JP2005519902A

JP2005519902A - 慢性的移植片拒絶反応の治療と予防のためのＴＧＦ−β拮抗薬の使用

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Publication number: JP2005519902A
Application number: JP2003561533A
Authority: JP
Inventors: シャフケシャブジー; ジョージシュディスエイ．セント; ミンギャオリュー
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2002-01-22
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2023-01-21
Also published as: US20090263389A1; AU2003209308A1; WO2003061587A2; US20030180301A1; EP1478354A2; JP4564261B2; CA2473829A1; WO2003061587A3; BRPI0307070A2; EP1478354A4

Abstract

移植片機能の損失を治療または予防するためのTGF-β拮抗薬の有効な使用が記載される。TGF-β拮抗薬の使用が、TGF-β介在性線維増殖を特徴とする慢性的拒絶反応に起因する宿主における臓器機能の損失を有効に防止することが示される。組換え受容体、即ちTGF-βIII型受容体（TGFBIIIR）の形をとったインサイチューでのTGF-β拮抗薬の発現は、ラット肺移植モデルの未処理対照と比較して閉塞性細気管支炎を防止することが示された。これにより、ヒト宿主を含む脊椎動物宿主において、肺、腎臓、肝臓、および心臓のような移植臓器の慢性的拒絶反応を予防または阻害する有効な方法が提供される。

Description

発明の分野
本発明は、分子生物学および臓器移植の分野における発明である。本発明はTGF-βの有効な阻害剤の使用による、移植された臓器または組織の拒絶反応を治療または予防する新規な方法に向けられる。

発明の背景
臓器移植は疾患または傷害に起因する臓器機能の損失に直面した患者に重要な治療になっている。米国では、例えば、1997年1月から1998年12月の間に（即ち、完全な3年の追跡統計のある最も最近の期間）、1600件を超す肺移植、4000件を超す心臓移植、7000件を超す肝臓移植、400件を超す膵臓移植、および22000件を超す腎臓移植が行われた。

ヒト宿主における心臓、肺、腎臓、膵臓、および肝臓の同種移植は一般的であり、特にブタまたはサルの臓器のヒトへの異種移植には期待できる結果を示すものもある。すべての種類の同種移植の1ヶ月の成功率は90%を超すが、移植片の1年間の生存率は著しく低く、腎臓以外のすべての臓器についての3年間の生存率は74%以下（腎臓移植片の生存率は79%）である。United Network for Organ Sharing（UNOS）2001年統計参照。

臓器移植の成功は移植片拒絶反応の回避に依存する。移植片拒絶反応の種類は、その時間枠および組織学によって臨床的に分類されている。激症拒絶反応は移植後、数分から数時間内で起き、急性拒絶反応は通常1〜30日以内に起き、慢性拒絶反応はその後数ヶ月から数年にわたることがある。激症拒絶反応と急性拒絶反応はドナーの臓器および宿主間の組織適合性の様々な程度の欠落によって促進される、ドナーの臓器への免疫的攻撃の結果であると広く理解されている。免疫抑制は急性拒絶反応の克服に時には成功し、シクロスポリンAのような免疫抑制剤の使用は移植片レシピエントでほぼ普遍的である。

激症拒絶反応と急性拒絶反応は、免疫抑制プロトコールで抑制されるが、慢性拒絶反応の治療は十分に定義されていない。急性拒絶反応および慢性拒絶反応は、免疫応答として顕著に異なる特性を有すると理解されている。慢性拒絶反応は経時的に起き、通常宿主が移植後に受ける延長した傷の治癒過程の結果である。それは宿主の複数の因子と過程を含み、移植片を救う時間枠でこれを検出し治療することが困難な場合がある。

殆どの臓器で、拒絶反応が起きていることを示す最も確実な方法は、その臓器の生検による。しかし、実際上の理由から生検は必ずしも行われるわけではなく、慢性的拒絶反応が疑われる場合には特に実際的でない。移植片臓器の慢性的拒絶反応は、一般的にレシピエントまたは宿主において臓器がその機能を開始した後の臓器不全として特徴づけられる。従って、一般的に慢性的拒絶反応はもしもそれが阻止されない場合に臓器不全、感染、および臓器組織の壊死に至る臓器機能の低下によってモニターされる。慢性的拒絶反応は一般に、コラーゲン、フィブロネクチン、およびエラスチンのような細胞外マトリックスタンパク質の広範な沈着によって特徴づけられる病原性線維症、ならびに筋線維芽細胞表現型を有する細胞の出現によって同定されるが、一般に移植片を救うことができる治療は手遅れである。線維症は、線維形成による臓器の微細構造の障害、または臓器機能に対して開いたままであることが必要である経路の遮断が観察される慢性的拒絶反応を特徴とする証拠となる。

最近の研究は、慢性的拒絶反応の機構を複数の相互に関連した炎症カスケードの存在およびこの免疫応答の複雑性に重点を置いて調査した。傷の治癒および慢性的拒絶反応に関与する過程は複雑であり、かつ慢性的拒絶反応との多くの正の相関が存在することが見出されている。例えば、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-2、およびグランザイムBのような調節分子および細胞毒性分子は全て拒絶反応発症においてアップレギュレートされ（Suthanthiran M., 1997, F.Kidney Int. Suppl., 58:S15-21参照）、ヒト移植片手術で遍在するシクロスポリンAもまた線維症に関係している（例えばCuhaciら、1999, Transplantation, 68(6):785-90参照）。その結果、慢性的拒絶反応の予防または治療の単一治療は、一部、慢性的拒絶反応に関与する細胞機構の複雑性のために排除された。

激症移植片拒絶反応および急性移植片拒絶反応の治療および予防において、重要な改善がなされているが、殆どの移植片、即ち移植組織は最終的に慢性的拒絶反応をもたらす。これは、これらの過程を推進する機構についての本発明者らの知識の範囲を反映している。現在の治療プロトコールまたは薬物が、慢性的拒絶反応を効果的に制御、または慢性的拒絶反応を決定する免疫学的因子を調節することは未だ証明されていない。従って、慢性的拒絶反応における単一の因子または少数の因子の阻害または制御が移植片の慢性的拒絶反応に影響するか否かを決定する必要性が当技術分野において存在する。

発明の概要
本発明者らは、線維症があらゆる型の臓器移植片の慢性拒絶反応における共通の因子であること、およびTGF-βが線維症による慢性拒絶反応において上昇することが多い（他の多くの因子と共に）ことに注目した。例えば、肺移植において、移植後のTGF-βのアップレギュレーションに相関する線維増殖は閉塞性細気管支炎として知られている小気道の線維性破壊につながる（例えば、Charpinら、Transplantation, 65(5): 752-755; El-Gamelら、1998, Eur. J. Cardiothorac. Surg., 13(4): 424-30参照)；腎移植では、腎移植片機能の低下につながる管状間隙（tubulointerstitium）の線維症がTGF-βの発現の増加および尿中へのTGF-βの分泌に相関した（例えば、Cuhaciら、1999, Transplantation, 68(6): 785-790; Boratynska, 1999, Ann. Transplant., 4(2): 23-28)；心臓移植では、総TGF-βおよび内因性TGF-βの発現（mRNA）がアテローム性動脈硬化の急速な進展に相関する例がみられる（Littleら、1999, Transpl. Int, 12(6): 393-401)；ならびに肝臓再生では、TGF-βは肝細胞増殖の阻害剤であり、かつ慢性肝疾患で線維症を誘発すると考えられている（例えば、Faustoら、1991, Ciba Found. Symp., 157: 165-174; Discussion 174-7）。

TGF-βは、ショウジョウバエおよびヒトのような広範な生物における、発生および組織の恒常性を制御するタンパク質のスーパーファミリーのメンバーである（Grande, 1997, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 214(1): 27-40)。TGF-βは、ミトコンドリアにおけるエネルギー産生、血管緊張の調節、細胞の分化、増殖、およびアポトーシスを含む多様な生物学的過程で機能している。TGF-βは、傷の治癒に関連した細胞外マトリックス生成の活性化を担うサイトカインとして最もよく知られている。TGF-βの細胞増殖への影響は複雑で、TGF-βの活性化を誘導、または傷の治癒および組織再生を誘発する機構については未だ殆ど知られていない。

本発明者らは、TGF-β単独の阻害、即ちTGF-βの拮抗薬の導入が移植臓器の慢性的拒絶反応の阻害に有用であることを見出した。これは線維増殖に伴う慢性的拒絶反応がTGF-β機能の直接の阻害剤を使用して阻害可能となることの最初の証明である。

TGF-βは、創傷修復に関連する、細胞外マトリックス生成の活性化を担うサイトカインとして最もよく知られており、特に線維症に関する研究の最初の線維形成誘導性サイトカインとして留まるが、TGF-βは遍在性であり、かつ多様な生物学的機能を示す。本発明は、TGF-βが肺、腎臓、心臓、膵臓、および肝臓の移植片を含む移植された臓器の慢性的拒絶反応において重要な役割を果たすことを教示し、TGF-β拮抗薬が移植片機能の損失を防ぐ有効な治療薬として作用することを証明している。

従って、本発明の目的は、慢性的拒絶反応に感受性があるか、または慢性的拒絶反応の症状を示す個体に、TGF-β拮抗薬の薬学的有効量を投与することを含む移植片臓器の慢性的拒絶反応の治療および予防の方法を提供することである。

関連した態様において、本発明は移植片拒絶反応を予防または遅延するために移植片レシピエントを治療する薬学的組成物の調製におけるTGF-β拮抗薬の使用を提供する。

本発明は更に、宿主（レシピエント）哺乳動物において移植片機能を維持、または移植片機能の損失を遅延、停止、予防、または逆転するためのTGF-β拮抗薬の使用に関する。本発明の好ましい態様は、望ましい移植片臓器機能レベルを維持および調節するために、または移植片中の線維症を減少、または阻害するためにTGF-β拮抗薬の薬学的有効量を投与することを含む。

本発明のTGF-β拮抗薬は、移植片臓器内または移植片レシピエント内のいずれかで、TGF-βの量または活性を減少させることが可能な任意の分子を含む。本発明のTGF-β拮抗薬はまた、TGF-βの量または活性を減少させることが可能な分子をコードしている任意の核酸配列も含む。好ましくは、TGF-β拮抗薬は、TGF-βの1つまたは複数のアイソフォーム（isoform）に対する抗体；TGF-β受容体およびTGF-βに結合するその可溶性断片；TGF-β受容体に対する抗体；潜伏関連ペプチド；大きな潜伏性TGF-β；フェチュイン（fetuin）、デコリン（decorin）、バイグリカン（biglycan）、フィブロモジュリン（fibromodulin）、ルミカン（lumican）、およびエンドグリン（endoglin）のようなTGF-β阻害プロテオグリカン；ソマトスタチン；マンノース−6−ホスフェート；マンノース−1−ホスフェート；プロラクチン；インスリン様成長因子II；IP−10；arg-gly-aspトリペプチドおよびこのトリペプチドを含むペプチド；植物、真菌、または細菌からのTGF-β阻害抽出物；TGF-β遺伝子の転写または翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド；およびSMAD、MAD、Ski、Snoを含むTGF-βシグナル伝達に関与するタンパク質；ならびに上に特定したTGF-βの活性を阻害する能力を保持した分子の任意の変異体、断片、または誘導体を含む。より好ましくは、TGF-β拮抗薬は、その受容体（またはF(ab)₂断片、Fv断片、一本鎖抗体、およびTGF-βへ結合する能力を保持した抗体の他の形態または断片）へのTGF-βの結合を遮断するヒトのまたはヒト化されたモノクロナール抗体である。好ましいモノクロナール抗体はハイブリドーマID11.16 (ATCCアクセッション番号HB 9849)から得られたネズミのモノクロナール抗体のヒトまたはヒト化された形態である。他の好ましいTGF-β機能の阻害剤は、可溶性TGF-β受容体、特に例えばTGFBIIRまたはTGFBIIIRの細胞外ドメイン、最も好ましくは組換え可溶性TGF-β受容体（rsTGFBIIRまたはrsTGFBIIIR）を含むTGF-βII型受容体（TGFBIIR）またはTGF-βIII型受容体（TGFBIIIRまたはβグリカン）である。可溶性TGF-β受容体のようなポリペプチド阻害剤は、本明細書に示すように遺伝子移入を介して効果的に導入してもよい。

発明の詳細な説明
本明細書の開示は、TGF-β介在線維増殖による移植片臓器の慢性的破壊を遮断するためのTGF-β拮抗薬の有効な使用を記載する最初の報告である。本明細書に示されたように、TGF-β拮抗薬は移植片機能の損失を予防および低減するのに有用である。本明細書において、移植臓器の慢性的拒絶反応が、TGF-β活性を直接阻害するTGF-β拮抗薬の投与によって阻止できることが始めて実証された。従って、本発明は、移植臓器、特に肺、心臓、腎臓、膵臓、および肝臓の同種移植の慢性的拒絶反応を予防または遅延する方法を提供する。本発明は、慢性的拒絶反応の主要指標であるが、通常移植片の拒絶反応または不全が避けられない場合に検出される指標である、移植片組織における破壊性線維症を阻止する方法を提供する。

本発明は、移植片を受けた個体に、TGF-β拮抗薬の薬学的有効量を投与することを含む、線維症に関連した移植片の拒絶反応の治療および予防の方法に向けられている。本発明はまた、移植片臓器の慢性的拒絶反応の治療または遅延に有用な薬学的組成物の調製にTGF-β拮抗薬を使用することにも向けられている。特定の態様において、本方法および組成物は移植された肺、心臓、膵臓、腎臓、もしくは肝臓、または線維症もしくはTGF-βが介在する慢性的拒絶反応に感受性である、任意の他の移植可能な臓器または組織の慢性的拒絶反応の治療または遅延に有用である。

慢性的拒絶反応は特定の臓器に特徴的なある範囲の特異的な障害から起きる。例えば、肺移植では、そのような障害には気道（閉塞性細気管支炎）の線維増殖性破壊が含まれる；心臓移植または弁の交換のような心臓組織の移植では、そのような障害にはアテローム性動脈硬化症が含まれる；腎臓移植では、そのような障害には閉塞性腎炎、腎硬化症、尿細管間質性腎障害が含まれる；肝臓移植では、そのような障害には総胆管症候群の消失が含まれる。

本明細書に用いられているように、「移植片」という用語は名詞として使用される場合、ドナー個体からの臓器全体（肺、腎臓、心臓、肝臓など）、またはレシピエント個体（宿主）に移植するためにドナーから切除される臓器の機能的一部（ドナーの肝臓の葉、心臓の弁、動脈または静脈の切片、皮膚移植片）を意味する。「移植片」はレシピエントに異物であり、かつ本発明の目的のために、慢性的拒絶反応による不全に対して感受性である任意の移植片、組織、または細胞を意味してもよい。同種移植片はレシピエントと同じ種であるドナーから切除された移植片であり、異種移植片はレシピエントと異なる種であるドナーから切除された移植片である。

本明細書に用いられているように、「移植片の慢性的拒絶反応の治療または遅延」への言及、は一般的に移植片機能を遅らせる、停止（最初の発症を停止させることを含む）する、または移植片機能の損失を逆転させるために機能する任意の過程を意味する。そのような治療は慢性的拒絶反応の症状が現れる前、またはそのような症状の発症後に投与してもよい。

本明細書に用いられているように、「移植片機能の損失」は、ドナー動物において臓器または組織が示す正常な過程の任意の生理学的混乱または機能不全を表す。本発明の目的に関して、移植された臓器の単なる物理的異常（線維症を含む）は、本質的に臓器機能不全または臓器の疾患もしくは障害とは考えない。移植片機能の損失は、特に臓器がドナーで正常に行う過程の減少を指す。例えば、腎移植において、圧ろ過、選択的再吸収、または尿細管分泌の減少は、骨髄低灌流；低酸素尿細管傷害、尿細管壊死、タンパク質円柱の形成、および尿細管閉塞、または尿細管の流れを低下させる症状の発現を含む骨髄低酸素症；ならびに虚血および他の直細動脈傷害のような骨髄血流を減少させる症状の発現と同様、腎機能の損失を示す。

本明細書に用いられているように、「組換え」という用語は、単離したDNAの操作および宿主細胞の形質転換によって、人工的に変化させた、または操作された核酸、外因性（変性）核酸、もしくは人工的に発現させたポリペプチドでトランスフェクトされた宿主細胞を記載するために用いられる。組換えは、遺伝子工学技術を用いてインビボで組み立てられたDNA分子を特別に包含する用語であり、分子、構造物、ベクター、細胞、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを記載するための「組換え」という用語の形容詞としての使用は、特に天然に存在するそのような分子、構造物、ベクター、細胞、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを除外する。タンパク質の「組換え発現」は宿主細胞中の人工の組換え遺伝子の発現だけでなく、組換え手段による、天然に存在する遺伝子配列のインサイチューでの活性化を含む。

本明細書に用いられているように、「薬学的組成物」は薬学的に有効な量の1つまたは複数の活性成分（例えば、TGF拮抗薬）を1つまたは複数の薬学的担体および／または添加剤と併用して含む任意の組成物を表す。薬学的組成物に有用な適した薬学的担体および／または添加剤、ならびに剤形、処方、およびそのような組成物の用量の決定は、当業者が十分行える範囲内である（例えば、Remington's Pharmacetical Sciences, Mack Publishing社参照）。担体および／または添加剤は賦形剤、崩壊剤、結合剤、増量剤、潤滑剤、水性媒体、油性媒体、分散剤、保存剤、ならびに等張化剤、緩衝剤、可溶化剤、平滑化剤、および／または安定化剤を含んでも良いがこれらに限定されない。本発明の薬学的組成物中の活性成分の割合は、当業者によって、例えば、特に移植宿主、移植宿主の年令および体重、移植宿主の臨床状態、投与時間、剤形、投与方法、ならびに活性化合物の組み合わせに基づいて適切に決定できる。本発明の薬学的組成物は毒性が低いことが好ましく、かつ脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて安全に使用可能である。

本明細書に用いられているように、「薬学的有効量」は、被験者において所望の生理学的結果を達成するために有効な量である。特に、TGF-β拮抗薬の薬学的有効量は、移植片機能の損失に関連した病理的過程の1つまたは複数を改善するのに十分な期間の間、TGF-βの量または活性を低下するのに十分な量である。有効量は選択された特定のTGF-β拮抗薬に依存して変化し、また治療すべき被験者に関連した様々な因子および状態ならびに障害の重症度（例えば、年令、体重、および患者の健康、ならびに用量反応曲線および毒性データ）にも依存する。ある所与の薬剤に対する薬学的有効量の決定は、当業者が十分行える範囲内である。

移植宿主への「投与」はいかなる特定の送達系にも限定されず、非経口的（皮下、静脈内、骨髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注入を含む）、直腸、局所、経皮、または経口（例えば、カプセル、懸濁液、または錠剤）を非制限的に含んでよい。宿主への投与は単回用量または反復投与で行うことができ、任意の様々な生理学的に許容できる塩の形態で、および／または薬学的組成物（先述）の一部として許容できる薬学的担体および／または添加剤と共に行うことができる。繰り返すが、生理学的に許容できる塩の形態および標準的な薬学的処方技術は当業者に周知である（例えば、Remington's Pharnmaceutical Sciences, Mack Publishing社）。TGF-β拮抗薬の宿主個体への投与は、拮抗薬をコードしている核酸配列をインビボで患者（宿主）に投与するか、またはインビトロで細胞に投与後、患者に導入し、その後、拮抗薬が核酸配列でコードされた産物のインサイチューでの発現によって産生される、遺伝子の転移によって行われる。TGF-β拮抗薬を送達する遺伝子治療の方法は、当業者に周知である（例えば、国際公開公報第96/25178号参照、また以下の実施例1〜5参照）

本明細書に用いられているように、「宿主」は脊椎動物ドナーから移植された臓器または組織の、任意の脊椎動物レシピエントを指す。ドナーおよび宿主は同種または異種であってよい。「宿主」および「レシピエント」という用語は互換的に用いることができる。

本明細書に用いられているように、「TGF-β」はTGF-βのすべてのアイソフォームを指す。TGF-βは現在5つのアイソフォーム（1〜5）が知られており、それらのすべては相同（60〜80 %の同一性）であり、それらのすべては約25 kDのホモダイマーを形成し、共通のTGF-β細胞受容体（I，II，III型）に作用する。TGF-βの遺伝子生物学および分子生物学は当技術分野で周知である（例えば、Roberts, 1998, Miner.Electrolyte and Metab., 24(2-3): 111-119; Wrana, 1998, Miner.Electrolyte and Metab., 24(2-3): 120-130参照）。

本明細書に用いられているように、「TGF-β拮抗薬」は、細胞内または生理学的系内のいづれかにおいて、TGF-βの量または活性を減少させることが可能な任意の分子である。TGF-β拮抗薬は、TGF-β1、2、または3の量または活性を減少するように作用することが好ましい。例えば、TGF-β拮抗薬は転写、翻訳、プロセシング、または輸送のレベルで、TGF-βの発現を阻害する分子であってよく、TGF-βの安定性または前駆分子の活性、成熟した形への変換に影響してもよく、TGF-βが1つまたは複数の細胞受容体（I、II、またはIII型）に結合する能力に影響してもよく、またはTGF-βのシグナル伝達に干渉してもよい。

多様なTGF-β拮抗薬と、それらの製造方法が当技術分野において公知であり、更に多くの方法が現在開発中である（例えば、Dennisら、米国特許第5,821,227号参照）。採用されている特異的なTGF-β拮抗薬は特徴を制限するものではなく、本明細書に定義されている任意の有効なTGF-β拮抗薬は、本発明の方法および組成物に有用である。好ましくはTGF-β拮抗薬は、TGF-β1、TGF-β2またはTGF-β3の拮抗薬であり、最も好ましくはTGF-β1の拮抗薬である。

TGF-β拮抗薬の例には、TGF-βの1つまたは複数のアイソフォームに向けられたモノクロナール抗体およびポリクロナール抗体（Daschら、米国特許第5,571,714号；国際公開公報第97/13844号および国際公開公報第00/66631号も参照）；TGF-β受容体、そのような受容体の可溶型（好ましくは可溶性TGF-βIII型受容体）またはTGF-β受容体に向けられた抗体（Segariniら、米国特許第5,693,607号; Linら、米国特許第6,001,969号、米国特許第6,010,872号、米国特許第6,086,867号、米国特許第6,201,108号；国際公開公報第98/48024号；国際公開公報第95/10610号；国際公開公報第93/09228号；国際公開公報第92/00330号）; 潜伏関連ペプチド（国際公開公報第91/08291号）; 大きな潜伏性 TGF-β(国際公開公報第94/09812号)；フェチュリン（米国特許第5,821,227号）；デコリンならびにバイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンのような他のプロテオグリカン（国際公開公報第91/10727号；Ruoslahtiら、米国特許第5,654,270号、米国特許第5,705,609号、米国特許第5,726,149号；Border、米国特許第5,824,655号；国際公開公報第91/04748号；Letarteら、米国特許第5,830,847号、米国特許第6,015,693号；国際公開公報第91/10727号；国際公開公報第93/09800号；および国際公開公報第94/10187号）；ソマトスタチン（国際公開公報第98/08529号）；マンノース‐6‐ホスフェートまたはマンノース‐1‐ホスフェート（Ferguson, 米国特許第5,520,926号）；プロラクチン（国際公開公報第97/40848号）；インスリン様成長因子II（国際公開公報第98/17304号）；IP-10（国際公開公報第97/00691号）；arg-gly-asp含有ペプチド（Pfeffer, 米国特許第5,958,411号；国際公開公報第93/10808号）；植物、真菌、およびバクテリアの抽出物（EP-A-813 875；JP 8119984；およびMatsunagaら、米国特許第5,693,610号）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（Chung, 米国特許第5,683,988号；Fakhraiら、米国特許第5,772,995号；Dzau, 米国特許第5,821,234号；米国特許第5,869,462号；および国際公開公報第94/25588号）; SMADおよびMADを含むTGF-βのシグナル伝達に関与するタンパク質（EP-A-874-046；国際公開公報第97/31020号; 国際公開公報第97/38729号；国際公開公報第98/03663号；国際公開公報第98/07735号；国際公開公報第98/07849号；国際公開公報第98/45467号; 国際公開公報第98/53068号；国際公開公報第98/55512号：国際公開公報第98/56913号；国際公開公報第98/53830号；国際公開公報第99/50296号；Falb, 米国特許第5,834,248号；Falbら米国特許第5,807,708号; およびGimenoら、米国特許第5,948,639号）、Ski and Sno（Vogel, 1999, Science, 286: 665; およびStroscheinら、1999, Science, 286: 771-774）；ならびにTGF-βの活性を阻害する能力を有する上記に特定した分子の任意の変異体、断片、または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。

好ましい態様において、TGF-β拮抗薬は、そのTGF-βの受容体に対するTGF-βの結合を遮断するヒトもしくはヒト化されたモノクロナール抗体、またはF(ab)₂断片、Fv断片、一本鎖抗体およびTGF-βへの結合能を有する他の形態の「抗体」のようなその断片である。１つの態様では、TGF-β拮抗薬は、ファージディスプレイ（phage display）（国際公開公報第00/66631号）によって製造されたヒト抗体である。さらに好ましい態様において、そのモノクロナール抗体はヒトまたはハイブリドーマ1D11.16（Daschら、米国特許第5,783,185号に記載されたATCCアクセッション番号HB9849）から得られたネズミモノクロナール抗体のヒト化された種類である。

本発明のさらなる好ましい態様は、TGF-βの受容体または結合パートナー、好ましくは可溶性受容体または結合パートナーの発現に適したベクターの使用を含む。より好ましくは、可溶性TGF-β拮抗薬の投与は可溶性拮抗薬をコードしているcDNA、最も好ましくは、TGF-βII型（rsTGFBIIR）またはIII型受容体（rsTGFBIIIR）の細胞外ドメインをコードしているcDNAを含むベクターを使用する遺伝子移入によって実施され、そのベクターは、そのベクターでトランスフェクトされた臓器の細胞において、可溶性TGF-β拮抗薬のインサイチュー発現を起こすために、ドナーの臓器に、好ましくは局所的に投与される。そのようなインサイチュー発現はTGF-βの活性を阻害し、TGF-β介在線維形成を制限する。適した任意のベクターを使用してもよい。好ましいベクターには、遺伝子移入の目的で開発された、アデノウイルス、レンチウイルス、Epstein Barrウイルス（EBV）、アデノ関連ウイルス（AAV）およびレトロウイルスベクターが含まれる。例えば、Souza および Armentano, 1999, Biotechniques, 26: 502-508参照。TGF-β介在線維形成の阻害の使用に適したアデノウイルスベクターを下記の実施例で示す。他の遺伝子移入のベクターを使用しない方法、例えば脂質／DNA複合体、タンパク質／DNA結合体、裸のDNA移入法などを使用してもよい。

アデノウイルス遺伝子移入によって送達するために開発されたその他の適したTGF-β拮抗薬には、Ig Fcドメイン（Isakaら、1999, Kidney Int., 55: 465-475）に融合した、TGF-βII型受容体の細胞外ドメインをコードしているキメラcDNA、TGF-βII型受容体（Zhaoら、1998, Mech. Dev., 72: 89-100）のドメインネガティブ変異体のアデノウイルス遺伝子移入ベクター、およびTGF-β結合プロテオグリカン（Zhaoら、1999, Am. J. Physiol., 277: L412-L422）であるデコリンに対するアデノウイルス遺伝子移入ベクターを含むが、これらに限定されない。アデノウイルス介在遺伝子移入は、他の遺伝子送達法と比べて非常に効率が高い。しかし、治療法としてアデノウイルスベクターを使用するインビボ遺伝子移入は、炎症を誘導し、導入遺伝子発現の量および持続を制限し、かつ効果的な再トランスフェクションを防止する宿主の免疫応答によって制限されている。しかし、すべての移植患者において、宿主の免疫応答が一般に抑制されている本発明での使用には、移植免疫抑制は、アデノウイルス介在遺伝子トランスフェクションに対するトランスフェクション後の宿主の免疫応答を減弱し、それによって、導入遺伝子発現を増加および延長させる。宿主の免疫抑制はまた、アデノウイルスベクターによる有効な再トランスフェクションを可能にする。従って、移植の設定における遺伝子治療の臨床的応用は、TGF-β拮抗薬送達の好ましい様式である。

本発明に使用する適したTGF-β拮抗薬には、TGF-βの量または活性を抑制する能力が保たれている限り、前述のTGF-β拮抗薬の機能的変異体、変種、誘導体および類似体が含まれる。本明細書に使用されているように、「変異体、変種、誘導体、および類似体」は親化合物と類似の形状または構造を有する分子を指し、TGF-β拮抗薬として作用する能力を保持している分子を表す。例えば、本明細書に開示した任意のTGF-β拮抗薬は結晶化してもよく、有用な類似体を活性部位の形状に関係する位置に基づいて合理的に設計してもよい。あるいは、当業者は過度の実験を行なわずに既知の拮抗薬の官能基を修飾し、そのような修飾した分子を活性、半減期、生物学的利用率、または他の望ましい特性の増加についてスクリーニングしてもよい。TGF-β拮抗薬がポリペプチドである場合、送達の容易性、活性、半減期等（例えば、上述のようなヒト化抗体または機能性抗体断片）を増加させるために、ポリペプチドの断片および修飾を作製してもよい。合成および組換えポリペプチド産生における当技術分野のレベルから判断して、そのような修飾は過度の実験を行わずに達成できる可能性がある。当業者は、結晶構造および／または本明細書に記載したTGF-β阻害剤の活性部位の知識に基づいて、新規な阻害剤を設計してもよい。

TGF-β拮抗薬は、TGF-βの線維増殖性作用の遮断に有益であると決定された任意の時間に投与してもよい。投与は移植後が好ましい。あるいは、例えばトランスフェクションまたは他の手段によって宿主中に移植された組換え遺伝子の発現によって、特にTGF-β拮抗薬の生物学的利用率が遅延または誘導される投与系に対しては、投与は特に移植前または移植時に行うことができる。TGF-β拮抗薬の投与または発現は、移植臓器または組織の導入後のTGF-β濃度のピークに一致するのが最も好ましい。例えば、移植後の最初の週の間に、浸潤性TGF-β陽性リンパ球数の増加が観察されている。Boehlerら、1997, Transplantation, 64: 311-317。以下に示したデータでは、移植後7日目にTGF-β陽性浸潤細胞数の増加が確認され、これは、これらの細胞から産生されるTGF-βのピークである可能性を示唆している。TGF-β拮抗薬の投与は、例えば、気道腔、血管、腎尿細管等の移植片構造体でのTGF-β介在線維増殖および線維性沈着のその後の発症を最も効果的に中和するように、TGF-βの発現の最大時に最大量の拮抗薬を送達するように時間を調整することが好ましい。拮抗薬の投与のタイミングは拮抗薬の剤形に最も有利に合わせられると考えられる。例えば、本明細書に示したデータで、遺伝子移入法では導入遺伝子発現のピークに到達するのに24-28時間かかると言う以前の観察が確認され、従って、移植後5〜6日目に送達されたベクターは、浸潤TGF-β陽性細胞のピークと一致した導入遺伝子発現のピークを生じるように設計され、これによってTGF-βによって誘発される移植片線維症を最も効果的に阻害する。

TGF-β拮抗薬は上に概説したように、任意の適した方法で投与してもよく、投与様式は、使用する拮抗薬の種類または活性に合わせるのが好ましい。例えば、TGF-βをダウンレギュレートするTGF-β拮抗薬は、局所的または全身的に投与してもよいが、TGF-βに結合して細胞受容体へのその結合を遮断することによって働くTGF-β拮抗薬は、最大の効果を得るためには局所的に投与される（下記の実施例５参照）。本明細書に例示したアデノウイルス遺伝子移入を介する可溶性TGF-βIII型受容体の場合のような、可溶性TGF-β阻害剤が使用される好ましい態様において、移植片の部位での局所注入が線維増殖を予防するのに有効である。

本明細書に記載した本発明の組成物および方法の他の適した修飾および適合は明らかあり、これらを本明細書に開示した発明の範囲または態様から逸脱することなく行ってもよいことは当業者に容易に理解されると考えられる。本発明を詳細に説明したが、本発明は以下の実施例を参照してより明確に理解できると思われる。実施例は単に説明のために挙げたもので、本発明を制限することを意図したものではない。

実施例1
TGFB拮抗薬の遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの調製
ヒトTGF-βIII型可溶性受容体を、クローン番号7411（クローン番号7411はWhitehead InstituteのLodish/Weinberg labsから入手した）（Morenら、Biochem Biophys. Research Communication, 189:356-362 (1992)）から以下のプライマー

を用いてVent_R（商標）DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly,MA）によって増幅した。PCR産物は、1 %アガロースゲル上で分画し、2.2kb産物を精製し、Ecl136IIおよびXba Iで消化し、pAdQUICK（以前はpAd_vantageと呼ばれた）シャトルベクターpSV2-ICEU I（Genzyme社、 Cambridge, MA）のEcoR V-Xba I部位にクローニングした。組換えアデノウイルは、Souzaら、1999, Biotechniques, 26:502-8の図1に説明される多段階方式で作製した。この迅速なクローニング系は3つの段階を含む：1) 導入遺伝子をシャトルベクターpSV2-ICEU Iにクローニングする。2) 次いで、それをpSV2-Ceu Iから消化によって、ウイルスベクターpAdQUICKのI-Ceu I部位にサブクローニングする。3) 次いで、pAdQUICKベースの組換えアデノウイルベクターをSnaBIで切断し、逆方向末端反復を曝露する。導入遺伝子発現を、ヤギ抗ヒトTGFBIIIR抗体（R & D Systems, Minneapolis, MN）をプローブとしたウエスタンブロティングを用いて、組換えアデノウイルスAd2TGFBIIIRで感染させた相補293細胞（アデノウイル5型 (Ad5), ATCC CRL-1573, Rockville, MD）によって形質転換した初代ヒト胚性腎細胞）の上清を試験して確認した。

実施例2
雄のBrown-Norway および Lewisラット（約200-300 g）をそれぞれHarlan Sprague Dawley社（Indianapolis、IN）およびCharles River Canada社（St. Constant, Quebec, Canada）から購入した。動物の飼育はNIHガイドラインに従って提供され、Toronto General Hospital Research institute Animal Care Committeeで承認された。

前に記載したように、異所性気管移植を行った（Boehlerら、1997, Transplantation, 64: 311-7; Boehlerら、1988, Hum. Gene Ther., 9: 541-51; Sugaら、2000, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162: 1940-1948）。簡潔に述べると、Brown-Norwayラットの気管全体を切除し、2つの等しいサイズの部分に分割し、ついでレシピエント（ルイスラット）の背中に作った皮下袋に入れた。移植片を、移植後2日目、7日目、14日目、および21日目に取り除き、組織学的および免疫組織学的試験のために、気管断片の真ん中の3分の1を10 %緩衝ホルマリンで固定した。

組織学的染色のために、移植片標本をSugaら、2000, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162: 1940-1948に記載されているように加工した。簡潔に述べると、凍結標本をO.C.T化合物（Sakura Finetek U.S.A.社; Torrence, Calf.）に包埋し、5μmの切片に切断し、ポリ-L-リジン被覆スライドに置き、空気乾燥し、アセトンで15分間固定した。Protein Block Serum-Free溶液（DAKO Diagnostic Canada社, Mississauga, Ontario, CA）で遮断後、切片を1:100に希釈したポリクロナールウサギ抗TGF-βIgG（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）と共に30分間インキュベートした。二次抗体とアルカリホスファターゼの結合段階および色相反応を、ラット標本（DAKO Diagnostic Canada）用LSAB 2アルカリホスファターゼキットの製造業者の指示書に従って行った。色相反応は、内因性アルカリホスフェート活性遮断剤（Levamisole; DAKO Diagnostic Canada）を含むFast Red Substrate System（DAKO Diagnostic Canada）を添加して展開した。スライドはヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照を0.1 %ウシ血清アルブミンを含み、一次抗体を含まないPBSと、またはアイソタイプ特異的ウサギIgGと共にインキュベートした。

形態計測のために、ホルマリンで保存した気管断片の中央部分をヘマトキシリンおよびエオジン染色用に4μmの切片に切断した。Reichenspurnerら、1997, Transplantation, 64: 373-383に記載されるようなコンピューター化形態計測をビデオカメラ付きの顕微鏡下、切片の写真画像を撮って行った。画像をCイメージング1280形態計測システム（Compix社、Cranberry Township, Penn.）に移した。管腔周囲、上皮ライニング、開存管腔の縁、および軟骨内の縁はマニュアルドローイング（manual drawing）で追跡し、各長さまたは面積をコンピューターシステムで計算した。上皮損失の割合は（1−上皮ライニング長÷管腔周囲長）×100 %で表し; 管腔閉塞の割合は（1−開存管腔面積÷内側軟骨面積）×100 %で表した。データは平均値±平均の標準偏差で表した。統計解析はSigmaStat v1.0統計ソフトウェア（Jandel Scientific; San Rafael, Calif）を用いて行った。

実施例3
移植後各時点でのTGF-βの発現
肺同種移植で発症する線維性気道閉塞は3相の時間経過に従う：即ち、最初の虚血相、それに続く完全な上皮損失を伴った顕著な細胞性浸潤相、および最後の同種移植気道管腔の線維性閉塞相である。Boehlerら、1997, Transplantation, 64: 311-317参照。浸潤細胞は主にリンパ球とマクロファージ、特にCD4^＋単核細胞である。

同種移植気管組織中のTGF-βタンパク質の発現および分布を、これらの3相で免疫組織化学染色で検査した。異なった時点で、組織切片を取り除き検査した。結果は、2日目から7日目までに浸潤単核細胞数が増加し、これらの細胞は抗TGF-β抗体で強く染色されることを示した。気道管腔は14日目に線維性組織で満たされ、少数のTGF-β陽性細胞が認められた。21日目ではTGF-β陽性染色細胞は認められなかったが、線維性組織は引き続き陽性に染色された。

実施例4
各時点におけるTGF-β拮抗薬遺伝子の移入
線維性気道閉塞における可溶性TGFBIIIRのアデノウイルス介在性遺伝子移入の影響を試験するために、可溶性TGFBIIIR遺伝子を含む組換えアデノウイルス（5×10⁹粒子）を、移植当日（D0）、移植後5日目（D5）、および移植後10日目（D10）の3つの異なる時点で局所注入（レシピエントのLewisラットの同種移植部位での注入）することにより投与した。結果を図2に示す。気道閉塞は未処理対照（CO）と比較して、D0群でやや阻害されたがD5群でより阻害の程度が大きかった。

実施例5
阻害および投与経路
アデノウイルス介在性可溶性TGFBIIIR遺伝子移入の筋肉内注入と局所注入とを共に試験した。可溶性TGFBIIIR遺伝子を含むアデノウイルスベクターを、同種移植後5日目に局所的（気管移植部位に）または筋肉内（TGまたはIMG）注入した。空ベクターを含む組換えアデノウイルスを陰性対照（TV--空ベクター、局所注入；IMV--空ベクター、筋肉内注入）として用いた。未処理対照群（CO）も用いた。結果を図3に示す。可溶性TGFBIIIRの局所遺伝子トランスフェクション（群TG）は管腔の開存性を21日目まで保ったが、他のすべての群は殆ど完全な線維性管腔閉塞を示した（図3と図4）。気管構造の検査で、局所遺伝子移入は気道管腔の線維性閉塞を防止したが、上皮ライニング全体（すべての群で同じであった）の損失は遺伝子移入によっては防止できなかった。更に、上皮下空間に僅かな程度の線維増殖が観察され、その場所の正常な構造物に置き換わった。

可溶性TGFBIIIRの局所作用は、臨床の目的には特に有利である。肺移植後、このタンパク質またはその遺伝子（または類似のTGF-β阻害剤）は、その全身的影響を最小限にして、気管を通して局所的に送達し、線維性気道閉塞からの慢性的拒絶反応を防止できる。従って、局所投与に要求されるTGF-β拮抗薬の量は、全身的に作用する薬剤の場合よりも少なく、全身性副作用の可能性が低減される量である。

前述の結果は、TGF-β結合の直接的な阻害剤、例えば可溶性TGFBIIIRのアデノウイルス介在性局所遺伝子移入は、細気管支炎閉塞のラット気管移植モデルにおける同種移植片誘発線維性気道閉塞の発症を顕著に阻害することを示す。この結果は、臨床的に観察されたTGF-βの過剰発現と、移植後の移植された肺の慢性的機能不全に寄与する気道線維症の発症との間の関係を強調する。これはTGF-βの活性を遮断するために設計された治療手段が、慢性的移植片線維症の阻害に有用であることを示す始めての直接的な証拠を提供する。浸潤単核細胞の強い抗TGF-β染色は、これらの細胞が同種移植片の設定における主要なTGF-β源の1つである可能性を示唆している。

本発明は分子生物学および医学の分野で周知の標準的な実験技術および科学的技術に関連する。これらの技術は以下の公表文献に記載された技術を含むが、これらに限定されない。

本明細書上記の各公表文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。

rs TGFBIIIRのインビボ発現のための組換えアデノウイルスベクターAd2 TGFBIIIR E3Δ2.9の模式図である。本ベクターはpADQUICK中のICEU I部位で、EI領域の代わりにヒトrs TGFBIIIRの発現カセットを挿入して調製される（以前pAd_vanatageと呼ばれた。Souzaら、1999, Biotechniques, 26: 502-8参照）。ラット気管同種移植片における管腔閉塞の発症に及ぼすアデノウイルスベクター組換え可溶性TGF-βIII型受容体（rsTGFBIIIR）cDNAの時間依存性阻害作用を示す棒グラフである。グラフは未処理対照（CO）と比較した、移植片の部位に0日目（D0）、5日目（D5）、および10日目（D10）に注入されたrsTGFBIIIRを含むアデノウイルスの効果を示す。5日目に投与したTGFBIIIR発現ベクターは線維性気道閉塞の発症を阻害した（COに対してp=0.06）。アデノウイルス介在性可溶性TGFBIIIR遺伝子移入の局所投与の、ラット気管同種移植片の管腔閉塞発症における阻害作用を示す棒グラフである。 TGF-β拮抗薬で処理された、または処理されていない気管同種移植片からの代表的な組織切片を示す。可溶性TGFBIIIRcDNAまたは空のベクターを含むアデノウイルスを、肺組織の移植後5日目に、移植片部位（局所）または筋肉内に注入した。21日目の同種移植片の代表的な組織切片を示す。CO=無処理対照；TG=局所遺伝子；TV=局所空ベクター;IMG=筋肉内遺伝子。移植片部位での可溶性TGFBIIIRベクターは管腔の開存性を保ったのに対して、他の群からの切片は線維症による管腔切片の閉塞を示した（TGをCO、TV、IMGと比較）。

【配列表】

Claims

移植片におけるTGF-β介在線維症によって特徴づけられる慢性的な移植片拒絶反応の治療のための、薬学的組成物調製への有効量のTGF-β拮抗薬の使用。
慢性的な拒絶反応がレシピエントのTGF-β陽性細胞の移植片への浸潤によって特徴づけられることを特徴とする、請求項1記載の使用。
移植片が肺であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が腎臓であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が心臓であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が肝臓または肝臓の一部であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が心臓の弁であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が血管の切片であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が同種移植片であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片が異種移植片であることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
移植片レシピエントがヒトであることを特徴とする、請求項1または2記載の使用。
TGF-β拮抗薬が、TGF-βの1つまたは複数のアイソフォームに対して向けられた抗体、TGF-β受容体、TGF-β受容体の1つまたは複数に対して向けられた抗体、潜伏関連ペプチド、大きな潜伏性TGF-β、TGF-β阻害プロテオグリカン、ソマトスタチン、マンノース−6−ホスフェート、マンノース−１−ホスフェート、プロラクチン、インスリン様成長因子II、IP−10、arg-gly-asp含有ペプチド、植物、真菌、細菌抽出物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびTGF-βシグナル伝達に関与するタンパク質からなる群より選択される、請求項1または2記載の使用。
TGF-β阻害プロテオグリカンが、フェチュイン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項12記載の使用。
TGF-βシグナル伝達に関与するタンパク質が、SMAD、MAD、Ski、およびSnoからなる群より選択されることを特徴とする、請求項12記載の使用。
TGF-βの1つまたは複数のアイソフォームに対して向けられた抗体がモノクロナール抗体ID11.16のヒトまたはヒト化された形態であることを特徴とする、請求項12記載の使用。
拮抗薬が、レシピエントにおいて拮抗薬をコードしている遺伝子を発現する事ができる遺伝子移入ベクターを介して投与されることを特徴とする、請求項12記載の使用。
遺伝子移入ベクターが、組換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項16記載の使用。
遺伝子が、TGF-β受容体またはTGF-βに結合可能なその断片をコードすることを特徴とする、請求項17記載の使用。
TGF-β受容体がTGF-βIII型受容体であることを特徴とする、請求項17記載の使用。
移植片レシピエントにおける移植片機能の損失の治療のための、薬学的組成物調製への有効量のTGF-β拮抗薬の使用。
移植片機能の損失が、レシピエントのTGF-β陽性細胞の移植片への浸潤によって特徴づけられることを特徴をする、請求項20記載の使用。
移植片が肺であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が腎臓であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が心臓であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が肝臓の一部であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が心臓の弁であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が血管の切片であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が同種移植片であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
移植片が異種移植片であることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
レシピエントがヒトであることを特徴とする、請求項20または21記載の使用。
TGF-β拮抗薬が、TGF-βの1つまたは複数のアイソフォームに対して向けられた抗体、TGF-β受容体、TGF-β受容体の1つまたは複数に対して向けられた抗体、潜伏関連ペプチド、大きな潜伏性TGF-β、TGF-β阻害プロテオグリカン、ソマトスタチン、マンノース−6−ホスフェート、マンノース−1−ホスフェート、プロラクチン、インスリン様成長因子II、IP−10、arg-gly-asp含有ペプチド、植物、真菌、細菌抽出物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびTGF-βシグナル伝達に関与するタンパク質からなる群より選択されることを特徴をする、請求項20または21記載の使用。
TGF-β阻害プロテオグリカンが、フェチュイン、デコリン、バイグリカン、フィブロモジュリン、ルミカン、およびエンドグリンからなる群より選択されることを特徴とする、請求項31記載の使用。
TGF-βシグナル伝達に関与するタンパク質が、SMAD、MAD、Ski、およびSnoからなる群より選択されることを特徴とする、請求項31記載の使用。
TGF-βの1つまたは複数のアイソフォームに対して向けられた抗体が、ヒトまたはヒト化モノクロナール抗体ID11.16のヒトまたはヒト化された形態であることを特徴とする、請求項31記載の使用。
拮抗薬が、レシピエントにおいて拮抗薬をコードしている遺伝子を発現する事ができる遺伝子移入ベクターを介して投与されることを特徴とする、請求項31記載の使用。
遺伝子移入ベクターが組換えアデノウイルスであることを特徴とする、請求項35記載の使用。
遺伝子が、TGF-β受容体またはTGF-βに結合することができる可能なその断片をコードしていることを特徴とする、請求項36記載の使用。
TGF-β受容体がTGF-βIII型受容体であることを特徴とする、請求項37記載の使用。