JP2005519986A - 造血障害を治療するためのｉｌ−１９、ｉｌ−２２およびｉｌ−２４の使用 - Google Patents

造血障害を治療するためのｉｌ−１９、ｉｌ−２２およびｉｌ−２４の使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、哺乳動物遺伝子配列およびそれによりコードされるポリペプチドを用いて哺乳動物造血性障害を処置する方法に関する。

Description

本発明は、人の医療分野に適用される組換えＤＮＡ技術に関する。具体的には、本発明は、造血障害の治療方法または予防方法に関し、これらの方法は、このような処置を必要とする患者へのIL-19、IL-22またはIL-24の投与を含む。
造血は一生における必須のプロセスであり、これにより、非常に特化した血液細胞（二酸化炭素および酸素輸送を担う細胞（赤血球）、血液凝固を担う細胞（血小板）、体液性免疫を担う細胞（Ｂリンパ球）、細胞性免疫を担う細胞（Ｔリンパ球）ならびに外来生物およびそれらの生成物に反応する細胞（顆粒球、単球およびマクロファージ）を含む）が生産される。これらの細胞は全て、骨髄性およびリンパ性と称される機能的に異なる２つのグループに分けることができる。正常な成人の一生の間には、骨髄系細胞は骨髄内に限られて生産されるが、他方、リンパ系統の細胞は骨髄、脾臓、胸腺およびリンパ節で種々の程度で生産される。成熟した機能的終細胞およびその直前の前駆体は、限られた寿命および限られた増殖能力を有しており、それゆえ自己維持的ではない。従って、これらの細胞はより原始的な増殖性細胞のプールから連続的に複製される。つまるところ、骨髄系統およびリンパ系統の両方の細胞全てが全能性幹細胞に由来する。
造血は、必然的に厳密に制御されている。造血サイトカインの作用により、造血幹細胞の増殖および分化が生じ、最終的に造血細胞（赤血球、血小板、顆粒球および単球）となる。幹細胞からの単独の細胞タイプの発生は、適切な順序で作用する複数のサイトカインの共同作用的な作用を必要とするかもしれない。
インターロイキン-20 (IL-20)は、最近、IL-10関連サイトカインであることが記載された(国際特許出願公開公報WO 99/27103およびWO 00/12708)。IL-20をコードする配列は、ヒト染色体lq32に位置する。これは、IL-10、IL-19およびIL-24をコードする遺伝子が位置する領域と同じ領域であり、これらもまたIL-10-関連サイトカインである。IL-20は、造血活性を有すると記載されている (米国特許出願番号60/272,242、2001年２月28日出願、本明細書中に参照して組み込む)。IL-22は、JAK-STATシグナル伝達経路を活性化し、IL-14産生を適度に阻害する。また、刺激型Ｔ細胞(stimulated T-cell)ではIL-22 mRNAレベルが上昇している。IL-24およびIL-19の生物学的活性は、あまり知られていない。米国特許番号5,985, 614は、ヒトIL-19をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列を教示する。本明細書中下記の参考文献３は、IL-22をコードするヌクレオチドおよびアミノ酸配列を教示する。
サイトカインレセプターは、１種以上の一体型膜タンパク質から構成され、これは高親和性でサイトカインと結合してレセプターサブユニットの細胞質部分を介して細胞へと結合事象を伝達する。クラスIIサイトカインレセプター(例えば、IL-19、IL-20、IL-22およびIL-24に結合するもの）は、通常、２個の異なるレセプター鎖(α鎖およびβ鎖)から構成されるヘテロ二量体である。クラスIIサイトカインレセプターサブユニットは、１つのタイプのサイトカインの結合に必ずしも限定されない。例えば、IL-10レセプター複合体はIL-lORαおよびIL-lORβから構成されるが、他方、IL-22は、そのレセプター複合体においてIL-lORβをIL-22Rと組み合わせて使用する。IL-20、IL-24およびIL-19は全て、IL-20RαおよびIL-20Rβ(１)からなるレセプター複合体に結合することが示されている。また、IL-24およびIL-20は両方ともIL-22RおよびIL-20Rβからなるレセプター複合体にも結合する（１）。
造血サイトカインは、血液細胞の分解および再構築の間の不均衡、または特定の血液細胞の不適切な数での産生から生じる種々の疾患を治療するために哺乳動物においてうまく使用されてきた。例えば、組換えエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、慢性腎不全患者、ジドブジン処置ＨＩＶ感染患者、化学療法中の癌患者、および近年では自己輸血を受けている患者における貧血の治療のために投与される糖タンパク質である。組換えトロンボポエチン（ＴＰＯ）は、現在、血小板減少症、血小板新生(thrombopoiesis)および貧血の治療に関して評価を受けている。
EPOおよびTPOの利用可能性にもかかわらず、個人の造血状態を改変する別の方法を提供する必要性が特に存在する。１種以上のタイプの造血細胞の産生を刺激しうるタンパク質に対する必要性が特に存在する。従って、本発明は、患者における望ましくない造血状態を改善または予防し得る新規な治療方法を提供する。
本発明は、赤血球生成（赤血球細胞の産生）、白血球生成（白血球細胞の産生）および／または血小板生成（thrombocytopoiesis）（血小板の産生）を含む、造血を調節する方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載のIL-19アゴニスト、IL-22アゴニスト、IL-24アゴニスト、IL-19アンタゴニスト、IL-22アンタゴニスト、IL-24アンタゴニスト、IL-19ポリペプチド、IL-22ポリペプチド、IL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つを含む（またはそれからなる）医薬組成物を治療上有効な量で、そのような処置を必要とする細胞、組織、器官、哺乳動物または患者（好ましくは、ヒト）に投与して造血活性を調節することを含む。
本発明の１つの実施態様は、少なくとも１つの精製および単離したIL-19、IL-22またはIL-24のアゴニスト、ポリペプチドまたはその変異体を治療上有効な量で、造血細胞の増加方法を必要とする哺乳動物または患者（好ましくは、ヒト）を治療するために用いる方法である。
本発明の別の態様は、少なくとも１つの精製および単離したIL-19、IL-22またはIL-24のアンタゴニストを治療上有効な量で、造血細胞の減少方法を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者を治療するために用いる方法である。
発明の詳細な説明
以下に記載の特定の態様は、それらを変更してもなおかつ特許請求の範囲内に含まれ得るので、本発明は以下の特定の実施態様に限定されない。本明細書中で用いる技術用語は、特定の実施態様を記載するためのものであり、限定を意図するものではない。それよりも、本発明の範囲は特許請求の範囲により確立される。
定義
用語「アミノ酸」は、本明細書中において最も広い意味で用いられており、天然のアミノ酸、および非天然のアミノ酸（アミノ酸変異体および誘導体を含む）を含む。後者は、アミノ酸部分を含有する分子を含む。本明細書中のアミノ酸の言及は、天然のタンパク質性（proteogenic）Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、化学的に修飾したアミノ酸（例えば、アミノ酸変異体および誘導体）、天然の非タンパク質性アミノ酸（例えば、ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等）、および当該分野においてアミノ酸に特徴的であることが公知の特性を有する化学的に合成した化合物を含むことが認識される。
IL-19アゴニスト、IL-22アゴニスト、IL-24アゴニスト、IL-19アンタゴニスト、IL-22アンタゴニスト、IL-24アンタゴニスト、IL-19ポリペプチド、IL-22ポリペプチド、IL-24ポリペプチドまたはIL-19アゴニスト、IL-22アゴニスト、IL-24アゴニスト、IL-19アンタゴニスト、IL-22アンタゴニスト、IL-24アンタゴニスト、IL-19ポリペプチド、IL-22ポリペプチド、IL-24ポリペプチドの変異体(総称して「本発明のポリペプチド」と称する) への非天然のアミノ酸（これは合成性のネイティブではないアミノ酸、置換アミノ酸または１つ以上のＤアミノ酸を含む)への組み込みは、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較してインビトロまたはインビボで増加した安定性を示すという点で有利である。Ｄ−ペプチドは内生的ペプチダーゼおよびプロテアーゼに耐性であり、それにより分子のバイオアベイラビリティの改善およびインビボにおける寿命が長期化されている。本発明のペプチドが短期間のみ活性であることが望ましい場合、分子内にＬ−アミノ酸を使用することにより、内生的ペプチダーゼ、プロテアーゼ等が分子を消化できるようにし、それにより細胞の分子への暴露を制限する。さらに、D-アミノ酸を含有するポリペプチドは、ヘルパーＴ細胞への主要組織適合複合体クラスＩＩ拘束性の提示のために効率的に処理されないので、生物全体における体液性免疫反応の誘導がおそらく弱くなる。
Ｄ−アミノ酸の使用に加えて、当業者であれば、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドのアミノ酸配列における修飾により、それぞれ、配列番号２、４および６に示される本来のポリペプチド配列を有するタンパク質と比較して、等しいかまたはそれよりも優れた機能特性を示す機能的ポリペプチドが生じ得ることを認識する。従って、このような修飾により生じる配列が、非修飾型ポリペプチドと実質的に同じ（または、望ましくありうる場合には、改善された、もしくは減少した）活性を有するならば、本発明の方法はIL-19、IL-22またはIL-24のポリペプチドまたはその変異体における変更を意図し、これには、天然の変異または人為的操作のいずれかによる１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、置換、短縮、融合、サブユニット配列のシャッフリングなどを含み得る。最も好ましくは、本発明の方法で用いるための修飾型ポリペプチドは、配列番号２、４または６（好ましくは、シグナル配列を有さない成熟形態のポリペプチド）に対して少なくとも約95％相同である配列を有する。さらにより好ましくは、本発明の方法で使用するための修飾型ポリペプチドは、配列番号２、４または６（好ましくは、シグナル配列を有さない成熟形態のポリペプチド）に対して少なくとも96％、97％、98％または99％相同である配列を有する。
用語「アンタゴニスト」は、最も広い意味で用いられており、目的のポリペプチドの生物学的活性を部分的または完全に、遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を含む。同様の様式で、用語「アゴニスト」は、最も広い意味で用いられており、目的のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現、安定性および／または生物学的活性を誘導または増加させる任意の分子を含む。
IL-19、IL-22またはIL-24のポリペプチドまたはそれらの変異体に関する用語「機能的」は、特定の分子がインビボまたはインビトロで本明細書中に開示されるIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド(それぞれ、配列番号２、４、６に示される配列を有する)に起因する生物学的活性に類似するまたは同一であるまたは優れている生物学的活性（例えば、造血前駆細胞の増殖および／または分化を誘発する能力）を示す意味であることを意図する。
用語「ヘマトクリット」は、血液中の血漿および血球の相対量を測定する際に使用される装置により測定される、赤血球細胞の体積の白血球細胞の体積に対する比の値を意味する。ヘマトクリットの達成目標はある個体と別の個体とでは異なり、その結果として任意の所定の患者に対する実際の目的ヘマトクリットを決定する際には医師の判断が適切であり得ることが理解される。それでもなお、目的ヘマトクリットの決定は、当業者に周知である。
用語「IL-19組成物」は、本明細書中に定義しており、本発明の方法に有用である、IL-19アゴニスト、IL-19アンタゴニスト、IL-19ポリペプチド、IL-19変異体の少なくとも１つからなる、あるいは構成される組成物を意味する。同様に、用語「IL-22組成物」は、本発明の方法に有用である、IL-22アゴニスト、IL-22アンタゴニスト、IL-22ポリペプチド、IL-22変異体の少なくとも１つからなる、あるいはこれらから構成される組成物を意味する。同様に、用語「IL-24組成物」は、本発明の方法でも使用のための、IL-24アゴニスト、IL-24アンタゴニスト、IL-24ポリペプチド、IL-24変異体の少なくとも１つからなる、あるいは構成される組成物を意味する。好ましくは、本発明の組成物中のIL-19、IL-22およびIL-24ポリペプチドは、シグナル配列を有さない成熟形態のタンパク質、またはその変異体である。
本明細書中で用いる用語「IL-19変異体」は、本明細書中で意図される種々のタイプの修飾のうちの少なくとも１つをさらに有するIL-19ポリペプチド（この配列は配列番号２に示す）を意味する。さらに、ポリペプチドで用いる場合、IL-19変異体は、配列番号２に示される縮重型アミノ酸配列(シグナルペプチド有り、または無し)を有するIL-19ポリペプチドと少なくとも約95％アミノ酸配列の同一性を有する、本明細書中に記載の「機能的な」IL-19ポリペプチドを意味することを意図する。このようなIL-19ポリペプチド変異体としては、例えば、配列番号２のＮ末端またはＣ末端または配列内で、１つ以上のアミノ酸残基が付加、置換または欠失しているIL-19ポリペプチドが挙げられる。
本明細書中で用いる用語「IL-22変異体」は、本明細書中で意図される種々のタイプの修飾のうちの少なくとも１つをさらに含有するIL-22ポリペプチド（この配列を配列番号４に示す）を意味する。さらに、ポリペプチドで用いる場合、IL-22変異体は、配列番号４に示される縮重型アミノ酸配列(シグナルペプチド有り、または無し)を有するIL-22ポリペプチドと少なくとも約95％アミノ酸配列の同一性を有する、本明細書中に記載の「機能的な」IL-22ポリペプチドを意味することを意図する。このようなIL-22ポリペプチド変異体としては、例えば、配列番号４のＮ末端またはＣ末端または配列内で、１つ以上のアミノ酸残基が付加、置換または欠失しているIL-22ポリペプチドが挙げられる。
本明細書中で用いる用語「IL-24変異体」は、本明細書中で意図される種々のタイプの修飾のうちの少なくとも１つをさらに含有するIL-24ポリペプチド（この配列は配列番号６に示す）を意味する。さらに、ポリペプチドで用いる場合、IL-24変異体は、配列番号６に示される縮重型アミノ酸配列(シグナルペプチド有り、または無し)を有するIL-24ポリペプチドと少なくとも約95％アミノ酸配列の同一性を有する、本明細書中に記載の「機能的な」IL-24ポリペプチドを意味することを意図する。このようなIL-24ポリペプチド変異体としては、例えば、配列番号６のＮ末端またはＣ末端または配列内で、１つ以上のアミノ酸残基が付加、置換または欠失しているIL-24ポリペプチドが挙げられる。
より好ましくは、本発明の組成物および方法において用いるための変異体ポリペプチドは、配列番号２、４または６に示す配列(図２、４および６)と少なくとも約96％のアミノ酸配列同一性を有し、さらにより好ましくは、少なくとも97％、98％または99％の同一性を有する（これはシグナル配列を有するか、または有さないが、好ましくは有さない）。
用語「阻害（する）」は、疾患または状態の進行または重篤度の阻害、予防、防止、遅延、静止または逆転の、通常受け入れられている意味を有する。
本明細書中で用いる用語「成熟タンパク質」または「成熟ポリペプチド」は、哺乳動物細胞中での発現により産生される形態のタンパク質を意味する。通常、一旦、粗面小胞体での成長タンパク質鎖の搬出（ｅｘｐｏｒｔ）が開始されると、哺乳動物細胞により分泌されるタンパク質は、「成熟」形態のタンパク質を産生するために完全なポリペプチドから切断されるシグナルペプチド（ＳＰ）配列を有すると仮定される。しばしば、分泌タンパク質の切断は均一ではなく、１種類より多くの成熟タンパク質を生じるかも知れない。分泌タンパク質の切断部位は、完全なタンパク質の１次アミノ酸配列により決定され、通常、完全に正確には推測することはできない。タンパク質がＳＰ配列を有するかどうか、ならびに配列に対する切断点を推測する方法は入手可能である。切断点は、アミノ酸１０とアミノ酸３５の間のIL-19、IL-22またはIL-24のＮ−末端ドメイン内に存在し得る。IL-19、IL-22またはIL-24シグナルペプチドの推定切断部位は図２、４および６に示す。実際の切断点は、推定切断部位のいずれかの末端で約６アミノ酸までで変動するかもしれない。当業者であれば理解するように、しばしば、切断点は生物間で変化し、完全に確実には推測することはできない。場合により、分泌タンパク質の切断点は、タンパク質の精製製品で見出される１種以上の成熟タンパク質のアミノ末端配列決定により経験則により決定される。
本明細書中で用いる用語「組換えDNA発現ベクター」または「発現ベクター」は、任意の組換えDNAクローニングベクター、例えば、プロモーターおよび他の調節エレメントが存在し、それにより作動可能に連結されている、タンパク質をコードしているかもしれないDNAの転写が可能となっているプラスミドまたはファージを意味する。
核酸またはタンパク質に関して用いる場合、用語「単離」は、天然の供給源において同定され、そして通常は随伴する夾雑物の少なくとも１つから分離されている物質を意味する。このような核酸はベクターの一部かもしれず、および/またはこのような核酸またはタンパク質は組成物の一部かもしれないが、このようなベクターまたは組成物は天然の環境物の一部ではないという点でやはり単離されている。
本明細書中で用いる場合、用語「精製（する）」は、目的の成分（例えば、タンパク質または核酸）からサンプル夾雑物を取り除くプロセスの結果を意味する。これにより、精製した成分のサンプル中の割合は増加する。
用語「造血性細胞の増加」は、疾患、障害または治療行為(treatment intervention)から生じる消耗のような消耗の後に造血性細胞の回復または回復の上昇を意味する。
本明細書中で用いる用語「処置」または「治療」は、疾患、状態または障害と戦うまたは予防するための患者の管理または看護を意味し、これには、さらに本明細書中に定義される症状または合併症の発症を予防するため、症状または合併症を緩和するため、または疾患、状態または障害を排除するためにIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、単離および精製したIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体、またはIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、単離および精製したIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体を含有する（またはこれらからなる、または基本的に構成されている）組成物の少なくとも１つの、このような処置を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者への投与が含まれる。「予防的処置」の例は、標的の生理学的症状または障害の予防、または減少である。処置を必要とする対象には、障害または疾患を既に有しているもの、および障害または疾患を有しやすい、または障害または疾患が予防されるべきであるものが挙げられる。
本発明のポリペプチド変異体に関して「活性な」または「活性」とは、本発明のポリペプチドの生物学的機能および／または本発明の非修飾型ポリペプチドと同様のレセプターまたはリガンドへの結合能が保持されていることを意味する。さらに具体的には、「生物学的活性」は、参照ポリペプチドにより引き起こされる生物学的機能（阻害または刺激のいずれか）を意味する。代表的な生物学的活性の例としては、これらに限定されないが、炎症性細胞(例えば、白血球)の組織への浸潤を誘発または阻害する分子の能力、白血球の内皮細胞または上皮細胞への接着を誘発または阻害する分子の能力、Ｔ細胞増殖または活性化を刺激または阻害する分子の能力、細胞によるサイトカイン遊離を刺激または阻害する分子の能力、または血管透過性を増加または減少させる分子の能力が挙げられる。
１種以上のさらなる治療薬剤「と組合せ」ての投与としては、同時（共に）および任意の順番での連続的な投与が挙げられる。
「治療上有効な量」は、活性薬剤（例えば、ＬＰポリペプチド）が哺乳動物に治療効果を与えるために必須である最小量、すなわち、生理学的症状における改善、疾患の進行、上記の障害に関連する生理学的状態または障害に圧倒されることへの抵抗性における改善を誘発、改善、あるいはそれらを引き起こさせるような量である。
概説
ヒトＥＰＯおよび幹細胞因子と組み合わせてIL-20ポリペプチドに暴露すると、ヒトCD+34前駆細胞が顕著に増殖し、分化することが示されている。また、IL-20ポリペプチドの添加は赤血球前駆細胞のサイズを非常に上昇させた（米国特許出願番号第60/272,242(2001年２月28日出願)参照。本明細書中に組み込む）。ここに本出願人らは、単離および精製した本発明のポリペプチド（成熟IL-19ポリペプチド、IL-22ポリペプチド、IL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体）の造血性前駆細胞の増殖および分化を刺激する能力を示すことを教示する。本発明の好ましい態様は、１つのタイプの造血性前駆細胞(例えば、赤血球および血小板の前駆細胞)のより高い増殖を刺激するために、少なくとも１種の単離および精製した成熟IL-19、IL-22またはIL-24のポリペプチドまたはその変異体を使用する方法である。本発明の別の態様は、１つのタイプの造血性前駆細胞(例えば、赤血球および血小板の前駆細胞)よりも多い増殖を刺激するために、少なくとも１種のIL-19、IL-22またはIL-24アゴニストを使用する方法である。
さらに、造血性プロセスと密接に関連するIL-19、IL-22またはIL-24の活性を本明細書中に記載する。それゆえ、本発明は造血性障害の治療または予防方法を提供し、この方法はこのような処置を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者にIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体の少なくとも１つを含有する、またはそれらからなる、または基本的にそれらから構成される医薬組成物を治療上有効な量で投与して造血細胞を増加させることを含む（しかしこれらに限定されない）方法を提供する。このような方法は、種々の状態および／または状況において必要とされる場合、造血、赤血球生成、白血球生成、血小板生成、好中球、顆粒球および／または血小板の産生を、このような細胞の前駆体の増殖および／または分化を刺激することにより増加させるまたは刺激するために有用であり、このような状態および状況としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定するわけではない。
（ａ）不適切な血小板の産生（例えば、無形成性貧血、不応性貧血、白血病、前白血病（ｐｒｅｌｅｕｋｅｍｉａ）／骨髄異型症候群、巨赤芽球性貧血、化学療法または放射線療法）、および既存の血小板欠乏症または推定の血小板欠乏症（例えば、臓器／骨髄移植を含む（これらに限定されない）計画的な外科手術による）、
（ｂ）血小板破壊の増加（例えば、特発性血小板減少性紫斑病、他の免疫性血小板減少症、ＨＩＶ関連血小板減少症、敗血症／播種性血管内血液凝固および脈管炎）、
（ｃ）異常な血小板機能（例えば、グランツマン（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ）血小板無力症、急性／慢性白血病、骨髄増殖症候群、尿毒症、血小板ストレージプール疾患（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｏｏｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、フォンウイルブランド病および術後心血管機能不全）、ならびに
（ｄ）他の血液凝固障害（例えば、無フィブリノーゲン血症または任意の原因の創傷）。
血小板欠乏症に関する一般的な用語は血小板減少症であり、従って、本発明の方法および組成物は、通常、血小板減少症の治療に利用可能である。血小板減少症（血小板欠乏症）は、種々の理由（化学療法、放射線療法、外科手術、不慮の血液損失および他の特定の疾患状態を含む）のために存在し得る。血小板減少症に関連する、本発明に従って処置され得る代表的な特定の疾患状態は、以下のものである。無形成性貧血、特発性血小板減少症および血小板減少症を生じる特定の転移性腫瘍。また、ＡＩＤＳに関する特定の処置もまた、血小板減少症を生じる（例えば、ＡＺＴ）。特定の創傷治癒障害もまた、血小板数の増加により利益を得るかもしれない。
予測される血小板欠乏症（例えば、将来の外科手術に起因するもの）に関しては、単離および精製したIL-19、IL-22またはIL-24のアゴニスト、ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つを、血小板が必要となる前に数日間〜数時間、投与することができる。急性状態（例えば、不慮および大量の血液損失）に関しては、IL-19、IL-22またはIL-24のアゴニスト、ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つを、さらに本明細書中に記載されるように、血液または精製血小板または他のサイトカインと共に投与することができる。
また、本発明は造血性障害の治療または予防方法を提供し、この方法は、このような処置を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者に、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニストの少なくとも１つを含む、それらからなる、または基本的にそれらから構成されている医薬組成物を、造血性細胞を減少させるために治療上有効な量で投与することを含む（しかし、これに限定しない）。
さらに、本発明は、造血機能、赤血球生成、白血球生成または血小板生成に関連する機能のうちの少なくとも１つに依存する細胞内シグナル伝達経路を調節する、IL-19、IL-22またはIL-24のアゴニスト、アンタゴニスト、ポリペプチドまたはそれらの変異体、およびIL-19、IL-22またはIL-24のアゴニスト、アンタゴニスト、ポリペプチドまたはそれらの変異体の少なくとも１つを含有するまたはそれらからなる組成物を提供する。IL-19、IL-22またはIL-24分子(すなわち、アゴニスト、アンタゴニスト、ポリペプチドおよびそれらの変異体)およびIL-19、IL-22またはIL-24組成物は、Ｔ細胞活性化および／または増殖を刺激(アゴニスト、ポリペプチドおよびそれらの変異体)または阻害(アンタゴニスト)し、それによりウィルスにより引き起こされる感染（HIVを含むが、これらに限定されない）および種々の自己免疫疾患（リウマチ様関節炎、狼瘡、移植片対宿主、宿主対移植片、インスリン依存型糖尿病、自己免疫脳脊髄炎(encephlo-myelitis)および多発性硬化症を含むが、これらに限定されない）の処置に治療用途を有する。
本発明の好ましい実施態様は、造血性障害（貧血および貧血と一般的に関連している障害を含むが、これらに限定されない）の治療または予防方法を提供し、この方法はそのような処置を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者にIL-19アゴニスト、IL-22アゴニスト、IL-24アゴニスト、IL-19ポリペプチド、IL-22ポリペプチド、IL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つを含む（またはそれからなる、あるいは基本的にそれから構成されている）医薬組成物を治療上有効な量で投与することを含む。
本発明の好ましい実施態様はまた、造血性障害（貧血および貧血と一般的に関連している障害を含むが、これらに限定されない）の治療または予防方法を提供し、この方法はそのような処置を必要とする哺乳動物または患者（好ましくはヒト）に本明細書中に記載のIL-19、IL-22またはIL-24のアゴニスト、ポリペプチドまたはそれらの変異体を含む（またはそれからなる、あるいは基本的にそれから構成されている）医薬組成物を治療上有効な量で投与することを含む。
本発明の好ましい実施態様は、赤血球増加症および／または白血病を含む（しかし、これらに限定されない）造血性障害の治療または予防方法を提供し、この方法はそのような処置を必要とする哺乳動物（好ましくはヒト）にIL-19、IL-22またはIL-24のアンタゴニストを含む医薬組成物を治療上有効な量で投与することを含む。
本発明はさらに、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体および／またはIL-19、IL-22またはIL-24組成物のうちの少なくとも１つを１種以上の薬学的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤を共に含有する（またはそれらからなるまたは基本的にそれらから構成されている(すなわち、約10％未満の純度)）医薬製剤を提供する。
本発明はまた、造血性障害（貧血および／または一般的に貧血と関連している障害を含むが、これらに限定されない）を治療または予防する方法を提供し、この方法はそのような処置を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者にIL-19、IL-22またはIL-24組成物を治療上有効な量で投与することを含み、この組成物は、少なくとも１つの活性（例えば、赤血球および／または巨核球前駆細胞の分化および／または増殖を含むが、これらに限定されない）を有する。IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドはこれらの効果に応じて対応する活性についてスクリーニングされ得る。
本発明はさらに、貧血、白血病およびこのような状態に関連した障害の治療または予防のための医薬の製造における、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つの使用を提供する。
変異体
図２、４または６に示す、シグナルペプチド配列を有するまたは有さない配列番号２、４または６に開示される特定のポリペプチド配列（すなわち、「本発明のポリペプチド」）ならびに本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質に関しては、本明細書中に規定するポリペプチドの変異体を含むこともまた、理解される。用語「変異体」は、本発明のポリペプチドとは異なるが、その基本的な性質は保持しているポリペプチドを意味する。通常、変異体は、構造および/または配列同一性において全体的に密接に類似しており、多くの部分で、本発明のポリペプチドと同一である。
本発明はまた、配列番号２、４または６のポリペプチド配列（図２、４または６に示す、シグナル配列を有するまたは有さない）と少なくとも95％、96％、97％、98％、99％同一であるアミノ酸配列を有する、またはそれからなるポリペプチドに関する。
別のアミノ酸配列に対して少なくとも、例えば、約95％「配列同一性」を示すまたは有するポリペプチドとしては、例えば、試験アミノ酸配列の（平均して）100アミノ酸ストレッチ毎に５個までのアミノ酸変化を含みうる。言い換えると、第２のアミノ酸配列に対して少なくとも95％同一である第１のアミノ酸配列は、例えば、アミノ酸残基の挿入、欠失または置換により第２の配列と異なるアミノ酸残基を総数の５％まで有し得る。
ポリペプチド配列のアミノ酸残基における変化は、アミノ末端位またはカルボキシ末端位、またはこれらの末端位の間、配列内の残基の中の個々の間、または配列内の１つ以上の連続フラグメントの間のいずれかで生じうる。実際問題として、任意の特定のポリペプチド配列が別の配列と少なくとも約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％または99％の類似性を示すかどうかは、当業者に公知の方法を用いることにより従来通りに決定することができる。
本明細書中で同定したアミノ酸配列に関して、語句「パーセント（％）同一性」は、保存的置換は配列同一の一部としては考慮せずに配列および挿入ギャップを(必要であれば、最大配列同一割合となるように)整列させた後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義する。アミノ酸同一割合を決定するための整列は、例えば、ALIGN、ALIGN-2、Megalign (DNASTAR)またはBLAST(Blast、Blast-2、WU-Blast-2等)ソフトウェアのような公開されているコンピューターソフトウェアを用いて、当業者の技術範囲内にある種々の様式で達成することができる。当業者であれば、整列の測定のための適切なパラメーター(比較する配列の全長にわたり最大整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む)を決定することができる。例えば、本明細書中で用いる同一性の％値は、WU-BLAST-2 [Altschulら、Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996)]を用いて作製した。WU-BLAST-2サーチパラメーターのほとんどはデフォルト値に設定されている。デフォルト値に設定されていないもの、すなわち、調整パラメーターは以下の値を用いて設定されている。オーバーラップスパン＝１、オーバーラップ割合＝0.125、ワード閾値(T)＝11およびスコアリングマトリックス＝BLOSUM 62。本明細書中においては、アミノ酸配列同一性％値は、(ａ) WU-BLAST-2により決定した、目的のhSEZ6ポリペプチドのアミノ酸配列と目的の比較アミノ酸配列（すなわち、目的のhSEZ6ポリペプチドに対して比較する配列）との間のマッチした同一アミノ酸残基数を、（ｂ）目的のポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除算して決定する。
変異体は、変異誘発技術、またはタンパク質遺伝子操作および組換えDNA技術の公知の方法を用いる直接合成により、製造することができる。このような変異体は、ポリペプチドの特徴または発現レベルを改善または変更するために作製されるか、または偶然発生するかもしれない。生物学的機能の実質的な欠損を伴うことなく、１つ以上のアミノ酸が分泌型ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から欠失されることも多い。さらに、ポリペプチド変異体が天然に存在するタンパク質の生物学的活性と類似の生物学的活性を有しうることを多数の証拠が示している。ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失することにより１つ以上の生物学的機能の変更または欠損を生じたとしても、他の生物学的活性は保持されうる。
本発明のポリペプチドの変異体は、例えば、国際特許出願WO97/20078および米国特許第6,303,344号および同第6,297,053号により開示されるDNAシャッフリングにより作製することができる。
本発明はまた、参照ポリペプチドの生物学的活性（例えば、リガンド結合または抗原性）を示すポリペプチド変異体を含む。このような変異体は、当該分野で公知の一般的な規則を用いて、活性に影響を与えないように、選択される欠失、挿入、逆転、反復および置換等を含む。
これらの位置におけるアミノ酸中の変化がおそらくタンパク質機能に影響を与えるので、１つの技術は保存的アミノ酸残基の位置を同定するために異なる種におけるアミノ酸配列を比較する。対照的に、置換がより頻繁に生じる位置の残基は、通常、これらの位置のアミノ酸残基がタンパク質機能に余り重要ではないことを示している。従って、アミノ酸置換に寛容な位置は、通常、タンパク質の生物学的活性を維持しながら修飾することができる。
別の技術は、タンパク質機能に重要な領域を同定するためにポリペプチドの特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子操作を使用する。例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャンニング変異誘発（分子中の各残基への１つのアラニン変異の導入）を用いることができる。続いて、得られた変異体を生物学的活性について試験することができる。
これら２つの技術により、驚くべきことに、タンパク質がアミノ酸置換に寛容であることが証明され、通常、タンパク質中の特定のアミノ酸位置でどのアミノ酸変化が許容され得るかが示される。例えば、典型的には、(タンパク質の三次構造内で)最も埋もれているアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とするが、表面側鎖の特徴は通常ほとんど保存されていない。好ましい保存的アミノ酸置換を本明細書中の表１に列挙する。
荷電アミノ酸の、別の荷電アミノ酸または中性アミノ酸での置換を含むポリペプチド変異体は、改善された特徴、例えば、より低い凝集を有するポリペプチドを生じうる。医薬製剤の凝集は、活性を減少させ、凝集体の免疫原性活性に起因するクリアランスを上昇させる。
本発明のさらなる態様は、アミノ酸置換を少なくとも１つ含むが、アミノ酸置換が15個を超えず、好ましくはアミノ酸置換が10個を超えない本発明のアミノ酸配列を含むタンパク質を意図する。
当然のことながら優先傾向が高くなる順番で、本発明のポリペプチドは、０または１個のアミノ酸置換を含むが、10、9、8、7、6、5、4、3、2または１個を超えないアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有することが非常に好ましい（ここで、保存的置換は非保存的置換よりも好ましい）。
本発明の新規な方法は、それぞれ、配列番号２、４および６に示される配列を有するIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド(好ましくは、シグナルペプチドを有さない）の使用方法を含むことを意図し、ならびにさらに１つ以上の置換、欠失、挿入、逆転、付加をさらに含む、それらの活性ポリペプチド変異体は、さらに対応する非修飾型IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドとして、実質的に類似する、または良好な生物学的活性および/または薬学的に所望の特性を有する。
本発明の１態様において、１個のアミノ酸変化が、それぞれ、配列番号２、４または６に示される配列を有するIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド(シグナルペプチドを有するまたは有さない）内で作製される。あるいは、少なくとも２個の変化が、これらのポリペプチド配列のうちの少なくとも１つ内で作製される。あるいは、少なくとも３個の変化が、これらのポリペプチド配列のうちの少なくとも１つ内で作製される。あるいは、少なくとも４個から少なくとも１０個までの変化が、これらのポリペプチド配列のうちの少なくとも１つ内で作製される。当業者であれば、多数の置換および／またはタンパク質配列または構造に対する他の変化が、ポリペプチドの生物学的活性または特徴に実質的に影響を与えることなく行われうることを理解する。例えば、保存的アミノ酸置換を作製すること、または１つのアミノ酸を同じアミノ酸クラス由来の別のもの(例えば、負に荷電した残基、正に荷電した残基、極性非荷電残基、および非極性残基、または当該分野において受け入れられている他のクラス分け)で置き換えることは、機能に対して重要な影響を与えることなく行われることが多い。本明細書中以下の表１に従って行った、それぞれ、配列番号２、４または６に示される配列を有するIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド(シグナルペプチドを有するまたは有さない）の修飾は、当該分野において認識されている特定のアミノ酸の置換可能性に基づいて、非修飾型ポリペプチドと同じ、または実質的に類似する、または優れてさえいる生物学的活性を保持する変異体ポリペプチドを生じると期待され、また、本発明の方法で有用であると予測される。
Figure 2005519986
このような変化を作製する際に考慮され得る１つの因子は、アミノ酸のハイドロパシーインデックスである。タンパク質上の相互作用的生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、KyteおよびDoolittleにより議論されている(2）。アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性は、得られたタンパク質の二次構造に寄与していると受け止められている。次いで、これはタンパク質と、分子（例えば、酵素、基質、レセプター、リガンド、DNA、抗体、抗原など）との相互作用に影響を与える。疎水性および荷電特性に基づき、各アミノ酸は以下のようなハイドロパシーインデックスを割り当てられている。イソロイシン(＋4.5)、バリン(＋4.2)、ロイシン(＋3.8)、フェニルアラニン(＋2.8)、システイン／シスチン(＋2.5)、メチオニン(＋1.9)、アラニン(＋1.8)、グリシン(−0.4)、トレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタミン酸／グルタミン／アスパラギン酸／アスパラギン(−3.5)、リジン(−3.9)およびアルギニン(−4.5)。
当該分野において公知のように、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換され得、類似の生物学的活性を有する（すなわち、なお生物学的機能を保持している）結果物のペプチド等を生じる。このような変化を作製する際に、±２以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸で互いに置きかえることが好ましい。より好ましい置換は、±１以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸での置換である。最も好ましい置換は、±0.5以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸での置換である。
また、類似のアミノ酸は親水性に基づいて置換され得る。米国特許第4,554,101号は、隣接するアミノ酸の親水性により支配されるタンパク質の最も高い局地的な平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを開示する。以下の親水性値がアミノ酸に割り当てられている。アルギニン／リジン（＋3.0）、アスパラギン酸／グルタミン酸（＋3.0±１）、セリン（＋0.3）、アスパラギン／グルタミン（＋0.2）、グリシン（０）、トレオニン（−0.4）、プロリン（−0.5±１）、アラニン／ヒスチジン（−0.5）、システイン（−1.0）、メチオニン（−1.3）、バリン（−1.5）、ロイシン／イソロイシン（−1.8）、チロシン（−2.3）、フェニルアラニン（−2.5）およびトリプトファン（−3.4）。従って、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中の１つのアミノ酸を類似の親水性スコアを有する別のアミノ酸で置換することができ、類似の生物学的活性を有する結果物のペプチド等をやはり生じる（すなわち、やはり正確な生物学的機能を保持する）。このような変化を作製する場合、±２以内のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が互いに置換されることが好ましく、±１以内のものがより好ましく、±0.5以内のものが最も好ましい。
上記に概説したように、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド中のアミノ酸置換はアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ等）に基づき得る。本発明のペプチドなどの内部でサイレントな変化を生じる保存的アミノ酸変化を作製するために、種々の上記の特徴を考慮に入れた代表的な置換は、天然のアミノ酸が属するそのクラスの他のメンバーから選択され得る。アミノ酸は以下の４つのグループに分けることができる。（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、および（４）中性非極性アミノ酸。これらの種々のグループ内の代表的なアミノ酸としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない。（１）酸性（負に荷電した）アミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸、（２）塩基性（正に荷電した）アミノ酸、例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジン、（３）中性極性アミノ酸、例えば、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン、ならびに（４）中性非極性アミノ酸、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン。
本明細書中に記載のものと類似または同一であるインビボまたはインビトロでの生物学的活性（例えば、赤血球および／または巨核球の前駆細胞の分化および／または増殖を誘発または増加させる能力）を有するIL-19、IL-22またはIL-24変異体もまた、本発明の方法に有用であり、それ自体、本発明に含まれる。IL-19、IL-22またはIL-24変異体は、機能的に関連付けられると同時に、定義により、それぞれ、配列番号２、４および６に示される配列(シグナル配列有りまたは無し)と１以上の位置で異なるアミノ酸配列を含む。本発明の方法に有用である変異体は、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、逆転および／または置換により作製することができる。このような変異体は、通常、例えば、表１に従う単独または複数の保存的アミノ酸置換が行なわれる固相技術または組換え技術により作製することができる。通常、複数の置換の場合、IL-19、IL-22またはIL-24変異体の95％〜100％の残基が、それぞれ、配列番号２、４または６に示す対応する連続配列（シグナル配列有りまたは無し）と同一であることが好ましく、IL-19、IL-22またはIL-24変異体の96％〜100％の残基が、それぞれ配列番号２、４または６に示す対応する連続配列（シグナル配列有りまたは無し）と同一であることがより好ましく、IL-19、IL-22またはIL-24変異体の98％〜100％の残基が、それぞれ、配列番号２、４または６に示す対応する連続配列（シグナル配列有りまたは無し）と同一であることが最も好ましい。
本発明の方法に有用であり得る別のクラスの変異体には、Ｎ−末端および／またはＣ−末端に付加したオリゴペプチドまたはアミノ酸を少なくとも１つさらに含む、本明細書中に規定のIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドが挙げられる。「オリゴペプチド」は、ペプチド結合によりＮ−末端および／またはＣ−末端に連結された２〜約250個のアミノ酸の鎖である。適切なオリゴペプチドおよびアミノ酸は、本明細書中に規定のポリペプチドの生物学的活性を顕著には減少させず、ポリペプチドの所望の薬学的および薬理学的特性を実質的には減少させないものである。このような修飾の好ましい例としては、他のポリペプチド（例えば、プレトリプシノーゲンリーダー配列）中に見出されるリーダー配列をさらに含む本明細書中に規定のIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド（それぞれ、配列番号２、４または６）が挙げられる。
また、本明細書中に規定のIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドは、修飾型（例えば、融合タンパク質または「タグ化」タンパク質）で発現させ、用いることができる。IL-19、IL-22またはIL-24融合タンパク質は、天然では見出されないハイブリッドタンパク質分子を表し、これは２つ以上の異なるタンパク質、フラグメントまたはそれらの変異体が１つのポリペプチド鎖上で共有結合で連結されている、翻訳的融合物または酵素的融合物を含む。ヒト血清アルブミン、トロンボポエチンのＣ−末端ドメイン、ｈＣＧのＣ−末端伸長ペプチドおよび／またはＦｃフラグメントは、本発明で用いるためのIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体と融合することができるタンパク質の例である。本明細書中で用いる場合、抗体の「Ｆｃフラグメント」は、この単語に免疫学の分野において通常与えられる意味を有する。具体的には、この用語は、補体に結合する抗体フラグメントを意味し、抗体から２つの抗原結合領域（Fabフラグメント）を取り除くことにより得られる。従って、Fcフラグメントは、両方の重鎖（これらは非共有結合相互作用およびジスルフィド結合により会合している）由来のほぼ等しいサイズのフラグメントから形成される。Fcフラグメントはヒンジ領域を含み、抗体のCH２およびCH３ドメインからＣ末端へと伸張する。
タンパク質発現および続いての精製に関する好ましい方法において、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子(それぞれ、配列番号１、３または５に示す配列)を５’末端で修飾して、発現により得られるタンパク質のアミノ末端にいくつかのヒスチジン残基をコードすることができる。この「ヒスチジンタグ」により、「固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー」（ＩＭＡＣ）（これは基本的には米国特許第4,569,794号に記載されている）と称される１工程タンパク質精製法を可能とする。ＩＭＡＣ法は、上記のような修飾型組換えタンパク質を発現する細胞の粗抽出物から開始する、組換えタンパク質の実質的に純粋な迅速な単離を可能とする。
合成
IL-19、IL-22またはIL-24のポリペプチドおよびその変異体の機能的フラグメントは、当業者に周知の任意の多数の適切な技術（配列番号２、４または６の任意の部分の化学合成、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドのタンパク質分解的消化、その変異体のプロポリペプチド、または最も好ましくは組換えＤＮＡ変異誘発技術を含む）により作製することができる。例えば、好ましい方法では、欠失変異のネステッドセット(nested set)を、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドをコードする核酸配列に導入して、タンパク質分子のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかから種々の量のタンパク質コード領域を欠失する。また、この方法を用いてカルボキシおよびアミノ末端の両方が取り除かれている、インタクトなタンパク質の内部フラグメントを作製することができる。種々の適切なヌクレアーゼ(例えば、Bal3Iまたは緑豆ヌクレアーゼ)を用いてそのような欠失を作製することができる。望ましい場合、得られた遺伝子欠損フラグメントを、任意の適切な宿主細胞(細菌、酵母、昆虫または哺乳動物)中での増殖および発現のために、任意の適切なベクターにサブクローニングすることができる。
本明細書中に開示するタンパク質または全長タンパク質の機能的フラグメントは、上記のように、または当該分野において周知の技術を使用して製造することができる。このようなタンパク質を任意の適切なアッセイを使用して生物学的活性(例えば、インビボまたはインビトロでの赤血球前駆細胞の分化および/または増殖を誘導および／または増強する能力)について試験することができる。
当業者であれば、IL-19、IL-22またはIL-24をコードする遺伝子を複数の組換えDNA技術(例えば、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅またはデノボDNA合成(４))により得ることができることを認識するであろう。原核生物または真核生物細胞での増殖のために適切なベクター(例えば、プラスミドまたはファージ)中でcDNAライブラリーを構築する方法は、当該分野において周知である(４)。適切なクローニングベクターは周知であり、広範に入手可能である。
IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子またはそれらの任意のフラグメントは、遺伝子が発現されている組織(例えば、胎盤)中から単離することができる。１つの方法では、mRNAを単離し、第１鎖cDNA合成を行う。第２鎖の産生のために第２回目のDNA合成を行うことができる。望ましい場合、二本鎖cDNAを任意の適切なベクター(例えば、プラスミド)にクローニングすることにより、cDNAライブラリーを形成することができる。それぞれ、IL-19、IL-22またはIL-24に対する配列番号１、３または５の適切な領域に標的化したオリゴヌクレオチドプライマーをPCR増幅のために使用することができる。PCR増幅は、鋳型DNA、適切な酵素、プライマーおよび緩衝液を含み、通常、DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)で行う。ポジティブな結果は、アガロースゲル電気泳動の後に適切にサイズ分けしたDNAフラグメントを測定することにより決定することができる。本発明で用いるタンパク質を多数の異なる方法(例えば、固相ペプチド合成または組換え方法を含む当該分野において周知の化学的な方法)で合成することができる。
本発明に有用なタンパク質は、クローニングしたIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子を用いる組換えDNA方法を含む多数の方法により製造することができる。組換え方法は、高収率が望ましい場合に好ましい。クローニングした遺伝子の発現は、当業者に周知の種々の適切な宿主細胞中で行うことができる。この目的のために、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子を適切な手段により宿主細胞に導入する。クローニングした遺伝子の染色体組込みは本発明の範囲内にあるが、遺伝子が適切な染色体外に維持される発現ベクターにクローニングされて遺伝子のコード領域が構成性または誘導性プロモーターに作動可能に連結されることが好ましい。
IL-19、IL-22またはIL-24のタンパク質またはその変異体の組換え産生における基本工程は以下の通りである。
ａ）該タンパク質またはその変異体をコードする、天然、合成性または半合成性DNAを構築すること、
ｂ）タンパク質またはその変異体の発現に適した様式で、単独または融合タンパク質のいずれかとしてDNAを発現ベクターに組み込むこと
ｃ）該ベクターを適切な真核生物または原核生物宿主細胞に形質転換するかまたは導入して組換え宿主細胞を形成すること、
ｄ）組換え宿主細胞をIL-19、IL-22またはIL-24のタンパク質またはその変異体を発現する様式で培養すること、
ｅ）IL-19、IL-22またはIL-24のタンパク質またはその変異体を、当該分野において周知の適切な方法により回収し、実質的に精製すること。
本発明の核酸を保有するために適したベクターは、RNAウィルス、DNAウィルス、溶菌性バクテリオファージ、溶原性バクテリオファージ、安定なバクテリオファージ、プラスミド、ウイロイドなどを含む。最も好ましいベクターはプラスミドである。
発現ベクターの製造の際には、部分的には、産生される核酸またはタンパク質の量が発現系の選択に影響を与えることを当業者ならば理解する。プロモーター配列に関して、誘導性プロモーターは作動可能に連結された遺伝子の高レベルの調節可能な発現を可能にするので、誘導性プロモーターが好ましい。発現ベクターに関する他の関連する考慮としては、組換えタンパク質の位置を指示する配列を含むかどうかが挙げられる。例えば、遺伝子のコード領域の前にあるシグナルペプチドをコードする配列は、得られたポリペプチドの細胞外排出を指示するために有用である。
上記のように、本発明の方法に用いるIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドは、直接発現によるか、または酵素切断または化学的切断により除去可能である別のタンパク質またはペプチドとの翻訳融合物として目的のタンパク質を含む融合タンパク質としてのいずれかにより合成することができる。組換え系における特定のペプチドの産生において融合タンパク質としての発現が寿命を長期化させ、所望のペプチドの収率を増加させ、タンパク質の精製の簡便な方法を提供することが、しばしば、観察されている。これは特に、原核生物宿主での哺乳動物タンパク質を発現する場合に、関連している。特定の部位でポリペプチドを切断するペプチダーゼ(例えば、腸活素およびトロンビン)、またはペプチド鎖のアミノまたはカルボキシ末端からペプチドを消化するペプチダーゼ（例えば、ジアミノペプチダーゼ）である種々のペプチダーゼが公知である。さらに、特定の化学物質（例えば、臭化シアン）は特定の部位でポリペプチド鎖を切断する。
本発明での使用に適した代表的な哺乳動物宿主細胞としては、HepG-2 (ATCC HB 8065)、CV-1 (ATCC CCL 70)、LC-MK2 (ATCC CCL 7.1)、3T3 (ATCC CCL 92)、CHO-K1 (ATCC CCL 61)、HeLa (ATCC CCL 2)、RPMI8226 (ATCC CCL 155)、H4IIEC3 (ATCC CCL 1600)、C127I (ATCC CCL 1616)、HS-Sultan (ATCC CCL 1484)およびBHK-21 (ATCC CCL 10)が挙げられる。哺乳動物細胞のベクターでのトランスフェクションは、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーションなどを含む（しかし、これらに限定されない）複数の周知の方法により行うことができる（４）。組換え産生したタンパク質を、任意の適切な手段により形質転換した細胞の細胞抽出物から精製することができる。
IL-19、IL-22またはIL-24 cDNA（それぞれ、図１、３および５に示す配列番号１、３および５に示す配列）および配列番号２、４または６をコードする関連する核酸分子またはその変異体（シグナルペプチド配列有りまたは無し）は、化学的合成方法により製造することができる。目的の遺伝子に対応するDNA配列のフラグメントは、ホスフォロアミダイト化学を用いる従来的なDNA合成装置(例えば、Applied Biosystems Model 380Aまたは380B DNA合成機 (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA))を用いて製造した後、フラグメントをライゲーションして全遺伝子を再構築する。あるいは、ホスホトリエステル化学を用いて本発明の核酸を合成することができる(７)。
別の方法、すなわちPCRでは、例えば、配列番号１、３または５の一部または全てを含む本明細書中に開示し記載するDNA配列を、複数の出発物質から製造する。例えば、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子を発現する組織からのcDNA製造物を用いて開始する。PCRを用いて、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子の任意の領域を増幅に対して標的化することにより完全長または部分的な長さの遺伝子配列を製造することができる。
シグナル配列
本発明のポリペプチドは、細胞内のタンパク質輸送を可能とするシグナルペプチド配列を有し得る(図２、４および６)が、このシグナルペプチド配列は、細胞外に輸送された場合に存在する成熟ポリペプチド中には存在しない。あるいは、本発明のポリペプチドはシグナルペプチド配列無しで製造することができる。いずれかの方法で、成熟ポリペプチドはシグナルペプチド配列を有さない。
約10〜30個の疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドは、初期タンパク質をリボソームから小胞体(ER)へと向かわせる。一旦、ERへと局在すると、タンパク質はさらに細胞内のゴルジ体へと向かわせられるかもしれない。ゴルジはタンパク質を小胞、リソソーム、細胞膜および他の細胞小器官へと分配する。シグナル配列によりERへと向かわせられたタンパク質は細胞から細胞外空間へと遊離されうる。細胞外へと移動させられるタンパク質を含む小胞体は細胞膜と融合し、エクソサイトーシスと称されるプロセスを介して細胞外空間へとその内容物を放出する。エクソサイトーシスは構成的にか、または引き金となるシグナルを受け取った後に生じ得る。後者の場合、エクソサイトーシスの引き金が引かれるまでタンパク質は分泌小胞に保存される。この経路を通過するタンパク質は、細胞外空間に放出されるか、または原形質膜中に保持されるかのいずれかである。
種々のタンパク質由来のシグナルペプチドの一般的な構造は、通常、正に荷電したn-領域、続いて疎水性h-領域および中性であるが極性のあるc-領域として記載される。(-3, -1)則は、(シグナルペプチド切断部位に対して)-3位と-1位にある残基は、正確に切断が生じるために、小さく、中性である必要があると記している。
多くの場合、シグナルペプチドを含むアミノ酸は輸送の間か、または最終的な目的地に達した後にタンパク質から切断される。特定の酵素であるシグナルペプチダーゼはシグナルペプチド配列のタンパク質からの除去を担う。これらの酵素は、シグナルペプチドがタンパク質を所望の位置に向かわせた後に活性化される。
本発明のポリペプチドは組換えにより製造することができる。通常、シグナル配列は発現ベクターの構成要件であるかもしれないか、またはこのようなベクター中に挿入される本発明のポリペプチドをコードするDNAの一部であるかもしれない。大腸菌発現に関しては、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列であり得る。酵母分泌に関しては、シグナル配列は、例えば、酵母転化酵素リーダー、α因子リーダー(サッカロミセス属およびクリュイベロミセス属(Kluyveromyces)のcc因子リーダー、後者は米国特許番号5,010,182に記載)、または酸ホスファターゼリーダー、C. albicansグルコアミラーゼリーダー(EP 362,179)またはWO 90/13646に記載のシグナルであってもよい。哺乳動物細胞発現においては、哺乳動物シグナル配列を、同種または関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列のように、ウィルス性分泌リーダーと同様にタンパク質の分泌を指向するために用いることができる。
造血性障害の処置を必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者における、そのような障害の変更に関するIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体、またはIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、単離し精製したIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つを含むまたはそれらからなるまたは基本的にそれらから構成される組成物の有用性は、本明細書中に記載の、あるいは当該分野において公知の方法またはアッセイを適用することにより、過度の実験を行なうことなく当業者により決定され得る。同様に、本発明の、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体、またはIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つを含むまたはそれらからなるまたは基本的にはそれらから構成される組成物の本発明の方法における有用性は、本明細書中に記載の造血のインビトロモデルまたはインビボモデル（実施例を参照のこと）、または当該分野において公知の別のアッセイを用いて評価または定量することができる。
細胞ベースの系は、造血性障害の症状を改善するように作用し得る化合物を同定するために用いられ得る。このような細胞系としては、例えば、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子を発現する組換えまたは非組換え細胞（例えば、セルライン）を挙げることができる。このような細胞系を用いる際には、造血性障害の症状を改善する能力を示すと思われる化合物を、IL-19、IL-22またはIL-24を発現する細胞のそのような症状の改善を誘発するために充分な濃度で充分な時間の間、その細胞に暴露する。暴露した後、例えば、IL-19、IL-22またはIL-24mRNA転写物に関して、または細胞により発現されるIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子産物に関して細胞溶解物をアッセイすることにより細胞をアッセイして、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子の発現における変化を測定することができる。
さらに、動物ベースのシステムまたは哺乳動物造血性障害に関するモデル（例えば、ヒトまたは改変形のIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子を含むトランスジェニックマウス）は、障害の症状を改善する能力を同定するために使用することができる。このような動物モデルは、薬物の同定、調剤、医薬および診療のための試験物質として使用することができる。例えば、動物モデルを、症状を改善する能力を示すと思われる化合物に、造血性障害の症状の改善を誘発するために充分な濃度で充分な時間の間、暴露してもよい。特定の処置に対する動物の反応を、障害に起因する症状の減少を評価することによりモニターすることができる。造血性障害様症状に好ましい影響を与える処置は、このような障害でのヒトの治療的診療に対する候補物質とみなすことができる。試験薬剤の用量は、用量応答曲線を導くことにより決定することができる。
１つの実施態様において、本発明の方法は、細胞に化合物を接触させること、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定すること、およびそのレベルを化合物無しで細胞により産生されたIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子の発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルと比較することを含む。化合物の存在下で得られたレベルが非存在下で得られたレベルと異なる場合、哺乳動物IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子の発現および／または哺乳動物IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子産物の合成または活性を調節する化合物が同定されている。
別の実施態様において、本発明の方法は、化合物を宿主に投与すること、およびIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルを測定することを含む。測定したレベルを、化合物にさらされていない宿主におけるIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子発現、遺伝子産物発現または遺伝子産物活性のレベルと比較する。宿主が化合物に曝された場合に得られるレベルが、宿主が化合物に曝されていない場合に得られるレベルと異なる場合、哺乳動物IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子の発現、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子産物の合成または活性のいずれかを調節する化合物は本発明の方法に用いることができる。
本発明の方法は、例えば、造血性障害の症状を改善するために哺乳動物IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子の発現および／または哺乳動物IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子産物の合成および／または活性を調節する化合物を投与することを含み得る。あるいは、哺乳動物造血性障害がIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子変異から生じる場合、このような方法は、損なわれていないIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子産物をコードする核酸分子を哺乳動物に補うことにより、損なわれていないIL-19、IL-22またはIL-24遺伝子産物が発現され、障害の症状が改善されることを含み得る。
治療用途のために、有効量のIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、単離し精製したIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つ、またはIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つを有効量で含有する、またはそれらからなる、または基本的にはそれらから構成される組成物を、それらを必要とする哺乳動物、ヒトまたは患者に、約0.1〜1000μg/kgの用量で投与する。本発明に関する方法の実施の際には、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体、またはIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたは本明細書中に記載のその変異体のうちの少なくとも１つを含む、またはそれらからなる、または基本的にはそれらから構成される組成物を、１日に複数回、１日に１回、週に１回の投薬、または他の任意の定期的な間隔で投与することができる。投薬あたりの量および投薬の頻度は医師により決定され、疾患の性質および重篤度、ならびに患者の年齢および全体的な健康のような因子に依存する。
また、本発明は、活性薬剤としてIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体、ならびに製薬上許容される固体または液体のキャリアを含有する製薬用IL-19、IL-22またはIL-24組成物を提供する。例えば、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つは、従来的な製薬キャリアおよび賦形剤とともに投与され、錠剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁剤、シロップ、ウェハ、非経口製剤などの形態で用いられ得る。組成物は、活性なIL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つを約0.1重量％〜90重量％、ならびにより一般的には、約10重量％〜30重量％で含有する。組成物は、一般的なキャリアおよび賦形剤（例えば、コーンスターチまたはゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸）を含有し得る。
一般的な提案として、非経口的に患者に投与される、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つの用量あたりの薬学的な全有効量は、約１μg/kg/日〜１０mg/kg/日、具体的には２mg/kg/日〜８mg/kg/日、より具体的には２mg/kg/日〜４mg/kg/日、さらになお具体的には2.2mg/kg/日〜3.3 mg/kg/日の範囲、ならびに最終的には2.5 mg/kg/日であるが、上記のように、これは治療上の判断に供される。より好ましくは、この用量は少なくとも0.01 mg/kg/日である。連続投与される場合、代表的には、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体は、約１μg/kg/時間〜約50μg/kg/時間の投薬速度で、１日１〜４回の注射、または、例えばミニポンプを用いる連続皮下注入のいずれかにより投与される。静脈内バッグ溶液もまた、使用することができる。変化を観察するために必要とされる治療の長さ、ならびに反応が生じるための治療の後の間隔は、おそらく所望の効果に応じて変化する。
IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つを含む医薬組成物は、経口的、経直腸的、頭蓋内、非経口的、くも膜下槽内(intracisternally)、膣内、腹膜内、局所的（散剤、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして）、経皮的、髄膜下、経頬粘膜または経口もしくは経鼻スプレーとして、投与され得る。「製薬上許容されるキャリア」は、非毒性の固体、半固体または液体の増量剤(filler)、希釈剤、カプセル化材料、または任意のタイプの処方補助物質(auxiliary)を意味する。本明細書中で用いる用語「非経口」は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下および関節内への、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つを含む(あるいはこれらからなる、または基本的に構成される)注射、注入およびインプラントを含む投与態様を含むが、これらに限定するわけではない。
化合物を経口または非経口投与のために処方することができる。皮下投与のために好ましい経口製剤は、緩衝剤（例えば、リン酸、クエン酸、酢酸、ホウ酸、TRIS）、塩（例えば、NaCl、KCl）、二価金属（例えば、Zn、Ca）および等張化剤（例えば、グリセロール、マンニトール）、界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、ジクサートナトリウム(ddicusate sodium)、ラウリル流酸ナトリウム）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、および抗菌剤（例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、アルコール、ベンジルアルコール、ブチルパラベン(butylparben)、メチルパラベン(methylparaben)、エチルパラベン、クロロクレゾール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、プロピルパラベン)を含有してもよい。
静脈内(IV)用途のため、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つは、一般的に用いられる静脈内流体中で投与され、注入により投与される。生理的生理食塩水、リンゲル溶液、または５％デキストロース溶液のような流体が用いられ得る。
筋肉内製剤に関しては、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つの滅菌処方物（好ましくは、適切な可溶性塩形態)（例えば、塩酸塩）を薬学的な希釈剤（例えば、発熱物質不含水（滅菌）、生理的生理食塩水または５％グルコース溶液）に溶解し、投与することができる。適切な不溶性形態の化合物を、水性ベースまたは製薬上許容されるオイルベース（例えば、オレイン酸エチルのような長鎖脂肪酸エステル）中の懸濁液として製造し、投与することができる。
また、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体を、徐放性システムにより適切に投与する。徐放性組成物の適切な例は、成形物品の形態での半透過性ポリマー性マトリックス（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）を含む。徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第3,773.919号、EP58,481）が挙げられるがこれに限定されない。また、他の徐放性組成物としては、リポソーム閉じ込め式修飾型(liposomally entrapped modified)のIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドおよび／またはその変異体が挙げられる。このようなリポソームは、米国特許出願第4,485,045号および同第4,544,545号；およびEP102,324のような公知の方法により製造される。通常、リポソームは小さく（約200〜800オングストローム）単層タイプのものであり、これは脂質含量が約30mol％コレステロールを超え、この選択した割合は最適な治療のために調節される。
非経口投与のため、１つの実施態様では、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体は、通常、所望の程度の純度で、単位投薬注射形態（液剤、懸濁剤または乳剤）中で製薬上許容されるキャリア（すなわち、用いる投薬量および濃度ではレシピエントに対して非毒性のものであり、製剤中の他の成分と適合性であるもの）と混合することにより製剤化することができる。好ましくは、製剤は、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが知られている他の化合物を含有しない。
通常、製剤は、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つを、液体キャリアまたは微細に分割した固体キャリアもしくはその両方と、均一および密接に接触させることにより製造する。次いで、必要であれば、製品を所望の製剤に成形する。好ましくは、キャリアは非経口キャリアであり、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が挙げられる。非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油およびオレイン酸エチル）ならびにリポソームもまた、本明細書中において有用である。
キャリアは、等張性および化学的安定性を増加させる物質のような添加剤を少量、適切に含有する。このような物質は、用いる用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これにはリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝液、アスコルビン酸のような抗酸化剤、ポリアルギニンまたはトリペプチドのような低分子量（約10残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物、EDTAのようなキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような対イオン、および／またはポリソルベート、ポロキサマーまたはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはそれらの変異体のうちの少なくとも１つは、通常、このようなビヒクル中に約0.1mg/ml〜100mg/ml、好ましくは１〜10mg/mlの濃度で、約３〜８のpHで処方される。上記の賦形剤、キャリアまたは安定化剤の特定の使用により、特定の活性成分の塩の形成が生じることが理解される。
治療上の投与のために用いられる組成物は滅菌されていなければならない。滅菌は、滅菌ろ過メンブレン（例えば、0.2ミクロンメンブレン）を通してのろ過により簡単に達成される。通常、治療用組成物を滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置し、続いて皮下注射針で穿刺可能なストッパーを有するようにシールする。
製薬上有用なIL-19、IL-22またはIL-24組成物は、通常、水溶液または再構築のための凍結乾燥製剤として単位用量または複数回用量の容器（例えば、シール型アンプルまたはバイアル）中に保存される。凍結製剤の例として、10mlのバイアルに滅菌ろ過したIL-19、IL-22またはIL-24組成物のうちの１つの１％(w/v)水溶液５mlを充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注射用静菌水を用いて凍結乾燥ポリペプチドを再構築することにより、注入溶液を作製する。
また、本発明は、本発明の医薬組成物の成分の１つ以上を充填した容器を１つ以上含む医薬パックまたはキットを提供する。医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を統制する政府機関により規定されている形態の注意書きがこのような容器に添えられていてもよい。この注意書きは、ヒト投与に対する製造、使用または販売の政府機関による認可を反映する。
さらに、本発明の治療方法は、単独、または他のサイトカイン、可溶性Mplレセプター、造血性因子、インターロイキン、増殖因子、それらのキメラ(例えば、ミエロポイエチン(myelopoietin))またはそれらに対する抗体との組合せ、または可溶性レセプターまたはそのオーグメンター(augmentor)のいずれかとの組合せで、造血性疾患状態の治療でもまた使用されうる。本発明の治療方法は、いくつかの形態の血小板減少症、貧血、白血病、骨髄移植の治療に有用であり、IL-3またはGM-CSFのような造血の一般的な刺激物質との組み合わせに有用であると予測される。他の巨核球刺激因子（すなわち、meg-CSF、幹細胞因子(SCF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンＭ(OSM)または他の巨核球刺激活性を有する分子）もまた、IL-19、IL-22またはIL-24アゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24アンタゴニスト、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドまたはその変異体のうちの少なくとも１つと共に用いることができる。このような同時投与のためのさらなる例示的なサイトカインまたは造血因子としては、以下のものが挙げられる。IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-20、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、M-CSF、SCF、GM-CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、EPO、インターフェロン-α(IFN-α)、コンセンサス(consensus)インターフェロン、IFN-β、IFN-γ、トロンボポエチン(TPO)、アンジオポエチン(例えば、Ang-1、Ang-2、Ang-4、Ang-Y)、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド、血管上皮成長因子(VEGF)、アンジオゲニン、骨形成タンパク質-１、２、３、４、５、６、７、８、９、10、11、12、13、14または15、骨形成タンパク質レセプター１ａ、骨形成タンパク質レセプター１ｂ、脳由来神経栄養(neutrophic)因子、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子レセプター、上皮細胞成長因子、内皮由来好中球誘引物質、繊維芽細胞成長因子４、５、６、７、８、8a、8b、8c、９または１０、酸性繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor acidic)、塩基性繊維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor basic)、グリア細胞株由来神経栄養因子レセプター、へパリン結合上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子レセプター、インスリン様成長因子１、インスリン様成長因子レセプター、インスリン様成長因子11、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子レセプターａ、神経成長因子、神経成長因子レセプター、ニュートロフィン−３、ニュートロフィン−４、胎盤成長因子、胎盤成長因子２、血小板由来内皮細胞成長因子、血小板由来成長因子（血小板由来成長因子Ａ鎖、血小板由来成長因子AA、血小板由来成長因子AB、血小板由来成長因子Ｂ鎖、血小板由来成長因子BBおよび血小板由来成長因子レセプターを含むがこれらに限定しない）、前Ｂ細胞成長刺激因子、幹細胞因子レセプター、腫瘍壊死因子(TNFO、TNFI、TNF2を含む)、形質転換増殖因子ｕ、形質転換増殖因子Ｐ、形質転換増殖因子P1、P1.2、P2、P3またはP5、潜伏(latent)形質転換増殖因子P1、形質転換増殖因子Ｐ結合タンパク質１、形質転換増殖因子Ｐ結合タンパク質２、形質転換増殖因子Ｐ結合タンパク質３、腫瘍壊死因子レセプター１型、腫瘍壊死因子レセプター２型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプター、血管内皮成長因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的または免疫学的に活性なフラグメント。さらに、同時または連続的のいずれかで、可溶性哺乳動物Mplレセプターのいずれか（これは、おそらく、一旦成熟形態に至った巨核球を血小板へと破片にする効果を有する）を有効量投与することはさらに有用であり得る。従って、可溶性Mplレセプター（リガンドを不活性化させて成熟巨核球に血小板を産生させるため）の投与と組み合わせての、上記の追加の因子のうちの少なくとも１つと組み合わせてのIL-19、IL-22またはIL-24組成物の投与が、血小板産生を刺激する特に有効な手段であることが期待される。上記の用量は、治療用組成物におけるこのような追加の成分を補うように調節される。１つ以上のさらなる治療用薬剤と組み合わせての投与には、同時（併用）および任意の順番での連続投与が挙げられる。治療される患者の進行は、本明細書中に記載のアッセイ、あるいは当該分野において公知のアッセイによりモニターすることができる。
以下の実施例は本発明をより充分に記載するものである。当業者であれば、記載の特定の試薬、装置および手順が単に例示であり、決して本発明を制限するものとは意図しないことを認識するであろう。
実施例１：トランスジェニックげっ歯類開発
Ａ．トランスジーン構築
標準的方法に従ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを合成し、これを用いて全長コード領域および周囲配列を含むプラスミドから、またはゲノムDNAからIL-24コード領域およびIL-19コード領域を増幅する。
IL-24については、PCRプライマーの具体的なセットは以下のものである。
Figure 2005519986
 IL-19については、PCRプライマーの具体的なセットは以下のものである。
Figure 2005519986
 IL-22については、PCRプライマーの具体的なセットは参考文献３中に見いだすことができる。多数の別のPCRプライマーセットが当業者により設計されうる。プライマーは、プラスミドへのクローニングを提供するために制限酵素部位を組み込むことができる。
Ｂ．トランスジェニック動物開発
確立されている技術[Hogan,B.ら、(1986)Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,NY]を参考文献８により改変して用いてトランスジェニックマウスを作製した。簡単に説明すると、ヒトアポリポプロテインＥ(hApoE)遺伝子プロモーター−５’hApoE非翻訳領域−IL-19、IL-22またはIL-24/FLAG肝臓制御配列(HCR)融合遺伝子を取り巻く6.4kbのDNAフラグメントをSalIおよびSpeIを用いる消化によりプラスミドpLIV7- IL-19、IL-22またはIL-24から切りだし、ゲル電気泳動およびガラスビーズ抽出により精製する。hApoE遺伝子プロモーター−5'hApoE非翻訳領域−(IL-19、IL-22またはIL-24)−ＨＣＲ融合遺伝子を含む精製DNAフラグメントを、ＦＶＢ／Ｎ系統の受精したばかりの１細胞期胚（接合体）の雄性前核にマイクロインジェクションする。胚をインビトロで一晩培養して２細胞期まで発生させる。次いで、２細胞期の胚を擬性妊娠させたICR系統マウスの卵管に移植し、出産まで発達させる。新生児マウスにおけるトランスジーンの存在について試験するために、足指の小さい破片を各動物から取り、プロテイナーゼＫを用いて消化して核酸を遊離させる。続いて、足指抽出物のサンプルを、hApoE非翻訳領域に特異的なプライマーを用いるPCR分析にかけてトランスジーン含有マウスを同定する。各遺伝子について５匹の創始(founder)トランスジェニックマウスを同定する。これらの各創始体を交配させてＦ１およびＦ２世代を作製する。
実施例２：造血モジュレーターに関してのインビトロ試験
Ａ．ヒト巨核球アッセイ
試験ポリペプチド(例えば、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド)を、CD34＋前駆細胞に由来するヒト巨核球の発生を刺激する能力についてアッセイすることができる。CD34＋選択細胞を記載されるように骨髄から入手し（９）、２mMグルタミン、2-メルカプトエタノール（10-4Ｍ）、１％ウシ血清アルブミン、低密度リポプロテイン（40μg/ml，Sigma）、ウシ膵臓インスリン（10μg/ml）、ヒトトランスフェリン(200μg/ml)、ヒト組変えトロンボポエチン(50ng/ml，R＆D System)、ヒト組変え幹細胞因子(50ng/ml，R＆D System)およびヒト組換えIL-3(10ng/ml，R＆D System)および1.1mg/mlコラーゲンを含むイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM;GIBCO)中でインキュベートする。CD34＋細胞を２ウェルチャンバスライド上で3300細胞/mlの最終濃度でプレーティングする。細胞を、５％CO２大気の加湿ボックス中で37℃で12日間インキュベートし、１：３のメタノール：アセトン溶液を用いて直接培養ウェルに固定し、モノクローナル抗体である抗-GPIIb/IIIa (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)でインキュベートする。免疫反応系を、ビオチン結合型ヤギ抗マウスＩｇＧ、続いてアビジン−アルカリフォスファターゼ結合体を用いて発色させ、桃色により同定し、100倍の倍率で倒立位相差顕微鏡を用いてカウントする。結果を１ウェルあたりの巨核球の平均数＋／−平均値(SEM)の標準偏差で表す。
Ｂ．ヒト造血前駆細胞に対するIL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチドの増殖/分化活性
ヒト骨髄CD34＋細胞(Poietic, BioWhittaker由来)を、0.9％メチルセルロース、２mMグルタミン、2-メルカプトエタノール（10-4Ｍ）、１％ウシ血清アルブミン、ウシ膵臓インスリン（10μg/ml）、ヒトトランスフェリン(200μg/ml)および種々の濃度のヒト幹細胞因子(IL-3、EPOおよびGM-CSF)を補充したイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM;GIBCO)中でインキュベートする。CD34+細胞を35mmディッシュに最終濃度1000細胞/mlでプレーティングする。細胞を37℃で14〜16日間、大気中５％CO2でインキュベートする。コロニーを倒立顕微鏡下でスコアする。試験ポリペプチド(例えば、IL-22、IL-19、IL-24ポリペプチド)(200ng/ml)での処理により、コロニーサイズの増加が生じうる。
Ｃ．骨髄液体培養物に関するアッセイ
CD34＋ヒト骨髄細胞はPoietic, BioWhittakerから購入し、30％ウシ胎仔血清、抗生物質、2mMグルタミン、2-メルカプトエタノール(10-4M)および種々の濃度のヒト幹細胞因子(IL-3、EPOおよびGM-CSF)を補充したイスコブ改変ダルベッコ培地(IMDM;GIBCO)中でインキュベートする。CD34＋細胞を、蒸発を防止するために通気性シールメンブレンを用いて、5000細胞/ウェルでＵ底96ウェルプレートにプレーティングし、37℃、５％C02で10日間培養する。栄養補充(feeding)は、４および７日目に培地の80％を新しい培地で交換することにより行う。10日目に細胞をＶ底プレートに移し、CD41(FITC)およびCD36(PE)について染色する。次いで、細胞を、フローサイトメトリーで一定時刻捕捉モード(timed acquisition mode)で捕捉し、ネガティブコントロールと比較する。試験ポリペプチド(例えば、IL-19、IL-22またはIL-24ポリペプチド)(200 ng/ml)を用いての処理により、CD34＋細胞の増殖を刺激することができる。
実施例３：造血モジュレーターに関するインビボ試験
Ａ．骨髄移植の後の血液細胞の回復
RPMI培地（10％ウシ胎仔血清含有）を用いて正常８〜10週齢Balb-Cマウス（Harlan Sprague Dawley）の後足を穏やかに洗浄することにより骨髄を回収した。いくつかの実験に関して、ドナーマウスを、ＢＭの回収前に３日間、５−フルオロウラシル(5-FU)(150mg/体重1kg)で腹膜内注入して注射用に予備処理する。10.8Gy(126cGy/分で137Cs、投薬間隔最短３時間での分割投薬）での全身照射の後、致死量未満で照射したマウスに１×106骨髄細胞を静脈内注射する。試験ポリペプチド(250μg/体重１kg)をPBSで希釈し、毎日0.2ml容量を皮下注射する（これは照射およびドナー骨髄細胞の注入と同日から開始する）。コントロールマウスには同体積のPBSを投与する。移植後の期間の間、マウスを２〜４日ごとに秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの造血分析を、眼窩採血で、CDC HemavetTM機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてWright-Giemsaで染色し、分化分析に関して100倍で試験する。末梢血ヘマトクリットは、Model MB Micro-Capillary Centrifugeを用いてキャピラリーチューブを５分間スピンさせることにより行なう。従って、試験ポリペプチドを用いて抹消血液細胞カウントの回復を加速することができる。
Ｂ．化学／放射線療法併用後の血液細胞の回復
８〜10週齢のBalb/Cマウス(Harlan Sprague Dawley)に、5-フルオロウラシル(150mg／体重1kg)を腹膜内投与した後、３日後に致死量未満の照射（20〜22mgのマウスに対して0.6Gy全身照射）を行なう。試験ポリペプチドを、毎日0.2mlの体積で皮下注射する（これは照射と同日に開始する）。ネガティブコントロールマウスには処置マウスと同体積のPBSを投与する。試験ポリペプチド投与は14日間続ける。マウスを、照射後７日目および14日目にに分析する。照射後の期間の間、マウスを２〜４日毎に秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの血液分析を、眼窩採血で、CDC HemavetTM機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてWright-Giemsaで染色し、分化分析に関して100倍で試験する。末梢血ヘマトクリットは、Model MB Micro-Capillary Centrifugeでキャピラリーチューブを５分間スピンさせることにより行なう。試験ポリペプチドは、化学および／または放射線療法後の抹消血液細胞カウントの回復の加速に有用であり得る。
Ｃ．貧血の処置
貧血および造血性障害の種々の動物モデルは当該分野において公知であり、通常、貧血病態の指標であると受け入れられている。例えば、前低酸素性赤血球増加症(exhypoxic polycythemic)マウスバイオアッセイを用いて、外来的に投与した試験サンプルに対する反応でのマウスにおける赤血球生成の上昇の指標として、新規に合成された赤血球細胞への５’Fe(鉄)の取込を定量することができる。このアッセイは、WO/0024893(本明細書中に参照して組み込む)に記載されている。
試験薬剤は任意の種々の投与経路（例えば、i.v.、s.c.、i.p.またはミニポンプまたはカニューレによる）により投与することができ、適切な試験動物としては、実施例１の記載と同様に正常マウスならびにIL-19、IL-22またはIL-24トランスジェニックマウスが挙げられる。これらの処置に対する非特異的効果についてのコントロールは、類似の組成のビヒクルを活性薬剤有りまたは無しで用いて、同じタイプの動物で同じパラメーターをモニターすることにより行なう。
実施例４：混合リンパ球反応系でのIL-19、IL-22またはIL-24脾細胞の増殖
混合リンパ球反応アッセイにおいて、マイトマイシンＣで処理した後にDBA/2マウス(Harlan Sprague Dawley)由来の脾細胞を刺激細胞として用いることができる。応答細胞は、IL-19、IL-22またはIL-24遺伝子で移植したC57BL/6マウス(Harlan Sprague Dawley)またはネイティブなマウスから単離した脾細胞である。応答Ｔ細胞の懸濁液を同種刺激リンパ球と共に培養する。活性化刺激は、同種刺激細胞で発現させた外来性組織適合性抗原（通常、MHCクラスＩまたはクラスII分子）である。
簡単に説明すると、DBA/2由来の脾細胞をRPMI＋10％FBSおよびPen/Strep中で96-ウェルプレートに１×10６細胞／ウェルで加える。年齢が適合するC57BL/6ネイティブマウスまたはレトロウィルス発現型IL-19、IL-22またはIL-24マウスのいずれか由来の脾細胞を、0.5、１、２、４または８×105細胞／ウェルのいずれかで応答細胞としてウェルに加える。コントロールウェルは、DBA刺激脾細胞単独、またはC57BL/6応答脾細胞単独を含有した。インビトロで72時間後、ウェルをトリチル化チミジン１μＣｉでパルス標識する。１８時間後、細胞を回収し、カウントする。
実施例５：抗原性刺激の際にIL-19、IL-22またはIL-24を発現する脾細胞の増殖およびサイトカイン分泌
平底96ウェルプレートを５μg/mlα-CD3を含む100μl培地（RPMI,10％FBS）でコーティングする。プレートを1.5時間、37℃でコーティングし、吸引し、PBSで２回洗浄する。次いで、４×105脾細胞を培地体積100μl中で各ウェルに加え、プレートを37℃で48時間、インキュベートする。プレートを1200rpmで５分間遠心分離した後、各ウェルから上清100μlを取り出し、96ウェルＵ底プレートに移し、そのうちの10μlを標準的な手順に従ってサイトカイン分泌イムノアッセイに用いる。細胞の残りを１μCiの3H-チミジン／ウェルでパルス標識し、計測前にさらに24時間インキュベートする。抗-CD3による脾細胞の活性化に加えて、他の刺激を同じ様式で試験することができる。試験用の好ましい刺激としては、IL-2(2.5ng/ml)の希釈物、ConA(8μg/ml)の希釈物、PMAの１μＭイオノマイシン(ionomycin)での希釈物、およびLPS(100μg/ml)が挙げられる。
実施例６：トランスジェニックマウスの致死量未満の用量での放射線への暴露
両方の性別の野生型およびトランスジェニックマウスを600cGyで照射する。マウスを、照射後3、7、10および14日目に分析する。マウスを照射後の期間に２日毎に秤量する。白血球細胞カウントおよび血小板カウントの血液分析を、眼窩採血で、CDC MascotTM機械で行なう。血液塗沫を、標準的な方法を用いてWright-Giemsaで染色し、分化分析に関して100倍で試験する。抹消血ヘマトクリットは、Model MB Micro-Capillary Centrifugeを用いてキャピラリーチューブを５分間スピンさせることにより行なう。致死量未満の用量での放射線に対する照射後に、IL-19、IL-22またはIL-24を用いて抹消血液細胞カウントの回復を加速することができる。
参考文献
1. Dumoutier, L.ら、J. Immunology. (2001). 167: 3545-3549。
2. KyteおよびDoolittle. 1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132。
3. Dumoutierら、Genes and Immunity (2000). 1: 488-494。
4. Sambrookら、Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 第２版、14章(1989)。
5. SmithおよびWaterman, J. Mol. Biol. (1985). 147: 195。
6. Altschulら、J. Mol. Biol. (1990). 215: 403。
7. M. J. Gaitら、Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, (1984)。
8. Fox and Solter, Mol. Cell. Biol. (1988). 8: 5470。
9. Hokom, M. H. , Choi, E. , Nichol, J. L., Hornkohl, A. , ArakawaおよびHunt, Molecular Biology of Haematopoiesis (1994). 3：15。
ヒトIL-19をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号１)。 ヒトIL-19のアミノ酸配列を下線を付したシグナル配列と共に示す(配列番号２)。約25〜177のアミノ酸はIL-19の成熟形態を示す。 ヒトIL-22をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号３)。 ヒトIL-22のアミノ酸配列を下線を付したシグナル配列と共に示す (配列番号４)。約28〜179のアミノ酸はIL-22の成熟形態を示す。 ヒトIL-24をコードするヌクレオチド配列を示す(配列番号５)。 ヒトIL-24のアミノ酸配列を下線を付したシグナル配列と共に示す(配列番号６）。約26〜206のアミノ酸配列は、IL-24の成熟形態を示す。
【配列表】
Figure 2005519986
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Figure 2005519986
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Figure 2005519986
Figure 2005519986

Claims (20)

  1. １つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を増加させることを必要とする哺乳動物の１つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を増加させる方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを治療上有効な量で投与することを含む方法。
  2. １つ以上のタイプの成熟造血細胞の数を増加させることを必要とする哺乳動物の１つ以上のタイプの成熟造血細胞の数を増加させる方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを治療上有効な量で投与することを含む方法。
  3. 成熟造血細胞のタイプが、赤血球、顆粒球、単球および血小板からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 成熟造血細胞が赤血球である、請求項２に記載の方法。
  5. ヘマトクリットを増加させることを必要とする哺乳動物のヘマトクリットを増加させる方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを治療上有効な量で投与することを含む方法。
  6. 少なくとも１つの追加の造血サイトカインを治療上有効な量で投与することも含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドよりも前に、同時に、または後に造血サイトカインを投与する方法。
  7. 少なくとも１つの追加の造血サイトカインが、Epo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. １つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を減少させることを必要とする哺乳動物の１つ以上のタイプの造血前駆細胞の数を減少させる方法であって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体を治療上有効な量で投与することを含む方法。
  9. 哺乳動物における造血障害を治療または予防する処置を必要とする哺乳動物に配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを少なくとも１つ治療上有効な量で含む医薬組成物を投与することを含む方法。
  10. 少なくとも１つの追加の造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を哺乳動物に投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの投与よりも前に、同時に、または後に造血サイトカインを投与する、請求項１０に記載の方法。
  12. 造血サイトカインがEpo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
  13. 配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む組成物が追加の造血サイトカインをも含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 哺乳動物における造血性障害の治療または予防方法であって、そのような処置を必要とする哺乳動物に、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを治療上有効な量で含有する医薬組成物を投与することを含む方法。
  15. 少なくとも１つの追加の造血サイトカインを治療上有効な量で含有する医薬組成物を哺乳動物に投与することをも含む、請求項１４に記載の方法。
  16. ＬＰ８２ポリペプチドの投与よりも前に、同時にまたは後に造血サイトカインを投与する、請求項１５に記載の方法。
  17. 追加の造血サイトカインがEpo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
  18. 造血前駆細胞刺激量の配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２の約25位から177位のアミノ酸、配列番号４の約28位から179位のアミノ酸および配列番号６の約26位から206位のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと、製薬上許容されるキャリア、希釈剤または賦形剤とを含有する医薬組成物。
  19. 少なくとも１つの追加の造血サイトカインをも含有する、請求項１８に記載の医薬組成物。
  20. 少なくとも１つの追加の造血サイトカインがEpo、TPO、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-11、G-CSF、GM-CSF、M-CSFおよびSCFからなる群から選択される、請求項１８に記載の医薬組成物。

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