JP2005518824A - ユビキチン因子を同定するためのアッセイおよびユビキチン因子の活性を変調する因子を同定するためのアッセイ - Google Patents

ユビキチン因子を同定するためのアッセイおよびユビキチン因子の活性を変調する因子を同定するためのアッセイ Download PDF

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Abstract

ユビキチン媒介プロテイン分解の酵素成分であるユビキチン因子をアッセイする方法および組成を提供する。より具体的には、そのようなユビキチン因子の活性を変調する因子をアッセイする方法および組成を提供する。特に、本発明の方法は、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびユビキチン連結因子などのユビキチン因子の同定、ならびに、これらユビキチン因子の活性を変調させる因子の同定を行うことを目的としている。一局面において、本発明は、ユビキチン標的タンパク質を必要としないアッセイ方法を提供する。

Description

本願は、以下に示す５件の特許出願それぞれの一部継続出願であって、それらに対して優先権を主張する。すなわち、米国特許出願第１０／１５２，１５６号（２００２年５月２０日出願）であり、これは第１０／１０８，７６７号（２００２年３月２６日出願）の一部継続出願であり、さらにこれは第１０／１０９，４６０号（２００２年３月２６日出願）の一部継続出願であり、さらにこれは第１０／０９１，１３９号（２００２年３月０４日出願）の一部継続出願であり、さらにこれは第１０／０９１，１７４号（２００２年３月０４日出願）の一部継続出願であり、各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
本出願は、以下の２件の出願に関連する。すなわち、米国特許第０９／８２６，３１２号（２００１年４月３０日出願、係続中）であり、これは第０９／５４２，４８７号（２０００年４月０３日出願、係続中）の一部継続出願であり、各々は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
（発明の分野）
本発明は、ユビキチン媒介タンパク質分解の分野に関する。具体的には、本発明は、ユビキチン媒介タンパク質分解の酵素成分であるユビキチン因子（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ａｇｅｎｔ）をアッセイする方法および組成物に関し、より具体的には、そのようなユビキチン因子の活性を変調する因子をアッセイする方法および組成物に関する。
（発明の背景）
ユビキチンは、すべての真核生物で発現され、高度に保存された７６アミノ酸のタンパク質である。多くの細胞内タンパク質のレベルは、ユビキチン媒介タンパク質分解過程によって調節されている。この過程には、標的タンパク質にユビキチンを共有結合させ、その結果、２６Ｓプロテアソームによって迅速に検出、分解されるポリユビキチン化標的タンパク質にすることが関与している。
これら標的タンパク質のユビキチン化は、３つのユビキチン因子の酵素活性によって媒介されていることが知られている。ユビキチンは、最初に、ユビキチン活性化因子（例えば、Ｅ１）によって、ＡＴＰ依存的方法で活性化される。ユビキチンのＣ末端は、ユビキチン活性化因子と高エネルギー・チオエステル結合を形成する。ユビキチンは、その後をユビキチン結合因子（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｅ２（ユビキチン部分キャリアタンパク質とも呼ばれる））に転移され、この２番目のユビキチン因子にもチオエステル結合を介して連結される。最後にユビキチンは、ユビキチン連結因子（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｅ３）の誘導にしたがって、標的タンパク質と連結し、末端イソペプチド結合を形成する。この過程で、ユビキチンのモノマーまたはオリゴマーが標的タンパク質に結合する。標的タンパク質上で、それぞれのユビキチンは、ユビキチン連結因子の活性によって、次のユビキチンに共有結合される。
ユビキチン経路の酵素成分には、大きな関心がよせられている（総説として、Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２：１６９−１７８（２００１）を参照）。Ｅ１ユビキチン活性化因子およびＥ２ユビキチン結合因子のメンバーは、構造的関連性を示し、かつ十分に特徴付けされている酵素である。Ｅ２ユビキチン結合因子には、多数の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）があり、それらのいくつかはＥ３ユビキチン連結因子と好ましい対を作って作用し、別の標的タンパク質に対する特異性を与える。Ｅ２ユビキチン結合因子の命名法は、種を越えて標準化されてはいないが、この分野の研究者はこの問題に取り組んでおり、当業者なら、容易に様々なＥ２結合因子、およびその種ホモローグ（ｓｐｅｃｉｅｓ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）を同定することができる（ＨａａｓおよびＳｌｅｐｍａｎｎ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．１１：１２５７−１２６８（１９９７））。
概して、ユビキチン連結因子は２つの異なる活性をもつ。１つは、イソペプチド結合を介してユビキチンのモノマーまたはオリゴマーを標的タンパク質に結合するユビキチン・リガーゼ活性であり、もう１つは、リガーゼと基質を物理的に一緒にするターゲッティング活性である。異なるユビキチン連結因子の基質特異性はユビキチン媒介タンパク質分解過程の選択性の主要な決定因子である。
真核細胞において、いくつかのユビキチン連結因子は、ユビキチン連結活性をもつＳＣＦと呼ばれる複合体を構成する複数のサブユニットを含有する。ＳＣＦは、Ｇ１進行（Ｇ１ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）の調節に重要な役割をもち、少なくとも３つサブユニット、ＳＫＰ１、キュリン（Ｃｕｌｌｉｎ）（少なくとも７個のファミリー・メンバーがある）、および基質に直接結合し基質を複合体に取り入れるＦボックス・タンパク質（何百種もが知られている）からなる。ＳＣＦと、ＲＩＮＧ・フィンガー・タンパク質の最近発見されたファミリーであるＲＯＣ／ＡＰＣ１１タンパク質との間のコンビナトリアル相互作用は、ユビキチン連結因子にリガーゼ活性を与える主要要素であるこが示されている。ＲＯＣ／キュリンの特定の組み合わせによって、特定の細胞経路が調節可能であり、例としては、姉妹染色分体の分離と、有糸分裂において終期からＧ１に進入する過程とのタンパク質分解調節において関与するＡＰＣ１１−ＡＰＣ２の機能（Ｋｉｎｇら、前出；Ｋｏｅｐｐら、Ｃｅｌｌ ９７：４３１−３４（１９９９））、ならびに、ＮＦ−κＢ／ＩκＢ媒介転写調節におけるＩκＢのタンパク質分解に関与するＲＯＣ１−キュリン１の機能（Ｔａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ３（４）：５２７−５３３（１９９９）；Ｌａｎｅｙら、Ｃｅｌｌ ９７：４２７−３０（１９９９））が挙げられる。
最もよく特徴付けされているユビキチン連結因子は、後期への進入と、有糸分裂からの進出との両方に必要な多成分複合体であるＡＰＣ（後期促進複合体（ａｎａｐｈａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ））である（総説として、Ｋｉｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１６５２−５９（１９９６）を参照）。ＡＰＣは、多くのタンパク質のユビキチン媒介タンパク質分解を促進することによって、後期を通じて細胞の継代を調節する重要な役割をもつ。ＡＰＣは、有糸分裂のＢ型サイクリンの分解してＣＤＣ２キナーゼを不活性化するのに加えて、姉妹染色分体の分離および紡錘体の分解のために、他の多くのタンパク質を分解するのに必要である。ＡＰＣによって分解されるタンパク質のほとんどには、それらのタンパク質をユビキチン・ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）とそれに続く分解との標的にする「ディストラクション・ボックス（ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｂｏｘ）」と呼ばれる保存された９アミノ酸モチーフが含まれている。しかし、Ｇ１サイクリン、ＣＤＫ阻害剤、転写因子、シグナル伝達中間体を含むＧ１期に分解されるタンパク質には、この保存されたアミノ酸モチーフが含まれない。その替わりに、基質のリン酸化がそれらのタンパク質をユビキチン連結因子との相互作用に誘導し、ユビキチン・ユビキチン化を引き起こす重要な役割をはたしているようである（Ｈｅｒｓｈｋｏら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：４２９−７５（１９９８））。
ＨＥＣＴ（Ｅ６−ＡＰカルボキシル末端ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｅ６−ＡＰ ｃａｒｂｏｘｙ ｔｅｒｍｉｎｕｓ））ドメインＥ３連結因子と、ＲＩＮＧフィンガー・ドメインＥ３連結因子との、２クラスのＥ３ユビキチン連結因子の主要なクラスが知られている。Ｅ６ＡＰは、Ｅ３連結因子のＨＥＣＴドメイン・サブクラスのプロトタイプであり、子宮頸がんでパピローマウイルスによって活性化されるがん抑制遺伝子ｐ５３のユビキチン連結因子として機能するマルチ・サブユニット複合体である（Ｈｕａｎｇら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：１３２１−１３２６）。このクラスのメンバーは、Ｅ６ＡＰのカルボキシル末端に対して相同性を示し、Ｅ１活性化因子およびＥ２結合因子と同様に、Ｃｙｓ活性部位をユビキチンとのチオエステル結合形成に利用する。しかし、それとは対照的に、のＥ３連結因子のＲＩＮＧフィンガー・ドメイン・クラスは、ユビキチン結合したＥ２中間体と相互作用し、複合体がユビキチンをアクセプターに転移するのを活性化すると考えられている。Ｅ３連結因子のＲＩＮＧドメイン・クラスの例には、ＩＫＫ活性化に関与するＴＲＡＦ６、インシュリンおよびＥＧＦを標的とするＣｂｌ、ＤＣＣを標的とするＳｉｎａ／Ｓｉａｈ、血球新生（Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびマスト細胞）に関与するＩｔｃｈｙ、アポトーシスの阻害剤に関与するＩＡＰ、およびｐ５３の調節に関与するＭｄｍ２がある。
Ｅ３連結因子のＲＩＮＧフィンガー・ドメイン・サブクラスは、さらに２つのサブクラスに分けられる。１つのサブクラスでは、ＲＩＮＧフィンガー・ドメインと、基質認識ドメインとが、連結因子を形成する別々のサブユニット内に含有されている（例えば、ＳＣＦ複合体のＲＢｘ１サブユニットおよびＦボックス・サブユニット）。ユビキチン連結因子の２つめのサブクラスでは、連結因子は、ＲＩＮＧフィンガー・ドメインと基質認識ドメインを単一サブユニット上にもっている（例えば、Ｍｄｍ２およびｃｂｌ）（Ｔｙｅｒｓら、（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：６０１，６０３−６０４；Ｊｏａｚｅｉｒｏら、（２０００） １０２：５４９−５５２）。連結因子のさらに別のクラスは、「ＰＨＤ」ドメインをもち、かつＲＩＮＧフィンガー・ドメイン連結因子に相同な連結因子（Ｃｏｓｃｏｙら、（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５５（７）：１２６５−１２７３）（例えば、ＭＥＫＫ１）である。ＰＨＤドメイン連結因子は、膜結合型Ｅ３連結因子の新規クラスである。
Ｍｄｍ２は、単一サブユニットＥ３連結因子の２番目のサブクラスであって、重要ながん抑制遺伝子であるｐ５３の機能および安定性の調節に関与している。細胞内で、ｐ５３は、ＤＮＡ修復、アポトーシス、および細胞増殖の停止に関与する遺伝子の発現を誘導するＤＮＡ結合転写因子として機能する。すべてのヒトのがんの約５０％において、ｐ５３は、欠失または変異によって不活性化されている。細胞内におけるｐ５３のレベルは、低い定常レベルに維持されており、細胞のストレスに応答する様々なシグナル経路によって、翻訳後に、誘導および活性化される（Ｌａｋｉｎら、（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７６４４−７６５５；Ｏｒｅｎ、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６０３１−３６０３４）。ストレス応答を引き起こし、ｐ５３を活性化する刺激には、酸素ストレス、がん遺伝子の不適切な活性化、およびＤＮＡ損傷を引き起こす物質（例えば、電離放射線、化学物質、および紫外線光）が含まれる。Ｍｄｍ２のカルボキシル末端には、このＥ３連結因子の活性化に不可欠なＲＩＮＧフィンガー・ドメインの改変体が含まれる（Ｓａｕｒｉｎら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２０８−２１４）。最近の研究によって、Ｍｄｍ２がそれ自体のユビキチン化を媒介し、その結果、このタンパク質上にポリユビキチン鎖が形成されることが明らかになった（Ｚｈｉｈｏｎｇら、（２００１）Ｊ．Ｂ．Ｃ．２７６：３１３５７−３１３６７；Ｈｏｎｄａら、（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９：１４７３−１４７６；Ｓｈｅｎｇｙｕｎら、（２０００）２７５：８９４５−８９５１）。さらに、Ｍｄｍ２のユビキチン連結活性は、そのＲＩＮＧフィンガー・ドメインに依存している。
通常、細胞内のＥ３による標的タンパク質のユビキチン化は、ポリユビキチン鎖の形成を導く。ユビキチンのカルボキシル末端と、標的タンパク質中のＬｙｓのαアミノ基との間でイソペプチド結合が形成される。ユビキチン鎖の伸長または形成は、それ以前に結合したユビキチンのＬｙｓ４８（時にはＬｙｓ６３）と、さらなるユビキチンのカルボキシル末端Ｇｌｙとによるさらなるイソペプチド結合の形成の結果によるものである。ユビキチン化された標的タンパク質のプロテアソームによる効率的な認識には、このような立体配置で結合した少なくとも４つのユビキチンが必要である。しかし、Ｍｄｍ２よって媒介されたｐ５３のユビキチン化では、Ｌｙｓ４８またはＬｙｓ６３のどちらもポリユビキチン鎖の形成に必要とされていない。最近の研究によって、ヒトＭｄｍ２が、酵素の異性化を必要とするメカニズムによるｐ５３のマルチプル・モノユビキチン化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｏｎｏｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）を媒介することが示された（Ｚｈｉｈｏｎｇら、（２００１）Ｊ．Ｂ．Ｃ．２７６：３１３５７−３１３６７）。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、ユビキチンをあらかじめ結合させてあるＥ２を用いることで、ｐ５３へのユビキチン転移がＥ１非依存的に起こりうる。これらの結果は、あらかじめ結合させてあるＥ２がＭｄｍ２に結合可能であり、かつその後Ｅ１非存在下にユビキチンをＭｄｍ２に転移させることができることを示唆している。
したがって、ユビキチン因子（例えば、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびユビキチン連結因子）は、標的タンパク質の分解と、細胞プロセスの調節とを導くユビキチン媒介タンパク質分解経路の主要な決定因子である。このため、このようなユビキチン因子の活性を変調する因子は、細胞のシグナル伝達に関与する特定分子を上方制御または下方制御するのに利用可能である。
そのようなシグナル伝達物質の上方制御または下方制御によって、特定の細胞応答を促進または低下させ、疾病過程を治療することが可能である。この原理は、気管疾患および血管不全に対するホスホジエステラーゼ阻害剤、転移性形質転換に対するキナーゼ阻害剤、および喘息などの炎症症状に対するプロテアーゼ阻害剤を含むいくつかの治療薬のデザインに用いられている。
細胞周期調節などの細胞プロセスにおけるユビキチン媒介タンパク質分解の重要性のため、この酵素経路の触媒成分であるユビキチン因子を同定する迅速かつ簡便な方法、およびそのような触媒成分の活性を変調する因子を同定する迅速かつ簡便な方法を求める要望がある。したがって、本発明の目的は、ユビキチン媒介タンパク質分解の触媒成分であるユビキチン因子をアッセイする方法、より具体的には、ユビキチン因子の活性を変調させる因子の測定方法を提供することである。
（発明の要旨）
上記の目的にしたがって、本発明は、ユビキチン媒介タンパク質分解の酵素成分であるユビキチン因子を、アッセイする方法および組成物を提供する。より、具体的には、本発明は、ユビキチン媒介タンパク質分解の酵素成分であるユビキチン因子の活性を変調する因子を、アッセイする方法および組成物を提供する。特に、本発明の方法は、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびユビキチン連結因子などのユビキチン因子の同定、ならびに、これらユビキチン因子の活性を変調させる因子の同定を行うことを目的としている。一局面において、本発明は、ユビキチン標的タンパク質を必要としないアッセイ方法を提供する。本発明の方法において、ユビキチン因子は、異なる組み合わせでユビキチン部分（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｍｏｉｅｔｙ）と混合され、ユビキチン因子、標的タンパク質、モノユビキチン部分、およびポリユビキチン部分のうち、少なくとも１つの基質分子へのユビキチン部分の結合の測定、またはこのような結合の変調の測定に用いられる。このモノユビキチン部分またはポリユビキチン部分は、ユビキチン因子または標的タンパク質に結合したものが好ましい。
本発明の方法および組成物の局面において、ユビキチン活性化因子はＥ１、ユビキチン結合因子はＥ２、かつ／または、ユビキチン連結因子はＥ３である。別の局面では、標的タンパク質はほ乳類標的タンパク質であって、さらなる局面では、標的タンパク質はヒト標的タンパク質である。別の局面では、ユビキチン部分はほ乳類ユビキチンであって、さらなる局面では、ユビキチン部分はヒト・ユビキチンである。別の局面では、ユビキチン部分はユビキチン誘導体である。いくつかの局面において、候補因子は、小分子またはｓｉＲＮＡ、好ましくは１９〜２２塩基長のｓｉＲＮＡであり、さらなる局面では、候補因子はペプチドである。いくつかの局面において、ユビキチン部分は標識を有し、さらなる局面では、その標識はエピトープ・タグを含む。別の局面では、少なくとも第１のユビキチン部分と、第２のユビキチン部分が使用され、その際第１のユビキチン部分および第２のユビキチン部分は異なる蛍光標識を有し、かつその際、それらの蛍光標識が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対を形成する。
一局面において、本発明は、少なくとも１つのユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を変調させる因子をアッセイする方法であって、ａ）第１のユビキチン因子、候補因子、およびユビキチン部分を混合するステップと、ｂ）第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。さらなる一局面において、第１のユビキチン因子はユビキチン活性化因子である。さらなる一局面では、このユビキチン活性化因子はＥ１である。
別の局面では、この方法は、混合ステップに第２のユビキチン因子を含めることをさらに包含する。さらなる一局面では、第１のユビキチン因子はユビキチン結合因子であり、第２のユビキチン因子はユビキチン活性化因子である。さらなる一局面では、ユビキチン結合因子はＥ２であり、ユビキチン活性化因子はＥ１である。また、さらなる一局面では、ユビキチン結合因子はＥ２であり、ユビキチン活性化因子はユビキチン部分を有するＥ１である。
別の局面では、第１のユビキチン因子はユビキチン連結因子であり、第２のユビキチン因子はユビキチン部分を有するユビキチン結合因子である。さらなる一局面では、ユビキチン連結因子はＥ３であり、ユビキチン結合因子はユビキチン部分を有するＥ２である。
別の局面では、この方法は、混合ステップでさらに第３のユビキチン因子を含む。さらなる一局面では、第３のユビキチン因子はユビキチン連結因子である。また、さらなる一局面では、ユビキチン連結因子はＥ３である。
アッセイが第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合に関する測定の方法において、以下の関連する局面が提供される。一局面において、第１のユビキチン因子はタグを有する。さらなる一局面では、第１のユビキチン因子はエピトープ・タグを有する。別の局面では、第１のユビキチン因子は標識を有する。また、さらなる一局面では、第１のユビキチン因子は結合タグ（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｔａｇ）を有する。別の局面では、第１のユビキチン因子が固体支持体に結合し、さらなる一局面では、この固体支持体はマイクロタイター・プレートまたはビーズである。
アッセイが第２のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合に関する方法において、以下の関連する局面が提供される。ある局面では、第２のユビキチン因子はタグを有する。さらなる一局面では、第２のユビキチン因子はエピトープ・タグを有する。別の局面では、第２のユビキチン因子は標識を有する。また、さらなる一局面では、第２のユビキチン因子は結合タグを有する。別の局面では、第２のユビキチン因子が固体支持体に結合し、さらなる一局面では、この固体支持体はマイクロタイター・プレートまたはビーズである。
別の局面では、本発明は、少なくとも１つのユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を調節する因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン連結因子を含む第１のユビキチン因子、第２のユビキチン因子、候補因子、ユビキチン部分、および基質を混合する工程と、ｂ）第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。さらなる一局面において、第２のユビキチン因子はユビキチン部分を有するユビキチン結合因子である。
さらなる一局面において、本発明はさらに、混合ステップで第３のユビキチン因子を含み、ここで第３のユビキチン因子がユビキチン活性化因子であり、ここで基質およびユビキチン部分が異なる蛍光標識を有し、かつここで、それらの蛍光標識が蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を形成する。
本発明の以下の局面で、ユビキチン連結因子は好ましくはＭｄｍ２タンパク質であり、かつ、標的タンパク質は好ましくはｐ５３である。好適な実施形態において、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２融合タンパク質であり、さらに好ましくは、Ｍｄｍ２−ＧＳＴ融合タンパク質である。
本発明の一局面において、Ｍｄｍ２タンパク質が第１のＦＲＥＴ標識を有し、ユビキチン部分が第２のＦＲＥＴ標識を有する。別の局面では、Ｍｄｍ２タンパク質は結合タグを有する。別の局面では、Ｍｄｍ２タンパク質が固体支持体上において提供され、さらなる一局面では、この固体支持体はマイクロタイター・プレートまたはビーズを含む。別の局面では、Ｍｄｍ２タンパク質は哺乳動物Ｍｄｍ２であり、さらなる一局面では、Ｍｄｍ２タンパク質はヒトＭｄｍ２である。
別の局面では、ｐ５３タンパク質が第１のＦＲＥＴ標識を有し、ユビキチン部分が第２のＦＲＥＴ標識を有する。別の局面では、ｐ５３タンパク質は結合タグを有する。別の局面では、ｐ５３タンパク質が固体支持体上において提供され、さらなる一局面では、この固体支持体はマイクロタイター・プレートまたはビーズを含む。
一局面において、本発明は、Ｍｄｍ２タンパク質へのユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）少なくとの１つのユビキチン部分を有する第１のユビキチン因子、Ｍｄｍ２タンパク質、および候補因子を混合する工程と、ｂ）Ｍｄｍ２タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。さらなる局面では、第１のユビキチン因子はユビキチン結合因子である。
さらなる一局面において、本発明はさらに、工程ａ）で、ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子を混合し、それによってユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することを含む。
さらなる一局面において、この方法はさらに、ユビキチン活性化因子およびユビキチン部分を混合し、それによってユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することを含む。
別の局面では、本発明は、ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）少なくとも１つのユビキチン部分を有するユビキチン結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、ｐ５３タンパク質、および候補因子を混合する工程と、ｂ）ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。
さらなる一局面において、この方法はさらに、ユビキチン結合因子およびユビキチン部分を混合し、それによってユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することを含む。
関連する局面では、この方法はさらに、工程ａ）で、ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子を混合し、それによって該ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することを含む。
さらなる一局面において、この方法はさらに、ユビキチン活性化因子およびユビキチン部分を混合し、それによってユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することを含む。
別の局面では、本発明は、Ｍｄｍ２タンパク質へのユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、候補因子およびユビキチン部分を混合する工程と、ｂ）Ｍｄｍ２タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は、ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、ｐ５３タンパク質、候補因子およびユビキチン部分を混合する工程と、ｂ）ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は、ｐ５３タンパク質への第２のユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、第１のＦＲＥＴ標識で標識された第１のユビキチン部分を有するｐ５３タンパク質、候補因子、および第２のＦＲＥＴ標識で標識された第２のユビキチン部分を混合する工程と、ｂ）ＦＲＥＴ反応を検出することによって、ｐ５３タンパク質への第２のユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は、ｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）第１のＦＲＥＴで標識された第１のユビキチン部分を有するユビキチン結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、第１のユビキチン部分が第２のＦＲＥＴ標識で標識されていることを特徴とする第２のユビキチン部分を有するｐ５３タンパク質、および候補因子を混合する工程と、ｂ）ＦＲＥＴ反応を検出することによって、ｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。
別の局面では、本発明は、ｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合を調節する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）第１のＦＲＥＴで標識された第１のユビキチン部分を有するユビキチン結合因子、ユビキチン結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、第１のユビキチン部分が第２のＦＲＥＴ標識で標識されていることを特徴とする第２のユビキチン部分を有するｐ５３タンパク質、および候補因子を混合する工程と、ｂ）ＦＲＥＴ反応を検出することによって、ｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合をアッセイする工程とを含む方法を提供する。
本発明の他の局面は、以下の発明の説明から、当業者に明らかなものとなる。
（発明の詳細な説明）
本発明は、ユビキチン媒介タンパク質分解の酵素成分であるユビキチン因子をアッセイする方法および組成物を提供する。より具体的には、本発明は、ユビキチン媒介タンパク質分解の酵素成分であるユビキチン因子の活性を変調する因子をアッセイする方法および組成物を提供する。特に、本発明の方法は、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合体化因子、およびユビキチン連結因子などのユビキチン因子の同定、ならびに、これらユビキチン因子の活性を変調させる因子の同定を行うことを目的とする。
本発明の利点は、ユビキチン因子の活性を一反応容器でアッセイする方法を提供し、これによって、例えば、反応産物の単離および精製などの後続のステップを不要にすることを含む。その結果、このアプローチは、ユビキチン因子活性を変調する因子のためのマルチ・ウェル・アレイ分析（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ ａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）およびハイ・スループット・スクリーニング技法（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を可能にする。加えて、本発明は、特定の標的タンパク質をあらかじめ同定する必要なしに、多くの異なった組み合わせのユビキチン因子の解析を可能にする測定方法を提供する。特に、本発明は、標的タンパク質の非存在下で、異なった組み合わせのユビキチン因子の解析を可能にする方法を提供する。あるいは、標的タンパク質の非存在下で、組み合わせのユビキチン因子の解析を可能にする方法を提供する。
本発明の方法において、ユビキチン因子は、異なる組み合わせでユビキチン部分と混合され、ユビキチン因子、標的タンパク質、モノユビキチン部分、およびポリユビキチン部分のうち、少なくとも１つの基質分子へのユビキチン部分の結合のアッセイ、またはこのような結合の変調のアッセイに用いられる。このモノユビキチン部分またはポリユビキチン部分は、ユビキチン因子または標的タンパク質に結合したものが好ましい。本発明は、例えば以下の組み合わせのユビキチン因子を、プラスまたはマイナス標的タンパク質で、以下の方法用に提供する。すなわち、
ユビキチン活性化因子と、ユビキチン部分とを混合することによって、ユビキチン活性化因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子と、ユビキチン部分とを混合することによって、ユビキチン結合因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子とを混合することによって、ユビキチン結合因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子と、ユビキチン連結因子とを混合することによって、ユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子と、ユビキチン連結因子と、ユビキチン部分とを混合することによって、ユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子と、ユビキチン連結因子とを混合することによって、ユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子と、ユビキチン連結因子と、標的タンパク質と、ユビキチン部分とを混合することによって、標的タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子と、ユビキチン連結因子と、標的タンパク質とを混合することによって、標的タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法；または
ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子と、ユビキチン結合因子と、標的タンパク質とを混合することによって、標的部分へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法である。
特に、本発明の方法において、対象基質分子（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）へのユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイするために、上に挙げた例の組み合わせに候補因子が含まれる。
本発明は、上に挙げた例の組み合わせのユビキチン因子を用いて、対象基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする種々のアプローチ、または対象基質分子へのユビキチン部分の結合を変調する因子をアッセイするアプローチを、様々に提供する。そのようなアプローチの例には、
アッセイの成分を溶液相で混合し、次に対象基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイするアプローチ；または、
対象基質分子を固体支持体上に提供することによって、アッセイの成分を固相で混合し、次に対象基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイするアプローチ；または、
アッセイの成分を溶液相で混合し、次に対象基質分子を固体支持体上に結合させ、次に対象基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイするアプローチ；または、
アッセイの成分を溶液相で混合し、次にユビキチン部分に結合した対象基質分子を精製し、次に精製産物を固体支持体上に結合させ、さらに、対象基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイするアプローチがある。
ユビキチン因子の例は、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびユビキチン連結因子である。好適な実施形態において、ユビキチン活性化因子は好ましくはＥ１、またはその改変体であり；ユビキチン結合因子は好ましくはＥ２、またはその改変体であり；ユビキチン連結因子は好ましくはＥ３、またはその改変体である。好適な実施形態において、Ｅ３はＭｄｍ２である。別の好適な実施形態では、Ｍｄｍ２は融合タンパク質であり、より好ましくはＭｄｍ２−ＧＳＴ融合タンパク質である。したがって、本発明は、ユビキチン活性化活性、ユビキチン結合活性、およびユビキチン連結活性を変調する因子をアッセイする方法を提供する。より具体的には、本発明は、ユビキチン因子、標的タンパク質、モノユビキチン部分、またはポリユビキチン部分へのユビキチン部分の結合を変調する因子をアッセイする方法を提供する。このモノユビキチン部分またはポリユビキチン部分は、ユビキチン因子または標的タンパク質に結合したものが好ましい。
概して、本発明の方法は、ユビキチン部分と一つ以上のユビキチン因子を、標的タンパク質の存在下または非存在下で混合し、ユビキチン因子、標的タンパク質、モノユビキチン部分、およびポリユビキチン部分のうち、少なくとも１つの基質分子に結合したユビキチン部分の量を測定する方法を提供する。このモノユビキチン部分またはポリユビキチン部分は、ユビキチン因子または標的タンパク質に結合したものが好ましい。本明細書において使用される場合、「基質分子」、または「標的タンパク質」、およびこれらの文法的等価物は、ユビキチン因子の活性、またはユビキチン化の過程を介してユビキチン部分が結合する（ｂｉｎｄ ｏｒ ａｔｔａｃｈ）分子、好ましくはタンパク質を意味する。本明細書において使用される場合、「対象基質分子」とは、本発明の方法でユビキチン部分の結合がアッセイされるユビキチン因子、標的タンパク質、またはユビキチン部分を意味する。本明細書においてユビキチン因子の活性に関して使用される場合、「結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」とは、基質分子へのモノユビキチン部分またはポリユビキチン部分の転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）および／またはユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）のことをいう。したがって、「ユビキチン化」およびその文法的等価物は、基質分子へのユビキチン部分の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、すなわち、転移、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）、および／またはライゲーションを意味し、「ユビキチン化反応」およびその文法的等価物は、ユビキチン化（すなわち、基質分子へのユビキチン部分の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、すなわち転移、結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）、および／またはライゲーション）が可能な条件下で、成分を混合することをいう。
いくつかの好適な実施形態において、ユビキチン因子はユビキチン部分を有する。本明細書においてユビキチン因子に関して使用される場合、「ユビキチン部分を有する」という句、またはその文法的等価物は、ユビキチン因子へのユビキチン部分のプレ・ローディング（ｐｒｅ−ｌｏａｄｉｎｇ）、プレ・コンジュゲーション（ｐｒｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、またはプレ・アタッチメント（ｐｒｅ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）（「プレ・コジュゲート（ｐｒｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ユビキチン因子」、または「プレ・ロード（ｐｒｅ−ｌｏａｄｅｄ）ユビキチン因子」を形成する）のことをいい、その結果、対象基質分子へユビキチン部分を結合するために、３つのユビキチン因子すべて（すなわち、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびユビキチン連結因子）の混合、および／または、プレ・コジュゲートされていないユビキチン部分の混合が必要なくなることをいう。例えば、ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子の場合、ユビキチン結合因子へのユビキチン部分の結合は、プレ・コジュゲートされていないユビキチン部分の非存在下で実施可能である。例えば、ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子の場合、ユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合は、ユビキチン活性化因子、およびプレ・コジュゲートされていないユビキチン部分の非存在下で実施可能である。また例えば、ユビキチン部分を有するユビキチン連結因子の場合、標的タンパク質へのユビキチン部分の結合は、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびプレ・コジュゲートされていないユビキチン部分の非存在下で実施可能である。本発明の方法および組成物に適した、プレ・コジュゲートされたユビキチン因子は、当技術分野で公知の方法を用いて調製できる。好適な実施形態において、プレ・コジュゲートされたユビキチン因子は、Ｚｈｉｈｏｎｇら、（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３１，３５７−３１，３６７にしたがって調製した。
本明細書において、「標的タンパク質」とは、ユビキチン因子の活性、またはユビキチン化の過程を介して、ユビキチン部分が結合（ｂｉｎｄ ｏｒ ａｔｔａｃｈ）する、ユビキチン部分以外のタンパク質を意味する。好適な実施形態において、標的タンパク質は、哺乳動物標的タンパク質であり、より好ましくは、ヒト標的タンパク質である。好適な実施形態において、標的タンパク質はｐ５３である。
以下の好適な実施形態において、少なくとも１つのユビキチン因子が標的タンパク質の非存在下でユビキチン部分と混合される。
好適な実施形態において、本発明は、少なくとも１つのユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を変調する因子をアッセイする方法であって、ａ）第１のユビキチン因子、候補因子、およびユビキチン部分を混合するステップと、ｂ）第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。好適な一実施形態において、第１のユビキチン因子はユビキチン活性化因子であり、好ましくはＥ１である。別の実施形態では、この方法は、混合ステップに第２のユビキチン因子をさらに含み、その際、第１のユビキチン因子は好ましくはユビキチン結合因子であり、さらに好ましくはＥ２であり；かつ、第２のユビキチン因子は好ましくはユビキチン活性化因子であり、さらに好ましくはＥ１である。別の実施形態では、ユビキチン結合因子は好ましくはＥ２であり、ユビキチン活性化因子は好ましくはユビキチン部分を有するＥ１である。
別の実施形態では、第１の因子は、好ましくは、ユビキチン連結因子であり、そしてより好ましくは、Ｅ３である；そして第２の因子は、好ましくは、ユビキチン部分を含むユビキチン結合因子であり、そしてより好ましくは、ユビキチン部分を含むＥ２である。
別の実施形態では、この方法は、混合ステップに第３のユビキチン因子をさらに含む。一実施形態において、第３のユビキチン因子は好ましくはユビキチン連結因子であり、より好ましくはＥ２である。
第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合に関してアッセイする方法において、以下の好適な実施形態が提供される。一実施形態において、第１のユビキチン因子は好ましくはタグを有し、より好ましくはエピトープ・タグまたはエピトープ標識を有する。別の実施形態では、第１のユビキチン因子は好ましくは結合タグを有する。別の好適な実施形態では、第１のユビキチン因子は好ましくは固体支持体に結合しており、より好ましくはマイクロタイター・プレートまたはビーズに結合している。
第２のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合に関してアッセイする方法において、以下の好適な実施形態が提供される。一実施形態において、第２のユビキチン因子は好ましくはタグを有し、より好ましくはエピトープ・タグまたは標識を有する。別の実施形態では、第２のユビキチン因子は好ましくは結合タグを有する。別の実施形態では、第２のユビキチン因子は好ましくは固体支持体に結合しており、より好ましくはマイクロタイター・プレートまたはビーズに結合している。
好適な実施形態において、本発明は、ＭｄＭ２タンパク質へのユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）少なくとも１つのユビキチン部分を有する第１のユビキチン因子、ＭｄＭ２タンパク質、および候補因子を混合するステップと、ｂ）ＭｄＭ２タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、第１のユビキチン因子は好ましくはユビキチン結合因子である。
別の好適な実施形態では、この方法は、ステップａ）において、ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子を混合し、それによってユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することさらに含む。
別の好適な実施形態では、この方法は、ユビキチン活性化因子およびユビキチン部分を混合し、それによってユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することをさらに含む。
別の好適な実施形態では、本発明は、ＭｄＭ２タンパク質へのユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、ＭｄＭ２タンパク質、候補因子、およびユビキチン部分を混合するステップと、ｂ）ＭｄＭ２タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。
あるいは、本発明は標的タンパク質を含むアッセイを提供する。以下の好適な実施形態において、標的タンパク質はユビキチン部分、および少なくとも１つのユビキチン因子と混合される。
別の好適な実施形態では、本発明は、少なくとも１つのユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を変調する因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン連結因子を含有する第１のユビキチン因子、第２のユビキチン因子、候補因子、ユビキチン部分、および標的タンパク質を混合するステップと、ｂ）第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、第２の因子は好ましくは、ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子である。
別の好適な実施形態では、この方法は、混合ステップに第３のユビキチン因子をさらに含み、その際第３の因子はユビキチン活性化因子であり、その際、基質およびユビキチン部分は異なる蛍光標識を有し、その際、この標識は蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対を形成する。
別の好適な実施形態では、本発明は、ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）少なくとも１つのユビキチン部分を有する結合因子、Ｍｄｍ２タンパク質、ｐ５３タンパク質、および候補因子を混合するステップと、ｂ）ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。
さらなる好適な実施形態において、この方法は、ユビキチン結合因子およびユビキチン部分を混合し、それによって、ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することさらに含む。
さらなる好適な実施形態において、この方法は、ステップａ）で、ユビキチン部分を有するユビキチン活性化因子を混合し、それによって、ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することさらに含む。
さらなる好適な実施形態において、この方法は、ユビキチン活性化因子およびユビキチン部分を混合し、それによって、ユビキチン部分を有するユビキチン結合因子を形成することさらに含む。
別の好適な実施形態では、本発明は、ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、ＭｄＭ２タンパク質、ｐ５３タンパク質、候補因子、およびユビキチン部分を混合するステップと、ｂ）ｐ５３タンパク質へのユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。
別の好適な実施形態では、本発明は、ｐ５３タンパク質への第２のユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、ＭｄＭ２タンパク質、第１のＦＲＥＴ標識で標識された第１のユビキチン部分を有すｐ５３タンパク質、候補因子、および第２のＦＲＥＴ標識で標識されたユビキチン部分を合わせるステップと、ｂ）ＦＲＥＴ反応を検出することによってｐ５３タンパク質への第２のユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。
別の好適な実施形態では、本発明は、ｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）第１のＦＲＥＴ標識で標識されたユビキチン部分を有すユビキチン結合因子、ＭｄＭ２タンパク質、第１のユビキチン部分が第２のＦＲＥＴ標識で標識されている第２のユビキチン部分を有すｐ５３タンパク質、および候補因子を合わせるステップと、ｂ）ＦＲＥＴ反応を検出することによってｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。
別の好適な実施形態では、本発明は、ｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合を変調する候補因子をアッセイする方法であって、ａ）第１のＦＲＥＴ標識で標識されたユビキチン部分を有すユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、ＭｄＭ２タンパク質、第１のユビキチン部分が第２のＦＲＥＴ標識で標識されていることを特徴とする第２のユビキチン部分を有すｐ５３タンパク質、および候補因子を混合するステップと、ｂ）ＦＲＥＴ反応を検出することによってｐ５３タンパク質への第１のユビキチン部分の結合をアッセイするステップとを含む方法を提供する。
好適な実施形態において、目的の基質分子は、マルチウェル・プレートのウェルのような反応容器表面に結合されている。この実施形態は、目的の基質分子に結合したユビキチン部分の非結合または遊離のユビキチン部分からの分離を容易にする。ユビキチン因子または標的タンパク質を反応容器表面に結合する手法は、以下に説明されている。本方法は、全反応を一つの反応容器で行うことを可能にし、アッセイをハイスループットスクリーニングの適用に有用なものとする。
好適な実施形態においてユビキチン部分は、以下にさらに説明されるように直接または間接に標識され、標識の量が測定され、目的の基質分子へのユビキチン部分の結合量の指標とされる。したがって、本発明は、ユビキチン因子活性の簡便かつ迅速な、検出および測定を可能にする方法を提供し、アッセイをハイスループットスクリーニングの適用に有用なものとする。好適な一実施形態において標識シグナルは、以下に説明するＦＲＥＴシステムなどで、対象基質分子へのユビキチン部分の結合の程度に応じて変化する。当業者は、ユビキチンのユビキチン化を調節する因子に関するスクリーニングへの本発明の適用性を理解する。
本明細書において、「ユビキチン部分（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、ユビキチン因子によって、他のポリペプチドに転移または結合されるポリペプチドのことをいう。ユビキチン部分は、ユビキチンを含み、このユビキチンはいかなる種の生物からのもでもよく、好ましくは真核生物種からのものである。好適な実施形態において、ユビキチン部分が含有するのは哺乳動物ユビキチンであり、より好ましくはヒトユビキチンである。好適な実施形態において、ユビキチン部分は７６アミノ酸のヒトユビキチンを含む。好適な実施形態において、ユビキチン部分は図１５Ａに示されたアミノ酸配列を含む。一実施形態においては、さらに以下で説明されるように、ユビキチンの改変体が使用される。
本明細書において、「ポリユビキチン部分（ｐｏｌｙ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、１つより多い数のユビキチンを含有するユビキチン部分の鎖をいう。本明細書中で使用される場合、「モノユビキチン部分」とは、１つのユビキチン部分をいう。本発明の方法において、モノユビキチン部分またはポリユビキチン部分は、ユビキチン部分（これは、モノユビキチン部分またはポリユビキチン部分自体であり得る）の転移または結合の基質分子として用いることができる。
好適な実施形態において、ユビキチン部分が標的タンパク質に結合したとき、そのタンパク質は２６Ｓプロテアソームによる分解の標的とされる。
本明細書において、「ユビキチン部分」は天然に存在する対立遺伝子と、そのような７６アミノ酸ポリペプチドの人工改変体を包含する。好適な実施形態において、ユビキチン部分は、本明細書に参考として援用されるＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号Ｐ０２２４８の配列に相当するアミノ酸配列または核酸配列を含む。別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は、それぞれ本明細書に参考として援用されるＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号ＮＭ＿００６１５６（ＮＥＤＤ８）；ＮＭ＿００３３５２（ＳＵＭＯ−１，別名ＵＢＬ１）；ＸＭ＿０４８６９１（ＳＵＭＯ−１，別名ＵＢＬ１）；ＮＭ＿００６９３６（ｓｍｔ３ａ）；ＸＭ＿００９８０５（ｓｍｔ３ａ）；ＸＭ＿０９５４００（ｓｍｔ３ｂ）；ＮＭ＿００６９３７（ｓｍｔ３ｂ）；ＸＭ＿０４１５８３（ｓｍｔ３ｂ）；ＮＭ＿０１５７８３（ＩＳＧ１５）；またはＮＭ＿００５１０１（ＩＳＧ１５）の配列に相当するアミノ酸配列または核酸配列を含む。
ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号およびそれに相当するアミノ酸配列または核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースで見いだされる。ここで引用したＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号に相当する配列は、本明細書に参考として援用される。ＧＥＮＢＡＮＫは当技術分野で公知である。Ｂｅｎｓｏｎ，ＤＡら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｄｈ ２６：１−７（１９９８）およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／参照。好ましくは、ユビキチン部分は図１５Ａに示したアミノ酸配列を有する。好適な実施形態において、ユビキチン部分の改変体は図１５Ａに示したアミノ酸配列と、好ましくは７５％より大きい、より好ましくは８０％より大きい、さらにより好ましくは８５％より大きい、最も好ましくは９０％より大きい全体的アミノ酸配列同一性をもつ。いくつかの実施形態において、配列同一性は約９３％から９５％、または９８％という高さを示す。
別の好適な実施形態では、ユビキチン部分のタンパク質は図１５Ａに示したアミノ酸配列と、好ましくは８０％より大きい、さらにより好ましくは８５％より大きい、より好ましくは９０％より大きい、最も好ましくは９３％より大きい全体的アミノ酸配列類似性をもつ。いくつかの実施形態において、配列同一性は約９５％から９８％、または９９％という高さを示す。
当技術分野で公知なように、既知の配列に対しあるタンパク質（上記で議論されるように核酸）が配列同一性または類似性をもつかを同定するのに、多くの異なるプログラムが使用可能である。配列同一性および／または配列類似性は、当技術分野で公知な標準的技法を用いて判定できる。そのような技法には、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ，Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同定アルゴリズム（ｌｏｃａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：２４４０（１９８８）の類似性検索法（ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｍｅｔｈｏｄ）；これらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行プログラム（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＴＳ，およびＴＡＳＴＥ，ウィスコンシン・ジェネティック・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）によって記述されているベスト・フィット・シーケンス・プログラム（Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｒｏｇｒａｍ）（好ましくは初期設定を用いる）；または目視が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、同一性パーセントがＦａｓｔｅｄによって以下のパラメター基づいて計算される：ミスマッチ・ペナルティー１；ギャップ・ペナルティー１；ギャップ・サイズ・ペナルティー０．３３；およびジョイニング・ペナルティー（ｊｏｉｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）３０「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ１２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは進行的ペアワイズアライメント（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ，ｐａｉｒ ｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）を用い、関連する配列のグループから多配列アラインメントをつくる。ＰＩＬＥＵＰはまた、アラインメントをつくるのに用いたクラスター形成の関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、ＦａｎｇおよびＤｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏ１．３５：３５１−３６０（１９８７）の進行的アライメント法 （ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）の簡便化したものを用いる。進行的アライメント法は、ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９）によって記述されたものと類似のものである。有用なＰＩＬＥＵＰパラメターには、ギャップウェイト初期値３．００、ギャップ長ウェイト初期値０．１０および重みつきエンドギャップが含まれる。
有用なアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＬａｔｃｈｅｄら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）、およびＫａｒｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７（１９９３）に記述されている。特に有用なＢＬＡＳＴアルゴリズムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムであり、これはＬａｔｃｈｅｄら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉｓｔ，２６６：４６０−４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得た。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメターを用いるが、それらの多くは初期値に設定されている。調節可能なパラメターは以下の値に設定される：オーバーラップ・スパン（ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ）＝１、オーバーラップ・フラクション（ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ）＝０．１２５、ワード・スレスホルド（ｗｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１。ＨＡＳＰ ＳおよびＨＡＳＰ Ｓ２パラメターは動的値であり、特定配列の組成および対象配列が検索される特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体によって設定されるが、それらの値は、感度を増加させるために調節してもよい。
さらなる有用なアルゴリズムは、ギャップ付きＢＬＡＳＴ（ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ）であり、Ｌａｔｃｈｅｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に報告されている。ギャップ付きＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコア（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ；９に設定されたスレスホルド・パラメターＴ；キャップなし伸長を立ち上げる２ヒット法（ｔｗｏ−ｈｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｔｒｉｇｅｒ ｕｎｃａｐｐｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ）；ギャップ長ｋに対するコスト付加１０＋ｋ；１６に設定されたＵｐ；アルゴリズムのデータベース検索ステージで４０、出力ステージで６７に設定されたμ０を用いる。ギャップ付きアラインメントは、−２２ビット（ｂｉｔ）に相当するスコアによって立ち上げられる。
アミノ酸配列同一性パーセント値は、一致する同一アミノ酸残基数を、整列された（ａｌｉｇｎｅｄ）領域の「より長い」配列のアミノ酸残基総数で割ることによって決定される。「より長い」配列は、整列された領域内で最も多く実質的アミノ酸残基をもつ配列である（配列スコアを最大化するためにＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２で導入されたギャップは無視される）。
アライメントには、整列されるべき配列中にギャップを導入することが含まれ得る。加えて、図１５Ａに示したアミノ酸配列より多いか、または少ない数のアミノ酸を含む配列に関し、一実施形態において、配列同一性の百分率は、同一アミノ酸数のアミノ酸総数に対する関係に基づいて決定されるものと理解される。したがって、例えば、以下で考察されるように、図１５Ａに示したアミノ酸配列より短い配列の配列同一性は、一実施形態において、このより短い配列のアミノ酸数を用いて決定される。配列同一性の計算の際、挿入、欠失、置換などの多様な配列変異の出現に対して、相対的重み付け（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｗｅｉｇｈｔ）は行わない。
一実施形態において、同一性のみが正（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）（＋１）に加算され、ギャップを含むあらゆる形態の配列変異は「０」の値が配分される。このことは、配列類似性の計算に関して以下で記述されているような、重みつきスケールまたはパラメターの必要性を回避するものである。百分率配列同一性は、例えば、一致する同一アミノ酸残基数を、整列された領域の「より短い」配列のアミノ酸残基総数で割り、さらに１００を掛けることによって計算される。「より長い」配列は、整列された領域内で最も多く実質的アミノ酸残基をもつ配列である
本発明のユビキチン部分は、図１５Ａに示したアミノ酸配列より長い、または短いポリペプチドであってもよい。したがって、好適な実施形態において、図１５Ａに示したアミノ酸配列の部分または断片は、ユビキチン部分の定義のうちに含まれる。ここに示された一実施形態において、ユビキチン部分の断片は、それがユビキチン因子によって別のポリペプチドに結合された場合、ユビキチン部分であるとみなされる。
加えて、以下により詳しく概説されるように、本発明のユビキチン部分は、例えば、タグの付加、他の融合配列の付加、または、さらなるコード配列、もしくは非コード配列の解明によって、図１５Ａに示されたアミノ酸配列より長くすることが可能なポリペプチドである。以下に記述されるように、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＧＦＰ）などの蛍光ペプチドへのユビキチン部分の融合は、特に好ましいものである。
ユビキチン部分、および本発明の他のタンパク質は、好ましくは組換えタンパク質である。「組み換えタンパク質」は、組換え技法を用い、以下に説明されるような組換え核酸の発現を介してつくられるタンパク質である。好適な実施形態において、本発明のユビキチン部分はＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号Ｍ２６８８０もしくはＡＢ００３７３０、またはそれらの断片に相当する核酸配列の発現を介してつくられる。ほとんどの好適な実施形態において、そのような核酸は、図１５Ａに示したアミノ酸配列をコードする。組み換えタンパク質は、少なくとも１つ以上の特徴によって、天然に存在するタンパク質から区別される。例えば、そのタンパク質は、野生型宿主内で通常同伴しているタンパク質および成分のいくつか、またはすべてから単離または精製され、実質的に純粋なものであってもよい。例えば、単離されたタンパク質は、自然状態で通常同伴している物質の少なくともいくつかが除去されて（ｕｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）おり、所与試料の総タンパク質重量の少なくとも約０．５％、より好ましくは少なくとも約５％を構成する。実質的に純粋なタンパク質は、総タンパク質重量の少なくとも約７５％を構成し、少なくとも約８０％が好ましく、少なくとも約９０％が特に好ましい。この定義には、ある生物または宿主細胞中の別の生物からのタンパク質生成も含まれる。あるいは組換えタンパク質は、そのタンパク質が増大した濃度レベルでつくられるように、誘導可能なプロモーターまたは高発現プロモーターを使用することを通じて、通常みられるより有意に高濃度につくられたものであってもよい。あるいはタンパク質は、以下で論じられるような、エピトープ・タグの付加、またはアミノ酸置換、挿入、および欠失のような、自然では通常見いだされないよう形態のものであってもよい。
以下でさらに定義されているように、本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含有する分子のことをいう。核酸には、センス核酸およびアンチセンス核酸を含むゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびオリゴヌクレオチドが含まれる。そのような核酸は、生理的環境での該分子の安定性および半減期を増大させるため、リボース−リン酸骨格に修飾を含むものであってもよい。
核酸は、二本鎖、一本鎖、または二本鎖配列および一本鎖配列の両方んぽ部分を含むものであってもよい。当業者に理解されるように、ある一本鎖（「ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）」）の描写によって、もう一方の鎖（「クリック（Ｃｒｉｃｋ）」）の配列も定義される。したがって図１および図３に示した配列は、該配列の相補的配列も含む。本明細書において、「組換え核酸」という用語は、概ね、エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、自然には通常みられない形態で、始めインビトロで形成された核酸を意味する。したがって、通常結合されていないＤＮＡ分子を連結することによって、インビトロで形成される直鎖状形態の単離核酸、または発現ベクター形態の単離核酸は、本発明の目的においては、共に組み換え体とみなされる。いったん組換え核酸がつくられ、宿主細胞または宿主生物に再導入されると、それは非組み換え的に、すなわち、インビトロでの操作よりむしろ宿主細胞のインビボ細胞機構を利用して複製されると理解されるが、このような、いったん組換えによって生成された核酸は、その後非組み換え的に複製されても、本発明の目的において、なお組換え体とみなされる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本願を通して相互交換的に使用され、かつ少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、それには、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドが含まれる。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模擬構造（ｐｅｐｔｉｄｅｍｉｍｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）から構成されるものでよい。したがって本明細書において、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモ−フェニルアラニン、シトルリン、およびノルロイシンは、本発明の目的において、アミノ酸とみなされる。「アミノ酸」はまた、プロリンおよびハイドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含む。側鎖は、（Ｒ）配置でも、または（Ｓ）配置でもよい。好適な実施形態において、アミノ酸は（Ｓ）配置、すなわちＬ配置である。天然非存在の側鎖が使用される場合、例えば、インビボ分解を回避または遅延するために、非アミノ酸置換基を用いてもよい。
一実施形態において、本発明は、ユビキチン部分改変体、Ｅ１改変体、Ｅ２改変体、Ｅ３改変体などのタンパク質改変体を含有する組成物を提供する。これらの改変体は、置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体の３クラス中１つ以上のクラスに該当する。これらの改変体は、普通に、本組成物のタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発によって調製し、カセット式変異誘発もしくはＰＣＲ変異誘発または当該分野で周知の他の技術を用いて改変体をコードするＤＮＡを生成し、その後、上記に概説されているように、該ＤＮＡを組換え細胞培養中で発現させて得られる。しかし、１００〜１５０個のアミノ酸を有する改変体は、既に確立された技法を用いた生体外合成によって調製してもよい。アミノ酸配列改変体は、それらの改変体と該タンパク質アミノ酸配列の天然発生の対立遺伝子改変体または種間改変体とを区別する特性である、改変体の所定の特性によって特徴付けされる。通常、これらの改変体は、天然発生類似体と定性的に同じ生物学的活性を示すが、以下により詳細に概説されるように、特徴が変化した改変体を選択することも可能である。
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域が事前決定的であるのに対し、変異そのものは事前決定的である必要はない。例えば、所与の部位での変異効率を最適化するため、標的コドンまたは領域でランダム変異誘発を行い、最適な所望の活性に関して発現された改変体をスクリーニングしてもよい。既知の配列を有するＤＮＡ中の所定部位に置換変異を導入する方法は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発、およびＰＣＲ変異誘発がある。多数の改変体の迅速な生成は、遺伝子シャフリング（ｇｅｎｅ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）法などの技法を用いて行うことができる。この方法によって、あるヌクレオチド配列の類似改変体断片が組換えし、新規の改変体の組み合わせを産出することが可能となる。このような技術の例は、米国特許第５，６０５，７０３号、第５，８１１，２３８号、第５，８７３，４５８号、第５，８３０，６９６号、第５，９３９，２５０号、第５，７６３，２３９号、第５，９８５，４０８号、および第５，９４５，３２５で見出され、そのそれぞれは、その全体が本明細書中で参考として援用される。本発明の活性アッセイを用いて、突然変異体のスクリーニングを実行する。
アミノ酸置換は、典型的には、単一残基で起こる。挿入は、通常約１から２０のアミノ酸程度であるが、それよりかなり多い挿入も許容され得る。欠失は、約１から約２０の残基の範囲であるが、いくつかの場合で、欠失がそれより大分多くてもよい。
置換、欠失、挿入、または任意のその組合せを用いて、最終誘導体に到達することができる。一般に、これらの変化は、少数のアミノ酸上で行われて、分子の変化を最小にする。しかし、特定の状況では、より大きな変化が許容され得る。タンパク質の特質での小さい変化が望まれるとき、通常下記にリストにした典型的な置換にしたがって、元の残基の置換が行われる。
Figure 2005518824
 上記リストに示されるものより保存されにくい置換を選択することによって、機能または免疫学的アイデンティティでの置換的変化を行ってもよい。例えば、変化領域中のポリペプチド主鎖の構造、例えばアルファへリックス構造またはベータシート構造か、標的部位にある分子の電荷または疎水性か、あるいは側鎖のバルクかに、より大きく作用する置換を行ってもよい。一般に、ポリペプチドの特性で最大の変化を生み出すと予期される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはトレオニルが、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルと置換する（または、疎水性残基によって置換される）ことか、（ｂ）システインもしくはプロリンが任意の他の残基と置換する（または、任意の他の残基によって置換される）ことか、（ｃ）陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスチジルが、電気陰性残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルと置換する（または、電気陰性残基によって置換される）ことか、あるいは（ｄ）バルキー（ｂｕｌｋｙ）な側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を持たない残基、例えばグリシンと置換する（または、側鎖を持たない残基によって置換される）ことかにおける置換である。
改変体は、典型的には、天然に存在するアナログと同様の定性的生物活性を示し、かつ同様の免疫応答を誘導する。しかし、必要に応じて、改変体を選択して、タンパク質の特質を改変することも可能である。あるいは、タンパク質の生物活性を変化させるように改変体を設計してもよい。例えば、グリコシル化部位を変更または除去することが可能である。
ポリペプチドの共有結合改変は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合改変の１つの様式には、ポリペプチドの選択された側鎖、Ｎ末端残基、またはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化因子と、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることが含まれる。ニ官能性因子による誘導体化は、例えば、スクリーニングアッセイ方法で使用される水不溶性支持体マトリックスまたは表面にタンパク質を架橋するために有用であり、より詳細に下記に記載する。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸を有するエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシニミジルエステルを含む同種ニ官能性（ｈｏｍｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等のニ官能性マレイミド、メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等が挙げられる。
他の改変としては、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基へのグルタミニル残基およびアスパラギニル残基のそれぞれのアミド分解、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のアミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ．７９−８６（１９８３）、Ｎ末端アミンのアセチル化、ならびに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲内に含まれるポリペプチドの共有結合改変の別の様式には、ポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを変化させることが含まれる。「ネイティブなグリコシル化パターンを変化させる」とは、本明細書中の目的としては、ネイティブな配列のポリペプチド中で見出される１つ以上の糖質部を欠失すること、および／またはネイティブな配列のポリペプチド中には存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。
ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加を、そのアミノ酸配列を変化させることによって実行し得る。例えば、（Ｏ結合型グリコシル化部位に対する）ネイティブな配列のポリペプチドに、１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基を付加することによって、あるいは１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基で置換することによって、変化を起こすことが可能である。特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成することによって、予め選択された塩基でポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、ＤＮＡレベルでの変化を介して、任意でアミノ酸配列を変化させてもよい。
ポリペプチド上の糖質部の数を増加させる別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学結合または酵素結合によるものである。このような方法は当該分野で記載されており、例えば１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
ポリペプチド上に存在する糖質部の除去を、化学的または酵素的に、あるいはグリコシル化に対する標的として機能するアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異置換によって実行することが可能である。化学的グリコシル化技術は、当該分野で既知であり、例えばＨａｋｉｍｕｄｄｉｎら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｅｈｅｍ．、１１８；１３１（１９８１）により記載されている。多様なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することによって、ポリペプチド上の糖質部の酵素切断を実行することができ、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８；３５０（１９８７）によって記載されている。
タンパク質の共有結合改変の別の様式には、米国特許番号第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号記載の方法で、様々な非タンパク質ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１つにポリペプチドを結合することが含まれる。
別のポリペプチド、非相同ポリペプチド、またはアミノ酸配列に融合される第１のポリペプチドを有するキメラ分子を形成する方法で、本発明のポリペプチドを改変してもよい。一実施形態では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提示するタグポリペプチドとの、基質分子（例えば、ユビキチン部分、ユビキチン因子、または標的タンパク質）の融合を含む。一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端にエピトープタグを配置する。タグポリペプチドに対する抗体を用いて、ポリペプチドのこのようなエピトープタグ形態の存在を検出することができる。また、エピトープタグを設けることで、抗タグ抗体か、またはエピトープタグに結合する別のタイプの親和性マトリックスかを用いた親和性精製によって、ポリペプチドを容易に精製できる。代替の実施形態では、キメラ分子は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との、本明細書で開示されるポリペプチドの融合を含んでよい。キメラ分子の二価形態に関して、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものであり得る。本発明の成分用のタグは、以下に詳細に定義および記載される。
本発明は、目的の基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法を提供する。本発明の好適な実施形態は、ユビキチン部分およびユビキチン因子、ならびに標的タンパク質（または標的タンパク質なしで）を混合することと、さらに候補因子の存在または非存在下でそれを行うことと、ユビキチン部分が対象基質分子へ結合できる条件下でそれを行うことと、例えば基質分子に結合するユビキチン部分（モノユビキチン部分またはポリユビキチン部分）の量を測定することによって、対象基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを伴う。これらのアッセイでは、異なるユビキチン因子の組み合わせおよび個別のユビキチン因子の異なるサブユニットの組み合わせで、これに標的タンパク質をプラスまたは標的タンパク質を除いて、さらに候補ユビキチン因子の存在または非存在下で、起因する活性を観察および測定することができる。
好適な実施形態では、本発明は、さらに、ユビキチン活性化活性をアッセイする方法に関する。「ユビキチン活性化活性」、「ユビキチン部分活性化」、およびその文法的等価物は、好ましくはユビキチン活性化因子である基質分子へのユビキチン部分の結合（ｂｉｎｄｉｎｇまたはａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を意味する。好適な実施形態では、ユビキチン活性化因子は、Ｅ１である。好ましくは、Ｅ１は、ユビキチン部分と高エネルギーのチオエステル結合を形成する。
好適な実施形態では、本発明はまた、ユビキチン結合活性をアッセイする方法に関する。「ユビキチン結合活性」、「ユビキチン部分結合」、およびその文法的等価物は、ユビキチン結合因子への活性化ユビキチン部分の結合または結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を意味する。当業者に理解されるように、ユビキチン部分−ユビキチン結合因子での高エネルギーのチオエステル結合の存在により、ユビキチン連結因子（例えば、Ｅ３）の触媒的活性の非存在下で、低い割合で他のユビキチン部分に結合ユビキチン部分を連結することができる。したがって、ユビキチン部分のいくつかは、ポリユビキチン部分の形態で結合される。
好適な実施形態では、本発明は、ユビキチン連結活性をアッセイする方法に関する。「ユビキチン連結活性」、「ユビキチン部分ライゲーション」、およびその文法的等価物は、好ましくは標的タンパク質である基質分子、または好ましくは標的タンパク質に結合するモノユビキチン部分もしくはポリユビキチン部分である基質分子へのユビキチン部分の転移または結合を意味する。好ましくは、各ユビキチン部分は、次のユビキチン部分がそれに結合して複数のユビキチン部分子を含む鎖（ポリユビキチン部分）を形成できるように、ユビキチン連結因子により共有結合される。
本発明は、ユビキチン部分と、他の成分とを混合することを含む方法および組成物を提供する。「混合すること」とは、対象基質分子へのユビキチン部分の結合が起こり得る条件下で、反応容器中に、様々な成分を付加することを意味する。好適な実施形態では、反応容器は、９６ウエルプレートのウエルまたは他の市販のマルチウエルプレートのウエルである。代替の好適な実施形態では、反応容器は、ＦＡＣＳ機である。本発明で有用な他の反応容器としては、限定はされないが、３８４ウエルプレートおよび１５３６ウエルプレートが挙げられる。本発明で有用なさらに他の反応容器は、当業者には自明である。
目的の基質分子へのユビキチンの結合に適用可能な条件が得られる限り、成分の付加は、連続してもよく、または所定の順番もしくはグループ分けでもよい。このような条件は、当該分野で周知であり、そのガイダンスを以下に提供する。
好適な実施形態では、本発明の１つ以上の成分はタグを有する。「タグ」は、結合される分子か、または結合される分子の同定もしくは単離に有用な分子を意味し、好ましくは基質分子である。例えば、タグは、結合タグまたは標識タグであり得る。タグを有する成分は、「タグ−Ｘ」と称され、ここで、Ｘは成分である。例えば、タグを有するユビキチン部分は、本明細書で、「タグ−ユビキチン部分」と称される。好ましくは、タグは、結合される成分に共有結合する。組み合わせの１つより多い成分がタグを有するとき、タグは、例えば「タグ１−ユビキチン部分」のように識別用に番号を付される。成分が１つより多いタグを有する場合、各タグは、例えば「タグ１、２−ユビキチン部分」のように番号を付される。好適なタグとしては、限定はされないが、標識、結合対のパートナー、および表面基質結合分子（または結合タグ）が挙げられる。当業者には明らかであるように、多数の分子は、タグの使用方法によって、１種類より多いタグとしての使用が見出される。
「標識」とは、直接的（すなわち、１次標識）、または間接的（すなわち、２次標識）に検出され得る分子を意味する。例えば、標識を、その有無が判るように可視化および／または測定または同定することができる。当業者に理解されるように、これを実行する方法は、標識に依存する。好適な標識としては、限定はされないが、蛍光標識、標識酵素、およびラジオアイソトープが挙げられる。
「蛍光標識」とは、その固有の蛍光特性を介して検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、限定はされないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ）、スチルベン、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＴＭ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）、およびオレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ）が挙げられる。好適な光学染色については、Ｒｉｃｈａｒｄ Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄによる１９９８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されており、これは本明細書中で参考として明確に援用される。好適な蛍光標識には、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；Ｃｈａｌｆｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３（５１４８）：８０２−８０５（１９９４年２月１１日）、およびＥＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ；１．Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、１８０１ ｄｅ Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ（Ｑｕｅｂｅｃ） Ｃａｎａｄａ Ｈ３Ｈ １Ｊ９；２．Ｓｔａｕｂｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（３）：４６２−４７１（１９９８）；３．ＨｅｉｍおよびＴｓｉｅｎ，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２（１９９６））、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；１．Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、１０２０ Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ Ｃｉｒｃｌｅ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ ９４３０３）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０（１２）：５４０８−５４１７（１９９３））、β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５（８）：２６０３−２６０７（１９８８年４月））、Ｒｅｎｉｌｌａ、ＷＯ９２／１５６７３；ＷＯ９５／０７４６３；ＷＯ９８／１４６０５；ＷＯ９８／２６２７７；ＷＯ９９／４９０１９；米国特許第５，２９２，６５８号；米国特許第５，４１８，１５５号；米国特許第５，６８３，８８８号；米国特許第５，７４１，６６８号；米国特許第５，７７７，０７９号；米国特許第５，８０４，３８７号；米国特許第５，８７４，３０４号；米国特許第５，８７６，９９５号；および米国特許第５，９２５，５５８号が含まれる。上記に引用した参考文献は全て本明細書中で参考として明確に援用される。
いくつかの例では、複数の蛍光標識を利用する。好適な実施形態では、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対のメンバーである少なくとも２つの蛍光標識を用いる。ＦＲＥＴは、当該分野で公知の現象であり、光子を放出することなく、１つの蛍光色素の励起がもう１つの蛍光色素に転移する。ＦＲＥＴ対は、ドナー蛍光団およびアクセプター蛍光団からなる。ドナーの蛍光発光スペクトルと、アクセプターの蛍光吸収スペクトルとが重ならなければならず、かつ２つの分子は近接していなければならない。ドナーの５０パーセントが不活性化される（エネルギーがアクセプターに転移される）ドナーとアクセプターとの間の距離は、フェルスター半径（Ｒ０）によって定義され、これは通常１０〜１００Åである。ＦＲＥＴ対を構成する蛍光発光スペクトルの変化が検出可能であり、その数値での変化は近接していることを示唆している（すなわち、互いの１００Å以内）。これは、典型的には、２つの分子の結合または解離に起因し、そのうちの一方は、ＦＲＥＴドナーで標識されており、他方は、ＦＲＥＴアクセプターで標識されており、この際、このような結合によって、ＦＲＥＴ対の近接が引き起こされる。このような分子の結合によって、アクセプターの蛍光発光の増加および／またはドナーの蛍光発光の消光が生じる。
本発明で有用なＦＲＥＴ対（ドナー／アクセプター）としては、限定はされないが、ＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、フルオレセイン／ＬＣレッド６４０、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／Ｃｙ５．５、およびフルオレセイン／ＬＣレッド７０５が挙げられる。
ＦＲＥＴの別の局面では、蛍光ドナー分子および非蛍光アクセプター分子（「クエンチャー」）を用いることも可能である。この適用では、クエンチャーがドナーの近接から外れると、ドナーの蛍光発光が増加し、クエンチャーがドナーに近接されると、蛍光発光は減少する。有用なクエンチャーとしては、限定はされないが、ＤＡＢＣＹＬ、ＱＳＹ７、およびＱＳＹ３３が挙げられる。有用な蛍光ドナー／クエンチャー対としては、限定はされないが、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、テキサス・レッド／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファー・イエロー／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が挙げられる。
当業者には、ＦＲＥＴおよびフルオレセイン・クエンチングにより、長期にわたる標識分子の結合のモニタリングが可能になり、結合反応の時間経過に関する継続的な情報が提供されることが認識される。
他のユビキチン部分上のリシン残基を含むリシン残基へのその末端カルボキシル基の連結によって、基質分子にユビキチン部分を連結することを忘ないことが重要である。したがって、標識または他のタグの結合は、ユビキチン部分上のこれらの活性基のいずれをも干渉するべきではない。標識に対する結合点を提供する明白な目的のために、当該分野で周知であり、かつ本明細書に開示される手段を介して、タンパク質配列にアミノ酸を付加してもよい。好適な実施形態では、１つ以上のアミノ酸を、タグ、好ましくは蛍光標識をそれに結合させるために、成分の配列に付加する。好適な実施形態では、蛍光標識が結合するアミノ酸はシステインである。
「標識酵素」とは、検出可能な産物を産生する標識酵素基質の存在下で反応することができる酵素を意味する。本発明で使用するための好適な標識酵素としては、限定はされないが、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコース・オキシダーゼが挙げられる。このような基質の使用方法は、当該分野で周知である。標識酵素の存在は概ね、同定可能な産物を産生する標識酵素基質との酵素の触媒反応を介して明らかになる。このような産物は、テトラメチル・ベンジジンとホースラディッシュ・ペルオキシダーゼとの反応のように不透明でありえ、多様な色を持つことが可能である。蛍光反応産物を産生するルミノール（Ｌｕｍｉｎｏｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から入手可能）等の他の標識酵素基質が開発されている。標識酵素基質を用いて標識酵素を同定する方法は、当該分野で周知であり、多くのキットが市販されている。様々な標識酵素の使用例および方法は、Ｓａｖａｇｅら、Ｐｒｅｖｉｅｗｓ ２４７：６−９（１９９８）、Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：２２７−２３６（１９８９）に記載されており、これらの文献の各々の全体を本明細書で援用する。
「ラジオアイソトープ」とは、任意の放射性分子を意味する。本発明で使用するための好適なラジオアイソトープとしては、限定はされないが、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが挙げられる。標識としてのラジオアイソトープの使用に関しては当該分野で周知である。
さらに、標識を間接的に検出することが可能である。すなわち、タグは、結合対のパートナーである。「結合対のパートナー」とは、第１の部および第２の部の１つを意味し、該第１の部および該第２の部は、互いに対して特異的な結合親和性を有する。本発明で使用するための好適な結合対としては、限定はされないが、抗原／抗体（例えば、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）／抗ＤＮＰ、ダンシル−Ｘ／抗ダンシル、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ルシファー・イエロー／抗ルシファー・イエロー、およびローダミン／抗ローダミン）、ビオチン／アビジン（またはビオチン／ストレプトアビジン）、およびカルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）／カルモジュリンが挙げられる。他の好適な結合対としては、ＦＬＡＧ−ペプチド（Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：１２０４−１２１０（１９８８））、ＫＴ３エピトープ・ペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２））、チューブリン・エピトープ・ペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．、２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１））、およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチド・タグ （Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３９３−６３９７（１９９０））等のポリペプチドと、それらに対するそれぞれの抗体とが挙げられる。一般に、好適な実施形態では、ユビキチン部分ライゲーションでは立体的な考慮が重要であることから、結合対のパートナーの小さい方がタグとして機能する。当業者に理解されるように、標識以外の適用で、結合対のパートナーを用いてもよく、以下にさらに記載する。
当業者に理解されるように、１つの結合対のパートナーは、別の結合対のパートナーであってもよい。例えば、抗原（第１の部分）を第１の抗体（第２の部分）と結合させることも可能であり、更に、この第１の抗体（第２の部分）が第２の抗体（第３の部分）に対する抗原であってもよい。このような状況により、第１の部分と、第３の部分との間接的な結合は、それぞれに対する結合対のパートナーである媒介役の第２の部分を介して可能になることがさらに認識される。
当業者に理解されるように、結合対のパートナーは、上述のように、標識を有することが可能である。これにより、標識を有する結合パートナーの結合で、タグが間接的に標識され得ることがさらに認識される。結合対のパートナーであるタグに標識を結合させることは、今記載したように、「間接的標識」として本明細書中で言及される。
「表面基質結合分子」または「結合タグ」、およびその文法的等価物は、特定の表面基質に対して結合親和性を有する分子を意味し、この基質は、一般に、表面に塗布されるか、組み込まれるか、またはそれ以外で結合される結合対のメンバーである。好適な表面基質結合分子およびそれらの表面基質としては、限定はされないが、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）タグまたはポリヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグおよびニッケル基質と、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ・タグおよびその抗体基質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）と、インフルエンザＨＡタグ・ポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５基質（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８：２１５９−２１６５（１９８８））と、ｃ−ｍｙｃタグならびにそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体基質（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、５；３６１０−３６１６（１９８５））と、ヘルペス単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体基質（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、３（６）：５４７−５５３（１９９０））とが挙げられる。一般に、本発明で有用な表面結合基質分子としては、限定はされないが、ニッケル基質に結合するポリヒスチジン構造（Ｈｉｓ−ｔａｇ）と、抗体を含む表面基質に結合する抗原と、アビジン基質に結合するハプテン（例えばビオチン）と、カルモジュリンを含む表面基質に結合するＣＢＰとが挙げられる。
抗体組み込み基質の産生は周知である。Ｓｌｉｎｋｉｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２：３４２−３４８（１９９１）；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら、上掲；Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ，Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；Ｋｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：６１７６−６１８５（１９９４）；およびＷｉｌｂｕｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：２２０−２３５（１９９４）（その全ては、参照により明確に本明細書で援用される）を参照せよ。抗原を有するタンパク質の結合および生産に関しては上記に記載されている。
カルモジュリン組み込み基質は市販されおり、ＣＢＰを有するタンパク質の産生に関しては、Ｓｉｍｃｏｘら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ８：４０−４３（１９９５）に記載されており、これは、全体として参照により本明細書で援用される。
当業者に理解されるように、タグの形態に大きく依存して、様々な方法で、本発明のタグ成分を構築することができる。本発明の成分およびタグは、好ましくは、共有結合によって結合する。
タグもポリペプチドであるときの組換え手段によるタグ−ポリペプチドの産生に関しては下記に記載される。ＦＬＡＧ標識タンパク質の産生は当該分野で周知であり、このような産生用のキットが市販されている（例えばＫｏｄａｋおよびＳｉｇｍａから）。ＦＬＡＧ標識タンパク質の産生および使用方法に関しては、例えばＷｉｎｓｔｏｎら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１３：２７０−２８３（１９９９）と、上記のキットに備えられた産生ハンドブックとで見つけられ、全体として本明細書で援用される。
標的分子および基質のビオチン標識は、周知であり、例えば、タンパク質、核酸、糖質、カルボン酸のビオチン標識用のアミン反応因子およびチオール反応因子を含む多数のビオチン標識因子が知られている。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ、Ｈａｕｇｌａｎｄ，６ｔｈ Ｅｄ．１９９６の第４章を参照せよ。これは、参照として本明細書で援用される。アビジンまたはストレプトアビジンを介して、ビオチン標識成分にビオチン標識基質を結合することができる。同様に、多数のハプテン標識試薬も公知である（Ｉｄ．）。
ラジオアイソトープでタンパク質を標識する方法は、当該分野で公知である。例えば、このような方法は、Ｏｈｔａら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ３：５３５−５４１（１９９９）で見つけられ、全体として参照により本明細書で援用される。
組換え手段によるＨｉｓ−ｔａｇを有するタンパク質の生産は周知であり、このようなタンパク質の産生用のキットが市販されている。このようなキットおよびその使用は、Ｑｉａｇｅｎから得られるＪｏａｎｎｅ ＣｒｏｗｅらによるＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されており、参照により本明細書に明確に援用される。
チオール、アミン、カルボキシル等の化学的反応基を用いた標識の官能性化は、当該分野で公知である。好適な実施形態では、タグを官能性化して、共有結合を促進する。
タグの共有結合は、直接的であってもよく、またはリンカーを介してもよい。一実施形態では、リンカーは相対的に短い結合部であり、分子を結合させるために用いられる。結合部は、本発明の成分、例えばユビキチン部分上に、直接合成されることが可能であり、かつタグの結合を促進する少なくとも１つの官能基を含む。あるいは、結合部は、少なくとも２つの官能基を有ることが可能であり、これを用いて、例えば、官能性化タグに官能性化成分を結合させる。付加的な実施形態では、リンカーはポリマーである。この実施形態では、共有結合を直接的に実行するか、あるいはポリマーへ成分またはタグから得た部を結合させることを用いて実行する。好適な実施形態では、共有結合は直接的である。すなわちリンカーを使用しない。この実施形態では、成分は、好ましくは、カルボン酸等の官能基を有し、これは、官能性化タグへの直接結合のために用いられる。成分およびタグは、上記に明記したものを含む様々な方法で結合され得ることが理解されるべきである。重要なことは、結合方法が成分の官能性を著しく変化させないことである。例えば、タグ−ユビキチン部分では、ユビキチン部分が別のユビキチン部分に共有結合して、ポリユビキチン部分鎖を形成することが可能な方法で、タグを結合させるべきである。当業者に理解されるように、標識およびユビキチン部分の共有結合の上記の記載内容は、本発明の開示の実質的に任意の２つの分子の結合に同等に適用される。
好適な実施形態では、上記に概説したように、タグを官能性化して、共有結合を促進する。したがって、多様なタグが市販されており、これには、限定はされないが、イソチオシアネート基、アミノ基、ハロアセチル基、マレイミド、スクシンイミジル・エステル、およびスルホニルハライド混合物を含む官能基が含有され、本明細書に記載されるように、その全ては、第２の分子にタグを共有結合させるために使用され得る。タグの官能基の選択は、上記に概説したリンカーまたは本発明の成分への結合の部位に依存する。したがって、当該分野で公知であるように、例えば、ユビキチン部分のカルボン酸基への直接結合に対しては、例えば１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いたカルボジイミド化学反応を介しての結合のために、アミノ修飾タグまたはヒドラジン修飾タグを用いる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ（上掲）の第９章および第１１章を参照し、Ｐｉｅｒｃｅ １９９４ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｔ−１５５〜Ｔ−２００ページも参照せよ。この両方は、参照として本明細書で援用される）。一実施形態では、本明細書に記載される多数のタグ用に市販されているもの等のタグに、カルボジイミドを最初に結合させる。
好適な実施形態では、ユビキチン部分は、タグ−ユビキチン部分の形態であり、この際タグは結合対のパートナーである。好ましくは、この実施形態では、タグはＦＬＡＧであり、結合パートナーは抗ＦＬＡＧである。好ましくは、この実施形態では、間接標識によって、標識をＦＬＡＧに結合させる。好ましくは、標識は標識酵素である。最も好ましくは、標識酵素はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼであり、これは、蛍光標識酵素基質と反応する。好ましくは、標識酵素基質はルミノールである。あるいは、標識は蛍光標識である。
別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は、タグ−ユビキチン部分の形態であり、この際タグは蛍光標識である。特定の好適な実施形態では、ユビキチン部分は、タグ１−ユビキチン部分およびタグ２−ユビキチン部分の形態であり、この際タグ１およびタグ２は、ＦＲＥＴ対のメンバーである。別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は、タグ１−ユビキチン部分およびタグ２−ユビキチン部分の形態であり、この際タグ１は蛍光標識であり、タグ２は蛍光標識のクエンチャーである。これらの好適な実施形態のいずれかでは、ユビキチン因子の活性を介して、タグ１−ユビキチン部分およびタグ２−ユビキチン部分が対象基質分子に結合するとき、好ましくは、タグ１およびタグ２は、互いの１００Å内であり、より好ましくは７０Å内であり、さらに好ましくは５０Å内であり、さらにより好ましくは４０Å内であり、いくつかの場合では、３０Å以下内である。
さらに別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は、タグ１、２−ユビキチン部分およびタグ１、３−ユビキチン部分の形態であり、この際タグ１は、結合対、好ましくはＦＬＡＧのメンバーであり、タグ２は蛍光標識であり、タグ２およびタグ３がＦＲＥＴ対のメンバーになるようにタグ３が蛍光標識であるか、またはタグ３はタグ２のクエンチャーである。
好適な実施形態では、本明細書に記載されるような組換え技術を用いて、ユビキチン部分配列に１つ以上のアミノ酸を付加して、タグに対する、好ましくは蛍光標識またはクエンチャーに対する結合点を設ける。好適な実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、ＣｙｓまたはＡｌａ−Ｃｙｓである。好ましくは、ユビキチン部分のＮ末端に１つ以上のアミノ酸を結合させる。好適な実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、ＦＬＡＧタグおよびユビキチン部分の配列に介在する。好適な実施形態では、付加されたシステインに、タグを、好ましくは蛍光標識またはクエンチャーを結合させる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ユビキチン活性化因子の使用を含む。本明細書で使用する場合、「ユビキチン活性化因子」とは、ユビキチン結合因子にユビキチン部分を転移または結合させることができるユビキチン因子（好ましくはタンパク質）を指す。好適な実施形態では、ユビキチン活性化因子は、ユビキチン部分と高エネルギーのチオールエステル結合を形成することによって、ユビキチン部分を「活性化」する。別の好適な実施形態では、ユビキチン活性化因子は、ユビキチン部分に結合または結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）する。別の好適な実施形態では、ユビキチン活性化因子は、モノユビキチン部分またはポリユビキチン部分である基質分子に、ユビキチン部分を転移または結合させることができる。好適な実施形態では、ユビキチン活性化因子は、モノユビキチン化ユビキチン結合因子またはポリユビキチン化ユビキチン結合因子にユビキチン部分を転移または結合させることができる。
好適な実施形態では、ユビキチン活性化因子はＥ１である。好適な実施形態では、Ｅ１は、下記に定義されるように、Ｅ２にユビキチン部分を転移または結合させることができる。
本発明の方法および組成物では、ユビキチン活性化因子は、以下の表１に列挙され、本明細書中に参考として援用される、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号の配列に対応するアミノ酸配列または核酸を含む。
Figure 2005518824
 ユビキチン活性化因子をコードする配列を用いて、本発明の方法および組成物で使用するのに適したその改変体を構築することも可能である。本発明の方法および組成物で使用するのに適したユビキチン活性化因子および改変体を本明細書に記載するように構築することが可能である。
好適な実施形態では、本発明で有用なＥ１タンパク質としては、本明細書中に参考として援用される、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ａ３８５６４、Ｓ２３７７０、ＡＡＡ６１２４６、Ｐ２２３１４、ＣＡＡ４０２９６、およびＢＡＡ３３１４４に対応するアミノ酸配列にコードされるポリペプチドが挙げられる。好適な実施形態では、Ｅ１は、図６Ｂで示されるようなアミノ酸配列を有するか、または図６Ａに示されるような配列を含む核酸にコードされる。好ましくは、Ｅ１はヒトＥ１である。Ｅ１は、Ａｆｆｉｎｉｔｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅｘｅｔｅｒ、Ｕ．Ｋ．）から市販されている。
好適な実施形態では、本発明用のＥ１タンパク質を生産するために用いられる核酸としては、本明細書中に参考として援用される、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｍ５８０２８、Ｘ５６９７６、およびＡＢ０１２１９０に開示されているものが挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態では、Ｅ１は、図６Ａに示される配列から本質的になる配列を有する核酸によってコードされる。引用したＥ１タンパク質の改変体も用語「Ｅ１」に含まれ、本明細書に記載するように作製され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ユビキチン結合因子の使用を含む。本明細書で使用する場合、「ユビキチン結合因子」とは、ユビキチン連結因子にユビキチン部分を転移または結合させることができるユビキチン因子（好ましくはタンパク質）を指す。いくつかの場合、ユビキチン結合因子は、標的タンパク質中のリジン残基にユブキチン部分を直接的に転移または結合させることができる（Ｈｅｒｓｈｋｏら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８２０６−８２１４）。好適な実施形態では、ユビキチン結合因子は、好ましくはユビキチン因子または標的タンパク質に結合した、モノユビキチン部分またはポリユビキチン部分にユビキチン部分を転移または結合させることができる。好適な実施形態では、ユビキチン結合因子は、モノユビキチン化ユビキチン連結因子またはポリユビキチン化ユビキチン連結因子にユビキチン部分を転移させることができる。
好適な実施形態では、ユビキチン結合因子はＥ２である。好適な実施形態では、ユビキチン部分は、Ｅ１からＥ２に転移される。好適な実施形態では、転移により、Ｅ２とユビキチン部分との間に形成されるチオールエステル結合を生じる。好適な実施形態では、Ｅ２は、下記に定義されるＥ３にユブキチン部分を転移または結合させることができる。
本発明の方法および組成物では、ユビキチン結合因子は、下記で表２に列挙し、本明細書中に参考として援用される、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号の配列に対応するアミノ酸配列または核酸配列を含む。
Figure 2005518824
Figure 2005518824
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 ユビキチン結合因子をコードする配列を用いて、本発明の方法および組成物で使用するのに適したその改変体を作製することもできる。本発明の方法および組成物で使用するのに適したユビキチン結合因子および改変体は、本明細書に記載されるように作製され得る。
好適な実施形態では、本発明の方法および組成物で用いられるＥ２は、以下のリストのＧｅｎｂａｎｋデータベース登録番号に対応する配列のアミノ酸配列または核酸配列を含む：ＡＣ３７５３４、Ｐ４９４２７、ＣＡＡ８２５２５、ＡＡＡ５８４６６、ＡＡＣ４１７５０、Ｐ５１６６９、ＡＡＡ９１４６０、ＡＡＡ９１４６１、ＣＡＡ６３５３８、ＡＡＣ５０６３３、Ｐ２７９２４、ＡＡＢ３６０１７、Ｑ１６７６３、ＡＡＢ８６４３３、ＡＡＣ２６１４１、ＣＡＡ０４１５６、ＢＡＡ１１６７５、Ｑ１６７８１、ＮＰ＿００３３３３、ＢＡＢ１８６５２、ＡＡＨ００４６８、ＣＡＣ１６９５５、ＣＡＢ７６８６５、ＣＡＢ７６８６４、ＮＰ＿０５５３６、Ｏ００７６２、ＸＰ＿００９８０４、ＸＰ＿００９４８８、ＸＰ＿００６８２３、ＸＰ＿００６３４３、ＸＰ＿００５９３４、ＸＰ＿００２８６９、ＸＰ＿００３４００、ＸＰ＿００９３６５、ＸＰ＿０１０３６１、ＸＰ＿００４６９９、ＸＰ＿００４０１９、Ｏ１４９３３、Ｐ２７９２４、Ｐ５０５５０、Ｐ５２４８５、Ｐ５１６６８、Ｐ５１６６９、Ｐ４９４５９、Ｐ３７２８６、Ｐ２３５６７、Ｐ５６５５４、およびＣＡＢ４５８５３であり、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。特に好ましいのは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号ＮＰ００３３３１、ＮＰ００３３３０、ＮＰ００３３２９、Ｐ４９４２７、ＡＡＢ５３３６２、ＮＰ００８９５０、ＸＰ００９４８８、およびＡＡＣ４１７５０に対応する配列（これらもまた、参考として援用される）である。当業者には、多数の異なるＥ２タンパク質およびイソ酵素が当該分野で既知であり、Ｅ２がユビキチン結合活性を有しさえすれば、本発明で使用され得ることが認識される。本明細書で記載されるように作製可能なＥ２の改変体も用語「Ｅ２」内に特に含まれる
好適な実施形態では、Ｅ２は、Ｕｂｃ５（Ｕｂｃｈ５、好ましくはＵｂｃｈ５ｃ）、Ｕｂｃ３（Ｕｂｃｈ３）、Ｕｂｃ４（Ｕｂｃｈ４）、およびＵｂｃＸ（Ｕｂｃ１０、Ｕｂｃｈ１０）の１つである。好適な実施形態では、Ｅ２はＵｂｃｈ５ｃである。好適な実施形態では、Ｅ２は、図７Ｂに示されるアミノ酸配列を有するか、または図７Ａに示される配列から本質的になる核酸によってコードされる。
本発明の方法および組成物に用いられるＥ２は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号Ｌ２２０５、Ｚ２９３２８、Ｍ９２６７０、Ｌ４０１４６、Ｕ３９３１７、Ｕ３９３１８、Ｘ９２９６２、Ｕ５８５２２、Ｓ８１００３、ＡＦ０３１１４１、ＡＦ０７５５９９、ＡＪ０００５１９、ＸＭ００９４８８、ＮＭ００７０１９、Ｕ７３３７９、Ｌ４０１４６、またはＤ８３００４に対応する配列の核酸配列を含み、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。上述のように、核酸をコードするこれらのＥ２および他のＥ２の改変体を用いて改変体Ｅ２タンパク質を作製することもできる。
好適な実施形態では、Ｅ２を作製するために用いられる核酸は、図７Ａに示される配列を含む。
好適な実施形態では、上記に定義したように、Ｅ２はタグを有し、複合体は、「タグ−Ｅ２」として本明細書で言及される。好適なＥ２タグとしては、標識、結合対のパートナー、および基質結合エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。最も好適な実施形態では、タグは、Ｈｉｓ−タグまたはＧＳＴ−タグである。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ユビキチン連結因子の使用を含む。本明細書で使用する場合、「ユビキチン連結因子」とは、標的分子にユビキチン部分を転移または結合させることができるユビキチン因子（好ましくはタンパク質）を指す。いくつかの場合、ユビキチン因子は、それ自体または別のユビキチン連結因子にユビキチン部分を転移または結合させることができる。好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＥ３である。
本明細書で使用する場合、「Ｅ３」とは、ユビキチン連結因子としてＥ３の活性に関連する（すなわち、標的タンパク質への、いくつかの場合はそれ自体または別のＥ３へのユビキチン部分のライゲーションまたは結合に関連する）１つ以上のサブユニット（好ましくはポリペプチド）を含むユビキチン連結因子を指す。好適な実施形態では、Ｅ３は、ＨＥＣＴドメインＥ３連結因子のメンバーである。別の好適な実施形態では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガードメインＥ３連結因子のメンバーである。好適な実施形態では、Ｅ３は、ｒｉｎｇフィンガーサブユニットおよびキュリンサブユニットを含む。本発明の方法および組成物で使用するのに適したＲＩＮＧフィンガーポリペプチドの例としては、ＲＯＣ１，ＲＯＣ２、およびＡＰＣ１１が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の方法および組成物で使用するのに適したキュリンポリペプチドの例としては、ＣＵＬ１、ＣＵＬ２、ＣＵＬ３、ＣＵＬ４Ａ、ＣＵＬ４Ｂ、ＣＵＬ５、およびＡＰＣ２が挙げられるがこれらに限定されない。別の好適な実施形態では、Ｅ３は、ｍｄｍ２である。
本発明の方法および組成物では、ユビキチン連結因子は、下記の表３に列挙され、本明細書中に参考として援用される、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＥＭＢＬ）データベース、またはＥＮＳＥＭＢＬデータベース（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓとＳａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅとの共同事業）の登録番号に対応する配列のアミノ酸配列または核酸配列を含む。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの登録番号は、上述したように見つけられ得る。ＥＭＢＬデータベースの登録番号は、ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ．で見つけられる。ＥＮＳＥＭＢＬデータベースの登録番号は、ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒ．で見つけられる。
Figure 2005518824
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Figure 2005518824
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 ユビキチン活性化因子をコードする配列を用いても、本発明の方法および組成物で使用するのに適したその改変体を作製することができる。本発明の方法および組成物で使用するのに適したユビキチン連結因子および改変体を本明細書に記載するように作製することが可能である。
好適な実施形態では、ＲＩＮＧフィンガーサブユニットは、本明細書中に参考として援用される、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＤ３０１４７、ＡＡＤ３０１４６、または６３２０１９６に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むがこれらに限定されない。より好適な実施形態では、ｒｉｎｇフィンガータンパク質は、図８、図９、および図１０Ｂで示されるものからなる群より選択される配列を有する。
好適な実施形態では、キュリンは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号４５０３１６１、ＡＡＣ５０５４４、ＡＡＣ３６６８１、４５０３１６３、ＡＡＣ５１１９０、ＡＡＤ２３５８１、４５０３１６５、ＡＡＣ３６３０４、ＡＡＣ３６６８２、ＡＡＤ４５１９１、ＡＡＣ５０５４８、Ｑ１３６２０、４５０３１６７、またはＡＡＦ０５７５１に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むがこれらに限定されず、そのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。さらに、本発明の文脈では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質およびキュリンのそれぞれは、本明細書で上述したように、既知の配列または列挙した配列の改変体を包含する。
好適な実施形態では、キュリンは、図１１Ｂおよび１２Ｂに示される配列を有する。
これらのＥ３連結因子および改変体を本明細書に記載されるように作製することが可能である。好適な実施形態では、ＲＩＮＧフィンガータンパク質を作製するために用いられる核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１４２０５９、ＡＦ１４２０６０に開示される核酸配列およびＮＣ００１１３６の４３３４９３〜４３３９９０の核酸を有するものを含むがこれらに限定されない。好適な実施形態では、キュリンは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＭ００３５９２、Ｕ５８０８７、ＡＦ０６２５３６、ＡＦ１２６４０４、ＮＭ００３５９１、Ｕ８３４１０、ＮＭ００３５９０、ＡＢ０１４５１７、ＡＦ０６２５３７、ＡＦ０６４０８７、ＡＦ０７７１８８、Ｕ５８０９１、ＮＭ００３４７８、Ｘ８１８８２、およびＡＦ１９１３３７に開示される核酸配列を有するものを含むがこれらに限定されない核酸から作製され、そのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。上述のように、これらの配列の改変体も、本発明により包含される。
好適な実施形態では、ＲＯＣ２を生産するために用いられる核酸は、図１２Ａに図示される配列を含む。好適な実施形態では、ＣＵＬ５を生産するために用いられる核酸は、図１３Ａに図示される配列を含む。好適な実施形態では、ＡＰＣ２を生産するために用いられる核酸は、図１４Ａに図示される配列を含む。
好適な実施形態では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組み合わせであるＡＰＣ１１／ＡＰＣ２を含む。別の好適な実施形態では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組み合わせであるＲＯＣ１／ＣＵＬ１を含む。別の好適な実施形態では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組み合わせであるＲＯＣ１／ＣＵＬ２を含む。さらに別の好適な実施形態では、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガータンパク質／キュリンの組み合わせであるＲＯＣ２／ＣＵＬ５を含む。しかし、当業者には、Ｅ３成分の任意の組み合わせを本明細書に記載される発明において生産および使用できることが認識される。
別の実施形態では、Ｅ３は、リガーゼＥ３−α、Ｅ３Ａ（Ｅ６−ＡＰ）、ＨＥＲＣ２、ＳＭＵＲＦ１、ＴＲＡＦ６、Ｍｄｍ２、Ｃｂｌ、Ｓｉｎａ／Ｓｉａｈ、Ｉｔｃｈｙ、ＩＡＰ、またはＮＥＤＤ−４を含む。この実施形態では、リガーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＣ３９８４５、Ｑ０５０８６、ＣＡＡ６６６５５、ＣＡＡ６６６５４、ＣＡＡ６６６５６、ＡＡＤ０８６５７、ＮＰ＿００２３８３、ＸＰ＿００６２８４、ＡＡＣ５１９７０、ＸＰ＿０１３０５０、ＢＡＢ３９３８９、Ｑ００９８７、ＡＡＦ０８２９８、またはＰ４６９３４に開示されるもののアミノ酸配列を有し、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。上記のように、改変体も本発明により包含される。この実施形態用のＥ３を作製するための核酸は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０６１５５６、ＸＭ００６２８４、Ｕ７６２４７、ＸＭ０１３０５０、Ｘ８９８０３２、Ｘ９８０３１、Ｘ９８０３３、ＡＦ０７１１７２、Ｚ１２０２０、ＡＢ０５６６６３、ＡＦ１９９３６４、およびＤ４２０５５に開示される配列を有するものと、その改変体とを含むがこれらに限定されない。
Ｅ３は、ＳＫＰ１およびＦ−ボックスタンパク質等の他の成分も含み得る。ＳＫＰ１に対するアミノ酸配列および核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＣ５０２４１およびＵ３３７６０にそれぞれ対応する。多数のＦ−ボックスタンパク質が当該分野で既知であり、それらのアミノ酸配列および核酸配列は、発表されている様々なソースから当業者により容易に得られる。
好適な実施形態では、本明細書に記載されるように、Ｅ３成分を組換え的に生産する。好適な実施形態では、Ｅ３成分は、同一宿主細胞で共発現する。２つ以上のＥ３成分をコードする核酸を含むベクターで細胞を形質転換することによって、またはそれぞれが所望のＥ３タンパク質複合体の１つの成分を含む別個のベクターで宿主細胞を形質転換することによって、共発現を達成することが可能である。好適な実施形態では、実施例でさらに詳細に記載されるように、ＲＩＮＧフィンガータンパク質およびキュリンを、それぞれが一方または他方のポリペプチドをコードする核酸を含む２つのベクターでトランスフェクションされた単一宿主中で発現させる。
好適な実施形態では、Ｅ３はタグを有し、この複合体は、「タグ−Ｅ３」として本明細書中で言及される。好ましくは、Ｅ３の１つの成分のみにタグを結合させる。好適なＥ３タグとしては、標識、結合対のパートナー、および基質結合エレメントが挙げられるがこれらに限定されない。より好ましくは、タグは表面基質結合分子である。最も好ましくは、タグは、Ｈｉｓ−タグまたはＧＳＴ−タグである。
本発明の方法および組成物で使用するのに適したユビキチン部分、ユビキチン因子、および標的分子を下記に記載されるようにクローニングおよび発現させることができる。したがって、プローブまたは縮重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマー配列を用いて、ヒトまたは他の生体から得た他の関連または変異したユビキチン部分、ユビキチン因子、および標的タンパク質を検出することが可能である。当業者に理解されるように、特に有用なプローブおよび／またはＰＣＲプライマー配列は、核酸配列の固有の領域を含む。当該分野で一般に公知のように、好適なＰＣＲプライマーは、約１５から約３５のヌクレオチド長であり、好ましくは約２０から約３０であり、必要であればイノシンを含んでよい。ＰＣＲ反応の条件は、当該分野で周知である。したがって、本明細書で引用される配列中の配列とともに、これらの配列の部分が提供され、この際１５以上のヌクレオチドの固有部分が特に好ましいこともまた理解される。当業者は、慣例的に、所望の長さにヌクレオチド配列を合成または切断できる。
その天然ソースから単離された後、例えばプラスミドまたは他のベクター内に含有されるか、あるいは線状核酸セグメントとしてそれから切り出された後、組換え核酸をプローブとしてさらに用いて、他の核酸を同定および単離することができる。それを「前駆体」核酸として用いて、修飾または変異した核酸およびタンパク質を構築することもできる。
タンパク質をコードする本発明の核酸を用いて、多様な発現ベクターを構築する。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに組み込まれるベクターのどちらかであり得る。一般に、これらの発現ベクターは、タンパク質をコードする核酸に作用可能に結合する転写および翻訳調節核酸を含む。用語「制御配列」とは、特定の宿主生体中の作用可能に結合するコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、任意でオペレーター配列、およびリボソーム結合部位を含む。プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用する真核細胞が既知である。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれるとき、「作用自在に結合する」。例えば、プレシークエンスまたは分泌リーダーに対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドに対するＤＮＡに作用自在に結合する。プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合、コード配列に作用自在に結合する。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作用自在に結合する。別の例としては、作用自在に結合するとは、隣接するように結合するＤＮＡ配列を指し、分泌リーダーの場合は、隣接するように、かつリーディング・フレーム中であるように結合するＤＮＡ配列を指す。しかし、エンハンサーは、隣接してはならない。都合のよい制限部位でライゲーションすることによって、結合を実行する。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド・アダプターまたはリンカーを、従来の実施にしたがって用いる。転写および翻訳調節核酸は、一般に、タンパク質を発現させるために用いられる宿主細胞に対して適当である；例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から得た転写および翻訳調節核酸配列は、好ましくはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中で、タンパク質を発現させるために用いられる。様々な宿主細胞に対して、多種類の適当な発現ベクターおよび好適な調節配列が当該分野で既知である。
一般に、転写および翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および転写停止配列、翻訳開始および翻訳停止配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を含んでよいが、これらに限定されない。好適な実施形態では、調節配列は、プロモーター、転写開始配列、および転写停止配列を含む。
プロモーター配列は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたはハイブリッド・プロモーターのいずれかであり得る。１つより多いプロモーターの因子を混合するハイブリッド・プロモーターもまた当該分野で既知であり、本発明に有用である。
さらに、発現ベクターは、付加的な因子を含んでよい。例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有してよく、これによって、２つの生体中で、例えば発現用の哺乳動物細胞または昆虫細胞中と、クローニングおよび増幅用の原核細胞宿主中とで維持されることが可能になる。さらに、発現ベクターを組み込むために、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに相同な少なくとも１つの配列を含み、好ましくは、発現コンストラクトに隣接する２つの相同配列を含む。ベクター中で融合するための適当な相同配列を選択することによって、組み込み用のベクターを宿主細胞中の特異的遺伝子座に指向させることができる。ベクターを組み込むためのコンストラクトは当該分野で周知である。
さらに、好適な実施形態では、発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変わる。
好適な発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４８に概ね記載されるようなレトロウイルス・ベクター系であり、その両方は、参照により本明細書により明確に組み込まれる。
タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、適当な条件下で培養して、タンパク質の発現を誘導または引き起こすことによって、本発明のタンパク質を生産する。タンパク質発現に適当な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わり、通常の実験を介して当業者により容易に確認される。例えば、発現ベクター中での構成性プロモーターの使用は、宿主細胞の成長および増殖を最適化することが必要である一方で、誘導性プロモーターの使用は、誘導のための適当な成長条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形態では、回収のタイミングが重要である。例えば、昆虫細胞発現で用いられるバキュロウイルス系は、溶菌性ウイルスであるので、回収時期の選択は産物収量にとって極めて重大であり得る。
適当な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む動物細胞が挙げられる。特に重要なのは、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞、ピッチア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母、大腸菌、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、Ｃ１２９細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｉ−５細胞、２９３細胞、アカパンカビ、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ならびにＨｅＬａ細胞である。非常に重要なのは、ピッチア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＰ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、大腸菌、ＳＦ９細胞、ＳＦ２１細胞、およびＨｉ−５細胞である。
好適な実施形態では、哺乳動物細胞中でタンパク質を発現させる。哺乳動物発現系も当該分野で既知であり、レトロウイルス系を含む。哺乳動物プロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡ中に、タンパク質に対するコード配列の下流（３’）転写を開始することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常コード配列の５’末端に近接して配置される転写開始領域と、転写開始部位の２５〜３０の塩基対上流の位置を用いたＴＡＴＡボックスとを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを導いて、正確な部位でＲＮＡ合成を開始させると考えられている。哺乳動物プロモーターは、通常ＴＡＴＡボックスの１００〜２００の塩基対上流内に位置する上流プロモーター因子（エンハンサー因子）も含む。上流プロモーター因子は、転写が開始され、どちらの方向性でも作用できる割合を決定する。ウイルス遺伝子はしばしば高度に発現され、広範な宿主範囲を有するので、哺乳動物プロモーターとして特に有用なのは、哺乳動物ウイルス遺伝子から得たプロモーターである。例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ヘルペス単純疱疹ウイルス・プロモーター、およびＣＭＶプロモーターが挙げられる。
典型的には、哺乳動物細胞に認識される転写終了およびポリアデニル化配列は、翻訳停止コドンに対して３’に位置する調節領域であり、従ってプロモーター因子と一緒に、コード配列に隣接する。部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化によって、成熟ｍＲＮＡの３’末端が形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から派生したものが挙げられる。
他の宿主と同様に、哺乳動物宿主に外来性核酸を導入する方法は、当該分野で周知であり、使用される宿主細胞によって変わる。技術としては、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、ウイルス感染、リポソーム中でのポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。
好適な実施形態では、タンパク質を細菌系で発現させる。細菌発現系は当該分野で周知である。
好適な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ｍＲＮＡ中に、タンパク質のコード配列の下流（３’）転写を開始することができる任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、通常コード配列の５’末端に近接して位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を備える。例としては、ガラクトース、ラクトース、およびマルトース等の糖代謝酵素から派生するプロモーター配列と、トリプトファン等の生合成酵素から派生する配列とが挙げられる。バクテリオファージから得たプロモーターが用いられてもよく、当該分野で既知である。さらに合成プロモーターおよびハイブリッド・プロモーターもまた有用である；例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合し転写を開始する能力を有する非細菌性起源の天然に存在するプロモーターを含むことができる。
機能的プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が望ましい。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、リボソーム結合部位は、シャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ）（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドンと、開始コドンの３〜１１のヌクレオチド上流に位置する３〜９ヌクレオチド長の配列とを含む。
発現ベクターは、細菌中でタンパク質の分泌をもたらすシグナル・ペプチド配列を含んでもよい。シグナル配列は通常、当該分野で周知のように、細胞からタンパク質の分泌を導く疎水性アミノ酸で構成されるシグナル・ペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）中か、または細胞の内膜および外膜の間に位置する細胞周辺腔（グラム陰性菌）中に分泌される。細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。適切な選択遺伝子としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、およびテトラサイクリン等の薬剤に対して細菌を耐性にする遺伝子が挙げられる。選択可能なマーカーは、ヒスチジン、トリプトファン、およびロイシン生合成経路中のもの等の生合成遺伝子も含む。
これらの成分を発現ベクター中に組み立てる。細菌用の発現ベクターは当該分野で周知であり、特に、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、およびストレプトコッカス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）用のベクターが挙げられる。
塩化カルシウム処置、電気穿孔、およびその他等の当該分野で周知の技術を用いて、細菌宿主細胞中に細菌発現ベクターを形質転換させる。
一実施形態では、昆虫細胞中でタンパク質を産生させる。昆虫細胞の形質転換用の発現ベクター、特にバキュロウイルスに基づく発現ベクターは、当該分野で周知である。
好適な実施形態では、酵母細胞中でタンパク質を産生させる。酵母発現系は当該分野で周知であり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、カンジダ属酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ）、ハンゼヌラ属酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロマイス属酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ）、ピッチア属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、およびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、スキゾサッカロマイス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ならびにヤロウイア属酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）用の発現ベクターを含む。酵母中の発現用の好適なプロモーター配列は、誘導性ＧＡＬ１，１０プロモーターと、アルコール脱水素酵素、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸異性化酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸−脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、および酸ホスファターゼ遺伝子から得たプロモーターとを含む。酵母選択可能マーカーとしては、ツニカマイシンに対する耐性を付与するＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、およびＡＬＧ７と、Ｇ４１８に耐性を付与するネオマイシン・リン酸転移酵素遺伝子と、銅イオンの存在下で酵母の増殖を可能にするＣＵＰ１遺伝子とが挙げられる。
当該分野で周知の技術を用いて、融合タンパク質としてタンパク質を構築してもよい。したがって、例えば、発現を増加させるために、または他の理由で、融合タンパク質としてタンパク質を構築することが可能である。例えば、タンパク質がペプチドであるとき、発現目的のために、ペプチドをコードする核酸を他の核酸に結合することも可能である。同様に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等のタンパク質標識に、本発明のタンパク質を結合することができる。
好適な実施形態では、発現後に、タンパク質を精製または単離する。どのような他の成分がサンプル中に存在するどうかに依存する当業者に既知の様々な方法で、タンパク質を単離または精製することが可能である。標準的精製方法としては、電気穿孔技術と、分子技術と、免疫学的技術と、イオン交換、疎水性、親和性、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー技術と、等電点電気泳動とが挙げられる。例えば、標準的抗ユビキチン部分抗体カラムを用いて、ユビキチン部分タンパク質を精製することが可能である。タンパク質濃度と組み合わせた限外濾過および透析濾過技術も有用である。好適な精製技術の一般的ガイダンスに関しては、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｉａｇ、ＮＹ（１９８２）を参照せよ。必要な精製度合いは、タンパク質の使用によって変わる。いくつかの例では、精製は必要でない。
構築された後、組成物は、ユビキチン因子の活性を変調する因子をアッセイすることを含むが、これに限定されない多数の適用に使用を見出す。具体的には、組成物を用いて、基質分子へのユビキチン部分の転移または結合を変調する因子をアッセイすることができる。用語「変調する」とは、本明細書でユビキチン因子の活性を言及する際使用されるように、ユビキチン因子の活性、例えば活性化活性、結合活性、連結活性、より具体的には、基質分子へのユビキチン部分の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）の活性における増加または減少を指す。用語「結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」とは、本明細書でユビキチン因子の活性を言及する際使用されるように、基質分子へのユビキチン部分の結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）、転移、または結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を指す。当業者には、ユビキチン因子の活性を変調する因子（すなわち、「モジュレーター」）は、酵素活性、基質との酵素相互作用、ユビキチン部分および基質間の相互作用、またはこれらの組み合わせに作用できることが認識される。
「候補」、「候補因子」、「候補モジュレーター」、「候補ユビキチン化モジュレーター」、または本明細書中の文法的等価物は、任意の候補分子を意味し、例えばタンパク質（本明細書中では、タンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む）、有機低分子または無機低分子、糖質、あるいはポリヌクレオチドを意味し、これらは、ユビキチン因子の活性を変調する能力に関して、より具体的には基質分子へのユビキチン部分の結合を変調する能力に関して試験される。候補因子は、多数の化学的クラスを包括する。好適な実施形態では、候補因子は低分子である。別の好適な実施形態では、候補因子は有機分子であり、特に、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合にとって必要な官能基を含む有機低分子であり、通常少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を、好ましくはこれらの官能化学基の少なくとも２つを含む。候補因子は、しばしば、１つ以上の化学官能基で置換される炭素環構造もしくは複素環式構造、および／または芳香性構造もしくは多環芳香性構造を含む。
当業者に理解されるように、合成化合物または天然化合物のライブラリーを含む広範で様々なソースから候補因子を得る。当業者に理解されるように、本発明は、広範で多様な既知のコンビナトリアルケミストリー型ライブラリを含む候補モジュレーターの任意のライブラリーをスクリーニングするための迅速かつ簡易な方法を提供する。
好適な実施形態では、候補因子は合成化合物である。ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む広範で多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成に対して、多数の技術が利用可能である。例えば、ランダム化学方法および酵素方法を含む新規化合物の生成方法を論じているＷＯ９４／２４３１４を参照のこと（これは、明らかに、本明細書中に参考として援用される）。ＷＯ９４／２４３１４に記載されるように、本方法の利点の１つは、アッセイ前に、候補因子を特徴付ける必要がないことである。本発明の方法を用いて、ユビキチン因子の活性を増加または減少させる能力に対して、より具体的には、基質へのユビキチン部分の結合を増加または減少させる能力に対して、任意の候補因子をスクリーニングできる。さらに、当該分野で既知であるように、スプリット合成反応を用いたコーディングタグを使用して、試験される化学部分を本質的に同定することが可能である。
あるいは、好適な実施形態では、入手可能であるかまたは即座に生産される、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物の形態で候補因子として天然化合物のライブラリーを利用する。
さらに、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段を介して、天然または合成的に生産されるライブラリーおよび化合物を容易に修飾する。既知の薬理学的因子を、酵素修飾を含む指向性化学修飾またはランダム化学修飾にかけ、構造的アナログを生産することが可能である。
好適な実施形態では、候補因子は、タンパク質、核酸、および化学部分を含む。
好適な実施形態では、候補因子は、上記に定義したように、タンパク質である。好適な実施形態では、候補因子は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質のフラグメントである。したがって、例えば、より詳細に下記に記載されるように、タンパク質を含む細胞抽出物、あるいはタンパク質細胞抽出物のランダム消化物または指向性消化物を試験することが可能である。このようにして、多数の候補因子に対してスクリーニングするために、原核生物および真核生物のタンパク質のライブラリーを作製することが可能である。この実施形態で特に好ましいのは、細菌、真菌、ウイルス、および哺乳動物のタンパク質のライブラリーであり、哺乳動物タンパク質が好ましく、ヒトタンパク質が特に好ましい。
好適な実施形態では、候補因子は、約２〜約５０のアミノ酸のペプチドであり、好ましくは約５〜約３０のアミノ酸、特に好ましくは約８〜約２０のアミノン酸のペプチドである。ペプチドは、上記に概説したような天然に存在するタンパク質の消化物でもよく、ランダムペプチドまたは「偏りのある」ランダムペプチドでもよい。「ランダム化する」または本明細書中の文法的等価物は、ランダムなヌクレオチドおよびアミノ酸からそれぞれ本質的になる各核酸およびペプチドを意味する。一般にこれらのランダムペプチド（または核酸、下記に論じる）は、化学的に合成されるので、任意の位置で、任意のヌクレオチドまたはアミノ酸を取り込むことが可能である。合成プロセスは、ランダム化タンパク質または核酸を生成するように設計され、配列の長さにわたって可能な組み合わせの全てまたは大部分の形成を可能にするので、ランダム化候補生体活性タンパク質因子のライブラリーが形成される。
確率的に十分な範囲の多様性をもたらして、特定のユビキチン連結因子酵素との相互作用を可能にするために、ライブラリーは、ランダム化因子の十分な構造的多様性集団を提供すべきである。したがって、相互作用ライブラリーは、そのメンバーの少なくとも１つが、ユビキチン因子またはユビキチン反応の他の成分（例えば、ユビキチン部分または標的タンパク質）と相互作用する構造を有するのに十分な大きさでなければならない。相互作用ライブラリーの必要な絶対的大きさを測定することは困難であるが、天然の免疫応答からヒントが得られる。すなわち、１０７〜１０８の異なる抗体の多様性は、生体が遭遇する大部分の潜在的抗原と相互作用するのに十分な親和性を有する少なくとも１つの組み合わせを提供する。公表されているインビトロ選択技術によっても、１０７〜１０８のライブラリーサイズは、標的に対する親和性を有する構造を見出すのに十分であることが示されている。本明細書中で概ね提案するような７〜２０のアミノ酸長のペプチドの組み合わせ全てのライブラリーは、２０７（１０９）から２０２０をコードする潜在能力を持つ。したがって、１０７〜１０８の異なる分子のライブラリーによって、本方法は、７個のアミノ酸に対する理論的に完全な相互作用ライブラリーの「機能する」サブセットと、２０２０のライブラリーに対する形状のサブセットとを可能にする。したがって、好適な実施形態では、当該方法で、少なくとも１０６、好ましくは少なくとも１０７、より好ましくは少なくとも１０８、最も好ましくは少なくとも１０９の異なる配列を同時に分析する。好適な方法により、ライブラリーのサイズおよび多様性が最大化される。
一実施形態では、任意の位置での配列優先も配列制約もなしに、ライブラリーを十分にランダム化する。好適な実施形態では、ライブラリーには偏りがある。すなわち、配列内のいくつかの位置は、一定のままであるか、または限られた数の可能性から選択される。例えば、好適な実施形態では、架橋用のシステインか、ＳＨ−３ドメイン用のプロリンか、またはリン酸化部位用のセリン、トレオニン、チロシン、もしくはヒスチジン等の作製に向けて、あるいはプリン等に向けて、例えば疎水性アミノ酸、親水性残基、立体的に偏りのある（小さいかまたは大きい）残基の規定されたクラス内で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基をランダム化する。
好適な実施形態では、偏りは、既知のクラスの分子と相互作用するペプチドまたは核酸に向けてある。例えば、候補因子がペプチドであるとき、細胞内シグナル伝達の大部分は、小さいペプチドドメインを介して他のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの短い領域を経由して実行されることが知られている。例えば、ＨＩＶ−１エンベロープ細胞質ドメインから得た短い領域は、細胞カルモジュリンの作用を遮断することが以前から示されている。スズメバチから得たマストパラン毒素と相同性を示すＦａｓ細胞質ドメイン領域は、死誘導アポトーシス機能またはＧタンパク質誘導機能を有する短いペプチド領域に限定され得る。Ｘｅｎｏｐｕｓ由来の天然ペプチドであるマゲイニンは、潜在的な抗腫瘍活性および抗微生物活性を持つことができる。プロテインキナーゼＣアイソザイム（βＰＫＣ）の短いペプチドフラグメントは、刺激後に、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細胞中のβＰＫＣの核トランスロケーションを遮断することが示されている。さらに、短いＳＨ−３標的ペプチドは、ＳＨ−３タンパク質への特異的結合に対する偽基質として用いられてきた。これは、当然、生物活性を有する利用可能なペプチドのうちの少ないリストであるが、文献により、この分野が詳述される。したがって、細胞内シグナル伝達カスケードに対して活性を有する小さなペプチドの潜在能力に関する多くの前例がある。さらに、候補モジュレーターの偏りのあるランダム化の基礎として、多数の分子のアゴニストおよびアンタゴニストも用いてよい。
したがって、偏りのあるランダム化候補モジュレーターの生成のための開始点として、多数の分子またはタンパク質ドメインが適している。共通の機能、構造、または親和性を付与する多数の低分子ドメインが知られている。さらに、当該分野で認識されているように、アミノ酸相同性の弱い領域は、強度な構造的相同性を有する可能性がある。これらの分子、ドメイン、および／または対応するコンセンサス配列の多数が既知であり、ＳＨ−２ドメイン、ＳＨ−３ドメイン、プレクストリン、死ドメイン、プロテアーゼ切断／認識部位、酵素インヒビター、酵素基質、およびＴｒａｆが含まれるがこれらに限定されない。
好適な実施形態では、候補因子は核酸である。候補因子に関して、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、または本明細書中の文法的等価物は、互いに共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。本発明の核酸は概ね、ホスホジエステル結合を含むが、いくつかの場合では、下記に概説するように、例えばホスホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９（１０）：１９２５（１９９３）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００（１９７０）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９（１９７７）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：３４８７（１９８６）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５（１９８４）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）；ならびにＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ ２６：１４１ ９１９８６））と、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１４３７（１９９１）；および米国特許番号第５，６４４，０４８号）と、ホスホロジチオエート（Ｂｒｌｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１（１９８９））と、Ｏ−メチルホスホロアミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）と、ペプチド核酸骨格および結合（Ｅｇｈｏｌｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５（１９９２）；Ｍｅｉｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８（１９９２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：５６６（１９９３）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３８０：２０７（１９９６）を参照のこと：その全ては、参照により組み込まれる）とを含む代替的骨格を有する可能性がある核酸アナログが含まれる。他のアナログ核酸は、陽性骨格（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６０９７（１９９５））と、非イオン性骨格（米国特許番号第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号、および同第４，４６９，８６３号；Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ ３０：４２３（１９９１）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０（１９８８）：Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ １３：１５９７（１９９４）：第２章および第３章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５（１９９４）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ ３４：１７（１９９４）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））と、米国特許番号第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号ならびに第６章および第７章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編に記載されるものを含む非リボース骨格とを有するものを含む。１つ以上の炭素環式糖を含む核酸も核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５）、ｐｐ１６９−１７６を参照のこと）。いくつかの核酸アナログについては、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ（１９９７年６月２日）、３５ページに記載されている。これらの参考文献の全ては、明らかに本明細書中に参考として援用される。リボース−リン酸骨格のこれらの修飾を行って、標識等のさらなる部分の付加を促進することが可能であり、または生理学的環境中のこのような分子の安定性および半減期を増加させることが可能である。
当業者に理解されるように、これらの核酸アナログ全ては、本発明での使用を見出すことができる。さらに、天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作製することができる。あるいは、異なる核酸アナログの混合物、天然に存在する核酸およびアナログの混合物を作製してもよい。特に好ましいのは、ペプチド核酸アナログを含むペプチド核酸（ＰＮＡ）である。天然に存在している核酸の高度に荷電しているホスホジエステル骨格と比較して、これらの骨格は、中性条件下で実質的に非イオンである。
明記されるように、核酸は、一本鎖または二重鎖であってもよく、二重鎖配列または一本鎖配列の両方の部分を含んでもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの両方のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドであってよく、ここで、核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組み合わせと、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン等を含む塩基の任意の組み合わせとを含む。本明細書で使用する場合、用語「ヌクレオシド」は、ヌクレオチド、ヌクレオシドアナログ、ヌクレオチドアナログ、およびアミノ修飾ヌクレオシド等の修飾ヌクレオシドを含む。さらに「ヌクレオシド」は、天然に存在しないアナログ構造を含む。したがって、例えば、それぞれが塩基を有するペプチド核酸の個々の単位は、本明細書中でヌクレオシドとして言及される。
タンパク質に関して上記で一般に記載したように、核酸候補因子は、天然に存在する核酸、ランダム核酸、または「偏りのある」ランダム核酸であり得る。タンパク質に関して上記に概説したように、例えば、原核生物または真核生物ゲノムの消化物を使用することも可能である。最終発現産物が核酸である場合、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも１５、最も好ましくは少なくとも２１のヌクレオチド位置をランダム化する必要があり、より好ましいのは、ランダム化がそれほど完全ではない場合である。同様に、少なくとも５、好ましくは少なくとも６、より好ましくは少なくとも７のアミノ酸位置をランダム化する必要があり、ここでもランダム化がそれほど完全ではない場合がより好ましい。
好適な実施形態では、候補因子は有機部分である。この実施形態では、ＷＯ９４／２４３１４に一般に記載されているように、化学的に修飾され得る一連の基質から、候補因子を合成する。本明細書中の「化学的に修飾された」とは、従来からの化学反応および酵素反応を含む。これらの基質は、一般的に、アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン、およびヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレーンおよびヘテロアリールを含む）、アルコール、エテール、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環式化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、βラクタム、テトラサイクリン、セファロスポリン、および糖質を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エコダイソン（ｅｃｏｄｙｓｏｎｅ）等を含む）、アルカロイド（麦角、ビンカ、クラーレ、ピロリジン、およびマイトマイシン）、有機金属化合物、ヘテロ原子を保有する化合物、アミノ酸、ならびにヌクレオシドを含むがこれらに限定されない。この部分において化学反応（酵素反応を含む）を実行して、新規の基質または候補因子を形成することが可能であり、その後これを本発明を用いて試験し得る。
当業者に理解されるように、１つより多い種類の候補因子を一度にスクリーニングすることが可能である。したがって、使用される候補因子のライブラリーは、１種類の因子（すなわちペプチド）のみを含むか、または複数の種類（ペプチドおよび有機因子）を含むことが可能である。一度でのいくつかの候補のアッセイを、下記にさらに記載する。
本発明は、標的タンパク質の存在または非存在下で、ユビキチン部分と、ユビキチン因子の異なる組み合わせとを混合することを含む方法および組成物を提供する。好適な実施形態では、候補因子は、基質分子へのユビキチン部分の結合を調節する因子をアッセイするための組み合わせに含まれる。好適な実施形態では、アッセイでの目的のユビキチン部分および／または基質分子はタグを含む。
好ましくは、タグは、標識、結合対のパートナー、または基質結合分子（もしくは結合タグ）である。好適な実施形態では、タグはエピトープタグである。別の好適な実施形態では、タグは標識である。より好ましくは、タグは蛍光標識または結合対のパートナーである。好適な実施形態では、タグは結合対のパートナーであり、ユビキチン部分は間接標識によって標識される。間接標識の実施形態では、好ましくは、標識は、蛍光標識または標識酵素である。標識酵素を含む実施形態では、好ましくは、その酵素に対する基質は、蛍光産物を産生する。好適な実施形態では、標識酵素基質はルミノールである。好適な実施形態では、特異的混合により、標的タンパク質と、成分とを混合することが除外される。
別の好適な実施形態では、好適な組み合わせは、タグ１−ユビキチン部分、タグ２−ユブキチン部分である。好ましくは、タグ１およびタグ２は、標識であり、より好ましくは蛍光標識であり、最も好ましくはタグ１およびタグ２は、ＦＲＥＴ対を構成する。
好適な実施形態では、好適な組み合わせは、目的のタグ１−ユビキチン部分およびタグ２−基質分子である。好ましくは、タグ１は、標識、結合対のパートナー、または基質結合分子であり、タグ２は、異なる標識、結合対のパートナー、または基質結合分子である。より好ましくは、タグ１は、蛍光標識または結合対のメンバーである。タグ１が結合対のメンバーであるとき、好ましくは、タグ１は、間接的に標識される。さらにより好ましくは、タグ１は、標識酵素で間接的に標識される。好ましくは、酵素の存在を明らかにするために用いられる標識酵素基質は、蛍光産物を産生し、より好ましくはルミノールである。現在記載される組み合わせでは、好ましくは、タグ２は、表面基質結合因子であり、より好ましくはＨｉｓ−タグである。
好適な実施形態では、本発明の方法は、標的タンパク質を含まない。好適な実施形態では、モノユビキチン部分またはポリユビキチン部分は、上述したように、基質分子である。ユビキチン因子の異なる組み合わせは、特定の標的タンパク質に特異的であるので、本アッセイは、標的タンパク質を必要とする従来のアッセイよりかなり用途が広い。しかし、該方法は、組み合わせが指向される特定の標的タンパク質を初めに同定することなしに、このような組み合わせの任意のバリエーションを使用可能にするので、本発明の方法で、これらのユビキチン因子の活性をアッセイすることができる。
様々な量で、本アッセイの成分を混合し得る。好適な実施形態では、反応溶液１００μｌ当たり２０〜２００ｎｇの最終濃度で、最も好ましくは、反応溶液１００μｌ当たり約１００ｎｇで、ユビキチン部分を混合する。
好適な実施形態では、反応溶液１００μｌ当たり１〜５０ｎｇの最終濃度で、より好ましくは反応溶液１００μｌ当たり１ｎｇ〜２０ｎｇ、最も好ましくは反応溶液１００μｌ当たり５ｎｇ〜１０ｎｇの最終濃度で、ユビキチン活性化因子（好ましくはＥ１）を混合する。
好適な実施形態では、反応溶液１００μｌ当たり１０〜１００ｎｇの最終濃度で、より好ましくは反応溶液１００μｌ当たり１０〜５０ｎｇの最終濃度で、ユビキチン結合因子（好ましくはＥ２）を混合する。
好適な実施形態では、反応溶液１００μｌ当たり１ｎｇ〜５００ｎｇの最終濃度で、より好ましくは反応溶液１００μｌ当たり５０〜４００ｎｇ、さらに好ましくは反応溶液１００μｌ当たり１００〜３００ｎｇ、さらにより好ましくは反応溶液１００μｌ当たり約１００ｎｇの最終濃度で、ユビキチン連結因子（好ましくはＥ３）を混合する。好適な実施形態では、反応溶液１００μｌ当たり５０〜１００ｎｇの最終濃度で、より好ましくは反応溶液１００μｌ当たり２０〜５０ｎｇ、さらにより好ましくは反応溶液１００μｌ当たり約１０ｎｇ〜２０ｎｇの最終濃度で、ユビキチン連結因子を混合する。
本発明のユビキチン因子の活性に有利な反応条件下で、より具体的には、本アッセイでの対象基質分子へのユビキチン部分の結合に有利な反応条件下で、本アッセイの成分を混合する。一般に、これは、生理学的条件下である。最適な活性を促進する任意の温度で、通常４℃と４０℃との間でインキュベーションを実行し得る。最適な活性について、インキュベーション時間を選択するが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するように最適化してもよい。代表的には０．５時間と１．５時間との間が、十分である。
本組成物中に、様々な他の試薬を含んでよい。これらは、塩、溶媒、緩衝液、例えばアルブミンのような中性タンパク質、または界面活性剤のような試薬を含み、これを用いて、ユビキチン因子の最適な活性を促進し得、より具体的には、本アッセイでの対象基質分子へのユビキチン部分の結合を促進し得、および／または非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を減少させ得る。また、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物剤等の、本アッセイの効率を他の方法で向上させる試薬を用いてもよい。本組成物はまた、好ましくは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を含む。
活性ユビキチン因子を促進する任意の順番で、より具体的には本アッセイでの対象基質分子へのユビキチン部分の結合を促進するか、または候補因子の調節活性の同定を最適化する順番で、成分の混合物を添加し得る。好適な実施形態では、ユビキチン部分を、反応緩衝溶液中に提供し、その後、ユビキチンユビキチン化酵素を添加する。別の好適な実施形態では、ユビキチン部分を反応緩衝溶液中に提供し、その後、候補因子を添加した後、ユビキチン因子を添加する。
一旦混合させると、好適な実施形態では、本発明のアッセイにおいて対象基質分子に結合したユビキチン部分の量を測定する。当業者に理解されるように、測定形態は、ユビキチン部分に結合している特定のタグに依存し得る。また当業者には自明であるように、基質分子に結合しているユビキチン部分の量は、その基質分子に直接結合している特定のユビキチン部分のみならず、その基質分子に好ましくは結合しているモノユビキチン部分またはポリユビキチン部分もまた包括する。
好適な実施形態では、ユビキチン部分に結合しているタグは、蛍光標識である。好適な実施形態では、ユビキチン部分に結合しているタグは、酵素標識または結合対のメンバーであり、このメンバーは、酵素標識で間接的に標識される。この後者の好適な実施形態では、酵素標識基質は、蛍光反応産物を産生する。これらの好適な実施形態では、ルミネッセンスによって、結合しているユビキチン部分の量を測定する。
他の好適な実施形態では、少なくとも第一のユビキチン部分および第２のユビキチン部分を使用し、この際、この第一のユビキチン部分および第２のユビキチン部分は、異なる蛍光標識を含み、これらの標識は、ＦＲＥＴ対を形成する。
本明細書で使用する場合、「ルミネッセンス（発光）」または「蛍光発光」とは、蛍光標識からの光子の放出を意味する。ＦＲＥＴ対が使用される実施形態では、蛍光測定は、連続して行われ得るか、またはライゲーション反応中の種々の時間点で行われ得る。このような測定用の装置が市販されており、このような測定をする技術で、当業者により容易に使用される。
本明細書で記載される標識のそれぞれに対して、基質分子へのユビキチン部分の結合を測定する他の形態は、当該分野で周知であり、当業者により容易に同定される。例えば、シンチレーション計数または写真乳剤に暴露した後のデンシトメトリーによって、あるいはホスフォルイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）等の装置を使用することによって、ラジオアイソトープ標識を測定してもよい。同様に、デンシトメトリーを用いて、酵素標識を使用する際に、不透明産物を産生する酵素標識基質との反応後のユビキチン部分の結合を測定することが可能である。
好適な実施形態では、本発明のアッセイで対象基質分子を、表面基材に結合させる。ユビキチン部分への標識の結合について上述したように、これを実行し得る。
別の好適な実施形態では、ユビキチン結合因子およびユビキチン連結因子の非存在下で、ユビキチン活性化因子を表面基材に結合させる。ユビキチン部分への標識の結合について上述したように、これを実行し得る。タグ−ユビキチン活性化因子を用いてもまた、これを実行し得、この際、そのタグは、表面基材結合分子である。
別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子の非存在下で、ユビキチン結合因子を表面基材に結合させる。ユビキチン部分への標識の結合について上述したように、これを実行し得る。タグ−ユビキチン結合因子を用いてもまた、これを実行し得、この際、そのタグは、表面基材結合分子である。
別の好適な実施形態では、標的タンパク質の非存在下で、ユビキチン連結因子を表面基材に結合させる。ユビキチン部分への標識の結合について上述したように、これを実行し得る。タグ−ユビキチン連結因子を用いてもまた、これを実行し得、この際、そのタグは表面基材結合分子である。
一般に、任意の基材結合分子を使用することができる。好適な実施形態では、タグは、Ｈｉｓタグであり、表面基材は、ニッケルである。好適な実施形態では、ニッケル表面基材は、９６ウェルプレート等のマルチウェルプレートのウェル表面上に存在する。このようなマルチウェルプレートは市販されている。表面基材への酵素の結合は、未結合ユビキチン部分からの、結合ユビキチン部分の分離を促進する。本実施形態では、ライゲーション反応後に、容器から未結合ユビキチン部分を容易に洗浄する。当業者に理解されるように、任意の表面基材結合因子およびそれが結合する表面基材を有する容器の使用は、結合ユビキチン部分と未結合ユビキチン部分との分離を促進するために効果的である。
別の実施形態では、本発明のアッセイでの対象基質分子は、直接にかまたは基質結合因子を介して基質分子に結合している、ビーズを含む。ライゲーション後に、未結合ユビキチン部分および測定される結合ユビキチン部分から、ビーズを分離し得る。好適な実施形態では、本発明のアッセイでの対象基質分子は、本アッセイでタグ−ユビキチン部分と混合するビーズおよびユビキチン因子を含み、この際、そのタグは蛍光標識である。この実施形態では、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）機を用いて、結合ユビキチン部分を有するビーズを分離することが可能である。このような使用の方法は、米国特許出願番号０９／０４７，１１９に記載されており、この米国特許出願は、全体として本明細書に援用される。その後、結合ユビキチン部分の量を測定することができる。
別の実施形態では、どのユビキチン因子も、表面基材に結合していない。好ましくは、この実施形態では、アッセイは、タグ１−ユビキチン部分およびタグ２−ユビキチン部分を含む。好ましくは、タグ１およびタグ２は標識であり、好ましくは蛍光標識であり、最も好ましくはタグ１およびタグ２は、ＦＲＥＴ対を構成する。この実施形態では、蛍光発光スペクトルを測定することによって、対象基質分子へのユビキチン部分の結合を測定する。この測定は、成分の混合後、連続的であっても、または一度以上であってもよい。連結されていないユビキチン部分と比較したこの組合せの蛍光発光スペクトルの変化は、ユビキチンユビキチン化の量を示す。当業者には、この実施形態で、蛍光発光スペクトルの変化は、ポリユビキチン部分の形成を介して、かつ／またはタンパク質（好ましくは標的タンパク質）上のすぐ近くの位置に結合することによって、近接しているＦＲＥＴ対の異なるメンバーを保持するユビキチン部分に起因することが、認識される。
本方法の好適な一実施形態では、ユビキチン連結因子は、ＭｄＭ２タンパク質であり、第１のＦＲＥＴ標識を含んでおり、ユビキチン部分は、第２のＦＲＥＴ標識を含む。別の実施形態では、ＭｄＭ２タンパク質は、結合タグを含む。別の実施形態では、好ましくは、ＭｄＭ２タンパク質を固体支持体上に設け、より好ましくは、固体支持体は、マイクロタイタープレートまたはビーズを含む。別の実施形態では、ｍｄｍ２タンパク質は、好ましくは哺乳動物ｍｄｍ２であり、より好ましくはヒトｍｄｍ２である。
別の好適な実施形態では、標的タンパク質は、ｐ５３であり、第１のＦＲＥＴ標識を含んでおり、ユビキチン部分は、第２のＦＲＥＴ標識を含む。
別の実施形態では、ｐ５３タンパク質は、好ましくは、結合タグを含む。別の実施形態では、好ましくは、ｐ５３タンパク質を固体支持体上に設け、より好ましくは、固体支持体は、マイクロタイタープレートまたはビーズを含む。
好適な実施形態では、本発明の組成物を用いて、基質分子へのユビキチン部分の結合を変調する因子を同定する。この実施形態では、組成物は、候補因子を含む。好適な実施形態では、基質分子に結合するタグ−ユビキチン部分の測定量および／または割合と、組成物に候補因子が存在しない際のそれとを比較することによって、基質分子へのユビキチン部分の結合に対するその因子の作用の有無を測定する。この実施形態では、基質分子へのユビキチン部分の結合を、その因子が向上または阻害するか、あるいは減少または増加させるかどうかを測定する。
好適な実施形態では、候補因子を含む本発明の組成物は、Ｅ３を持たず、Ｅ２へ結合するユビキチン部分の量および／または割合を測定する。この実施形態は、Ｅ３および候補因子の両方を持たない組成物中でＥ２に結合するユビキチン部分の量および／または割合を比較する工程も含み得、それによって、候補因子の調節活性が測定される。好適な実施形態では、候補因子の存在および非存在下でＥ２に結合するユビキチン部分の量のパーセント値の差を、候補因子の存在および非存在下でＥ３に結合する量のパーセント値の差と比較することによって、酵素活性カスケードおよび、基質分子へのユビキチン部分の結合における、の候補因子の作用点を測定する。すなわち、Ｅ１、Ｅ２、および／またはＥ３へのユビキチン部分の結合に候補因子が影響を及ぼすかどうかを測定する。
別の好適な実施形態では、本発明の組成物を用いて、アッセイでの対象基質分子へのユビキチン部分の結合を調節する因子を同定する。この実施形態では、本アッセイは、候補因子を含む。好適な実施形態では、タグ１およびタグ２がＦＲＥＴ対を構成する場合、基質分子に結合する（ポリユビキチン部分および／または基質分子に結合するユビキチン部分としての）タグ１−ユビキチン部分およびタグ２−ユビキチン部分の測定量および／または割合を、候補因子の非存在下でのこのような結合の量または割合と比較することによって、基質分子へのユビキチン部分の結合に対する候補因子の作用の有無を測定する。この実施形態では、基質分子へのユビキチンの結合を、候補因子が向上または阻害するか、あるいは増加または減少させるかどうかも測定する。
好適な実施形態では、ハイスループットスクリーニング系で、複数のアッセイを同時に実行する。この実施形態では、９６ウェルプレートまたは他のマルチウェルプレートのウェル等の複数の容器中で、複数のアッセイを実行してもよい。当業者に理解されるように、このような系を、複数の候補因子のアッセイおよび／またはユビキチン部分とのユビキチン因子の複数の組み合わせに適用してもよい。好適な実施形態では、標的タンパク質の存在または非存在下で、ユビキチン因子の異なる組み合わせを混合することによって、対象基質分子へのユビキチン部分の結合を測定するために、ハイスループットスクリーニング系で本発明を使用する。別の好適な実施形態では、さらに候補因子を混合することによって、個々の候補因子の作用を同時に試験するために、ハイスループットスクリーニング系で、本発明を使用する。
別の局面では、本発明は、混合物中の基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする方法を提供する。対象基質分子へのユビキチン部分の結合が起こり得る条件下で、細胞またはタンパク質の混合物中に（好ましくは細胞ライセート中に）ユビキチン部分を導入する。この実施形態では、ユビキチン部分は、タグ１−ユビキチン部分およびタグ２−２−ユビキチン部分の形態であり、この際、タグ１およびタグ２は、ＦＲＥＴ対を構成するか、またはタグ１が蛍光標識でありかつタグ２がタグ１のクエンチャーである。混合物または細胞中にユビキチンユビキチン化活性が存在するかどうかを指標として、蛍光発光スペクトルを測定する。好適な実施形態では、ユビキチン部分は、ＦＬＡＧ等の結合対のメンバーも含む。この後者の実施形態では、抗ＦＬＡＧ抗体で被覆した蛍光ビーズ等の多数の親和性に基づく分離手段の任意の１つか、または抗ＦＬＡＧ抗体を利用したアミノ沈降を用いて、あるいは固体支持体に結合する抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ユビキチンユビキチン化に関与する成分を混合物から単離することができる。細胞または混合物のユビキチン部分結合成分を分離する他の手段は、当業者には容易に明らかである。この方法で分離されるユビキチン部分結合成分は、ユビキチン因子および標的タンパク質を含んでよい。当業者には、ＨＰＬＣまたは電気泳動等の当該分野で周知の複数の手段によって、個別の同定またはその後の調査のためにこれらの成分の分離が得られることが、認識される。
本明細書で提供されるアッセイの工程は、順序を変化させることができることが、当業者に理解される。しかし、（化合物、選択される特性、または工程の順番の）種々の選択肢が本明細書で提供されている一方で、それらの選択肢は、それぞれ個別に提供され、本明細書で提供される他の選択肢からそれぞれ個別に分離させ得ることもまた、理解される。さらに、アッセイの感度を増加させる当該分野で自明かつ公知の工程は、本発明の範囲内であることが、意図されている。例えば、さらなる洗浄工程、ブロッキング工程等があってもよい。
以下の実施例は、本発明の様々な局面を実行することが考慮された先述の最良形態とともに、上記の発明を利用する方法をより詳細に説明するために役立つ。これらの実施例は、本発明の真の範囲を限定するものではなく、説明目的で提供されていることが理解される。本明細書で引用される全ての参考文献は、全体として参照により明確に援用されるものとする。
（実施例１：Ｅ２、Ｅ３、およびユビキチン部分の生成）
（Ｅ２生成）
Ｅ２（Ｕｂｃｈ５ｃ）のオープン・リ−ディング・フレームをＰＣＲで増幅し、ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、Ｎ末端がイン・フレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）でＧＳＴタグと融合するように、ｐＧｅｘ−６ｐ−１大腸菌発現ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングした。
（材料および方法）
プラスミドでＢＬ２１ ＤＥ３コンピテント大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２３０１３２）を形質転換する。細胞は、３７℃、ＴＢ＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン＋０．４％グルコース中で、ＯＤ６００が約０．６になるまで増殖させ、３２０μＭのＩＰＴＧを加えて誘導し、さらに３時間培養した後集菌する。ペレットは冷ＰＢＳで一回洗浄し、その後６倍容積の溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％ グリセロール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭＥＤＴＡ、１ｍＭ ＴＣＥＰ＋コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ＥＤＴＡフリー・プロテナーゼ・インヒビター・タブレット、再懸濁細胞２５ｍｌあたり１錠、ｐＨ８．０）に再懸濁する。懸濁液をホモゲナイズし、３×３０秒ソニケートした。その後、最終濃度０．５％のＮＰ４０を添加し、チューブを４℃で３０分間ゆらした。１１０００ｒｐｍで２５〜３０分間遠心した後、上清をグルタチオン・セファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７−０７５６−０１）と、元の培養液容積１００ｍｌあたりビーズ１ｍｌの割合で、４℃、１〜２時間、おだやかに振とうさせながらインキュベートする。ビーズをペレットにし、１０倍ベッド容積（１０ ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）の溶解緩衝液で１回、その後１０倍ベッド容積のプレシジョン・プロテアーゼ（Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ）緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ ＮＰ−４０、ｐＨ７．０）で２回洗浄する。プレシジョン・プロテアーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、プロダクト番号２７−０８４３）を、ＧＳＴ樹脂１ｍｌあたり８０μｌ（１６０ユニット）の割合で加え、４℃で４時間インキュベートする。切断されたＥ２タンパク質を含む上清を回収し、樹脂を１倍ベッド容積のプレシジョン緩衝液で２回洗浄した。３画分すべてをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適切なときにはプール（ｐｏｏｌ）する。
（ユビキチン部分生成）
ユビキチン部分は、ＰＣＲによるＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、ｐＦｌａｇ−Ｍａｃ発現ベクター（Ｓｉｇｍａ）にクローニングした。この結果、大腸菌内でのアミノ末端Ｆｌａｇ融合ユビキチン部分の発現が行われる。
（材料および方法）
タンパク質発現の誘導および細胞の溶解は、上述のＧＳＴ−Ｅ２調製と同様であるが、上清を、元の培養液容積１Ｌあたりビーズ１５ｍｌの割合でＦＬＡＧアフィニティー樹脂（ＶＷＲ，カタログ番号 ＩＢ １３０２０）に充填した点が異なる。その後、樹脂を１０倍ベッド容積の溶解緩衝液で洗浄する。タンパク質を１００ｍＭ 酢酸、１０％ グリセロール、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＮＰ−４０、ｐＨ３．５でカラムから溶出する。溶出液を１倍ベッド容積の画分として回収し、１０分の１倍容積の２Ｍ Ｔｒｉｓ、８０ｍＭ Ｂ−ＭＥ、ｐＨ９．０を含むチューブに入れて、ｐＨを中和する。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適当な画分をプールし、４００倍容積の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％ グリセロール、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に対して透析する。
（Ｅ３の生成）
また、Ｅ３複合体のコード配列をＰＣＲによって増幅し、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、バキュロウイルスを生成した。Ｅ３は２つのサブユニットを含有する。それらのサブユニットを、同一のＨｌ−５昆虫細胞に２つのバキュロウイルスにコ・インフェクション（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）して発現させる。サブユニットの１つはＨｉｓタグ付きであり、もう１つの一緒に発現される（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）サブユニットはタグ付加されていない。詳細な過程は、ギブコＢＲＬ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）による「Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」にしたがって行った。例えば、ＲＯＣ１はｐＦａｓｔＢａｃＨｔｂベクターに、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグ付きでクローニングし、ＣＵＬ１はｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターに、いかなる融合タグも付加しないでクローニングした。転移およびＳＦ−９細胞へのバクミド（Ｂａｃｍｉｄ）ＤＮＡのトランスフェクションの後、バキュロウイルスを回収、増幅し、タンパク質発現用にＨｉ−５細胞のコ・インフェクションに用いた。
（材料および方法）
細胞を回収し、冷ＰＢＳで１回洗浄し、約６倍容積の溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０％ グリセロール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール、１ｍ ＭＴＣＥＰ＋コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ）ＥＤＴＡフリー・プロテナーゼ阻害剤タブレット、再懸濁細胞２５ｍｌあたり１錠、ｐＨ８．０）に再懸濁する。その後、懸濁液を３×３０秒ソニケートし、最終濃度０．５％のＮＰ４０を添加し、４℃で３０分間インキュベートする。その後、溶解液を遠心し、上清をあらかじめ平衡化した（溶解液＋ＮＰ４０）Ｎｉ−ＮＴＡアガロース・ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１０００６３２）と１〜２時間インキュベートする。ペレットにしたビーズを溶解緩衝液で２回洗浄し、１〜２容積の溶解緩衝液に再懸濁し、さらに溶出用使い捨てカラムに移す。２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液の１倍ベッド容積アリコートを５つ使用して溶出を行う。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、適当な画分をプールする。その後、脱塩カラムまたは遠心濃縮装置（より頻繁には大容積用に用いた）を使用して、溶出プールを脱塩する。遠心装置を使用する場合、イミダゾールを含まない溶解緩衝液で、溶出されたプールを１対１に希釈し、適当な速度で容積が半分に減るまで遠心する。この時点で等容積の新しい緩衝液を加え、装置を再遠心した。総計４回これを行い、結果として３２倍の置換とした。
（実施例２：Ｅ１＋Ｅ２アッセイ）
Ｅ１＋Ｅ２およびユビキチン部分の混合によるＥ２へのユビキチン部分の結合は、大腸菌から精製したＦｌａｇ−ユビキチン、およびＨｉｓ−Ｕｂｃｈ５ｃとして大腸菌から精製したＥ２・Ｕｂｃｈ５ｃを用い、以下のプロトコールを使用してアッセイした。
（材料および方法）
Ｅ２へのユビキチン部分の結合を測定するアッセイを行うため、以下の手順を用いた。１％カゼイン／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを用い、ニッケル基質の９６ウェル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルを室温で１時間ブロックし、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄する。各ウェルには、以下のＦｌａｇ−ユビキチン部分（上記参照）反応液を加える。
最終濃度
６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５
６．２５ｍ ＭｇＣｌ２
０．７５ｍＭ ＤＴＴ
２．５ｍＭ ＡＴＰ
２．５ｍＭ ＮａＦ
１２．５ｎＭ オカダ酸
１００ｎｇ Ｆｌａｇ−ユビキチン部分（上記にしたがって生成）
ミリポア（ｍｉｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過した水で、緩衝液の最終容積を８０μｌにし、続いて、１０μｌのＤＭＳＯを加えた。
その後、Ｅ１、Ｈｉｓ−Ｅ２、および５％グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌを上記溶液に加える。Ｈｉｓ−Ｅ２は上記にしたがって生成した。Ｅ１は購入する（Ａｆｆｉｎｉｔｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｘｅｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）。以下の量の各酵素を、これらのアッセイに使用する。すなわち、５ｎｇ／ウェルのＥ１、および２５ｎｌ／ウェルのＥ２が用いられた。その後、反応を室温で１時間進行させた。
ユビキチン反応の後、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。Ｅ２結合ユビキチン部分を測定するため、マウス抗Ｆｌａｇ抗体（１：１００００）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ抗体（１：１５０００）を含むＰＢＳＴ（１００μｌ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートする。その後、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてルミノール基質（１／５希釈）を１００μｌ添加する。その後、フルオリメター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を使用して、各ウェルの発光を測定する。
（結果）
（Ｅ１へのユビキチン部分の結合およびＥ２へのユビキチン部分の結合）
図１Ａは、Ｅ１のみ、およびＥ１＋ｈｉｓ−Ｅ２に関して、上記の通り測定した発光を示す。
（実施例３：Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３アッセイ）
Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３およびユビキチン部分の混合によるＥ３へのユビキチン部分の結合は、大腸菌から精製したＦｌａｇ−ユビキチン、ＧＳＴ−Ｕｂｃｈ５ｃとして大腸菌から精製されＧＳＴタグが除かれているＥ２ Ｕｂｃｈ５ｃ、およびバキュロウイルスのコ・インフェクションによってＨｌ−５から精製されたＥ３ Ｈｉｓ−ＲＯＣ１／Ｃｕｌ１複合体を用い、以下のプロトコールを使用してアッセイした。このアッセイは、Ｅ３へのユビキチン部分の結合に対する候補因子の影響を示すためにも用いた。
（材料および方法）
１カゼイン／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを用い、ニッケル基質の９６ウェル・プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルを室温で１時間ブロックし、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）２００μｌで３回洗浄する。各ウェルには、以下のＦｌａｇ−ユビキチン部分（上記参照）反応液を加える。
最終濃度
６２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５
６．２５ｍ ＭｇＣｌ２
０．７５ｍＭ ＤＴＴ
２．５ｍＭ ＡＴＰ
２．５ｍＭ ＮａＦ
１２．５ｎＭ オカダ酸
１００ｎｇ Ｆｌａｇ−ユビキチン部分（上記にしたがって生成）
ミリポア（ｍｉｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過した水で、緩衝液の最終容積を８０μｌにする。
Ｅ３へのユビキチン部分の結合を変調する候補因子を同定することを目的としたアッセイでは、ＤＭＳＯ１０μｌ中の候補因子をこの溶液に添加する。候補因子が添加されない場合には、ＤＭＳＯ１０μｌをこの溶液に添加する。
その後、ユビキチン因子、および５％グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌを上記溶液に加える。Ｅ２−Ｕｂｃｈ５ｃ、およびＥ３−ＨｉｓＲＯＣ１／Ｃｕｌ１は上記にしたがって生成する。Ｅ１は購入する（Ａｆｆｉｎｉｔｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｘｅｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）。以下の量の各酵素を、これらのアッセイに使用する。すなわち、５ｎｇ／ウェルのＥ１、２５ｎｌ／ウェルのＥ２、および１００ｎｇ／ウェルのＨｉｓ−Ｅ３を用いる。その後、反応を室温で１時間進行させる。
ユビキチン・ユビキチン化反応の後、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄する。Ｅ３結合ユビキチン部分を測定するため、マウス抗Ｆｌａｇ抗体（１：１００００）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ抗体（１：１５０００）を含むＰＢＳＴ１００μｌを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ウェルを２００μｌのＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてルミノール基質（１／５希釈）を１００μｌ添加する。その後、フルオリメター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を使用して、各ウェルの発光を測定する。
（結果）
（Ｅ３へのユビキチン部分の結合）
図２は、いくつかの異なる組み合わせのユビキチン因子に関して測定した発光を示す。これらの実験で、Ｅ３のみがＨｉｓ−Ｅ３の形態にあった。これらの発光測定は、この活性が、ユビキチン因子による活性すなわちユビキチン部分結合の、全カスケードによる活性が特異的に測定することを示している。この活性は、３つのユビキチン因子すべて（すなわち、Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３）が反応中に存在することを必要としている。
（ユビキチン因子の量を変動させた場合）
図３Ａは、上記の手順において、ＤＭＳＯの存在下または非存在下でＥ１の量を変動させたときの、Ｅ３へのユビキチン部分結合にあらわれた相対的影響を示している。反応の他の成分を、上の詳細にあるように一定に保った場合、１００μｌ反応液あたり約１０ｎｇの添加で、最大量のユビキチン部分がＥ３に結合した。ＤＭＳＯの存在は、ユビキチン因子の活性に顕著な影響を与えなかった。
ユビキチン反応中のＥ３およびユビキチン部分の濃度を変動させたときの相対的影響を図３Ｂに示す。一般的にいって、各ユビキチン部分濃度で、Ｅ３の量が１００μｌあたり２００〜３００ｎｇであったときに、最大量のユビキチン部分がＥ３に結合した。一方、ユビキチン部分濃度の増大は、各Ｅ３濃度で、Ｅ３へのユビキチン部分の結合量を概ね増大させた。
また、１％カゼインでウェルをブロックした場合、シグナル対ノイズ比に改善がみられ、それは、ブロックなしか、または５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした場合より優れていることが見いだされた。バックグラウンドを、ウェルを５％ＢＳＡ、１％カゼイン、または何も含まない液で前処理した後、上記の成分のうちのＨｉｓ−Ｅ３を除く全成分を混合し、その結果得られる蛍光を測定した後に決定した。結果は、図４に示されている。
（Ｅ３へのユビキチン部分の結合を変調する因子の同定）
Ｅ３へのユビキチン部分結合を変調する因子の同定に、このアッセイが有用であることを示すため、いくつかの候補因子をユビキチン因子（Ｅ１＋Ｅ２＋Ｅ３）、およびユビキチン部分と、上記のようにさまざまな濃度で混合した。図５は、Ｅ３へのユビキチン部分の結合を変調する因子として同定された２つの因子から得られた結果を示す。これらの変調因子は、ＲＯＣ１／Ｃｕｌ１またはＲＯＣ２／Ｃｕｌ５のいずれかをＥ３成分として含む反応物中に存在するユビキチン因子の濃度に対応して、Ｅ３へのユビキチン部分の結合を用量依存的に減少させた。
Ｅ３へのユビキチン部分の結合に対する、変調因子の影響を、上記のように、Ｅ１、Ｅ２、およびＨｉｓ−Ｅ３を含むときと、Ｅ１、およびＨｉｓ−Ｅ２を含みＥ３を含まないときとで比較することによって、変調因子がＥ３に影響を与えるか、またはＥ３以外のユビキチン因子に影響を与えるかが示される。図６Ａに示される同定変調因子は、Ｅ３の存在下で、ユビキチン部分のＥ３への結合を低下させるが、Ｅ３の非存在下では結合を変調せず、この変調因子がＥ３へのユビキチン部分の結合に特異的な影響をもつことを示している。それとは対照的に、図６Ｂに示される、別の変調因子に関する結果は、Ｅ３が存在しても、または存在しなくても、この因子は活性を減少させており、この因子がＥ３以外のユビキチン因子の活性に影響を与えていることを示している。
（実施例４：Ｅ３に結合したユビキチン部分のＦＲＥＴ分析）
ユビキチン部分を調製し、ＥＤＡＮＳまたはフルオレセインで標識し、さらにこれらの標識の各蛍光およびＦＲＥＴ対としての相互作用を測定することで、標識されたユビキチン部分のＥ３への結合、および結合されたユビキチン部分のＦＲＥＴ活性を示した。
（材料および方法）
部位特異的変異誘導によって、ＦＬＡＧ−ユビキチン部分配列にＣｙｓ残基を組み込み、ユビキチン部分を生成した。ＦＬＡＧ−Ｃｙｓ−ユビキチン部分を生成するために、以下のプライマー：
５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣ−３’
を用い、ＦＬＡＧ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ユビキチン部分を生成するために、以下のプライマー：
５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＴＣＧＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣ−３’
のいずれかを用いて部位特異的変異誘導を行った。タンパク質は、上記の通り発現させ、精製した。
フルオレセイン５−マレイミド（発光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ）ピーク５１５ｎｍ）または１，５−ヨードアセトアミド（ｉｏｄａｃｅｔｏａｍｉｄｅ）ＥＤＡＮＳ（ＩＡＥＤＡＮＳ；発光ピーク４９０ｎｍ）を、上記の通り生成されたユビキチン部分のシステイン・チオール基と反応させ、チオール・エーテルを形成した。標識は、１ｍＭ ＴＣＥＰを含むＰＢＳ中で行った。標識タンパク質は、ゲルろ過によって未標識のものから分離した。
ユビキチン・アッセイは、若干の変更を含むが、実質的には上述のものと同様に行った。この反応ウェルではニッケル基質を用いず、したがってすべての成分は溶液中で遊離であった。等しい量のフルオレセイン標識ユビキチン部分と、ＩＡＥＤＡＮＳ標識ユビキチン部分を使用した。反応は、室温で２時間、１００〜１５０μｌの容積で行い、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で停止した。
反応に続き、産物を１ｍＭ ＴＣＥＰを含むＰＢＳ中で、スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）−７５ＨＲ１０／３０サイズ排除カラムおよび蛍光発光検出（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を用いたＨＰＬＣによって分離した。個々の連結種（ｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）を分離するには、分子量カットオフがより大きいゲルろ過カラム（例えば、スーパーデックス２００ＨＲ１０／３０）を使用することも可能である。
（結果）
図１６Ａおよび１６Ｂは、ＦＲＥＴ蛍光色素で標識したＦｌａｇ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ユビキチン部分の、Ｅ３−ユビキチン部分複合体への、Ｅ３依存的取り込みを示す。ＨＰＬＣによる単離によって、非結合ユビキチン部分からの発光と、Ｅ３ユビキチン連結因子に結合したユビキチン部分からの発光とが示されている。ＩＡＥＤＡＮＳの最適励起波長である３３６ｎｍの励起光において、以下に示す波長の蛍光発光がトレース（ｔｒａｃｅ）として示される。図１６Ａは、Ｅ１とＥ２との組み合わせに続く、ＩＡＥＤＡＮＳ（４９０ｎｍ、大きい方のピーク）およびフルオレセイン（５１５ｎｍ、小さい方のピーク）で標識されたユビキチン部分の蛍光シグナルを示す。非結合のユビキチン部分は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて単離した。図１６Ｂは、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３（Ｒｏｃ１／Ｃｕｌ１）の組み合わせに続く、ＩＡＥＤＡＮＳ（４９０ｎｍ、各溶出容積で大きい方のピーク）およびフルオレセイン（５１５ｎｍ、各溶出容積で小さい方のピーク）によって標識されたユビキチン部分の蛍光シグナルを示す。点線は、タンパク質溶液の光学密度（目盛は右側）を示し、タンパク質濃度が非常に低いにもかかわらず、発蛍光団が高感度であることを明らかにしている。
フルオレセインで標識されたユビキチン部分、およびＩＡＥＤＡＮＳで標識されたユビキチン部分は、Ｅ３へほぼ等量結合した。両方の発蛍光団で標識された非結合（未連結（ｕｎｌｉｇａｔｅｄ））のユビキチン部分からの蛍光発光と、Ｅ３に結合したユビキチン部分からの蛍光発光のスペクトル分析を比較することによって、５１５ｎｍ対４９０ｎｍの発光比が顕著に増大していることが示されている（図１７）。これは結合したユビキチン部分において、異なるユビキチン部分からの発蛍光団が、測定されるＦＲＥＴに十分に近接していることを示す。
（実施例５：Ｅ１＋Ｅ２＋Ｍｄｍ２＋ｐ５３アッセイ）
Ｅ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋Ｇｓｔ−Ｍｄｍ２＋Ｈｉｓ−ｐ５３、およびＦｌａｇ−ユビキチン部分の混合によるｐ５３へのユビキチン部分の結合は、購入したＥ１（Ａｆｆｉｎｉｔｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｘｅｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）、Ｅ．ｃｏｌｉから精製されたＦｌａｇ−ユビキチン部分、ＧＳＴ−Ｕｂｃｈ５ｃとしてＥ．ｃｏｌｉから精製されＧＳＴタグが除かれているＥ２ Ｕｂｃｈ５ｃ（Ｕｂｃ−５ともいう）、バキュロウイルス感染によってＨｌ−５細胞から精製されＧＳＴタグがインタクトであるＧＳＴ−Ｍｄｍ２（図１８に概念的に示されている）およびバキュロウイルス感染によってＨｌ−５細胞から精製したｐ５３（図１８に概念的に示されている）を用い、以下のプロトコールを使用してアッセイした。Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃは上記の通り作製した。Ｇｓｔ−Ｍｄｍ２およびＨｉｓ−ｐ５３は、ＧＳＴ−Ｕｂｃｈ５ｃおよびＥ３ Ｈｉｓ−ＲＯＣ１／Ｃｕｌ１に関しての上の記載にそれぞれ従って作製した。
（材料および方法）
ｐ５３へのユビキチン部分の結合を測定するアッセイを、ウェスタン・ブロット分析によって行うため、以下の手順を用いた。以下の組み合わせのユビキチン因子、ユビキチン部分、およびｐ５３を反応混合液中で混合した：Ｅ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋ｐ５３（コントロールとして）；Ｍｄｍ２＋ｐ５３（コントロールとして）；Ｅ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ（コントロールとして）；およびＥ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋Ｍｄｍ２＋ｐ５３（コントロールとして）。各反応混合液に以下を添加する。
最終濃度
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５
５ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．６ｍＭ ＤＴＴ
２．０ｍＭ ＡＴＰ
１００ｎｇ Ｆｌａｇ−ユビキチン部分（上記のように作製）
１００ｎｇ ＨＩｓ−ｐ５３。
ミリポア（ｍｉｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過した水で、緩衝液の最終容積を８０μｌにし、続いて、１０μｌのＤＭＳＯを加える。
その後、Ｅ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋ｐ５３；Ｍｄｍ２＋ｐ５３；Ｅ１＋Ｅ２Ｕｂｃｈ５ｃ；またはＥ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋Ｍｄｍ２＋ｐ５３；および５％グリセロールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌを上記溶液に加えた。Ｈｉｓ−Ｅ２、およびＭｄｍ２を上記のように作製し、Ｅ１は購入する（上記の通り）。以下の量の各酵素を、これらのアッセイに使用する：５ｎｇのＥ１、１５ｎｇのＥ２ Ｕｂｃｈ５ｃ、および５０ｎｇのＭｄｍ２。その後、反応を３７℃で１時間進行う。
反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、マウス抗Ｆｌａｇ、および抗マウスＩｇ−ＨＲＰを用いてウェスタン・ブロットによって分析した。
（結果：ｐ５３へのユビキチン部分の結合）
図１９は、上記のようにＥ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋ｐ５３；Ｍｄｍ２＋ｐ５３；Ｅ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ；およびＥ１＋Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃ＋Ｍｄｍ２＋ｐ５３について測定したユビキチン部分の結合を示す。
（実施例６：Ｅ１＋Ｅ２＋Ｍｄｍ２＋ｐ５３アッセイ）
Ｅ１＋Ｅ２・Ｕｂｃｈ５ｃ＋Ｇｓｔ−Ｍｄｍ２＋Ｈｉｓ−ｐ５３、およびＦｌａｇ−ユビキチン部分の混合によるｐ５３へのユビキチン部分の結合は、購入したＥ１（Ａｆｆｉｎｉｔｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｘｅｔｅｒ，Ｕ．Ｋ．）、Ｅ．ｃｏｌｉから精製したＦｌａｇ−ユビキチン部分、ＧＳＴ−Ｕｂｃｈ５ｃとしてＥ．ｃｏｌｉから精製されＧＳＴタグが除かれているＥ２・Ｕｂｃｈ５ｃ（Ｕｂｃ−５ともいう）、バキュロウイルス感染によってＨｌ−５細胞から精製されＧＳＴタグがインタクトであるＧＳＴ−Ｍｄｍ２（図１８に概念的に示されている）およびバキュロウイルス感染によってＨｌ−５細胞から精製したｐ５３（図１８に概念的に示されている）を用い、以下のプロトコールを使用してアッセイした。Ｅ２／Ｕｂｃｈ５ｃを上記のように作製した。Ｇｓｔ−Ｍｄｍ２およびＨｉｓ−ｐ５３、それぞれＧＳＴ−Ｕｂｃｈ５ｃおよびＥ３・Ｈｉｓ−ＲＯＣ１／Ｃｕｌ１に関しての上記のように作製した。
（材料および方法）
以下の手順は、ｐ５３へのユビキチン部分の結合を測定するアッセイに用いられたもので、図２０に概念的に図示されている。１％カゼイン／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌを用い、ニッケル基質の９６ウェル・プレートのウェル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を室温で１時間ブロックし、ＰＢＳ（２００μｌ）で３回洗浄した。各ウェルには、以下のＦｌａｇ−ユビキチン部分（上記参照）反応液を加える。
最終濃度
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５
５ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．６ｍＭ ＤＴＴ
２．０ｍＭ ＡＴＰ
１００ｎｇ Ｆｌａｇ−ユビキチン部分（上記のように作製）
１００ｎｇ Ｈｉｓ−ｐ５３。
ミリポア（ｍｉｌｉｐｏｒｅ）フィルターでろ過した水で、緩衝液の最終容積を８０μｌにし、続いて、１０μｌのＤＭＳＯを加える。
その後、Ｅ１＋Ｈｉｓ−Ｅ２およびＭｄｍ２および５％グリセロールを含む、２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）１０μｌを上記溶液に加えた。コントロールはＭｄｍ２のみ、またはＨｉｓ−ｐ５３のみを含んだ。Ｈｉｓ−Ｅ２、およびＭｄｍ２を上記のように作製し、Ｅ１は購入した（上記の通り）。以下の量の各酵素を、これらのアッセイに使用した：５ｎｇ／１ウェルのＥ１、１５ｎｇ／ウェルのＥ２ Ｕｂｃｈ５ｃ、および５０ｎｇ／ウェルのＭｄｍ２。その後、反応を室温で１時間進行させる。
ユビキチン反応の後、ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。ｐ５３結合ユビキチン部分を測定するため、マウス抗Ｆｌａｇ（１：１０，０００）および抗マウスＩｇ−ＨＲＰ（１：１５０００）を含むＰＢＳ（１００μｌ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。その後、ウェルを２００μｌのＰＢＳで３回洗浄し、続いてルミノール基質（１／５希釈）を１００μｌ添加した。その後、蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）を使用して、各ウェルの発光を測定した。
（結果：ｐ５３へのユビキチン部分の結合）
図２１は、Ｈｉｓ−ｐ５３のみ、Ｍｄｍ２のみ、およびＭｄｍ２＋Ｈｉｓ−ｐ５３について、上記ように測定した発光を示す。
以下の図に、好適な実施形態の例が図示されている。
図２２は、図中の略図で用いられるユビキチン活性化因子（ＵＡＡ）、ユビキチン結合体化因子（ＵＣＡ）、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ）、ユビキチン部分（Ｕ）、および候補因子（ＣＡ）の重要性を示す。
図２３は、第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ＵＡ−１＋ＣＡ＋Ｕを混合すること；および
２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。別の好適な実施形態では、ＵＡ−１はＵＡＡである。別の好適な実施形態では、ＵＡＡはＥ１である。さらに別の好適な実施形態では、ＵＡ−１は標識を含む。別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は標識を有する。
図２４は、第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第１のユビキチン因子ＵＡＡ１＋ＵＡ−２＋ＣＡ＋Ｕを混合すること；および
２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。別の好適な実施形態では、ＵＡ−２は標識を含む。さらに別の好適な実施形態では、ＵＡ−２は標識を含む。
図２５は、ユビキチン結合因子ＵＣＡ１である第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第２のユビキチン因子ＵＡＡ２＋ＵＣＡ１＋ＣＡ＋Ｕを混合すること；および
２）ＵＣＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。
図２６は、Ｅ２であるユビキチン結合因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここでアッセイは、以下：
１）ユビキチン活性化因子Ｅ１＋Ｅ２＋ＣＡ＋Ｕを混合すること；および
２）Ｅ２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図２７は、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるユビキチン結合因子である第２のユビキチン因子ＵＣＡ２−Ｕ＋ＵＬＡ１＋ＣＡを混合すること；および
２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は標識を含む。なお別の実施形態において、ＵＬＡ１は、標識を含む。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含む。
図２８は、Ｅ３であるユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるＥ２であるユビキチン結合体化因子＋Ｅ３＋ＣＡを混合すること；および
２）Ｅ３へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。好適な実施形態では、Ｅ３はＭｄｍ２タンパク質である。
図２９は、Ｅ２であるユビキチン結合体化因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるＥ１であるユビキチン活性化因子＋Ｅ２＋ＣＡを混合すること；および
２）Ｅ２へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。
図３０は、第三のユビキチン因子（ＵＡ−３）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるＥ１であるユビキチン活性化因子＋Ｅ２であるユビキチン結合因子＋ＵＡ−３＋ＣＡを混合すること；および
２）ＵＡ−３へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。好適な実施形態では、ＵＡ−３はＭｄｍ２タンパク質を含む。
図３１は、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ３）である第三のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるＥ１であるユビキチン活性化因子＋Ｅ２であるユビキチン結合体化因子＋ＵＬＡ３＋ＣＡを混合すること；および
２）ＵＬＡ３へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含む。
図３２は、Ｅ３であるユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を有するＥ１＋Ｅ２＋Ｅ３＋ＣＡを混合すること；および
２）Ｅ３へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。好適な実施形態では、Ｅ３はＭｄｍ２である。
図３３は、固体支持体に結合されている第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ＵＡ−１（固体支持体に結合されている）＋ＣＡ＋Ｕを混合すること；および
２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすること
を包含する。別の好適な実施形態では、ＵＡ−１はＵＡＡである。別の好適な実施形態では、ＵＡＡはＥ１である。別の好適な実施形態では、固形支持体はマイクロタイター・プレートである。別の好適な実施形態では、固形支持体はビーズである。
図３４は、固体支持体に結合されている第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（固体支持体に結合されている）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、固形支持体はマイクロタイター・プレートである。別の好適な実施形態では、固形支持体はビーズである。別の好適な実施形態では、ＵＡ−２はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図３５は、固体支持体に結合されているユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるユビキチン結合因子ＵＣＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（固体支持体に結合されている）＋ＣＡを混合することと、
２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図３６は、標識を具備した第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ＵＡ−１（標識付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図３７は、標識を具備したユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるユビキチン結合因子ＵＣＡ１である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（標識付き）＋ＣＡを混合することと、
２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図３８は、第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）への、標識を具備したユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ＵＡ−１＋ＣＡ＋Ｕ（標識付き）を混合することと、
２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図３９は、第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、標識を具備したユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２＋ＣＡ＋Ｕ（標識付き）を混合することと、
２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図４０は、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、標識を具備したユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分（標識付き）を備えるユビキチン結合因子ＵＣＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１＋ＣＡを混合することと、
２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図４１は、標識を具備した、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるユビキチン結合因子ＵＣＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（標識付き）＋ＣＡを混合することと、
２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図４２は、標識を具備した第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（標識付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、ＵＡ−２はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図４３は、結合タグ（または付着部（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ））を具備した第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ＵＡ−１（結合タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図４４は、結合タグ（または付着部）を具備したユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン部分を備えるユビキチン結合因子ＵＣＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（結合タグ付き）＋ＣＡを混合することと、
２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。
図４５は、結合タグ（または付着部）を具備した第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（結合タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図４６は、エピトープ・タグ（またはエピトープ標識（ｅｐｉｔｏｐｅ ｌａｂｅｌ））を具備した第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ＵＡ−１（エピトープ・タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図４７は、エピトープ・タグ（またはエピトープ標識）を具備した第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（エピトープ・タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、
２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。
図４８は、基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン連結因子ＵＬＡ１である第１のユビキチン因子＋第２のユビキチン因子＋基質分子＋ＣＡ ＋Ｕを混合することと、
２）基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、は標識を有する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質およびｐ５３を含有する基質分子を含む。
図４９は、基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン連結因子ＵＬＡ１である第１のユビキチン因子＋ユビキチン部分を備えるユビキチン結合因子である第２のユビキチン因子＋基質分子＋ＣＡ ＋Ｕを混合することと、
２）基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、は標識を有する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質およびｐ５３を含有する基質分子を含む。
図５０は、基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態を概念的に示し、ここで、アッセイは、以下：
１）ユビキチン連結因子ＵＬＡ１である第１のユビキチン因子＋第２のユビキチン因子＋ユビキチン活性化因子である第三のユビキチン因子＋第１のＦＲＥＴタグを具備したユビキチン部分＋第２のＦＲＥＴタグを具備した基質分子＋ＣＡを混合することと、
２）基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることと
を包含する。別の好適な実施形態では、は標識を有する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質およびｐ５３を含有する基質分子を含む。
図５１は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５１Ａ）および核酸配列（図５１Ｂ）を示す。
図５２は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５２Ａ）および核酸配列（図５２Ｂ１および図５２Ｂ２））を示す。
図５３は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５３Ａ）および核酸配列（図５３Ｂ１および図５３Ｂ２）を示す。
図５４は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５４Ａ）および核酸配列（図５４Ｂ）を示す。
図５５は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５５Ａ）および核酸配列（図５５Ｂ）を示す。
図１は、ユビキチン活性化因子、ユビキチン結合因子、およびユビキチン部分を混合したことによる、蛍光標識されたユビキチン部分のＥ２への結合の相対量を示す。これらの実験で、Ｅ２はＨｉｓ−Ｕｂｃｈ５ｃである。 図２は、様々な組み合わせのユビキチン因子と、ユビキチン部分とを混合したことによる、ユビキチン部分のＥ３への結合の相対量を示す。これらの実験で、Ｅ３は、ＲＩＮＧフィンガー・タンパク質ＲＯＣ１およびキュリン（Ｃｕｌｌｉｎ）Ｃｕｌ１を含有する。 図３は、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびユビキチン部分を混合したことによる、ユビキチン部分のＥ３への結合の相対量を示す。図３Ａは、ＤＭＳＯの存在下および非存在下で様々な量のＥ１を用いた、ユビキチン部分のＥ３への結合の相対量を示す。図３Ｂは、様々な量のユビキチン部分およびＥ３を用いた、ユビキチン部分のＥ３への結合の相対量を示す。 図４は、Ｆｌａｇ−ユビキチン部分と、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ結合抗マウス抗体と、ルミノール（Ｌｕｍｉｎｏｌ）蛍光ＨＲＰ基質とを混合するアッセイにおけるユビキチン部分のＥ３への結合の相対量を示す蛍光標識のシグナル対ノイズ比を示す。シグナルは、ユビキチン部分、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３を混合した反応組成物から測定し、反応組成物において、Ｅ３は反応容器表面基質（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ ｓｕｒｆａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）に特異的に結合されている。バックグラウンドは、Ｅ３非存在下でアッセイを行った後に存在する蛍光の量として測定した。 図５は、２つの異なるＥ３ユビキチン連結因子を用いたａｎへのユビキチン部分の結合を調節する２つの候補因子の濃度依存的影響を示す。図５Ａは、ユビキチン連結因子の成分として、ＲＯＣ１／Ｃｕｌ１またはＲＯＣ２／Ｃｕｌ５を含有するアッセイにおける、ユビキチン部分のＥ３への結合の濃度依存的減少を示す。図５Ｂは、別の候補因子による、ユビキチン部分のＥ３への結合の濃度依存的減少のわずかに相違したパターンを示す。 図６は、ユビキチン部分のＥ３への結合を調節する２つの候補因子の存在下および非存在下での、ユビキチン部分、Ｅ１、Ｅ２、およびにＥ３ユビキチン因子の混合、ならびにユビキチン部分、Ｅ１、およびにＥ２ユビキチン因子の混合による、ユビキチン部分のＥ３への結合と、ユビキチン部分のＥ２への結合の比を示す。図６Ａは、ユビキチン部分のＥ３への結合のみを調節する候補因子を示す。図６Ｂは、Ｅ３以外のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を調節する候補因子を示す。 図７は、Ｅ３へのユビキチン部分の結合、およびＥ２へのユビキチン部分の結合を調節する２つの候補因子の濃度依存的影響を示す。図７Ａは、候補因子が（ユビキチン部分、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３を混合することによる）ユビキチン部分のＥ３への結合に濃度依存的影響をもつが、（ユビキチン部分、Ｅ１、およびＥ２を混合することによる）ユビキチン部分のＥ２への結合には影響をもたないこと、従って、ユビキチン部分のＥ３への結合のみに影響を与えるという結果を示す。図７Ｂは、候補調節物質がユビキチン部分のＥ３への結合と、ユビキチン部分のＥ２への結合との両方に濃度依存的影響をもつこと、すなわち、Ｅ３以外の成分に影響を与えるという結果を示す。 図８Ａおよび８Ｂは、それぞれ、ウサギＥ１ユビキチン活性化因子をコードする核酸配列、およびウサギＥ１のアミノ酸配列を示す。 図９Ａおよび９Ｂは、それぞれ、Ｅ２ Ｕｂｃｈ５ｃをコードする核酸配列、およびＥ２ Ｕｂｃｈ５ｃのアミノ酸配列を示す。 図１０は、ＲＩＮＧフィンガー・タンパク質ＡＰＣ１１のアミノ酸配列を示す。 図１１は、ＲＩＮＧフィンガー・タンパク質ＲＯＣ１のアミノ酸配列を示す。 図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれ、ＲＩＮＧフィンガー・タンパク質ＲＯＣ２をコードする核酸配列、およびＲＯＣ２のアミノ酸配列を示す。 図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ、キュリンＣＵＬ５をコードする核酸配列、およびＣＵＬ５のアミノ酸配列を示す。 図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、キュリンＡＰＣ２をコードする核酸配列、およびＡＰＣ２のアミノ酸配列を示す。 図１５Ａ、１５Ｂ、および１５Ｃは、それぞれ、ヒト・ユビキチン部分、Ｆｌａｇ−ユビキチン部分、およびＦｌａｇ−Ｃｙｓ−ユビキチン部分のアミノ酸配列を示す。配列中のＦｌａｇ部分およびＦｌａｇ−Ｃｙｓ部分は太字で示されている。 図１６Ａおよび１６Ｂは、ＦＲＥＴ蛍光色素（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）で標識したＦｌａｇ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−ユビキチン部分のＥ３−ユビキチン部分複合体へのＥ３依存的取り込みを示す。ＨＰＬＣによる単離によって、遊離ユビキチン部分からの発光と、Ｅ３ユビキチン連結因子に結合したユビキチン部分からの発光とが示されている。ＩＡＥＤＡＮＳの最適励起波長である３３６ｎｍの励起光において、トレース（ｔｒａｃｅ）は、以下に示す波長の蛍光発光を示した。図１６Ａは、Ｅ１とＥ２との組み合わせに続く、ＩＡＥＤＡＮＳ（４９０ｎｍ、大きい方のピーク）およびフルオレセイン（５１５ｎｍ、小さい方のピーク）によって標識されたユビキチン部分の蛍光シグナルを示す。遊離のユビキチン部分は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分離した。図１６Ｂは、Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３（Ｒｏｃ１／Ｃｕｌ１）の組み合わせに続く、ＩＡＥＤＡＮＳ（４９０ｎｍ、各溶出量中の大きい方のピーク）およびフルオレセイン（５１５ｎｍ、各溶出量中の小さい方のピーク）によって標識されたユビキチン部分の蛍光シグナルを示す。点線は、タンパク質溶液の光学濃度（目盛は右側）を示し、タンパク質濃度が非常に低いにもかかわらず蛍光色素が高感度であることを明らかにしている。 図１７は、ＦＲＥＴのドナー／アクセプター対であるＥＤＡＮＳおよびフルオレセインで標識された遊離ユビキチン部分の、３３６ｎｍの励起光における、蛍光発光スペクトルを示す。点線は標識された遊離ユビキチン部分（反応物）の発光スペクトルを示し、実線は標識されたＥ３結合ユビキチン部分（生成物）の発光スペクトルを示す。Ｅ３結合ユビキチン部分の５１５：４９０ｎｍ発光比が、遊離ユビキチン部分に比べて、顕著に増大していることによって、ＦＲＥＴドナー／アクセプター対のＥＤＡＮＳドナーからフルオレセイン・アクセプターへのエネルギー転移が示されている。 図１８は、ＧＳＴ−Ｍｄｍ２およびＨｉｓ−ｐ５３の概念図である。 図１９は、Ｍｄｍ２による生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での、ｐ５３へのユビキチン部分の結合に関するウエスタン・ブロット分析を示す。 図２０は、Ｍｄｍ２による、ｐ５３へのユビキチン部分の結合に関する、ニッケル・プレートベースのアッセイ（ｎｉｃｋｅｌ ｐｌａｔｅ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）の概念図である。 図２１は、ニッケル・プレートベースのアッセイにおける、Ｍｄｍ２によるｐ５３へのユビキチン部分結合の量のルミネッセンス指標を測定した結果を示す。 図２２は、図中の概念図で用いられる、ユビキチン活性化因子（ＵＡＡ）、ユビキチン結合因子（ＵＣＡ）、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ）、ユビキチン部分（Ｕ）、および候補因子（ＣＡ）のキー（ｋｅｙ）を示す。 図２３は、第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、 １）ＵＡ−１＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ＵＡ−１はＵＡＡである。別の好適な実施形態では、ＵＡＡはＥ１である。さらに別の好適な実施形態では、ＵＡ−１は標識を有する。別の好適な実施形態では、ユビキチン部分は標識を有する。 図２４は、第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第１のユビキチン因子ＵＡＡ１＋ＵＡ−２＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ＵＡ−２は標識を有する。さらに別の好適な実施形態では、ＵＡ−２は標識を有する。 図２５は、ユビキチン結合体化因子ＵＣＡ１である第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第２のユビキチン因子ＵＡＡ２＋ＵＣＡ１＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＣＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図２６は、Ｅ２であるユビキチン結合体化因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン活性化因子Ｅ１＋Ｅ２＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）Ｅ２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図２７は、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、ユビキチン結合体化因子である第２のユビキチン因子ＵＣＡ２−Ｕ＋ＵＬＡ１＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ユビキチンは標識を有する。さらに別の好適な実施形態では、ＵＬＡ１は、標識を有する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図２８は、Ｅ３であるユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、Ｅ２であるユビキチン結合体化因子＋Ｅ３＋ＣＡを混合することと、 ２）Ｅ３へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、Ｅ３はＭｄｍ２タンパク質である。 図２９は、Ｅ２であるユビキチン結合体化因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、Ｅ１であるユビキチン活性化因子＋Ｅ２＋ＣＡを混合することと、 ２）Ｅ２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図３０は、第３のユビキチン因子（ＵＡ−３）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、Ｅ１であるユビキチン活性化因子＋Ｅ２であるユビキチン結合体化因子＋ＵＡ−３＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＡ−３へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、ＵＡ−３はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図３１は、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ３）である第３のユビキチン因子（ＵＡ−３）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、Ｅ１であるユビキチン活性化因子＋Ｅ２であるユビキチン結合体化因子＋ＵＬＡ３＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ３へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図３２は、Ｅ３であるユビキチン連結因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有するＥ１＋Ｅ２＋Ｅ３＋ＣＡを混合することと、 ２）Ｅ３へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、Ｅ３はＭｄｍ２タンパク質である。 図３３は、固体支持体に結合されている第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ＵＡ−１（固体支持体に結合されている）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ＵＡ−１はＵＡＡである。別の好適な実施形態では、ＵＡＡはＥ１である。別の好適な実施形態では、固体支持体はマイクロタイター・プレートである。別の好適な実施形態では、固体支持体はビーズである。 図３４は、固体支持体に結合されている第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（固体支持体に結合されている）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、固体支持体はマイクロタイター・プレートである。別の好適な実施形態では、固体支持体はビーズである。別の好適な実施形態では、ＵＡ−２はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図３５は、固体支持体に結合されているユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、ユビキチン結合体化因子ＵＣＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（固体支持体に結合されている）＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図３６は、標識を有した第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ＵＡ−１（標識付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図３７は、標識を有したユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、ユビキチン結合体化因子ＵＬＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（標識付き）＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図３８は、第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）への、標識を有したユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ＵＡ−１＋ＣＡ＋Ｕ（標識付き）を混合することと、 ２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図３９は、第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、標識を有したユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２＋ＣＡ＋Ｕ（標識付き）を混合することと、 ２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図４０は、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、標識を有したユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分（標識付き）を有し、ユビキチン結合体化因子ＵＣＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図４１は、標識を有した、ユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、ユビキチン結合体化因子ＵＬＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（標識付き）＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図４２は、標識を有した第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（標識付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ＵＡ−２はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図４３は、結合タグ（または結合部分（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ））を有した第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ＵＡ−１（結合タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図４４は、結合タグ（または結合部分）を有したユビキチン連結因子（ＵＬＡ１）である第１のユビキチン因子への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン部分を有し、ユビキチン結合体化因子ＵＬＡ２である第２のユビキチン因子＋ＵＬＡ１（結合タグ付き）＋ＣＡを混合することと、 ２）ＵＬＡ１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含有する。 図４５は、結合タグ（または結合部分）を有した第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（結合タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図４６は、エピトープ・タグ（またはエピトープ標識（ｅｐｉｔｏｐｅ ｌａｂｅｌ））を有した第１のユビキチン因子（ＵＡ−１）へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ＵＡ−１（エピトープ・タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−１へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図４７は、エピトープ・タグ（またはエピトープ標識）を有した第２のユビキチン因子（ＵＡ−２）への、ユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）第１のユビキチン因子すなわちＵＡＡ１＋ＵＡ−２（エピトープ・タグ付き）＋ＣＡ＋Ｕを混合することと、 ２）ＵＡ−２へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。 図４８は、基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン連結因子ＵＬＡ１である第１のユビキチン因子＋第２のユビキチン因子＋基質分子＋ＣＡ ＋Ｕを混合することと、 ２）基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含み、そして基質分子はｐ５３を含む。 図４９は、基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン連結因子ＵＬＡ１である第１のユビキチン因子＋ユビキチン部分を有し、ユビキチン結合体化因子である第２のユビキチン因子＋基質分子＋ＣＡ ＋Ｕを混合することと、 ２）基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。別の好適な実施形態では、は標識を有する。別の好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含み、そして基質分子はｐ５３を含む。 図５０は、基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイする好適な実施形態であって、ここで、このアッセイは、 １）ユビキチン連結因子ＵＬＡ１である第１のユビキチン因子＋第２のユビキチン因子＋ユビキチン活性化因子である第３のユビキチン因子＋第１のＦＲＥＴタグを有したユビキチン部分＋第２のＦＲＥＴタグを有した基質分子＋ＣＡを混合することと、 ２）基質分子へのユビキチン部分の結合をアッセイすることとを含む実施形態を概念的に示す。好適な実施形態では、ユビキチン連結因子はＭｄｍ２タンパク質を含み、そして基質分子はｐ５３を含む。 図５１は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５１Ａ）および核酸配列（図５１Ｂ）を示す。 図５２は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５２Ａ）および核酸配列（図５２Ｂ１および図５２Ｂ２）を示す。 図５２は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５２Ａ）および核酸配列（図５２Ｂ１および図５２Ｂ２）を示す。 図５３は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５３Ａ）および核酸配列（図５３Ｂ１および図５３Ｂ２）を示す。 図５４は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５４Ａ）および核酸配列（図５４Ｂ）を示す。 図５５は、好適な実施形態におけるＥ２のアミノ酸配列（図５５Ａ）および核酸配列（図５５Ｂ）を示す。

Claims (29)

  1. 少なくとも１つのユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を変調する因子をアッセイする方法であって、
    ａ） ｉ）第１のユビキチン因子、
    ｉｉ）候補因子、および
    ｉｉｉ）ユビキチン部分、
    を混合するステップと、
    ｂ）該第１の因子への該ユビキチン部分の結合をアッセイするステップと、
    を包含する、方法。
  2. 前記第１のユビキチン因子は、ユビキチン活性化因子であり、該ユビキチン活性化因子は、表１に列挙されるＥ１ポリペプチドから選択されるＥ１ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記混合ステップで第２のユビキチン因子を含むことをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１の因子は、ユビキチン結合因子であり、該ユビキチン結合因子は、表２に列挙されるＥ２ポリペプチドから選択されるＥ２ポリペプチドであり、前記第２の因子はユビキチン活性化因子であり、該ユビキチン活性化因子は、表１に列挙されるＥ１ポリペプチドから選択されるＥ１ポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記第１の因子は、ユビキチン連結因子であり、該ユビキチン連結因子は、表３に列挙されるＥ３ポリペプチドから選択されるＥ３ポリペプチドであり、前記第２の因子は、ユビキチン結合因子であり、該ユビキチン結合因子は、表２に列挙されるＥ２ポリペプチドから選択されるＥ２ポリペプチドであり、該ユビキチン結合因子が前記ユビキチン部分を含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ユビキチン活性化因子は、前記ユビキチン部分を含むＥ１ポリペプチドである、請求項４に記載の方法。
  7. 前記混合ステップで第３のユビキチン因子を含むことをさらに包含する、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第３の因子は、ユビキチン連結因子であり、該ユビキチン連結因子は、表３に列挙されるＥ３ポリペプチドから選択されるＥ３ポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
  9. 前記第１のユビキチン因子が、固体支持体に結合する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記第２のユビキチン因子が、固体支持体に結合する、請求項３に記載の方法。
  11. 前記第１のユビキチン因子が、固体支持体に結合する、請求項５に記載の方法。
  12. 前記固体支持体がマイクロタイター・プレートである、請求項９、１０、および１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記固体支持体がビーズである、請求項９、１０、および１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記第１の因子がタグを含む、請求項１または５に記載の方法。
  15. 前記第２の因子がタグを含む、請求項３に記載の方法。
  16. 前記ユビキチン部分がタグを含む、請求項１、３、および５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記第１の因子が結合タグを含む、請求項１または５に記載の方法。
  18. 前記第２の因子が結合タグを含む、請求項３に記載の方法。
  19. 前記第１の因子が標識を含む、請求項１または５に記載の方法。
  20. 前記第２の因子が標識を含む、請求項３に記載の方法。
  21. 前記第１の因子がエピトープ・タグを含む、請求項１または５に記載の方法。
  22. 前記第２の因子がエピトープ・タグを含む、請求項３に記載の方法。
  23. 少なくとも第一および第２のユビキチン部分が使用され、該第一および該第２のユビキチン部分の群は、異なる蛍光標識を含み、該標識は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対を形成する、請求項１、３、および５のいずれか１項に記載の方法。
  24. 少なくとも１つのユビキチン因子へのユビキチン部分の結合を変調する因子をアッセイする方法であって、
    ａ） ｉ）表３に列挙されるＥ３ポリペプチドから選択されるＥ３ポリペプチドであるユビキチン連結因子を含む、第１のユビキチン因子、
    ｉｉ）第２のユビキチン因子、
    ｉｉｉ）候補因子、
    ｉｖ）ユビキチン部分、および
    ｖ）標的タンパク質、
    を混合するステップと、
    該第１の因子への該ユビキチン部分の結合をアッセイするステップと、
    を包含する、方法。
  25. 前記第２の因子は、ユビキチン結合因子であり、該ユビキチン結合因子は、前記ユビキチン部分を含む表２に列挙されるＥ２ポリペプチドから選択されるＥ２ポリペプチドである、請求項２４記載の方法。
  26. 前記混合ステップで、第３のユビキチン因子を含むことをさらに包含し、該第３の因子は、ユビキチン活性化因子であり、該ユビキチン活性化因子は、表１に列挙されるＥ１ポリペプチドから選択されるＥ１ポリペプチドであり、基質および前記ユビキチン部分は、異なる蛍光標識を含み、該標識は、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）対を形成する、請求項２４に記載の方法。
  27. 前記ユビキチン部分は哺乳動物ユビキチン部分である、請求項１または２４に記載の方法。
  28. 前記ユビキチン部分は標識を含む、請求項２４に記載の方法。
  29. 前記標識はエピトープ・タグを含む、請求項２４に記載の方法。
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