスで容易に同定可能である。これらのマウス変異体は、候補ヒト疾患遺伝子の同定についておよび細胞機能の基本となるメカニズムの解説についての価値を証明している。今日までに、変異される場合、色素沈着に影響するマウス中には、約100座が存在する。しかし、根本的な遺伝子欠損は、これらの約60座中で同定されなかった(The Jackson Laboratory’s Mouse Genome Informatics web siteを参照のこと)。
メラノサイトは、皮膚、眼および髪の呈色を担う特殊色素作製細胞である。メラノサイトの欠損から生じる被毛色の変化は、マウスで容易に同定可能である。これらのマウス変異体は、候補ヒト疾患遺伝子の同定についておよび細胞機能の基本となるメカニズムの解説についての価値を証明している。今日までに、変異される場合、色素沈着に影響するマウス中には、約100座が存在する。しかし、根本的な遺伝子欠損は、これらの約60座中で同定されなかった(The Jackson Laboratory’s Mouse Genome Informatics web siteを参照のこと)。
減少した色素沈着を有する障害は、それらがメラノサイト分化に影響するかどうか、またはそれらがメラノサイト、メラノソーム中で色素作製小器官の機能に影響するかどうかに従って2つの群に分けられ得る。第一群の例としては、「白色斑」パターンを生じるメラノサイトの限局性非存在によって特徴付けられる、PiebaldismおよびWaardenburg Syndromeが挙げられる。これらの障害中で影響される遺伝子、KIT、MITF、PAX3、SOX10、EDNRB、EDN3は、メラノサイト直系の特異化、移動および生存度に関する(Jackson、Hum Mol Genet 6:1613 1624[1997])。これらの障害のマウスモデルは、特徴あるスポット被毛パターンを有する(Jackson、Hum Mol Genet 6:1613 1624[1997])。眼皮膚白皮症(OCA)I−IV、チュディアック−東症候群(CHS)、ヘルマンスキー−パドラック症候群(HPS)I−IIIおよびGriscelli症候群(GS)は、第二群に相当する。OCA中で減少した色素沈着に寄与する分子欠損は、主にメラノソーム形成ならびに形成されるメラニン色素の量および型に影響する遺伝子(TYR、TYRPI、PおよびAIM1)を生じる(Kingら、Scriverら、(編)The metabolic basis of inherited disease、第7版(McGraw Hill、New York)gyp.4353〜4392[1995]);およびNewtonら、Am J Hum Genet 69:981〜988[2001])。HPS、CHSおよびGSを担う遺伝子は、細胞内のメラノソームを含む小胞輸送の調節に関し、そしてHPSl、AP3、HPS3、CHSI;MYO5AおよびRAB27Aを含む(Jackson、Hum Mol Genet 6:1613〜1624[1997];およびMarks and Seabra、Nat Rev Mol Cell Biol 2:738〜748[2001])。
多くの遺伝子が、色素沈着障害に関連したが、マウスおよびヒトの両方に関するこれらの障害の遺伝子異質性(heterogeneity)の観点において、これらおよび他の種類においてさらなる候補疾患遺伝子を同定することは、当該分野で必要である。
(発明の簡単な要旨)
本発明は、メラノサイトに関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節での使用のため、ならびに色素沈着についての障害に関連のある状態を診断および/または処置する手段を決定する際の使用のために適切なRAB38および変異体RAB38に関する組成物および方法を提供する。
本発明は、メラノサイトに関する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調節での使用のため、ならびに色素沈着についての障害に関連のある状態を診断および/または処置する手段を決定する際の使用のために適切なRAB38および変異体RAB38に関する組成物および方法を提供する。
本発明は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、および配列番号12からなる群から選択される配列を含む単離された核酸を提供する。いくらかの実施形態において、核酸は、デオキシリボ核酸である。他の実施形態において、核酸は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、および配列番号12の相補体である。関連する実施形態において、核酸を含むベクターが、提供される。またベクターを含む宿主細胞も提供される。さらに、本発明は、配列番号9に示される核酸配列によってコードされたタンパク質を提供する。
いくらかの実施形態において、本発明は、Rab38増幅産物を生じるためにゲノムDNAから少なくともRab38の部分を増幅する工程;Rab38増幅産物を精製する工程;およびRab38増幅産物を配列決定する工程を包含する、Rab38中の変異体を検出するための方法を提供する。好ましい実施形態において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される。関連する実施形態において、Rab38ゲノムDNAの少なくとも一部分は、少なくとも一つのRab38エキソン、少なくとも一つのRab38イントロン、Rab38 5’非翻訳配列、およびRab38 3’非翻訳配列からなる群から選択される。いくらかの特定の好ましい実施形態において、少なくとも一つのRab38エキソンは、Rab38エキソン1、Rab38エキソン2、およびRab38エキソン3からなる群から選択される。いくらかの実施形態において、ゲノムDNAは、哺乳動物ゲノムDNAである。また、精製がサイズ選択を介して達成される実施形態が提供される。
本発明は、Rab38増幅産物を生じるためにゲノムDNAから少なくともRab38の部分を増幅する工程;Rab38増幅産物を消化して、消化されたRab38増幅殖産物を生成する工程;および消化されたRab38増幅産物を電気泳動する工程を包含する、Rab38中で変異を検出するための方法をさらに提供する。好ましい実施形態において、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される。いくらかの実施形態において、Rab38ゲノムDNAの少なくとも一部分は、少なくとも一つのRab38エキソン、少なくとも一つのRab38イントロン、Rab38 5’非翻訳配列、およびRab38 3’非翻訳配列からなる群から選択される。好ましい実施形態において、少なくとも一つのRab38エキソンは、Rab38エキソン1、Rab38エキソン2、およびRab38エキソン3からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態において、ゲノムDNAは、哺乳動物ゲノムDNAである。
本発明はまた、RAB38活性を調節するための生物学的活性因子をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は、RAB38活性を含むメラノサイト、および候補因子を提供する工程;および候補因子にメラノサイトを露呈して、処置されたメラノサイトを生じる工程;および候補因子によって処置されたメラノサイトのRAB38活性の調節を測定する工程を包含する。任意の実施形態において、RAB38活性は、GTPアーゼ活性を含む。いくらかの関連した実施形態において、RAB38活性は、GTP結合活性またはGDP放出を含む。いくらかの好ましい実施形態において、RAB38活性は、メラノソームへのTYRP1輸送またはメラノソームへのRAB38輸送を含む。
いくらかの実施形態において、本発明は、RAB38活性を調節する生物学的活性因子をスクリーニングするためのキットを提供し、このキットは、RAB38活性を含む複数のメラノサイト(ここで、このメラノサイトは、容器の中で提供される)およびメラノサイト中でRAB38活性の決定のための説明書を備える。いくらかの好ましい実施形態において、キットは、RAB38活性を分析するための手段をさらに包含する。いくらかの関連する実施形態において、RAB38活性を分析するための手段は、GTPアーゼ活性を評価するためのアッセイ、GTP結合活性を評価するためのアッセイ、GDP放出を評価するためのアッセイ、メラノサイトへのTYRP1輸送を評価するためのアッセイ、またはメラノサイトへのRAB38輸送を評価するためのアッセイを包含する。
本発明はまた、RAB38の少なくとも一部分の増幅について適切な少なくとも2つのプライマー配列を含むRAB38中の変異の検出のためのキット、およびこのキットを利用するための説明書を提供する。いくらかの好ましい実施形態において、プライマー配列は、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、および配列番号22からなる群から選択される。任意の関連する実施形態において、キットは、ポリメラーゼ連鎖反応中で使用するために適切である。本発明はまた、核酸を消化するための試薬をさらに含む実施形態を提供する。
いくらかの実施形態において、本発明はまた、RAB38を含むメラノサイトを含む、メラノソーム機能中で欠損を診断するためのキットおよびメラソーム機能中で欠損を評価するための説明書を提供する。いくらかの好ましい実施形態において、キットは、RAB38活性を分析するための手段をさらに含む。任意の関連する実施形態において、RAB38活性を分析するための手段は、GTPアーゼ活性を評価するためのアッセイ、GTP結合活性を評価するためのアッセイ、GDP放出を評価するためのアッセイ、メラノソームへのTYRP1輸送を評価するためのアッセイまたはメラノソームへのRAB38輸送を評価するためのアッセイを包含する。
(発明の詳細な説明)
本発明は、メラノサイトに関与する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調整における使用に適切な、RAB38および変異RAB38に関与する組成物および方法を提供する。さらに、この方法を用いて、色素沈着における障害に関する状態を、診断および/または処置し得る。
本発明は、メラノサイトに関与する組成物および方法に関する。特に、本発明は、色素沈着の調整における使用に適切な、RAB38および変異RAB38に関与する組成物および方法を提供する。さらに、この方法を用いて、色素沈着における障害に関する状態を、診断および/または処置し得る。
さらなる色素沈着疾患遺伝子を同定するという技術における必要性をみたすため、cDNAマイクロアレイを用いる発現プロファイル分析が、本発明を開発するために行われた。発現プロファイル分析は、何千もの遺伝子発現測定から見出される一般的なパターンを組織化し、そして複数の実験サンプル中の類似の特徴的な発現パターンを有する遺伝子を同定するために強力な道具である(Eisenら、Proc Natl Acad Sci USA 95:14863〜14868[1998])ので、この分析が本発明の開発のために利用された。クラスター中に含まれる遺伝子の分析は、これらの遺伝子がしばしば細胞中で機能的に関連していることを解明してきた(EisenおよびBrown、Methods Enzymol 303:179〜205[1999];ならびにModyら、Proc Natl Acad Sci USA 98:8862〜8867[2001])。以下に詳しく述べられるように、このアプローチを用いることによって、Rab38が、色素沈着遺伝子の候補として同定された。さらなる分析は、RAB38が、メラノソームタンパク質であり、マウス色素沈着変異体Chocolate(cht)中で変異され、メラノサイトにおけるメラノソームタンパク質TYRP 1の選別のために重要であることを確かにした。本発明の開発の間に行われた実験は、哺乳動物色素沈着疾患遺伝子を同定するためのマイクロアレイ発現プロファイリングの最初の成功した使用を提供する。
(発現プロファイル分析は、RAB38をChocolate候補遺伝子として同定する)
メラノサイトの機能および疾患に関与する新しい特徴付けされていない遺伝子を同定するために、発現プロファイルおよび機能分析のために用いられるべきcDNAクローンのコレクションが、生成された(Loftusら、Proc Natl Acad Sci USA 96:9277〜9280[1999])。IMAGEコンソーシアムライブラリ2NbHMからのcDNAクローン(The National Center for Biotechnology Information’s web site for UniGene Library No.198を参照のこと)は、メラノサイトの発達および機能を理解することを目的とした遺伝子発現研究について適切であると以前に示された(Loftusら、Proc Natl Acad Sci USA 96:9277〜9280[1999];ならびにLoftusおよびPavan、Pigment Cell Res 13:141−146[2000])。この分析のために、ライブラリ2NbHMからの4356cDNAクローンが、ガラスのスライドに印刷された。神経提由来組織および非神経提由来組織を表す合計17の細胞株が、この分析で用いられた。11のメラノーマ細胞株(Bittnerら、Nature 406:536〜540[2000])、3つの横紋筋肉腫細胞株、1つの神経膠芽腫細胞株、HeLa細胞、および293T細胞が、含まれた。これらの細胞株の各々についてのアレイハイブリダイゼーションが、参照として細胞株MnSOD6 cl1からのRNAを用いる、2つ1組の様式で実施された。MnSOD6 cl1は、ヒト第6染色体の1領域の導入によって非腫瘍形成性にされる、非メラニン性(amelanotic)黒色腫細胞株である(Trentら、Science 247:568〜571[1990])。MnSOD6 cl1は、異なる一連のcDNAクローンを用いて黒色腫株の発現プロファイル分析のために以前に使用されてきた(Bittnerら、Nature 406:536〜540[2000])。
メラノサイトの機能および疾患に関与する新しい特徴付けされていない遺伝子を同定するために、発現プロファイルおよび機能分析のために用いられるべきcDNAクローンのコレクションが、生成された(Loftusら、Proc Natl Acad Sci USA 96:9277〜9280[1999])。IMAGEコンソーシアムライブラリ2NbHMからのcDNAクローン(The National Center for Biotechnology Information’s web site for UniGene Library No.198を参照のこと)は、メラノサイトの発達および機能を理解することを目的とした遺伝子発現研究について適切であると以前に示された(Loftusら、Proc Natl Acad Sci USA 96:9277〜9280[1999];ならびにLoftusおよびPavan、Pigment Cell Res 13:141−146[2000])。この分析のために、ライブラリ2NbHMからの4356cDNAクローンが、ガラスのスライドに印刷された。神経提由来組織および非神経提由来組織を表す合計17の細胞株が、この分析で用いられた。11のメラノーマ細胞株(Bittnerら、Nature 406:536〜540[2000])、3つの横紋筋肉腫細胞株、1つの神経膠芽腫細胞株、HeLa細胞、および293T細胞が、含まれた。これらの細胞株の各々についてのアレイハイブリダイゼーションが、参照として細胞株MnSOD6 cl1からのRNAを用いる、2つ1組の様式で実施された。MnSOD6 cl1は、ヒト第6染色体の1領域の導入によって非腫瘍形成性にされる、非メラニン性(amelanotic)黒色腫細胞株である(Trentら、Science 247:568〜571[1990])。MnSOD6 cl1は、異なる一連のcDNAクローンを用いて黒色腫株の発現プロファイル分析のために以前に使用されてきた(Bittnerら、Nature 406:536〜540[2000])。
階層性クラスター分析は、メラノサイトの機能に関与することが以前に知られた、9つの遺伝子(DCT、TYRPl、PMEL17、AIM−l、MELANA/MARTI、MLSN、ATRN、PAX3およびCHSl)が一緒にクラスター化することを見出した(図1を参照のこと)。階層性クラスター化データの精密な分析において、さらなる遺伝子、Rab38が、これらのメラノサイト遺伝子に対して類似の発現バリエーションを有することが見出された(図1を参照のこと)。検証した9つのメラノサイト遺伝子の内、4つ(TYRP1、DCT、MLSNおよびAIM1)は、E11.5において、レチナール色素上皮(RPE)のメラノサイトにおいて発現された(図2を参照のこと)。この遺伝子クラスター中のRab38の配置に一致して、ホールマウントインサイチュ分析は、Rab38がまた、この齢でRPEのメラノサイトにおいて発現されることを実証した(図2を参照のこと)。ノーザンブロット分析は、Rab38発現が、メラノサイト由来の細胞株に制限されることを解明した(Jagerら、Cancer Res 60:3584〜3591[2000])。
最近入手可能なヒトゲノム配列を利用して、Rab38は、TYRが近位に隣接し、EEDおよびMY07Aが遠位に隣接して、ヒト第11染色体上に位置することが決定された(図3、パネルAを参照のこと)。マウス第7染色体上の保護された結合基が、ヒトゲノムマップをマウスゲノムマッピングデータと比較することによって同定された(The Jackson LaboratoryのウェブサイトをMammalian Homology Queryについて参照のこと)。マウスの保存された結合基中の遺伝子座のより精密な分析は、クローン化されていないマウス色素沈着変異体、chtが、この問題の間に含まれることを示した(図3、パネルA;ならびにPotterおよびRinchik、Mamm Genome 4:46〜48[1993]を参照のこと)。cht変異は、近交系C57B1/6Jバックグラウンドでの自発的な同質遺伝子的変異として生じ、1984年からこのバックグラウンドにおいて維持されている(MacpikeおよびMobraaten、Mouse News Lett 700:86[1984])。cht/chtマウスは、より明るい皮膚および眼により生まれたときに、そしてC57B1/6J親株と比較した場合深い毛色により離乳時に、同定可能である(図3、パネルBおよびCを参照のこと)。従って、Rab38は、ゲノムマップ位置cht/chtマウス、RPEおよびメラノサイト誘導体において影響を及ぼされたおよび細胞型中のRab38の発現に基づいてcht遺伝子座についての候補遺伝子として関係づけられた。
(Rab38の変異は、cht/chtマウスにおけるメラノサイト欠損の原因となる)
3つのマウスRab38エキソンについてのエキソン/イントロン境界に隣接するゲノム配列は、マウストレースアーカイブゲノム配列から得られた(National Center for Biotechnology InformationウェブサイトをTrace Archive Queryingについて参照のこと)。C57B1/6J chtl+動物からのDNAが、Jackson Laboratories Mouse DNA Resourceから得られ、ゲノムRab38プライマーを用いて増幅され、直接配列決定された。エキソン1において、G146Tヌクレオチド変異は、cht対立遺伝子において同定された(図4、パネルAを参照のこと)。この配列変化は、生じるヌクレオチド置換が、BsaJI部位(CCNNGG)をSexA1制限部位(ACCWGGT)へと変化させるので、配列変化が、複数のcht/cht DNAサンプルにおいて制限消化により確かめられた(図4、パネルBを参照のこと)。この配列変化は、8つのさらなる近交系マウス系統(CAST/Ei、SPRET/Ei、129/SVJ、FVB/NJ、AKR/J、A/J、DBA/1J、BALB/cJ)の分析において検出されなかった。RAB38タンパク質は、門の間で高度に保存されたアミノ酸同一性を示す:ヒト/ラット(96.2%)、ヒト/マウス(93.8%)、ラット/マウス(95.2%)(図4、パネルBを参照のこと)。G19V cht変異は、高度に保存されたホスフェート/Mg2+(PM)ドメイン内に位置し、そしてヌクレオチド結合ポケット内でGTPと直接接触すると予測される(図5、パネルAおよびBを参照のこと)。
3つのマウスRab38エキソンについてのエキソン/イントロン境界に隣接するゲノム配列は、マウストレースアーカイブゲノム配列から得られた(National Center for Biotechnology InformationウェブサイトをTrace Archive Queryingについて参照のこと)。C57B1/6J chtl+動物からのDNAが、Jackson Laboratories Mouse DNA Resourceから得られ、ゲノムRab38プライマーを用いて増幅され、直接配列決定された。エキソン1において、G146Tヌクレオチド変異は、cht対立遺伝子において同定された(図4、パネルAを参照のこと)。この配列変化は、生じるヌクレオチド置換が、BsaJI部位(CCNNGG)をSexA1制限部位(ACCWGGT)へと変化させるので、配列変化が、複数のcht/cht DNAサンプルにおいて制限消化により確かめられた(図4、パネルBを参照のこと)。この配列変化は、8つのさらなる近交系マウス系統(CAST/Ei、SPRET/Ei、129/SVJ、FVB/NJ、AKR/J、A/J、DBA/1J、BALB/cJ)の分析において検出されなかった。RAB38タンパク質は、門の間で高度に保存されたアミノ酸同一性を示す:ヒト/ラット(96.2%)、ヒト/マウス(93.8%)、ラット/マウス(95.2%)(図4、パネルBを参照のこと)。G19V cht変異は、高度に保存されたホスフェート/Mg2+(PM)ドメイン内に位置し、そしてヌクレオチド結合ポケット内でGTPと直接接触すると予測される(図5、パネルAおよびBを参照のこと)。
(Rab38chtが、Tyrp1を最終段階メラノソームへと標的化する効率の減少を生ずる)
新生仔マウスから培養されたメラノサイトの分析は、C57B1/6J Rab38cht/Rab38chtメラノサイトが、C57B1/6J Tyrplb/lTyrplbメラノサイト(図6、パネルC;およびHearingら、J Ultrastruct Res 43:88〜106[1973]を参照のこと)において観察される色調と類似するが、C57B1/6J +/+メラノサイト培養物において見られる強烈に黒い、卵形のメラノソーム(図6、パネルAおよびBを参照のこと)とは異なる、茶色の色調の、小さな円形のメラノソームを含むことを明らかにした。Tyrpl変異が茶色のマウスにおいて黒色色素から茶色色素への転換の原因となり、かつRab GTPaseが、タンパク質輸送における中心的な役割を果たすこと(Schimmollerら、J Biol Chem 273:22161〜22164 [1998];ならびにChavrierおよびGoud、Curr Opin Cell Biol 11:466〜475[1999])を考慮すると、TYRPIのメラノソームへの標的化は、Rab38cht/Rab38chtメラノサイトにおいて欠陥があると企図された。これと一致して、Rab38cht/Rab38chtメラノサイトにおける最終段階メラノソームは、TYRP1について、コントロールのメラノサイトにおける最終段階メラノソームが染まるよりもはるかに弱く、染まる(図7、パネルA Dを参照のこと)。さらに、GFPタグ化RAB38は、野生型細胞における最終段階メラノソームと共に局在する(図7、パネルEおよびFを参照のこと)。従って、RAB38は、Tyrp1をトランス−ゴルジネットワーク(TGN)から最終段階メラノソームへと移動させる小胞性中間体の輸送を調節するよう企図される。
新生仔マウスから培養されたメラノサイトの分析は、C57B1/6J Rab38cht/Rab38chtメラノサイトが、C57B1/6J Tyrplb/lTyrplbメラノサイト(図6、パネルC;およびHearingら、J Ultrastruct Res 43:88〜106[1973]を参照のこと)において観察される色調と類似するが、C57B1/6J +/+メラノサイト培養物において見られる強烈に黒い、卵形のメラノソーム(図6、パネルAおよびBを参照のこと)とは異なる、茶色の色調の、小さな円形のメラノソームを含むことを明らかにした。Tyrpl変異が茶色のマウスにおいて黒色色素から茶色色素への転換の原因となり、かつRab GTPaseが、タンパク質輸送における中心的な役割を果たすこと(Schimmollerら、J Biol Chem 273:22161〜22164 [1998];ならびにChavrierおよびGoud、Curr Opin Cell Biol 11:466〜475[1999])を考慮すると、TYRPIのメラノソームへの標的化は、Rab38cht/Rab38chtメラノサイトにおいて欠陥があると企図された。これと一致して、Rab38cht/Rab38chtメラノサイトにおける最終段階メラノソームは、TYRP1について、コントロールのメラノサイトにおける最終段階メラノソームが染まるよりもはるかに弱く、染まる(図7、パネルA Dを参照のこと)。さらに、GFPタグ化RAB38は、野生型細胞における最終段階メラノソームと共に局在する(図7、パネルEおよびFを参照のこと)。従って、RAB38は、Tyrp1をトランス−ゴルジネットワーク(TGN)から最終段階メラノソームへと移動させる小胞性中間体の輸送を調節するよう企図される。
(Rab38cht/Rab38chtは、血小板貯蔵不足を生じない)
小胞輸送に関与する遺伝子における変異体を持つマウスコーティング色変異体のサブセット(例えば、pale earおよびbeige)はまた、HPSおよびCHSを各々モデリングする血小板集合不足の原因となる。Rab38cht/Rab38chtマウスの病理をさらに分析するために、出血時間を血小板機能のアッセイとして測定した。野生型マウスとRab38cht/Rab38chtマウスとの間に違いは観察されなかった(2.53分対2.41分;p=0.7)。この観察は、OCAIII(Tyrplb)マウスモデルについてのゲノムコピーであるが、HPSまたはCHSのいずれでもないRab38cht/Rab38chtと一致する。一緒にまとめると、本明細書中に示されるデータは、RAB38が、TYRP1を色素沈着メラノームへと効率的に標的化するために必要であることを示し、そしてRab38cht/Rab38chtが、Tyrplb/Tyrplb OCAIIIマウスモデルのゲノムコピーであることを示唆する。
小胞輸送に関与する遺伝子における変異体を持つマウスコーティング色変異体のサブセット(例えば、pale earおよびbeige)はまた、HPSおよびCHSを各々モデリングする血小板集合不足の原因となる。Rab38cht/Rab38chtマウスの病理をさらに分析するために、出血時間を血小板機能のアッセイとして測定した。野生型マウスとRab38cht/Rab38chtマウスとの間に違いは観察されなかった(2.53分対2.41分;p=0.7)。この観察は、OCAIII(Tyrplb)マウスモデルについてのゲノムコピーであるが、HPSまたはCHSのいずれでもないRab38cht/Rab38chtと一致する。一緒にまとめると、本明細書中に示されるデータは、RAB38が、TYRP1を色素沈着メラノームへと効率的に標的化するために必要であることを示し、そしてRab38cht/Rab38chtが、Tyrplb/Tyrplb OCAIIIマウスモデルのゲノムコピーであることを示唆する。
(Rab38は、哺乳動物におけるメラノサイト色素沈着遺伝子である)
従って、cDNAマイクロアレイ発現プロファイリングを使用することによって、Rab38は、メラノサイト色素沈着に関与する重要な遺伝子として同定された。発現パターンの階層的クラスター化は、メラノサイト特異的様式で機能することが公知の9つの以前に同定されたメラノサイト遺伝子でRab38を分類した。これらの遺伝子は、メラノソーム機能に必須のDCT、TRYP1、およびPMELl7;重要なメラノーマ抗原であるMELAN−A/MART1およびMLSN(Chenら,Proc Natl Acad Sci USA 93:5915−5919[1996];およびDuncanら,J Clin Oncol 19:568−576[2001]);メダカにおけるBの原因である遺伝子として最近同定されたAIM−1(Fukamachiら,Nat Genet 28:381−385[2001])、マウスにおけるunderwhite(Newtonら,Am J Hum Gent 69:981−988[2001])、およびヒトにおけるOCA4(Newtonら,Am J Hum Gent 69:981−988[2001]);メラノソーム/リソソームベシクル輸送において機能するCHS1(Introneら,Mol Genet Metab 68:283−303[1999]);ならびにTYRP1の発現を含む(Galibertら,J Biol Chem 274:26894−26900[1999])、メラノサイト遺伝子発現を調節するペアードボックス転写因子であるPAX3(Watanabeら,Nat Genet 18:283−286[1998];Potterfら,Human Genet 107:1−6[2000];およびHornyakら,Mech Dev 101:47−59[2001])を含む。これらの遺伝子の7つにおける変異は、色素沈着におけるバリエーションと関連する、ヒトおよび/またはマウス(marine)障害において同定された(図1を参照のこと)。
従って、cDNAマイクロアレイ発現プロファイリングを使用することによって、Rab38は、メラノサイト色素沈着に関与する重要な遺伝子として同定された。発現パターンの階層的クラスター化は、メラノサイト特異的様式で機能することが公知の9つの以前に同定されたメラノサイト遺伝子でRab38を分類した。これらの遺伝子は、メラノソーム機能に必須のDCT、TRYP1、およびPMELl7;重要なメラノーマ抗原であるMELAN−A/MART1およびMLSN(Chenら,Proc Natl Acad Sci USA 93:5915−5919[1996];およびDuncanら,J Clin Oncol 19:568−576[2001]);メダカにおけるBの原因である遺伝子として最近同定されたAIM−1(Fukamachiら,Nat Genet 28:381−385[2001])、マウスにおけるunderwhite(Newtonら,Am J Hum Gent 69:981−988[2001])、およびヒトにおけるOCA4(Newtonら,Am J Hum Gent 69:981−988[2001]);メラノソーム/リソソームベシクル輸送において機能するCHS1(Introneら,Mol Genet Metab 68:283−303[1999]);ならびにTYRP1の発現を含む(Galibertら,J Biol Chem 274:26894−26900[1999])、メラノサイト遺伝子発現を調節するペアードボックス転写因子であるPAX3(Watanabeら,Nat Genet 18:283−286[1998];Potterfら,Human Genet 107:1−6[2000];およびHornyakら,Mech Dev 101:47−59[2001])を含む。これらの遺伝子の7つにおける変異は、色素沈着におけるバリエーションと関連する、ヒトおよび/またはマウス(marine)障害において同定された(図1を参照のこと)。
Rab38は、3つの理由で、cht遺伝子座の候補遺伝子として評価された。第1に、比較ゲノム分析により、ヒトRab38遺伝子の、マウスゲノムにおけるcht遺伝子座の領域に対する同時局在化が推定された。第2に、Rab38の発現は、cht/chtマウスにおいて罹患したそれらの細胞型に限定されることが見いだされた(図2およびJagerら,Cancer Res 60:3584−3591[2000]を参照のこと)。最後に、Rab38は、ベシクル輸送において重要な役割を果たすことが公知のタンパク質のファミリーのメンバーである(Nielsenら,Nat Cell Biol 1:376−382[1999];ならびにScottおよびZhao,J Invest Dermatol 116:296−304[2001])。
chtマウス由来のRab38コード領域の配列分析により、エキソン1におけるG146Tトランスバージョンが明らかになった。この配列変化は、原因となる変異である可能性が高い。なぜなら、この対立遺伝子は、C57B1/6Jバックグラウンドに対する自発的変異として現れたからである。さらに、G146T変化は、RAB38のGTP結合ポケット内でのGlyからValへの置換を生じた。RAB3Aの結晶構造分析(これは、他のRabタンパク質のモデルとして使用される)により、このアミノ酸残基が、そのヌクレオチド結合ポケット内のGTPと直接接触すると推定される(Dumasら,Structure Fold Des 7:413−423[1999])。さらに、RAB5(エンドソームのホモタイプ融合を調節するRab)における類似のアミノ酸残基の変異は、インビトロでGDP解離の速度の増大を生じ、インビボでエンドソーム融合の刺激を生じた(LiおよびLiang,Biochem J 355:681−689[2001])。この変異の機能的関連性のさらなる支持は、Rasタンパク質の研究に由来する。Rasにおける類似のG13残基における置換(Rab38chtと同じGからVへの変異を含む)は、急性骨髄性白血病において同定された(Bosら,Nature 315:726−730[1985];およびStirewaltら,Blood 97:3589−3595[2001])。本明細書中に開示される分析およびこれらの観察に基づいて、RAB38におけるGlyからValへの変異は、インビボでRAB38機能を破壊するために意図される。
Rab38cht/Rab38chtマウスの毛色は、brown(Tyrplb/Tyrplb)、OCAIIIマウスモデルの毛色とよく似ている。このbrownマウスモデルは、メラニン生合成遺伝子Tyrplに欠損を含み、このことによって、C57BL/6Jマウスの黒色から褐色への毛色の変化をを生じる。TYRPは、メラノソーム膜糖タンパク質である。これらは、DHICAオキシダーゼ酵素として、およびメラニン生成酵素複合体におけるTYRに対する構造的安定性を提供するための両方で機能する。TRYPIは、おそらく、最初に特徴付けられていない分類区画を通ることにより、トランスゴルジネットワーク(TGN)から段階IIのメラノソームへと、クラスリン(clatherin)コートベシクルを介して伝達されると考えられる(MarksおよびSeabra,Nat Rev Mol Cell Biol 2:738−748[2001])。類似の毛色表現型および推定されるRabタンパク質機能に基づいて、RAB38は、TYRP1のようなメラノソームタンパク質のメラノソームへの輸送に特異的に関与することが意図される。このことと一致して、GFPタグ化RAB38は、培養物における色素沈着メラノサイト株においてメラノソームと同時局在し、TYRP1は、Rab38cht/Rab38chtメラノサイトにおける色素沈着最終段階メラノソームに非効率的に標的化される。Rab38cht/Rab38chtマウスにおいて観察される褐色の毛色は、メラノソームTYRP1の減少した量の結果であると予測される。従って、RAB38は、タンパク質(例えば、TYRP1)のメラノソームへの適切な標的化に必要とされるベシクル輸送に関連する。
メラノソームの形成およびメラノソーム内のメラニン色素沈着は、一連の特異的ベシクル輸送工程を必要とする(Kingら,Scriverら(編)The Metabolic Basis of Inherited Disease,第7版.(McGraw Hill,New York)pp.4353−4392[1995];ならびにMarksおよびSeabra,Nat Rev Mol Cell Biol 2:738−748[2001])。Rab38chtマウスの、タンパク質の輸送における欠損が同定された他のマウス変異体に対する表現型の比較により、RAB38の作用部位への知見を提供することが予測される。変異した場合に、HPSに関与する4つの遺伝子(HPS1、AP3ならびにHPS3およびHPS4)は、マウスモデルpale ear(ep)、mocha、cocoa、およびlight earを、それぞれ生じる。これらのマウスモデルの各々に関して、メラノソームによって生成されるメラニンの色は、色はより薄いかまたは褐色の色調である。興味深いことに、Rab38cht/Rab38cht由来メラノサイトにおいて見られるものと類似して、Hpslep/Hpslep変異体由来のメラノサイトはまた、プレメラノソームではなく、膜複合体へのTYRP1の誤った局在化を示し(Sarangarajanら,J Invest Dermatol 117:641−646[2001])、繰り返し、褐色マウスを生じる。メラノソーム色素欠損に加えて、HPSマウスはまた、メラノソームおよびリソソームの拡大ならびに減少した血小板細胞凝集を示す(Swankら,Pigment Cell Res 13:59−67[2000];およびIntroneら,Mol Genet Metab 68:282−303[1999])。このことは、リソソームおよびメラノソームに影響を及ぼす初期のベシクル分類事象におけるHSP遺伝子の関与を示唆する。しかし、Rab38chtは、HPSマウスモデルの変異体のクラスと同じ変異体のクラスにはないようである。なぜなら、Rab38cht/Rab38chtマウスは、拡大したメラノソームまたはリソソームも、血小板機能の欠損も示さないからである。従って、HPS1およびRAB38の両方が、TYRP 1の適切な分類に関与しているようであるが、この調節は、その輸送プロセスにおける異なる段階で生じるようである。RAB38は、メラノソーム輸送にのみ影響を及ぼすようなので、RAB38は、HPS遺伝子の下流のベシクル輸送に関与することが予測される。
Rab38chtマウスは、後期段階メラノソームへの適切なTYRP1輸送におけるRAB38の必須の役割、従って、細胞表現型および臨床表現型を模倣することに起因して、TYRPlb(OCAマウスモデル)の遺伝子コピーであるようである。OCAは、TYR(OCAI)、P(OCAII)TYRP1(OCAIII)およびAIM1(OCAIV)における変異と関連した不均質な(heterogeneous)遺伝子障害である。しかし、OCAと臨床的に診断された患者の約10%は、これらの遺伝子のいずれにも変異を有さない。OCAの不均一性およびTYRPI分類におけるRAB38の推定される役割を仮定すると、Rab38は、OCAを有する患者、特に、TYR、P、TYRP1またはAIM1において分子欠損が見いだされない場合の、候補遺伝子であると予測される。
(RAB38活性のモジュレーターについてのハイスループットスクリーニング)
結論として、有用な特性を有する新たな化学的実体が、ある望ましい特性または活性を有する化合物(「リード化合物」といわれる)を同定し、リード化合物の改変体を作製し、その改変体化合物のその特性および活性を評価することによって生成される。しかし、現在の傾向は、薬物発見の全ての局面について時間枠を短くすることである。非常に多くを迅速かつ効率的に試験する能力が原因で、ハイスループットスクリーニング(HTS)法が、従来のリード化合物同定法に取って代わっている。
結論として、有用な特性を有する新たな化学的実体が、ある望ましい特性または活性を有する化合物(「リード化合物」といわれる)を同定し、リード化合物の改変体を作製し、その改変体化合物のその特性および活性を評価することによって生成される。しかし、現在の傾向は、薬物発見の全ての局面について時間枠を短くすることである。非常に多くを迅速かつ効率的に試験する能力が原因で、ハイスループットスクリーニング(HTS)法が、従来のリード化合物同定法に取って代わっている。
1つの好ましい実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多くの潜在的治療化合物(候補化合物)を含むライブラリーを提供することを包含する。次いで、このような「コンビナトリアル化学ライブラリー」が、本明細書中で記載されるように、1回以上のアッセイにおいてスクリーニングされて、所望の特徴的活性を示すライブラリーメンバー(特定の化学種またはサブクラス)が同定される。このように同定されたこれらの化合物は、従来の「リード化合物」として作用し得るか、またはそれら自体が、潜在的または実際の治療剤として使用され得る。
(a.コンビナトリアル化学ライブラリー)
最近、新たな化合物リードの生成を補助するためにコンビナトリアル化学ライブラリーの使用に注意が向けられている。コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多くの化学的「構成ブロック(building block)」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化合物の収集物である。例えば、線形的コンビナトリアル化学ライブラリー(例えば、ポリペプチドライブラリー)は、所定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)について、一セットの、アミノ酸といわれる化学的構成ブロックをあらゆる可能な様式で組み合わせることにより形成される。数百万の化合物が、化学的構成ブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通じて合成され得る。例えば、ある注釈者は、100個の交換可能な化学的構成ブロックの合成的なコンビナトリアル混合が、一億個のテトラマー化合物または100億個のペンタマー化合物の理論的合成を生じることを観察した(Gallopら(1994)37(9):1233−1250)。
最近、新たな化合物リードの生成を補助するためにコンビナトリアル化学ライブラリーの使用に注意が向けられている。コンビナトリアル化学ライブラリーは、試薬のような多くの化学的「構成ブロック(building block)」を組み合わせることによって、化学合成または生物学的合成のいずれかによって生成される多様な化合物の収集物である。例えば、線形的コンビナトリアル化学ライブラリー(例えば、ポリペプチドライブラリー)は、所定の化合物の長さ(すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数)について、一セットの、アミノ酸といわれる化学的構成ブロックをあらゆる可能な様式で組み合わせることにより形成される。数百万の化合物が、化学的構成ブロックのこのようなコンビナトリアル混合を通じて合成され得る。例えば、ある注釈者は、100個の交換可能な化学的構成ブロックの合成的なコンビナトリアル混合が、一億個のテトラマー化合物または100億個のペンタマー化合物の理論的合成を生じることを観察した(Gallopら(1994)37(9):1233−1250)。
コンビナトリアル化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者に周知である。このようなコンビナトリアル化学ライブラリーとしては、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号、Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.,37:487−493、Houghtonら(1991)Nature,354:84−88を参照のこと)が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチド合成は、決して、本発明とともに使用するために想定および意図される唯一のアプローチではない。化学的多様性のライブラリーを生成するための他の化学もまた使用され得る。このような化学物質としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:ペプトイド(PCT公開番号WO91/19735、1991年12月26日)、コードされたペプチド(PCT公開WO93/20242、1993年10月14日)、ランダムバイオオリゴマー(PCT公開WO92/00091、1992年1月9日)、ベンゾジアゼピン(米国特許第5,288,514号)、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなディバーソマー(diversomer)(Hobbsら,(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 90:6909−6913)、ビニル性(vinylogous)ポリペプチド(Hagiharaら(1992)J.Amer.Chem.Soc.114:6568)、βDグルコース足場を有する非ペプチドのペプチド模倣物(Hirschmannら,(1992)J:Amer.Chem.Soc.114:9217−9218)、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成(Chenら(1994)J.Amer.Chem.Soc.116:2661)、オリゴカルバメート(Choら,(1993)Science 261:1303)、ならびに/またはペプチジルホスホネート(Campbellら,(1994)J Org.Chem.59:658)。一般には、Gordonら(1994)J.Med.Chem.37:1385、nucleic acid libraries, peptide nucleic acid libraries(例えば、米国特許第5,539,083号を参照のこと)、抗体ライブラリー(例えば、Vaughnら(1996)Nature Biotechnology,14(3):309−314を参照のこと)、およびPCT/US96/10287)、炭水化物ライブラリー(例えば、Liangら(1996)Science,274:1520−1522、および米国特許第5,593,853号を参照のこと)、ならびに低有機分子ライブラリー(例えば、ベンゾジアゼピン,Baum(1993)C&EN,Jan 18,page 33、イソプレノイド米国特許第5,569,588号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン米国特許第5,549,974号、ピロリジン米国特許第5,525,735号および同第5,519,134号、モルホリノ化合物米国特許第5,506,337号、ベンゾジアゼピン米国特許第5,288,514号などを参照のこと)を参照のこと。
コンビナトリアルライブラリーの調製のためのデバイスは、市販されている(例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech,Louisville KY,Symphony,Rainin,Woburn,MA,433A Applied Biosystems,Foster City,CA,9050 Plus,Millipore,Bedford,MAを参照のこと)。
多くの周知のロボットシステムがまた、溶液相化学のために開発された。これらのシステムとしては、Takeda Chemical Industries,LTD.(Osaka,Japan)によって開発された自動化合成装置のような自動化ワークステーション、および多くのロボットシステム利用ロボットアーム(Zymate II,Zymark Corporation,Hopkinton,Mass.;Orca,HewlettPackard,Palo Alto,Calif.)(これは、化学者によって実行される手動の合成手順をまねる)が挙げられる。任意の上記デバイスは、本発明とともに使用するのに適している。本明細書中で考察されるように操作し得るように、これらのデバイスに対する改変(もしあれば)の性質および実施は、当業者に明らかである。さらに、多くのコンビナトリアルライブラリー自体が、市販されている(例えば、ComGenex,Princeton,N.J.,Asinex,Moscow,Ru,Tripos,Inc.,St.Louis,MO,ChemStar,Ltd,Moscow,RU,3D Pharmaceuticals,Exton,PA,Martek Biosciences,Columbia,MDなどを参照のこと)。
(b.化学ライブラリーのハイスループットアッセイ)
本明細書中に記載されるビルレンスを阻害する化合物についての任意のアッセイは、ハイスループットスクリーニングに受け入れ可能である。上記のように、ビルレンスと関連する核酸を同定した場合、同様な薬物候補が、遺伝子産物の発現を阻害するか、または発現されたタンパク質の活性を阻害するかのいずれかである。従って好ましいアッセイは、試験化合物による転写の阻害(すなわち、RAB38 mRNA産生の阻害)、試験化合物によるタンパク質発現の阻害、あるいは試験化合物による遺伝子(例えば、gDNA、もしくはcDNA)または遺伝子産物(例えば、RAB38 mRNAまたは発現されたタンパク質)への結合を検出する。あるいは、このアッセイは、遺伝子産物の特徴的な活性の阻害、あるいは、遺伝子産物と相互作用するレセプターまたは他の伝達分子の阻害または結合を検出し得る。
本明細書中に記載されるビルレンスを阻害する化合物についての任意のアッセイは、ハイスループットスクリーニングに受け入れ可能である。上記のように、ビルレンスと関連する核酸を同定した場合、同様な薬物候補が、遺伝子産物の発現を阻害するか、または発現されたタンパク質の活性を阻害するかのいずれかである。従って好ましいアッセイは、試験化合物による転写の阻害(すなわち、RAB38 mRNA産生の阻害)、試験化合物によるタンパク質発現の阻害、あるいは試験化合物による遺伝子(例えば、gDNA、もしくはcDNA)または遺伝子産物(例えば、RAB38 mRNAまたは発現されたタンパク質)への結合を検出する。あるいは、このアッセイは、遺伝子産物の特徴的な活性の阻害、あるいは、遺伝子産物と相互作用するレセプターまたは他の伝達分子の阻害または結合を検出し得る。
特定の核酸またはタンパク質産物の存在、非存在または定量化のためのハイスループットアッセイは、当業者に周知である。同様に、結合アッセイは、同様に周知である。従って、例えば、米国特許第5,559,410号は、タンパク質のハイスループットスクリーニング方法を開示し、米国特許第5,585,639号は、核酸結合のハイスループットスクリーニング方法(すなわち、アレイ)を開示し、一方、米国特許第5,576,220号および同第5,541,061号は、リガンド/抗体結合のスクリーニングのハイスループット方法を開示する。
さらに、ハイスループットスクリーニングシステムは、市販される(例えば、Zymark Corp.,Hopkinton,MA;Air Technical Industries,Mentor,OH;Beckman Instruments,Inc.Fullerton,CA;Precision Systems,Inc.,Natick,MAなどを参照のこと)。これらのシステムは、代表的に、全てのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体分散、時間を合わせたインキュベーション、およびアッセイに適切な検出器におけるマイクロプレートの最終の読み取りを含む、手順全体を自動化する。これらの構成可能なシステムは、ハイスループットで迅速な起動、ならびに高い程度の柔軟性および特注性(customization)を提供する。このようなシステムの製造業者は、種々のハイスループットの詳細なプロトコルを提供する。従って、例えば、Zymark Corp.は、遺伝子転写、リガンド結合などの調節を検出するためのスクリーニングシステムを記載する技術的紀要を提供する。
(RAB38活性を阻害する方法)
本発明の方法は、RAB38活性を阻害する方法を含む。当該分野で公知の任意の方法が、使用され得、重要なことのすべては、RAB38活性が、野生型状態またはコントロールと比較して、減少するかまたは除去されることである。RAB38活性のインヒビターは、発現プロセスの任意の工程で作用し得る。
本発明の方法は、RAB38活性を阻害する方法を含む。当該分野で公知の任意の方法が、使用され得、重要なことのすべては、RAB38活性が、野生型状態またはコントロールと比較して、減少するかまたは除去されることである。RAB38活性のインヒビターは、発現プロセスの任意の工程で作用し得る。
RAB38活性は、リボザイム、アンチセンス分子、siRNA、またはRAB38活性の低分子化学ブロッカーの使用を含む多くの方法によって阻害され得る。
(アンチセンスおよびRNAiポリヌクレオチド)
特定の実施形態において、RAB38タンパク質の活性は、コードmRNA核酸配列(例えば、RAB38 mRNA)またはそのサブ配列に相補的であり、そして好ましくは、それに対して特異的にハイブリダイズし得る阻害性またはアンチセンスポリヌクレオチド(例えば、核酸)の使用によって、ダウンレギュレートされるかまたは全体的に阻害される。mRNAに対するアンチセンスポリヌクレオチドの結合は、mRNAの翻訳および/または安定性を減少させる。
特定の実施形態において、RAB38タンパク質の活性は、コードmRNA核酸配列(例えば、RAB38 mRNA)またはそのサブ配列に相補的であり、そして好ましくは、それに対して特異的にハイブリダイズし得る阻害性またはアンチセンスポリヌクレオチド(例えば、核酸)の使用によって、ダウンレギュレートされるかまたは全体的に阻害される。mRNAに対するアンチセンスポリヌクレオチドの結合は、mRNAの翻訳および/または安定性を減少させる。
本発明の文脈において、アンチセンスポリヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在するサブユニットもしくはそれらの近いホモログから形成される合成種を含み得る。アンチセンスポリヌクレオチドはまた、糖部分または糖間連結を変更され得る。これらの例示としては、ホスホロチオエートおよび他の硫黄含有種がある。アナログは、それらが、癌タンパク質mRNAと効果的にハイブリダイズする限り、本発明によって包含される。例えば、Isis Pharmaceuticals,Carlsbad,CA;Sequitor,Inc.,Natick,MAを参照のこと。
このようなアンチセンスポリヌクレオチドは、組換え手段を使用して、容易に合成され得るか、またはインビトロで合成され得る。このような合成のための装置は、いくつかの販売業者(Applied Biosystemsを含む)によって販売される。他のオリゴヌクレオチド(例えば、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体)の調製もまた、周知である。
本明細書中で使用されるアンチセンス分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを含む。センスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス鎖への結合によって転写をブロックするために使用され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドは、標的mRNA(センス)配列またはDNA(アンチセンス)配列に結合し得る一本鎖核酸配列(RNAまたはDNAのいずれか)を含む。好ましいアンチセンス分子は、RAB38分子、またはそのリガンドもしくはアクチベーターに対する。本発明に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14〜30ヌクレオチドのフラグメントを含む。所定のタンパク質をコードするcDNA配列に基づいて、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein and Cohen(1988)Cancer Res.48:2659−2668;およびvan der Krol,ら(1988)BioTechniques 6:958−976に記載される。
RNA干渉は、配列特異的様式で遺伝子発現を抑制する機構である。例えば、Brumelkampら,(2002)Sciencexpress(21 March 2002);Sharp(1999)Genes Dev.13: 139−141;およびCathew(2001)Curr.Op.Cell Biol.13:244−248を参照のこと。哺乳動物細胞において、短い(例えば、21nt)二本鎖の小さい干渉RNA(siRNA)は、RNAi応答を誘導する際に効果的であることが示された。例えば、Elbashir,ら(2001)Nature 411:494−498を参照のこと。同定された遺伝子の発現レベルをダウンレギュレートするため(例えば、疾患の処置または疾患に対する関連の確認)の機構が使用され得る。
アンチセンスポリヌクレオチドに加えて、リボザイムは、RAB38ヌクレオチド配列の転写を標的化および阻害するために使用され得る。リボザイムは、他のRNA分子を触媒的に切断するRNA分子である。異なる種類のリボザイムが記載され、これには、I群リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、RNase P、およびアックスヘッド(axhead)リボザイム(例えば、異なるリボザイムの性質の一般的な総説について、Castanottoら、(1994)Adv.in Pharmacology 25:289−317を参照のこと)が挙げられる。
ヘアピンリボザイムの一般的な特徴は、例えば、Hampelら、(1990)Nucl.Acids Res.18:299−304;欧州特許公開番号0 360 257;米国特許第5,254,678号に記載される。調製方法は、例えば、WO 94/26877;Ojwangら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6340−6344;Yamadaら、(1994)Human Gene Therapy 1:39−45;Leavittら、(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:699−703;Leavittら、(1994)Human Gene Therapy 5:1151−120;およびYamadaら、(1994)Virology 205:121−126に記載される。
RAB38のポリヌクレオチドモジュレーターは、WO91/04753に記載されるように、リガンド結合分子との結合体の形成によって標的ヌクレオチド配列を含む細胞に導入され得る。適切なリガンド結合分子としては、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、または細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合分子の結合は、そのリガンド結合分子が、その対応する分子またはレセプターに結合するか、あるいはセンスオリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはその結合されたバージョンが細胞に侵入することをブロックする能力を実質的に妨害しない。あるいは、RAB38のポリヌクレオチドモジュレーターは、例えば、WO90/10448に記載されるような、ポリヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含む細胞に導入され得る。モデルにおけるアンチセンス分子またはノックアウトおよびノックの使用はまた、処置の方法に加えて、スクリーニングアッセイにおいて使用され得る。
イントラボディ(intrabody)はまた、RAB38タンパク質の活性をブロックまたは調節するための有効な手段を提供する。細胞内で発現される抗体構築物(通常、単鎖Fv抗体)は、細胞の内側の標的に対して指向される。scFv遺伝子は、細胞内に移入され得、ここで、scFvタンパク質発現は、その標的(例えば、RAB38)の特性を調節し得、時々、タンパク質機能を打ち消し、そして表現型ノックアウトをもたらす。
(RAB38インヒビターの局所投与)
有効であるために、局所的RABモジュレーターまたはインヒビターは、調節効果を作り出すために、十分な濃度の活性因子を含み、ここで、好ましくは、この調節効果は、阻害効果であり、治療的用量を送達するように十分に、インタクトな皮膚のような組織を貫通するべきであり、そして迅速な作用の開始を示し、そして長期の効果を有するべきである。上記を達成するために、迅速な開始をもたらすために高濃度で存在し、さらにまたは代替的に、RAB38調節を延長するために、適用の部位で皮膚を通して迅速に吸収され得る量で過剰に存在するRAB38モジュレーターを有することが、しばしば望ましい。
有効であるために、局所的RABモジュレーターまたはインヒビターは、調節効果を作り出すために、十分な濃度の活性因子を含み、ここで、好ましくは、この調節効果は、阻害効果であり、治療的用量を送達するように十分に、インタクトな皮膚のような組織を貫通するべきであり、そして迅速な作用の開始を示し、そして長期の効果を有するべきである。上記を達成するために、迅速な開始をもたらすために高濃度で存在し、さらにまたは代替的に、RAB38調節を延長するために、適用の部位で皮膚を通して迅速に吸収され得る量で過剰に存在するRAB38モジュレーターを有することが、しばしば望ましい。
本発明の好ましい局所処方物において、活性RAB38モジュレーターは、一般的に、局所薬物投与に適し、そして当該分野で公知の任意のこのような物質を含むものである。局所キャリアは、所望の形態(例えば、液体、ローション、クリーム、ペースト、ゲル、粉末、または軟膏)で組成物を提供するように選択され、そして天然に存在するかまたは合成起源のいずれかの材料から構成され得る。選択されたキャリアが、局所処方物の活性因子または他の成分に有害に作用しないことが必須で明らかである。本明細書中での使用のための適切な局所キャリアの例としては、水、アルコールおよび他の非毒性有機溶媒、グリセリン、鉱油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ワックスなどが挙げられる。本発明の組成物は、シャンプーの形態で投与され得、この場合、このような処方物の従来の成分は、同様に、例えば、界面活性剤、コンディショナー、粘度改変剤、湿潤剤などで含まれる。
本明細書中の特に好ましい処方物は、無色、無臭の軟膏、ローション、クリームおよびゲルである。
軟膏は、半固体調製物であり、これは、代表的に、石油または他の石油誘導体に基づく。使用される特定の軟膏ベースは、当業者によって理解されるように、最適な薬物送達を提供し、そして好ましくは、他の所望の特性(例えば、軟化性(emolliency)など)を同様に提供するものである。他のキャリアまたはビヒクルとともに、軟膏ベースは、不活性で、安定で、非刺激性で、非感受性であるべきである。Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Co.,1995),1399−1404頁において説明されるように、軟膏ベースは、4つのクラス(油性ベース;乳化可能ベース;エマルジョンベース;および水溶性ベース)に分類され得る。油性軟膏ベースとしては、例えば、植物油、動物から得られた脂肪、および石油から得られた半固体炭化水素が挙げられる。乳化可能軟膏ベース(吸収軟膏ベースとしても公知)は、ほとんどまたは全く水を含まず、これには、例えば、ヒドロキシステアリンスルフェート、無水ラノリンおよび親水性ワセリンが挙げられる。エマルジョン軟膏ベースは、油中水(W/O)エマルジョン、または水中油(O/W)エマルジョンのいずれかであり、これには、例えば、セチルアルコール、グリセリルモノステアレート、ラノリンおよびステアリン酸が挙げられる。好ましいW/O軟膏ベースは、種々の分子量のポリエチレングリコールから調製され;また、さらなる情報のために、Remington:The Science and Practice of Pharmacyに対して参照がなされる必要があり得る。
ローション剤は、摩擦なしに表皮表面に適用される調製物であり、代表的には、固体粒子(活性因子を含む)が水またはアルコール基剤中に存在する、液体または半液体の調製物である。ローション剤は、通常、固体の懸濁剤であり、好ましくは、本発明の目的のために水中油型の液体油性乳剤を含む。ローション剤は、より多くの液体組成物を適用するのが簡便であるため、身体の大きな領域を処置するための本明細書中で好ましい処方物である。ローション剤中の不溶性物質が細かく分割されることが一般的に必要である。ローション剤は、代表液にはより良い分散を生じる懸濁剤、および活性因子を皮膚に接触して局在化および維持するのに有用な化合物(例えば、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど)を含む。本発明と組み合せて用いられる、特に好ましいローション処方物は、親水性ワセリンと混合したプロピレングリコール(例えば、Beiersdorf,Inc.(Norwalk,Conn.)製のAquaphor.RTM.という商標で得られ得るもの)を含む。
当該分野で公知であるように、選択されたRAB38モジュレーターを含有するクリーム剤は、水中油もしくは油中水のいずれかの粘性の液体または半固体の乳剤である。クリーム基剤は、水で洗浄可能であり、油相、乳化剤および水相を含む。油相はまた、時々、「内」相と呼ばれ、一般にワセリンおよび脂肪アルコール(例えば、セチルアルコールまたはステアリルアルコール)を含み;水相は通常、必ずというわけではないが、容積において油相を上回り、そして、一般に湿潤剤を含む。クリーム処方物中の乳化剤は、Remington(前出)に説明されるように、一般に非イオン性界面活性剤か、アニオン性界面活性剤か、カチオン性界面活性剤かまたは両性界面活性剤である。
ゲル処方物がまた使用され得る。局所薬物処方物の分野の当業者によって理解されるように、ゲルは、半固体の懸濁型系である。単相ゲルは、キャリア液体全体に実質的に均一に分散する有機高分子を含有し、このキャリア液体は、代表的には水性であるが、また、好ましくはアルコールおよび必要に応じて油を含有する。
当業者に公知の種々の添加物が本発明の局所処方物に含有され得る。例えば、溶媒を使用して特定の薬物物質を可溶化し得る。他の任意の添加物としては、皮膚浸透増強剤、乳白剤、抗酸化剤、ゲル化剤、増粘剤、安定剤などが挙げられる。他の薬物(例えば、抗菌剤、抗真菌剤、抗生物質および抗炎症剤(例えば、ステロイド))もまた添加され得る。
本発明の好ましい局所処方物において、活性RAB38モジュレーターが、一般に総組成物の10重量%未満、好ましくは約1重量%未満、そして最も好ましくは、約0.1重量%未満の量で存在する。
(定義)
本発明の理解を促進するために、多数の用語が定義され、以下に議論される。
本発明の理解を促進するために、多数の用語が定義され、以下に議論される。
用語「治療有効量」とは、局所的に適用される場合、効果を生じるのに十分なRAB38モジュレーターの量を意味することが企図される。これらの量は当該分野で公知であるかまたは当該分野で公知の方法により決定され得、選択されるRAB38モジュレーター、そして組織(例えば、皮膚)が作用部位であるかどうかに依存して、代表的には成人1人あたり約1〜20,000mg、好ましくは約10〜10,000mgの範囲であり、そして最も好ましくは、適用あたり約20〜5,000mgの範囲のRAB38モジュレーター剤である。
用語「メラノソーム(melanosme)色素沈着のインヒビター」とは、メラノソームの形成を任意の程度まで阻止する、および/または、メラノソーム内の色素沈着を任意の程度まで阻止する任意の物質をいう。インヒビターは、メラノソーム色素沈着をもたらすプロセスの任意の工程において作用し得、これらの工程としては以下が挙げられるがこれらに限定されない:メラノソーム小胞を輸送する工程、小胞もしくはタンパク質を選別する工程、またはタンパク質活性に作用する工程。
用語「皮膚色のライトニング(明るくすること)」は、皮膚の色、トーンまたは影を、わずかではあるが可視的に減少することをいう。これらの変化は、減少または阻害されたRAB38機能の結果として生じるメラノソーム色素沈着の減少によりもたらされ得る。
RAB38ポリペプチドの「インヒビター」、「活性化剤」または「モジュレーター」は、RAB38活性に関するインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して同定される、阻害分子または活性化分子をいう。インヒビターは、その活性を減少、阻止、防止、活性化の遅延、不活性化、脱感作、またはダウンレギュレートする化合物である。活性化剤は、RAB38活性を増加、開放、活性化、促進、活性化の増強、感作またはアップレギュレートする化合物である。インヒビターおよび活性化剤に対するこのようなアッセイとしては、例えば、細胞中にRAB38ポリペプチドを発現させ、次いでGTPase活性を測定することが挙げられる。あるいは、内因性RAB38を発現する細胞がこのようなアッセイにおいて使用され得る。阻害の程度を調べるために、RAB38タンパク質を含むサンプルまたはアッセイを、潜在性の活性化剤またはインヒビターで処理し、そして、このインヒビターを含まないコントロールサンプルと比較する。コントロールサンプル(インヒビターで処理されない)に、100%の相対RAB38活性値を割り当てる。RAB38活性の阻害は、コントロールに対するRAB38活性値が約90%、好ましくは50%、より好ましくは25〜0%である場合に、達成される。RAB38活性の活性化は、コントロールに対するRAB38活性値が110%、より好ましくは150%、最も好ましくは少なくとも200〜500%より高いまたは1000%以上である場合に達成される。
用語「イントラボディ(intrabody)」は、細胞内の標的に対して指向される細胞内に発現される抗体構築物(通常は、単鎖Fv抗体)をいう。Nam,CHら(2002)Methods Mol Biol.193:301;der Maurr,AAら(2002)J.Biol Chem Nov 22;277(47):45075;Cohen,PA(2002)Methods Mol Biol 178:367。scFv遺伝子は細胞内に移行され得、ここで、scFvタンパク質発現は、その標的(例えば、RAB38)の特性を調節し、時々、タンパク質機能を消失させ、表現型ノックアウトを生じ得る。実際、scFvイントラボディは、細胞質内に発現され、任意の細胞区画に指向され得、ここで、このscFvイントラボディは細胞内タンパク質を標的化し、そして特定の生物学的効果を誘発し得る。従って、イントラボディは、タンパク質の活性を阻止または調節するための効果的な手段を提供する。
用語「リボザイム」は、触媒的に他のRNA分子を切断するRNA分子をいう。異なる種類のリボザイムが記載され、これらとしては、I群リボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアピンリボザイム、RNasePおよびアクスヘッド(axhead)リボザイムが挙げられる(例えば、Castanottoら(1994)Adv.in Pharmacology 25:289〜317(異なるリボザイムの特性の一般的な総説)を参照のこと)。
ヘアピンリボザイムの一般的な特徴が、例えば、Hampelら(1990)Nucl.Acids Res.18:299〜304;欧州特許公開番号0 360 257;米国特許第5,254,678号に記載される。調製方法は、例えば以下に記載される:WO 94/26877;Ojwangら、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6340〜6344;Yamadaら(1994)Human Gene Therapy 1:39〜45;Leavittら(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:699〜703;Leavittら(1994)Human Gene Therapy 5:1151〜120;およびYamadaら(1994)Virology 205:121〜126。
RNAとして発現される任意の細胞内遺伝子産物(mRNAによりコードされるタンパク質および構造RNA自身が挙げられる)は、配列および構造の適切な領域を含むように操作されたリボザイムによる特異的な切断および不活性化に標的化され得る。代替的な基質(DNA基質を含む)を切断する新規のリボザイムは、直接的な進化または、注意深く合理的な設計により、I群イントロンから操作された。
用語「siRNA」は、RNA干渉機構の一部である低分子の干渉RNA分子をいう。RNA干渉は、配列特異的な様式で遺伝子発現を抑制する機構である。例えば、Brumelkampら(2002)Sciencexpress(2002年3月21日);Sharp(1999)Genes Dev.13:139〜141;およびCathew(2001)Curr.Op.Cell Biol.13:244〜248を参照のこと。哺乳動物細胞において、短い(例えば、21nt)の二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)が、RNAi応答を誘導するのに効果的であることが示されている。例えば、Elbashirら(2001)Nature 411:494−498を参照のこと。この機構を使用して、例えば、皮膚色素沈着を減らす目的でRAB38機能を阻害すると同定された遺伝子の発現レベルをダウンレギュレートし得る。
用語「アンチセンス分子」、「RAB38に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド」、または「RAB38アンチセンスオリゴヌクレオチド」は以下の配列を有するオリゴヌクレオチドである:(i)RAB38ヌクレオチド配列の一部と安定な三重鎖を形成し得る配列、または(ii)RAB38のmRNA転写物の一部と安定な二重鎖を形成し得る配列。
アンチセンス技術は、特定の遺伝子産物のレベルを低下させる有効な手段として出現している。この技術は、これらの「アンチセンス」配列が遺伝子または関連する標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、安定な二本鎖または三本鎖を形成する(それぞれ、Watson−Crick結合またはHoogsteen結合に基づく)という知見に基づく。次いで、特異的に結合するアンチセンス化合物は、それぞれの標的を、酵素的分解、転写の阻止もしくはプロセッシングにより感受性にするかまたは、さもなくば標的ポリヌクレオチドの機能を阻止するかもしくは阻害するかのいずれかである。標的ポリヌクレオチドがRNAである場合、アンチセンス分子は、特定のRNA転写物にハイブリダイズし、正常なRNAプロセッシング、安定性および翻訳を妨害し、それによって、標的とされた遺伝子の発現を妨げる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与、または、目的のmRNAに相補的な細胞内アンチセンス配列を産生し得る発現構築物の送達は、インビトロおよびインビボにおいて特定の遺伝子の翻訳を阻止することが示されている。例えば、c−mycに焦点を当てるHoltら、Mol.Cell.Biol.1988,8,963〜973は、ヒト前骨髄球性白血病HL−60細胞において、標的mRNAとの細胞内二本鎖の形成およびc−mycタンパク質の選択的な減少を見出た。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、結合されるヌクレオチドから形成されるポリヌクレオチドをいう。さらに、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチド、または、生態系においてより安定であるか、もしくは標的配列により強固に結合するように、オリゴヌクレオチドに特定の特性を与えるように設計された、天然に存在するサブユニットもしくは類似のサブユニットから形成される合成オリゴヌクレオチドを含む。これはまた、オリゴヌクレオチドの改変(例えば、他の化合物にそれらを化学的に結合すること)もまた含み、この改変は、細胞への送達もしくは核および細胞の他の区画への送達を増強する。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変ヌクレオチド間結合を含み得、ヌクレアーゼに対する安定性を提供する。例えば、本発明は、ホスホロチオエートオリゴデオキシリボヌクレオチドを含み得る。従って、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボヌクレオチドおよび/またはデオキシリボヌクレオチドの未改変オリゴマー、ならびに、1つ以上のプリン部分もしくはピリミジン部分、糖部分またはヌクレオチド間結合が化学的に改変されているオリゴマーを含む。
上記の一般性を限定することなく、本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然または改変のモノマーもしくは結合の直鎖状オリゴマー(デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形態、ポリアミド核酸などが挙げられる)であって、規則的なパターンのモノマー−モノマー相互作用(例えば、Watson−Crick型の塩基対合、Hoogsteen型または逆Hoogsteen型の塩基対合など)により標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得るものを含む。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのアナログにより結合され、少数のモノマー単位(例えば、3〜4)から数百のモノマー単位の範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。ホスホジエステル結合のアナログとしては以下が挙げられる:ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデートなど(より完全には、以下に記載する)。本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」は、2’−デオキシおよび2’−ヒドロキシル形態を含む天然のヌクレオシド(例えば、KornbergおよびBaker,DNA Replication,第2版(Freeman,San Francisco,1992)に記載される)を含む。ヌクレオシドに関連する「アナログ」は、改変された塩基部分および/または改変された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む(例えば、Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)に一般的に記載される)。このようなアナログとしては、結合特性(例えば、二本鎖または三本鎖の安定性、特異性など)を増強するように設計された合成ヌクレオシドが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、安定性を増大させ、細胞内および細胞外の分解を妨げるように改変されることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、その標的配列への親和性ならびに薬学的に活性な形態で哺乳動物に送達される場合の適切な細胞および細胞区画への輸送を増加させるように改変されることがさらに好ましい。
標的ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本差の、RAB38DNAであってもRAB38RNAであってもよい。しかし、一本鎖DNAまたはRNA標的が好ましい。本発明のRAB38アンチセンスオリゴヌクレオチドが指向される標的としては、RAB38の対立遺伝子形態が挙げられることが理解できる。標的ポリヌクレオチド配列の知識がある場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドのために特定の配列を選択するための、文献中の相当なガイダンスが存在する。例えば、PeymanおよびUlmann、Chemical Reviews、90:543−584、1990;Crooke、Ann.Rev.Pharmacal.Toxicol.、32:329−376 (1992);ならびにZamecnikおよびStephenson,Proc.Natl.Acad.Sci.、75:280−284(1974)。好ましくは、RAB38アンチセンス化合物の配列は、G−C含量が少なくとも60%であるように選択される。好ましいプロトオンコジーンmRNA標的としては、5’キャップ部位、tRNAプライマー結合部位、開始コドン部位、mRNAドナースプライス部位、およびmRNAアクセプタースプライス部位、(例えば、Goodchildら、米国特許第4,806,463号)が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、モノマー−ヌクレオチド相互作用の規則的なパターン(例えば、ワソソン−クリック型の塩基対形成、フーグスチン型または逆フーグスチン型の塩基対形成、など)を介して、標的ポリペプチドに特異的に結合し得る任意の重合体化合物を含み得る。本発明のアンチセンス化合物はまた、ペンダント(pendent)基またはペンダント部分を、ポリマーの基本的な繰り返し単位の一部として、またはポリマーの基本的な繰り返し単位とは別個のいずれかで、特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達、または効率に関連する他の特性を増強するために含み得る(例えば、コレステロール部分、アクリジンのような二重鎖インターカレーター、ポリ−L−リジン、ホスホロチオエートのようなヌクレアーゼ耐性結合基の1つ以上を有する「末端キャッピング」、など)。
例えば、増強された脂質溶解度および/または増強されたヌクレアーゼ消化に対する耐性は、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合中のリン酸酸素をアルキル基またはアルコキシ基に置換し、アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドまたはアルキルホスホトリエステルオリゴヌクレオチドを形成することによって、増強されることが公知である。非イオン性オリゴヌクレオチド、例えば、ヌクレアーゼ加水分解に対する増加した耐性、および/または増加した細胞の取り込によって特徴付けられるが、相補的な核酸配列と安定な複合体を形成する能力を保持する。特に、アルキルホスホネートは、ヌクレアーゼ切断に対して安定であり、そして脂質に可溶性である。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドの調製は、Tsoら(米国特許第4,469,863号)に開示される。
好ましくは、ヌクレアーゼ耐性は、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオチド間結合を提供することによって、本発明のアンチセンスに化合物に与えられる。そのような結合の多くが、当該分野で公知である(例えば、ホスホロチオエート:ZonおよびGeiser、Anti−Cancer Drug Design、6:539−568(1991);Stecら、米国特許第5,151,510号;Hirschbein、米国特許第5,166,387号;Bergot、米国特許第5,183,885号;ホスホロジチオエート:Marshallら、Science、259:1564−1570(1993);CaruthersおよびNielsen、国際出願PCT/US89/02293;ホスホロアミデート例えば、−OP(=O)(NRlR2)−O−であって、RlおよびR2が水素またはCl−C3アルキルである;Jagerら、Biochemistry、27:7237−7246(1988);Froehlerら、国際出願PCT/US90/03138;ペプチド核酸:Nielsenら、Anti−Cancer Drug Design、8:53−63(1993)、国際出願PCT/EP92/01220;メチルホスホネート:Millerら米国特許第4,507,433号、Ts’oら、米国特許第4,469,863号;Millerら米国特許第4,757,055号;ならびに種々のタイプのP−キラル結合、特にホスホロチオエート、Stecら、欧州特許出願506,242(1992)およびLesnikowski、Bioorganic Chemistry、21:127−155(1993)。さらなるヌクレアーゼ結合としては、ホスホロセレノエート(phosphoroselenoate)、ホスホロジセレノエート(phosphorodiselenoate)、ホスホロアニロチオエート(phosphoroanilothioate)、ホスホロアニリデート(phosphoranilidate)、アルキルホスホトリエステル(例えば、メチル−およびエチル−ホスホトリエステル)、カーボネート(例えば、カルボキシメチルエステル)、カルバメート、モルホリノカルバメート、3’−チオホルムアセタール、シリル(例えば、例えば、ジアルキル(C1−C6)−またはジフェニルシリル、スルファメートエステルなどが挙げられる。これらをオリゴヌクレオチド内に導入する結合および方法は、多くの参考文献に記載される(例えば、一般的に、PeymanおよびUlmann,Chemical Reviews 90:543−584(1990);Milliganら、J.Med.Chem.、36:1923−1937(1993);Matteucciら、国際出願PCT/US91/06855において概説される)。
ヌクレアーゼ消化に対する耐性はまた、ヌクレオチド間結合を、Dagleら、Nucl.Acids Res.18、4751−4757(1990)の手順に従って、5’末端および3’末端の両方をホスホロアミダイトで改変することによって達成され得る。
好ましくは、ホスホジエステル結合の亜リン酸アナログを、本発明の化合物中で使用する(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、またはメチルホスホネート)。より好ましくは、ホスホロチオエートを、ヌクレアーゼ耐性結合として使用する。
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、酸素−イオウ置換(sulfur−for−oxygen substitution)を、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合中に含む。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、二重鎖形成のための効率的なハイブリダイゼーション特性と、本質的なヌクレアーゼ耐性を兼ね備えながら、荷電したリン酸アナログの水溶性を保持する。荷電は、レセプターを介する細胞の取り込み特性に寄与すると考えられている(Lokeら、Proc.Natl.Acad.Sci.、86、3474−3478(1989))。
好ましい結合基に加えて、本発明の化合物は、さらなる改変を含み得ることが考えられる(例えば、ホウ素化塩基、Spielvogelら、米国特許第5,130,302号;コレステロール部分、Sheaら、Nucleic Acids Research、18:3777−3783(1990)またはLetsingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.、86:6553−6556(1989);およびピリミジンの5−プロピニル改変、Froehlerら、Tetrahedron Lett.、33:5307−5310(1992)。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の任意の方法によって合成され得る。本発明において、オリゴヌクレオチドが合成化学の方法(例えば、アセトニトリル中で、テトラエチルチウラムジスルフィド(tetraethylthiuram disulfide)を用いる硫黄化作用による、ホスホルアミダイト化学)によって調製されることが好ましい。例えば、VuおよびHirschbein、Tetrahedron Lett.、1991、32、30005−30008を参照のこと。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、インビトロおよびインビボ転写系(例えば、T7ポリメラーゼまたは発現ベクターによる転写)を使用して合成され得る。インビトロまたはインビボ転写系を用いて合成されたオリゴヌクレオチドは、当該分野で公知の化学的方法を用いて改変され得る。そのような改変の例としては、リポソーム中へのカプセル化、またはステロイド、抗体、および細胞レセプターリガンドへの化学結合が挙げられる。
三重鎖が所望される実施形態においては、標的配列の選択における制約がある。一般に、フーグスチン型の結合を介して会合する3番目の鎖が、二重鎖標的中のホモピリミジン−ホモプリン部分の中で、最も安定である。通常、塩基トリプレットは、T−A*TまたはC−G*Cモチーフ(「−」は、ワトソン−クリック対形成を示し、そして「*」は、フーグスチン型結合を示す)を形成するが、他のモチーフも可能である。例えば、フーグスチン塩基対形成は、状態および鎖の組成に依存して、第3の鎖(フーグスチン鎖)と、その第3の鎖が結合する二重鎖のプリン−リッチ鎖との間で、平行および逆平行の方向を許容する。特定の実施形態において、三重鎖の安定性を最大化するか、またはそうでなければ調整するために、適切な配列、方向、状態、ヌクレオシドのタイプ(例えば、リボースヌクレオシドまたはデオキシリボースヌクレオシドが使用される場合)、塩基修飾(例えば、メチル化シトシンなど)を選択するために、文献において、広範な指針が存在する(例えば、Robertsら、Proc.Natl.Acad.Sci.、88:9397−9401(1991);Robertsら、Science,258:1463−1466(1992);Distefanoら、Proc.Natl.Acad.Sci、90:1179−1183(1993);Mergnyら、Biochemistry、30:9791−9798(1992);Chengら、J.Am.Chem.Soc.、114:4465−4474(1992);BealおよびDervan、Nucleic Acids Research、20:2773−2776(1992);BealおよびDervan、J.Am.Chem.Soc.、114:4976−4982;Giovannangeliら、Proc.Natl.Acad.Sci.、89:8631−8635(1992);MoserおよびDervan、Science、238:645−650(1987);McShanら、J.Biol.Chem.、267:5712−5721(1992);Yoonら、Proc.Natl.Acad.Sci.、89:3840−3844(1992);ならびにBlumeら、Nucleic Acids Research、20:1777−1784(1992))。
オリゴヌクレオチド部分の長さは、特異的な結合は、所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ生じ、そして他の偶発的な部位においては生じないことを確実にするように、多くの参考文献(例えば、Rosenbergら、国際出願PCT/US92/05305;またはSzostakら、Meth.Enzymol、68:419−429(1979))において説明されるように、十分長い必要がある。長さの上限は、いくつかの因子(長いオリゴマーの合成および精製の不都合および費用;より短いオリゴヌクレオチドよりも、より長いオリゴヌクレオチドの場合の、ミスマッチに対する、より大きな耐性;結合または特異性を増強するための改変が存在するか否か;二重鎖または三重鎖が所望されるか否か、などが挙げられる)によって決定される。
オリゴヌクレオチドの長さは、5〜200ヌクレオチドであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、10〜50ヌクレオチド長であることがより好ましい。オリゴヌクレオチドが15〜25ヌクレオチド長であることが最も好ましい。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、翻訳開始部位に特異的にハイブリダイズする。本発明の1つの好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列5’−AACGTTGAGGGGCAT−3’(配列番号1)を有する。このオリゴヌクレオチドは、翻訳開始コドンで始まり、その下流に伸びる、RAB38 mRNAの部分と相補的である。
一般に、本発明の実施において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの選択された部分に完全に相補的な配列を有する。しかし、完全な相補性は、必要とされない(特に、より長いオリゴマーにおいて)。従って、本明細書における、標的ポリヌクレオチドに「対して相補的なヌクレオチド配列」との言及は、標的部分に対して100%完全な相補性を有する配列を、必ずしも意味しない。一般に、標的(例えば、RAB38 mRNA)と安定な二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するオリゴヌクレオチド、すなわち、「ハイブリダイズ可能」なオリゴヌクレオチドが、適切である。安定な二重鎖の形成は、ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの配列および長さ、ならびに標的ポリヌクレオチドとの相補性の程度に依存する。一般に、ハイブリダイズするオリゴマーがより長い場合、より多くのミスマッチに対して耐性である。当業者は、任意の所定のアンチセンスオリゴマーおよび標的配列との間において耐えられ得るミスマッチの程度を、生じる二重鎖の融点(従って、熱安定性)に基づいて、容易に決定し得る。
好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドによって形成されたハイブリッドの熱安定性は、溶解(すなわち、鎖の解離)曲線によって決定される。鎖の50%が解離する温度が、融点(Tm)と考えられ、その結果、安定性の便利な尺度を提供する。Tm測定は、典型的には、中性pHにおいて、約1.0〜2.0μMの標的オリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を用いて、生理食塩水溶液中で行なわれる。典型的な条件は、以下のとおりである:10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中、または10mM Tris−HCl緩衝液(pH 7.0)中での、150mM NaCIおよび10mM MgCl2。溶解曲線のデータは、アンチセンスオリゴヌクレオチド/標的ポリヌクレオチド複合体のサンプルを、室温から約85〜90℃まで熱することによって、蓄積される。サンプルの温度が上昇するにつれて、260nm光の吸収が、1℃のインターバルでモニターされる(例えば、Cary(Australia)モデル1EまたはHewlett−Packard(Palo Alto、カリフォルニア)モデルHP 8459 UV/VISスペクトロフォトメーター、および、モデルHP 89100A温度コントローラー、または類似の機器を使用する)。そのような技術は、異なる長さおよび組成のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合強度を測定し、そして比較する便利な手段を提供する。
1つの実施形態に従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、RAB38遺伝子由来のメッセンジャーRNAとハイブリダイズ可能なように設計される。そのようなハイブリダイゼーションは、達成された場合に、メッセンジャーRNAの通常の役割を妨げ、細胞内でのその機能の改変を生じる。妨げられるメッセンジャーRNAの機能としては、全ての必須の機能(例えば、RNAのタンパク質翻訳部位への移動、RNAからタンパク質への実際の翻訳、1つ以上のmRNA種を生じるRNAスプライシング、および、可能性としては、RNAが関与する独立した触媒活性でさえも)、が挙げられる。そのようにRNAの機能が妨げられることの全体としての効果は、RAB38遺伝子発現の調節である。RAB38の発現を調節することによって、メラノサイトの色素沈着は調節されるか、または阻害される。
本明細書において使用する場合、用語「核酸」、「核酸配列」、および「ヌクレオチド配列」とは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびそのフラグメントまたは部分、ならびに一本鎖または二本鎖であり得る、センス鎖またはアンチセンス鎖の、ゲノム起源のまたは合成起源のDNAまたはRNAをいう。
本明細書において使用する場合、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、各々が、「制限部位」という特定のヌクレオチド配列においてか、またはその特定のヌクレオチド配列近傍において二重鎖DNAを切断する、細菌酵素をいう。
本明細書において使用する場合、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の規則によって関係付けられる、逆平行ポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)に関して使用される。例えば、配列5’AGTTC−3’は、配列3’TCAAG−5’に対して相補的である。
「増幅」は、核酸配列のさらなるコピーの生成として規定され、一般的に、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の当該分野で周知の技術を使用して実施される(例えば、DieffenbachおよびDveksler,PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview NY[1995])。本明細書中で使用される場合、用語「ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)」(「PCR」)は、クローニングまたは精製せずに、ゲノムDNAの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加するためのMullis法をいう(例えば、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,965,188号(参考として本明細書中に援用される)を参照のこと)。標的配列を増幅するためのこのプロセスは、所望の標的配列を含むDNA混合物に2つの大過剰のオリゴヌクレオチドプライマーを導入する工程、続いて、DNAポリメラーゼの存在下で熱サイクリングの正確な配列決定の工程からなる。この2つのプライマーは、二本鎖標的配列のこれらのそれぞれの鎖に相補的である。増幅を実施するために、混合物は、変性され、次いで、プライマーが、標的分子内のこれらの相補的配列にアニールされる。アニーリングの後、プライマーは、ポリメラーゼを用いて伸長され、相補鎖の新規対を形成する。変性の工程、プライマーアニーリングの工程、およびポリメラーゼ伸長(DNA合成)の工程は、代表的に、多数回反復され(すなわち、変性、アニーリング、および伸長は、1つの「サイクル」を構成し;通常、多数の「サイクル」である)、高い濃度の所望の標的配列の増幅されたセグメントを得る。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、互いに関するプライマーの相対的位置によって決定され、従って、この長さは、制御可能なパラメーターである。プロセスの反復局面によって、本方法は、「ポリメラーゼ連鎖反応」(本明細書中以後「PCR」)といわれる。標的配列の所望の増幅セグメントが、混合物中で(濃度に関して)優先的な配列になるので、これらは、VCR増幅されたといわれる。
本明細書中で使用される場合、用語「PCR産物」および「増幅産物」は、変性、アニーリングおよび伸長の2回以上のサイクルのPCR工程が、完了以後に、得られた化合物の混合物をいう。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、全て、共有ペプチド結合によって結合されるアミノ酸の一次配列をいう。一般的に、ペプチドは、数個のアミノ酸、代表的には、2〜25個のアミノ酸からなり、タンパク質より短い。「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質の両方を含む。
本明細書中で使用される場合、遺伝子に対する参照の場合、用語「部分」は、この遺伝子のフラグメントをいう。いくつかの実施形態において、フラグメントは、大きさが、10個の核酸から全核酸配列マイナス1個の核酸の範囲にある。
本明細書中で使用される場合、用語「精製」または「精製する」は、サンプルから少なくとも1つの夾雑物を除去することをいう。本明細書中で使用される場合、用語「実質的に精製された」は、これらの天然環境から除去されるか、「単離される」か、または「分離される」、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかである分子をいい、大部分は、他の成分を含まない。
用語「遺伝子」は、天然または組換え様式のいずれかにおいてほぼ組み合わせる場合、いくつかの産物または機能を提供する部分から構成される核酸(例えば、DNA)配列をいう。核酸のコード領域に加えて、用語「遺伝子」はまた、コード領域の5’末端および3’末端に隣接した全長mRNAの転写されたヌクレオチド配列を含む。これらの非コード領域は、5’非翻訳配列および3’非翻訳配列(5’UTおよび3’UT)という。5’UTおよび3’UTの両方は、調節的役割(翻訳開始、転写後切断およびポリアデニル化を含む)を提供し得る。好ましい実施形態において、哺乳動物「Rab38遺伝子」が提供される。
いくつかの実施形態において、遺伝子の「ゲノム」形態は、転写されたmRNA配列および他の非コード配列を含む。「イントロン」または「介在配列」は、一次転写物に含まれる遺伝子のセグメント(すなわち、異核RNA、すなわちhnRNA)であるが、これは、スプライス切断され、プロセスされたmRNA形態を生じる。逆に、「エキソン」は、プロセスされたmRNA配列に対応する遺伝子のセグメントである。
用語「作動可能な組み合わせにおける」および「作動可能に連結された」は、本明細書中で核酸に関して使用される場合、所定の遺伝子の転写および/または所望のタンパク質分子の合成を指向し得る核酸分子が生成されるような様式における核酸配列の結合をいう。本発明の好ましい実施形態において、プロモーターおよび/またはエンハンサーと「作動可能に組み合わされた」哺乳動物Rab38遺伝子が、提供される。
本明細書中で使用される、用語「ベクター」は、1つの細胞から別の細胞へDNAセグメントを移送する核酸分子に関して使用される。いくつかの実施形態において、ベクター「骨格」は、その維持を媒介し、その意図される用途を可能にするベクターの部分(例えば、複製に必要な配列、薬物耐性または抗生物質耐性を付与する遺伝子、マルチプルクローニング部位、および、クローン化された核酸の発現を可能にするおそらく作動可能に連結されたプロモーター/エンハンサー)を含む。ベクターは、しばしば、プラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスもしくは動物ウイルスに由来する。
本明細書中で使用される場合、用語「野生型」は、天然に存在する供給源から単離された場合の遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する、遺伝子または遺伝子産物をいう。野生型遺伝子は、集団中に最も頻繁に観察され、従って、遺伝子の「正常」形態または「野生型」形態と自由裁量で指定される。
対照的に、用語「変異体」および「突然変異」は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物に比べた場合の、配列特性および/または機能特性の改変(すなわち、変更された特性)を示す、遺伝子または遺伝子産物をいう。天然に存在する変異体は、単離され得、これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物に比べた場合、変更された特性を有するという事実によって同定されるということが、留意される。いくつかの実施形態において、本発明は、変異型Rab38遺伝子またはRAB38タンパク質を提供する。好ましい実施形態において、チョコレートRab38/RAB38変異体が、提供される。
用語「候補因子」は、任意の組成物の任意の分子をいい、これとしては、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、有機分子、無機分子、および/または生理学的応答または生物学的応答を生じ得ると疑われる分子の組み合わせが挙げられる。
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」は、RAB38の活性の変化をいう。例えば、調節は、酵素活性、結合特性、または任意の他のRAB38の生物学的特性もしくは機能的特性を引き起こし得る。
用語「メラノサイト」は、本明細書中で使用される場合、メラニン色素を合成する皮膚および眼中の特殊な細胞をいう。メラノサイトのクラスターは、皮膚上に母斑としてしばしば見られる。用語「メラノソーム」は、メラノサイトのメラニン産生細胞小器官をいう。
本明細書中で使用される場合、用語「GTPase活性」および「グアノシントリホスファターゼ活性」は、GTPを加水分解し、GDPおよび正リン酸塩を産生する酵素活性をいう。GTPase活性は、GTPase活性化タンパク質(活性化)によって、そしてグアニンヌクレオチド放出タンパク質(阻害)によって調節される。本発明の文脈において、GTPase活性は、「RAB38活性」またはRAB38のGTPase活性をいう。RAB38は、GDPに結合される場合、不活性であり、そしてGTPに結合される場合、活性である。従って、用語「GTP結合」は、GTPase(例えば、RAB38)によるGTPの結合をいい、その一方で、用語「GDP放出」は、GTPase(例えば、RAB38)によるGDPの放出をいう。RABファミリーのGTPaseは、小胞輸送のプロセスに関与する。本発明の背景において、用語「RAB活性」は、メラノサイトのメラノソームに対する「RAB38輸送」またはRAB38の輸送、およびメラノソームへの「TYRP1輸送」またはTYRP1の輸送を包含する。
本明細書中で使用される場合、用語「皮内(intradermal)貫通剤」は、角質層を通して表皮または真皮に、薬理学的に活性な化合物を輸送し得る薬剤をいい、その一方で、薬物貫通の皮内(intracutaneous)領域に制限される薬理学的効果を維持し、好ましくは、ほとんど全身吸収しないか、または全く全身吸収しない。
皮内(intradermal)貫通剤の「貫通増強量」は、皮内(intradermal)貫通剤なしでの貫通速度に比べて、角質層を通るRAB38インヒビター貫通またはモジュレーター貫通を増強する量である。
用語「薬学的に受容可能な局所処方物は、本明細書中で使用される場合、表皮に対して処方物を適用することによってRAB38モジュレーターまたはインヒビターの局所投与について、薬学的に受容可能である任意の処方物を意味する。本発明に従って、「局所処方物」は、少なくとも1つのRAB38モジュレーターまたはインヒビターを含み、そして、皮内(intradermal)貫通剤もまた含み得る。局所処方物の選択は、いくつかの因子に依存し、これとしては、処置される皮膚条件、存在するcおよび他の賦形剤、処方物中でのこれらの安定性、入手可能な製造装置、ならびに費用制限が挙げられる。
(実験)
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を示し、さらに例示するために提供され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および局面を示し、さらに例示するために提供され、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される:℃(摂氏度);BSA(ウシ血清アルブミン);DMEM(Dulbecco改変イーグル培地);FBS(ウシ胎仔血清); H2O(水);aa(アミノ酸);bp(塩基対);kb(キロ塩基対);EST(発現された配列タグ);kD(キロダルトン);gm(グラム);μg(マイクログラム);mg(ミリグラム);ng(ナノグラム);μl(マイクロリットル);ml(ミリリットル);mm(ミリメーター);nm(ナノメーター);μm(マイクロメーター);M(モーラー);mM(ミリモーラー);μM(マイクロモーラー);U(単位);MW(分子量);sec(秒);min(分);hr(時間);CO2(二酸化炭素);Cy3(インドカルボシアニン);Cy5(インドジカルボシアニン);(DEPC(ジエチルピロカーボネート);dNTP(デオキシヌクレオチド);MgCl2(塩化マグネシウム);PBS(リン酸緩衝化生理食塩水[150mM NaCl、10mMリン酸ナトリウム緩衝液,pH7.2]);SDS(ドデシル硫酸ナトリウム);SSC(生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝液);TBS(Tris緩衝化生理食塩水);PCR(ポリメラーゼ連鎖反応);RT(逆転写);w/v(重量 対 体積);v/v(体積 対 体積);Applied Biosystems(Applied Biosystems,Foster City,CA);Axon(Axon Instruments Inc.,Foster City,CA);GeneCodes(GeneCodes,Ann Arbor,MI);Invitrogen(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA);Jackson(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME);NEB(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA);NIH(National Institutes of Health,Bethesda,MD);Qiagen(Qiagen,Valencia,CA);Roche(Roche,MannHeim,Germany);およびSignet(Signet Laboratories,Dedham,MA)。
(実施例1)
(細胞培養)
マイクロアレイ分析についての全ての細胞を、5% CO2中37℃で90%コンフルエンスまで増殖させた。これらの実験で使用される細胞株を、Jeffry Trent(NIH)から得た。黒色腫細胞株を、10% FBS、2mM L−グルタミン、ならびに各100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むRPMI培地中で増殖させた。MnSOD6 cl1に対する培地は、500μg/mlゲネチシンもまた含んだ。293T細胞、U138細胞およびHeLa細胞を、10% FBS、2mM L−グルタミン、ならびに各100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM培地中で増殖させた。一次マウスメラノサイトを、以前に記載されるように培養した(Wuら、J Cell Sci 114:1091−1100[2001])。Melan−a細胞を、5%CO2中で、10% FBS、2mM L−グルタミン、10mM ピルビン酸ナトリウム、各100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、200nm 12−O−テトラデカノイルホルボール 13−酢酸、0.01mM 重炭酸ナトリウムならびに0.1mM 2−メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地中で培養した。
(細胞培養)
マイクロアレイ分析についての全ての細胞を、5% CO2中37℃で90%コンフルエンスまで増殖させた。これらの実験で使用される細胞株を、Jeffry Trent(NIH)から得た。黒色腫細胞株を、10% FBS、2mM L−グルタミン、ならびに各100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むRPMI培地中で増殖させた。MnSOD6 cl1に対する培地は、500μg/mlゲネチシンもまた含んだ。293T細胞、U138細胞およびHeLa細胞を、10% FBS、2mM L−グルタミン、ならびに各100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM培地中で増殖させた。一次マウスメラノサイトを、以前に記載されるように培養した(Wuら、J Cell Sci 114:1091−1100[2001])。Melan−a細胞を、5%CO2中で、10% FBS、2mM L−グルタミン、10mM ピルビン酸ナトリウム、各100単位/mlのペニシリンおよびストレプトマイシン、200nm 12−O−テトラデカノイルホルボール 13−酢酸、0.01mM 重炭酸ナトリウムならびに0.1mM 2−メルカプトエタノールを含むRPMI1640培地中で培養した。
(実施例2:RNA調製)
マイクロアレイ分析のための細胞を、掻き取ることによって収集した、4つの500cm2ディッシュのプールの状態で入手し、PBS中で洗浄し、そしてペレット化した。ペレットを10ml Trizol試薬(Invitrogen)中で溶解した。2mlのクロロホルムを添加し、サンプルを振盪し、次いで遠心分離して、相を分離した。水層を取り出し、そして等しい容積の75%エタノールを、攪拌しながら滴下した。サンプルをRNeasy maxiカラム(Qiagen)に適用し、そして製造業者の精製プロトコルに従った。サンプルを水中で溶出し、3M酢酸ナトリウムで沈澱させ、そして−80℃で保存した。RNAペレットをDEPC水中に1μg/pl濃度になるように再懸濁し、そしてMicrocon 100カラムに適用した。RNAサンプルを遠心分離し、そして7 10μg/μlになるように濃縮した。
マイクロアレイ分析のための細胞を、掻き取ることによって収集した、4つの500cm2ディッシュのプールの状態で入手し、PBS中で洗浄し、そしてペレット化した。ペレットを10ml Trizol試薬(Invitrogen)中で溶解した。2mlのクロロホルムを添加し、サンプルを振盪し、次いで遠心分離して、相を分離した。水層を取り出し、そして等しい容積の75%エタノールを、攪拌しながら滴下した。サンプルをRNeasy maxiカラム(Qiagen)に適用し、そして製造業者の精製プロトコルに従った。サンプルを水中で溶出し、3M酢酸ナトリウムで沈澱させ、そして−80℃で保存した。RNAペレットをDEPC水中に1μg/pl濃度になるように再懸濁し、そしてMicrocon 100カラムに適用した。RNAサンプルを遠心分離し、そして7 10μg/μlになるように濃縮した。
(実施例3:標識およびハイブリダイゼーション)
RNAを逆転写して蛍光標識したcDNAを得て、実験/参照対で、スライド上に共ハイブリダイズさせた。発現配列タグ(EST)クローンの挿入物を調製し、そして(DeRisiら,Nat Genet 14:457−460[1996])に記載される通りにスライドに適用した。逆転写した(RT)蛍光色素標識したcDNAを、当該分野で公知の通りに生成した(The National Human Genome Research InitiativeのMicroarray Projectのウェブサイトを参照のこと)。反応のために、60μgの総RNA(Cy3)または120μgの総RNA(Cy5)を用いた。ハイブリダイゼーションを、加湿チャンバ中で16時間、40μlの最終容積で、65℃にて実施した。スライドを室温にて、0.5×SSC/0.1% SDS中で3分間洗浄し、続いて0.6×SSC中で3分間、2回目の洗浄を行った。スライドを、遠心分離によって直ちにスピン乾燥した。
RNAを逆転写して蛍光標識したcDNAを得て、実験/参照対で、スライド上に共ハイブリダイズさせた。発現配列タグ(EST)クローンの挿入物を調製し、そして(DeRisiら,Nat Genet 14:457−460[1996])に記載される通りにスライドに適用した。逆転写した(RT)蛍光色素標識したcDNAを、当該分野で公知の通りに生成した(The National Human Genome Research InitiativeのMicroarray Projectのウェブサイトを参照のこと)。反応のために、60μgの総RNA(Cy3)または120μgの総RNA(Cy5)を用いた。ハイブリダイゼーションを、加湿チャンバ中で16時間、40μlの最終容積で、65℃にて実施した。スライドを室温にて、0.5×SSC/0.1% SDS中で3分間洗浄し、続いて0.6×SSC中で3分間、2回目の洗浄を行った。スライドを、遠心分離によって直ちにスピン乾燥した。
(実施例4:画像の獲得および分析)
Cy3蛍光色素(532λ)およびCy5蛍光色素(635λ)についての蛍光シグナルの強度を、Genepix 4000aスキャナー(Axon)を10μMの分解能で用いて得た。88個のハウスキーピングコントロール遺伝子のセットを用いて、標識効率を正規化した(Loftusら,Proc Natl Acad Sci USA 96:9277−9280[1999])。発現プロファイル分析を、平均連結法およびPersonの相関類似性測定を用いるクラスター化アルゴリズム(The National Human Genome Research InitiativeのGenome Clusteringのウェブサイトを参照のこと)を用いて行った。
Cy3蛍光色素(532λ)およびCy5蛍光色素(635λ)についての蛍光シグナルの強度を、Genepix 4000aスキャナー(Axon)を10μMの分解能で用いて得た。88個のハウスキーピングコントロール遺伝子のセットを用いて、標識効率を正規化した(Loftusら,Proc Natl Acad Sci USA 96:9277−9280[1999])。発現プロファイル分析を、平均連結法およびPersonの相関類似性測定を用いるクラスター化アルゴリズム(The National Human Genome Research InitiativeのGenome Clusteringのウェブサイトを参照のこと)を用いて行った。
(実施例5:マウスRab38遺伝子の組織化)
マウスRab38遺伝子の変異スクリーニングを促進するために、データベース検索を用いて、Rab38コード配列に隣接するゲノムDNAを同定した。Rab38 mRNA配列(配列番号9およびGenBank登録番号AY062237)を、マウスゲノム配列決定トレースアーカイブ(The National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを、トレースアーカイブクエリー(Trace Archive Querying)について参照のこと)に対してBLASTした。有意な類似性を、200よりも大きな、戻ってきたBLASTスコアによって決定した。適切なデータをダウンロードし、そしてSequencherバージョン3.1.1(GeneCodes)を用いてこのmRNA配列に対してアライメントした。ゲノムの組織化を、Spideyプログラム(The National Center for.Biotechnology InformationのウェブサイトをSpideyについて参照のこと)を用いることによって確認した。遺伝子の組織化をまた、ゲノムフラグメントのPCRおよびDNA配列決定によって実験的に確認した。この分析は、Rab38が以下の3つのエキソンから構成されることを明らかにした:エキソン1、ヌクレオチド1〜292;エキソン2、ヌクレオチド292〜572;およびエキソン3、ヌクレオチド573〜1439(ヌクレオチド位置は、GenBank登録番号AY062237をいう)。確認されたエキソン配列および周囲のイントロン配列を、GenBankに、以下の通りに寄託した:エキソン1、AF448441(配列番号10);エキソン2、AF448442(配列番号11);およびエキソン3、AF448443(配列番号12)。
マウスRab38遺伝子の変異スクリーニングを促進するために、データベース検索を用いて、Rab38コード配列に隣接するゲノムDNAを同定した。Rab38 mRNA配列(配列番号9およびGenBank登録番号AY062237)を、マウスゲノム配列決定トレースアーカイブ(The National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを、トレースアーカイブクエリー(Trace Archive Querying)について参照のこと)に対してBLASTした。有意な類似性を、200よりも大きな、戻ってきたBLASTスコアによって決定した。適切なデータをダウンロードし、そしてSequencherバージョン3.1.1(GeneCodes)を用いてこのmRNA配列に対してアライメントした。ゲノムの組織化を、Spideyプログラム(The National Center for.Biotechnology InformationのウェブサイトをSpideyについて参照のこと)を用いることによって確認した。遺伝子の組織化をまた、ゲノムフラグメントのPCRおよびDNA配列決定によって実験的に確認した。この分析は、Rab38が以下の3つのエキソンから構成されることを明らかにした:エキソン1、ヌクレオチド1〜292;エキソン2、ヌクレオチド292〜572;およびエキソン3、ヌクレオチド573〜1439(ヌクレオチド位置は、GenBank登録番号AY062237をいう)。確認されたエキソン配列および周囲のイントロン配列を、GenBankに、以下の通りに寄託した:エキソン1、AF448441(配列番号10);エキソン2、AF448442(配列番号11);およびエキソン3、AF448443(配列番号12)。
(実施例6:インサイチュハイブリダイゼーション)
時間を合わせた交配を用いて、種々の段階のFVBINJ(Jackson)マウス胚を得て、そしてEO.5を、膣栓形成日の正午と称した。胚をPBS中の4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。ジゴキシゲニン結合体化プローブを、RT結合部位リンカー(Roche)を用いた、直鎖化プラスミドおよび/またはPCR産物の逆転写(RT)によって合成した。以下のDNA源を、プローブ合成のために用いた:チロシナーゼ、cDNAクローン4633402007;Tyrp1、B16細胞株総RNAからのRT−PCR(TYRP15’T3F 5’−GCGCGAATTA ACCCTCACTA AAGGGTCTGA GCACCCCTGT CTTCT 3’、配列番号13;TYRP15’T7R 5’−GCGCGTAATACGACTCACTA TAGGGCCCAG TTGCAAAATT CCAGT−3’、配列番号14);Dct、cDNA;AimL/Matp、RIKEN cDNAクローンG370045L22;Mlsnl、B16細胞株総RNAからのRT−PCR(MLSN R T7 5’GCGGGTAATA CGACTCACTA TAGGGGCCAC AAACATGTCC TACTTAC−3’、配列番号15;MLSN FT3 5’GCGCGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAAGCT TCCGGACTCT CTAC 3’、配列番号16);Rab38,Riken cDNAクローン23 10011 F14。インサイチュハイブリダイゼーションを、以下の改変を行った、公開されたプロトコル(WilkinsonおよびNieto,Methods Enzymol 225:361−373[1993])を用いて行った。プローブのハイブリダイゼーション後、リボヌクレアーゼA消化を省略し、TBSをPBSの代わりに用い、そして基質BM−パープル(Roche)を5−ブロモ−4クロロ−3−インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウムの代わりに用いた。
時間を合わせた交配を用いて、種々の段階のFVBINJ(Jackson)マウス胚を得て、そしてEO.5を、膣栓形成日の正午と称した。胚をPBS中の4%パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。ジゴキシゲニン結合体化プローブを、RT結合部位リンカー(Roche)を用いた、直鎖化プラスミドおよび/またはPCR産物の逆転写(RT)によって合成した。以下のDNA源を、プローブ合成のために用いた:チロシナーゼ、cDNAクローン4633402007;Tyrp1、B16細胞株総RNAからのRT−PCR(TYRP15’T3F 5’−GCGCGAATTA ACCCTCACTA AAGGGTCTGA GCACCCCTGT CTTCT 3’、配列番号13;TYRP15’T7R 5’−GCGCGTAATACGACTCACTA TAGGGCCCAG TTGCAAAATT CCAGT−3’、配列番号14);Dct、cDNA;AimL/Matp、RIKEN cDNAクローンG370045L22;Mlsnl、B16細胞株総RNAからのRT−PCR(MLSN R T7 5’GCGGGTAATA CGACTCACTA TAGGGGCCAC AAACATGTCC TACTTAC−3’、配列番号15;MLSN FT3 5’GCGCGAATTA ACCCTCACTA AAGGGAAGCT TCCGGACTCT CTAC 3’、配列番号16);Rab38,Riken cDNAクローン23 10011 F14。インサイチュハイブリダイゼーションを、以下の改変を行った、公開されたプロトコル(WilkinsonおよびNieto,Methods Enzymol 225:361−373[1993])を用いて行った。プローブのハイブリダイゼーション後、リボヌクレアーゼA消化を省略し、TBSをPBSの代わりに用い、そして基質BM−パープル(Roche)を5−ブロモ−4クロロ−3−インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウムの代わりに用いた。
(実施例7:変異検出)
マウスRab38遺伝子ホモログを、エキソン含有ゲノムセグメントのPCR増幅およびDNA配列決定によって、変異についてスクリーニングした。以下のプライマー対を設計して、3つのタンパク質コードエキソンならびに少量の隣接イントロンDNAを増幅した:428bpの産物を生じる、Rab38 Ex1F 5’−TAGGAAGGAGGATTAAACCC G 3’(配列番号17)およびRab38 Ex 1R 5’GAACTCCTCATGGCTCACTC C 3’(配列番号18);464bpの産物を生じる、Rab38 Ex2F 5’−GGATATGAAGCTCCAGTGTA GTGTAC 3’(配列番号19)およびRab38 Ex2R 5’CACTGGACAG AAACATTATT GTCAC 3’(配列番号20);ならびに526bpの産物を生じる、Rab38 Ex3F 5’−AAGTTATCAG CCAGTGAGAT ACTGTG 3’(配列番号21)およびRab38 Ex3R 5’−CACATGTGGT ATATCTATCC TGACG 3’(配列番号22)。PCR反応物は、1.5μMの各プライマー、0.2μM dNTP、1.5pM MgCl2、1単位のAmpliTaq DNA Polymerase(Applied Biosystems)、1×の製造業者の10×緩衝液、および40ngのマウスゲノムDNAを含んでいた。サーマルサイクリングは、93℃にて2分間の最初の変性、続いて93℃にて10秒間、55℃にて5秒間および72℃にて30秒間を40サイクルからなっていた。72℃での最終伸長を、7分間行った。1%アガロースゲルでの分離後、PCR産物を切り出し、そしてQIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製した。DNA配列決定を、BigDyeターミネーター化学およびモデル3100 DNA配列決定機器(Applied Biosystems)を用いて実施した。サイクル配列決定ルーチンは、8μLのBigDyeカクテル、0.5μLの25[tMプライマー溶液、6.5μLの水、および5μLのPCR産物(約50ng/μLにて)を含む20μL反応物を用いて、92℃を20秒間、55℃を10秒間、および60℃を4分間の30サイクルであった。データを抽出し、そしてSequencing Analysisバージョン3.3(Applied Biosystems)を用いて分析し、そしてSequencherソフトウェアバージョン3.1.1(GeneCodes)を用いてアライメントした。アライメントは、野生型C57Bl/6Jマウスおよびヘテロ接合性cht/+マウス、ならびにマウスRab38 mRNA配列(GenBank登録番号AY062237)に由来する配列データを含んでいた。
マウスRab38遺伝子ホモログを、エキソン含有ゲノムセグメントのPCR増幅およびDNA配列決定によって、変異についてスクリーニングした。以下のプライマー対を設計して、3つのタンパク質コードエキソンならびに少量の隣接イントロンDNAを増幅した:428bpの産物を生じる、Rab38 Ex1F 5’−TAGGAAGGAGGATTAAACCC G 3’(配列番号17)およびRab38 Ex 1R 5’GAACTCCTCATGGCTCACTC C 3’(配列番号18);464bpの産物を生じる、Rab38 Ex2F 5’−GGATATGAAGCTCCAGTGTA GTGTAC 3’(配列番号19)およびRab38 Ex2R 5’CACTGGACAG AAACATTATT GTCAC 3’(配列番号20);ならびに526bpの産物を生じる、Rab38 Ex3F 5’−AAGTTATCAG CCAGTGAGAT ACTGTG 3’(配列番号21)およびRab38 Ex3R 5’−CACATGTGGT ATATCTATCC TGACG 3’(配列番号22)。PCR反応物は、1.5μMの各プライマー、0.2μM dNTP、1.5pM MgCl2、1単位のAmpliTaq DNA Polymerase(Applied Biosystems)、1×の製造業者の10×緩衝液、および40ngのマウスゲノムDNAを含んでいた。サーマルサイクリングは、93℃にて2分間の最初の変性、続いて93℃にて10秒間、55℃にて5秒間および72℃にて30秒間を40サイクルからなっていた。72℃での最終伸長を、7分間行った。1%アガロースゲルでの分離後、PCR産物を切り出し、そしてQIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製した。DNA配列決定を、BigDyeターミネーター化学およびモデル3100 DNA配列決定機器(Applied Biosystems)を用いて実施した。サイクル配列決定ルーチンは、8μLのBigDyeカクテル、0.5μLの25[tMプライマー溶液、6.5μLの水、および5μLのPCR産物(約50ng/μLにて)を含む20μL反応物を用いて、92℃を20秒間、55℃を10秒間、および60℃を4分間の30サイクルであった。データを抽出し、そしてSequencing Analysisバージョン3.3(Applied Biosystems)を用いて分析し、そしてSequencherソフトウェアバージョン3.1.1(GeneCodes)を用いてアライメントした。アライメントは、野生型C57Bl/6Jマウスおよびヘテロ接合性cht/+マウス、ならびにマウスRab38 mRNA配列(GenBank登録番号AY062237)に由来する配列データを含んでいた。
(実施例8:変異の確認および遺伝子型分類)
プライマー(cht Ex1F 5’−GGCCTCCAGG ATGCAGACAC C 3’、配列番号23;cht Ex1R 5’CCAGCAATGT CCCAGAGCTG C 3’、配列番号24)を、G146T配列の変化の周囲の213bpのフラグメントを増幅するように設計した。PCR増幅を、実施例7に記載の通りに行った。SexAI制限消化およびBsaJI制限消化を、10μLのPCR産物を含む20[tLの制限酵素消化物、1×の供給されたBSAを伴う2.5単位の酵素(NEB)および消化緩衝液を用いて行った。反応物を、製造業者の示唆する温度にて一晩インキュベートし、そして2%アガロースゲルにて電気泳動して、バンドパターンを可視化した。
プライマー(cht Ex1F 5’−GGCCTCCAGG ATGCAGACAC C 3’、配列番号23;cht Ex1R 5’CCAGCAATGT CCCAGAGCTG C 3’、配列番号24)を、G146T配列の変化の周囲の213bpのフラグメントを増幅するように設計した。PCR増幅を、実施例7に記載の通りに行った。SexAI制限消化およびBsaJI制限消化を、10μLのPCR産物を含む20[tLの制限酵素消化物、1×の供給されたBSAを伴う2.5単位の酵素(NEB)および消化緩衝液を用いて行った。反応物を、製造業者の示唆する温度にて一晩インキュベートし、そして2%アガロースゲルにて電気泳動して、バンドパターンを可視化した。
(実施例9:細胞のトランスフェクション)
GFP−RAB38構築物を、att部位リンカープライマー(AttB1−RRab 5’−GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTC CATGCAGACA CCTCACAAG−’、配列番号25およびAttB2−RRab−STP 5’−GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTT CTAGGATTTG GCACAGCCAG A 3’、配列番号26)を用いるマウスRab38を増幅するPCRによって作製し、そして製造業者の指示に従ってpDest 53(Invitrogen)へと「Gateway」クローニングした。GFP−RAB38を、製造業者の指示に従って4cm2表面積において1.6g/4μlのDNA/LipofectAMINE 2000比で用いたLipofectAMINE 2000(Invitrogen)を用いてmelan−a細胞にトランスフェクトした。72時間後、細胞を固定し、そして1:200希釈のTYRP1反応性抗体MEL5(Signet)を以前(Wuら,J Cell Sci 110:847−859[1997])に記載された通りに用いて染色した。
GFP−RAB38構築物を、att部位リンカープライマー(AttB1−RRab 5’−GGGGACAAGT TTGTACAAAA AAGCAGGCTC CATGCAGACA CCTCACAAG−’、配列番号25およびAttB2−RRab−STP 5’−GGGGACCACT TTGTACAAGA AAGCTGGGTT CTAGGATTTG GCACAGCCAG A 3’、配列番号26)を用いるマウスRab38を増幅するPCRによって作製し、そして製造業者の指示に従ってpDest 53(Invitrogen)へと「Gateway」クローニングした。GFP−RAB38を、製造業者の指示に従って4cm2表面積において1.6g/4μlのDNA/LipofectAMINE 2000比で用いたLipofectAMINE 2000(Invitrogen)を用いてmelan−a細胞にトランスフェクトした。72時間後、細胞を固定し、そして1:200希釈のTYRP1反応性抗体MEL5(Signet)を以前(Wuら,J Cell Sci 110:847−859[1997])に記載された通りに用いて染色した。
(実施例10:出血時間)
出血時間を、4つのC57Bl/6J Rab38cht/Rab38chtおよび4つのC57Bl/6J動物において、当該分野で記載された(Sviderskayaら,Genetics 148:381−390[1998])通りにアッセイした。アッセイしたマウスは、6〜12週齢であった。2mmの部分の尾を除去し、そして切断した尾を直ちに37℃の生理食塩水中に浸漬した。各マウスを、拘束機において水平位置に維持し、尾の先端を、身体の4〜5cm下に保持した。出血時間は、小さな血液流が急に停止するのに必要とされる時間であった。
出血時間を、4つのC57Bl/6J Rab38cht/Rab38chtおよび4つのC57Bl/6J動物において、当該分野で記載された(Sviderskayaら,Genetics 148:381−390[1998])通りにアッセイした。アッセイしたマウスは、6〜12週齢であった。2mmの部分の尾を除去し、そして切断した尾を直ちに37℃の生理食塩水中に浸漬した。各マウスを、拘束機において水平位置に維持し、尾の先端を、身体の4〜5cm下に保持した。出血時間は、小さな血液流が急に停止するのに必要とされる時間であった。
上記の明細書において言及した全ての刊行物および特許は、本明細書中に参考として援用される。本発明の記載される方法および系の種々の改変物およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、本願発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されないべきであることを理解すべきである。実際、当該分野および/または関連する分野の当業者に明らかである、記載される発明の実施形態の種々の改変は、本発明の範囲内にあることが意図される。製造業者の指示による通りのpDest 53(Invitrogen)。GFP RAB38を、製造業者の指示に従って4cm2表面積において1.6g/4μlのDNA/LipofectAMINE 2000比で用いたLipofectAMINE 2000(Invitrogen)を用いてmelan a細胞中にトランスフェクトした。72時間後、細胞を固定し、そしてTYRP1反応性抗体MELS(Signet)の1:200希釈物で以前に記載(Wuら,J Cell Sci 110:847−859[1997])された通りに染色した。
Claims (48)
- 配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12からなる群より選択される配列を含む、単離された核酸。
- 前記核酸が、デオキシリボ核酸である、請求項1に記載の単離された核酸。
- 請求項1に記載の核酸の相補体である、単離された核酸。
- 請求項1に記載の核酸を含む、ベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 配列番号9によって示される核酸配列によってコードされる、単離されたタンパク質。
- Rab38中の変異を検出するための方法であって、以下の工程:
a)ゲノムDNAから、Rab38の少なくとも一部を増幅して、Rab38増幅産物を得る工程;
b)該Rab38増幅産物を精製する工程;および
c)該Rab38増幅産物を配列決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される、請求項7に記載の方法。
- 前記Rab38の少なくとも一部が、少なくとも1つのRab38エキソン、少なくとも1つのRab38イントロン、Rab38 5’非翻訳配列およびRab38 3’非翻訳配列からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのRab38エキソンが、Rab38エキソン1、Rab38エキソン2およびRab38エキソン3からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAが、哺乳動物ゲノムDNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記精製する工程が、サイズ選択を使用して達成される、請求項7に記載の方法。
- Rab38中の変異を検出するための方法であって、以下の工程:
a)ゲノムDNAから、Rab38の少なくとも一部を増幅して、Rab38増幅産物を得る工程;
b)該Rab38増幅産物を消化して、消化Rab38増幅産物を得る工程;および
c)該消化Rab38増幅産物を電気泳動する工程、
を包含する、方法。 - 前記増幅する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して達成される、請求項13に記載の方法。
- 前記Rab38の少なくとも一部が、少なくとも1つのRab38エキソン、少なくとも1つのRab38イントロン、Rab38 5’非翻訳配列およびRab38 3’非翻訳配列からなる群より選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのRab38エキソンが、Rab38エキソン1、Rab38エキソン2およびRab38エキソン3からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAが、哺乳動物ゲノムDNAである、請求項13に記載の方法。
- RAB38活性を調節する生物学的に活性な因子についてスクリーニングするための方法であって、以下の工程:
a)以下:
(i)RAB38活性を有するメラノサイト、および
(ii)候補因子、
を提供する工程;ならびに
b)該メラノサイトを該候補因子に曝露して、処理されたメラノサイトを得る工程;ならびに
c)該候補因子によって処理されたメラノサイトのRAB38活性の調節を測定する工程、
を包含する、方法。 - 前記RAB38活性が、GTPase活性を含む、請求項18に記載の方法、
- 前記RAB38活性が、GTP結合活性を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記RAB38活性が、GDP放出を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記RAB38活性が、メラノソームへのTYRP1輸送を含む、請求項18に記載の方法。
- 前記RAB38活性が、メラノソームへのRAB38輸送を含む、請求項18に記載の方法。
- RAB38活性を調節する生物学的に活性な因子についてスクリーニングするためのキットであって、以下:
a)RAB38活性を有する複数のメラノサイトであって、ここで、該メラノサイトは、容器内に提供される、複数のメラノサイト、および
b)該メラノサイト中のRAB38活性の決定のための指示書、
を備える、キット。 - RAB38活性を分析するための手段をさらに備える、請求項24に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、GTPase活性を評価するためのアッセイを含む、請求項25に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、GTP結合活性を評価するためのアッセイを含む、請求項25に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、GDP放出を評価するためのアッセイを含む、請求項25に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、メラノソームへのTYRP1輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項25に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、メラノソームへのRAB38輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項25に記載のキット。
- RAB38中の変異を検出するためのキットであって、
RAB38の少なくとも一部の増幅のために適切な少なくとも2つのプライマー配列、および
該キットを利用するための指示書、
を備える、キット。 - 前記プライマー配列が、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21および配列番号22からなる群より選択される、請求項31に記載のキット。
- 前記キットが、ポリメラーゼ連鎖反応における使用に適切である、請求項31に記載のキット。
- 核酸を消化するための試薬をさらに備える、請求項31に記載のキット。
- メラノソーム機能における欠損を診断するためのキットであって、
RAB38を含むメラノサイト、および
メラノソーム機能における欠損を評価するための指示書、
を備える、キット。 - RAB38活性を分析するための手段をさらに備える、請求項35に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、GTPase活性を評価するためのアッセイを含む、請求項36に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、GTP結合活性を評価するためのアッセイを含む、請求項36に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、GDP放出を評価するためのアッセイを含む、請求項36に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、メラノソームへのTYRP1輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項36に記載のキット。
- 前記RAB38活性を分析するための手段が、メラノソームへのRAB38輸送を評価するためのアッセイを含む、請求項36に記載のキット。
- メラノサイトの色素沈着を調節するための組成物であって、RAB38活性のモジュレータを含む、組成物。
- 前記RAB38活性のモジュレータが、RAB38活性のエンハンサーである、請求項42に記載の組成物。
- 前記RAB38活性のモジュレータが、RAB38活性のインヒビターである、請求項42に記載の組成物。
- 前記RAB38活性のインヒビターが、siRNAおよびイントラボディからなる群より選択される、請求項44に記載の組成物。
- メラノソームの色素沈着および皮膚の色の変化を調節する方法であって、皮膚表面をRAB38活性のモジュレータと接触させ、それによって、該RAB38活性を調節する工程、を包含する、方法。
- 前記モジュレータが、RAB38活性をダウンレギュレートし、そして皮膚の色を明るくする、RAB38活性のインヒビターである、請求項46に記載の方法。
- 前記モジュレータが、RAB38活性をアップレギュレートし、そして皮膚の色を暗くする、RAB38活性のエンハンサーである、請求項46に記載の方法。
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