JP2005520140A - 等電点電気泳動の帯の鋳込みのためのアセンブリ及び使用 - Google Patents

Abstract

等電点電気泳動ゲルが長手方向に２つの半型に割ることができる棒状の鋳型内に鋳込まれ、各半型は、組み合わされた時に円形断面形状のチューブ状の完全型を形成するように、半円の外形形状（２２）を有する。平坦な溝（１５，１６）が各半鋳型の平坦な接触表面に切り込まれており、各溝は互いに直接対向して鋳型の全長に伸びる長方形の断面に室を形成し、両端が開放されている。一方の溝は、ゲルのための柔軟性のある裏打ち帯（１７）を受け、他方はゲルのための鋳込み室として働く。一旦ゲルがこの鋳型の中に鋳込まれると、ゲルがチューブゲルであるとして等電点電気泳動が実行でき、２つの半鋳型は容易に分離してゲルを取り外すのを可能にし、もし第２次元分離が必要であればゲルを移すことができる。

Description

本発明は、電気泳動分離分野に関し、特に等電点電気泳動で使用する細長いゲル帯に関する。

たんぱく質の精製及び複雑なたんぱく質混合物の分離のための電気泳動がこれまでに開発されており、現在多くの異なる方法で行われている。変形例は、分離媒体の組成、分離媒体の幾何的な形状、媒体を通しての移動度が達成される方法、及び分離が基礎とするパラメータで生じる。

特に有用な電気泳動の１つのタイプは等電点電気泳動であり、そこでは、たんぱく質がその等電点に従ってリニア（線形）な方法で分離される。等電点電気泳動は、ある時には全分離プロセスとし使用され、他の時には２次元分離の第１次元分離として使用され、第２次元分離は、２次元（「スラブ」型）分離媒体の１つのエッジに沿って等電的に集束されるゾーンを有するリニア媒体を配置することにより達成される。次に、電界が２次元媒体上にリニアな媒体を横切る方向に印加され、各集束ゾーンの中身のその媒体の外及び２次元媒体内への平行経路に沿った移動を生じ、各ゾーンの中身は等電点以外のパラメータに従って分離される。元のサンプル内のたんぱく質は、２つのパラメータに従って分離される利点を有する。

ｐＨ勾配は、帯電されるか又は媒体が電界内に配置された時に帯電される機能グループが付加される分子マトリクスで構成される次元的に安定な媒体を使用することにより共通に実現される。そのようなグループを含む固体媒体の帯は、「固定化ｐＨ勾配」（「ＩＰＧ」）帯と共通に称される。これらの帯の組成及び構造は、Rosengrenらにより１９７８年１２月１９日付けで発行された米国特許第4,130,470号において説明されている。帯のマトリクスを形成する固体材料は、粒状の、繊維状の又は膜状の材料、又はゲルのいずれかである。適当なゲルの例は、ポリアクリルアミド、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリビニールアルコール、デンプン、及びシリカゲルである。共有結合又は他の手段によりマトリクス上に固定される機能グループは、アミノ又は他の窒素ベアリングのような正に帯電するグループ、又はカルボン酸グループ、スルホン酸グループ、ホウ酸グループ、リン又はリン酸グループ，又はこれらの酸のエステルである。高分子媒体の典型的な製造方法は、帯電した又は帯電可能なモノマーを非帯電モノマーで重合するか、帯電した架橋剤を含むことである。帯電した又は帯電可能なグループの濃度における単調な増加又は減少は所望の勾配を生成する。

リニアな等電点電気泳動媒体は、チューブゲル又は平面ゲルの帯のいずれかであり、両方とも欠点がある。チューブゲルは、第１次元の分離の後そのチューブ状の封入器から取り外され、第２次元の分離のためのスラブ状ゲルに直接接触するように配置できる。しかし、チューブゲルは、封入器から取り外すのが難しく、一旦取り外すと剛性の不足のため取り扱いが難しく、ユーザの指でのゲルとの接触を最小にする必要がある。これに対して、帯状のゲルは、封入器の中を走らず、ユーザがゲルに接触せずに扱うことができるプラスチックの裏当て板上に鋳込まれているので、比較的取り扱いが容易である。しかし、帯状のゲルは、一般に乾燥された形で供給され、使用の前に再水和させなければならない。これは一般にサンプル自体を（希釈した形で）利用して行われ、単に帯をサンプルで濡らし、両方が平衡になるまで保持することにより行われる。この処理の制限の中には、この方法でゲルにより吸収できるサンプルの量は、拡散プロセスにより制限されるということがある。更に、帯が大気に対して水分を失って乾燥しないことを保証するような配慮がなされなければならない。このことが起きるのを防止するため、帯は鉱油のような電気的に絶縁で水が混合しない液体で覆われ、等電点電気泳動の間覆われ続ける。この間、帯の２つの端の電極との接触が維持されなければならない。更に、等電点電気泳動が一旦終了すると、第２次元の分離が開始される前に、鉱油は完全に除かれなければならない。これは、残留した油は、帯とスラブ状ゲルの間の電気的な連続性に妨げるからである。油の除去は、難しく厄介な処理である。最後に帯状のゲルに等電点電気泳動を行うのに使用される装置は、比較的複雑で、ゲルの形態、ゲルが装置に配置される方法、及び電気的な接触を行う方法のために高価である。

本発明は、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを鋳込んで使用することができるアセンブリであり、このアセンブリはチューブゲル及び平坦なＩＥＦ帯の両方の利点を提供するが、欠点はない。アセンブリは、縦方向に２つの半型又は半鋳型に割ることができる棒状の鋳型で構成され、各鋳型は半円上の外形を有し、半型がその平坦な接触表面に沿って組み合わされる時に、完全型は円形の断面を有するチューブ状の形状になる。溝又はへこみが２つの接触表面のそれぞれに刻まれ、互いに直接対向する溝は型の全長に伸びる長方形の断面の室を形成し、両端が開放されている。一方の溝はゲルの帯の柔軟性のある裏打ちを受け、他方の内部は２つの半鋳型が組み合わされた時にゲルのための鋳込み室として働く。一旦この室の中で裏打ち帯と一緒になったゲルは裏打ち帯に接着し、裏打ち帯は鋳型からゲルを取り外すために掴むことができる。

アセンブリの組み合わされた半鋳型の外部の円形断面は、アセンブリを、チューブゲル用に設計された電気泳動装置、すなわち、チューブ状の容器内でチューブゲルを受け、電気泳動を起こすのに必要なチューブゲルへの電気的な接触を提供するように設計された実験室装置で、使用するのを可能にする。チューブゲルは、チューブゲルと一緒に使用される改良された方法により、ゲルがサンプルと一緒にロードされるのを可能にし、それによりより多くのサンプル量がロードされ、より短時間でサンプルのローディングを達成するのを可能にする。割り型構造は、等電点電気泳動が完了した後ユーザがアセンブリを開いて、ゲルに接触すること無しにゲルを容易に取り外して置き直すのを可能にする。

好適な実施例では、円形断面はアセンブリの全長ほどは伸びておらず、替わりにアセンブリの端から始まる部分だけを占めており、残りの長さ部分は長方形の断面であり、ネジ、クランプ又は他の容易に取り外し可能な方法で２つの半鋳型を一体に固定する他の手段の使用を容易にする。

本発明の更なる特徴、実施例、利点及び実現は、以下の説明から明らかになる。

この発明は部品の配置形状及びその大きさのような構造的な詳細について変形例が可能であるが、本発明は１つの特定の実施例の詳細な説明によりもっともよく理解できると考えられる。付属の図面は、このような実施例を示す。

図１ａ及び１ｂの斜視図は、それぞれ上半分の鋳型１１と下半分の鋳型１２とを示し、その接触表面１３、１４が上を向くように示されている。接触表面は、各表面の中心線に沿って長く伸びる浅い溝１５、１６以外は、両方とも平面である。溝及び各半鋳型の外形は、図２ａ及び２ｂの端部の図でより分かり易く示され、そこには、両方の溝が平坦又は水平な面及び全体が長方形の断面を有し、溝は同じ深さではなく、上半分の鋳型１１の溝１５は、下半分の鋳型１２の溝より浅い。浅い溝１５は、ゲルを支持する固体材料の柔軟性のある帯を受け、深い溝１６はゲル鋳込み室として作用する。２つの溝は、同じ深さ又は異なる幅でもよい。後者の場合、帯支持の溝１５は、ゲルのための溝１６よりわずかに広い。

図３は、完成した型を形成するように結合された２つの半鋳型、及びサンプルを入れて等電点電気泳動を行えるようになっているゲル封入器を示す。この構成を実現するため、（図３に示される）柔軟性のある帯１７が上半分の鋳型１１の浅い溝内にまず配置され、次に上半分の型は裏返しにされて２つの平坦な表面が接触するように配置される。２つの合わされた溝により形成された室の残りは、ゲル形成溶液で満たされ、ゲルが鋳込まれる。

斜視図（図１ａ及び図１ｂ）及び端部の図（図２ａ及び図２ｂ）に示されるように、半鋳型の前側の端部は、それぞれ半円形状２１、２２を有する。これにより、型が図３に示すように完全に組み立てられると、外側形状は円形の断面チューブになる。この円形断面は、ユーザが、米国カリフォルニア州ヘラクルスのBio-Rad社により製造される各種のPROTEAN電気泳動セルのような、チューブゲルのために設計された電気泳動装置において、アセンブリの内部に、ゲルを挿入するのを可能にする。半鋳型の残りの部分は、長方形の外形２３、２４を有し、したがって組み立てられた鋳型のこの部分は、断面が長方形である。図示した特定の例は、正方形の断面を有する。断面における変形の目的は、２つの半鋳型を一体に固定するのを容易にするためであり、長方形の半型はネジ、ボルトまたはクランプにより一体に固定するのが容易である。図示の例は、６個のネジ穴２６を有する。容易に取り外せるか又は開けられる形で、２つの半鋳型を一体に固定する別の方法は、当業者には明らかであろう。例としては、クランプ、スナップ取り付け、フリクション取り付け、及び非永久接着剤である。更に、図示の２つの半鋳型は十分に分離可能であるが、それらをヒンジ、ピボット結合、又は柔軟性のある材料の帯により合わせることも可能である。

組み立てられた鋳型内へのゲルの鋳込み及びサンプルを有するゲルの入れ込み（ローディング）は、従来の方法に従って行われる。電気泳動サンプルのローディング、すなわち、ゲルの一方の端にサンプルを配置し、ゲル内にサンプルを駆動するようにゲルの長さに沿って電流を印加することによるサンプルのローディングは、特に従来通りであり、有用である。一旦サンプルが入れ込まれる（ロードされる）と、等電点電気泳動は従来技術により進めることができる。

電気泳動分離が起きた後、半鋳型は分離され、ゲルが取り出され、直接分析されるか、又は２次元分離の第２次元としての更なる分離のためにスラブゲルのエッジに沿って配置される。鋳型からのゲルの取り外しは、図４ａ及び図４ｂに示される。図４ａの側面図は、垂直な位置にある、組み立てられた半鋳型を示す。ゲル３１は、この図ではアセンブリの左側にある下側の半鋳型１２内の破線で示され、柔軟性のある支持帯１７は右側にある上側の半鋳型１１内の破線で示される。支持帯の一方の端は、鋳型の端から突き出ている。

分離が終了した時には、半鋳型は、図４ｂに示すように分離され、内部にゲル３１を有する下側の半鋳型１２が取り去られ、支持帯１７にゲルが付着している。ユーザは、支持帯の自由端を掴んで溝からゲルを引き出す。

この発明で実際に使用される材料は、本発明自体には重要でなく、変えることが可能である。上記の組成のどのようなゲルも使用できるが、ポリアクリルアミド及びアガロースゲルがもっとも一般的である。ポリアクリルアミドのゲルは、特にその広く使用されている点から好適である。柔軟性のある支持帯１７は、ゲルの分離特性を妨害せずにゲルを支持及び付着できれば、どのような材料でもよい。好ましい支持帯は、ゲルの重合プロセスの間、アガロース又はアクリルアミドのようなゲル材料を結合するものである。このタイプの支持材料の説明は、Nochumson Sなどに与えられた１９８３年１１月１６日に発行された米国特許第4,415,428号の「電気泳動のための支持及びその製造方法」に記載されており、その内容は、ここですべて参照されるものとする。この記載に合致する材料は、米国メーン州RocklandのFMC Bioproducts社から、（アガロースゲル用）GelBond及び（ポリアクリルアミド用）GelBond PAG（商標名）の製品名で、商業的に利用できるようになっている。鋳型自体は、不活性で、好ましくは容易に型になるどのような硬い材料で形成することも可能である。例としては、ポリカーボネート及びアクリルのようなプラスチックである。

鋳型の大きさは、同様に本発明にとって重要でなく、変形が可能である。大部分の場合、溝は、約０．０１ｃｍから約０．１０ｃｍの範囲内の深さを有し、約０．１ｃｍから約１．０ｃｍの範囲内の幅を有する。そして、鋳型のアセンブリの円形断面部は、約２．０ｃｍから約５．０ｃｍの長さと、約０．５ｃｍから約２．５ｃｍの直径（それは正方形の断面部分の一方の側の長さでもある。）を有する。鋳型の全長は、約１０ｃｍから約３０ｃｍの範囲である。現在企画されている例では、全長が１８ｃｍで、円形部分の長さが３．８ｃｍで、円形部分の直径及び正方形部分の一方の側の長さが０．９ｃｍで、浅い溝は０．０２ｃｍの深さ及び０．３３ｃｍの幅を有し、深い溝は０．０５ｃｍの深さ及び０．３０ｃｍの幅を有するが、すべて大まかである。

以上は説明の目的で行われた。前述のこの発明の基礎である概念を実現する更なる変化及び変形例が、当業者には容易に明らかであろう。

図１ａは、本発明のアセンブリの１つの例の２つの半鋳型の斜視図である。 図１ｂは、本発明のアセンブリの１つの例の２つの半鋳型の斜視図である。 図２ａは、図１ａと図１ｂに示された２つの半鋳型の端部の図である。 図２ｂは、図１ａと図１ｂに示された２つの半鋳型の端部の図である。 図３は、完全なアセンブリを形成するように結合された図１ａと図１ｂの２つの半鋳型の端部の図である。 図４ａは、前の図に示した感性したアセンブリの側面図である。 図４ｂは、電気泳動が起きた後取り外されるゲルがある、２つの型のうちの半分の側面図である。

Claims (8)

1. 等電点電気泳動ゲルの容器であって、
   第１及び第２の細長い半鋳型を備え、各半鋳型は半円の外形形状と平坦な接触表面とを有し、前記半鋳型は前記平坦な接触表面に沿って接触された時に円形断面のチューブ状の鋳型容器を形成し、
   各半鋳型は、前記平坦な接触表面内にへこみを有すると共に長さ方向に伸びており、
   当該容器は、
   前記各半鋳型の１つの中の前記へこみを満たすような大きさの不活性固体支持材料の柔軟性のある帯と、
   前記半鋳型を一緒に取り外し可能に取り付ける手段とを備える等電点電気泳動ゲルの容器。
2. 前記へこみは、長方形の断面である請求項１に記載の容器。
3. 前記へこみは、長方形の断面で、異なる深さである請求項２に記載の容器。
4. 前記へこみは、約０．０１ｃｍから約０．１０ｃｍの深さである請求項２に記載の容器。
5. 前記柔軟性のある帯は、該帯の一方の側に接着され、アクリルアミド又はアガロースのゲルに結合する樹脂を有する請求項１に記載の容器。
6. 前記柔軟性のある帯に接着される前記樹脂は、ポリアクリルアミドのゲルを形成するように前記容器内でアクリルアミドモノマーと該アクリルアミドモノマーの重合中に結合するエチレン的に不飽和であるグループを持つ請求項５に記載の容器。
7. 前記円形断面は、前記チューブ状の鋳型容器の端部の長さ方向に伸び、各半鋳型は長方形の形状を有する部分を更に備え、それにより前記チューブ状の鋳型容器の前記端部に隣接して長方形の断面を形成し、前記半鋳型を取り外し可能に一体に取り付ける取り付け手段は前記長方形の断面部分に存在する請求項１に記載の容器。
8. 前記端部は、長さが約２．０ｃｍから約５．０ｃｍであり、前記長方形の断面部分は、長さが約５．０ｃｍから約２０ｃｍである請求項７に記載の容器。

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