JP2005518199A - 栽培用植物および家畜化動物中のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列における進化的に有意の変化を同定するための方法 - Google Patents

栽培用植物および家畜化動物中のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列における進化的に有意の変化を同定するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、栽培品種化（家畜化）植物または動物における商業的にもしくは審美的に重要な形質に関連することもあり得るポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。当該方法は、進化的に有意の変化および進化的に中立の変化を同定するために、当該栽培化生物およびその祖先からの相同遺伝子の比較を用いる。このように同定された配列は、栽培化生物またはそれらの祖先における商業的にもしくは審美的に望ましい形質を増強するのに役立つことも可能である。

Description

本発明は、栽培品種化（家畜化）植物および動物における商業的にもしくは審美的に重要な形質に対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するために、分子的および進化的技術を用いることに関するものである。
背景技術
ヒトは、ある種の商業的に価値のある、および／または、審美的な形質を選択しながら、何千年もの間、植物や動物を育種してきた。栽培品種化植物は、収量、短日開花、タンパク質および／または油含量、収穫の容易さ、味、耐病性、耐乾燥性のような形質で、それらの野生祖先と異なる。家畜化動物は、脂肪および／またはタンパク質含量、ミルク産生、従順さ、繁殖力、および成熟までの期間、のような形質で、それらの野生型祖先と異なる。現在、上記の相違の素地となる大部分の遺伝子はわかっておらず、また重要なことに、これらの能力を賦与するようにこれらの遺伝子に発生した特定の変化も知られていない。栽培品種化（家畜化）植物および動物とそれらの野生型祖先との間のこれらの相違の根拠を理解することは、それらの形質を維持そして増強するための有用な情報をもたらすであろう。作物植物の場合、所望の形質を制御する特定の遺伝子類の同定は、従来は可能でなかった仕方で、直接的で迅速な改良を可能にするであろう。 栽培種とそれらの野生祖先との間の相同遺伝子またはタンパク質の比較は、保存された分子配列および機能特徴に関して有用な情報を提供することも可能であるが、このアプローチは、人為的選択圧のために配列が変化した遺伝子の同定に使うには、限界がある。洗練されたアルゴリズムと分析方法の進歩に伴って、どの遺伝子が正に選択されているかに関して、ＤＮＡ配列変化から、さらに多くの情報を引き出すことも可能である。これらの方法のうち最も有力なものである、“ＫA／ＫS”は、

非同義部位当りの非同義ヌクレオチド置換（Ｋ A ）
同義部位置当りの同義置換（ＫS）

の比のアラインされたタンパク質コードヌクレオチド配列間のペアワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）比較を含む（ここで、非同義はコードされたアミノ酸を変える置換を意味し、同義はコードされたアミノ酸を変えない置換を意味する）。“ＫA／ＫS型方法”は本法および同様な方法を包含する。
これらの方法は、相同タンパク質にアミノ酸差異をもたらす、ダーウィン的（すなわち、自然の）分子レベルの正の選択の存在を証明するために、使われてきた。複数のグループはそうした方法を用いて、特定のタンパク質が中立置換速度より速やかに進化したことを実証し、そしてそれゆえにダーウィン的分子レベルの正の選択の存在を支持している。例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄおよびＫｒｅｉｔｍａｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５１：６５２−６５４は、ある遺伝子座のコード領域中の同義置換に対するアミノ酸交換置換の数の比較に基づく、中立タンパク質進化仮説の統計検定を提案している。彼らは、この検定を３種のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＡｄｈ遺伝子座に適用したとき、当該遺伝子座が選択的に有利な突然変異の適応固定を受けたこと、また、大部分のタンパク質進化の説明として、適応変異の選択的固定が、中立突然変異の時計のように正確な蓄積に代る現実的なものらしいことを、それが代って示すと結論している。Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ２６１：２０３−２０７は、ＭｃＤｏｎａｌｄ ＆ Ｋｒｅｉｔｍａｎ検定を用い、適応進化が転写を制御する配列（非コード配列）で生じているかどうかを検討している。
Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：５６０６−５６０９は、ＭｉｙａｔａおよびＹａｓｕｎａｇａの方法を用い、２種のヘビからの１０種のＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のヌクレオチド配列のペアワイズ比較を行っている；この方法は、イントロンを含む非コード領域についての部位当りのヌクレオチド置換の数（ＫN）とＫAおよびＫSとを、比較するものである。当該タンパク質コード領域は、イントロンを含む非コード領域より、ずっと速い速度で進化してきたと、彼らは結論している。その高度に加速された置換速度は、餌を捕獲するために、あるいは捕食者に対する防御のために、強い選択有利性を提供したはずの新しい生理的活性を産み出すための、ＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のダーウィン的分子レベル進化の原因になっている。Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（５）：６８５−６９０は、ｄNが非同義置換の数でｄSが同義置換の数であるＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉの方法を、遺伝子への自然選択を実証する目的のために、用いている。ＭｅｔｚおよびＰａｌｕｍｂｉ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（２）：３９７−４０６は、ＭｃＤｏｎａｌｄ ＆ Ｋｒｅｉｔｍａｎ（前掲）検定ならびにＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉ，ＮｅｉおよびＪｉｎ，およびＫｕｍａｒ，Ｔａｍｕｒａ，およびＮｅｉに帰属する方法を用い；交換部位当たりの交換置換Ｐnおよびサイレント部位当りのサイレント置換Ｐsの平均比率を調べ、ウニ類における結合性遺伝子類に対する正の選択の証拠を探し、それらが種形成の準備行為として急速に進化したかどうかを検討している。Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（２）：３４６−３５８は、同様な方法を用いて、特定のマウス遺伝子ファミリーの進化を調べ、実験的に操作可能な系においてどうのように選択が遺伝的分岐を駆動するかについて、それらの方法が重要な基本的洞察を提供すると結論している。Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９５）は、縮重プライマーを用いて、鳥類およびアメリカワニ（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）のさまざまな種類からＭＨＣ遺伝子座を引出し、次いでそれらをＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉ法（ｄN：ｄS比）により分析し、ＭＨＣ研究を非哺乳類脊椎動物に拡張している。Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：７１３−７１５は、ＫA／ＫS分析を用い、（雄性を決定する）ＳＲＹ遺伝子における保存領域に隣接する領域中の方向性選択を探している。彼らは、ＳＲＹの急速な進化が、新種をもたらす生殖的隔離の有意の原因になり得ることを、示唆している。Ｗｅｔｔｓｅｔｉｎら（１９９６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１３（１）：５６−６６は、Ｋｕｍａｒ，ＴａｍｕｒａおよびＮｅｉのＭＥＧＡプログラムおよび系統学的分析を適用し、リスおよび類縁のげっ歯類におけるＭＨＣクラスＩ遺伝子類の多様化を研究している。ＰａｒｈａｍおよびＯｈｔａ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：６７−７４は、選択についての検定ならびに遺伝子変換および中立変異についての検定を含む、集団生物学的アプローチが、ヒトＭＨＣクラスＩ多型性の発生および維持を分析するためには、必要だと述べている。Ｈｕｇｈｅｓ（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．１４（１）：１−５は、脊椎動物免疫系の細胞中で発現されるタンパク質は異常に速く進化するという仮説を検証するために、ＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉの方法（ｄN：ｄS比）を用いて、１００以上のオルソログ免疫グロブリンＣ２ドメインをヒトおよびげっ歯類間で比較した。ＳｗａｎｓｏｎおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：７１０−７１２は、ｄN：ｄS比を用い、ライシンとライシンに対する卵受容体との間の協調進化を証明し、新種形成（種分化）におけるそうした協調進化の役割を論考している。ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：１５１−１５４は、霊長類リゾチームにおける正の選択を証明するために、ＫA／ＫSを用いた。
栽培品種化に関係する遺伝的変化は、メイズ（ｍａｉｚｅ，トウモロコシ）（コーン（ｃｏｒｎ，トウモロコシ）についての好ましい農業用語）で最も広範囲に研究されてきた（Ｄｏｒｗｅｉｌｅｒ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：２３２−２３５）。メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｓｐｐ． ｍａｙｓ）については、少数の単一遺伝子変化が、われわれの現在の栽培品種化メイズ植物とその野生祖先テオシンテ（ｔｅｏｓｉｎｔｅ）（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｓｐｐ． ｐａｒｕｉｇｌｕｍｉｓ）との間のすべての相違を、明らかに説明する（Ｄｏｒｗｅｉｌｅｒ，１９９３）。ＱＴＬ（量的形質遺伝子座）分析（Ｄｏｅｂｌｅｙ（１９９０）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：９８８８−９８９２）は、１５に過ぎない遺伝子が、メイズにおける興味のある形質を制御しており、そしてメイズとテオシンテとの間の形態の著しい相違を説明することを、証明した（Ｗａｎｇ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９８：２３６−２３９）。
重要なことに、同様に少数の遺伝子が、コメ（ｒｉｃｅ）、コムギ（ｗｈｅａｔ）、アワ（ｍｉｌｌｅｔ）、およびモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）を含む、他のイネ科牧草由来の作物植物における興味のある形質を制御している可能性がある（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１７１４−１７１８）。実際、メイズにおけるこれらの関連する遺伝子の大部分について、相同遺伝子が、他のイネ科牧草由来の作物
植物における同様な形質を制御している可能性がある（Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９５））。それゆえ、１つのイネ科牧草由来の作物植物におけるこれらの遺伝子の同定は、その他のすべてにおける相同遺伝子の同定を容易にするであろう。
上に引用された論文から見られるように、急速に進化している遺伝子を同定するための分子進化の分析方法（ＫA／ＫS型方法）は、多くの異なる目的を達成するために、最も普通にはダーウィン的分子レベルの正の選択の存在を確かめるために、さらにまたダーウィン的分子レベルの正の選択の頻度を評価するために、新種が形成される機構を解明するために、あるいは特定遺伝子多型性ついての単一または複数の起源を確立するために、適用も可能である。上に引用された論文および文献中の他の論文から明白なことは、人工的選択圧によりもたらされた栽培品種化（家畜化）植物および動物における進化的変化を同定するために、それらの著者のだれひとりとして、ＫA／ＫS型方法を適用していないことである。Ｔｕｒｃｉｃｈ（１９９６）Ｓｅｘｕａｌ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ９：６５−７４は、植物遺伝子にＫS分析の使用を記載しているが、望ましい商業的もしくは審美的形質の開発、維持または増強に利用可能な進化的に重要な配列変化を含む、それらの遺伝子を、栽培品種化（家畜化）植物および動物において、同定するために、だれひとりＫA／ＫS型分析を用いていないと信じられている。
相同祖先遺伝子に比較して、独特な、増強した、または変化した機能を賦与するように進化した遺伝子の、栽培種における同定は、これらの機能を調整するための作用物質の開発に用いることも可能である。その素地となる栽培種遺伝子および進化した特定のヌクレオチド変化の同定、およびこれらの進化した遺伝子によりコードされるタンパク質における物理的および生化学的変化のさらなる特徴解明は、所望形質の下地にある機構に貴重な情報を提供できるであろう。この貴重な情報は、標的タンパク質の機能をさらに亢進する作用物質の開発に適用することも可能である。あるいは、原因となる遺伝子のさらなる工作は、望ましい形質を修飾あるいは増強することも可能である。加えて、同定された遺伝子は、他の栽培植物で興味ある形質の制御に役割を果すことが見いだされるかもしれない。同様な方法は、家畜に興味ある形質の遺伝子を同定することも可能である。
本明細書に引用されたすべての参考文献は、そっくりそのまま参考文献により本明細書に援用される。
本発明は、栽培品種化（家畜化）植物または動物における商業的に価値のある形質を制御するポリヌクレオチドを同定する方法に関するものである。本発明の方法に従って、商業的に価値のある形質を制御することが見いだされるこれらのポリヌクレオチドは、それらの形質をさらに亢進するのに使用も可能である。耐乾燥性、耐病性、またはストレス耐性、または収量、タンパク質含量、短日開花、油含量、収穫の容易さ、味、などのような、商業的に価値のある形質を制御することが同定されたポリヌクレオチドは、栽培植物の商業的価値をさらに亢進するための組成物および方法の開発に用いることも可能である。価値のある形質を制御するポリヌクレオチドを同定することは望ましいが、植物および動物ゲノム中の数万もの遺伝子の中にそうしたポリヌクレオチドを同定するには、努力を必要とする。本発明は、１．０またはそれより大きいＫA／ＫS比により典型的に示される、進化的に有意のヌクレオチド変化を含むそれらの配列を選択するために、栽培および祖先生物の対応するポリヌクレオチド配列を比較することにより、そうしたポリヌクレオチドの探索を狭めることを含む。例えば、１．０のＫA／ＫS比をもつ祖先・現代植物ポリヌクレオチドペアのサブセットは、中立進化により影響されたポリヌクレオチドを含むはずで、すなわち、当該形質が、保存されるか、または変わるように、ヒトまたは自然によって加えられる圧力下になかった、ポリヌクレオチドである。その種のポリヌクレオチドは、次に、耐乾燥性、耐病性、またはストレス耐性のような形質をコードするものについて検査してもよく、なぜならばこれらの機能は、栽培化により劇的に補充され、これらのポリヌクレオチドへの自然選択圧を軽減しているからである。１．０より大きいＫA／ＫS比をもつ祖先・現代植物ポリヌクレオチドペアのサブセットは、選択により影響されたポリヌクレオチドを含むはずである。その種のポリヌクレオチドは、次に、収量、タンパク質含量、短日開花、油含量、収穫の容易さ、味、などのような、形質をコードするものについて検査してもよく、なぜならばこれらの形質は、食用作物のような植物の栽培品種化の過程で、ヒトによる、強い、一方向性で、絶え間ない選択圧の下に置かれてきたからである。
それゆえ、１つの実施態様では、本発明は、植物および動物を含む栽培品種化（家畜化）された生物における商業的または審美的形質に関連する、進化的に有意の変化をもつポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を同定するための方法を、提供する。本発明は、商業的にもしくは審美的に重要な形質のような、構造的、生化学的または生理的状態と関係がある、したがってそれらの原因となることもあり得る、特定の遺伝子変化を同定するために比較ゲノミクスを用い、そして増強された興味ある形質をもつ栽培品種化（家畜化）された生物を開発するために、これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列から得られる情報を用いる。
１つの好ましい態様では、栽培品種化（家畜化）された植物または動物のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、野生祖先には存在せず、栽培品種化（家畜化）された種に存在する、進化的に有意の変化をもたらした人工選択を、受けている。本態様の１つの例は、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、当該祖先に比べて、作物収量の増加と関連があってもよい。他の事例は、短日開花（すなわち、光の日照時間が或臨界時間より短い場合のみに開花すること）、タンパク質含量、油含量、収穫の容易さ、および味を含む。したがって本発明は、栽培品種化（家畜化）された生物における機能または形質の下地となる遺伝子および／または分子機構への洞察を得るのに、役立つ可能性がある。この情報は、当該機能または形質をさらに亢進するために、当該ポリヌクレオチドの設計に役立つこともあり得る。例えば、作物収量の改良の原因であることが明らかにされたポリヌクレオチドは、ランダムまたは定方向突然変異を受けさせ、次いで、その形質をさらに増強するポリヌクレオチドを同定するために、当該変異体遺伝子を検定してもよい。
したがって、１つの側面で、栽培品種化（家畜化）された生物（例えば、植物または動物）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法が提供されるが、ここで当該ポリペプチドは、栽培品種化（家畜化）された生物の祖先に比べて、その栽培品種化（家畜化）された生物中で独特で、増強されている、または変えられている、商業的にもしくは審美的に重要な形質と関連していてもよく、そして前記方法は、ａ）前記栽培品種化（家畜化）された生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、前記野生祖先のタンパク質コードヌクレオチド配列と比較すること；そしてｂ）前記野生型祖先の対応配列に比較して、進化的に意味のあるヌクレオチド変化を含むポリヌクレオチド配列を、前記栽培品種化（家畜化）された生物において選択すること：の工程を含む。
本発明のもう１つの側面で、栽培品種化（家畜化）された生物（例えば、植物または動物）のタンパク質コードヌクレオチド配列における進化的に有意な変化を同定するための方法が提供されるが、当該方法は、ａ）前記栽培品種化（家畜化）された生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を、前記栽培品種化（家畜化）された生物の野生祖先の対応配列と比較すること；そしてｂ）前記野生祖先の対応配列に比較して進化的に意味のあるヌクレオチド変化を含むポリヌクレオチド配列を、前記栽培品種化（家畜化）された生物において選択すること：の工程を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載された方法のいずれかにより同定されたヌクレオチド変化は、非同義置換である。いくつかの態様において、当該ヌクレオチド変化の進化的意義は、当該ヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫA）に従って決定される。いくつかの態様において、進化的に有意の変化は、栽培品種化（家畜化）された生物ポリヌクレオチドと対応する祖先ポリヌクレオチドとの間のＫA／ＫS比を決定することにより、評価される。これらの態様のいくつかでは、好ましくはその比は少なくとも約０．７５であり、またはより好ましくは１．０である。好ましさの増加に伴い、当該比は、少なくとも約１．０，１．２５，１．５０，２．００またはそれより大きい。
もう１つの側面で、本発明は、栽培品種化（家畜化）された生物における重要な形質を調整することも可能な作用物質を同定する方法で、当該方法が、少なくとも１つの候補作用物質を、進化的に有意の変化をもつポリヌクレオチド配列を発現する、細胞、モデル系、またはトランスジェニック植物または動物と、または進化的に有意のポリペプチドを含む組成物と接触させ、前記作用物質がポリペプチドの機能または合成を調整するその能力により同定される方法を提供する。
栽培品種化（家畜化）された生物のタンパク質コードヌクレオチド配列と、野生型祖先からのタンパク質コード配列との間の大規模な配列比較のための方法も提供されるが、当該方法は、ａ）配列相同性に従って、栽培品種化（家畜化）された生物の配列を野生祖先からの対応配列と整列させること（ａｌｉｇｎｉｎｇ）；そしてｂ）野生祖先生物からの相同配列に比較して、その栽培品種化（家畜化）された生物の配列内に何らかのヌクレオチド変化を同定することを、含む。
もう１つの側面で、本発明は、進化的に有意のヌクレオチド変化を、栽培品種化（家畜化）された生物中で独特で、増強されている、または変えられている、商業的にもしくは審美的に重要な形質と相関させるための方法を提供するが、当該方法は、ａ）本明細書に記載された方法に従って、進化的に有意の変化をもつヌクレオチド配列を同定すること；そしてｂ）その栽培品種化（家畜化）された生物中またはモデル系中における、その同定された配列の存否の機能性効果を分析すること：を含む。
本方法で使われる栽培品種化植物は、その野生祖先が現存し、そして知られているメイズ、コメ、トマト類（ｔｏｍａｔｏｅｓ）、ジャガイモ類（ｐｏｔａｔｏｅｓ）、または任意の栽培植物でよい。例えば、メイズの祖先はテオシンテ（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｕｉｇｌｕｍｉｓ）であり；コムギの祖先はＴｒｉｔｉｃｕｍ ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ，Ｔ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓおよびＡｅｇｉｌｏｐｓ ｔａｕｓｃｈｉｉであり；そしてコメの祖先はＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎである。前記重要形質は、収量、短日開花、タンパク質含量、油含量、耐乾燥性、味、収穫の容易さ、または耐病性、のような任意の商業的にもしくは審美的に重要な形質であってもよい。好ましい態様では、栽培品種化植物はコメで、そして重要形質は収量である。
本発明のもう１つの態様で、祖先生物におけるストレス耐性に関連するポリヌクレオチドの同定のための方法が提供される。本態様では、栽培品種化（家畜化）生物でのポリヌクレオチドは、ストレス耐性に関連する、または関連すると思われている祖先生物のポリヌクレオチドと比較して、中立進化を受けており、そしてそれによって突然変異が、栽培品種化（家畜化）生物のポリヌクレオチドに蓄積している。当該祖先のストレス耐性形質は、当該栽培品種化（家畜化）生物に比較して、独特であるか、増強されているか、または変化していてもよい。
前記ポリヌクレオチド配列を同定するための方法は、ａ）前記栽培品種化（家畜化）生物のポリペプチドコードヌクレオチド配列を前記野生祖先のポリペプチドコードヌクレオチド配列に比較すること；そしてｂ）前記栽培品種化（家畜化）生物の対応する配列に比較して、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む、前記祖先生物のポリヌクレオチド配列を選択することで、ここで当該変化は進化的に中立であるもの、を含む。前記ストレス耐性形質は、耐乾燥性、耐病性、病虫害耐性、高塩濃度耐性、または商業的に興味深い他のストレス耐性形質であってもよい。
栽培品種化（家畜化）生物の野生祖先のポリペプチドコードポリヌクレオチド配列中に進化的に中立な変化を同定するための方法も提供されるが、当該方法は、ａ）当該野生祖先のポリペプチドコードポリヌクレオチド配列を、当該栽培品種化（家畜化）生物の対応する配列に比較すること；そしてｂ）当該野生祖先の対応する配列に比較してヌクレオチド変化を含む、当該栽培品種化（家畜化）生物のポリヌクレオチド配列を選択することで、ここで当該変化は進化的に中立で、そして当該ポリヌクレオチドが当該野生型祖先のストレス耐性形質と関連するもの、を含む。
中立進化は、約０．７５と１．２５との間の、より好ましくは約０．９と１．１との間の、そして最も好ましくは約１．０のＫA／ＫS比により、典型的に示される。そのＫA／ＫS比較は、栽培品種化（家畜化）生物に対する祖先生物、または祖先生物に対する栽培品種化（家畜化）生物として、計算されてもよい。
もう１つの側面において、本発明は、生物（祖先生物または栽培品種化（家畜化）された生物）におけるストレス耐性形質を変調することも可能な作用物質を同定する方法を提供するが、ここで少なくとも１つの候補物質を、当該祖先生物、栽培品種化（家畜化）生物と、またはストレス耐性と関連するポリヌクレオチド配列を発現する、細胞またはトランスジェニック生物と、接触させる、そしてここで当該物質は、当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの機能を変調するその能力により同定される。
野生祖先のポリペプチドコードヌクレオチド配列と栽培品種化（家畜化）された生物のものとの間の大規模配列比較のための方法も提供されるが、ここで当該祖先ポリペプチドは、当該栽培品種化（家畜化）された生物に比べて、当該野生祖先で、独特で、増強されている、または変えられている、ストレス関連形質を付与する、または付与すると思われ、そして当該方法は、ａ）配列相同性に従って祖先配列および栽培品種化（家畜化）配列を整列させること、そしてｂ）祖先相同配列に比べて、栽培品種化（家畜化）配列に進化的に中立である何らかのヌクレオチド変化を同定することを含む。
もう１つの側面で、本発明は、進化的に中立のヌクレオチド変化を、栽培品種化（家畜化）された生物中で独特で、増強されている、または変えられている、商業的にもしくは審美的に重要な形質と相関させるための方法を提供するが、当該方法は、ａ）本明細書に記載された方法に従って、進化的に中立の変化をもつヌクレオチド配列を同定すること；そしてｂ）その栽培品種化（家畜化）された生物中またはモデル系中における、その同定された配列の存否の機能性効果を分析すること：を含む。
発明の詳細な説明
１つの実施態様では、本発明は、栽培品種化（家畜化）された生物（例えば、植物および動物）における商業的にもしくは審美的に重要な形質と関連する、そしてそれゆえにそれらに寄与または原因となることもあり得る、正に選択された遺伝子および特定の遺伝子変化を同定するために、比較ゲノミクスを利用する。
もう１つの態様で、本発明は、栽培品種化（家畜化）された生物の祖先におけるストレス耐性と関連する進化的に中立の遺伝子および遺伝子変化を同定する。
本発明の実施は、別に示さない限りは、当該技術分野の熟練の範囲内にある、分子生物学、遺伝学、および分子進化の慣用技術を使用する。そうした技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら編，１９９４）；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”，（Ｌｉ，１９９７）：のような文献中に十分に説明されている。
Ｉ． 定義
本明細書で使われる場合、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドの重合体型を指す。本用語は、前記分子の一次構造を指し、それゆえ、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。それはまた、メチル化および／またはキャップ形成ポリヌクレオチドのような修飾ポリヌクレオチド、修飾塩基、バックボーン修飾、および同種のものを含むポリヌクレオチド、を含む。用語「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は互換的に使用される。
本明細書で使われる場合、「遺伝子」は、タンパク質をコードする配列を含む、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部を指す。遺伝子はまた、（プロモーター、エンハンサー、リプレッサーおよび他の調節配列のような）５’および３’フランキング配列ならびにイントロンのような、非コード配列も含むことは、当該技術分野では言うまでもない。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸の重合体を指す。これらの用語はまた、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化を含む反応を通じて翻訳後修飾されるタンパク質も含む。
用語「栽培品種化（家畜化）された生物」は、人工選択圧に曝され、そして商業的にもしくは審美的に重要な形質を発達させた、同一の、種、亜種、品種、栽培品種、または株の、個々の生きている生物または集団を指す。いくつかの好ましい態様では、前記栽培品種化（家畜化）された生物は、メイズ、コムギ、コメ、モロコシ、トマト、またはジャガイモより成る群から選択された植物、または、祖先がわかっている、商業的に興味深い、任意の他の栽培品種化植物である。「植物」は、発生の任意の段階の任意の植物、とくに種子植物である。
他の好ましい態様で、前記栽培品種化（家畜化）された生物は、ウシ類（ｃａｔｔｌｅ）、ウマ類（ｈｏｒｓｅｓ）、ブタ類（ｐｉｇｓ）、ネコ類（ｃａｔｓ）、およびイヌ類（ｄｏｇｓ）より成る群から選択された動物である。栽培品種化（家畜化）生物およびその祖先は、異なる種、亜種、品種、栽培品種、または株、またはそれらの任意の組合せとして、関係づけられることもあり得る。
用語「野生祖先」または「祖先」は、それから栽培品種化（家畜化）生物の種、亜種、品種、栽培品種、または株が発生した、先駆者または前任者生物の種、亜種、品種、栽培品種、または株を、意味する。栽培品種化（家畜化）された生物は、１つまたは１つより多い祖先をもつことがある。典型的には、栽培化植物は１つまたは複数の祖先をもつことがあるのに対して、家畜化動物は、通常、単一の祖先のみをもつ。
用語「商業的にもしくは審美的に重要な形質」は、当該形質の原因となるポリペプチドを調整することも可能な改良された生物または作用物質の開発、またはそれぞれのポリヌクレオチドに関連する情報（例えば、物理的または生化学的データ）を、それの分析が提供可能な植物または動物のような栽培品種化（家畜化）生物に存在する形質を指すのに、本明細書では使われる。その商業的にもしくは審美的に重要な形質は、当該祖先に比べて、独特で、増強され、または変えられていてもよい。「変えられる」により、その重要な形質が、当該祖先に観察される形質とは定性的にまたは定量的に異なることを意味する。
用語「ＫA／ＫS型方法」は、（非同義および同義部位を決定する、より厳密な方法を含め）相同遺伝子における非同義置換および同義置換の数の間の、比率として（常にではないが）しばしば示される差を評価する方法を意味する。これらの方法は、非限定的にＫA／ＫS，ｄN／ｄS，ＤN／ＤSを含む、いくつかのシステム名称を用いて呼ばれる。
用語「進化的に有意の変化」および「適応的進化変化」は、選択圧の緩和または正の選択圧のいずれかに帰されることがあり得る２つの生物、種、亜種、品種、栽培品種、および／または株間の、１つまたは１つより多いヌクレオチドまたはペプチド配列変化（類）を指す。進化的に有意の変化の存在を決定するための１つの方法は、ＫA／ＫS比を測定することのような、ＫA／ＫS型分析法を適用することである。典型的には、１．０またはそれより大きいＫA／ＫS比が、進化的に有意の変化と考えられる。
厳密に言うと、正確に１．０のＫA／ＫS比は選択圧の緩和（中立進化）を示し、そして１．０より大きいＫA／ＫS比は正の選択を示す。しかし、ＧｅｎＢａｎｋ中のＥＳＴｓおよび他の公開データベース類は、ある程度の配列エラーをもつことはよくあり、そしてたとえ僅かの正しくないヌクレオチドでも、ＫA／ＫS比に影響することがあるのは、一般に認められている。このため、０．７５のような低いＫA／ＫS比をもつポリヌクレオチドは、慎重に再配列決定し、そして選択圧の緩和（中立の進化的に有意の変化）、正の選択圧（正の進化的に有意の変化）、または負の選択圧（進化的に保守的な変化）について再評価されることもあり得る。
用語「正の進化的に有意の変化」は、他の関係生物と比較した場合に正である適応変化を結果として生じる、特定の生物、種、亜種、品種、栽培品種、または株における進化的に有意の変化を意味する。正の進化的に有意の変化の事例は、作物植物で収穫の増加をもたらした変化である。上述のように、正の選択は１．０より大きいＫA／ＫS比で示される。好ましさの増加に伴い、ＫA／ＫS値は、１．２５，１．５および２．０より大きい。
用語「中立の進化的に有意の変化」は、その祖先生物に比べて栽培品種化（家畜化）生物に現れ、そして中立の条件下で発達した、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド変化を指す。中立の進化的変化は、約０．７５−１．２５の間の、好ましくは約０．９および１．１の間の、そして最も好ましくは約１．０に等しい、ＫA／ＫS値により証明される。また、中立進化の場合、推定されるような「方向性」はない。当該遺伝子は、制約なしに自由に変化を蓄積するので、祖先版も栽培品種化（家畜化）版も両方とも、相互に関して変化しつつある。
用語「抵抗性の」は、ある生物が、好ましくは非抵抗性生物と比較した場合、疾患状態および／または当該疾患の発生を避ける、あるいはその程度を減らす、能力を示すことを、意味する。
用語「感受性」は、ある生物が、好ましくは抵抗性であることがわかっている生物と比較した場合、疾患状態および／または当該疾患状態の発生を避ける、あるいはその程度を減らす、ことができないことを、意味する。
抵抗性および感受性は個体ごとに変動すること、また本発明の目的のために、これらの用語は種内の個体の群にも適用すること、は言うまでもない、そして抵抗性および感受性の比較は、種内比較に使われることもあるが、一般には種間の相違を全体として指す。野生親類の分類学的分類は相当変わりやすい。したがって、分類学的分類に基づく種差は、分類学的分類が変われば、種内差に変わることもある。
用語「ストレス抵抗性」は、乾燥、疾患、有害生物（昆虫、植食動物、および微生物を非限定的に含む）、高塩濃度、および当該植物の恒常性を乱す傾向があり、修正されなければ、障害、疾患、または死をもたらす恐れもある、内的または外的な、他の不利な刺激に、耐える能力を指す。
用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当該技術分野では知られており、また十分理解されており、そして共通祖先を共有する関係配列を指し、また配列同一性の程度に基づき決定される。これらの用語は、１つの種、亜種、品種、栽培品種、または株に見られる遺伝子と、もう１つの種、亜種、品種、栽培品種、または株の対応または相当する遺伝子との間の関係を表す。本発明の目的のために、相同配列が比較される。「相同配列類」または「相同体類」または「オルソログズ」は、機能的に関係があると、考えられ、信じられ、または知られている。機能的関係は、（ａ）配列同一性の程度；（ｂ）同一のまたは同様な生物機能、を非限定的に含む多くの仕方の何れか１つで示してもよい。好ましくは（ａ）および（ｂ）の両方が示される。配列同一性の程度は、変動してもよいが、（当該技術分野で知られる標準配列アラインメントプログラムを用いる場合）好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％である。相同性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）補遺３０，節７．７１８，表７．７１で論考されているような、当該技術分野で容易に入手できるソフトウエアプログラムを用いて決定可能である。好ましいアラインメントプログラムは、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ，オックスフォード、英国）およびＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ペンシルバニア）である。もう１つの好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いるＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ミシガン）である。
用語「ヌクレオチド変化」は、当該技術分野でよく理解されているように、ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を指す。
「ハウスキーピング遺伝子」は、当該技術分野ではよく理解されている用語で、成長、分裂、静止、代謝、および／または死を、非限定的に含む、一般的な細胞機能に関連する遺伝子を意味する。「ハウスキーピング」遺伝子は、一般に、１つより多い細胞型で見られる機能を遂行する。それに対して、細胞特異的遺伝子は、一般に、特定の細胞型および／またはクラスで、機能を遂行する。
用語「作用物質」は、本明細書で使われる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する、単純または複雑な有機または無機分子のような生物学的または化学的化合物、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチド、を意味する。膨大な一連の化合物が合成可能であり、例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー、またさまざまなコア構造に基づく合成有機および無機化合物があり、そしてこれらも、用語「作用物質」に含まれる。加えて、植物または動物抽出物および同類物のような、さまざまな天然源は、スクリーニング用の化合物を提供することも可能である。化合物は、単独で、または相互に組み合わせて、試験してもよい。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を調整すること」という用語は、作用物質を添加しない場合に比較して、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が変更されることを意味する。調整は、機能に影響する任意のレベルで生じてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接的または間接的であってもよく、そして直接的にまたは間接的に測定してもよい。
「ポリヌクレオチドの機能」は、複製；翻訳；発現パターン（類）を非限定的に含む。ポリヌクレオチド機能はまた、当該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能を含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用して、タンパク質発現、立体配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分（ｍｏｉｅｔｉｅｓ）への結合、活性（または他の機能特性）、タンパク質の構造または機能の調節および／または他の側面、に影響する作用物質は、ポリヌクレオチド調整機能をもつと考えられる。
「ポリペプチドの機能」は、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、を非限定的に含む。例えば、ポリペプチドに作用して、その立体配座、折りたたみ（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、に影響する作用物質は、ポリペプチド調整機能をもつと考えられる。有効な作用物質がポリペプチドの機能を調整するように働く仕方は、１）立体配座、折りたたみ、または他の物理的特性を変えること；２）その天然リガンドに対する結合強度を変えること、またはリガンドへの結合の特異性を変えること；および３）当該ポリペプチドの活性を変更すること、を非限定的に含む。
用語「標的部位」は、単一のアミノ酸であってもよく、および／または、構造性および／または機能性モチーフ、例えば、結合部位、二量体化ドメイン、または触媒活性部位の一部である、ポリペプチド中の場所を意味する。標的部位は、治療剤のような作用物質との直接的または間接的相互作用に役立つことも可能である。
用語「分子差」は、任意の構造性および／または機能性差異を含む。そうした差異を検出するための方法ならびにそうした差異の事例は、本明細書に記載されている。
「機能性効果」は、当該技術分野では周知の用語で、直接的であれ間接的であれ、活性の任意のレベルで示される任意の効果を意味する。
用語「収穫の容易さ」は、消費または他の商業的処理のために構造体または部分（例えば、果実、葉、根）の手作業のまたは自動の収集を容易にする、植物特性または特徴を指す。
用語「収量」は、食物用、治療用、獣医用または他の市場用にヒトによる使用のために利用可能な植物または動物の組織または材料の量を指す。
用語「増強された経済的生産性」は、所望の特徴を改良するために、商業的にもしくは審美的に重要な形質を調整する能力を指す。収量の増加およびストレス耐性の亢進は、増強された経済的生産性の２つの例である。
ＩＩ． 当該技術分野で知られる一般的手順
本発明の目的のための、栽培品種化（家畜化）植物または動物またはその祖先からのポリヌクレオチドの来源は、任意の適当な来源、例えば、ゲノム配列またはｃＤＮＡ配列であってもよい。好ましくは、ｃＤＮＡ配列が比較される。タンパク質コード配列は、本明細書に記載されたもののような利用可能な私的、公開および／または商業データベースから入手可能である。これらのデータベースは、進行中の研究努力により産生された分子配列データの貯蔵所として役立つ。あるいは、タンパク質コード配列は、例えば、当該技術分野で周知の方法に従って、細胞中で発現されたｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡの配列決定から、またはＰＣＲ増幅後に、得てもよい。あるいは、ゲノム配列を、配列比較のために使ってもよい。ゲノム配列は、利用可能な公開、私的、および／または商業データベースから、またはゲノムＤＮＡライブラリーの配列決定から、またはＰＣＲ後にゲノムＤＮＡから、入手可能である。
いくつかの態様では、当該ｃＤＮＡは、一定の発生段階における組織、または当該生物をある環境条件にさらした後に得た組織から、得たｍＲＮＡから調製される。本発明の配列比較に用いられるｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野の文献に十分に説明されている慣用のｃＤＮＡライブラリー構築技術を用いて、構築可能である。全ｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ類を逆転写するための鋳型として使われる。転写されたｃＤＮＡ類は、適切なベクター中へサブクローン化し、ｃＤＮＡライブラリーを確立する。確立されたｃＤＮＡライブラリーは、完全長ｃＤＮＡ含量のために最大化されたものでもよいが、完全長に達しないｃＤＮＡ類も使用してよい。さらに、配列頻度は、例えば、Ｂｏｎａｌｄｏら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：７９１−８０６に従って、標準化可能である。当該構築ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択されたｃＤＮＡクローンは、標準自動配列決定技術を用いて配列決定可能である。好ましくは、完全長ｃＤＮＡクローン類を配列決定に使用する。ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローン類の全体または大きな部分のいずれかを配列決定してもよいが、単一ｃＤＮＡ、または数ｃＤＮＡクローンのようにできるだけ少なく配列決定することにより、本発明のいくつかの態様を実行することも可能である。
本発明の１つの好ましい実施態様において、配列決定予定のｃＤＮＡクローン類を、それらの発現特異性に従って、前選択可能である。特異的に発現される活性遺伝子に対応するｃＤＮＡ類を選択するために、当該ｃＤＮＡ類は、同一動物の他の器官、組織または細胞から得られるｍＲＮＡ類を用いて、差引きハイブリッド形成法（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）にかけることが可能である。適切な厳格性および濃度をもつ二三のハイブリッド形成条件下で、非組織特異的ｍＲＮＡ類とハイブリッド形成し、したがって「ハウスキーピング」遺伝子を表すらしいそれらのｃＤＮＡ類は、当該ｃＤＮＡプールから排除されよう。したがって、配列決定予定の残るｃＤＮＡ類は、組織特異的機能と関連している可能性が一層高い。差引きハイブリッド形成の目的のための、非組織特異的ｍＲＮＡ類は、１つの器官から、または好ましくは異なる器官および細胞の組合わせから得ることが可能である。非組織特異的ｍＲＮＡ類の量を最大にして、組織特異的ｃＤＮＡ類を飽和させる。
あるいは、オンラインデーターベースからの情報を使って、特定の機能と関連している可能性が一層高いｃＤＮＡ類に対する優先順位を選択する、または与えることが可能である。例えば、配列決定のための祖先ｃＤＮＡ候補は、候補栽培品種化（家畜化）生物ｃＤＮＡ配列から設計されたプライマーを使ってＰＣＲにより選択可能である。候補栽培品種化（家畜化）生物ｃＤＮＡ配列は、例えば、骨格筋のような特定の組織にのみ見られるもの、あるいは特定の機能に重要であるらしい遺伝子類に対応するものである。そうした組織特異的ｃＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ配列についての発現プロファイルおよび／または生物活性に関する情報が指定されている、オンライン配列データベースを検索することにより、得ることが可能である。
既知栽培品種化（家畜化）生物の遺伝子に対する祖先相同体（類）の配列は、ＰＣＲ法（例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００ ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．）を用いて）のような、当該技術分野での標準的方法を用いて得てもよい。例えば、配列決定用の祖先ｃＤＮＡ候補は、候補栽培品種化（家畜化）生物ｃＤＮＡ配列から設計されたプライマーを使ってＰＣＲにより選択可能である。ＰＣＲのために、プライマーは、ＰＲＩＭＥＲR（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のような公共的に入手可能なプライマーデザインプログラムを含む、当該技術分野の標準法を用いて、栽培品種化（家畜化）生物の配列から、作ってもよい。増幅された祖先配列は、次に、自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）のような当該技術分野の標準的な方法および装置を用いて、配列決定してもよい。同様に、祖先遺伝子模倣物は、栽培品種化（家畜化）生物における対応遺伝子を得るために、使用も可能である。
ＩＩＩ． 栽培品種化（家畜化）生物における正に選択されたポリヌクレオチドの同定
好ましい態様で、本明細書に記載された方法は、農業的に重要な栽培品種化植物において興味ある形質を制御する遺伝子を同定するために、適用が可能である。人類は、これらの形質を制御する遺伝子類の知識なしに、数千年間、栽培品種化植物を育ててきた。関与する特定の遺伝的機構の知識は、望ましいまたは増強された形質をもつ植物を作出するのに、分子レベルでの非常に迅速かつ直接的な介入を可能にするであろう。
人類は、人工選択を通じて、作物植物に強い選択圧を与えてきた。この圧は、栽培品種化生物およびそれらの野生祖先の相同遺伝子類の間の進化的に有意の変化に反映されている。僅か数遺伝子、例えば種当り１０から１５が、栽培品種化作物植物で商業的に興味ある形質を制御していることが、見いだされている。これら少数の遺伝子を、植物分子生物学の標準的方法を通じて同定することは、極めて困難であった。本明細書に記載されたＫA／ＫSおよび関連分析は、興味ある形質を制御する遺伝子を同定できる。
興味ある任意の作物植物について、ｃＤＮＡライブラリーは、栽培種または亜種およびその野生祖先から、構築可能である。１９９９年１月２９日出願のＵＳＳＮ０９／２４０，９１５に記載されているように、それぞれのｃＤＮＡライブラリーは、相同ポリヌクレオチドを同定するために、相互に“ＢＬＡＳＴ化”されている。あるいは、熟練技術者は、ｃＤＮＡライブラリーを構築せずに、商業的に、および／または公共的に利用可能なゲノムまたはｃＤＮＡデータベースにアクセス可能である。
次に、ＫA／ＫSまたは関連分析は、選択圧下で急速に進化した、選択された遺伝子を同定するために、実施される。次いで、これらの遺伝子は、商業的または審美的興味のある形質に関与しているかどうかを決定するために、標準的な分子およびトランスジェニック植物方法を用いて、評価される。興味ある遺伝子類は、それから、例えば、ランダムまたは部位特異的変異誘発により操作され、新しい、改良された品種、亜種、株または栽培種を開発する。
本発明の一般的方法は次のとおりである。要するに、ヌクレオチド配列は、栽培品種化生物および野生祖先から得る。当該栽培品種化生物および祖先のヌクレオチド配列を相互に比較し、相同である配列を同定する。当該相同配列を分析して、栽培品種化生物および祖先間で核酸配列差をもつものを同定する。次に、分子進化分析を実施して、当該差の進化的有意性を定量的におよび定性的に評価する。正に選択された遺伝子について、外群（ｏｕｔｇｒｏｕｐ）分析を行い、栽培品種化生物で（または祖先で）正に選択されたそれらの遺伝子を同定することが可能である。次いで、当該配列は、分子的／遺伝的同一性および生物活性に関して特徴解明をする。最後に、当該情報を使って、当該遺伝子によりコードされたポリペプチドの生物機能を調整できる作用物質の同定が可能である。
本発明の一般的方法は、祖先生物および栽培品種化生物のタンパク質コードヌクレオチド配列を比較することを含む。バイオインフォマティクスを当該比較に適用し、進化的に有意な変化（類）であるヌクレオチド変化または変化類を含む配列を選択する。本発明は、何らかの進化的利点を与えるように進化した遺伝子の同定およびその特定の進化した変化の同定を可能にする。好ましい態様で、栽培品種化生物はＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａであり、そして野生祖先はＯｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎである。本発明の場合、タンパク質コードヌクレオチド配列は、標準的配列決定技術によりＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎクローンから得た。
栽培品種化生物およびその野生祖先のタンパク質コード配列を比較して、相同配列を同定する。この比較を完結するための任意の適切な機構が、本発明により使用できる。アラインメントは、手作業で、またはソフトウエア（適当なアラインメントプログラムの事例は当該技術分野で知られている）により実施してもよい。好ましくは、祖先からのタンパク質コード配列を、データベース検索、例えばＢＬＡＳＴ検索を経由して、栽培化種配列に比較する。高スコア“ヒット”すなわちＢＬＡＳＴ分析後に有意の類似性を示す配列を回収し、分析することになる。有意の類似性を示す配列は、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の配列同一性をもつものでもよい。好ましくは、約８０％より大きな同一性を示す配列が、さらに分析される。データベース検索を経由して同定された相同配列は、Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ ８：１８９−１９１による、普通に用いられる単純なアラインメントプログラム、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖのような、当該技術分野で知られ、そして入手可能な、配列アラインメント方法およびプログラムを用いて、それらの全体を整列してもよい。
本発明は、栽培品種化生物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法が提供するが、ここで当該ポリペプチドは、当該栽培品種化生物の野生祖先に比較して、当該栽培品種化生物で改良された収量に関連する、または関連すると思われており、前記方法は、ａ）当該栽培品種化生物のポリペプチドコードヌクレオチド配列を、当該野生祖先のポリペプチドコードヌクレオチド配列に比較すること；そしてｂ）当該野生祖先の対応する配列に比較して、ヌクレオチド変化を含む、当該栽培品種化生物のポリヌクレオチド配列を選択すること、の工程を含み、ここで当該変化は進化的に有意で、そしてここで当該栽培品種化生物のポリヌクレオチドが同定される。好ましい態様では、収量の改良に関係するポリペプチドは、ＥＧ３０７ポリペプチドである。
この場合、例えば、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎから得たヌクレオチド配列を、相同配列を同定するために、ＧｅｎＢａｎｋでのＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＳＴｓの検索で、クエリー配列として用いた。注目すべきは、完全タンパク質コードヌクレオチド配列が必要ないことである。実際、部分ｃＤＮＡ配列を比較してもよい。興味ある配列が、下記の方法により同定されれば、別のクローニングおよび／またはバイオインフォマティクス方法を用いて、興味ある遺伝子またはタンパク質の全コード配列を得ることも可能である。
あるいは、栽培品種化生物とその祖先との間のタンパク質コード配列の配列決定および相同性比較は、新たに開発された配列決定チップ技術を用いることにより、同時に実施してもよい。例えば、Ｒａｖａら 米国特許第５，５４５，５３１号を参照されたい。
栽培品種化生物および祖先の整列されたタンパク質コード配列は、特定部位におけるヌクレオチド配列差異を同定するために、分析される。ここでも、本分析を達成するために任意の適当な方法が、本発明により使用できる。ヌクレオチド配列差異が全くなければ、当該祖先タンパク質コード配列は、通常それ以上分析されない。検出された配列変化は、普通、そして好ましくは、最初に正確さをチェックされる。好ましくは、最初のチェックは、当該技術分野でいずれもそしてすべてが知られている、１つまたは１つより多くの下記の工程の実施を含む：（ａ）祖先および栽培品種化生物配列間に変化がある点を見いだすこと；（ｂ）祖先または栽培品種化生物に独特と思われる塩基が、当該コールド（ｃａｌｌｅｄ）塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、当該配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックすること；（ｃ）配列変化に対応する１つ以上の栽培品種化生物配列があるかどうかを見るために、当該栽培品種化生物ヒットをチェックすること。同じ遺伝子について、祖先配列中のヌクレオチドは異なる位置に、同じヌクレオチドをもつ複数の栽培品種化生物配列エントリーが存在すれば、当該栽培品種化生物配列が正確であること、そしてその変化が有意であること、の独立した裏付けとなる。そうした変化は、これらのヌクレオチド配列変化が、そのコード化タンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかどうかを決定するために、データベース情報および当該遺伝暗号を用いて、調べられる。「ヌクレオチド変化」の定義が明らかにしているように、本発明は、祖先からの対応配列に比較した場合に、栽培品種化生物のタンパク質コードポリヌクレオチド配列に、置換、欠失、または挿入のいずれか、少なくとも１つのヌクレオチド変化を、包含する。好ましくは、当該変化はヌクレオチド置換である。さらに好ましくは、１つ以上の置換が、その同定された配列中に存在し、そして分子進化分析にかけられる。
数種の異なる分子進化分析すなわちＫA／ＫS型方法のいずれかを採用して、栽培種遺伝子配列と対応する祖先のものとの間の前記同定ヌクレオチド変化の進化的有意性を定量的にそして定性的に評価することが可能である。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＡｋａｓｈｉ（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｃｏｌ．Ｓｙｓｔ．２６：４０３−４２２；Ｌｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ミネソタ、１９９７。例えば、タンパク質への正の選択（すなわち、分子レベル適応進化）は、同義部位当りの同義置換（ＫS）に対する非同義部位当りの非同義ヌクレオチド置換（ＫA）の比のペアワイズ比較により、タンパク質コード遺伝子中に検出可能である（Ｌｉら，１９８５；Ｌｉ，１９９３）。ＫAおよびＫSの任意の比較を用いてもよいが、これら２つの変数を比として比較するのが、特に便利であり、そして最も有効である。配列は、標準的な統計方法を用いて、ＫAおよびＫS間の統計的に有意な差を示すことにより同定する。
本発明の場合、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよびＯ．ｓａｔｉｖａからの相同配列が、同定された。１つのＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎクローン、ＰＢＩ０３０７Ｈ９，配列番号３１およびＧｅｎＢａｎｋ中のＯ．ｓａｔｉｖａの配列の比較は、高いＫA／ＫS比を明らかにした。Ｏ．ｓａｔｉｖａのいくつかの異なる株のさらなるクローニングおよびＰＣＲを行って、ＥＧ３０７と名付けられた全遺伝子を得たが、その結果、当該全遺伝子配列にＫA／ＫS分析を行うことができた。これらの手順は実施例１０に詳述されている。Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのＥＧ３０７の完全配列、配列番号２８、およびＯ．ｓａｔｉｖａ ｃｖ．Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ １の完全配列，配列番号２５を、図１に示す。対応するタンパク質配列、配列番号３０および配列番号２７、を図２に示す。ＫA／ＫS比のまとめを、実施例１１の表１に示す。いくつかの株は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎと栽培株との交雑育種のために、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎにより類似していた。いくつかの株の高いＫA／ＫS比は、進化的に有意の変化を示している。
好ましくは、ＬｉらによるＫA／ＫS分析コンピュータープログラムを用いて本発明を実行するが、種間の正に選択された遺伝子を検出できる他の分析プログラムも使用可能である。Ｌｉら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．２：１５０−１７４；Ｌｉ（１９９３）；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：９６−９９；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：１５１−１５４；Ｎｅｉ（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ニューヨーク，Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）も参照されたい。比に換算して遺伝子の相同タンパク質コード領域間で同義部位当りの同義置換の割合と非同義部位当りの非同義置換の割合との比較を含むＫA／ＫS法は、進化の際、適応選択により、または中立選択により、駆動されることがあり得る配列置換を同定するのに使われる。同義（「サイレント」）」置換は、遺伝暗号の縮重のため、コードされるアミノ酸配列に変化をもたらさないものであり；非同義置換はアミノ酸交換を生じる。各タイプの変化の程度は、それぞれ非同義部位置当りの非同義置換および同義部位当りの同義置換の数である、ＫAおよびＫSとして推定可能である。ＫA／ＫSの計算は、手作業でも、あるいはソフトウエアを用いることによっても、実施可能である。適当なプログラムの例はＭＥＧＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）である。
ＫAおよびＫSを推定する目的のために、完全または部分タンパク質コード配列を使って、非同義および同義部位だけでなく同義および非同義置換の総数も計算する。分析するポリヌクレオチド配列の長さは、任意の適切な長さでよい。好ましくは、何らかのおよびすべての有意な変化を決定するためには、全コード配列を比較する。Ｌｉ９３（Ｌｉ（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：９６−９９）またはＩＮＡのような公共的に入手可能なコンピュータープログラムを使って、すべてのペアワイズ比較についてＫAおよびＫS値を計算することが可能である。本分析は、少数の重要な変化が全体配列によりマスクされないように、「スライディングウインドウ（引違い窓）」方式で配列を調べるためにさらに応用してもよい。「スライディングウインドウ」は、当該遺伝子の連続重複サブセクションの検査を指す（サブセクションは任意の長さでよい）。

例えば、本発明で同定された遺伝子ＥＧ３０７のスライディングウインドウＫA／ＫS分析は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎに比較したとき、Ｏ．ｓａｔｉｖａ株の多くでＥＧ３０７の５’末端に多数の非同義変化があることを示した。当該遺伝子の３’末端は、当該株の全部で低い比をもっていた。これらの手順および結果は、実施例１１および表２−７に詳述されている。
非同義および同義置換の割合の比較は、ＫA／ＫS比により表される。ＫA／ＫSは、検討中の配列に適応進化が働いた程度の反映であることが、示されている。コード配列の完全長または部分セグメントを、ＫA／ＫS分析に使用可能である。ＫA／ＫS比が高ければ高いほど、配列は適応進化を受けてきたこと、そして当該非同義置換は進化的に有意であることの、可能性が多い。例えば、ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）を参照されたい。好ましくは、ＫA／ＫS比は、少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０，より好ましくは少なくとも約１．２５，より好ましくは少なくとも約１．５０，またはより好ましくは少なくとも約２．００である。好ましくは、統計分析は、ステューデントのｔ検定およびＹａｎｇ（１９９８）
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．３７：４４１−４５６により記載された尤度比検定のような、標準法を非限定的に含み、すべての高ＫA／ＫS比について実施する。
相同配列のペアワイズ比較について、１より有意に大きいＫA／ＫS比は、偶然だけの結果として予測されるより、また当該比が１より小さい場合に普通観察されるパターンに対比して、正の選択が、より多数のアミノ酸交換を固定したことを、強く示唆している。Ｎｅｉ（１９８７）；ＨｕｇｈｅｓおよびＨｅｉ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３５：１６７−１７０；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌ．４：９１１−９１３；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＡｋａｓｈｉ（１９９５）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｅｃｏ．Ｓｙｓｔ．２６：４０３−４２２；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。１より少ない比は、負の、または精製選択の役割を一般には表している：すなわち、機能的で、有効なタンパク質の一次構造を変えないままにする強い圧力がある。約１の比は、中立条件下の進化を示す。
ＫA／ＫS比を計算するすべての方法は、祖先および栽培品種化生物からの相同遺伝子のタンパク質コード領域についての同義部位当りの同義置換の数に対する非同義部位当りの非同義置換の数のペアワイズ比較に基づいている。各方法は、「多重ヒット」（すなわち、同一部位における１つ以上のヌクレオチド置換）を推定するために、異なる補正を履行している。各方法はまた、進化的時間に亘ってどのようにＤＮＡ配列が変化するかについて、異なるモデルを用いている。それゆえ、好ましくは、異なるアルゴリズムからの結果の組合わせは、正に選択された遺伝子の検出のための感度のレベルおよび当該結果における信頼度を増加するために、用いられる。
好ましくは、ＫA／ＫS比は、パラソロガス遺伝子ペア（すなわち、遺伝子重複の結果である遺伝子ではなく、種分化の結果生じる遺伝子）ではなく、オルソロガス遺伝子ペアについて計算するべきである；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。この区別は、系統樹構築を可能にする、他の祖先との追加比較を実施することにより、行ってもよい。樹構築に使われる場合、オルソロガス遺伝子は、既知「種樹」を生じるはずである、すなわち、既知の生物学的樹を回復する樹を産生するはずである。それに対して、パラソロガス遺伝子は、既知の生物学的樹に違反すると思われる樹を生じるはずである。
本明細書に記載された方法は、タンパク質コード配列に機能的に関係する祖先または栽培品種化生物ポリヌクレオチド配列の同定をもたらすことがあり得るのは、言うまでもない。そうした配列は、非限定的に、非コード配列またはタンパク質をコードしないコード配列を含むこともあり得る。これらの関係配列は、イントロンまたは（プロモーターおよびエンハンサーのような調節エレメントを含む）５’および３’フランキング配列のような、ゲノム中のタンパク質コード配列に、例えば、物理的に隣接する可能性もある。これらの関係配列は、入手可能な公開、私的および／または商業的ゲノムデータベースの検索を経由して、または、別途、プローブとしてタンパク質コード配列で当該生物のゲノムライブラリーをスクリーニングし、配列決定することにより、得てもよい。関係コード配列を用いて非コード配列を得るための方法および技術は、当業者には周知である。
ＫA／ＫS分析のような分子進化分析により検出される進化的に有意のヌクレオチド変化は、栽培品種化生物におけるそれらの独特な存在、またはこれらの変化が栽培品種化生物において独特である程度について、さらに検定することも可能である。例えば、栽培品種化遺伝子において同定された変化は、関連の種、亜種、または当該栽培品種化生物と共通の祖先をもつ他の生物の、他の配列中の存否について検定することも可能である。この比較（「外群分析」）は、正に選択された遺伝子が（当該祖先と違って）問題の栽培品種化生物で正に選択されているかどうかの決定を可能にする。
例えば、ＥＧ３０７遺伝子中に同定された変化は、多数のＯ．ｓａｔｉｖａ株にさまざまな程度で同定された。表２−７を参照されたい。加えて、ＥＧ３０７の相対物は、メイズ、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ、その野生祖先テオシンテ、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、およびメイズの野生親類、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓおよびＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓにも同定された。実施例１３および表９を参照されたい。コメおよびメイズのＥＧ３０７は、ヌクレオチドレベルで多少違っていたが、タンパク質配列はずっと似ていた。コメおよびコーンはそれらの野生祖先から独立に栽培品種化されたことがわかっているが、一定のパターンが現れている：現代の作物（メイズまたはコメ）におけるアミノ酸交換の大多数は、当該祖先植物（テオシンテまたは祖先コメ）に比較して、電荷／極性の増加、溶解性の増加、および疎水性の減少を生じている。このパターンは、これら２つの独立の栽培化事象で、偶然に生じたとは非常に考えにくい。これは、これらの交換が、ヒトが加えた栽培化に対するのと同じような応答であったことを、示唆している。これは、ＥＧ３０７が、これら２つの穀物のヒト栽培化の結果として選択された、強い証拠である。
栽培化生物およびその祖先との間の少なくとも１つの進化的に有意な変化をもつ配列は、他の祖先タンパク質コード配列のＰＣＲ分析のためのプライマーとして使用可能であり、そして結果として生じるポリヌクレオチドを配列分析して、同じ変化が他の祖先に存在するかどうかを見る。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の祖先に比較して、当該栽培化系列に独特であるかどうか、または当該適応変化が、当該栽培化種および他の祖先に比較して、当該祖先に独特であるかどうか、についてのさらなる識別を可能にする。栽培化生物で検出されるが、他の祖先で検出されないヌクレオチド変化は、当該栽培化生物での適応進化的変化を表す可能性がさらに高い。あるいは、祖先で検出され、栽培化生物または他の祖先で検出されないヌクレオチド変化は、祖先の適応進化的変化を表す可能性が高い。比較に使われる他の祖先は、栽培化生物とのそれらの系統発生関係に基づいて選択可能である。そうした比較の統計的有意性は、確立された入手可能なプログラム、例えばＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：１５１−１５４により使われるようなｔ検定、を用いて決定してもよい。統計的に高いＫA／ＫS比を示すそれらの遺伝子は、適応進化を受けた可能性が非常に高い。
有意な変化をもつ配列は、異なる栽培化集団からのゲノムにおいてプローブとして用いて、当該配列変化が１つ以上の栽培化集団により共有されているかどうかを見ることが可能である。異なる栽培化集団からの遺伝子配列は、データベースから、または、別途、多数の近縁関係のない多様な栽培化集団からのＰＣＲ増幅ＤＮＡの直接配列決定から、入手してもよい。異なる栽培化集団において同定された変化の存在は、当該変化の進化的有意性をさらに示すはずである。
種間に有意の変化をもつ配列は、当業者に知られた方法および技術を用いて、それらの分子的／遺伝的同一性および生物機能の点で、さらに特徴解明が可能である。例えば、当該配列は、公共的に入手可能なバイオインフォマティクスプログラムを用いて、当該生物のゲノム内で遺伝子的におよび物理的に位置づけが可能である。当該ヌクレオチド配列内に新たに同定された有意な変化は、当該生物の進化における当該遺伝子の有望な役割および独特の、増強した、変更された、機能性能力との有望な関連とを示唆することがあり得る。
本発明の技術を用いて、ＥＧ３０７と名付けられた、これまで知られなかった進化的に有意の遺伝子がコメで、実施例１０に詳述されるように、発見されている。Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよび二三のＯ．ｓａｔｉｖａ株の間で実施例１１に記載のように行われたＫA／ＫS分析は、表１に示すように進化的に有意の変化を示した。当該遺伝子は正に選択されていた。実施例１２に記載されているように、いくつかの異なるコメ地図を用いて、ＥＧ３０７は、３番染色体上に存在する、１０００粒重についてのＱＴＬと関連するマーカーである、マーカーＲＺ６７２の約１０ｃＭ以内にあることがわかった。（１０００粒重は、１０００個のランダムに選ばれた完全に充満した米粒の３つの異なる試料の重量（質量）である。）これは、米粒間に生じる重量の個々の変動を配慮した、収量の高感度尺度である。したがって、ＲＺ６７２マーカーが、単一世代に乗換えのためにＥＧ３０７から分離するのは、約１０％のチャンスしかなく、ＥＧ３０７は収量増加の制御に重要な役割を果すことを強く示唆している。
やはり本発明の技術を用いて、ＥＧ１１１７と名付けられた、これまで知られなかった進化的に有意の遺伝子がコメで、実施例１４に詳述されるように、発見されている。Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよび二三のＯ．ｓａｔｉｖａ株の間で実施例１４に記載のように行われたＫA／ＫS分析は、表１０に示すように進化的に有意の変化を示した。当該遺伝子は正に選択されていた。実施例１３および１４に記載されているように、いくつかの異なるコメ地図を用いて、ＥＧ１１１７は、３番染色体上に存在する、１０００粒重についてのＱＴＬと関連するマーカーである、マーカーＲＺ６７２と同じＢＡＣ上にあることがわかった。ＥＧ１１１７は、ＥＧ３０７から約２−３ｃＭにある。
進化的に有意のＫA／ＫS値およびマッピングデータの組合せから、当業者は、ＥＧ３０７およびＥＧ１１１７は収量関連遺伝子であると、当然、結論できる。ＥＧ３０７のそしてＥＧ１１１７の収量増加機能は、変異体またはトランスジェニック植物を作り、そして育てることにより、容易に確認可能である。別の方法は、コメ由来のＥＧ３０７のおよびＥＧ１１７配列を用いる関連分析（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）および系統分析（ｐｅｄｉｇｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を含み、メイズおよびその野生祖先からのＥＧ３０７のおよびＥＧ１１７遺伝子は、実施例１３に詳述されるように、得られた。
当該同定配列をもつ推定遺伝子は、例えば、相同体検索により、さらに特徴解明してもよい。当該推定遺伝子と既知遺伝子との共通の相同性は、同じような生物的役割または機能を示す可能性がある。推定遺伝子配列を特徴解明するもう１つの模範的方法は、既知配列モチーフに基づくものである。ある種の配列パターンは、シグナル配列、ＤＮＡ結合ドメイン、または膜貫通ドメインのような、特定の生物学的特性をもつタンパク質の領域をコードすることが知られている。
有意な変化をもつ同定配列はまた、当該遺伝子が組織または細胞型特異性によってどこで発現されるかを見ることによって、さらに評価が可能である。例えば、当該同定コード配列をプローブとして用い、当該配列の発現パターンを明らかにするはずのｉｎ ｓｉｔｕ ｍＲＮＡハイブリッド形成を実施可能である。ある組織で発現される遺伝子は、その組織、例えば発生中の内胚乳組織に関連する重要な機能に関連するものなので、より優れた候補になる可能性がある。種メンバーの発生の各段階における当該遺伝子発現のタイミングも決定可能である。
配列特徴解明のもう１つの模範的方法として、有意な変化をもつ同定ヌクレオチド配列の機能的役割は、形質導入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）栽培化生物で、例えば、トランスジェニック植物または動物で、同定された遺伝子の異なる対立遺伝子について機能検定を実行することにより、査定可能である。植物機能検定の最近の例は、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）およびメタボライトプロファイリング（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）の使用を含むが、それぞれ、Ｓｅｋｉら、“完全長ｃＤＮＡマイクロアレイを用いる乾燥および寒冷ストレス下の１３００個のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）遺伝子の発現パターンのモニタリング”、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １３：６１−７２（２００１）を参照，およびＲｏｅｓｓｎｅｒら、“メタボライトプロファイリングは、遺伝的にまたは環境的に修飾された植物系の網羅的なフェノタイピング（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を可能にする”、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １３：１１−２９（２００１）を参照されたい。
配列特徴解明のもう１つの模範的方法として、コンピュータープログラムの使用は、栽培化生物および祖先からの相同タンパク質の三次元構造のモデリングおよび視覚化を可能にする。祖先タンパク質（類）においてどのアミノ酸が交換されているかの特定の正確な知識は、機能的な相違と関連することがあり得る構造変化の検出を可能にする。このように、モデリング技術の利用は、前項で論考した機能的役割の同定と密接に関連している。これらの技術の個別のまたは組合わせたものの使用は、本発明の一部を構成する。
前記方法により同定された栽培化生物の遺伝子は、共通の祖先を共有する他種における相同遺伝子を同定するために、使用可能である。例えば、メイズ、コメ、コムギ、アワ、モロコシ、および他の穀類は、共通の祖先を共有しており、コメで同定された遺伝子類は、これらの他のイネ科植物における相同遺伝子類を直接もたらすことも可能である。同様に、トマトとジャガイモは共通の祖先を共有しており、前記の方法によりトマトで同定された遺伝子類は、ジャガイモに相同体があることが予想され、そして逆の場合も同じである。
本発明はまた、植物細胞中の収量増加遺伝子を検出する方法も提供するが、それは：ａ）ＥＧ３０７遺伝子または長さ１２ヌクレオチド、好ましくは３０ヌクレオチドより大きい、その遺伝子の部分を、配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、および配列番号８５より成る群から選択される核酸分子と約５０％またはそれより大きい配列同一性をもつ核酸分子配列の検出を提供するハイブリッド形成条件下で、当該植物細胞からのゲノムＤＮＡの調製物と接触させること；そしてｂ）ハイブリッド形成を検出し、それによって収量増加遺伝子を同定することを含む。
本発明はまた、組み換え植物細胞ライブラリーから収量関連遺伝子を単離する方法も提供するが、それは：ａ）植物細胞ＤＮＡまたは組み換え植物細胞ライブラリーの調製物を提供すること；ｂ）当該調製物または植物細胞ライブラリーを、５０％またはそれより大きい配列同一性をもつ遺伝子の検出を提供するハイブリッド形成条件下で、検出可能標識化ＥＧ３０７保存性オリゴヌクレオチドと、接触させること；そしてｃ）当該検出可能標識との会合により収量関連遺伝子を単離することを含む。
本発明はまた、植物細胞ＤＮＡから収量関連遺伝子を単離する方法も提供するが、それは：ａ）植物細胞ＤＮＡの試料を提供すること；ｂ）ＥＧ３０７遺伝子の保存領域に配列相同性をもつオリゴヌクレオチドのペアを提供すること；ｃ）当該オリゴヌクレオチドのペアを、ポリメラーゼ連鎖反応仲介のＤＮＡ増幅に適した条件下で、植物細胞ＤＮＡ試料に結合させること；そしてｄ）当該増幅収量関連遺伝子またはその断片を単離すること、を含む。
本明細書に記載の方法により同定された配列は、栽培化生物に独特の、増強された、または変更された機能性能力を調整すること、および／または、これらの配列を用いてこれらの能力における欠陥を補正すること、に役立つ作用物質を同定するために、使用可能である。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系、細胞ベースの発現系、およびトランスジェニック動物および植物系のような、当該技術分野で知られるスクリーニング技術を採用する。本発明により提供されるアプローチは、急速に進化した遺伝子を同定するだけなく、それらがもう１つの種に存在するので、あまりに毒性が強くないと思われるタンパク質にするようにできる調整も示す。
本発明はまた、ＥＧ３０７ポリペプチドを産生する方法も提供するが、それは：ａ）当該細胞中に発現のために位置づけされるＥＧ３０７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質導入された細胞を提供すること；ｂ）当該ポリヌクレオチドを発現するための条件下で、当該形質導入細胞を培養すること；そしてｃ）当該ＥＧ３０７ポリペプチドを単離すること、を含む。
本発明はまた、植物細胞中の収量増加遺伝子を検出する方法も提供するが、それは：ａ）ＥＧ３０７ ＯＲ ＥＧ１１１７遺伝子または長さ１２ヌクレオチドより大きい、好ましくは３０ヌクレオチドより大きい、その遺伝子の部分を、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８より成る群から選択される核酸分子に約５０％またはそれより大きい配列同一性をもつ、核酸分子配列の検出を提供するハイブリッド形成条件下で、当該植物細胞からのゲノムＤＮＡの調製物と接触させること；そしてｂ）ハイブリッド形成を検出し、それによって収量増加遺伝子を同定することを含む。
本発明はまた、組み換え植物細胞ライブラリーから収量関連遺伝子を単離する方法も提供するが、それは：ａ）植物細胞ＤＮＡまたは組み換え植物細胞ライブラリーの調製物を提供すること；ｂ）当該調製物または植物細胞ライブラリーを、５０％またはそれより大きい配列同一性をもつ遺伝子の検出を提供するハイブリッド形成条件下で、検出可能に標識されたＥＧ３０７ ＯＲ ＥＧ１１１７保存性オリゴヌクレオチドと接触させること；そしてｃ）当該検出可能標識との会合により収量関連遺伝子を単離することを含む。
本発明はまた、植物細胞ＤＮＡから収量関連遺伝子を単離する方法も提供するが、それは：ａ）植物細胞ＤＮＡの試料を提供すること；ｂ）ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子の保存領域に配列相同性をもつオリゴヌクレオチドのペアを提供すること；ｃ）当該オリゴヌクレオチドのペアを、ポリメラーゼ連鎖反応仲介のＤＮＡ増幅に適した条件下で、植物細胞ＤＮＡ試料に結合させること；そしてｄ）当該増幅収量関連遺伝子またはその断片を単離すること、を含む。
本明細書に記載の方法により同定された配列は、栽培化生物に独特の、増強された、または変更された機能能力を調整すること、および／または、これらの配列を用いてこれらの能力における欠陥を補正すること、に役立つ作用物質を同定するために、使用可能である。これらの方法は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系、細胞ベースの発現系、およびトランスジェニック動物および植物のような、当該技術分野で知られるスクリーニング技術を採用する。本発明により提供されるアプローチは、急速に進化した遺伝子を同定するだけなく、それらがもう１つの種に存在するので、あまりに毒性が強くないと思われるタンパク質にするようにできる調整も示す。
本発明はまた、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを産生する方法も提供するが、それは：ａ）当該細胞中に発現のために配置されたＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質導入された細胞を提供すること；ｂ）当該ポリヌクレオチドを発現するための条件下で、当該形質導入細胞を培養すること；そしてｃ）当該ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを単離すること、を含む。
Ａ． ＥＧ３０７ポリペプチド
本発明の１つの態様は、単離された植物ＥＧ３０７ポリペプチドである。本明細書で使われる場合、ＥＧ３０７ポリペプチドは、１つの態様で、約４４７アミノ酸の、そして図２に表された配列（配列番号６）をもつ、Ｏ．ｓａｔｉｖａポリペプチドに関係する（すなわち、構造類似性をもつ）ポリペプチドである。そうしたポリペプチドの最初の同定は、実施例に詳述されている。好ましいＥＧ３０７ポリペプチドは、下記の遺伝子の少なくとも１つに、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされる：すなわち、（ａ）Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＯ．ｓａｔｉｖａ遺伝子）；（ｂ）Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ遺伝子）；（ｃ）Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子をコードする１つの遺伝子；（ｄ）Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＺｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ遺伝子）；（ｅ）Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＺ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ遺伝子）；および（ｆ）Ｚｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ）である。用語「１つの（ａ ｏｒ ａｎ）」実体は、その実体の１つまたは１つより多く（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）を指す；例えば、１つの遺伝子は、１つまたは１つより多くの遺伝子、または少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）遺伝子を指すことを、指摘できる。それ自体、用語「１つの（ａ ｏｒ ａｎ）」、「１つまたは１つより多くの」および「少なくとも１つの」は、本明細書では互換的に使用可能である。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「もつ（ｈａｖｉｎｇ）」は、互換的に使用可能であることも、指摘できる。
本明細書で使われる場合、厳格なハイブリッド形成条件は、オリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、同じような核酸配列をもつ分子を同定するために使われる、標準的ハイブリッド形成条件を指す。そのような標準的条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｓ Ｐｒｅｓｓ，１９８９に開示されている。そうした条件の例は、本出願の実施例部分に提示されている。
本明細書で使われる場合、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子は、当該遺伝子によりコードされるＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリペプチドの産生を制御する、（非限定的に、転写、翻訳、または翻訳後制御領域のような）調節領域、ならびにコード領域そのもののような、天然のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子に関係するすべての核酸配列を含む。１つの態様で、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子は、核酸配列：配列番号４を含む。核酸配列：配列番号４は、その産生が実施例に開示されているｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）ポリヌクレオチドの推定配列を表す。核酸配列決定技術は、全くエラー無しではないので、配列番号４（ならびに本明細書に提示された他の配列）は、せいぜい、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの見掛けの核酸配列を表すことに、注意すべきである。
もう１つの態様で、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子は、配列番号４に同様ではあるが、同一ではない配列を含む、対立遺伝子変異体であってもよい。配列番号１を含むＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子の対立遺伝子変異体は、その活性が、同じ生化学的または発生的過程に関するゲノム中の１つの遺伝子座（または複数の遺伝子座）、および／または、配列番号４を含む遺伝子と本質的に同じ遺伝子座に生じるが、例えば突然変異または組み換えにより起因する自然変異のために、同様ではあるが、同一ではない配列をもつ、遺伝子である。ゲノムは再構成を受けることがあるので、対立遺伝子の物理的配列は必ずしも常に同じとは限らない。対立遺伝子変異体は、典型的には、それらが比較されている遺伝子によりコードされるポリペプチドのものと同様な活性をもつ、ポリペプチドをコードする。対立遺伝子変異体はまた、当該遺伝子の５’または３’非翻訳領域に（例えば、調節制御領域に）変更を含むことがある。対立遺伝子変異体は、当業者には周知であり、当該ゲノムは、複相で、および／または２つまたはそれより多いコメ栽培品種または株を含む集団中にあるので、与えられたコメ栽培品種または株内に見られることが予想されるはずである。例えば、以下により詳しく記載予定の、配列番号１８により表される核酸配列をもつＯ．ｓａｔｉｖａポリヌクレオチドは、Ｏ．ｓａｔｉｖａのＫａｓａｌａｔｈ株の対立遺伝子変異体を表すと、考えられている。
同様に、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子は、当該遺伝子によりコードされるＺ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７ポリペプチドの産生を制御する調節領域、ならびにコード領域そのもののような、天然のＺ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子に関係するすべての核酸配列を含む。１つの態様で、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子は、核酸配列：配列番号６６を含む。核酸配列：配列番号６６は、その産生が実施例に開示されているｃＤＮＡポリヌクレオチドの推定配列を表す。もう１つの態様で、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子は、配列番号６６に同様ではあるが、同一ではない配列を含む、対立遺伝子変異体であってもよい。
本発明によれば、単離された、または生物学的に純粋な、ポリペプチドは、その自然環境から取り出されたポリペプチドである。したがって、「単離された」および「生物学的に純粋な」は、当該ポリペプチドが精製された程度を必ずしも反映するものではない。本発明の単離されたＥＧ３０７ポリペプチドは、その天然源から得てもよく、組み換えＤＮＡ技術を用いて産生されてもよく、または化学合成により産生されてもよい。本発明のＥＧ３０７ポリペプチドは、機能検定において天然ＥＧ３０７の機能を遂行するその能力により同定することも可能である。「天然ＥＧ３０７ポリペプチド」とは、Ｏ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、および／またはＺ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓの完全長ＥＧ３０７ポリペプチドを意味する。「機能検定において天然ＥＧ３０７の機能を遂行できる」という言葉は、当該ポリペプチドが機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約１０％をもつことを、意味する。他の好ましい態様では、当該ＥＧ３０７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約２０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ＥＧ３０７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約３０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ＥＧ３０７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約４０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ＥＧ３０７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約５０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約６０％をもつ。より好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約７０％をもつ。より好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約８０％をもつ。より好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約９０％をもつ。機能検定の例は、本明細書のほかのところで詳述するように、抗体結合検定、または収量増加検定を含む。
本明細書で使われる場合、単離された植物ＥＧ３０７ポリペプチドは、完全長ポリペプチドまたはそうしたポリペプチドの任意の相同体であってもよい。ＥＧ３０７相同体の例は、当該相同体が天然のＥＧ３０７活性をもつように、アミノ酸が、欠失され（例えば、ペプチドのように、当該ポリペプチドの断端版）、挿入され、逆向きにされ、置換され、および／または誘導体化され（例えば、糖付加、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、および／またはグリセロホスファチジルイノシトールの付加による）ている、ＥＧ３０７ポリペプチドを含む。
１つの態様で、当業者に知られている技術を用いて、前記相同体が免疫原として動物に投与された場合、当該動物は、天然ＥＧ３０７ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに対して、体液性および／または細胞性免疫応答を起すはずである。ＥＧ３０７相同体はまた、機能検定においてＥＧ３０７の機能を遂行するそれらの能力により、選択されることも可能である。
植物ＥＧ３０７ポリペプチド相同体は、自然対立遺伝子変異または自然突然変異の結果のこともある。本発明のＥＧ３０７ポリペプチド相同体はまた、当該ポリペプチドへの直接修飾、または、ランダムあるいは標的突然変異誘導を行うために、例えば古典的なまたは組み換えＤＮＡ技術を用いて、当該ポリペプチドをコードしている遺伝子への修飾を、非限定的に含む、当該技術分野では知られている技術を用いて、産生することも可能である。
本発明に従って、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、機能検定において本発明のＥＧ３０７ポリペプチドの機能を遂行するように、本発明の単離植物ＥＧ３０７ポリペプチドの能力をまねることができる任意の化合物を指す。ミメトープの例は、本発明の単離ポリペプチドの１つまたは１つより多いエピトープをまねる少なくとも１つの結合部位を含む、抗イディオタイプ抗体またはそれらの断片；単離ポリペプチドの非ポリペプチド性免疫原部分（例えば、炭水化物構造体）；および本発明の単離ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに類似の構造をもつ、核酸を含む、合成または天然有機分子を、非限定的に含む。その種のミメトープは、本発明のポリペプチドのコンピューター作出構造を用いて、設計することも可能である。ミメトープはまた、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または他の有機分子のような、分子のランダム試料を作製すること、そして対応する結合パートナーを用いるアフィニティークロマトグラフィー技術によりそうした試料をスクリーニングすることにより、得ることも可能である。
本発明のＥＧ３０７ポリペプチド相同体の最小サイズは、対応する天然ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの相補的配列と安定なハイブリッドを形成できるポリヌクレオチドによりコードされるのに十分なサイズである。それゆえ、そうしたポリペプチド相同体をコードしているポリヌクレオチドのサイズは、核酸組成および当該ポリヌクレオチドと相補的配列との間の相同性パーセントに、ならびに、ハイブリッド形成条件それ自体（例えば、温度、塩濃度、およびホルムアミド濃度）に、依存する。安定なハイブリッドを形成するのに必要な相同性の程度は、当該相同配列が当該ポリヌクレオチド中に分散しているか、または当該ポリヌクレオチドの別個の領域に固まっている（すなわち、局在する）かどうかによって、変わることがある、ことも注意するべきである。そうしたポリヌクレオチドの最小サイズは、典型的には、当該ポリヌクレオチドがＧＣリッチであれば、長さは少なくとも約１２ないし約１５ヌクレオチド、そしてそれらがＡＴリッチであれば、長さは少なくとも約１５ないし約１７塩基である。好ましくは、当該ポリヌクレオチドは長さが少なくとも１２塩基である。
それゆえ、本発明のＥＧ３０７ポリペプチド相同体をコードするのに使われるポリヌクレオチドの最小サイズは、長さが約１２から約１８ヌクレオチドまでである。そうしたポリヌクレオチドの最大サイズに関しては、実用上の制限以外に制限はなく、当該ポリヌクレオチドは、遺伝子の一部、全遺伝子、または複数の遺伝子、またはそれらの部分を含むことも可能である。同様に、本発明のＥＧ３０７ポリペプチド相同体の最小サイズは、長さが約4から約６アミノ酸までで、好ましいサイズは、そうしたポリペプチドの完全長体、融合体、多価体、または機能の部分が所望されるかどうかによる。好ましくは、当該ポリペプチドは、長さが少なくとも３０アミノ酸である。
任意の植物ＥＧ３０７ポリペプチドが、本発明の適したポリペプチドである。ＥＧ３０７ポリペプチドを単離する（天然ポリペプチドの単離または組み換えまたは合成技術による当該ポリペプチドの産生を含む）のに適した植物は、メイズ（トウモロコシ、ｍａｉｚｅ），コムギ（小麦、ｗｈｅａｔ），オオムギ（大麦、ｂａｒｌｅｙ），ライムギ（ライ麦、ｒｙｅ），アワ（粟、ｍｉｌｌｅｔ），エジプトマメ（ひよこ豆、ｃｈｉｃｋｐｅａ），ヒラマメ（レンズ豆、ｌｅｎｔｉｌ），アマ（亜麻、ｆｌａｘ），オリーブ（ｏｌｉｖｅ），イチジクアーモンド（ｆｉｇ ａｌｍｏｎｄ），ピスタチオ（ｐｉｓｔａｃｈｉｏ）、クルミ（胡桃、ｗａｌｎｕｔ），ビート（ｂｅｅｔ），パースニップ（ｐａｒｓｎｉｐ）；オレンジ（ｏｒａｎｇｅ），レモン（ｌｅｍｏｎ），ライム（ｌｉｍｅ），グレイプフルーツ（ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ），タンジェリン（ｔａｎｇｅｒｉｎｅ），ミンネオラ（ｍｉｎｎｅｏｌａ），およびタンジェロー（ｔａｎｇｅｌｏ）を非限定的に含む、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ ｆｒｕｉｔｓ）；サツマイモ（甘藷、ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ），マメ（豆、ｂｅａｎ），エンドウ（えんどう豆、ｐｅａ），チコリ（ｃｈｉｃｏｒｙ），レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ），キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ），カリフラワー（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ），ブロッコリ（ｂｒｏｃｃｏｌｉ），カブ（蕪、ｔｕｒｎｉｐ），ラディッシュ（大根、ｒａｄｉｓｈ），ホウレンソウ（ｓｐｉｎａｃｈ），アスパラガス（ａｓｐａｒａｇｕｓ），タマネギ（ｏｎｉｏｎ），ニンニク（ｇａｒｌｉｃ），コショウ（ｐｅｐｐｅｒ），セロリ（ｃｅｌｅｒｙ），カボチャ（ｓｑｕａｓｈ），アメリカカボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ），アサ（麻、ｈｅｍｐ），ズッキーニ（西洋カボチャ、ｚｕｃｃｈｉｎｉ），リンゴ（ａｐｐｌｅ），ナシ（ｐｅａｒ），マルメロ（ｑｕｉｎｃｅ），メロン（ｍｅｒｏｎ），プラム（西洋すもも、ｐｌｕｍ），サクランボ（ｃｈｅｒｒｙ），モモ（ｐｅａｃｈ），ネクタリン（ｎｅｃｔａｒｉｎｅ），アンズ（ａｐｒｉｃｏｔ），イチゴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ），ブドウ（ｇｒａｐｅ），ラズベリー（ｒａｓｂｅｒｒｙ），クロイチゴ（ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ），パイナップル（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ），アボカド（ａｖｏｃａｄｏ），パパイア（ｐａｐａｙａ），マンゴー（ｍａｎｇｏ），バナナ（ｂａｎａｎａ），ダイズ（大豆、ｓｏｙｂｅａｎ），トマト（ｔｏｍａｔｏ），モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ），サトウキビ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ），テンサイ（砂糖大根、ｓｕｇａｒｂｅｅｔ），ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ），ナタネ（菜種、ｒａｐｅｓｅｅｄ），クローバー（ｃｌｏｖｅｒ），タバコ（ｔａｂａｃｃｏ），ニンジン（ｃａｒｒｏｔ），ワタ（綿、ｃｏｔｔｏｎ），アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ、ａｌｆａｌｆａ），コメ（イネ、ｒｉｃｅ），ジャガイモ（馬鈴薯、ｐｏｔａｔｏ），ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ），キュウリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ），シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）；および針葉（ｃｏｎｉｆｅｒｏｕ）および落葉樹（ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ ｔｒｅｅｓ）のような木本植物（ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔ）、を含み、コメおよびメイズが好ましい。ＥＧ３０７ポリペプチドを単離するための、好ましいコメ植物は、Ｏ．ｓａｔｉｖａのＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ １および２，Ｌｅｍｏｎｔ，ＩＲ６４，Ｔｅｑｉｎｇ，Ａｚｕｃｅｎａ，Ｋａｓａｌａｔｈ １，２，３および４株である。
本発明の好ましい植物ＥＧ３０７ポリペプチドは、植物で発現または調整された場合、当該植物の収量を増加させることができる化合物である。
本発明の１つの態様は、融合セグメントに付着したＥＧ３０７ポリペプチド含有ドメインを含む融合ポリペプチドである。本発明のＥＧ３０７ポリペプチドの一部としての融合セグメントの包含は、生産、貯蔵、および／または使用中の当該ポリペプチドの安定性を増強することも可能である。当該セグメントの特性によって、融合セグメントはまた、そうした融合セグメントを含むＥＧ３０７ポリペプチドで免疫された動物により始動される免疫応答を亢進するために、免疫賦活剤として働くこともある。さらに、融合セグメントは、結果として生じた融合ポリペプチドの、アフィニティークロマトグラフィー用いる精製を可能にするような、ＥＧ３０７ポリペプチドの精製を簡易化するための手段として、機能することも可能である。適当な融合セグメントは、所望の機能（例えば、安定性の増加を与える、ポリペプチドへの免疫原性の増加を与える、および／またはポリペプチドの精製を簡素化する）をもつ任意のサイズのドメインでよい。１つまたは１つより多い融合セグメントを使用することは、本発明の範疇に入る。融合セグメントは、当該ポリペプチドのＥＧ３０７含有ドメインのアミノおよび／またはカルボキシル末端に、結合させてもよい。そうしたポリペプチドのＥＧ３０７含有ドメインの簡単な回収を可能にするために、融合セグメントと融合ポリペプチドのＥＧ３０７含有ドメインとの間の結合は、切断し易くしてもよい。融合ポリペプチドは、ＥＧ３０７含有ドメインのカルボキシルおよび／またはアミノ末端のいずれかに付着した融合セグメントを含むポリペプチドをコードする、融合ポリペプチドで形質転換された組み換え体細胞を培養することにより、好ましくは産生される。
本発明における使用のための好ましい融合セグメントは、グルタチオン結合ドメイン；二価金属イオンに結合できるポリヒスチジンセグメントのような、金属結合ドメイン；ポリペプチドＡ，ポリペプチドＧ，Ｔ細胞、Ｂ細胞、Ｆｃ受容体または補体ポリペプチド抗体結合ドメインのような、免疫グロブリン結合ドメイン；マルトース結合ポリペプチドからのマルトース結合ドメインのような、糖結合ドメイン；および／または「標識（ｔａｇ）」ドメイン（例えば、β−ガラクトシダーゼの少なくとも一部、ストレプ（ｓｔｒｅｐ）標識ペプチド、モノクローナル抗体のような、当該ドメインに結合する化合物を用いて精製できる他のドメイン）、を含む。より好ましい融合セグメントは、ポリヒスチジンセグメントのような、金属結合ドメイン；マルトース結合ドメイン；ストレプ標識ペプチド、を含む。
本発明の好ましい植物ＥＧ３０７ポリペプチドは、コメＥＧ３０７ポリペプチドおよびメイズＥＧ３０７ポリペプチドである。より好ましいＥＧ３０７ポリペプチドは、Ｏ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓおよびＺ．ｌｕｚｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリペプチドである。Ｏ．ｓａｔｉｖａ株は、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ，Ａｚｕｃｅｎａ，Ｋａｓａｌａｔｈ １，２，３および４、Ｔｅｑｉｎｇ，Ｌｅｍｏｎｔ，およびＩＲ６４，を含む。Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ株は、Ｂｅｎｚ，ＢＫ４，ＩＡ１９，およびＷｉｌｋｅｓを含む。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ株は、ＢＳ７，ＨｕｏＢａｉ，Ｍａｋｋｉ，Ｍｉｎ１３，Ｐｉｒａ，Ｓａｒｉ，Ｓｍｅｎａ，およびＷ２２を含む。
本発明の１つの好ましいＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、および／または配列番号１８により表されるポリヌクレオチドの成分と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｏ．ｓａｔｉｖａポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、および／または配列番号１８をもつポリヌクレオチドの成分と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
ＥＧ３０７ゲノム核酸配列を調べると、当該遺伝子類が、第１エキソン領域、第１イントロン領域、第２エキソン領域、第２イントロン領域、および第３エキソン領域を含む、いくつかの領域を含むことを、示す。
ポリヌクレオチド配列番号４および配列番号９１は、Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ栽培種）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号４および配列番号９１は、多数のヌクレオチドにより連結されているが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため不明であるが、約６と考えられている。配列番号４および配列番号９１の翻訳は、当該Ｏ．ｓａｔｉｖａＥＧ３０７ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームを含むことを示唆する。当該リーディングフレームは、約４４７アミノ酸のＯ．ｓａｔｉｖａＥＧ３０７ポリペプチドをコードしており、その推定アミノ酸配列は配列番号６と本明細書では表されるが、それは、配列番号４の約ヌクレオチド３７から約ヌクレオチド３９にわたる開始（スタート）コドンおよび、配列番号４の約ヌクレオチド２２７８から約ヌクレオチド２２８０にわたる終結（ストップ）コドンをもち、それとともに配列番号４のヌクレオチド１−１２６にわたる第１エキソン、配列番号９１のヌクレオチド９−８２２にわたる第１イントロン、配列番号９１のヌクレオチド８２３−１１４１にわたる第２エキソン、配列番号９１のヌクレオチド１１４２−１２２２にわたる第２イントロン、および配列番号９１のヌクレオチド１２２３−２１５７にわたる第３エキソンをもつと、仮定している。配
列番号４のヌクレオチド３７から約ヌクレオチド２２８０のオープンリーディングフレームは、本明細書の配列番号５に示される。
同様に、Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ａｚｕｃｅｎａ株）ポリヌクレオチド配列番号１の翻訳は、配列番号１の約ヌクレオチド３から約ヌクレオチド２４１０までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号１のヌクレオチド１−９２にわたる第１エキソン、配列番号１のヌクレオチド９３−１０７５にわたる第１イントロン、配列番号１のヌクレオチド１０７６−１３９４にわたる第２エキソン、配列番号１のヌクレオチド１３９５−１４７５にわたる第２イントロン、および配列番号１のヌクレオチド１４７６−２４４１にわたる第３エキソンをもつことを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号２として本明細書では表され、そして配列番号３として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｔｅｑｉｎｇ株）ポリヌクレオチド配列番号７の翻訳は、約ヌクレオチド２１から約ヌクレオチド２４２１までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号７のヌクレオチド１−１１０にわたる第１エキソン、配列番号７のヌクレオチド１１１−１０８９にわたる第１イントロン、配列番号７のヌクレオチド１０９０−１４０５にわたる第２エキソン、配列番号７のヌクレオチド１４０６−１４８６にわたる第２イントロン、および配列番号７のヌクレオチド１４８７−２４６１にわたる第３エキソンをもつことを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号８として本明細書では表され、そして配列番号９として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号１０および配列番号１１は、Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｌｅｍｏｎｔ株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号１０および配列番号１１は、数不明のヌクレオチドにより連結されている。当該ゲノム配列中には、当該遺伝子の非コード部分に挿入／欠失があるかもしれないので、したがってヌクレオチドの実際の数は不明であるが、約１０と考えられている。Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｌｅｍｏｎｔ株）ポリヌクレオチド配列番号１０および配列番号１１の翻訳は、配列番号１０の約ヌクレオチド１６６から配列番号１１の約ヌクレオチド１５４７までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号１０のヌクレオチド１−２５５にわたる第１エキソン、配列番号１０のヌクレオチド２５５−４５１および配列番号１１のヌクレオチド１−２１２にわたる第１イントロン、配列番号１１のヌクレオチド２１３−５３１にわたる第２エキソン、配列番号１１のヌクレオチド５３２−６１２にわたる第２イントロン、および配列番号１１のヌクレオチド６１３−１６１６にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号１２として本明細書では表され、そして配列番号１３として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、Ｏ．ｓａｔｉｖａ（ＩＲ６４株）ポリヌクレオチド配列番号１４の翻訳は、約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド２４００までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号１４のヌクレオチド１−９０にわたる第１エキソン、配列番号１４のヌクレオチド９１−１０６８にわたる第１イントロン、配列番号１４のヌクレオチド１０６９−１３８４にわたる第２エキソン、配列番号１４のヌクレオチド１３８５−１４６５にわたる第２イントロン、および配列番号１１のヌクレオチド１４６６−２４５９にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号１４として本明細書では表され、そして配列番号１５として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｋａｓａｌａｔｈ株）ポリヌクレオチド配列番号１７の翻訳は、約ヌクレオチド２から約ヌクレオチド２４０２までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号１７のヌクレオチド１−９１にわたる第１エキソン、配列番号１７のヌクレオチド９２−１０７０にわたる第１イントロン、配列番号１７のヌクレオチド１０７１−１３８６にわたる第２エキソン、配列番号１７のヌクレオチド１３８７−１４６７にわたる第２イントロン、および配列番号１７のヌクレオチド１４６８−２４３２にわたる第３エキソンを、示唆する。
当該オープンリーディングフレームは、配列番号１８として表され、そして配列番号１９として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。配列番号１８で、Ｋａｓａｌａｔｈ １株については、８８９位の「Ｎ」は「Ｇ」であり、そして９７１位の「Ｎ」は「Ａ」であるので、配列番号１９中のアミノ酸残基２９７をバリンに、そしてアミノ酸残基３２４をグルタミンにしている。配列番号１８で、Ｋａｓａｌａｔｈ ２株については、８８９位の「Ｎ」は「Ｇ」であり、そして９７１位の「Ｎ」は「Ｔ」であるので、配列番号１９中のアミノ酸残基２９７をバリンに、そしてアミノ酸残基３２４をロイシンにしている。配列番号１８で、Ｋａｓａｌａｔｈ ３株については、８８９位の「Ｎ」は「Ｃ」であり、そして９７１位の「Ｎ」は「Ａ」であるので、配列番号１９中のアミノ酸残基２９７をロイシンに、そしてアミノ酸残基３２４をグルタミンにしている。配列番号１８で、Ｋａｓａｌａｔｈ ４株については、８８９位の「Ｎ」は「Ｃ」であり、そして９７１位の「Ｎ」は「Ｔ」であるので、配列番号１９中のアミノ酸残基２９７をロイシンに、そしてアミノ酸残基３２４をロイシンにしている。
本発明の好ましいＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、および／または配列番号１８により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチドである。
本発明の好ましいＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および／または配列番号３１により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎポリヌクレオチドによりコードされる、ポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および／または配列番号３１をもつポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
ポリヌクレオチド配列番号２７および配列番号２８は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（５９５３株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号２７および配列番号２８は、多数のヌクレオチドにより連結されているが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約２３と考えられている。配列番号２７および配列番号２８の翻訳は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームを含むことを示唆する。当該リーディングフレームは、約４４６アミノ酸のＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードしており、その推定アミノ酸配列は配列番号３０と本明細書では表されるが、それは、配列番号２７の約ヌクレオチド１８から約ヌクレオチド２０にわたる開始（スタート）コドンおよび、配列番号２８の約ヌクレオチド１３３０から約ヌクレオチド１３３２にわたる終結（ストップ）コドンをもつオープンリーディングフレームとともに、配列番号２７のヌクレオチド１−１０７にわたる第１エキソン、第１イントロンなし、配列番号２８のヌクレオチド１−３１６にわたる第２エキソン、配列番号２８のヌクレオチド３１７−３９７にわたる第２イントロン、および配列番号２８のヌクレオチド３９８−１３３２にわたる第３エキソンをもつと、仮定している。配列番号２７のヌクレオチド１８から配列番号２８の約ヌクレオチド１３３２までのオープンリーディングフレームは、配列番号２９として本明細書では表される。
同様に、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（５９４８株）ポリヌクレオチド配列番号２０の翻訳は、ヌクレオチド１の約１５ヌクレオチド５’から約ヌクレオチド２３８５までのオープンリーディングフレーム、表されていない第１エキソン、配列番号２０のヌクレオチド１−１０５３にわたる第１イントロン、配列番号２０のヌクレオチド１０５４−１３６９にわたる第２エキソン、配列番号２０のヌクレオチド１３７０−１４５０にわたる第２イントロン、および配列番号２０のヌクレオチド１４５１−２４４７にわたる第３エキソン、を示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号２１として本明細書では表され、そして配列番号２２として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号２３および配列番号２４は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（５９４９株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号２３および配列番号２４は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約１３と考えられている。配列番号２３および配列番号２４の翻訳は、配列番号２３の約ヌクレオチド５７から配列番号２４の約ヌクレオチド１５６２までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号２３のヌクレオチド１−１４６にわたる第１エキソン、配列番号２４のヌクレオチド１−２３０にわたる第１イントロン、配列番号２４のヌクレオチド２３１−５４６にわたる第２エキソン、配列番号２４のヌクレオチド５４７−６２７にわたる第２イントロン、および配列番号２４のヌクレオチド６２８−１６１５にわたる第３エキソン、を示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号２５として表され、そして配列番号２６として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（ＩＲＣＧ１０５４９１株）ポリヌクレオチド配列番号９０の翻訳は、約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド１３４１までのオープンリーディングフレームを示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号３１として本明細書では表され、配列番号３２として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
本発明の好ましいＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および／または配列番号３１により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＺｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、および／または配列番号７８により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、および／または配列番号７８をもつポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
配列番号６６の翻訳は、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７ポリヌクレオチド（Ｂｅｎｚ株）が、オープンリーディングフレームを含むことを示唆する。当該リーディングフレームは、約４４８アミノ酸のＺｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードしており、その推定アミノ酸配列は配列番号６８として本明細書では表されるが、それは、配列番号６６の約ヌクレオチド１から約ヌクレオチド３にわたる開始（スタート）コドン、および配列番号６６の約ヌクレオチド２５６９から約ヌクレオチド２５７１にわたる終結（ストップ）コドンをもつオープンリーディングフレームとともに、配列番号６６のヌクレオチド１−８１にわたる第１エキソン、配列番号６６のヌクレオチド８２−１２０４にわたる第１イントロン、配列番号６６のヌクレオチド１２０５−１５１７にわたる第２エキソン、配列番号６６のヌクレオチド１５１８−１６１８にわたる第２イントロン、および配列番号６６のヌクレオチド１６１９−２６４４にわたる第３エキソン、を仮定している。配列番号６６のヌクレオチド３から約ヌクレオチド２５７１までのオープンリーディングフレームは、配列番号６７として本明細書では表される。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号６９および配列番号７０は、Ｚ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（ＢＫ４株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号６９および配列番号７０は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約１０と考えられている。Ｚ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（ＢＫ４株）ポリヌクレオチド配列番号６９および配列番号７０の翻訳は、配列番号６９の約ヌクレオチド１０から配列番号７０の約ヌクレオチド１７２８までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号６９のヌクレオチド１−９０にわたる第１エキソン、配列番号６９のヌクレオチド９１−５８６および配列番号７０のヌクレオチド１−３６１にわたる第１イントロン、配列番号７０のヌクレオチド３６２−６７４にわたる第２エキソン、配列番号７０のヌクレオチド６７５−７７５にわたる第２イントロン、および配列番号１１のヌクレオチド７７６−１７７５にわたる第３エキソン、を示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号７１として表され、そして配列番号７２として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号７３および配列番号７４は、Ｚ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（ＩＡ１９株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号７３および配列番号７４は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約１２と考えられている。Ｚ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（ＩＡ１９株）ポリヌクレオチド配列番号７３および配列番号７４の翻訳は、配列番号７３の約ヌクレオチド６９から配列番号７４の約ヌクレオチド１２８０までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号７３のヌクレオチド１−１４９にわたる第１エキソン、配列番号７３のヌクレオチド１５０−３０５にわたる第１イントロン、配列番号７４のヌクレオチド１−２２６にわたる第２エキソン、配列番号７４のヌクレオチド２２７−３２７にわたる第２イントロン、および配列番号７４のヌクレオチド３２８−１３０９にわたる第３エキソン、を示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号７５として本明細書では表され、そして配列番号７６として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号７７および配列番号５９は、Ｚ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（Ｗｉｌｋｅｓ株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号７７および配列番号５９は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約１４と考えられている。Ｚ． ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（Ｗｉｌｋｅｓ株）ポリヌクレオチド配列番号７７および配列番号５９の翻訳は、配列番号７７の約ヌクレオチド３６から配列番号５９の約ヌクレオチド１５９８までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号７７のヌクレオチド１−８６にわたる第１エキソン、配列番号５９のヌクレオチド１−２３１にわたる第１イントロン、配列番号５９のヌクレオチド２３２−５４４にわたる第２エキソン、配列番号５９のヌクレオチド５４５−６４５にわたる第２イントロン、および配列番号５９のヌクレオチド６５６−１６４０にわたる第３エキソン、を示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号７８として本明細書では表され、そして配列番号７９として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
本発明の好ましいＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、および／または配列番号６４により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＺｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１，配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、および／または配列番号６４により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１，配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、および／または配列番号６４をもつポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
ポリヌクレオチド配列番号３３および配列番号３４は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（ＢＳ７株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号３３および配列番号３４は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約２１と考えられている。配列番号３３および配列番号３４の翻訳は、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームを含むことを示唆する。当該リーディングフレームは、約４４８アミノ酸のＺｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードしており、その推定アミノ酸配列は配列番号３６として本明細書では表されるが、それは、配列番号３３の約ヌクレオチド３から約ヌクレオチド５にわたる開始（スタート）コドン、および配列番号３４の約ヌクレオチド１３９６から約ヌクレオチド１３９８にわたる終結（ストップ）コドンをもつオープンリーディングフレームとともに、配列番号３３のヌクレオチド１−８３にわたる第１エキソン、配列番号３３のヌクレオチド８４−１８０および配列番号３４のヌクレオチド１−３１にわたる第１イントロン、配列番号３４のヌクレオチド３２−３４４にわたる第２エキソン、配列番号３４のヌクレオチド３４５−４４５にわたる第２イントロン、および配列番号３４のヌクレオチド４４６−１４４７にわたる第３エキソン、を仮定している。配列番号３３のヌクレオチド３から配列番号３４の約ヌクレオチド１３９８までのオープンリーディングフレームは、配列番号３５として本明細書では表される。
同様に、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（ＨｕｏＢａｉ株）ポリヌクレオチド配列番号３７の翻訳は、約ヌクレオチド２８から約ヌクレオチド２５９９までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号３７のヌクレオチド１−１０８にわたる第１エキソン、配列番号３７のヌクレオチド１０９−１２３２にわたる第１イントロン、配列番号３７のヌクレオチド１２３３−１５４５にわたる第２エキソン、配列番号３７のヌクレオチド１５４６−１６４６にわたる第２イントロン、および配列番号３７のヌクレオチド１６４７−２６４６にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号３８として本明細書では表され、そして配列番号３９として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号４０および配列番号４１は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｍａｋｋｉ株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’末端から３’末端を表す。配列番号４０および配列番号４１は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約２０と考えられている。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｍａｋｋｉ株）ポリヌクレオチド配列番号４０および配列番号４１の翻訳は、配列番号４０の約ヌクレオチド６１から配列番号４１の約ヌクレオチド２２６３までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号４０のヌクレオチド１−１４１にわたる第１エキソン、配列番号４０のヌクレオチド１４２−２６２および配列番号４１のヌクレオチド１−８９６にわたる第１イントロン、配列番号４１のヌクレオチド８９７−１２０９にわたる第２エキソン、配列番号４１のヌクレオチド１２１０−１３１０にわたる第２イントロン、および配列番号４１のヌクレオチド１３１１−２３１１にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号４２として表され、配列番号４３として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｍｉｎ１３株）中のＥＧ３０７遺伝子の、５’末端から３’末端への、３部分を表す。配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、配列番号４４と配列番号４５との間では１９、そして配列番号４５と配列番号４６との間では１７と考えられている。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｍｉｎ１３株）ポリヌクレオチド、配列番号４４、配列番号４５および配列番号４６の翻訳は、配列番号４４の約ヌクレオチド４５から配列番号４６の約ヌクレオチド１７４１までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号４４のヌクレオチド１−１２５にわたる第１エキソン、配列番号４５のヌクレオチド１−１９８および配列番号４６のヌクレオチド１−３７４にわたる第１イントロン、配列番号４６のヌクレオチド３７５−６８７にわたる第２エキソン、配列番号４６のヌクレオチド６８８−７８８にわたる第２イントロン、および配列番号４６のヌクレオチド７８９−１７８７にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号４７として本明細書では表され、そして配列番号４８として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号４９および配列番号５０は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｐｉｒａ株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号４９および配列番号５０は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明である。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｐｉｒａ株）ポリヌクレオチド配列番号４９および配列番号５０の翻訳は、配列番号４９の約ヌクレオチド３１から配列番号５０の約ヌクレオチド１７２２までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号４９のヌクレオチド１−１１１にわたる第１エキソン、配列番号４９のヌクレオチド１１２−４９５および配列番号５０のヌクレオチド１−３５５にわたる第１イントロン、配列番号５０のヌクレオチド３５６−６６８にわたる第２エキソン、配列番号５０のヌクレオチド６６９−７６９にわたる第２イントロン、および配列番号５０のヌクレオチド７７０−１７６８にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号５１として本明細書では表され、配列番号５２として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号５３および配列番号５４は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｓａｒｉ株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号５３および配列番号５４は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約２２と考えられている。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｐｉｒａ株）ポリヌクレオチド配列番号５３および配列番号５４の翻訳は、配列番号５３の約ヌクレオチド１９から配列番号５４の約ヌクレオチド１７５６までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号５３のヌクレオチド１−９９にわたる第１エキソン、配列番号５３のヌクレオチド１００−２１２および配列番号５４のヌクレオチド１−３８９にわたる第１イントロン、配列番号５４のヌクレオチド３９０−７０２にわたる第２エキソン、配列番号５４のヌクレオチド７０３−８０３にわたる第２イントロン、および配列番号５４のヌクレオチド８０４−１８０３にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号５５として本明細書では表され、そして配列番号５６として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号５７および配列番号５８は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｓｍｅｎａ株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号５７および配列番号５８は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、１４と考えられている。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｓｍｅｎａ株）ポリヌクレオチド配列番号５７および配列番号５８の翻訳は、配列番号５７の約ヌクレオチド６８から配列番号５８の約ヌクレオチド２１９９までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号５７のヌクレオチド１−１４８にわたる第１エキソン、配列番号５７のヌクレオチド１４９−３０５および配列番号５８のヌクレオチド１−８３４にわたる第１イントロン、配列番号５８のヌクレオチド８３５−１１４７にわたる第２エキソン、配列番号５８のヌクレオチド１１４８−１２４８にわたる第２イントロン、および配列番号５８のヌクレオチド１２４９−２２０８にわたる第３エキソンを、示唆する。加えて、配列：配列番号５９は、配列番号５９のヌクレオチド７３８後の開始点で欠失を含む。当該オープンリーディングフレームは、配列番号６０として本明細書では表され、そして配列番号６１として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
同様に、ポリヌクレオチド配列番号６２および配列番号６３は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｗ２２株）中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号６２および配列番号６３は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約２２と考えられている。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ（Ｗ２２株）ポリヌクレオチド配列番号６２および配列番号６３の翻訳は、配列番号６２の約ヌクレオチド１から配列番号６３の約ヌクレオチド１３６７までのオープンリーディングフレームとともに、配列番号６２のヌクレオチド１−８１にわたる第１エキソン、配列番号６２のヌクレオチド８２−８９３にわたる第１イントロン、配列番号６３のヌクレオチド１−３１３にわたる第２エキソン、配列番号６３のヌクレオチド３１４−４１４にわたる第２イントロン、および配列番号６３のヌクレオチド４１５−１４１１にわたる第３エキソンを、示唆する。当該オープンリーディングフレームは、配列番号６４として本明細書では表され、そして配列番号６５として本明細書では表されるポリペプチドをコードする。
本発明の好ましいＺ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、および／または配列番号６４により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の好ましいＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、および／または配列番号３１により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＺｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号８０、配列番号８１、および／または配列番号８２により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号８０、配列番号８１、および／または配列番号８２をもつポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
ポリヌクレオチド配列番号８０および配列番号８１は、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ中のＥＧ３０７遺伝子の５’および３’末端を表す。配列番号８０および配列番号８１は、多数のヌクレオチドにより連結されるが、その正確な数は、当該遺伝子の非コード部分の挿入／欠失の可能性のため、不明であるが、約２４と考えられている。本発明の１つの好ましいＺｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号８０および配列番号８１により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｚｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号８０および配列番号８１をもつポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
配列番号８０および配列番号８１の翻訳は、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームを含むことを示唆する。当該リーディングフレームは、約４４８アミノ酸のＺｅａ ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードしており、その推定アミノ酸配列は配列番号８３として本明細書では表されるが、それは、配列番号８０の約ヌクレオチド２１から約ヌクレオチド２３にわたる開始（スタート）コドン、および配列番号８１の約ヌクレオチド１６５６から約ヌクレオチド１６５８にわたる終結（ストップ）コドンをもつオープンリーディングフレームとともに、配列番号８０のヌクレオチドの１−１０１にわたる第１エキソン、配列番号８０のヌクレオチドの１０２−２２５および配列番号８１のヌクレオチド１−２９１にわたる第１イントロン、配列番号８１のヌクレオチド２９２−３１３にわたる第２エキソン、配列番号８１のヌクレオチド３１４−７０５にわたる第２イントロン、および配列番号８１のヌクレオチド７０６−１６７２にわたる第３エキソン、を仮定している。配列番号８０のヌクレオチド２１から配列番号８１の約ヌクレオチド１６５８へのオープンリーディングフレームは、配列番号８２として本明細書では表される。
本発明の好ましいＺ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号８０、配列番号８１、および／または配列番号８２により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＺｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号８４および／または配列番号８５により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｚｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。そうしたＥＧ３０７ポリペプチドは、核酸配列：配列番号８４および／または配列番号８５をもつポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされる。
配列番号８４の翻訳は、Ｚｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリヌクレオチドが、オープンリーディングフレームを含むことを示唆する。当該リーディングフレームは、約４４８アミノ酸のＺｅａ ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードしており、その推定アミノ酸配列は配列番号８６として本明細書では表されるが、それは、配列番号８４の約ヌクレオチド５から約ヌクレオチド７にわたる開始（スタート）コドン、および配列番号８４の約ヌクレオチド２３６５から約ヌクレオチド２３６７にわたる終結（ストップ）コドンをもつオープンリーディングフレームとともに、配列番号８４のヌクレオチドの１−８５にわたる第１エキソン、配列番号８４のヌクレオチドの８６−９９８にわたる第１イントロン、配列番号８４のヌクレオチド９９９−１３１１にわたる第２エキソン、配列番号８４のヌクレオチド１３１２−１４１４にわたる第２イントロン、および配列番号８４のヌクレオチド１４１５−２４２３にわたる第３エキソン、を仮定している。配列番号８４のヌクレオチド５から約ヌクレオチド２３６７へのオープンリーディングフレームは、配列番号８５として本明細書では表される。
本発明の好ましいＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリペプチドは、配列番号８４、および／または配列番号８５により表されるポリヌクレオチドと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
さまざまなＯ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ、およびＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７核酸配列およびアミノ酸配列の比較は、植物のこれらの種が、類似のＥＧ３０７遺伝子およびポリペプチドをもつことを示す。Ｏ．ｓａｔｉｖａおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのさまざまな株からのＥＧ３０７のコード領域のヌクレオチド配列は、相互に比較したとき、９９．０％配列同一性をもち、そのことは、それらが相同であることを明白にしている。すべてのコメ配列は、祖先および現代いずれも、同じ停止コドン（ＴＡＧ）をもち、そして（これまでわれわれが収集した５’ＵＴＲ配列について）、それらの５’ＵＴＲ配列は９８．４％配列同一性をもつ。Ｏ．ｓａｔｉｖａおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのさまざまな株のタンパク質配列は、９８．２％配列同一性をもち、やはり、これらが相同配列であることを証明している。コメからのＥＧ３０７のタンパク質配列は、メイズからのＥＧ３０７のタンパク質配列に約９４％同一であり、やはりそれらの相同性を証明している。メイズＥＧ３０７およびテオシンテＥＧ３０７のタンパク質配列は、９９．８％配列同一性をもつ。
Ｏ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ、およびＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７核酸配列およびアミノ酸配列の間にこの程度の同一性が見られることは、本明細書に開示されたポリペプチドおよび核酸配列が与えられれば、任意の植物ＥＧ３０７ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを得るための能力を裏付けている。これらの植物ＥＧ３０７ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、植物における収量増加に有用な新規化合物を表す。
本発明の好ましい植物ＥＧ３０７ポリペプチドは、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ、およびＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリペプチドについて本明細書で開示されたアミノ酸配列の１つまたは１つより多いものに、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、同一である、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のより好ましい植物ＥＧ３０７ポリペプチドは：配列番号１および／または配列番号２の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号３の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号４、配列番号８１および／または配列番号５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号７および／または配列番号８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１０、配列番号１１および／または配列番号１２の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１３の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１４および／または配列番号１５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１７および／または配列番号１８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号２０および／または配列番号２１の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号２２の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号２３、配列番号２４および／または配列番号２５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号２６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号２７、配列番号２８および／または配列番号２９の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号３０の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号９０および／または配列番号３１の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号３２の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号３３、配列番号３４および／または配列番号３５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号３６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号３７および／または配列番号３８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号３９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号４０、配列番号４１および／または配列番号４２の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号４３の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および／または配列番号４７の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号４８の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号４９、配列番号５０および／または配列番号５１の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号５２の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号５３、配列番号５４および／または配列番号５５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号５６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号５７、配列番号５８および／または配列番号６０の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号６１の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号６２、配列番号６３および／または配列番号６４の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号６５の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号６６および／または配列番号６７の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号６８の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号６９、配列番号７０および／または配列番号７１の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号７２の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号７３、配列番号７４および／または配列番号７５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号７６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号７７、配列番号５９および／または配列番号７８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号７９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号８０、配列番号８１および／または配列番号８２の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号８３の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；および配列番号８４および／または配列番号８５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号８６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；を含む。本明細書で使われる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「少なくとも一部」は、上記のようなその種の配列の最小サイズ特性をもつ部分、または、それより大きい完全長分子までの任意の断片を意味する。例えば、ポリヌクレオチドの一部は、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、というように、完全長ポリヌクレオチドまでの長さのものであってもよい。同様に、ポリペプチドの一部は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、というように、完全長ポリペプチドまでのものであってもよい。使われる予定の前記一部の長さは、特定の使用目的次第である。上述のように、ハイブリッド形成プローブとして有用なポリヌクレオチドの一部は、１２ヌクレオチドのように短くてもよい。エピトープとして有用なポリペプチドの一部は、４アミノ酸のように短くてもよい。完全長ポリペプチドの機能を遂行するポリヌクレオチドの一部は、一般には、４アミノ酸より長い。
本発明のとくに好ましい植物ＥＧ３０７ポリペプチドは、（コードされたポリペプチド、完全長ポリペプチド、プロセスされたポリペプチド、融合ポリペプチド、およびそれらの多価ポリペプチドを、非限定的に含む）配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１９、配列番号２２、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５２、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７６、配列番号７９、配列番号８３、および／または配列番号８６、ならびに上記の配列番号類の少なくとも一部を含む、ポリペプチドの断端型相同体であるポリペプチド、を含むポリペプチドである。そうしたポリペプチドを産生するための方法の例は、実施例の節のものを含め、本明細書に開示されている。
Ｂ． ＥＧ１１１７ポリペプチド
本発明の１つの態様は、単離された植物ＥＧ１１１７ポリペプチドである。本明細書で使われる場合、ＥＧ３０７ポリペプチドは、１つの態様で、約５５２アミノ酸のＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎポリペプチドに関係する（すなわち、構造類似性をもつ）、そして図７に表された配列（配列番号９５）をもつ、ポリペプチドである。そうしたポリペプチドの最初の同定は、実施例に詳述されている。好ましいＥＧ１１１７ポリペプチドは、下記の遺伝子の少なくとも１つに、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドによりコードされる：すなわち、（ａ）Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＯ．ｓａｔｉｖａ遺伝子）；（ｂ）Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ遺伝子）；（ｃ）Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ１１１７遺伝子をコードする１つの遺伝子；（ｄ）Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする１つの遺伝子（すなわち、１つのＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ遺伝子）である。
本明細書で使われる場合、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７遺伝子は、当該遺伝子によりコードされるＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７ポリペプチドの産生を制御する、（非限定的に、転写、翻訳、または翻訳後制御領域のような）調節領域、ならびにコード領域そのもののような、天然のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子に関係するすべての核酸配列を含む。１つの態様で、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７遺伝子は、核酸配列：配列番号４を含む。核酸配列：配列番号４は、その産生が実施例に開示されているｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）ポリヌクレオチドの推定配列を表す。核酸配列決定技術は、全くエラー無しではないので、配列番号４（ならびに本明細書に提示された他の配列）は、厳密には、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの見掛けの核酸配列を表すことに、注意すべきである。
もう１つの態様で、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７遺伝子は、配列番号９２および／または配列番号９３に同様ではあるが、同一ではない配列を含む、対立遺伝子変異体であってもよい。
本発明のＥＧ１１１７ポリペプチドは、機能検定において天然ＥＧ１１１７の機能を遂行するその能力により同定することも可能である。「天然ＥＧ１１１７ポリペプチド」の語は、Ｏ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、および／またはＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓの完全長ＥＧ１１１７ポリペプチドを意味する。「機能検定において天然ＥＧ１１１７の機能を遂行できる」という言葉は、当該ポリペプチドが機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約１０％をもつことを、意味する。他の好ましい態様では、当該ＥＧ１１１７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約２０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ＥＧ１１１７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約３０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ＥＧ１１１７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約４０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ＥＧ１１１７ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約５０％をもつ。他の好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約６０％をもつ。より好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約７０％をもつ。より好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約８０％をもつ。より好ましい態様では、当該ポリペプチドは、機能検定において天然ポリペプチドの活性の少なくとも約９０％をもつ。機能検定の例は、本明細書のほかのところで詳述するように、抗体結合検定、または収量増加検定を含む。
本明細書で使われる場合、単離された植物ＥＧ１１１７ポリペプチドは、完全長ポリペプチドまたはそうしたポリペプチドの任意の相同体であってもよい。１つの態様で、当業者に知られている技術を用いて、前記相同体が免疫原として動物に投与された場合、当該動物は、天然ＥＧ１１１７ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに対して、体液性および／または細胞性免疫応答を起すはずである。ＥＧ１１１７相同体はまた、機能検定においてＥＧ１１１７の機能を遂行するそれらの能力により、選択されることも可能である。
植物ＥＧ１１７ポリペプチド相同体は、自然対立遺伝子変異または自然突然変異の結果のこともある。本発明のＥＧ１１１７ポリペプチド相同体はまた、当該ポリペプチドへの直接修飾、または、ランダムあるいは標的突然変異誘導を行うために、例えば古典的なまたは組み換え体ＤＮＡ技術を用いて、当該ポリペプチドをコードしている遺伝子への修飾を、非限定的に含む、当該技術分野では知られている技術を用いて、産生することも可能である。
本発明に従って、ミメトープ（ｍｉｍｅｔｏｐｅ）は、機能検定において本発明のＥＧ３０７ポリペプチドの機能を遂行するように、本発明の単離植物ＥＧ３０７ポリペプチドの能力をまねることができる任意の化合物を指す。ミメトープの例は、本発明の単離ポリペプチドの１つまたは１つより多いエピトープをまねる少なくとも１つの結合部位を含む、抗イディオタイプ抗体またはそれらの断片；単離ポリペプチドの非ポリペプチド性免疫原部分（例えば、炭水化物構造体）；および本発明の単離ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに類似の構造をもつ、核酸を含む、合成または天然有機分子を、非限定的に含む。その種のミメトープは、本発明のポリペプチドのコンピューター作出構造を用いて、設計することも可能である。ミメトープはまた、オリゴヌクレオチド、ペプチド、または他の有機分子のような、分子のランダム試料を作製すること、そして対応する結合パートナーを用いるアフィニティークロマトグラフィー技術によりそうした試料をスクリーニングすることにより、得ることも可能である。
本発明のＥＧ３０７ポリペプチド相同体の最小サイズは、対応する天然ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの相補的配列と安定なハイブリッドを形成できるポリヌクレオチドによりコードされるのに十分なサイズである。最小サイズ特性は、本明細書に開示されている。
任意の植物ＥＧ１１１７ポリペプチドが、本発明の適したポリペプチドである。（天然ポリペプチドの単離または組み換え体または合成技術による当該ポリペプチドの産生を含む方法で）ＥＧ１１１７ポリペプチドを単離するのに適した植物は、「ＥＧ３０７ポリペプチド」というタイトルの節に記載されているものを含む。
本発明の好ましい植物ＥＧ１１１７ポリペプチドは、植物で発現または調整された場合、当該植物の収量を増加させることができる化合物である。
本発明の１つの態様は、融合セグメントに付着したＥＧ１１１７ポリペプチド含有ドメインを含む融合ポリペプチドである。
本発明の好ましい植物ＥＧ１１１７ポリペプチドは、コメＥＧ１１１７ポリペプチドおよびメイズＥＧ１１１７ポリペプチドである。より好ましいＥＧ１１１７ポリペプチドは、Ｏ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、およびＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７ポリペプチドである。Ｏ．ｓａｔｉｖａ株は、Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ，Ａｚｕｃｅｎａ，Ｋａｓａｌａｔｈ １，２，３および４，Ｔｅｑｉｎｇ，Ｌｅｍｏｎｔ，およびＩＲ６４を含む。Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ株は、Ｂｅｎｚ，ＢＫ４，ＩＡ１９，およびＷｉｌｋｅｓを含む。Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ株は、ＢＳ７，ＨｕｏＢａｉ，Ｍａｋｋｉ，Ｍｉｎ１３，Ｐｉｒａ，Ｓａｒｉ，Ｓｍｅｎａ，およびＷ２２を含む。
本発明の１つの好ましいＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７ポリペプチドは、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７および／または配列番号９８により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７ポリペプチドは、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｏ．ｓａｔｉｖａポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＺ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ１１１７ポリペプチドは、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、ｍａｙｓ ｍａｙｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
本発明の１つの好ましいＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７ポリペプチドは、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および／または配列番号１６８により表されるポリヌクレオチドの相補物と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。
コメについてのＥＧ１１１７ゲノム核酸配列の点検は、当該遺伝子類が、第１エキソン領域、第１イントロン領域、第２エキソン領域、第２イントロン領域、第３エキソン領域、第３イントロン領域、および第４エキソン領域を含む、いくつかの領域を含むことを、示す。ＥＧ１１１７コメおよびコメ祖先ゲノム核酸配列のそれぞれにおけるこれらの領域の場所は、下表に要約されている：
Figure 2005518199
ゲノム配列の翻訳は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよびＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドがオープンリーディングフレームを含むこと、を示唆する。Ｏ．ｓａｔｉｖａ Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株の推定タンパク質配列を用いて、ＢＬＡＳＴ検索を実施した。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＰＴＲ２−Ｂ（ヒスチジン輸送タンパク質、ＮＰ １７８３１３）への非常に強いタンパク質ＢＬＡＳＴヒットは、コード配列（ＣＤＳ）の約３０コドンのみが、コメ配列から消失していることを示唆する（図８）。
最後に、当該推定コード配列およびタンパク質配列は、次のように表される：
Figure 2005518199
ＥＧ１１１７の部分配列も、メイズおよびテオシンテで決定されている。この情報は、下の表に要約される：
Figure 2005518199
ゲノム配列の翻訳は、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓおよびＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドがオープンリーディングフレームを含むこと、を示唆する。当該オープンリーディングフレーム情報の要約は、下表にでている：
Figure 2005518199
本発明の好ましい植物ＥＧ１１１７ポリペプチドは、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、およびＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、ＥＧ１１１７ポリペプチドについて本明細書で開示されたアミノ酸配列の１つまたは１つより多いものに、少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてより好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９８％、同一である、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本発明のより好ましい植物ＥＧ１１１７ポリペプチドは：配列番号９２、配列番号９３、および／または配列番号９４の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号９５の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号９６、配列番号９７および／または配列番号９８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号９９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１００および／または配列番号１０１の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１０２の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１０３、および／または配列番号１０４の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１０５の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１０６および／または配列番号１０７の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１０８の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号０９および／または配列番号１１０の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１１１の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１１２、配列番号１１３、および／または配列番号１１４の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１１５の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１１６および／または配列番号１１７の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１１８の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１１９および／または配列番号１２０の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１２１の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４および／または配列番号１２５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１２６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９および／または配列番号１３０の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１３１の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１３２および／または配列番号１３３の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１３４の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、および／または配列番号１３８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１３９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１４０、配列番号１４１、および／または配列番号１４２の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１４３の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６および／または配列番号１４７の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１４８の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、および／または配列番号１５２の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１５３の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１５４および／または配列番号１５５の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１５６の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１５７および／または配列番号１５８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１５９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、および／または配列番号１６３の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１６４の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および／または配列番号１６８の少なくとも一部によりコードされ、そしてそれは、配列番号１６９の少なくとも一部を含むアミノ酸配列をもつポリペプチド；を含む。本明細書で使われる場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「少なくとも一部」は、上記のようなそうした配列の最小サイズ特性をもつ部分、または、完全長分子までの任意のより大きな断片を意味する。例えば、ポリヌクレオチドの一部は、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、というように、完全長ポリヌクレオチドまでの長さでもよい。同様に、ポリペプチドの一部は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、というように、完全長ポリペプチドまでの長さでもよい。使われる予定の前記一部の長さは、特定の用途次第であろう。上述のように、ハイブリッド形成プローブとして有用なポリヌクレオチドの一部は、１２ヌクレオチドのように短くてもよい。エピトープとして有用なポリペプチドの一部は、４アミノ酸のように短くてもよい。完全長ポリペプチドの機能を遂行するポリペプチドの部分は、一般に、４アミノ酸より長い。
本発明のとくに好ましい植物ＥＧ１１１７ポリペプチドは、（コードされたポリペプチド、完全長ポリペプチド、プロセスされたポリペプチド、融合ポリペプチド、およびそれらの多価ポリペプチドを、非限定的に含む）配列番号９５、配列番９９、配列番号１０２、配列番号１０５、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１５、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２６、配列番号１３１、配列番号１３４、配列番号１３９、配列番号１４３、配列番号１４８、配列番号１５３、配列番号１５６、配列番号１５９、配列番号１６４、配列番号１６９、および／または配列番号１７０、を含むポリペプチド、ならびに上記の配列番号類の少なくとも一部を含む、ポリペプチドの断端型相同体であるポリペプチドである。そうしたポリペプチドを産生するための方法の例は、実施例の節のものを含め、本明細書に開示されている。
Ｃ． ＥＧ３０７ポリヌクレオチド
本発明の１つの態様は、下記の遺伝子の少なくとも１つと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、単離された植物ポリヌクレオチドである：すなわち、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７遺伝子、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７遺伝子、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７遺伝子、およびＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ遺伝子である。そうした遺伝子類の明らかな特性は、これまでに記載されている。本発明のポリヌクレオチドは、単離された天然植物ＥＧ３０７遺伝子またはその相同体を含むことが可能で、後者について以下により詳細に記載される。本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは１つより多い調節領域、完全長または部分コード領域またはそれらの組合せを含むことが可能である。本発明のポリヌクレオチドの最小サイズは、厳格なハイブリッド形成条件下で、前述の遺伝子類の１つと安定なハイブリッドを形成できる最小サイズである。適切かつ好ましい植物は、上に開示されている。
本発明に従って、単離されたポリヌクレオチドは、その自然環境から外された（すなわち、ヒトの操作に曝された）ポリヌクレオチドである。したがって、「単離された」は、当該ポリヌクレオチドが精製されている程度を反映する用語ではない。単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ，ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡいずれかの誘導体を含むことが可能である。
本発明の単離された植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチドは、全（すなわち、完全）遺伝子か、当該遺伝子と安定なハイブリッドを形成できるその一部のいずれかとして、その天然源から得ることも可能である。単離された植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチドはまた、組み換え体ＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を用いて、産生も可能である。単離された植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチドは、そうした修飾が、本発明のＥＧ３０７ポリペプチドをコードするための、または天然遺伝子分離体と厳格な条件下で安定なハイブリッドを形成するための、当該ポリヌクレオチドの能力を本質的に妨害しないような仕方で、その中のヌクレオチド類が、挿入され、欠失され、置換され、および／または逆向きにされた、天然対立遺伝子変異体および修飾ポリヌクレオチドを非限定的に含む、天然ポリヌクレオチドおよびそれらの相同体を含む。
植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチド相同体は、当業者に知られている多くの方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同書を参照）を用いて、産生することも可能である。例えば、ポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発のような古典的変異誘発技術および組み換え体ＤＮＡ技術、突然変異を誘導するためのポリヌクレオチドの化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅および／または突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成、およびポリヌクレオチドの混合物およびそれらの組合せを「構築する」ための混合物群のライゲーション、を非限定的に含むさまざまな技術を用いて、修飾可能である。ポリヌクレオチド相同体は、当該核酸によりコードされるポリペプチドの機能（例えば、ＥＧ３０７ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに対する免疫応答を引き起す能力、ＥＧ３０７遺伝子を含むトランスジェニック植物における収量を増加させる能力）をスクリーニングすることにより、および／またはＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子との、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７遺伝子との、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子との、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７遺伝子、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓＥＧ３０７遺伝子および／またはＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓＥＧ３０７遺伝子とのハイブリッド形成により、修飾核酸の混合物から選択も可能である。
本発明の単離されたポリヌクレオチドは、本発明の少なくとも１つの植物ＥＧ３０７ポリペプチドをコードする核酸配列を含むことが可能で、そうしたポリペプチドの例は本明細書に開示されている。「ポリヌクレオチド」という言葉は物理的ポリヌクレオチドを主に指し、そして「核酸配列」という言葉は当該ポリヌクレオチド上のヌクレオチドの配列を主に指すが、それら２つの言葉は互換的に使用可能で、とくに、ＥＧ３０７ポリペプチドをコードできるポリヌクレオチドまたは核酸配列に関してはそうである。これまでに開示されているように、本発明の植物ＥＧ３０７ポリペプチドは、完全長植物ＥＧ３０７コード領域をもつポリペプチド、部分的植物ＥＧ３０７コード領域をもつポリペプチド、融合ポリペプチド、多価保護ポリペプチド、およびそれらの組合せを、非限定的に含む。
本発明の少なくともいくつかのポリヌクレオチドは、それから当該ポリヌクレオチドが単離された、ＥＧ３０７ポリペプチドで免疫されている動物に由来する、免疫血清に選択的に結合するポリペプチドをコードする。
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、適切な植物中で発現された場合、当該植物の収量を増加できる。以下にさらに詳しく開示されるように、そうしたポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ、三重らせんを形成しうる分子、リボザイム、または核酸ベースの化合物であるか、またはそれらをコードすることが可能である。
本発明の１つの態様は、本発明のＥＧ３０７ポリヌクレオチドに、またはそうしたＥＧ３０７ポリヌクレオチドの相同体に、またはそうしたポリヌクレオチドの相補物に、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチドである。本発明の任意の核酸配列のポリヌクレオチド相補物は、当該配列が言及されている鎖に相補的である（すなわち、それと完全二重らせんを形成できる）ポリヌクレオチドの核酸配列を指す。核酸配列が１つの鎖について決定されている、すなわち配列番号により表されている、本発明の二本鎖核酸分子は、その配列番号の相補物である配列をもつ相補鎖も含むことを留意するべきである。したがって、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に示されている与えられた配列番号と、および／または、それら配列番号の相補物（本明細書に示されている
ものも、いないものも含む）のいずれかと、厳格なハイブリッド形成条件下で安定なハイブリッドを形成する、それらのポリヌクレオチドを含む。相補的配列を推定する方法は、当業者には知られている。ＥＧ３０７ポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸配列の対応領域（類）と、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そしてなおさらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性をもつ核酸配列を含む、ＥＧ３０７ポリヌクレオチドが好ましい。植物中に自然に存在する、ＥＧ３０７ポリペプチドの少なくとも一部をコードできるＥＧ３０７ポリヌクレオチドがとくに好ましい。
本発明のとくに好ましいＥＧ３０７ポリヌクレオチドは、次のポリヌクレオチドの少なくとも１つと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する：すなわち、配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号９０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、および／または配列番号８５、またはそうしたポリヌクレオチドの相同体または相補物に対してである。
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７遺伝子に、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７遺伝子に、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ３０７遺伝子に、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７遺伝子に、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ ＥＧ３０７遺伝子に、および／またはＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７遺伝子に、ならびにそれらのポリヌクレオチドのいずれかの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチドに、ハイブリッド形成できる（すなわち、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する）核酸配列：配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、および／または配列番号７８、の少なくとも一部を含む。そうした好ましいポリヌクレオチドは、前記配列番号に含まれるものに加えて、非限定的に、完全長遺伝子、完全長コード領域、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または多価保護化合物をコードするポリヌクレオチド、のようなヌクレオチドを含むことも可能である。
本発明はまた、そうしたポリヌクレオチドが発現されるはずの細胞の、コドン使用性質に適応するように修飾されているポリヌクレオチドを含め、配列番号３の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２２の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号２６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号３０の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号３６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号３９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号４３の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号４８の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号５２の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号５６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号６１の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号６５の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号６８の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号７２の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号７６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号７９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号８３の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または配列番号８６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む。
とくに、実施例の節に詳細に記載されているように、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７ポリヌクレオチドの知識が、本発明のＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、Ｚ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ、Ｚ．ｄｉｐｌｏｐｅｒｅｎｎｉｓ、およびＺ．ｌｕｘｕｒｉａｎｓ ＥＧ３０７ポリヌクレオチド類の単離を可能にしたので、本発明のいくつかの植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチドの核酸配列を知ることは、例えば、（ａ）それらのポリヌクレオチドのコピーを作る、（ｂ）そうしたポリヌクレオチドの少なくとも一部を含むポリヌクレオチド（例えば、完全長遺伝子、完全長コード領域、調節制御配列、断端型コード領域を含むポリヌクレオチド）を得る、および（ｃ）他の植物についてのＥＧ３０７ポリヌクレオチドを得る、ことを当業者に可能にする。そうしたポリヌクレオチドは、本発明の抗体で適切な発現ライブラリーをスクリーンすること；適切なライブラリーまたはＤＮＡをスクリーンするために、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる伝統的なクローニング技術；および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、適切なライブラリーまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅；を含むさまざまな仕方で得ることも可能である。スクリーンするための、またはそこからポリヌクレオチドを増幅するための、好ましいライブラリーは、茎、生殖構造体／組織、葉、根、および、ひこばえ、を非限定的に含む、単離された植物組織から調製された、ゲノムＤＮＡライブラリー，ＢＡＣライブラリー，ＹＡＣライブラリー，ｃＤＮＡライブラリーのようなライブラリー；および上にリストされた組織のいずれか、または全部からのプールされたｃＤＮＡ類から構築されたライブラリー、を含む。コメの場合には、Ｃｌｅｍｓｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手可能な、ＢＡＣライブラリーが好ましい。同様に、スクリーンするための、またはそこからポリヌクレオチドを増幅するための、好ましいＤＮＡ源は、植物ゲノムＤＮＡを含む。遺伝子をクローン化し、そして増幅するための技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，同誌に、およびＧａｌｕｎおよびＢｒｅｉｍａｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ，１９９７に開示されている。
本発明はまた、植物ＥＧ３０７遺伝子または他の植物ＥＧ３０７ポリヌクレオチドを含むもののような、本発明の他の、好ましくはより長い、ポリヌクレオチドの相補的領域と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドであるポリヌクレオチドを、含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ，ＤＮＡ，またはいずれかの誘導体であってもよい。そうしたオリゴヌクレオチドの最小サイズは、与えられたオリゴヌクレオチドと、本発明のもう１つのポリヌクレオチド上の相補的配列との間で、安定なハイブリッドを形成するのに必要なサイズである。最小サイズ特性は本明細書に開示されている。前記オリゴヌクレオチドのサイズはまた、本発明に従うオリゴヌクレオチドの使用のために十分でなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、非限定的に、別のポリヌクレオチドを同定するためのプローブとして、ポリヌクレオチドを増幅または伸長するためのプライマーとして、発現分析のための標的として、標的突然変異誘発および／または回収のための候補として、を含むさまざまな応用に、またはＥＧ３０７ポリペプチドの産生または活性を変更するための農業的応用に、使用が可能である。そうした農業的応用は、例えば、アンチセンスベースの、三重らせん形成ベースの、リボザイムベースの、および／またはＲＮＡ薬剤ベースの、技術におけるそうしたオリゴヌクレオチドの使用を含む。それゆえ本発明は、１つまたは１つより多いそうした技術の使用により、植物における経済的生産性を高めるための、そうしたオリゴヌクレオチドおよび方法を含む。
Ｄ． ＥＧ１１１７ポリヌクレオチド
本発明の１つの態様は、下記の遺伝子の少なくとも１つと、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、単離された植物ポリヌクレオチドである：すなわち、Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７遺伝子、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７遺伝子、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ１１１７遺伝子、およびＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７遺伝子である。そうした遺伝子類の明らかな特性は、これまでに記載されている。本発明のポリヌクレオチドは、単離された天然植物ＥＧ１１１７遺伝子またはその相同体を含むことが可能である。本発明のポリヌクレオチドは、１つまたは１つより多い調節領域、完全長または部分的コード領域、またはそれらの組合せを含むことが可能である。本発明のポリヌクレオチドの最小サイズは、厳格なハイブリッド形成条件下で、前述の遺伝子類の１つと安定なハイブリッドを形成できる最小サイズである。適切かつ好ましい植物は、上に開示されている。単離されたＥＧ１１１７遺伝子およびそれらの相同体の特性は、「ＥＧ３０７ポリヌクレオチド」というタイトルの節で上記されている。
本発明の１つの態様は、本発明のＥＧ１１１７ポリヌクレオチドに、またはそうしたＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの相同体に、またはそうしたポリヌクレオチドの相補物に、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する、植物ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドである。ＥＧ１１１７ポリペプチドの少なくとも一部をコードする核酸配列の対応領域（類）と、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そしてなおさらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性をもつ核酸配列を含む、ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドが好ましい。植物中に自然に存在する、ＥＧ１１１７ポリペプチドの少なくとも一部をコードできるＥＧ１１１７ポリヌクレオチドがとくに好ましい。
本発明のとくに好ましいＥＧ１１１７ポリヌクレオチドは、次のポリヌクレオチドの少なくとも１つと：、またはそうしたポリヌクレオチドの相同体または相補物に対して、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する。
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７遺伝子に、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７遺伝子に、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ１１１７遺伝子に、および／またはＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７遺伝子に、ならびにそれらのポリヌクレオチドのいずれかの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチドに、ハイブリッド形成できる（すなわち、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する）核酸配列：配列番号９２の少なくとも一部を含む。そうした好ましいポリヌクレオチドは、前記配列番号に含まれるものに加えて、非限定的に、完全長遺伝子、完全長コード領域、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または多価保護化合物をコードするポリヌクレオチド、のようなヌクレオチドを含むことも可能である。
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７遺伝子に、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７遺伝子に、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ ＥＧ１１１７遺伝子に、および／またはＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７遺伝子に、ならびにそれらのポリヌクレオチドのいずれかの対立遺伝子変異体であるポリヌクレオチドに、ハイブリッド形成できる（すなわち、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成する）核酸配列：配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および／または配列番号１６８の少なくとも一部を含む。そうした好ましいポリヌクレオチドは、前記配列番号に含まれるものに加えて、非限定的に、完全長遺伝子、完全長コード領域、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／または多価保護化合物をコードするポリヌクレオチド、のようなヌクレオチドを含むことも可能である。
本発明はまた、そうしたポリヌクレオチドが発現されるはずの細胞の、コドン使用性質に適応するように修飾されているポリヌクレオチドを含め、配列番号９５の少なくとも一部を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号９９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１０２の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１０５の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１０８の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１１１の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１１５の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１１８の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２１の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１２６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３１の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３４の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１３９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１４３の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１４８の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１５３の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１５６の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１５９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１６４の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１６９の少なくとも一部をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、を含む。
とくに、実施例の節に詳細に記載されているように、本発明のＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの知識が、本発明のＯ．ｓａｔｉｖａ、Ｚ．ｍａｙｓ ｍａｙｓ、およびＺ．ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ１１１７ポリヌクレオチド類の単離を可能にしたので、本発明のいくつかの植物ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの核酸配列を知ることは、例えば、（ａ）それらのポリヌクレオチドのコピーを作る、（ｂ）そうしたポリヌクレオチドの少なくとも一部を含むポリヌクレオチド（例えば、完全長遺伝子、完全長コード領域、調節制御配列、断端型コード領域を含むポリヌクレオチド）を得る、および（ｃ）他の植物についてのＥＧ１１７ポリヌクレオチドを得る、ことを当業者に可能にする。そうしたポリヌクレオチドは、本発明の抗体で適切な発現ライブラリーをスクリーンすること；適切なライブラリーまたはＤＮＡをスクリーンするために、本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いる伝統的なクローニング技術；および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、適切なライブラリーまたはＤＮＡのＰＣＲ増幅；を含むさまざまな仕方で得ることも可能である。好ましいライブラリーは、「ＥＧ３０７ポリヌクレオチド」というタイトルの節で上記されている。
本発明はまた、植物ＥＧ１１１７遺伝子または他の植物ＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを含むもののような、本発明の他の、好ましくはより長い、ポリヌクレオチドの相補的領域と、厳格なハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成できるオリゴヌクレオチドであるポリヌクレオチドを、含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ，ＤＮＡ，またはいずれかの誘導体であってもよい。そうしたオリゴヌクレオチドの最小サイズは、与えられたオリゴヌクレオチドと、本発明のもう１つのポリヌクレオチド上の相補的配列との間で、安定なハイブリッドを形成するのに必要なサイズである。最小サイズ特性は本明細書に開示されている。前記オリゴヌクレオチドのサイズはまた、本発明に従うオリゴヌクレオチドの使用のために十分でなければならない。その種の応用は、「ＥＧ３０７ポリヌクレオチド」というタイトルの節で上記されている。
Ｅ． 組み換え体分子
本発明はまた、宿主細胞中に前記ポリヌクレオチドを配達できる任意のベクター中へ挿入された、本発明の少なくとも１つの植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを含む、組み換え体ベクターを含む。そうしたベクターは、本発明のポリヌクレオチドに隣接して天然には見られない核酸配列であり、当該ポリヌクレオチド（類）が由来する種以外の種から誘導される、異種核酸配列を含む。本明細書で使われる場合、誘導されたポリヌクレオチドは、あるポリヌクレオチドまたはあるポリヌクレオチドの部分に配列が、同一か、類似しているが、修飾塩基、バックボーン修飾、ヌクレオチド変化、および同類のもの、のような修飾を含むことがある、ものである。前記ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれでも、原核生物性または真核生物性のいずれでもよく、そして典型的には、ウイルスまたはプラスミドである。組み換え体ベクターは、本発明の植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドのクローニング、配列決定、および／または、ほかの操作に使用可能である。本明細書で組み換え体分子と呼ばれ、そして以下により詳細に記載される組み換え体ベクターの１つのタイプは、本発明のポリヌクレオチドの発現で使用可能である。好ましい組み換え体ベクターは、形質転換細胞中で複製可能である。
本発明の組み換え体ベクター中に含まれるような適当かつ好ましいポリヌクレオチドは、適当かつ好ましい植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドそれ自体のために、本明細書で開示されているようなものである。本発明の組み換え体ベクター中に、およびとくに組み換え体分子中に、含まれるようなとくに好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、および／または配列番号７８、を含む。本発明の組み換え体ベクター中に、およびとくに組み換え体分子中に、含まれるような別の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および／または配列番号１６８、を含む。
本発明の単離された植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドは、天然ポリペプチドの産生および回収、組み換え体ポリペプチドの産生および回収、および当該ポリペプチドの化学合成を含む、さまざまな仕方で産生可能である。１つの態様で、本発明の単離されたポリペプチドは、当該ポリペプチドの産生に有効な条件下で、当該ポリペプチドを発現し、そして当該ポリペプチドを回収できる細胞を培養することによって、産生される。培養に好ましい細胞は、当該ポリペプチドを発現できる組み換え体細胞で、その組み換え体細胞は、本発明の１つまたは１つより多いポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換することにより、産生される。細胞中へのポリヌクレオチドの形質転換は、ポリヌクレオチドを当該細胞中へ挿入可能な任意の方法により、達成可能である。形質転換技術は、非限定的に、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、顕微注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、およびプロトプラスト融合（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ）を含む。組み換え体細胞は、単細胞性のままでも、あるいは組織、器官、または多細胞生物へ成長してもよい。本発明の形質転換ポリヌクレオチドは、染色体外に留まってもよく、あるいは発現されるそれらの能力が保持されるような仕方で、当該形質転換（すなわち、組み換え体）細胞の染色体内の１つまたは１つより多い部位へ組込まれてもよい。それで細胞を形質転換する、適切かつ好ましいポリヌクレオチドは、適切かつ好ましい植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドそれ自身について、本明細書に開示されているようなものである。本発明の組み換え体細胞中に含まれるとくに好ましいポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８４、および／または配列番号８５、を含む。本発明の組み換え体細胞中に含まれる別の好ましいポリヌクレオチドは、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および／または配列番号１６８、を含む。
形質転換に適した宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換できる任意の細胞を含む。宿主細胞は、非形質転換細胞でも、すくなくとも１つのポリヌクレオチドで既に形質転換されている細胞のいずれでもよい。本発明の宿主細胞は、内因的に（すなわち、自然に）本発明の植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを産生できるか、または本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換された後で、そうしたポリペプチドを産生できるかのいずれでもよい。本発明の宿主細胞は、本発明の少なくとも１つのポリペプチドを産生できる任意の細胞で、そして細菌、真菌（酵母およびイネいもち病菌のＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａを含む）、寄生虫（線虫類、とくにＸｉｐｈｉｎｅｍａ，Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ，およびＴｙｌｅｎｃｈｌｏｈｙｎｃｈｕｓ属のものを含む）、昆虫、他の動物および植物の細胞を含んでもよい。
形質転換に適した宿主ウイルスは、非限定的に、イネの縞葉枯病ウイルス（ｒｉｃｅ ｓｔｒｉｐｅ ｖｉｒｕｓ）およびヒエのホジャブランカウイルス（ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｈｏｊａ ｂｌａｎｃａ ｖｉｒｕｓ）を含む、本発明のポリヌクレオチドで形質転換可能な任意のウイルスを含む。
好ましい態様では、植物組織内で生存し、複製できる、いわゆるエンドファイト（植物組織内生菌、ｅｎｄｏｐｈｙｔｅｓ）である非病原性共生細菌、または葉圏（ｐｈｙｌｌｏｓｐｈｅｒｅ）または根圏（ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ）に定着できる、いわゆるエピファイト（植物表面寄生菌、ｅｐｉｐｈｙｔｅ）である非病原性共生細菌、が使われる。そうした細菌は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ａｌｃａｌｇｅｎｅｓ，Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ，Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｒｗｉｎｉａ，Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，Ｓｅｒｒａｔｉａ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の細菌を含む。ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよびＧｌｉｏｃｌａｄｉｕｍのような共生真菌も、同じ目的のための本発明ヌクレオチド配列の発現のために可能な宿主である。
組み換え体細胞は、１つまたは１つより多い転写制御配列を含む発現ベクターに機能可能に連結された、本発明の１つまたは１つより多いポリヌクレオチドをそれぞれが含む、１つまたは１つより多い組み換え体分子で宿主細胞を形質転換することにより、好ましくは産生される。「機能可能に連結された」という言葉は、宿主細胞中へ形質転換されたとき、当該分子が正しいリーディングフレーム中に発現されることができるような仕方での、発現ベクター中へのポリヌクレオチドの挿入を指す。本明細書で使われる場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換でき、そして特定のポリヌクレオチドの発現を果すことができる、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、当該発現ベクターはまた、当該宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性のいずれかでよく、そして典型的には、ウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、寄生虫、昆虫、他の動物および植物の細胞を含む、本発明の組み換え体細胞中で機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）任意のベクターを含む。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌、酵母、真菌、昆虫、および哺乳動物の細胞中で、そしてより好ましくはこれまでに開示された細胞タイプ中で、遺伝子発現を指令可能である。
本発明の組み換え体分子はまた、（ａ）本発明の発現されたＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを、当該ポリペプチドを産生する細胞から分泌されることを可能にするための、分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含んでもよく、および／または（ｂ）融合ポリペプチドとして、本発明のポリヌクレオチドの発現をもたらす融合配列を含んでもよい。適切なシグナルセグメント、および融合セグメント核酸によりコードされる融合セグメントの事例は、本明細書に開示されている。真核性組み換え体分子は、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列の周りに、および／または、内部に、介在性の、および／または、非翻訳性の配列を含んでもよい。適切なシグナルセグメントは、本発明のポリペプチドの分泌を指図できる、天然のシグナルセグメントまたは任意の異種シグナルセグメントを含む。器官およびオルガネラ特異的発現を高めるために用いられる、好ましいシグナルおよび融合配列は、非限定的に、アルセリンー５（ａｒｃｅｌｉｎ−５）、Ｇｏｏｓｓｅｎｓ，Ａ．ら、「Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓのアルセリンー５遺伝子はトランスジェニックＰｈａｓｅｏｌｕｓ ａｃｕｔｉｆｏｌｉｕｓおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物における高速特異的発現を指図する」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９９９）１２０：１０９５−１１０４を参照、ファセオリン（ｐｈａｓｅｏｌｉｎ）、Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ，Ｃ．ら、「タバコ種子におけるマメのベータファセオリン遺伝子の発生的に調節された発現」ＰＮＡＳ（１９８５）８２：３３２０−３３２４を参照、高ヒドロキシプロリン糖タンパク質、セルピン（ｓｅｒｐｉｎ）、Ｙａｎ，Ｘ．ら、「修飾ベータグルクロニダーゼ遺伝子とのシグナル配列の遺伝子融合は分泌経路／形質膜にベータグルクロニダーゼタンパク質の貯留をもたらす」Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（１９９７）１１５：９１５−９２４を参照、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ １、Ｅｓｓｌ，Ｄ．ら、「タバコのＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ １からのＮ−末端７７アミノ酸はＮｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ細胞のゴルジ装置中にリポータータンパク質を貯留するのに十分である」Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９９）４５３（１−２）：１６９−７３を参照、アルブミン、Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ，Ｊ．ら、「修飾２Ｓ種子貯蔵タンパク質を用いてトランスジェニック植物中に産生されたエンケファリン類」ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９２９−９３２（１９８９）を参照、およびＰＲ１，Ｐｅｎ，Ｊ．ら、「植物中の活性工業酵素の能率的生産」Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｒｏｐｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄ．（１９９３）１：２４１−２５０を参照、を含む。
本発明のポリヌクレオチドは、前記組み換え体細胞に適合し、そして本発明のポリヌクレオチドの発現を制御する、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および他の調節配列のような、調節配列を含む発現ベクターに機能可能に連結が可能である。とくに、本発明の組み換え体分子は、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、および終結を制御する配列である。プロモーター依存性遺伝子発現を、細胞型特異的に、組織特異的に、制御可能にする、または外部シグナルまたは作用物質により誘導可能にする、のに十分な、それらの転写制御配列が含まれる；そうした要素（エレメント、ｅｌｅｍｅｎｔｓ）は、当該天然（ｎａｔｉｖｅ）遺伝子の５’または３’領域に位置してもよい。とくに重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレイター、およびリプレッサー配列のような、転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列は、本発明の組み換え体細胞の少なくとも１つで機能できる、任意の転写制御配列を含む。さまざまなその種の転写制御配列が、当業者には知られている。好ましい転写制御配列は、非限定的に、ｔａｃ，ｌａｃ，ｔｒｐ，ｔｒｃ，ｏｘｙ−ｐｒｏ，ｏｍｐ／ｌｐｐ，ｒｒｎＢ，（λPLおよびλPR、およびその種のプロモーター類を含む融合類のような）バクテリオファージ ラムダ（λ），バクテリオファージＴ７，Ｔ７ｌａｃ，バクテリオファージＴ３，バクテリオファージＳＰ６，バクテリオファージＳＰ０１，メタロチオネイン、α−接合因子（ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ），Ｐｉｃｈｉａ アルコールオキシダーゼ，（シンドビスウイルス サブゲノムプロモーター類のような）アルファウイルス サブゲノムプロモーター類、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、中間初期プロモーター（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）のようなサイトメガロウイルス、シミアンウイルス４０，レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端反復（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ），ラウス肉腫ウイルス、熱ショック（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ），リン酸および硝酸転写制御配列（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｄ ｎｉｔｒａｔｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ），のように細菌、酵母、真菌、昆虫、および哺乳動物の細胞で機能するもの、ならびに原核生物細胞または真核生物細胞における遺伝子発現を制御できる他の配列、を含む。
とくに好ましい転写制御配列は植物転写制御配列である。転写制御配列の選択は、発現のための時間的および空間的必要条件次第で、および標的種次第でも変わる。したがって、任意の植物器官（葉、根、実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ）、未熟または成熟生殖構造体など）において、または植物発生の任意の段階で、本発明のヌクレオチド配列の発現が、好ましい。双子葉植物からの多くの転写制御配列が単子葉植物で効力があり、逆の場合も同じであることが、明らかにされているが、理想的には、双子葉植物転写制御配列が双子葉植物での発現に選択され、そして単子葉植物プロモーターが単子葉植物での発現に選択される。しかし、選択される転写制御配列の出所に制限はない；所望の細胞中で当該ヌクレオチド配列の発現の駆動に、それらが効力を発揮すれば十分である。 構成的に発現される好ましい転写制御配列は、非限定的に、アクチンまたはユビキチンをコードする遺伝子からのプロモーター、およびＣａＭＶ３５Ｓおよび１９Ｓのプロモーター、を含む。本発明のヌクレオチド配列はまた、化学的に調節されているプロモーターの調節下に発現されることも可能である。このことは、当該作物植物が誘導性化学物質で処理された場合にのみ、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドが合成されることを可能にする。遺伝子発現の化学誘導についての好ましい技術は、公開出願ＥＰ０３３２１０４（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに対する）および米国特許第５６１４３９５号に詳述されている。化学誘導の好ましいプロモーターは、タバコＰＲ−１ａプロモーターである。
好ましいカテゴリーのプロモーターは、当該植物の生理状態により誘導されもの（すなわち、創傷誘導性、水分ストレス誘導性、塩ストレス誘導性、疾病誘導性、および同種のもの）である。創傷部位に、およびまた植物病原体感染の部位に、発現される多数のプロモーターが記載されている。理想的には、そうしたプロモーターは感染の部位で局所的にのみ活性であるべきで、そしてこのような仕方で、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドは、蓄積が望ましい細胞にのみ蓄積する。この種の好ましいプロモーターは、Ｓｔａｎｆｏｒｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１５：２００−２０８（１９８９），Ｘｕら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２：５７３−５８８（１９９３），Ｌｏｇｅｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１５１−１５８（１９８９），ＲｏｈｒｍｅｉｒおよびＬｅｈｌｅ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２；７８３−７９２（１９９３），Ｆｉｒｅｋら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２２：１２９−１４２（１９９３），およびＷａｒｎｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：１９１−２０１（１９９３）により記載されたものを含む。
好ましい組織特異的発現パターンは、非限定的に、緑色組織特異的、根特異的、茎特異的、および花特異的、を含む。緑色組織での発現に適したプロモーターは、光合成に関与する遺伝子を調節する多くのもの、および単子葉植物および双子葉植物の両方からクローン化されているものの多くを含む。好ましいプロモーターは、ホスホエノールカルボキシラーゼ遺伝子からのメイズＰＥＰＣプロモーターである（ＨｕｄｓｐｅｔｈおよびＧｒｕｌａ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１２：５７９−５８９（１９８９））。根特異的発現のための好ましいプロモーターは、ｄｅ Ｆｒａｍｏｎｄ（ＦＥＢＳ ２９０：１０３−１０６（１９９１）；Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに対するＥＰ０４５２２６９）により記載されたものである。好ましい茎特異的プロモーターは、米国特許第５６２５１３６号（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに対する）に記載されているもので、そしてメイズｔｒｐＡ遺伝子の発現を駆動するものである。
本発明の組み換え体分子は、その事例が本明細書に開示されているが、形質転換される細胞中で当該ポリヌクレオチド（類）の発現を効果的に調節できる、任意の転写制御配列の少なくとも１つに機能可能に連結され、これまでに記載された任意のポリヌクレオチドの少なくとも１つを含むことが可能な分子である。
本発明の組み換え体細胞は、本発明の任意のポリヌクレオチドの少なくとも１つで形質転換された任意の細胞を含む。それで細胞を転換する、適切かつ好ましいポリヌクレオチドならびに適切かつ好ましい組み換え体分子は、本明細書に開示されている。
本発明の組み換え体分子はまた、本発明の１つまたは１つより多いポリペプチドおよび植物で発現された場合有用な１つまたは１つより多い他のポリペプチドをコードする、植物ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを含む１つまたは１つより多い組み換え体分子で共形質転換も可能である。
組み換え体ＤＮＡ技術の使用は、例えば、宿主細胞内の当該ポリヌクレオチドのコピーの数、それらのポリヌクレオチドが転写される効率、生じた転写産物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率、を操作することにより、形質転換されたポリヌクレオチドの発現を改善可能なことは、当業者には理解されているだろう。本発明のポリヌクレオチドの発現を増加させるのに有用な組み換え体技術は、非限定的に、高コピー数プラスミドに機能可能に連結されたポリヌクレオチド、１つまたは１つより多い宿主細胞染色体中への当該ポリヌクレオチドの組込み、プラスミドへのベクター安定性配列の付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペラーター、エンハンサー）の置換または修飾、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガルノ配列）の置換または修飾、宿主細胞のコドン使用に相当するような本発明のポリヌクレオチドの修飾、転写産物を脱安定化する配列の削除、および発酵中に組み換え体酵素産生から組み換え体細胞増殖を時間的に分離する制御シグナルの使用、を含む。本発明の発現された組み換え体ポリペプチドの活性は、そうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを断片化、修飾、または誘導化することにより、改良が可能である。
本発明の組み換え体細胞は、そうしたポリペプチドを産生するのに有効な条件下でそうした細胞を培養すること、そして当該ポリペプチドを回収することにより、本発明の１つまたは１つより多いポリペプチドを産生するのに使用も可能である。ポリペプチドを産生するのに有効な条件は、非限定的に、ポリペプチド産生を可能にする、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ，および酸素条件を、含む。適切なまたは有効な培地は、その中で本発明の細胞が、培養されたとき、本発明のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを産生できる、任意の培地を指す。そうした培地は、典型的には水性培地で、同化できる炭素、窒素、およびリン酸源、ならびに適切な塩類、ミネラル、金属、およびビタミンのような他の栄養素を含む。当該培地は、複雑な栄養素を含んでもよく、または特定最小培地でもよい。本発明の細胞は、非限定的に、バッチ式、フェッド・バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）式、細胞リサイクル式、および連続式発酵槽を含む、慣用の発酵バイオリアクター中で、培養可能である。培養はまた、震盪フラスコ、試験管、ミクロタイター皿、およびペトリ皿中で行うことも可能である。培養は、当該組み換え体細胞について適切な、温度、ｐＨ，および酸素含量で、行われる。そうした培養条件は、いずれの通常の当業者の専門技術の十分範囲内にある。
産生に使われるベクターと宿主系によって、本発明の生じたポリペプチドは、当該組み換え体細胞内に留まる；発酵培地中に分泌される：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラスム間隙のような２つの細胞性膜の間のスペース中へ分泌される；または細胞またはウイルスの膜の外表面上に保持される；のいずれかでよい。
「当該ポリペプチドを回収すること」という言葉は、当該ポリペプチドを含む発酵培地全体を集めることを単に指し、そして分離または精製の余分の工程を意味する必要はない。本発明のポリペプチドは、非限定的に、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、および分別可溶化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）のような、さまざまな標準的ポリペプチド精製技術を用いて、精製可能である。本発明のポリペプチドは、好ましくは、「本質的に純粋な」形で回収される。本明細書で使われる場合、「本質的に純粋な」は、診断薬または試験化合物としての当該ポリペプチドの有効な使用を可能にする純度を指し、そして好ましさの増加に伴って、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％均質な、を意味する。
Ｆ． トランスフェクトされた植物細胞およびトランスジェニック植物
ＥＧ３０７およびＥＧ１１１７に関して、とくに好ましい組み換え体細胞は植物細胞である。「植物細胞」により、半透性膜に囲まれ、そしてプラスミドを含む任意の自己増殖性細胞を意味する。そうした細胞はまた、さらなる増殖が望まれるならば、細胞壁を必要とする。植物細胞は、本明細書で使われる場合、限定なしに、藻類、シアノバクテリア、種子、懸濁培養、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、苗条（ｓｈｏｏｔｓ），配偶体（ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅｓ）、胞子体（ｓｐｏｒｏｐｈｙｔｅｓ）、花粉、および小胞子（ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｅｓ），を含む。
とくに好ましい態様で、本発明の、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドの少なくとも１つ（または両方）またはそれらの対立遺伝子または変異体型が、高等生物、例えば植物、で発現される。この場合、有効量の当該ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物は、改善された経済的生産性を示す。本発明のヌクレオチド配列は、発現カセットへ挿入され、それは次いで、前記植物のゲノムへ好ましくは安定的に組込まれる。もう１つの好ましい態様では、当該ヌクレオチド配列は、非病原性自己複製ウイルスに含まれる。本発明に従って形質転換される植物は、単子葉植物または双子葉植物でよく、そして非限定的に、メイズ（トウモロコシ、ｍａｉｚｅ），コムギ（小麦、ｗｈｅａｔ），オオムギ（大麦、ｂａｒｌｅｙ），ライムギ（ライ麦、ｒｙｅ），アワ（粟、ｍｉｌｌｅｔ），エジプトマメ（ひよこ豆、ｃｈｉｃｋｐｅａ），ヒラマメ（レンズ豆、ｌｅｎｔｉｌ），アマ（亜麻、ｆｌａｘ），オリーブ（ｏｌｉｖｅ），イチジクアーモンド（ｆｉｇ ａｌｍｏｎｄ），ピスタチオ（ｐｉｓｔａｃｈｉｏ），クルミ（胡桃、ｗａｌｎｕｔ），ビート（ｂｅｅｔ），パースニップ（ｐａｒｓｎｉｐ）；オレンジ（ｏｒａｎｇｅ），レモン（ｌｅｍｏｎ），ライム（ｌｉｍｅ），グレイプフルーツ（ｇｒａｐｅｆｒｕｉｔ），タンジェリン（ｔａｎｇｅｒｉｎｅ），ミンネオラ（ｍｉｎｎｅｏｌａ），およびタンジェロー（ｔａｎｇｅｌｏ）を非限定的に含む、柑橘類（ｃｉｔｒｕｓ ｆｒｕｉｔｓ）；サツマイモ（甘藷、ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ），マメ（豆、ｂｅａｎ），エンドウ（えんどう豆、ｐｅａ），チコリ（ｃｈｉｃｏｒｙ），レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ），キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ），カリフラワー（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ），ブロッコリ（ｂｒｏｃｃｏｌｉ），カブ（蕪、ｔｕｒｎｉｐ），ラディッシュ（大根、ｒａｄｉｓｈ），ホウレンソウ（ｓｐｉｎａｃｈ），アスパラガス（ａｓｐａｒａｇｕｓ），タマネギ（ｏｎｉｏｎ），ニンニク（ｇａｒｌｉｃ），コショウ（ｐｅｐｐｅｒ），セロリ（ｃｅｌｅｒｙ），カボチャ（ｓｑｕａｓｈ），アメリカカボチャ（ｐｕｍｐｋｉｎ），アサ（麻、ｈｅｍｐ），ズッキーニ（西洋カボチャ、ｚｕｃｃｈｉｎｉ），リンゴ（ａｐｐｌｅ），ナシ（ｐｅａｒ），マルメロ（ｑｕｉｎｃｅ），メロン（ｍｅｒｏｎ），プラム（西洋すもも、ｐｌｕｍ），サクランボ（ｃｈｅｒｒｙ），モモ（ｐｅａｃｈ），ネクタリン（ｎｅｃｔａｒｉｎｅ），アンズ（ａｐｒｉｃｏｔ），イチゴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ），ブドウ（ｇｒａｐｅ），ラズベリー（ｒａｓｂｅｒｒｙ），クロイチゴ（ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ），パイナップル（ｐｉｎｅａｐｐｌｅ），アボカド（ａｖｏｃａｄｏ），パパイア（ｐａｐａｙａ），マンゴー（ｍａｎｇｏ），バナナ（ｂａｎａｎａ），ダイズ（大豆、ｓｏｙｂｅａｎ），トマト（ｔｏｍａｔｏ），モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ），サトウキビ（ｓｕｇａｒｃａｎｅ），テンサイ（砂糖大根、ｓｕｇａｒｂｅｅｔ），ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ），ナタネ（菜種、ｒａｐｅｓｅｅｄ），クローバー（ｃｌｏｖｅｒ），タバコ（ｔａｂａｃｃｏ），ニンジン（ｃａｒｒｏｔ），ワタ（綿、ｃｏｔｔｏｎ），アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ、ａｌｆａｌｆａ），コメ（イネ、ｒｉｃｅ），ジャガイモ（馬鈴薯、ｐｏｔａｔｏ），ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ），キュウリ（ｃｕｃｕｍｂｅｒ），シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）；および針葉（ｃｏｎｉｆｅｒｏｕ）および落葉樹（ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ ｔｒｅｅｓ）のような木本植物（ ｗｏｏｄｙ ｐｌａｎｔ）、を含む。
一旦、所望のヌクレオチド配列が特定の植物種中へ形質転換されたならば、伝統的な育種技術を用いて、その種中で増殖させるか、または、とくに商業品種を含む、同種の他の品種中へ移してもよい。
したがって、本発明は、トランスフェクトされた植物細胞またはトランスジェニック植物を産生するための方法を提供するが、それは、ａ）タンパク質をコードし、そして当該細胞に先天的でないＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチド（当該ポリヌクレオチドは実際には先天的であってもよいが、当該発現パターンは発生的に変えることも可能で、それでなお、好ましい効果をもたらす）に由来する、異種ＤＮＡセグメントを含むように、植物細胞をトランスフェクトすることで；ここで当該ポリヌクレオチドは、トランスジェニックタンパク質の発現のために有効に使用可能なプロモーターへ、機能可能に連結される；ｂ）そこからトランスジェニック植物が再生されるような条件下で、前記細胞を最適に増殖させ、そして維持すること；ｃ）前記ＤＮＡが発現され、前記植物中のＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドの総量が変えられるような条件下で、前記トランスジェニック植物を最適に生育させること；の工程を含む。好ましい態様で、当該方法はさらに、前記異種ＤＮＡセグメントが発現される、前記異種ＤＮＡセグメントを含む、前記トランスジェニック植物の子孫のさらなる世代を得て、そして生育させることの工程を含む。本明細書で使われる場合、「異種ＤＮＡ」、または、ある場合には、「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、特定の仕方で植物の形質を変えるために、（多分、異なるプロモーターにより駆動される）、外来遺伝子またはポリヌクレオチド、または、先天性または内因性遺伝子またはポリヌクレオチドの付加あるいは修飾版、を指す。
本発明はまた、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む、植物細胞も提供する。好ましい態様では、当該トランスジェニック植物細胞は、トランスジェニック植物の増殖材料である。本発明はまた、進化的に有意のＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドからのプロモーター、エンハンサー、またはイントロンポリヌクレオチド、およびリポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、構築体でトランスフェクトされた宿主細胞を含む、トランスフェクトされた宿主細胞も提供する。
本発明はまた、植物における改善された経済的生産性提供をする方法を提供するが、それは、ａ）それによって前記植物細胞におけるＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７発現が変えられる、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードするトランスジーンをもつトランスフェクトされた植物細胞を産生すること；ｂ）そこで当該ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７トランスジーンが当該トランスジェニック植物中で発現される、トランスフェクトされた植物細胞からトランスジェニック植物を生育させること；を含む。前記トランスジーンの発現は、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７発現の増加を含む。いくつかの態様で、前記トランスジーンの発現は、先天性のＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子を干渉することも可能なＲＮＡを産生し、その結果、当該先天性遺伝子の発現が除去されるか、低減されて、有用な結果をもたらす。
本発明はまた、当該植物中に導入されたベクター中での発現を含む、植物細胞において発現されるＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする、異種ＤＮＡを含むトランスジェニック植物、を提供する。
本発明はまた、植物組織中でＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子をコードするポリヌクレオチドに、機能可能に連結された転写制御エレメントを含む単離されたポリヌクレオチド、を提供する。好ましい態様で、前記転写制御エレメントは、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子に先天的なプロモーターである。
本発明はまた、トランスフェクトされた細胞を作る方法を提供するが、それは、ａ）栽培化植物中に進化的に有意なＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを同定すること；ｂ）転写または翻訳調節エレメント、エンハンサー、イントロン、または他の５’または３’フランキング配列でもよい非ポリペプチドコード配列を同定するために、前記ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを使用すること；ｃ）前記非ポリペプチドコード配列およびリポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む構築体を組立てること；そしてｄ）前記構築体を宿主細胞中へトランスフェクトすること；を含む。本発明はまた、本方法に従って産生されたトランスフェクト細胞も提供する。１つの態様で、当該宿主細胞は植物細胞であり、そして当該方法はさらに、トランスジェニック植物を再生するのに適した条件下で、当該細胞を増殖および維持する工程を含む。また、当該方法により産生されたトランスジェニック植物も提供される。
本発明の核酸配列は、好ましくはトランスジェニック植物で発現され、それにより、当該トランスジェニック植物中に対応するＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドの生合成を起す。このようにして、改善された経済的生産性に関係する特性をもつトランスジェニック植物が作製される。トランスジェニック植物におけるそれらの発現のために、本発明のヌクレオチド配列は、修飾および最適化を必要とするかも知れない。好ましい遺伝子配列は、単子葉および双子葉植物種の両方で適当に発現されてもよいが、配列は、単子葉植物または双子葉植物の特定のコドン優位性およびＧＣ含量優位性を説明するように、修飾してもよいが、これらの優位性は相違することが明らかにされているからである（Ｍｕｒｒａｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，４７７−４９８（１９８９））。上記のもののような、前記ヌクレオチド配列内でつくられるのに必要なすべての変化は、公開された特許出願、（Ｍｏｎｓａｎｔｏに対する）ＥＰ０３８５９６２，（Ｌｕｂｒｉｚｏｌに対する）ＥＰ０３５９４７２、および（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙに対する）ＷＯ９３／０７２７８に記載された方法を用いる、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、および合成遺伝子構築の周知技術を用いて、つくられる。
翻訳の効率的な開始には、開始メチオニンに隣接する配列が修飾を必要とすることもある。例えば、それらは、植物で有効なことが知られている配列の封入により修飾されることも可能である。Ｊｏｓｈｉは植物用に適切なコンセンサスを示唆しており（ＮＡＲ １５：６６４３−６６５３（１９８７））、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈは別のコンセンサス翻訳イニシエーターを示唆している（１９９３／１９９４カタログ，２１０ページ）。これらのコンセンサスは、本発明のヌクレオチド配列との使用に適している。当該配列は、（第２アミノ酸非修飾のままで）ＡＴＧまでそしてそれを含む、または別に（当該トランスジーンの第２アミノ酸を修飾する可能性がある）ＡＴＧに続くＧＴＣまでそしてそれを含む、ヌクレオチド配列を含む構築体へ取込まれる。
トランスジェニック植物における当該ヌクレオチド配列の発現は、植物で機能性であることが示されている転写制御エレメントにより駆動される。これらの調節エレメントの制御下でのポリヌクレオチドによる植物の形質転換は、当該形質転換植物中での制御された発現を提供する。そうした転写制御エレメントは、上に記載されている。転写の適当なイニシエーターの選択に加えて、植物におけるＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドの発現のための構築は、異種ヌクレオチド配列の下流に付着される適当な転写ターミネーターを必要とする。いくつかのそうしたターミネーターは、当該技術分野で入手でき、そして知られている（例えば、ＣａＭＶからのｔｍ１、ｒｂｃＳからのＥ９）。植物中で機能することが知られている任意の入手可能なターミネーターが、本発明の関係で使用可能である。
多くの他の配列が、本発明で記載されている発現カセット中へ取込み可能である。これらは、イントロン配列（例えば、Ａｄｈｌおよびｂｒｏｎｚｅｌからの）およびウイルスリーダー配列（例えば、ＴＭＶ，ＭＣＭＶ，およびＡＭＶからの）のような発現を高めることが明らかにされている配列、を含む。
本発明はまた、植物における収量を増加させる方法を提供するが、それは、ａ）ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードするトランスジーンをもち、そして当該トランスジーンが当該遺伝子（類）の制御された発現に適した調節配列の制御下にある、トランスジェニック植物細胞を産生すること；そしてｂ）そこで当該ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７トランスジーンが当該トランスジェニック植物中で発現される、トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を生育させること；を含む。
本発明はまた、植物における収量を増加させる方法を提供するが、それは、ａ）ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子を含むトランスジーンをもつトランスフェクト植物細胞を、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子の構成的発現を提供するプロモーターの制御下で、産生すること；そしてｂ）そこで当該ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７トランスジーンが当該トランスジェニック植物中で構成的に発現される、トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を生育させること；を含む。
本発明はまた、トランスジェニック植物において制御可能な収量を提供する方法を提供するが、それは、ａ）ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子を含むトランスジーンをもつトランスフェクト植物細胞を、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子の制御可能な発現を提供するプロモーターの制御下で、産生すること；そしてｂ）そこで当該ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７トランスジーンが当該トランスジェニック植物中で制御可能的に発現される、トランスジェニック植物細胞からトランスジェニック植物を生育させること；を含む。１つの態様で、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７遺伝子は、組織特異的または細胞型特異的プロモーターを用いて、または化学シグナルまたは作用物質のような外部のシグナルまたは作用物質の導入により活性化されるプロモーターにより、発現される。
本発明のヌクレオチド配列の発現を、植物中の異なる細胞局在に標的すること、が好ましい。ある場合には、シトゾル中の局在化が好ましく、また他の場合には、ある細胞下オルガネラ中の局在化が好まれこともあろう。異種ＤＮＡコードポリペプチドの細胞下局在化は、当該技術分野で周知の技術を用いて行われる。典型的には、既知のオルガネラ標的化遺伝子産物からの標的ペプチドをコードするＤＮＡは、当該ヌクレオチド配列の上流に操作され、そして融合される。多くのその種の標的配列が葉緑体について知られており、そして異種構築体中におけるそれらの働きが明らかにされている。本発明のヌクレオチド配列の発現はまた、宿主細胞の小胞体に、あるいは空胞に標的される。これを達成するための技術は、当該技術分野で周知である。
植物形質転換に適するベクターは、本明細書の別のこところに記載されている。アグロバクテリア（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介形質転換には、バイナリーベクターまたは少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列をもつベクターが適しており、一方、直接遺伝子移入には、任意のベクターが適しており、そして興味のある構築体のみを含む線形ＤＮＡが好まれよう。直接遺伝子移入の場合、単一ＤＮＡ種による形質転換または共形質転換が使用可能である（Ｓｃｈｏｃｈｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１０９３−１０９６（１９８６））。直接遺伝子移入およびアグロバクテリア仲介移入のいずれについても、形質転換は、通常（しかし必ずしも常にではなく）、抗生物質（カナマイシン、ハイグロマイシンまたはメトトレキセート）または除草剤（バスタ（ｂａｓｔａ））に抵抗性を与える選択マーカーとともに、行われる。しかし、選択マーカーの選択は、本発明に決定的なものではない。
もう１つの好ましい態様で、本発明のヌクレオチド配列は、色素体（プラスチド、ｐｌａｓｔｉｄ）ゲノム中へ直接形質転換される。色素体形質転換の主な利点は、色素体が、単一プロモターの制御下で複数のオープンリーディングフレームを発現できることである。色素体形質転換技術は、米国特許第５４５１５１３号、第５５４５８１７号および第５５４５８１８号に、ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１６７８３号に、そしてＭｃＢｒｉｄｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，７３０１−７３０５に、詳しく記載されている。葉緑体形質転換の基本技術は、例えば、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）またはプロトプラスト形質転換（例えば、塩化カルシウムまたはＰＥＧ仲介形質転換）を用いて、適当な標的組織中へ興味ある遺伝子とともに、選択マーカーを隣接するクローン化色素体ＤＮＡの領域を導入することを含む。ターゲッティング配列と呼ばれる、１から１．５ｋｂフランキング領域は、色素体ゲノムとの相同組み換えを容易にし、それによって当該プラストーム（ｐｌａｓｔｏｍｅ）の特定領域の交換または修飾を可能にする。当初、スペクチノマイシンおよび／またはストレプトマイシンに抵抗性を付与する葉緑体１６Ｓ ｒＲＮＡおよびｒｐｓ１２遺伝子中の点変異が、形質転換用の選択マーカーとして利用されている（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，８５２６−８５３０；Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４，３９−４５）。これは、標的葉の１００回爆撃当り約１回の頻度で、安定なホモプラスミックな（ｈｏｍｏｐｌａｓｍｉｃ）形質転換体を生じた。これらのマーカー間のクローニング部位の存在は、外来遺伝子の導入のための色素体標的ベクターの創出を可能にした（Ｓｔａｕｂ，Ｊ．Ｍ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２，６０１−６０６）。形質転換頻度の実質的増加が、劣性ｒＲＮＡまたはｒ−ポリペプチド抗生物質耐性遺伝子の、優性選択マーカーであるスペクチノマイシン解毒酵素アミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼをコードする細菌性ａａｄＡ遺伝子との、交換により得られる（Ｓｖａｂ，Ｚ．およびＭａｌｉｇａ，Ｐ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，９１３−９１７）。以前、このマーカーは、緑藻Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｈａｒｄｔｉｉの色素体ゲノムの高頻度形質転換に用いられて成功している（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｍ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４０８３−４０８９）。色素体形質転換に有用な他の選択マーカーは、技術分野では知られており、そして本発明の範疇に含まれる。典型的には、ホモプラスチド状態に達するには、形質転換後に約１５−２０細胞分裂周期が必要である。各植物細胞に存在する環状色素体ゲノムの数千コピーのすべてに、相同組み換えにより遺伝子が挿入される色素体発現は、全可溶性植物ポリペプチドの１０％を容易に超える発現レベルを可能にするのに、核発現遺伝子に対して膨大なコピー数の利点を利用している。好ましい態様で、本発明のヌクレオチド配列は、色素体ターゲティングベクター中へ挿入され、所望の植物宿主の色素体ゲノム中へ形質転換される。本発明のヌクレオチド配列を含む色素体ゲノムについてホモプラスティックな植物が得られ、そして好ましくは当該ヌクレオチド配列の高発現が可能である。
本発明はまた、植物収量関係遺伝子を同定する方法も提供するが、それは、ａ）植物組織試料を提供すること；ｂ）当該植物組織試料中に候補植物収量関係遺伝子を導入すること；ｃ）当該植物組織試料内で当該候補植物収量関係遺伝子を発現させること；およびｄ）当該植物組織試料が収量応答に変化を示すかどうかを決定することで、ここで応答の変化が植物収量関係遺伝子を同定すること、を含む。本発明はまた、当該方法に従って単離された植物収量関係遺伝子も提供する。
収量応答は、本明細書で使われる場合、当業者に周知の技術により測定される。穀物の場合、収量応答は、例えば、次の計量値、すなわち、粒重、粒長、粒重／１０００粒、穂のサイズ、穂の数、および粒の数／穂、の１つまたは１つより多くにより決定される。
Ｇ． ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７抗体
本発明はまた、本発明のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドに、またはそのミメトープに、選択的に結合できる単離された抗体を含む。その種の抗体は、本明細書では抗ＥＧ３０７または抗ＥＧ１１１７抗体とも呼ばれる。本態様のとくに好ましい抗体は、抗Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ３０７抗体、抗Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ３０７抗体、抗Ｚ．ｍａｙｓ ＥＧ３０７抗体、抗Ｏ．ｓａｔｉｖａ ＥＧ１１１７抗体、抗Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＥＧ１１１７抗体、抗Ｚ．ｍａｙｓ ＥＧ１１１７抗体、を含む。
単離された抗体は、それらの自然環境から取出された抗体である。用語「単離された」は、そうした抗体の純度の状態を指すのではない。そうしたものとして、単離された抗体は、そうした抗体を含む抗血清、またはさまざまな程度に精製された抗体を含むこともある。
本明細書で使われる場合、用語「に選択的に結合する」は、本発明の特定のポリペプチドおよびそのミメトープに優先的に結合するための、本発明の抗体の能力を指す。結合は、免疫ブロット検定、免疫沈澱検定、放射線免疫検定、酵素免疫検定（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体検定、および免疫電子顕微鏡法を含む、当業者に知られたさまざまな方法を用いて、測定可能である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，同誌、およびＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９９０，同誌を参照されたい。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。本発明の抗体は、当該抗体を得るために使用したポリペプチドまたはミメトープのエピトープの少なくとも１つに選択的に結合できる、一本鎖抗体を含む、抗体断片および遺伝的に工作された抗体のような、機能的同等物を含む。本発明の抗体はまた、１つ以上のエピトープに結合できるキメラ抗体も含む。好ましい抗体は、本発明のポリヌクレオチドにより、少なくとも一部は、コードされるポリペプチドまたはそのミメトープに応答して、つくられる。
本発明の抗体を産生する好ましい方法は、（ａ）当該抗体を産生するために、本発明のポリペプチドまたはそのミメトープの有効量を動物に投与すること、そして（ｂ）当該抗体を回収すること、を含む。もう１つの方法で、本発明の抗体は、本発明のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを産生するのに、これまで開示されたような技術を用いて、組み換え的に産生される。
本発明の抗体は、本発明の範疇内にあるさまざまな潜在的用途をもっている。例えば、そうした抗体は、（ａ）植物によるＥＧ３０７またはＥＧ１１１７の発現を検出するための検定での試薬として、および／または（ｂ）発現ライブラリーをスクリーンするための、および／またはポリペプチドおよび他の夾雑物の混合物から本発明の所望のポリペプチドを回収するための、手段として、使うことも可能である。さらに、本発明の抗体は、そうした植物を直接殺すために、細胞毒性物質を植物に標的（ターゲット）するために使うことも可能である。ターゲティングは、当業者に知られている技術を用いて、前記細胞毒性物質にそうした抗体を共役させる（すなわち、安定に結合させる）ことにより、達成可能である。適切な細胞毒性物質は当業者に知られている。適切な細胞毒性物質は、非限定的に、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素、リシン（ｒｉｃｉｎ）毒素、シードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｘｏｔｏｘｉｎ）、モデシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）毒素、アブリン（ａｂｒｉｎ）毒素、およびシガ（ｓｈｉｇａ）毒素のような、二本鎖ポリペプチド（すなわち、ＡおよびＢ鎖をもつ毒素）；アメリカヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスポリペプチド、α−アマニチン（α−ａｍａｎｉｔｉｎ）、およびリボソーム阻害性ポリペプチドのような、単鎖毒素；およびメルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、およびダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）のような、化学毒素、を含む。好ましい二本鎖毒素は、当該毒素の毒性ドメインおよびトランスロケーションドメインを含むが、当該毒素の固有の細胞結合性ドメインを欠くように、修飾される。
Ｈ． 成長促進組成物の処方
本発明はまた、本発明のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドの少なくとも１つまたは両方を含む組成物を含む。成長を効率的に制御するために、そうした組成物は、好ましくは十分量のポリペプチドを含む。そうした量は、標的作物次第で、および湿度、温度、または土壌のタイプのような、環境条件次第で、変わる。好ましい態様では、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドを含む組成物は、当該ポリペプチドを発現する宿主細胞を、余分の精製を加えずに、含む。もう１つの好ましい態様では、ＥＧ３０７および／またはＥＧ１１１７ポリペプチドを発現する細胞は、成長促進剤としてのそれらの使用前に、凍結乾燥される。もう１つの態様で、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドは、宿主細胞から分泌されるように、操作される。それらが発現される宿主細胞から当該ポリペプチドの精製が望ましい場合、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドのさまざまな程度の精製が行われる。
本発明はさらに、本明細書に記載の１つまたは１つより多い化合物または化合物の群と均一に混合される、本発明の少なくとも１つのＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを含む、組成物の調製を含む。本発明はまた、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチド、またはＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを含む組成物の、植物への適用を含む、植物を取扱う方法に関する。ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドは、別の化合物とともに、同時にまたは連続して、組成物の形で作物面積に、または処理される植物に、適用することも可能である。これらの化合物は、肥料または微量栄養素供与体の両方でも、または植物の成長に影響する他の調製物でもよい。それらはまた、選択的な除草剤、殺虫剤、殺かび剤、殺菌剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤、または、処方技術分野で習慣的に用いられる、さらなる担体、界面活性剤、適用促進補助剤との共用が望まれるのであれば、これらの調製物のいくつかの混合物でもよい。適当な担体および補助剤は、固体または液体でよく、そして処方技術で通常用いられる物質、例えば、天然または再生のミネラル物質、溶剤、分散剤、展着剤（ｗｅｔｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ），粘着付与剤（ｔａｃｋｉｆｅｒｓ）、結合剤、または肥料、に相当する。
本発明のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを適用する好ましい方法は、土壌、水、または植物の茎葉（ｆｏｌｉａｇｅ）を散布することによる。適用の回数および適用の割合は、植物のタイプおよび期待する収量の増加次第である。ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドはまた、液体組成物で当該植物の場所を充満させることにより、土壌を経由して根を通じ（全身作用）、または固体の形で土壌に当該化合物を適用することにより、例えば顆粒型で（土壌施用）、当該植物に浸透させることも可能である。ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドはまた、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを含む液体処方物で種子を含浸させるか、または固体処方物でそれらを被覆するか、のいずれかにより、種子に適用してもよい（コーティング）。特殊な場合には、別のタイプの適用も可能で、例えば、当該植物の茎や芽の選択的処理である。 ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドは、非修飾型で、または好ましくは、処方の技術分野で慣用的に用いられている補助剤とともに、使用され、そしてそれゆえ、既知の仕方で、乳化可能な濃縮物、被覆可能なペースト、直接散布可能なまたは希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤（ｗｅｔｔａｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒｓ）、可溶性粉末、粉剤（ｄｕｓｔ）、顆粒、およびまた、例えば、ポリマー物質中のカプセル剤、に処方される。当該組成物の性質と同様に、噴霧、霧化、散粉、散布、または注入のような、適用の方法が、意図する対象物およびその場の状況に従って、選ばれる。
ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを含む処方物、組成物、または調製物および、適切な場合には、固体または液体の補助剤が、既知の仕方で、例えば、配合剤、例えば、溶剤、固体担体、および適切な場合には、表面活性化合物（界面活性剤）とともに、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを均一に混合および／または粉砕することにより、調製される。
適当な溶剤は、芳香族炭化水素、好ましくは８から１２の炭素原子をもつ画分、例えば、キシレン混合物または置換ナフタレン類、ジブチルフタレートまたはジオクチルフタレートのようなフタレート類、シクロヘキサンまたはパラフィン類のような脂肪族炭化水素、エタノール、エチレングリコール、モノメチルまたはモノエチルエーテルのようなアルコール類およびグリコール類およびそれらのエーテル類およびエステル類、シクロヘキサノンのようなケトン類、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルスルフォキサイドまたはジメチルホルムアミドのような強極性溶剤、ならびにエポキシ化ココナッツ油のようなエポキシ化植物油または大豆油または水、を含む。
例えば、粉剤および分散性粉末用に使われる固形担体は、方解石、滑石、カオリン、モンモリロン石（ｍｏｎｔｍｏｒｉｌｌｏｎｉｔｅ）、またはアタプルギット（ａｔｔａｐｕｌｇｉｔｅ）のような、普通は、天然の鉱物充填剤である。物理的性質を改善するために、高度に分散性のケイ酸または高度に分散性の吸収性ポリマーを添加することも可能である。適当な顆粒化吸着性担体は、多孔タイプで、例えば、軽石、砕煉瓦、シーピアライト（ｓｅｐｉｏｌｉｔｅ）またはベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）であり；そして適当な非吸着性担体は、方解石または砂のような材料である。加えて、無機または有機性質の非常に多くの顆粒化前の材料を使用することも可能で、例えば、とくに白雲石（ｄｏｌｏｍｉｔｅ）または粉砕された植物残留物である。
適当な表面活性化合物は、良好な乳化性、分散性、および湿潤性の性質をもつ、非イオン性、陽イオン性および／または陰イオン性界面活性剤である。用語「界面活性剤」は、界面活性剤の混合物を含むとも理解されよう。適当な陰イオン性界面活性剤は、水溶性石鹸および水溶性合成表面活性化合物の両方であってもよい。
適当な石鹸は、アルカリ金属塩、アルカリ性土金属塩、または高級脂肪酸（１０から２２炭素原子の鎖）の非置換または置換アンモニウム塩、例えば、オレイン酸またはステアリン酸の、または例えば、ココナッツ油または獣脂から得ることができる天然脂肪酸混合物の、ナトリウムまたはカリウム塩である。脂肪酸メチルタウリン塩も、使うことが可能である。
しかし、さらに頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、とくに脂肪スルフォン酸塩、脂肪硫酸塩、スルフォン酸化ベンジイミダゾール誘導体、またはアルキルアリールスルフォン酸、が使われる。
前記脂肪スルフォン酸塩または硫酸塩は、普通、アルカリ金属塩、アルカリ性土金属塩、または非置換または置換アンモニウム塩で、そしてアルキルラジカル類のアルキル部分（ｍｏｉｅｔｙ）も含む、８から２２炭素アルキルラジカルをもち，例えば、リグノンスルフォン酸の、ドデシル硫酸の、または天然脂肪酸から得られた脂肪アルコール硫酸の混合物の、ナトリウムまたはカルシウム塩である。これらの化合物はまた、脂肪アルコール／エチレンオキシド付加物の硫酸エステルおよびスルフォン酸の塩も含む。前記スルフォン酸化ベンジイミダゾール誘導体は好ましくは、２スルフォン酸基、および８から２２炭素原子を含む１脂肪酸ラジカルを含む。アルキルアリールスルフォン酸の例は、ドデシルベンゼンスルフォン酸、ジブチルナフタレンスルフォン酸の、またはナフタレンスルフォン酸／ホルムアルデヒド縮合産物の、ナトリウム、カルシウム、またはトリエタノールアミン塩である。対応するリン酸塩、例えば、４から１４モルのエチレンオキシドとのｐ−ノニルフェノールの付加物のリン酸エステルの塩も適している。
非イオン性界面活性剤は好ましくは、脂肪族またはシクロ脂肪族アルコール、または飽和または不飽和脂肪酸およびアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘導体で、当該誘導体は、（脂肪族）炭化水素部分に３から３０グリコールエーテル基および８から２０炭素原子、およびアルキルフェノールのアルキル部分に６から１８炭素原子を含む。
別の適当な非イオン性界面活性剤は、ポリプロピレングリコール、エチレンジアミンプロピレングリコール、およびアルキル鎖に１から１０炭素原子を含むアルキルポリプロピレングリコールと、ポリエチレンオキシドとの水溶性付加物であり、それらの付加物は２０から２５０のエチレングリコールエーテル基と１０から１００のプロピレングリコールエーテル基を含む。これらの化合物は、通常、プロピレングリコール単位当り１から５のエチレングリコール単位を含む。
非イオン性界面活性剤の代表例は、ノニルフェノールポリエトキシエタノール類、ひまし油ポリグリコールエーテル類、ポリプロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、トリブチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール、およびオクチルフェノキシエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタンおよびポリオキシエチレンソルビタントリオレエートの脂肪酸エステルも適当な非イオン性界面活性剤である。
陽イオン性界面活性剤は好ましくは、Ｎ−置換基として少なくとも１つのＣ８−Ｃ２２アルキルラジカル、および別の置換基として低級の非置換性またはハロゲン化された、アルキル、ベンジルまたは低級のヒドロキシアルキルラジカルをもつ、４級アンモニウム塩である。それらの塩は好ましくは、ハロゲン化物、メチル硫酸類、またはエチル硫酸類、の形で、例えば、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムまたは臭化ベンジルジ（２−クロロエチル）エチルアンモニウムである。処方の技術分野で慣習的に用いられる界面活性剤は、例えば、“ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ‘ｓ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ Ａｎｎｕａｌ”，ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．Ｒｉｎｇｗｏｏｄ，ニュージャージー、１９７９，およびＳｉｓｅｌｙおよびＷｏｏｄ，“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｅ Ａｇｅｎｔｓ”，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ニューヨーク、１９８０に記載されている。
ＩＶ． 中立条件下で進化した遺伝子の同定
本明細書に詳細に記載されているように、ＫA／ＫS分析は、正に選択されたタンパク質コード遺伝子の同定を可能にする；しかしこのタイプの分析はまた、中立条件下で進化している遺伝子のような、もう１つのセットの進化的に有意の遺伝子を同定するのに、使用することも可能である。
ＫA／ＫS比＞１は、正の選択の役割を意味するのに対して、逆にＫA／ＫS比＜１は、タンパク質コード遺伝子が負に選択された（すなわち、保存されている）ことを示唆する。本明細書の別のところに記されているように、大部分の遺伝子（事実、圧倒的に多数）は保存されている。非常に少数の遺伝子が正に選択されるので、稀な遺伝子だけがＫA／ＫS比＞１を示す。本明細書に記載されているように、穀類（ならびに他の作物）の栽培品種化の間に正に選択された遺伝子は、有意の商業的価値をもつ；しかし栽培品種化植物のゲノム中に含まれるもう１つのセットの遺伝子は、（当該栽培品種化子孫で所望の増強された形質をつくるようには）正に選択されてもおらず、負に選択され（保存され）てもいない。上記のように、このサブセットの植物遺伝子もまた、有意の商業的価値をもち、そしてこのセットの遺伝子は、本明細書に記載されている、ＫA／ＫS分析を用いることにより、同定が可能である。
これらの遺伝子は、乾燥、疾病、（非限定的に、昆虫、植食動物、および微生物を含む）有害生物、高塩濃度、および他のストレスに対して当該植物を抵抗性にするものを、含む。有害生物による攻撃、および乾燥または高塩濃度、などによる障害は、農家、種子会社、および大農業会社にとって、数十億ドルもの年間損失の原因である。これらのストレスに対して野生植物を抵抗性にする遺伝子の同定は、したがって、社会的にも（飢えた世界に対して）、そして経済的にも、大きな価値がある。
これらの遺伝子を検出するための方法は、次のようである。まず植物が栽培化された後（そして引続き、その子孫がさらに栽培化されるにつれて）、例えば、ヒトは当該植物の要求に合うように十分量の水を供給する、という意味で、それらの植物は「甘やかされた」ことになる。それゆえ、その植物は、「自分自身で」乾燥ストレスを処理する必要がない。同様に、ヒトは、（物理的にか、殺虫剤の使用かのいずれかにより）害虫を除き、そして栽培化植物を植食動物から隔離するので、当該栽培化植物はこれらの有害生物に対処する必要に常時直面することはない。実際、栽培化穀物は、それらの野生親類／祖先より、例えば、乾燥、高塩濃度、有害生物、および他のストレスに、普通はずっと傷つきやすい。これは、生物が、生存に必要ない能力を一般には維持しないからである。ヒトがこれらの役割を引受けるので、栽培化植物は、ストレス関係形質のためにコードする遺伝子を維持する高い代謝コスト（「代謝浪費」）を節約できる。
抵抗性のこの消失は、当該祖先とその甘やかされた栽培化子孫との間の遺伝的相違（すなわち、変化）に当然由来するはずである。結果として機能の消失を生じるこれらの遺伝的変化は、３つの異なる機構によって起る可能性がある。これらの形質をコードする遺伝子が、当該子孫作物のゲノムから実際には消失していることもあり得る。遺伝子消失は、実証されており、そしてよく知られた現象である。同様に、子孫作物で「不要な」形質をコードする遺伝子が、当該ゲノム中にまだ存続しているが、例えば、プロモーター変化の結果として、もはや発現されないこともあり得る。あるいは、これらの不要な形質をコードする遺伝子が、まだ当該ゲノムの一部であって、そしてまだ発現されるが、当該遺伝子が、そのタンパク質産物を、その祖先相同体に比べて、機能しなくするか、完全には機能しないようにするヌクレオチド置換を蓄積しているのかも知れない。これらの遺伝子は、このように、中立的に進化している。
中立アミノ酸交換は、（正または負のいずれかの）選択圧のない、遺伝子のタンパク質産物中に蓄積する。関心のある遺伝子についての機能性タンパク質産物を維持する必要がなくなった栽培化植物については、分子的中立の状態が存在する。これは、有害生物、疾病、乾燥、塩など、の抵抗性のような形質をコードする遺伝子を含む。そうした完全に拘束されない、中立的に進化する遺伝子は、ＫA／ＫS分析による検出の申し分のない候補であるが、それは、祖先および子孫植物からの相同体を比較した場合、中立的に進化する遺伝子は、ＫA／ＫS比＝１を理想的に示すであろう。
それゆえ、本明細書で発明され、そして記載されている方法は、祖先植物についてのｃＤＮＡライブラリーの高性能配列決定すること、その結果得られたＥＳＴｓを現代子孫からのＥＳＴｓのデータベースに対してＢＬＡＳＴＩＮＧすること、そして相同ペアについてＫA／ＫS分析を行うこと、を含む。この方法の詳細は、正に選択された遺伝子の場合について、本明細書の別のところで説明される。ＫA／ＫS比＝１をもつ遺伝子は、重要なストレス抵抗形質を制御する、そしてこれらの遺伝子は遺伝子類のセットであり、この比を用いて効果的にそして迅速に同定が可能である。この商業的に価値のある遺伝子のセットは、有害生物、疾病、乾燥、高塩濃度など、に対する抵抗性のような望ましい形質をコードするものを含む。これらの遺伝子を最もよく同定するために、現代栽培化種および祖先種の両方からのＥＳＴ配列決定は、非常に慎重に、高水準の精度で実施するべきである。ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な穀類ＥＳＴデータベースが利用可能であるが、本目的のために特別に調製されたｃＤＮＡライブラリーからのＥＳＴｓを再配列決定してもよい。配列決定の精度は重要で、これは、１に等しいＫA／ＫS比をもつ、祖先および現代相同体間の遺伝子ペア比較の非常に狭い分布を生じるであろう。これは、擬陽性の数を最少まで減らし、そうして当該処理をはかどらせるだろう。
当該スクリーニング処理の精度が厳格に制御されないか、わからない場合、配列決定エラーが１．０のＫA／ＫS比を曖昧にするであろう、そしてこのために、約０．７５−１．２５の間のＫA／ＫS値は、中立進化の証拠について注意深く検討される。
中立条件下で進化したポリヌクレオチドは、次いで、既知の量的形質遺伝子座(Quantitative trait loci)、すなわちＱＴＬの１つの上にマッピングすることが可能で、それにより、当該ポリヌクレオチドにより制御される特定のストレス抵抗性形質を迅速にそして明確に同定することが可能である。
Ｖ． 作用物質の同定のためのスクリーニング法
本発明はまた、上記の方法を用いて同定され、そして特徴解明されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるスクリーニング法も、提供する。これらのスクリーニング法は、栽培化または祖先生物における特性を増強または減弱するのに役立つと思われる仕方で、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能（類）を調整することも可能な作用物質を同定するのに有用である。一般に、当該方法は、試験される予定の少なくとも１つの作用物質を、栽培化生物、祖先生物、または上記の方法により同定されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクトしてあるトランスジェニック生物または細胞、あるいはそうしたポリヌクレオチド配列によりコードされたポリペプチドの調製物、と接触させることを設定するが、そこでの作用物質は、当該ポリヌクレオチド配列または当該ポリペプチドのいずれかの機能を調整する能力により同定される。例えば、作用物質は、同定された遺伝子の所望の時期における発現を誘導するために、栽培品種化（家畜化）植物または動物に適用または接触される化合物であってもよい。具体的に植物に関して、作用物質は、適切な時期に開花を誘導するために、使用されてもよい。
本明細書で使われる場合、用語「作用物質」は、単純または複雑な有機または無機分子のような生物学的または化学的化合物、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドを意味する。膨大な一連の化合物、例えば、オリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー、およびさまざまなコア構造に基づく合成有機および無機化合物は合成が可能であり、そしてこれらも、用語「作用物質」に含まれる。加えて、さまざまな天然源は、植物または動物抽出物および同類物のような、スクリーニング用の化合物を提供することも可能である。化合物は、単独で、または相互に組合わせて、試験してもよい。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を調整する」ことは、作用物質を添加しないことに比較した場合に、当該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が変更されることを意味する。調整は、機能に影響する任意のレベルで生じてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能は、直接的または間接的であってもよく、そして直接的にまたは間接的に測定してもよい。ポリヌクレオチドの「機能」は、複製、翻訳、および発現パターン（類）を非限定的に含む。ポリヌクレオチド機能はまた、当該ポリヌクレオチド内でコードされるポリペプチドに随伴する機能を含む。例えば、ポリヌクレオチドに作用して、タンパク質発現、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能特性）、タンパク質の構造または機能の調節および／または他の側面、に影響する作用物質は、ポリヌクレオチド機能を調整したと考えられる。有効な作用物質がポリヌクレオチドの発現を調整するように働く仕方は、非限定的に、１）当該ポリヌクレオチド中の転写因子応答エレメントに対する転写因子の結合を修飾すること；２）当該ポリヌクレオチドの発現に必要な２つの転写因子間の相互作用を修飾すること；３）当該ポリヌクレオチドの発現に必要な転写因子が核に入るための能力を変更すること；４）当該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を阻害すること；５）普通はリガンドと相互作用し、そして当該リガンドのその結合が当該ポリヌクレオチドの発現をもたらす、細胞表面受容体を修飾すること；６）当該ポリヌクレオチドの発現をもたらすシグナル伝達カスケードの成分の不活性化を阻害すること；そして７）当該ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を増強すること、を含む。
ポリペプチドの「機能」は、非限定的に、立体配座、折りたたみ（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、を含む。例えば、ポリペプチドに作用して、その立体配座、折りたたみ（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、に影響する作用物質は、ポリペプチド機能を調整したと考えられる。有効な作用物質がポリペプチドの機能を調整するように働く仕方は、１）立体配座、折りたたみ、または他の物理的特性を変えること；２）その天然リガンドに対する結合強度を変えること、またはリガンドに対する結合の特異性を変えること；および３）当該ポリペプチドの活性を変更すること、を非限定的に含む。
一般に、スクリーンされる作用物質の選択は、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチド標的、その認知された機能、その三次元構造（もしわかっているか、推測されるなら）、および合理的化合物設計の他の側面のような、いくつかのパラメーターにより支配される。候補物質の多数順列を作製するために、コンビナトリアルケミストリーの技術を利用することも可能である。当業者は試験用の適当な作用物質を工夫および／または入手することができる。
本明細書に記載のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング検定法は、慣用の薬剤スクリーニング検定法よりいくつかの利点をもつと思われる：１）作用物質が、所望の治療効果を達成するために、細胞内に入らなければならない場合、ｉｎ ｖｉｖｏ検定は、当該作用物質が細胞に入れるかどうかに関して表示を与えることができる；２）ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング検定法は、作用物質が当該検定系へ添加された状態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能の調整に関連する、少なくとも１つの特性を発揮する効果がないが、それらが有効な作用物質になるような仕方で、一旦細胞内部では、細胞成分により修飾される、前記作用物質を同定できる；３）最も大切なことだが、ｉｎ ｖｉｖｏ検定系は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能に関連する特性を最終的には生じる経路の任意の成分に影響する作用物質の同定を可能にする。
一般に、スクリーニングは、本発明の方法を用いて同定されたポリヌクレオチドでトランスフェクトしておいた適切な細胞の試料に作用物質を添加し、そしてその作用、すなわち当該ポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチド内でコードされたポリペプチドの機能の調整をモニターすることにより、実施可能である。当該実験は、好ましくは、候補作用物質を加えない対照試料を含む。当該処理および無処理細胞を、次いで、顕微鏡分析、生死判別試験、複製する能力、組織学的試験、当該細胞に随伴する特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、当該細胞または細胞可溶化物により発現される酵素活性のレベル、感染性媒介物に曝された場合の当該細胞の相互作用、および他の細胞または化合物と相互作用する当該細胞の能力、を非限定的に含む、任意の適当な表現型基準により比較する。処理および無処理細胞間の差異は、当該候補作用物質に起因する作用を示す。最適には、当該作用物質は、対照細胞に対するより、実験細胞に対してより大きな作用をもつ。適切な宿主細胞は、非限定的に、真核生物細胞、好ましくは植物または動物細胞を含む。細胞の選択は、意図される検定の性質に少なくとも一部は依存するはずである。
あるポリヌクレオチドの発現を上方制御する作用物質を試験するために、当該ポリヌクレオチドが発現される（本明細書で使われる場合、発現は転写および／または翻訳を含む）ように、興味あるポリヌクレオチドでトランスフェクトされた適当な宿主細胞は、試験される作用物質と接触させられる。作用物質は、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの発現増加をもたらすその能力について試験されることになろう。ベクターの作製およびトランスフェクションの方法は、当該技術分野で周知である。「トランスフェクション（＝形質移入、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、例えば、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、またはエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む、外因性配列を導入する任意の方法を包含する。外因性ポリヌクレオチドは、（プラスミドのような）非組込みベクターとして維持してもよく、または宿主ゲノム中へ組込まれてもよい。
転写を特異的に活性化する作用物質を同定するために、転写調節領域をリポーター遺伝子に連結し、そして当該構築体を適切な宿主細胞に添加することも可能である。本明細書で使われる場合、用語「リポーター遺伝子」は、同定可能な遺伝子産物（すなわち、リポータータンパク質）をコードする遺伝子を意味する。リポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、を非限定的に含む。リポーター遺伝子の産物に対する同定方法は、酵素検定法および蛍光測定検定法、を非限定的に含む。リポーター遺伝子、およびそれらの産物を検出するための検定法は、当該技術分野では周知で、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）および最新の定期刊行物に記載されている。リポーター遺伝子類、リポーター遺伝子検定法、および試薬キットも商業源から、容易に入手可能である。適切な細胞の事例は、植物、真菌、酵母、哺乳動物、および他の真核生物細胞、を非限定的に含む。通常技術の熟練者は、ウイルスベクターのような適当なベクターの調製を含む真核生物細胞をトランスフェクトすること；エレクトロポレーションによるような、ベクターを細胞中へ搬入すること；そしてリポーターまたは薬剤感受性エレメントを用いることによるような、形質転換されている細胞を選択すること、のための技術に十分習熟しているであろう。これらの構築体中の調節領域からの転写への作用物質の作用は、当該リポーター遺伝子産物の活性を通じて評価されるはずである。
上述の通常は抑制されている条件下での発現の増加に加えて、それが正常に発現される場合には、発現が減少されることもあり得る。転写速度の減少を介して作用物質がこれを達成することがあり得るし、また上記のリポーター遺伝子系は、このための検定をする手段になろう。その種の作用物質を評価するための宿主細胞は、発現が許容状態にある必要があろう。
（興味のあるポリヌクレオチドから）ｍＲＮＡを転写する細胞は、ｍＲＮＡの半減期および／またはｍＲＮＡの翻訳を特異的に調整する作用物質を同定するのに使用できよう。そうした細胞はまた、当該ポリペプチドのプロセシングおよび／または翻訳後修飾への作用物質の作用を評価するのにも使えるはずである。作用物質が、当該ポリペプチドの代謝回転を修飾する（すなわち、その半減期を増やすか、減らす）ことにより、細胞中のポリペプチドの量を調整することもあり得る。ｍＲＮＡおよびポリペプチドに関する当該作用物質の特異性は、当該作用物質の不在下で当該産物を調べることにより、および無関係なｍＲＮＡおよびポリペプチドの産物を調べることにより、決定されるはずである。ｍＲＮＡ半減期、タンパク質プロセシング、およびタンパク質代謝回転を調べる方法は、当業者には周知である。
ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法はまた、ポリペプチドとの相互作用を通じてポリペプチド機能を直接調整する作用物質の同定にも有用なことがあり得る。そうした作用物質は、正常なポリペプチド・リガンド相互作用を、もしあれば、遮断できるであろうし、あるいはそうした相互作用を増強または安定化できるであろう。そうした作用物質はまた、当該ポリペプチドの立体配座も変更できるであろう。当該作用物質の影響は、免疫沈澱反応を用いて決定可能であろう。適切な抗体は、当該ポリペプチドおよびそれと堅く会合した任意のタンパク質を沈澱させるのに使われるはずである。処理細胞からと無処理細胞から免疫沈澱されたポリペプチドを比較することによって、ポリペプチド・リガンド相互作用を、もしあれば、増大または阻害すると思われる作用物質を同定可能であろう。ポリペプチド・リガンド相互作用はまた、ポリペプチド間の緊密ではあるが非共有結合相互作用を共有結合相互作用へ変換する、架橋形成試薬を用いて評価可能である。タンパク質・タンパク質相互作用を調べる技術は、当業者に周知である。タンパク質立体配座を評価する技術も、当業者に周知である。
スクリーニング方法が、無細胞転写または翻訳系のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を含むことがあり得ることも、言うまでもない。それらの系では、転写または翻訳が生じるようにし、作用物質が機能を調整するその能力について試験される。ある作用物質がｍＲＮＡの翻訳またはポリヌクレオチドを調整するかどうかを決定する検定のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を用いてもよい。これらの系は商業的に入手可能で、関心のあるポリヌクレオチド配列に対応するｍＲＮＡを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ手段を提供する。ｍＲＮＡが作られたら、それをｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳し、そしてその翻訳産物を比較することも可能である。如何なる作用物質も含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系（負の対照）と、作用物質を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系との間の翻訳産物の比較は、当該作用物質が翻訳に影響するかどうかを示す。対照および試験ポリヌクレオチド間の翻訳産物の比較は、当該作用物質が、もしこのレベルで作用しているなら、（一般的な非選択的または非特異的な仕方で、翻訳に影響するのと異なり）、選択的に翻訳に影響するかどうかを示す。ポリペプチド機能の調整は、上記のｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏ検定を、非限定的に含む多くの仕方で、ならびにタンパク質調製物を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ検定で、達成可能である。ポリペプチド類は、天然源または組み換え源から抽出および／または精製して、タンパク質調製物を作出可能である。作用物質をタンパク質調製物の試料に加え、そしてその影響をモニター可能である；すなわち、当該作用物質が、ポリペプチドに働くかどうか、そしてどのように働くか、およびその立体配座、折りたたみ（または他の物理的特性）、（リガンドのような）他の部分への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質の構造または機能の他の側面、に影響するかどうか、そしてどのように影響するかは、ポリペプチド機能を調整したと考えられる。
本明細書に記載された方法によって同定されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドに結合する作用物質についての検定のための事例では、ポリペプチドはまず、原核生物または真核生物発現系で、未変性タンパク質として、または（上に記載されたように同定されたポリヌクレオチドによりコードされた）ポリペプチドが十分特徴が解明されたエピトープまたはタンパク質と共役された融合タンパク質として、組み換え的に発現される。次に、組み換えポリペプチドは、例えば、適切な抗体または抗エピトープ抗体を用いる免疫沈澱により、または当該抱合体の固定化リガンドへの結合により、精製される。次いでポリペプチドまたは融合タンパク質から作られたアフィニティーカラムを用いて、適切に標識された化合物の混合体を選別する。適当な標識は、蛍光色素、放射性同位体、酵素、および化学発光化合物を、非限定的に含む。非結合および結合化合物は、当業者により日常的に使われるさまざまな条件（例えば、高塩、界面活性剤）を用いる洗浄によって分離可能である。当該アフィニティーカラムへの非特異的結合は、単に当該抱合体またはエピトープだけを含むアフィニティーカラムを用いて、当該化合物混合体を前洗浄することにより、最小限にすることも可能である。同様な方法は、ポリペプチドに対する結合に競合する作用物質（類）についてのスクリーニングに使用可能である。アフィニティークロマトグラフィーに加えて、溶融温度の変化、または別の分子に結合すると変化するタンパク質の蛍光異方性を測定するような他の技術がある。例えば、ポリペプチドに共役的に結合するセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒにより供給される，Ｓｔｉｔｔら（１９９５）Ｃｅｌｌ ８０：６６１−６７０）を用いるＢＩＡコア検定法は、異なる作用物質の結合活性を決定するのに実施してもよい。
本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法は、ポリペプチドのアミノ酸配列、三次元原子構造、または他の性質（または複数の性質）が、ポリペプチドに結合すると予想される作用物質を設計するための基礎を提供する、構造的な、または合理的な薬剤設計を含むことも、また言うまでもない。一般に、このような関係における作用物質の設計および／または選択は、栽培化生物のおよび相同祖先のポリペプチドの構造の並行比較、当該ポリペプチド標的の認知された機能、その三次元構造（もしわかっているか、推測されるなら）、および合理的薬剤設計の他の側面ような、いくつかのパラメーターにより支配される。候補作用物質の多数順列を作製するために、コンビナトリアルケミストリーの技術を利用することも可能である。
また本発明のスクリーニング法では、当該技術分野で知られるトランスジェニック動物および植物系も思量される。
上記のスクリーニング法は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調整する活性を示すことがあり得る任意の作用物質を検出するために設計された、一次選別を表す。当業者は、作用物質をさらに評価するためには、二次試験が必要らしいことを、認識するだろう。例えば、二次試験は、当該技術分野で知られるマウスおよび他の動物モデル（ラットのような）を用いる検定で、または栽培化（家畜化）植物または動物そのもので、当該作用物質（類）を試験することを含んでもよい。加えて、細胞毒性検定は、一次選別で陽性と試験された作用物質が生きている生物での使用に適するであろうことの、さらなる確証として実施されはずである。例えば、ＭＴＴ検定法（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む、細胞毒性のための任意の検定法が、本目的に適するはずである。
本明細書に早期に詳述されたスクリーニング法は、具体的にＥＧ３０７またはＥＧ１１１７に適用してもよい。したがって、本発明は、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの非ポリペプチドコード領域の機能を調整する作用物質を同定する方法を提供するが、それは、リポーター遺伝子コード領域に機能可能に連結された非ポリペプチドコード領域を含む構築体でトランスフェクトされた宿主細胞を、少なくとも１つの候補作用物質と、接触させることを含むが、ここで当該作用物質は、前記リポーターポリヌクレオチドの転写または翻訳を調整するその能力により同定される。本発明はまた、当該方法により同定された作用物質を提供する。
本発明はまた、進化的に有意のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの非ポリペプチドコード領域の機能を調整する作用物質を同定する方法を提供するが、それは、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを含む植物またはトランスジェニック植物を、少なくとも１つの候補作用物質と、接触させることを含むが、ここで当該作用物質は、前記リポーターポリヌクレオチドの転写または翻訳を調整するその能力により同定される。本発明はまた、当該方法により同定された作用物質を提供する。
本発明はまた、収量を調整することが可能な作用物質を同定する方法を提供するが、その方法は、少なくとも１つの候補作用物質を、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子を含む植物または細胞と、接触させることを含むが、ここで当該作用物質は、収量を調整するその能力により同定される。１つの態様で、当該植物または細胞は、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。本発明はまた、当該方法により同定された作用物質を提供する。１つの態様で、その同定された作用物質は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの機能を調整することにより、収量を調整する。もう１つの態様で、その同定された作用物質は、当該ポリペプチドの機能を調整することにより、収量を調整する。
本発明はまた、本明細書に記載されたスクリーニング法により同定された作用物質も含む。
次の実施例は、当業者をさらに助けるために、提供される。そうした実施例は、例証的であるように意図されおり、それゆえに、本発明を制限すると見なすべきではない。多数の典型的な修飾および変形が、本出願に記載されており、そして他のものは、当業者には明らかになるだろう。そうした変形は、本明細書に記載され、そして請求されているように、本発明の範疇に入ると考えられる。
（実施例）
（実施例１）：ｃＤＮＡライブラリー構築
栽培品種化（家畜化）植物または動物ｃＤＮＡライブラリーは、当該植物または動物からの適切な組織を用いて構築される。当業者は、興味ある形質に従って分析するための適切な組織または複数の組織を知っているはずである。あるいは、生物体全体を用いてもよい。例えば、１日齢植物実生は、当該植物の遺伝子の大部分を発現することがわかっている。
全ＲＮＡを当該組織から抽出する（ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ，Ｑｕｉａｇｅｎ；ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ Ｒａｐｉｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｋｉｔ，５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．、または任意の適当な同等製品）、そして当該ＲＮＡの完全性および純度を慣用の分子クローニング方法に従って決定する。ポリＡ＋ＲＮＡを単離し（Ｍｉｎｉ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ，５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．、または任意の同様で適当な製品）、そしてｃＤＮＡの逆転写用の鋳型として、プライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）とともに、使用する。合成されたｃＤＮＡは、商業的に入手可能なキットを用いて、クローニング用に処理し、修飾する。次に、組み換え体をパッケージし、宿主細胞系中で増殖させる。当該パッケージングミックスの一部を増幅し、そして残りは増幅前に保存する。当該ライブラリーは標準化可能であり、そして当該ライブラリー中の独立組み換え体の数を決定する。
（実施例２）：配列比較
当該ｃＤＮＡライブラリーからダンダムに選択された祖先ｃＤＮＡクローンは、ＡＢＩ３７７またはＭｅｇａＢＡＣＥ１０００または任意の同様で適当な製品のような自動シークエンサーを用いて配列決定する。当該配列決定を行うには、Ｍ１３ ＵｎｉｖｅｒｓａｌおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー類のようなクローニングベクター上に普通に使われるプライマー類が使用される。末端シークエンシングにより完全には配列決定されない挿入断片については、色素標識ターミネーターまたはカスタムプライマーを用いて、残りのギャップに充填することが可能である。
検出された配列差異は正確さについて最初にチェックするが、それは例えば、栽培化配列と祖先配列との間に差異がある点を見いだすこと；栽培化生物に独特と思われる塩基が、当該コールド塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、当該配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックすること；配列変化に対応する１つ以上の配列があるかどうかを見るために、当該栽培化生物のヒットをチェックすること；および必要なら、当該技術分野で知られる他の方法、による。同じ遺伝子について祖先ではヌクレオチドが異なっている位置に同じヌクレオチドをもつ複数の栽培化生物配列が見つかったなら、それは当該栽培化配列が正確であること、そしてその栽培化／祖先差異が本物であることの独立した裏付けを提供する。そうした変化は、これらのＤＮＡ配列変化が、そのコードタンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかどうかを決定するために、公共または商業データベース情報および当該遺伝コードを用いて調べられる。当該配列はまた、当該コードタンパク質の直接配列決定によっても調べることができる。
（実施例３）：分子進化分析
比較されている栽培化（家畜化）植物または動物配列はＫA／ＫS分析に付す。本分析では、Ｌｉ９３およびＩＮＡのような、公共的にまたは商業的に入手可能なコンピュータープログラムを使って、上記のように検討中の各配列について、部位当りの同義変化の数（ＫS）により部位当りの非同義変化の数（ＫA）を割って決定する。完全長コード領域またはコード領域の部分セグメントを使用可能である。ＫA／ＫS比が高ければ高いほど、配列は適応進化を受けてきた可能性が多い。ＫA／ＫS値の統計有意性は、ｔ検定のような確立された統計的方法および入手可能なプログラムを用いて決定する。
高ＫA／ＫS比の有意性に対する支持をさらに与えるために、検討中の栽培化配列を、他の進化的に近縁種に比較してもよい。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の近縁種に比較して、栽培化（家畜化）植物または動物種系列に独特であるかどうかについての、さらなる識別を可能にする。当該配列はまた、栽培化（家畜化）植物または動物に当該配列がどの程度保存されているかを評価するために、いくつかの多様な栽培化集団の代表者からの関心ある遺伝子を直接配列決定することによって、調べることも可能である。
（実施例４）：ｃＤＮＡライブラリー構築
テオシンテｃＤＮＡライブラリーは、全テオシンテ１日齢実生または他の適切な植物組織を用いて構築される。全ＲＮＡは当該実生組織から抽出され、そして当該ＲＮＡの完全性および純度は慣用の分子クローニング方法に従って決定される。ポリＡ＋ＲＮＡが選択され、そしてプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）とともに、ｃＤＮＡの逆転写用の鋳型として使用される。合成されたｃＤＮＡは、商業的に入手可能なキットを用いて、クローニング用に処理し、修飾される。次に、組み換え体をパッケージし、宿主細胞系中で増殖させる。当該パッケージングミックスの一部を増幅し、そして残りは増幅前に保存する。組み換え体ＤＮＡは、確立された方法を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞にトランスフェクトするのに使われる。当該ライブラリーは標準化可能であり、そして当該ライブラリー中の独立組み換え体の数を決定する。
（実施例５）：配列比較
当該ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択されたテオシンテ実生ｃＤＮＡクローンは、ＡＢＩ３７７のような自動シークエンサーを用いて配列決定する。当該配列決定を行うには、Ｍ１３ ＵｎｉｖｅｒｓａｌおよびＲｅｖｅｒｓｅプライマー類のようなクローニングベクター上に普通に使われるプライマー類が使用される。末端シークエンシングにより完全には配列決定されない挿入断片については、色素標識ターミネーターを用いて、残りのギャップに充填するために使われる。
その結果得られたテオシンテ配列は、データベース検索を経由して、栽培化メイズ配列に比較される。ゲノムデータベースは、メイズを含む多数の種について公共的にまたは商業的に入手可能である。メイズデータベースの１つの例は、ミゾウリ大学のウェブサイトｔｈｅ ＭａｉｚｅＤＢ ｗｅｂｓｉｔｅで見いだすことも可能である。ＭａｉｚｅＤＢは、メイズゲノムおよびその発現に関する最近の知識への公共インターネットゲートウェイである。他の適切なメイズＥＳＴ（発現配列タグ）データベースは、私的に所有され、そして維持されている。高いスコアリング“ヒット”、すなわち、ホモロジー分析後に有意の（例えば、＞８０％）類似性を示す配列が、検索され、そして分析される。次に２つの相同配列が、Ｈｉｇｇｉｎｓらにより開発されたアラインメントプログラムＣＬＵＳＴＡＬ Ｖを用いて、整列される。ヌクレオチド置換、挿入、および欠失を含む、いかなる配列差異をも、当該アラインメントにより検出そして記録することが可能である。
検出された配列差異は正確さについて最初にチェックされるが、それは、テオシンテとメイズの配列に差異がある点を見いだすこと；メイズに独特と思われる塩基が、当該コールド塩基に特異的な強い鮮明なシグナルに対応するかどうかを決定するために、当該配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックすること；配列変化に対応する１つ以上のメイズ配列があるかどうかを見るために、メイズヒットをチェックすること；および必要なら、当該技術分野で知られる他の方法、による。同じ遺伝子についてテオシンテではヌクレオチドが異なる位置に、同じヌクレオチドをもつの複数のメイズ配列が見つかれば、それは当該メイズ配列が正確であること、そしてそのテオシンテ／メイズ差異が本物であることの独立した裏付けを提供する。そうした変化は、これらのＤＮＡ配列変化が、そのコードタンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかどうかを決定するために、公共／商業データベース情報および当該遺伝コードを用いて、調べられる。当該配列はまた、当該コードタンパク質の直接配列決定によっても調べることができる。
（実施例６）：分子進化分析
比較されているテオシンテおよびメイズ配列は、ＫA／ＫS分析に付す。本分析では、Ｌｉ９３およびＩＮＡのような、公共的にまたは商業的に入手可能なコンピュータープログラムを使って、上記のように検討中の各配列について、部位当りの同義変化の数（ＫS）により部位当りの非同義変化の数（ＫA）を割って決定する。この比、ＫA／ＫSは、検討中の配列で、適応進化、すなわち、正の選択が作用してきた程度の反映であることが、示されている。典型的には、これらの比較分析では、完全長コード領域が使われてきた。しかし、コード領域の部分セグメントも有効に使用可能である。ＫA／ＫS比が高ければ高いほど、配列は適応進化を受けてきたことの可能性が多い。ＫA／ＫS値の統計有意性は、ｔ検定のような確立された統計的方法および入手可能
なプログラムを用いて決定される。テオシンテとメイズとの遺伝子の間で統計的に高いＫA／ＫS比を示すそれらの遺伝子は、適応進化を受けた可能性が非常に高い。
高ＫA／ＫS比の有意性に対する支持をさらに与えるために、検討中の当該配列を、他の祖先メイズ種に比較してもよい。これらの比較は、当該適応進化的変化が、他の祖先に比較して、栽培化メイズ系列に独特であるかどうかについての、さらなる識別を可能にする。当該配列はまた、メイズ種に当該配列がどの程度保存されているかを評価するために、いくつかの多様なメイズ集団の代表者からの関心ある遺伝子の直接配列決定によって、調べることも可能である。
（実施例７）：データベースから得られたメイズおよびテオシンテ相同配列へのＫA／ＫS法の適用
Ｇｅｎｂａｎｋ上で入手可能な栽培化メイズおよびテオシンテ配列（ｔｈｅ Ｅｎｔｒｅｚ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｅｂ ｓｉｔｅを通じてアクセス可能）の比較は、少なくとも４つの相同遺伝子：ｗａｘｙ，Ａ１*，Ａ１およびｇｌｏｂｕｌｉｎを明らかにし、それらについての配列はメイズおよびテオシンテの両方から入手可能であった。メイズおよびテオシンテの両方についてのこれらの遺伝子についてのすべての入手可能な配列を比較した。当該ＫA／ＫS比は、Ｌｉ９３および／またはＩＮＡを用いて決定した：
Figure 2005518199
メイズに観察された多型性（複数の対立遺伝子コピー）および／または倍数性（細胞当り２セット以上の染色体）は、ＫA／ＫS分析を複雑または困難にするかも知れないと予想されたが、そうではないことがわかった。
上記のＫA／ＫS値は、これらの遺伝子が正に選択されないことを示しているが、本例は、ＫA／ＫS法がデータベースから得られたメイズおよびそのテオシンテ配列に適用可能なことを例証している。
（実施例８）：トランスジェニック植物を用いるタンパク機能の研究
実施例４−７の方法に従って得られた正に選択されたメイズ遺伝子の機能的役割は、トランスジェニックメイズ植物中で当該遺伝子の各対立遺伝子の評価を実施することにより、評価可能である。トランスジェニック植物は、Ｐｅｎｇら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：２５６−２６１に記載の方法の応用を用いて、作出が可能である。当該トランスジェニック植物またはそのタンパク抽出物の生理学的、形態学的および／または生化学的検討は、特定の表現型と各対立遺伝子との関連づけを可能にするはずである。
（実施例９）：ＱＴＬｓへの正に選択された遺伝子のマッピング
ＱＴＬ（量的形質遺伝子座）分析は、植物の高さおよび油含量を含む、メイズにおける興味あるいくつかの表現型的形質を制御する遺伝子を含む染色体領域を決定した。本法により同定された正に選択された各遺伝子を既知ＱＴＬｓの１つの上に物理的にマッピングすることにより、正に選択された各遺伝子により制御される特定の形質を、迅速かつ確実に同定可能である。
（実施例１０）：新遺伝子ＥＧ３０７の発見
規準化されたｃＤＮＡライブラリーを、現代イネの祖先であることがわかっている種、Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎの（葉、円錐花序、および茎を含む）プールした組織から構築した。ＰＢＩ０３０７Ｈ９と呼ぶクローンをまず、ＭｅｇａＢＡＣＥ １０００シークエンサー（ＡＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で高性能配列決定プロジェクトの一部として、配列決定した（配列番号８９）。このクローンの配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索で、クエリー配列として使用した。４つの無名コメＥＳＴｓ（アクセス番号ＡＵ０９３３４５，Ｃ２９１４５，ＩＳＡＪ０１６１，ＡＵ０５６７９２）がヒットとして検索された。さらなる配列決定は、ＰＢＩ３０７Ｈ９が部分ｃＤＮＡクローンであることを明らかにした。ＰＢＩ３０７Ｈ９は、ＧｅｎＢａｎｋ中の栽培化イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）ＥＳＴｓに比較すると、高いＫA／ＫS比をもっていた。ｃＤＮＡ増幅および配列決定は次のように行った：全ＲＮＡは、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（ＮＳＧＣ５９５３株）およびＯ．ｓａｔｉｖａ栽培品種Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ（Ｑｕｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃７４９０３）から単離した。第１鎖ｃＤＮＡは、ｄＴプライマー（ＡＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃２７−９２６３−０１）を用いて合成し、そして次にＰＣＲ分析（Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃２０３４４５）に使用した。
命名を簡単にするために、クローンＰＢＩ０３０７Ｈ９に含まれる遺伝子は、本実施例および明細書を通して、ＥＧ３０７と名付ける。当初、最終的配列確認前は、現代イネ（Ｏ．ｓａｔｉｖａ）および祖先イネ（Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ）ＥＧ３０７由来のＥＧ３０７についてのＫA／ＫS比は１．７であった。
これらの部分配列がＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよびＯ．ｓａｔｉｖａの両方で確認された後、この遺伝子の５’末端を得るために遺伝子特異的プライマーを用いて、５’ＲＡＣＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃Ｋ１８１１−１）を行った。ＥＧ３０７と呼ぶ当該完全遺伝子は、長さ１３４４ｂｐ（塩基対）のコード領域をもつ。Ｏ．ｓａｔｉｖａおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ中の完全ＥＧ３０７ ＣＤＳ（１３４４ｂｐ）の最終確認は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよびＯ．ｓａｔｉｖａの多数の株のペアワイズ比較を可能にした。これらの比較の多くは、１より大きいＫA／ＫS比をもたらし、いくつかは統計的に有意であった。これは、ＥＧ３０７遺伝子への正の選択の役割についての、説得力のある証拠である。祖先イネに課された選択圧はヒトによって課されたので、これは、ＥＧ３０７が、イネのヒトによる栽培品種化の間に選択された遺伝子であるという、説得力のある証拠である。ＥＧ３０７に対する相同体は、ＧｅｎＢａｎｋの非重複部門へのＢＬＡＳＴ検索によっては、全く同定されず、そして上述のように、僅か４つのイネ遺伝子が、ＧｅｎＢａｎｋのＥＳＴ部門でのＢＬＡＳＴにより同定された（ＡＵ０９３３４５，ＡＵ０５６７９２、Ｃ２９１４５，およびＩＳＡ０１６１）。これら４ＥＳＴｓいずれも、本質的には特徴解明はされなかった。
（実施例１１）：ＥＧ３０７の別のＫA／ＫS分析
ＥＧ３０７遺伝子についてＯ．ｓａｔｉｖａ中に存在する遺伝的多様性の程度を確かめるため、Ｑｉａｇｅｎのプロトコル（ＤＮａｅｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃６９１０３）を用いて、Ｏ．ｓａｔｉｖａのいくつかの異なる株（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｍａｌｌ Ｇｒａｉｎｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄ．Ａ．Ａｂｅｒｄｅｅｎ，アイダホから入手）から、ゲノムＤＮＡを単離した。次に、６つの異なるＯ．ｓａｔｉｖａ株：Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ，Ｌｅｍｏｎｔ，ＩＲ６４，Ｔｅｑｉｎｇ，Ａｚｕｃｅｎａ，およびＫａｓａｌａｔｈからのゲノムＤＮＡ中で、ＥＧ３０７を配列決定した。これらの株のそれぞれのＫA／ＫS比は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎに比較すると、変化していた。表１は、コード領域の全１３４４塩基についての結果を示す。
表１ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（ＩＲＧＣ１０５４９１株）対調べた全Ｏ．ｓａｔｉｖａ株についての全ＣＤＳ ＫA／ＫS比
Figure 2005518199
Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎとこれらの全Ｏ．ｓａｔｉｖａ株との間には非翻訳（ＵＴＲ）領域に相違があった。その広い範囲のＫA／ＫS比は、それらのＯ．ｓａｔｉｖａ株間の交雑育種の異なる程度のためと考えられた。それらの栽培化株とＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎとの間の交雑育種のために、いくつかのものは、他のものより、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎに似ていた。スライディングウインドウ分析（すべり窓分析、ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｎａｌｙｓｉｓ）を、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎＥＧ３０７のタンパク質コード領域と、われわれが配列決定したＯ．ｓａｔｉｖａ株のそれぞれのタンパク質コード領域との間で、すべてのペアワイズ比較について実施した。これは、栽培化の間に選択された当該タンパク質の特定領野の同定を可能にした。そうした正確な位置決めは、祖先タンパク質と栽培化子孫作物植物の当該タンパク質との間で重要である変化の特徴解明への標的アプローチを可能にするだろう。これは、収量増加を目的として、前記タンパク質のこれらの肝要なドメインを標的にする作用物質を開発することを可能にすると思われる。
前記「ウインドウ」の長さは、大部分の場合、１５０ｂｐで、隣のウインドウと５０ｂｐの重複があった。（したがって、例として、もしＣＤＳの５’末端から読取ると、第１ウインドウは長さ１５０ｂｐで、その３’側への隣接第２ウインドウも同じ長さであった。第２ウインドウも１５０で、第２ウインドウの５’末端で５０ｂｐだけ第１ウインドウに重複し、そして第３ウインドウも長さ１５０ｂｐで、第３ウインドウの５’末端で５０ｂｐだけ第２ウインドウに重複していた。このように、第２ウインドウは、各５０ｂｐづつその両隣接ウインドウと重複していた）。加えて、ＣＤＳをほぼ半分に分割して、第２のウインドウ分析も行った。これにより、ヌクレオイドのより大きな試料サイズが可能になり、その結果、正確な統計的サンプリングの実施が可能である。また、留意すべきは、ＫA／ＫSは慣用的には比率として表示されるが、実際には、「ＫA値は、統計的に有意な量だけＫS値を超えているのか？」を尋ねる仕方であることである。したがって、（栽培化は約７０００−８０００年に過ぎないので）祖先イネ対現代イネの比較ではよくあるように、ＫS＝０の場合、当該分数の分母がゼロに等しくなるので、比は計算できない。しかしそうした比較でもなお、もし（ＫA−ＫS）差が統計的に有意であれば、正の選択の作用を検出することも可能である。したがって、以下の表に示すいくつかの比較について、その比較が統計的に有意であれば、正の選択が検出可能である。ＫA／ＫS比が有意であるそれらの比較と同様に、これらは太字で示してある。
ヌクレオチド置換過程の確率的な性質の結果として、現代イネ株に対する必ずしもすべての比較が正の選択の証拠を明らかにするとは思われず、とくにＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎと現代Ｏ．ｓａｔｉｖａとの間にいくつかのの交雑育種が起ったことがわかっているだけに、そうであることも注目しなければならない。
表２ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（ＮＳＧＳ５９４８株）対Ｏ．ｓａｔｉｖａ“Ｎｉｐｐｏｎｎｂａｒｅ”株についてのスライディングウインドウＫA／ＫS比。すべての統計的に有意の比較は太字で示してあるのに、注目されたい。
Figure 2005518199
第１大ウインドウを用いた場合、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎとＮｉｐｐｏｎｂａｒｅとの間の比較で示される正の選択について統計的支持があることに、ここで注目することが大切である。これは、祖先Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、および栽培化Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株）ＥＧ３０７相同体間に（ヒト栽培化の結果として）正の選択が生じたことの、よい証拠である。上述のように、ヌクレオチド置換過程の確率的な性質の結果として、現代イネ株に対する必ずしもすべての比較が正の選択の証拠を明らかにするとは思われない。さらに、上述のように、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎといくつかの栽培化株との間に交雑育種が起ったことが、選択のシグナルを一層曖昧にしている。しかし、本分析が明らかにしているのは、正の選択がＥＧ３０７遺伝子に生じたことである。
表３ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＳＧＳ５９４８株、対Ｏ．ｓａｔｉｖａ（“Ｌｅｍｏｎｔ”株）についてのスライディングウインドウＫA／ＫS比。すべての統計的に有意の比較は太字で示してあるのに、注目されたい。
Figure 2005518199
第１大ウインドウを用いた場合、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎとＬｅｍｏｎｔとの間の比較で示される正の選択について統計的支持があることに、ここで注目することが大切である。これは、祖先Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、および栽培化Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ｌｅｍｏｎｔ株）ＥＧ３０７相同体間に（ヒト栽培化の結果として）正の選択が生じたことの、よい証拠である。上述のように、ヌクレオチド置換過程の確率的な性質の結果として、現代イネ株に対する必ずしもすべての比較が正の選択の証拠を明らかにするとは思われない。さらに、上述のように、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎといくつかの栽培化株との間に交雑育種が起ったことが、選択のシグナルを一層曖昧にしている。しかし、本分析が明らかにしているのは、正の選択がＥＧ３０７遺伝子に生じたことである。
表４ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＳＧＳ５９４８株、対Ｏ．ｓａｔｉｖａ（“ＩＲ６４”株）についてのスライディングウインドウＫA／ＫS比。すべての統計的に有意の比較は太字で示してあるのに、注目されたい。
Figure 2005518199
Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎからの、およびＯ．ｓａｔｉｖａ ＩＲ６４株からの、ＥＧ３０７のタンパク質コード領域は同一であり、それゆえＫA／ＫS値はゼロに等しいことに注目されたい。ＩＲ６４は低収量現代株（私信、Ｓｈａｎｎｏｎ Ｐｉｎｓｏｎ，遺伝学研究員、ＵＳＤＡ−ＡＲＳ Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ，Ｂｅａｕｍｏｎｔ，テキサス）で、野生Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎとの大量の交雑が疑われている。
表５ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＳＧＳ５９４８株、対Ｏ．ｓａｔｉｖａ（“Ｔｅｑｉｎｇ”株）についてのスライディングウインドウＫA／ＫS比。すべての統計的に有意の比較は太字で示してあるのに、注目されたい。
Figure 2005518199
Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよびＯ．ｓａｔｉｖａ Ｔｅｑｉｎｇ株からのＥＧ３０７配列間の比較は、１より大きいＫA／ＫS比を示さないことに注目されたい。しかし上述のように、ヌクレオチド置換過程の確率的な性質の結果として、現代イネ株に対する必ずしもすべての比較が正の選択の証拠を明らかにするとは思われない。さらに上述のように、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎといくつかの栽培化株との間に交雑育種が起ったことが、選択のシグナルを一層曖昧にしている。
表６ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＳＧＳ５９４８株、対Ｏ．ｓａｔｉｖａ（“Ａｚｕｃｅｎａ”株）についてのスライディングウインドウＫA／ＫS比。すべての統計的に有意の比較は太字で示してあるのに、注目されたい。
Figure 2005518199
第１大ウインドウを用いた場合、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎとＡｚｕｃｅｎａとの間の比較で示される正の選択について統計的支持があることに、ここで注目することが大切である。これもまた、祖先Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ、および栽培化Ｏ．ｓａｔｉｖａ（Ａｚｕｃｅｎａ株）ＥＧ３０７相同体間に（ヒト栽培化の結果として）正の選択が生じたことの、よい証拠である。上述のように、ヌクレオチド置換過程の確率的な性質の結果として、現代イネ株に対する必ずしもすべての比較が正の選択の証拠を明らかにするとは思われない。さらに、上述のように、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎといくつかの栽培化株との間に交雑育種が起ったことが、選択のシグナルを一層曖昧にしている。しかし、本分析がもう一度明らかにしているのは、正の選択がＥＧ３０７遺伝子に生じたことである。
表７ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＳＧＳ５９４８株、対Ｏ．ｓａｔｉｖａ（“Ｋａｓａｌａｔｈ ４”株）についてのスライディングウインドウＫA／ＫS比。すべての統計的に有意の比較は太字で示してあるのに、注目されたい。
Figure 2005518199
スライディングウインドウはＫａｓａｌａｔｈ ４についてのみ示されているのに、注目されたい。本配列には４つの対立遺伝子差があり（Ｋａｓａｌａｔｈ １、２、３、および４と呼ぶ）、そしてそれらは単一ヌクレオチドだけの違いなので、簡明のために、１つだけを示すように選んだ。しかし、全ＣＤＳ配列のそれぞれについてＫA／ＫS比を示してある。Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよびＯ．ｓａｔｉｖａ Ｋａｓａｌａｔｈ株からのＥＧ３０７配列間の比較は、１より大きいＫA／ＫS比を示さないことに注目されたい。しかし上述のように、ヌクレオチド置換過程の確率的な性質の結果として、現代イネ株に対する必ずしもすべての比較が正の選択の証拠を明らかにするとは思われない。さらに、上述のように、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎといくつかの栽培化株との間に交雑育種が起ったことが、選択のシグナルを一層曖昧にしている。
Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎのＮＳＧＣ５９５３株におけるＥＧ３０７の配列決定が完了したので、その完成配列を用いて増幅プライマーを設計した。次いでこれらのプライマーはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いて、ＮＳＧＣ５９４８，ＮＳＧＣ５９４９，およびＩＲＧＣ１０５４９１を含む、いくつかの他のＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ株からのＥＧ３０７遺伝子を増幅した。増幅されたＥＧ３０７遺伝子は、次いで、これらの株のそれぞれについて配列決定した。
（実施例１２）：ＥＧ３０７のマッピング
ＥＧ３０７は次に物理的にイネ中にマッピングされた。クレムソン大学は、イネＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ細菌性人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを開発した；Ｂｕｄｉｍａｎ，Ｍ．Ａ．１９９９，「２つのモデル作物、トマトおよびイネについての深度網羅ＢＡＣライブラリーの構築と特性解明、およびトマト中のｊｏｉｎｔｌｅｓｓ−２への染色体歩行の開始」、博士論文、Ｔｅｘａｓ Ａ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，テキサス、を参照されたい。ライブラリークローンはハイブリダイゼーションフィルターの形でクレムソンから入手可能である。
スクリーニングに用いた２つの異なるイネＢＡＣライブラリーは、クレムソン大学ゲノミクス研究所（ＣＵＧＩ）から購入した。ＯＳＪＮＢａライブラリーは、ジャポニカイネ株（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ品種）のゲノムＤＮＡからＣＵＧＩで構築され、そして１１ゲノム相当をカバーする、１３０ｋｂの平均インサートサイズをもつ。これは、国際イネゲノム配列決定プロジェクト用の最も広く使われているライブラリーの１つである。それは、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１のＨｉｎｄＩＩＩサイト中に構築され、そして３６８６４クローンを含む。ＯＳＪＮＢｂライブラリーもまた、ジャポニカイネ株（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ品種）のゲノムＤＮＡからＣＵＧＩで構築され、そして１５ゲノム相当をカバーする、１２０ｋｂの平均インサートサイズをもつ。これは、国際イネゲノム配列決定プロジェクト用の最も広く使われているライブラリーのもう１つである。それは、ｐＩｎｄｉｇｏＢａｃ５３６のＥｃｏＲ１サイト中に構築され、そして５５２９６クローンを含む。
ＤＩＧプロトコル（ＢＭＢ−Ｒｏｃｈｅ ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｃａｔ＃１６３６０９０）は、ユニークなＥＧ３０７ ４９４ｂｐ ＰＣＲ産物（プライマー：５’−ＧＡＧＴＴＣＡＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＧＣＡ−３’（配列番号８７）および５’−ＣＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＴＧＧ−３’）（配列番号８８）の標識に成功し、イネＢＡＣフィルターに対してスクリーンするために使用された。当該ブロットは、ＤＩＧプロトコル（ＢＭＢ−Ｒｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｃａｔ＃１６３６０９０）当りとして、化学ルミネッセンスを用いて容易に検出された。２つの異なるＯ．ｓａｔｉｖａライブラリー、ＯＳＪＮＢａおよびＯＳＪＮＢｂは、ＯＳＪＮＢｂライブラリーをカバーする３つ、そしてＯＳＪＮＢａライブラリーをカバーする２つの、合計５つの異なるフィルターについてスクリーンされた。表８は、全３スクリーンにより同定された個々のＢＡＣｓを示す：
表８ ＥＧ３０７ ４９４ｂｐ ＰＣＲ産物によるＢＡＣライブラリーの全スクリーンで同定された個々のＢＡＣｓ。
Figure 2005518199
特定のコンティグ（整列群、ｃｏｎｔｉｇ）または染色体へのある遺伝子の物理的マッピングを可能にする基準データは、当業者には知られており、そしてフィルターセットまたはＣＵＧＩからのライブラリーの購入者にはウェブページ上で知らされ利用できる。やはり３番染色体上にあるコンティグ１１３にも、いくつかの微かな、有意ではないハイブリッド形成があった。
イネコンティグ８０は、３番染色体上にあり、そして６６ＢＡＣｓと７マーカーを含んでいた。コンティグ８０内のすべてのこれらのＢＡＣｓの重複により判断すると、ＥＧ３０７は、３番染色体の短腕上のマーカーＣＤＯ１３８７の上流、約２００ｋｂにあった。
ＵＳＤＡ−ＡＲＳにより開発され、そして展示された、公共的にアクセス可能なゲノムデータベースで、以前ＲｉｃｅＧｅｎｅｓ中にあったデータは、現在はＧｒａｍｅｎｅ中に組込まれている。最近、Ｇｒａｍｅｎｅは、ＵＳＤＡ ＩＦＡＦＳプログラムにより資金提供され、イネ科植物における比較ゲノム分析のための、展示された公開源のＷｅｂアクセス可能なデータ資源を作製した。それは、コーネル大学、日本イネゲノム研究プログラム（ＪＲＧＰ）、および韓国イネゲノム研究プログラム（ＫＲＧＲＰ）からのイネ遺伝子地図のコレクション、ならびに他のイネ科植物（メイズ、オートムギ、およびコムギ）からの地図との比較、を提供する。ＣＤＯ１３８７マーカーは、ＲｉｃｅＧｅｎｅｓウェブサイトを用いていくつかの異なるイネ地図にマッピングされた。
いくつかのＱＴＬｓもこの領域にマッピングされたが、それらの多くはかなり広い範囲を占め、当該染色体のほとんど全体をカバーしていた。１０００粒重量について十分実証された１つのＱＴＬは、３番染色体のこの領域にマッピングされ、そしてマーカーＲＺ６７２と付随していた（Ｓ．Ｒ．ＭｃＣｏｕｃｈら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０：８９９−９０９、９８年１０月）。１つの地図（Ｒ３）上で、ＣＤＯ１３８７は３０．４ｃＭにマッピングされ、ＲＺ６７２は３９ｃＭにマッピングされ、そしてこれらのマーカーは両方とも、４つの他のイネ地図（Ｒｉｃｅ−ＣＵ−３，３ＲＣ９４，３ＲＣ００，および３ＲＷ９９）において同じような範囲でマッピングされた（図５）。したがって、ＥＧ３０７はこのＱＴＬマーカーの〜１０ｃＭ以内にあった。Ｒ３地図はまた、２１．４５ｃＭ−２１．９５ｃＭにマッピングされたＢＡＣ，ＯＳＪＮＢａ００９１Ｐ１１ももっていた。ＥＧ３０７は、イネＢＡＣライブラリーのスクリーニングで、このＢＡＣおよび同じコンティグ中の他のいずれについてもネガティブであった。当該イネの粒重量ＱＴＬ領域はまた、イネとメイズとの間のいくつかの遺伝子相同性研究にも含まれていて（Ｗ．Ａ．Ｗｉｌｓｏｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５３（１）：４５３−４７３、９９年９月）、その研究ではイネ染色体３Ｓとメイズ染色体１Ｓおよび９Ｌとの間の遺伝子相同性（ｓｙｎｔｅｎｙ）が示された。
（実施例１３）：メイズおよびテオシンテ中のＥＧ３０７の同定
（イネＥＧ３０７配列を用いた）ＢＬＡＳＴによるＧｅｎＢａｎｋ中のメイズゲノムの検索は、２つのメイズＥＳＴｓ，アクセス番号ＢＥ５１１２８８およびＢＧ３２０９８５、を同定したが、それらは相同のようであった。メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）およびテオシンテ（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ）ＥＧ３０７相同体（配列番号３５により表される提案オープンリーディングフレームをもつ、配列番号３３および配列番号３４、および配列番号６７により表される提案オープンリーディングフレームをもつ、配列番号６６）の増幅成功を可能にしたプライマーを設計した。（メイズおよびテオシンテについてのタンパク質配列が推定された；そして配列番号３６および配列番号６８で表される）。表９は、メイズとテオシンテとの間の比較についてのＫA／ＫS推定値を示す。
表９ テオシンテ（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ）対現代メイズ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）についてのＫA／ＫS比。
Figure 2005518199
これらのＫA／ＫS値は、１より大きい比を示していないが、なお正の選択の証拠がある。祖先イネとその現代栽培化子孫との間のすべてのアミノ酸交換が特性解明され、そして同じ分析がテオシンテとその子孫である現代メイズについて行われた。栽培化の両（独立した）ケースで、一定のパターンが観察される：すなわち、祖先植物（テオシンテまたは祖先イネ）に比較して、現代作物（メイズまたはイネのいずれか）におけるほとんどすべてのアミノ酸交換は、荷電／極性の増加、溶解性の増加、および疎水性の減少をもたらしている。これら２つの独立の栽培化事象で、このパターンが偶然に生じたとは極めて考えにくい。これは、これらの交換が、ヒトによる栽培化に対する同様な応答であったこと、を示唆している。これは、ＥＧ３０７が、これら２つの穀類のヒト栽培化の結果として選択されたことの、強力な証拠である。
テオシンテの１株中のＥＧ３０７の配列決定が完成した段階で、その完成した配列を使って、増幅プライマーを設計した。これらのプライマーを次に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いて、いくつかの他のテオシンテ株、ならびに現代メイズのいくつかの株からＥＧ３０７遺伝子を増幅した。増幅されたＥＧ３０７遺伝子は次に、これらの株のそれぞれについて配列決定した。
前述の発明は、明瞭さと理解の目的のために、イラストおよび実施例によって詳しく記載したが、ある種の変更および修飾が実施可能なことは、当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲は前記の説明および実施例によって限定されず、特許請求の範囲の記載により定まると解釈すべきである。
（実施例１４）：新遺伝子ＥＧ１１１７の発見およびＫAＫS分析
クローンＩＷＦ１１１７Ｈ５（以下ＥＧ１１１７と呼称）は、ＭｅｇａＢＡＣＥ１０００シークエンサー（ＡＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で行われた、ＥＧの高性能配列決定プロジェクトの際に、まず、配列決定された。本クローンは、祖先イネＯｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎからの材料から構築された、基準ｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）から配列決定された。ＧｅｎＢａｎｋ ＢＬＡＳＴの結果、３つの無名のイネＥＳＴｓ（ＡＵ０５５８８４，ＡＵ０５５８８５，ＢＩ８０８３６７）、２つの無名のトウモロコシＥＳＴｓ（ＡＩ７８３０００，ＡＷ０００２２３）、および２つの無名のコムギＥＳＴｓ（ＢＥ４４４４５６，ＢＥ４４３８４５）をヒットした。さらなる配列決定は、ＩＷＦ１１１７Ｈ５が部分ｃＤＮＡクローンであることを明らかにした。それは、ＧｅｎＢａｎｋで栽培化イネＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ＥＳＴｓに比較した場合、ゼロにより割られるＫA／ＫS比をもっていた。
ゲノムＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎのプロトコル（ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃６９１０３）に従い、０．ｓａｔｉｖａのいくつかの異なる栽培品種から単離した。全ＲＮＡは、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよび０．ｓａｔｉｖａ Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ栽培種から単離した（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃７４９０３）。第１鎖ｃＤＮＡはｄＴプライマー（ＡＰ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ Ｔ−Ｐｒｉｍｅｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃２７−９２６３−０１）を用いて合成し、そしてそれから、ＰＣＲ分析（Ｑｉａｇｅｎ ＨｏｔＳｔａｒ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ：ｃａｔ＃２０３４４５）に使用した。これらのプロトコルはまた、Ｚｅａ ｍａｙｓ（メイズ）、Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（テオシンテ）に、およびＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ（現代コムギ）にも行った。
これらの部分配列がＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよび０．ｓａｔｉｖａの両者で確認されたので、本遺伝子の５’末端を得ようと試みて、逆ＰＣＲを遺伝子特異的プライマーで行った。これまでのところ、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎおよび０．ｓａｔｉｖａ中のＣＤＳの１６５９ｂｐ（図６および７）が同定されている。この部分配列は、終止コドンを含む。
次にＥＧ１１１７は、６つの異なる０．ｓａｔｉｖａ株：Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ，Ｌｅｍｏｎｔ，ＩＲ６４、Ｔｅｑｉｎｇ，Ａｚｕｃｅｎａ，およびＫａｓａｌａｔｈからのゲノムＤＮＡ中で部分的に配列決定した。これらの株のそれぞれについてのＫA／ＫS比は、Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ５９４８株に比較すると、異なっていた。コード領域の１６５６塩基についてのＫA／ＫS比は、次のとおりである：
表１０ Ｏ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ ＮＳＧＣ５９４８株対０．ｓａｔｉｖａの各種株についてのＫA／ＫS比。
Figure 2005518199
この広範囲のＫA／ＫS比は、０．ｓａｔｉｖａ株間の交雑育種の量によると考えられる。あるものはＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎに類似するが、それはＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎと栽培化株との交雑育種のためである。
０．ｓａｔｉｖａ Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株の推定タンパク質配列を使って、ＢＬＡＳＴ検索を実施した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＰＴＲ２−Ｂ（ヒスチジン輸送タンパク質、ＮＰ １７８３１３）（配列番号１７０）に対する非常に強いタンパク質ＢＬＡＳＴヒットは、ＣＤＳの僅か約３０コドンのみがイネ配列から消失していることを、示唆する（図８）。
ホモロジー検索結果は、ＥＧ１１１７遺伝子が、真菌、植物、昆虫、および哺乳動物を含む、広範囲の種に見られるペプチド輸送タンパク質のファミリーに非常に似たタンパク質をコードすること、を示唆している。（Ｋｏｈら，（２００２）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２８：２１−２９；Ｈａｕｓｅｒら，（２００１）Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１８：１０５−１２；Ｈａｕｓｅｒら，（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３０３７−４２；Ｌｕｂｋｏｗｉｔｚら，（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３−３８７−９６；Ｓｔｅｉｎｅｒら，（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６：８２５−３４を参照）。ＥＧ１１１７は、１２の推定膜貫通ドメイン領域をもつらしい、５７７アミノ酸のタンパク質をコードする。ＥＧ１１１７のＫA／ＫS分析は、ＥＧ１１１７遺伝子の少なくとも一部が、コメの栽培化の際に強く選択されたこと、を示唆する。
この特定のタンパク質は、たとえそれが、非常に多くのよく特徴解明されたペプチド輸送タンパク質に明瞭な構造相同性を示すとしても、ユニークなことは明らかである（Ｓｔｅｉｎｅｒら（１９９５））。当該配列は、本ファミリーのタンパク質に特徴的な推定１２回膜貫通ドメインをコードしているらしい。ＥＧ１１１７タンパク質は、明らかに、ペプチド輸送タンパク質だけでなく、オリゴペプチド輸送タンパク質、および硝酸輸送タンパク質にも、相同性をもつ（Ｌｕｂｋｏｗｉｔｚら，（１９９７）；Ｌｉｎら，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：３７９−８８；Ｗｅｓｔら，（１９９８）Ｐｌａｎｔ Ｊ．１５：２２１２２９）。他のタイプの輸送タンパク質に対する相同性はない。
ペプチド輸送タンパク質は内在性膜タンパク質で、ジ／トリペプチド輸送体の場合には、典型的に１２回膜貫通ドメインを含み、そしてオリゴペプチド輸送体の場合には、１２から１４回の膜貫通ドメインを含むらしい。ペプチド輸送タンパク質ファミリー（ＰＴＲファミリー）は、酵母および植物で広範囲に調べられている。典型的には、これらのタンパク質は、プロトン依存的な仕方で、細胞膜を横切るジ／トリペプチドまたはオリゴペプチドの輸送を助ける。これらの輸送者は、細胞膜を横切るペプチドの動きを、内側に向けられた電気化学的プロトン勾配の下へ、プロトンの動きに共役させ、ペプチドの輸送が基質勾配に逆らって起ることを可能にする（Ｎａｋａｚｏｎｏら，（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２９：４１２−１６；Ｍａｔｓｕｋｕｒａら，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４：８５−９３；Ｔｏｙｏｆｕｋｕら，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：９４０−４７；Ｈｉｒｏｓｅら，（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：１３８９−１３９６；Ｈｏｒｉｅら，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２７：１２９−３８）。ペプチド輸送体は、典型的には、すべてのありえるジおよびトリペプチドを配列非依存的に輸送する。すべてが、Ｄ−エナンチオマーを含むペプチドより、結合に高い親和性をもつアミノ酸のＬ−エナンチオマーを含むペプチドに、立体選択性を示す。今のところ、さまざまな輸送体の構造を、それらの基質特異性またはそれらの基質親和性に、関連させることはできない。
多くの異なるペプチド輸送タンパク質が、さまざまな種で同定されてきた。これらのタンパク質のグローバルアラインメント（ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）は、このファミリーのすべてのメンバーに典型的に見られる、一次アミノ酸配列中のモチーフを、研究者が同定することを可能にした。ペプチド輸送体ファミリーのＰＴＲ−２メンバー中に、第５膜貫通ドメイン（ＴＭＤ５）の保存性Ｆ−Ｙ−ｘ−ｘ−Ｉ−Ｎ−ｘ−Ｇ−Ｓ−Ｌ残基について名付けられた“ＦＹＩＮＧ”モチーフ、および膜貫通ドメイン１０（ＴＭＤ１０）のＷ−Ｑ−Ｉ−Ｐ−Ｑ−ＹモチーフまたはＥ−ｘ−Ｃ−Ｅ−Ｒ−Ｆ−ｘ−Ｙ−Ｙ−Ｇモチーフのいずれかが、同定されている（Ｂｅｃｋｅｔら，（２０００）「ペプチド：未来の波」中、 Ｍ．ＬｅｂｌおよびＲ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ編，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，９５７−５８）。興味深いことに、パン酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるＦＹＩＮＧモチーフの部位特異的変異誘発は、ジペプチドでの増殖の減弱、毒性ジペプチドに対する感受性の減少、および放射線標識ジロイシンの排除を起す。これらのデータは、ＦＹＩＮＧモチーフが、基質認識および／または転位に重要な役割を果すことを、示唆した。
植物の場合、ペプチド輸送体はペプチドおよび硝酸の栄養的取込みに大切であるだけでなく、これらの輸送体はオーキシン類、病原性毒素に対する応答、および他の発生過程にも影響するという証拠が、文献に掲載されている。シロイヌナズナのペプチド輸送体ＡｔＰＴＲ２の場合、根の成長が、この特定の輸送タンパク質により輸送されると考えられている有毒エチオニン含有ペプチドにより、影響されることが証明された（Ｓｔｅｉｎｅｒら，（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１２８９−９９）。その後の研究で、ＡｔＰＴＲ２−Ｂ遺伝子のセンスまたはアンチセンス構築体の組み換え体発現による、ＡｔＰＴＲ２−Ｂタンパク質の過剰発現または阻害のいずれかは、トランスジェニックシロイヌナズナ植物において開花の遅れおよび種子発生の停止を起すことが、示された（Ｓｏｎｇら，（１９７７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４：９２７−９３５）。これは、ペプチド輸送体が、植物の成長および発生の両方に極めて重大な影響を及ぼすことがあることを、示唆している。
推定ＥＧ１１１７ペプチド輸送体のさらなる分析は、他の代表的植物ＰＴＲ−２型タンパク質に比較して、ＦＹＩＮＧモチーフが、実際に、ＥＧ１１１７のＴＭＤ５に存在することを、証明している。加えて、ＥＧ１１１７は、他の代表的植物ＰＴＲ−２型タンパク質と同じく、ＴＭＤ１０にＷＱＶＰＱＹモチーフをもつ。ＤＩＡＬＩＧＮローカルアラインメントプログラム（Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ（１９９９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １５：２１１−２１８，により作製された多重配列アラインメントは、多様なＰＴＲ−２型植物タンパク質配列にほぼ９５％アラインメントがあり、イネＥＧ１１１７タンパク質とアミノ酸レベルで約７０％相同性をもつことを証明している。Ｏ．ｓａｔｉｖａおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎタンパク質では、僅か３つの非同義アミノ酸交換がある。これらの交換は、前記推定ペプチド輸送タンパク質の機能または特異性を劇的に変えることもある、構造的に有意の交換である。１つの場合では、グルタミン（極性、非荷電）からヒスチジン（塩基性）アミノ酸への変化である。他の２つの位置では、酸性のアスパラギン酸から非荷電のグリシンへの変化、および酸性のグルタミン酸から非荷電のグリシンへの変化が、見られる。全体として、３つの変化はすべて、より塩基性電荷プロフィールへのシフトである。
（実施例１５）：ＥＧ１１１７のマッピング
ＥＧ１１１７は次に物理的にイネ中でマッピングされた。ＤＩＧプロトコル（ＢＭＢ−Ｒｏｃｈｅ ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ ｃａｔ＃１６３６０９０）は、ユニークなＥＧ１１１７ ６５７ｂｐ ＰＣＲ産物（プライマー：５’−ＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴ−３’および５’−ＧＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＧＴ−３’）の標識に成功し、クレムソン大学からのイネＢＡＣフィルターに対してスクリーンするために使用された。当該ブロットは、ＤＩＧプロトコル（ＢＭＢ−Ｒｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｃａｔ＃１６３６０９０）どおり化学ルミネッセンスを用いて明確に検出された。２つの異なるＯ．ｓａｔｉｖａライブラリー（ＯＳＪＮＢａおよびＯＳＪＮＢｂ）は、合計２つの異なるフィルターについてスクリーンされた。下に、両スクリーンにより同定された個々のＢＡＣｓを示す：
表１１ ＥＧ１１１７ ＰＣＲ産物によるＢＡＣライブラリーの全スクリーンで同定された個々のＢＡＣｓ。
Figure 2005518199
イネコンティグ５８は、３番染色体上にあり、そして１８１個のＢＡＣｓと１５個のマーカーを含んでいる。ＥＧ１１１７は、マーカーＣＤＯ１３８７，Ｃ２３６，Ｃ８７５，Ｒ２７７８およびＲ２０１５と同じＢＡＣｓにマッピングされる。これらはすべて、地図３ＲＪ９８上の３５．８ｃＭにマッピングされる。このマーカーは、ＲｉｃｅＧｅｎｅｓまたはＧｒａｍｅｎｅウェブサイトによりアクセスすると、いくつかの異なるイネ地図にマッピングされる。また、この領域にマッピングされるいくつかのＱＴＬｓもある。１０００粒重量について十分実証された１つのＱＴＬは、３番染色体のこの領域にあり、そしてマーカーＲＺ６７２に付随している（ＭｃＣｏｕｃｈ，Ｓ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５０：８９９−９０９）。１つの地図上で、ＣＤＯ１３８７は３０．４ｃＭにマッピングされ、そしてＲＺ６７２は３９ｃＭにマッピングされ、そしてこれらのマーカーは両方とも、同じような範囲で、４つの他のイネ地図にマッピングされる。イネのこの領域はまた、イネとメイズとの間のいくつかの遺伝子相同性研究にも含まれていて（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５３（１）：４５３−４７３）、その研究でイネ染色体３Ｓとメイズ染色体１Ｓおよび９Ｌとの間の遺伝子相同性が示された。
（実施例１６）：ＥＧ３０７とＥＧ１１１７の関係
ＥＧ１１１７および既述の遺伝子ＥＧ３０７は、同じＣｌｅｍｓｏｎ ＢＡＣコンティグ５８にマッピングされる。ＥＧ１１１７は、ＥＧ３０７の約３ｃＭ上流のｐ腕の末端側に存在する。ＥＧ１１１７はコンティグ５８上のマーカーの多くと同じＢＡＣｓにマッピングされ、そしてＥＧ３０７は同じコンティグにマッピングされるが、そのポジティブＢＡＣｓに直接マッピングされるマーカーをもたない。
Ｒｉｃｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＲＧＰ），ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＮＩＡＳ）およびｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｔｅｃｈｎｏ−ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ（ＳＴＡＦＦ）の合同プロジェクト、およびＪａｐａｎｅｓｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｅ，Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ（ＭＡＦＦ）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍからのイネについての公開ＹＡＣ地図からのデータを用いて、別の分析を行った。 ＲＧＰデータベースは、これら２つの遺伝子（ＥＧ１１１７およびＥＧ３０７）を３番染色体上で２ｃＭ離して置いている。本ＹＡＣ地図はＰｌａｎｔ Ｃｅｌｌ誌に掲載が受理されている（Ｗｕ，Ｊ．ら、２００２ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，掲載前コピー）。ＢＬＡＳＴ検索（上記参照）上で、ＥＧ１１１７はＡＵ０５５８８４およびＡＵ０５５８８５をヒットしている。これらのＧｅｎＢａｎｋ ＥＳＴ エントリーは両方とも、ＹＡＣｓ Ｙ２５３３およびＹ５４８８にマッピングするクローンＳ２０１２６から来ている。これらのＹＡＣｓは、３３．５ｃＭで３番染色体にマッピングされるＳ１０９６８とつながっている。
これら２つの遺伝子の予想外の近接は、機能的関連の可能性を示唆する。ＥＧ３０７とＥＧ１１１７とは共同で、収量を増加するのかも知れない。ＥＧ３０７はＥＧ１１１７のための転写因子として植物オペロンを作出していることも、考えられる。すべての徴候は、ＥＧ３０７およびＥＧ１１１７は両方とも、１）イネ栽培化および祖先種に対するＫA／ＫS分析、２）粒重量ＱＴＬへの連鎖、および３）祖先および栽培化種の間のアミノ酸交換の進化的パターン：に基づく農業的に重要な形質へ影響を及ぼすはずの遺伝子の論理的候補である、ということである。ＥＧ１１１７も、イネにおけるＫA／ＫS分析に基づき、栽培化中の強い正の選択の証拠を示す。ＥＧ１１１７は、ペプチド輸送体のファミリーに相同のタンパク質をコードする。本ファミリーの他のメンバーは、成長、開花、および種子発生に影響することが、植物で示されている。ＥＧ１１１７はまた、粒重量のＱＴＬに関連づけられている。これが偶然とは、とてもありえない。これらは、農業的に意義のあるものとしてそれらの遺伝子をいずれも実証するために、本提案の目的で使用するための、理想的な遺伝子である。
（実施例１７）：収量候補の実証：関連分析と系統分析
穀類において収量を制御するＥＧ３０７およびＥＧ１１１７の役割は、本特許の別のところに記載されているように、トランスジェニック植物の作製により実証が可能であるが；別の実証支持は、関連分析と系統分析から得られる。
関連分析は、当該遺伝子が既知形質と関連するかどうか知るために、非常に多くの十分特徴解明された、イネ株中の各候補遺伝子の配列決定を含む。ＥＧ３０７は、１３の十分特徴解明された現代イネ株で配列決定され、そして、９つの最高収量株に、正に選択された派生対立遺伝子が存在し、一方、４つの最低収量株に祖先対立遺伝子が存在することが決定された。表１２の調査により観察されたパターンは、実に目覚ましいものである。これは、ＥＧ３０７が確かに収量に影響すること、すなわち、いわゆる「収量」遺伝子であろうことの証拠を、加えている。

表１２ 高収量イネ株への正に選択されたＥＧ３０７対立遺伝子の関与
Figure 2005518199
系統分析は、２つの重要なセットのデータを利用する。利用可能な粒重量データに加えて、多くのイネ株の由来（すなわち、系統における）はよく知られている。これは、収量関連候補遺伝子を既知のイネ株系統上にプロットすることによる、実証計画を可能にする。各株について、ＥＧ３０７およびＥＧ１１１７の既知の１０００粒重量および対立遺伝子のタイプ（すなわち、「派生した」、適応した、現代の、対立遺伝子）を記録する。適応対立遺伝子の伝達のパターンは、これらのデータから推定が可能である。
（実施例１８）：メイズおよびテオシンテ中のＥＧ１１１７の同定
実施例１３に記載の当業者には周知の方法を用いて、ＥＧ１１１７を、多数のメイズ株（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓ）、配列番号１１９、１２２、１２３、１２４、１２７、１２８、１２９、１３２、１３５、１３６、１３７、１４０、１４１、１４４、１４５、１４６、１４９、１５０、１５１、１５４）および多数のテオシンテ株（Ｚｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ）（配列番号１５７、１６０、１６１、１６２、１６５、１６６、１６７）から増幅した。
（実施例１９）：遺伝子候補ＥＧ３０７の機能の決定
ＥＧ３０７タンパク質の機能を解明するため、それが相互作用するイネタンパク質が決定される。この「交際により有罪（ｇｕｉｌｔ−ｂｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」アプローチは、未知タンパク質と関連する可能性がある経路または機能を同定したいと思う状況では、有用である（編集部（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１０）。相互作用タンパク質を決定する２つの方法は、酵母ツーハイブリッドアプローチ（ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ ａｐｐｒｏａｃｈ）のような全体的スクリーニングアプローチ、ならびに、当該未知タンパク質の組み換え的に発現された型を用いて、相互作用の親和性に基づいて相互作用タンパク質を単離することによる直接的アプローチを含む。実験方法および設計の概要を、両方法について示す。
Ａ． 酵母ツーハイブリッド（ＹＴＨ）スクリーン。 相互作用タンパクについてのＹＴＨスクリーニング法は、関心のあるタンパク質と転写活性化因子タンパク質結合ドメインの半分との組み換え体融合物（おとり）の作製、および転写活性化因子活性化ドメインの他の半分と融合された標的である可能性のあるタンパク質のコード領域のｃＤＮＡライブラリー（標的タンパク質）の使用、に頼っている。もし当該おとりが標的タンパク質と相互作用するならば、当該転写因子の２つの半分（結合ドメインおよび活性化ドメイン）はまとめられ、そしてリポーター遺伝子の転写の開始が起る。典型的に用いられるＹＴＨ系の２つの基本的タイプがある；すなわち、標準ＹＴＨについてのＧＡＬ４に基づくシステム（Ｆｉｅｌｄｓら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４４５−２４６）およびＬｅｘＡに基づく「相互作用トラップ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ−Ｔｒａｐ）」（ＩＴ）法（Ｇｏｌｅｍｉｓら，（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ中、 Ｆ．Ｍ．Ａｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク；Ｇｏｌｅｍｉｓら，（１９９７）Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ中、 Ｄ．Ｌ．ＳｐＳｅｐｔｏｒ，Ｒ．Ｇｏｌｄｍａｎ，およびＬ．Ｌｅｉｎｗａｎｄ編，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）である。
２つのイネＹＴＨ ｃＤＮＡライブラリー（Ｌ ｃｖ Ｍｉｌ−Ｙａｎｇ）は、Ｅｕｇｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｙｕｓｏｎｇ Ｔａｅｊｏｎ，韓国）から商業的に入手可能である。これらのライブラリーは、長さ＜２ｃｍまたは＞２ｃｍのいずれかの発生中のイネ穂から単離されたｍＲＮＡを用いて作製されたｃＤＮＡからＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＨｙｂｒｉＺＡＰR（ＧＡＬ４に基づくシステム）中に作製されている。これらのライブラリーは、早期および後期の両胚発生で大切なタンパク質をコードするはずである。重要なことに、当該ＥＧ３０７タンパク質はこれらの組織に存在するはずであることが、ＥＧ３０７発現のわれわれのＲＴ−ＰＣＲ分析からわかっている。したがって、これらのライブラリーは、ＥＧ３０７タンパク質と相互作用するタンパク質を発現すると思われる。
実験的詳細。 ＨｙｂｒｉＺＡＰ ＹＴＨシステムに特異的な標準試薬、酵母株、ベクター、およびＤＮＡ単離／配列決定法は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手される。ＥＧ３０７のコード領域は、Ｏ．ｓａｔｉｖａ苗条ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いてクローン化される。そのＰＣＲ増幅インサートは、線形のｐＢＤ−ＧＡＬ４ Ｃａｍ ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクター中へクローン化され、そしてインサートをもつ形質転換体は、クロラムフェニコールプレート上で選択されて、「おとり」プラスミドを作製する。クローニングの連結およびＥＧ３０７のコード領域はＥＧでの標準配列決定技術を用いて配列決定され、適正なリーディングフレームの使用、およびＥＧ３０７の増幅中に突然変異が導入されていないことを確かめる。
Ｅｕｇｅｎｔｅｃｈからの両商業ライブラリーは、一次ライブラリーから単回増幅されていることが当該会社により報じられており、そして２ｘ１０8ｐｆｕで提供される。ライブラリーＩ（＜２ｃｍ穂）は、１ｘ１０6ｐｆｕの初期複雑度および３．６ｘ１０8ｐｆｕ／ｍｌの増幅ライブラリータイターをもつ。ライブラリーＩのインサートサイズは、０．５から３．０ｋｂの範囲である。ライブラリーＩＩ（＞２ｃｍ穂）は、５ｘ１０5ｐｆｕの初期複雑度および４ｘ１０6ｐｆｕ／ｍｌの増幅ライブラリータイターをもつ。ライブラリーＩＩのインサートサイズは、０．５から１．６ｋｂの範囲である。これらの既製ライブラリーは、極めて相応な価格で商業的に入手可能なので、この特定のシステムを用いて最初のＹＴＨハントを行うのが賢明である。
おとりプラスミドと標的プラスミドライブラリーの両方は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ’ｓ ＹＲＧ−２ Ｙｅａｓｔコンピテント細胞ライブラリーキットを用いて、酵母ＹＲＧ−２株中へコトランスフェクトされる。両プラスミドをもつ酵母は、ＹＲＧ−２栄養要求性突然変異（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の補完性により選択される。この場合、おとりおよび標的プラスミドは、ＹＲＧ−２株のトリプトファンおよびロイシン両栄養要求を補完するはずである。本コトランスフェクションから増殖するコロニーを使って、酵母ライブラリーを作製し、それは次に、ヒスチジンを欠き、Ｘ−ｇａｌを含むプレート上でのさらなる選択により、相互作用する標的タンパク質についてスクリーンする。ＹＲＧ−２株は２つの別のリポータープラスミドをもっている。一方は、ＨＩＳ遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列をもち、ＹＲＧ−２ヒスチジン栄養要求性突然変異を補完するのに使われる。他方のプラスミドは、ＬａｃＺリポーター遺伝子の上流にＧＡＬ４結合配列をもつ。これは、当該酵母をＸ−ｇａｌ含有プレート上に置いた場合、リポーター遺伝子発現について青色／白色スクリーニングを可能にする。当該相互作用スクリーニングフェーズの際、相互作用のおとり；標的組合せを含む酵母だけが、ヒスチジン栄養要求性を補完し、そしてまた、ＬａｃＺの発現およびＸ−ｇａｌ基質の青色産物への変換を起す。相互作用についてのこの二重スクリーンは、同定される擬陽性コロニーの数を制限するのに役立つ。加えて、ある程度、青色基質産生の強度は、おとりと標的タンパク質との間の相互作用の強度の、ある指標である。
相互作用コロニーを拾い出し、当該ＤＮＡを単離し、そして数百コロニーからの標的プラスミドインサートの配列を決定する。配列は翻訳され、そしてタンパク質配列を、完全長コード領域および可能性のあるオープンリーディングフレームの双方に対して、ＥＳＴｓから検索する。複数の同一配列が標的として同定された場合、当該タンパク質は優先的に選択された相互作用タンパク質である可能性を表す。ある配列が一度または少数回のみ表示されるならば、それは、非特異的相互作用タンパク質であるか、ｃＤＮＡライブラリー中で限られた回数表示される転写産物か、のいずれかである。
複数クラスの相互作用タンパク質が、このようにして同定されるはずである。理想的には、既知機能のタンパク質は高度に表示され、そして理論的な機能を有するまたは経路に関係するタンパク質も容易に同定される。たとえ相互作用タンパク質（類）が未知であっても、既知タンパク質に相同であれば、公開ドメイン中の既知情報に基づいて、当該相互作用の関連を確かめるための、実験をデザインすることが、なお可能である。

タンパク質・タンパク質相互作用があると思われるときは、追加のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ研究により立証されよう。時間が許せば、相互作用を確認するためにより簡単な検定をフェイズＩの際に行う。アフィニティプルダウン（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎｓ）およびファーウェスタン（ｆａｒ−ｗｅｓｔｅｒｎｓ）のような検定は、抗体および組み替え体タンパク質のような追加の試薬がつくられたときに、行われよう。おとりタンパク質（ＥＧ３０７）ならびに推定相互作用タンパク質の両方についての組み替え体タンパク質の作製は、エピトープタグ融合タンパク質（ＧＳＴ，ｍｙｃ，Ｖ５，ビオチン標識）と同じく、必要に応じて行われる。ｉｎ ｖｉｖｏ相互作用をはっきりと証明し、そしてまた、その相互作用に影響する可能性がある因子を測定するためには、関連ｉｎ ｖｉｖｏ相互作用（例えば、２つの適切に構築された緑色蛍光タンパク質融合体間の蛍光エネルギー転移）についての別の証拠も必要かも知れない。しかし、そうした実験は、明らかに、フェーズＩの範囲を超えている。
ＹＴＨハントが、おとりタンパク質自身がＧＡＬ４転写活性化配列に結合し、そして当該リポーターシステムの活性化を起こすことを同定することは可能である。これが起るならば、当該ＥＧ３０７タンパク質の２つの半分を独立に発現する２つのおとり構築体が構築される。これらの構築体は、ＹＲＧ−２中のＧＡＬ４リポーター類の直接活性化についてテストされることになろう。もし直接活性化が陰性であれば、ｃＤＮＡ標的ライブラリーは、おとり：標的の相互作用について再スクリーンされることになる。
もし相互作用タンパク質が商業的既製ＹＴＨライブラリーから何も同定されないならば、これらのライブラリーは低品質であるか、または実際に相互作用しているタンパク質を同定するのに、そのＧＡＬ４ ＹＴＨシステムが十分鋭敏でない可能性がある。いずれの場合にも、相互作用トラップシステム（ＬｅｘＡ）中に構築された代わりのライブラリーを使ってみることが考えられる。これらのライブラリーは、次に、何らかの他の未知候補タンパク質のさらなる特徴解明の基盤として役立つはずである。
（実施例２０）：物理的方法を用いる相互作用タンパク質の直接単離および同定。
植物組織から相互作用タンパク質を直接単離するため、さまざまな可溶化植物組織中に存在するタンパク質のアフィニティー単離が行われる。単離された相互作用タンパク質は限定タンパク質分解を受け、そして生じるペプチド断片は、既知または予測されたタンパク質を示すペプチド断片パターンが生じるかどうかを同定するために、質量分析により分析される。
ＥＧ３０７タンパク質は細菌の発現系中へクローン化され、ＰｈａｒｍａｃｉａのｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いてＧＳＴ−ＥＧ３０７融合タンパク質を作製する。ＩＰＴＧにより発現が誘導された培養物の細菌ライゼート（可溶化液、ｌｙｓａｔｅｓ）を用い、グルタチオンセファロースビーズ上で当該融合タンパク質を精製する。当該可溶性タンパク質は、当該カラム上に遊離グルタチオンを通過させると、固相への結合のための競合によって、当該ビーズから溶出される。当該組み替え体ＧＳＴ−ＥＧ３０７は、次に、新しいグルタチオンセファロースビーズに再結合されたとき、アフィニティーリガンドとして、使用可能である。あるいは、遊離のＥＧ３０７タンパク質は、Ｘａ因子との融合タンパク質の処理による、ＧＳＴドメインの除去によって得ることも可能である。推定ＥＧ３０７タンパク質中に、Ｘａ因子プロテアーゼサイトはない。
大量の０．ｓａｔｉｖａ実生（２００−３００グラム）から単離された植物細胞ライゼートは、標準的な分別組織破壊と純化技術により作出される。細胞質ゾルのタンパク質を単離するために、当該細胞は、プロテアーゼインヒビターカクテルの存在下で当該組織ライゼートを冷却しながら、ポリトロン組織ホモジェナイザーおよび超音波処理器を用いて、機械的剪断により、破壊される。当該可溶性細胞質ゾル細胞ライゼートは、残骸を除くために低速で分画遠心分離により純化し、次いで不溶性の凝集タンパク質を除去するために高速遠心分離により純化される。当該不溶性画分中のタンパク質を単離するために、ＮＰ−４０，ＢｒｉｊR３５、およびデオキシコレートのようなさまざまな界面活性剤が、これらの不溶性膜画分から単離された膜結合タンパク質を可溶化するのに使われる。不溶性物質は遠心分離により除かれる。
当該植物細胞ライゼートは、前記グルタチオン・セファロース：ＧＳＴ ＥＧ３０７ビーズ上を個別に通過させる。ビーズは、さまざまなイオン強度の緩衝液で洗浄し、弱く結合されたタンパク質を除去する。結合タンパク質は、次いで、低ｐＨ，高塩濃度、または変性界面活性剤のいずれかで、溶出される。純粋タンパク質類は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を移動させ、そして当該バンドを、質量分析に適合する銀染色試薬またはコマジーブルーで染色される。興味あるバンドはゲルから切り出され、そして後の分析のために凍結される。これらのタンパク質は、タンパク質分解酵素ペプチドシグネチュアおよび当該相互作用タンパク質の正体を決定するために、限定タンパク質分解に続く質量分析を行う質量分析施設に送られる。
本技術は、当該相互作用の親和性が、ＥＧ３０７タンパク質と可能性のある相互作用タンパク質との間で緊密な結合を確保するのに十分に特異的で、強力である限り、当該相互作用タンパク質の同定を可能にするはずである。これらのデータは、次いで、そのタンパク質が他のタンパク質に相同であれば、当該相互作用タンパク質の同定を可能にするだろう。ＥＧ３０７タンパク質に対する親和性の欠如のために、本法により同定されるタンパク質がないことが、あり得るのは明らかである。あるいは、上に概説した方法により作製されたライゼート中に相互作用タンパク質がないことも、あり得る。
もしあまりにも多くのタンパク質が、グルタチオン・セファロース：ＧＳＴ ＥＧ３０７ビーズに結合するようであれば、それらのタンパク質は、セファロース、グルタチオン、グルタチオンシンテターゼに、またはＥＧ３０７とＮ末端ＧＳＴ融合をつくることにより作製された人工エピトープのいずれかに、非特異的に結合していることも、あり得る。これらの非特異的相互作用の一部を排除するために、ライゼートは、セファロースビーズ単独、グルタチオンセファロース、ならびにグルタチオンビーズに共役した無関係なＧＳＴ融合タンパク質で、前浄化する。その前浄化工程後にも非特異的バンドが残るならば、高塩濃度、低塩濃度、高または低ｐＨ、Ｔｗｅｎｎ−２０のような非イオン性界面活性剤、のような一層厳しい洗浄および結合条件を採用して、本おとりタンパク質に結合するタンパク質を制限する。
（実施例２１）：ペプチド輸送機能をもつと推定された新規タンパク質をコードする遺伝子候補ＥＧ１１１７の機能を決定する。
ＥＧ１１１７タンパク質は、それが、タンパク質のＰＴＲ−２ファミリーのメンバーであることを示唆するシリコホモロジー（コンピューター相同性）データに基づき、一種のペプチド輸送タンパク質をコードするらしいので、この特定の機能を直接評価する実験を行う。２つの補完的だが、独立のアプローチを用いる。第１に、酵母における異種ペプチド輸送タンパク質機能を調べる方法を用いて、酵母のＰＴＲ−２欠損変異体における細胞膜を横切りペプチドを輸送し、そして栄養要求性アミノ酸要求を補完するための、ＥＧ１１１７の栽培化型および祖先型の両方の能力を調べる。第２に、有毒エチオニン含有ペプチドの存在下で、イネ実生の栽培化種および祖先種の両方の成長特性を用いて、イネの栽培化種および祖先種間の測定可能な表現型差を、潜在的ペプチド輸送タンパク質変異に相関させる。
栄養要求性酵母における異種ペプチド輸送機能の補完分析。 これらの研究に、ジ／トリペプチドを輸送する能力にも突然変異をもつ、特別にデザインされた栄養要求性変異酵母株を用いて、シロイヌナズナの新規ペプチド輸送タンパク質を同定するために使用された既述の方法を利用する（Ｓｔｅｉｎｅｒら，１９９４）。本異種系は、植物ペプチド輸送タンパク質が酵母細胞中にクローン化でき、そしてその組み替え的に発現されたタンパク質機能が、当該酵母株の栄養要求性アミノ酸要求の補完により測定できることを、証明した。これは、ＥＧ１１１７の両型の機能に関する情報を迅速に生じる、単純だが、有力な検定法である。
酵母親株ＢＹ４７４２［Ｍａｔα，ｈｉｓ３−，ｌｅｕ２−，ｌｙｓ２−，ｕｒａ２−］、およびＡＴＣＣから入手可能な「完全酵母欠損アレイコレクション」からのＹＫＲ０９３Ｗ ＯＲＦ欠損変異体で、それにはＰＴＲ−２遺伝子が欠損しており、ＢＹ４７４２−ｐｔｒ２と命名されている。両株ともＡＴＣＣから入手可能である。ＥＧ１１１７の栽培化型および祖先型は、ｐＹＥＳ２．１−ＴＯＰＯ−ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中へクローン化されるが、それは、酵母のＢＹ４７４２−ｐｔｒ２栄養要求株中に、推定ＰＴＲ−２タンパク質の組み替え体発現を可能にする。トランスフェクタントの選択は、ウラシルを欠くプレート上で行う。当該トランスフェクタントからプラスミドＤＮＡを再分離し、そしてＥＧ１１１７特異的プライマーにより分析し、当該株が適切なプラスミドをもつことを確認する。タンパク質発現は、当該培地中のガラクトースの存在により制御する。トランスフェクタントはガラクトースを含む培地中で増殖させ、そしてＥＧ１１１７タンパク質発現は、前記ベクターにより付与されたＣ末端Ｖ５エピトープタグのウェスタンブロット分析によりモニターされる。下に補完および根成長検定に使われたペプチドを示す：
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Ｅｔｈ＝エチオニンは、メチオニンの有毒誘導体である。栄養要求性表現型についての全選択は、ロイシンを欠くプレート上で行う。
ＥＧ１１１７がペプチド輸送タンパク質をコードするかどうかをテストするため、上にリストされたペプチドは、商業的に合成され、そして精製される。各ペプチドはロイシンをもつので、当該ペプチドが、機能性のペプチド輸送タンパク質でトランスフェクトされそしてガラクトースの存在下で増殖されたロイシン栄養要求性ＢＹ４７４２−ｐｔｒ２株中へ輸送されるならば、その株は増殖できるはずである。
実施される第２の検定は阻害検定である。この場合、ＢＹ４７４２−ｐｔｒ２ ＥＧ３０７トランスフェクタントならびに、対照としての、ＢＹ４７４２親株およびＢＹ４７４２−ｐｔｒ２欠損変異株を、ＹＰＧ（酵母エキス、ペプトン、ガラクトース）プレート上にローンとしてプレートし、そして有毒エチオニンペプチド誘導体を、メンブランディスク上にスポットし、当該酵母ローン上に置く（Ｓｔｅｉｎｅｒら，１９９４）。次いで、当該ディスクの周りに透明のゾーンができたら、当該酵母は、前記有毒ペプチドを細胞中に輸送し、当該細胞を殺すことを当該酵母に可能にする、機能性輸送タンパク質を発現したことを、示す。
ＥＧ１１１７タンパク質の栽培化型および祖先型の両方が、アミノ酸栄養要求性変異を補完し、それらが両方とも機能性輸送タンパク質であることを示唆するならば、次の実験を行う。ｐＨまたは陽イオン依存性を評価するために、プレーティング培地のｐＨまたはイオン強度を変化させ、そして補完性ペプチドの存在下で増殖するか、または有毒ペプチドの存在下で死ぬかにつき、ＥＧ１１１７タンパク質をもつ当該トランスフェクタントの能力を決定する。同様に、ペプチドに対する親和性の潜在的差異を評価するために、酵母形質転換体の増殖への特定ペプチドまたはそのペプチドの有毒変異体の用量応答作用を評価する。
ＥＧ１１１７タンパク質がペプチド輸送タンパク質を実際にコードすることを見いだす可能性は、非常に高い。当該タンパク質の前記２つの型がこの機能に測定可能な差異を示す可能性も高く、おそらく、特異性／選択性、至適ｐＨ、または親和性に変化が明らかになるだろう。酸性から一層塩基性の特性へのアミノ酸配列中の非同義変化は存在するが、これらの変更は当該タンパク質の重要でない領域にあるのかも知れない。あるいは、これらの変化は、その機能を変えるほど、当該タンパク質の３次元構造を十分には変えない可能性もある。
これらのタンパク質がペプチドを輸送しないとは考えられないが、ＥＧ１１１７タンパク質が何か別の基質の輸送タンパク質であることはあり得る。この場合、ＥＧ１１１７がペプチドを輸送するという何らの証拠も得られなければ、これらの他の機能のいくつかを選別するために、同様の系または少なくとも当該トランスフェクト酵母を使うことは可能である。例えば、単糖類または多糖類輸送能力の試験は、適切な栄養要求性株で可能であろう。あるいは、標的輸送機能のための他の酵母欠損変異体を、現存のトランスフェクタントと交配させることも可能である。この場合、選択プレート上の交配酵母の増殖は、その特定の欠損変異の補完を示すことになる。本戦術を用いて、公共的に入手可能な非常に多くの異なる酵母欠損変異体を走査することも、可能であろう（Ｂｒａｃｈｍａｎら，（１９９８）Ｙｅａｓｔ １４：１１５−１３２）。
（実施例２２）：エチオニン含有有毒ペプチドに対する祖先および栽培化イネ実生の異なる感受性。
これらの研究は、ＥＧ１１１７タンパク質が、イネの栽培化株と祖先株とでは、違って機能することを、ｉｎ ｖｉｖｏで直接証明するための試みを表している。有毒ペプチドを輸送する能力は、当該有毒ペプチドを取り込む細胞の死をもたらす。機能の欠如は、当該実生根の成長持続への有毒ペプチドの作用に対する抵抗性として、表現されよう。表現型差の欠如は、ＥＧ１１１７が発現されなかったか、または他の輸送タンパク質が、選択されたＥＧ１１１７タンパク質の変更された機能を補償するか、のいずれかを示唆している。
イロイヌナズナに使われた方法の修飾版が、これらの研究では使用される（Ｓｔｅｉｎｅｒら，１９９４）。Ｏ．ｓａｔｉｖａおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｅｎからのイネ種子は芽を出させ、そしてその実生は暗所の湿った容器中のイネ培地上での成長を持続可能にした。当該実生は、エチオニン含有有毒ペプチドまたは対照として非毒性ペプチドで含浸させたディスクにさらす。当初の実験は、有毒ペプチドに対する感受性に劇的な差が存在するかどうかを、決めることに焦点をしぼる。劇的な差が観察されないならば、有毒ペプチドの用量範囲を用いる一層大規模な別の実験に用いて、有毒ペプチド用量に対する感受性の差が存在するかどうかを決める。これは、イネの前記２株に存在するペプチド輸送体の機能活性における差を示唆することになろう。
本セットの研究からの結果は、ＥＧ１１１７コードタンパク質における仮定された差を補償する別のペプチド輸送機構があるかどうかに、かかっている。ＥＧ１１１７が、イネによって使われる主要なペプチド輸送タンパク質である限り、またはイネ植物の成長に決定的である、独特の機能をもつ限り、栽培化型と祖先型との間のＥＧ１１１７の機能におけるどのような差も、前記有毒ペプチドに対する感受性の差により明らかにされるはずである。シロイヌナズナでの同様な実験は、単一のＰＴＲ−２タンパク質が単一ペプチド輸送系の一部であることの証明に成功した（Ｓｔｅｉｎｅｒら，１９９４）。すなわち、単一ペプチド輸送体の変異体が、成長阻害に劇的な結果を与えた。とくに、これらの研究は、初期胚におけるＰＴＲ−２発現の発生遮断によるＰＴＲ−２タンパク質の欠損またはＰＴＲ−２タンパク質発現の欠如が、周囲の環境中の有毒ペプチドの存在に対して当該植物に抵抗性をもたらした。イネ実生の成長も同様であり、そしてＥＧ１１１７の機能のどのような差でもイネ実生の成長の変化により容易に明らになると、思われる。
図１はＥＧ３０７についてのＯ．ｓａｔｉｖａ 栽培品種ＮｉｐｐｏｎｂａｒｅおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（ＮＳＧＣ５９５３）のヌクレオチドアラインメントを示す。本アラインメントは、５’末端上に非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み、そして本遺伝子についての開始および終止コドンを記す。 図２はＥＧ３０７についてのＯ．ｓａｔｉｖａ 栽培品種ＮｉｐｐｏｎｂａｒｅおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ（ＮＳＧＣ５９５３）のタンパク質アラインメントを示す。本アラインメントは完全コード（ＣＤＳ）領域を含む。 図３は遺伝子のコード領域についてＺｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓおよびＺｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ（テオシンテ、Ｂｅｎｚ９６７株）中のＥＧ３０７のヌクレオチド配列を示す。開始および終止コドンが同定されている。 図４はＺｅａ ｍａｙｓ ｍａｙｓおよびＺｅａ ｍａｙｓ ｐａｒｖｉｇｌｕｍｉｓ ＥＧ３０７のタンパク質アラインメントを示す。本アラインメントは完全長推定タンパク質配列を含む。 図５は５つの異なるイネ遺伝子地図にマッピングされたマーカーＣＤＯ１３８７およびＲＺ６７２を示し、これらのマーカーの範囲が当該５地図の間で一致することを示す。ＥＧ３０７はＣＤＯ１３８７の上流（約２００ｋｂ）にあり、そして１０００粒重量についてのＱＴＬはマーカーＲＺ６７２と関連している。 図６はＥＧ１１１７についてのＯ．ｓａｔｉｖａ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株）およびＯ．ｒｕｆｉｇｏｇｏｎ（５４９８株）のヌクレオチドアラインメントを示し、そして３つの非同義変化があることを示す。 図７はＥＧ１１１７についてのＯ．ｓａｔｉｖａ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株）およびＯ．ｒｕｆｉｇｏｇｏｎ（５４９８株）のタンパク質アラインメントを示す。本アラインメントは終止コドンをもつ部分ＣＤＳ領域を含む。Ｏ．ｓａｔｉｖａおよびＯ．ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ間の３つのアミノ酸の差は太字で示される。 図８はＯ．ｓａｔｉｖａ（Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ株）およびシロイヌナズナＰＴＲ２−Ｂ（ヒスチジン輸送タンパク質，ＮＰ １７８３１３）のタンパク質アラインメントを示す。
【配列表】
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Claims (78)

  1. 栽培品種化（家畜化）生物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、野生祖先と比較した当該栽培品種化（家畜化）生物における収量の増加と関連するまたは関連するのではないかと思われる前記ポリペプチド、を同定するための方法であって、
    ａ）当該栽培品種化（家畜化）生物のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当該野生祖先のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に比較する工程；そして
    ｂ）当該野生祖先における対応する配列と比較した場合、進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該栽培品種化（家畜化）生物におけるポリヌクレオチド配列を選択し、当該栽培品種化（家畜化）生物のポリヌクレオチド配列を同定する工程：
    を含む、前記方法。
  2. 収量の改良と関連する前記ポリペプチドがＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドである、請求項１の方法。
  3. ａ）植物細胞を、当該細胞に天然には存在しないＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドに由来し、ポリペプチドをコードし、且つトランスジェニックタンパク質の発現に効果的に使用可能なプロモーターに機能可能に連結された異種ＤＮＡセグメントを含むようにトランスフェクトする工程；
    ｂ）場合により、当該細胞をそこからトランスジェニック植物が再生される条件下で成育させ、そして維持する工程；および
    ｃ）場合により、当該ＤＮＡが発現される条件下で前記トランスジェニック植物を成育させて、当該植物中のＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドの総量を増加させる工程：
    を含む、トランスフェクト植物細胞またはトランスジェニック植物の製造方法。
  4. 前記異種ＤＮＡセグメントを含む前記トランスジェニック植物の子孫の以降の世代を得、そして成育させ、当該異種ＤＮＡセグメントを発現させる工程をさらに含む、請求項３の方法。
  5. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む、植物細胞。
  6. 請求項５のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物の増殖用の材料。
  7. 植物組織中で発現するＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡを含む、トランスジェニック植物。
  8. 植物組織中でＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されているプロモーターを含む、単離されたポリヌクレオチド。
  9. ポリヌクレオチドが組み替え体ポリヌクレオチドである、請求項８の単離されたポリヌクレオチド。
  10. プロモーターがＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子に天然に存在するプロモーターである、請求項８の方法。
  11. トランスフェクトされた細胞の製造方法であって、
    ａ）栽培化植物の祖先中の進化的に有意なＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドまたは栽培化植物中の相当するポリヌクレオチドを同定する工程；
    ｂ）当該ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドを使って、転写または翻訳調節エレメント、エンハンサー、イントロンまたは他の５’または３’フランキング配列であってもよい非ポリペプチドコード配列を同定する工程；
    ｃ）リポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結されている当該非ポリペプチドコード配列を含む構築体を組み立てる工程；そして
    ｄ）宿主細胞中へ当該構築体をトランスフェクトする工程：
    を含む、前記方法。
  12. 請求項１１の方法により製造されたトランスフェクト細胞。
  13. 宿主細胞が植物細胞であり、当該細胞をそこからトランスジェニック植物が再生される条件下で増殖させ、そして維持する工程をさらに含む、請求項１１の方法を含む、トランスジェニック植物の製造方法。
  14. 請求項１２の方法により製造されたトランスジェニック植物。
  15. 進化的に有意なＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの非ポリペプチドコード領域の機能を調整する作用物質を同定する方法であって、請求項１１のトランスフェクト宿主細胞を少なくとも１つの候補作用物質と接触させ、リポーターポリヌクレオチドの転写または翻訳を調整する能力により作用物質を同定する、ことを含む前記方法。
  16. 請求項１５の方法により同定された作用物質。
  17. 進化的に有意なＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドの非ポリペプチドコード領域の機能を調整する作用物質を同定する方法であって、請求項１３のトランスジェニック植物を少なくとも１つの候補作用物質と接触させ、リポーターポリヌクレオチドの転写または翻訳を調整するその能力により作用物質を同定する、ことを含む前記方法。
  18. 請求項１７の方法により同定された作用物質。
  19. リポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能可能に連結された、進化的に有意なＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリヌクレオチドからのプロモーター、エンハンサーもしくはイントロンのポリヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含む構築体でトランスフェクトされた宿主細胞を含む、トランスフェクトされた宿主細胞。
  20. 収量を調整することが可能な作用物質を同定する方法であって、少なくとも１つの候補作用物質を、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子を含む植物または細胞に接触させ、収量を調整するその能力により作用物質を同定することを含む、前記方法。
  21. 前記植物または細胞が、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７をコードするポリヌクレオチドおよびその遺伝子でトランスフェクトされる、請求項２０の方法。
  22. 請求項２０の方法に従って同定された作用物質。
  23. 同定された作用物質が、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの機能を調整することによって収量を調整する、請求項２０の方法。
  24. 同定された作用物質が、当該ポリペプチドの機能を調整することによって収量を調整する、請求項２０の方法。
  25. 植物における収量増加をもたらす方法であって、
    ａ）ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７が植物細胞中で発現される、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードする異種ＤＮＡをもつトランスフェクト植物細胞を製造する工程；そして
    ｂ）ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７トランスジーンが当該トランスジェニック植物中で発現される、トランスフェクト植物細胞からトランスジェニック植物を成育させる工程：
    を含む、前記方法。
  26. トランスジーンが、当該トランスジーンの発現制御に適した調節配列の制御下にある、請求項２５の方法。
  27. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドの製造方法であって、
    ａ）発現のために細胞中に配置された、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた前記細胞を提供する工程；
    ｂ）当該ポリヌクレオチドを発現するための条件下で当該トランスフェクト細胞を培養する工程；そして
    ｃ）当該ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７ポリペプチドを単離する工程：
    を含む、前記方法。
  28. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子をコードする異種ＤＮＡが、当該ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子の構成的発現をもたらすプロモーターの制御下にある、請求項２５の方法。
  29. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子をコードする前記異種ＤＮＡが、当該ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子の制御可能な発現をもたらすプロモーターの制御下にある、請求項２５の方法。
  30. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子が、組織特異的または細胞型特異的プロモーターを用いて、または、化学シグナルまたは作用物質のような外部シグナルまたは作用物質の導入により活性化されるプロモーターを用いて発現される、請求項２９の方法。
  31. 収量関連遺伝子またはその断片を植物細胞から単離する方法であって、
    ａ）植物細胞ポリヌクレオチドの試料を提供する工程；
    ｂ）ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７遺伝子の保存領域に配列相同性をもつオリゴヌクレオチドのペアを提供する工程；
    ｃ）オリゴヌクレオチドの当該ペアを、ポリメラーゼ連鎖反応仲介ポリヌクレオチド増幅に適した条件下で当該植物細胞ポリヌクレオチド試料に結合させる工程；そして
    ｄ）増幅された収量関連ポリヌクレオチドまたはその断片を単離する工程：
    を含む、前記方法。
  32. 請求項３１の方法により単離された、植物収量関連ポリヌクレオチド。
  33. 収量関連ポリヌクレオチドを単離する方法であって、
    ａ）ゲノム植物細胞ＤＮＡおよび組み替え体植物細胞ライブラリーポリヌクレオチドより成る群から選択されたポリヌクレオチドの調製物を提供する工程；
    ｂ）当該調製物を、５０％またはそれより大きい配列同一性をもつポリヌクレオチドの検出をもたらすハイブリッド形成条件下で、ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７オリゴヌクレオチドと接触させる工程；そして
    ｃ）当該ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７オリゴヌクレオチドとの会合により収量関連ポリヌクレオチドを単離する工程：
    を含む、前記方法。
  34. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７オリゴヌクレオチドが検出可能に標識され、そして当該検出可能標識との会合により収量関連遺伝子が単離される、請求項３３の方法。
  35. 前記ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７オリゴヌクレオチドが少なくとも長さ１２ヌクレオチドである、請求項３３の方法。
  36. ＥＧ３０７またはＥＧ１１１７オリゴヌクレオチドが少なくとも長さ３０ヌクレオチドである、請求項３３の方法。
  37. 植物の収量関連遺伝子を同定する方法であって、
    ａ）植物組織試料を提供する工程；
    ｂ）当該植物組織試料中へ候補植物収量関連遺伝子を導入する工程；
    ｃ）当該植物組織試料内で当該候補植物収量関連遺伝子を発現させる工程；そして
    ｄ）応答の変化が植物収量関連遺伝子を同定する、収量応答の変化を当該植物組織試料が示すかどうかを決定する工程：
    を含む、前記方法。
  38. 請求項３７の方法に従って単離された、植物収量関連遺伝子。
  39. ａ）配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  40. ａ）配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、および配列番号１１７より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  41. ａ）配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、および配列番号１５５より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  42. ａ）配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  43. ａ）配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９７、および配列番号９８より成る群から選択されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド：
    より成る群から選択された単離ポリペプチド。
  44. ａ）配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１６、および配列番号１１７より成る群から選択されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド：
    より成る群から選択された単離ポリペプチド。
  45. ａ）配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５４、および配列番号１５５より成る群から選択されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド：
    より成る群から選択された単離ポリペプチド。
  46. ａ）配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、および配列番号１６８より成る群から選択されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド：
    より成る群から選択された単離ポリペプチド。
  47. 野生祖先または栽培化生物において、当該野生祖先または栽培化生物の経済的生産性亢進と関連する、または関連するのではないかと思われるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法であって、
    ａ）当該野生祖先および当該栽培化生物のポリペプチドコードヌクレオチド配列を比較する工程；そして
    ｂ）それぞれ、当該野生祖先または栽培化生物における対応する配列と比較した場合、進化的に中立のまたは正の進化的に有意なヌクレオチド変化を含む当該栽培化生物または野生祖先のいずれかにおけるポリヌクレオチド配列を選択し、それにより経済的生産性亢進と関連するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定する工程：
    を含む、前記方法。
  48. 栽培化生物の野生祖先のポリペプチドであって、当該栽培化生物に比べて当該野生祖先において独特で亢進または変更されたストレス抵抗性形質と関連する前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定するための方法であって、
    ａ）当該野生祖先のポリペプチドコードヌクレオチド配列に、当該栽培化生物のポリペプチドコードヌクレオチド配列を比較すること；そして
    ｂ）当該栽培化生物における対応する配列と比較した場合、進化的に中立なヌクレオチド変化を含む当該野生祖先におけるポリヌクレオチド配列を選択することにより、当該野生祖先のポリヌクレオチド配列を同定する：
    工程を含む、前記方法。
  49. 栽培化生物が、メイズ、コメ（イネ）、トマト、ポテトおよびその祖先がわかっている他の栽培化植物より成る群から選択された植物である、請求項４８の方法。
  50. 栽培化生物がメイズであり、そして前記野生祖先がテオシンテである、請求項４９の方法。
  51. 栽培化生物のタンパク質コードヌクレオチド配列がｃＤＮＡに相当する、請求項４８の方法。
  52. ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項４８の方法。
  53. 栽培化生物が植物であり、そして前記ストレス抵抗性形質が、乾燥抵抗性、疾病抵抗性、有害生物抵抗性、高塩濃度抵抗性、および商業的に関心のある他のストレス抵抗性形質より成る群から選択される、請求項４８の方法。
  54. 栽培化生物の野生祖先におけるストレス抵抗性形質を調整することが可能な作用物質を同定する方法であって、少なくとも１つの候補作用物質を、請求項４８で同定されたポリヌクレオチド配列を発現する野生祖先もしくは栽培化生物、または、細胞もしくはトランスジェニック生物と接触させ、そして当該ポリヌクレオチドの機能または同定されたポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの機能を調整する能力により作用物質を同定することを含む前記方法。
  55. 請求項５４の作用物質を投与することによって、栽培化生物の野生祖先におけるストレス抵抗性を調整する方法。
  56. 請求項４８の野生祖先ストレス抵抗性ポリヌクレオチド配列に相当する、栽培化生物におけるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド配列に対する作用物質を同定する方法であって、少なくとも１つの候補作用物質を、当該ポリヌクレオチド配列を発現する栽培化生物もしくは祖先生物、または、細胞もしくはトランスジェニック生物と接触させ、そして、当該ポリペプチドの機能を調整する能力により作用物質が同定されることを含む前記方法。
  57. 請求項５６の作用物質を投与することによって、栽培化生物におけるストレス抵抗性を調整する方法。
  58. 栽培化生物の野生祖先のポリペプチドコードポリヌクレオチド配列における進化的に中立な変化を同定するための方法であって、
    ａ）野生祖先のポリペプチドコードポリヌクレオチド配列を栽培化生物の対応配列と比較する工程；そして
    ｂ）当該野生祖先の対応配列に比べて、進化的に中立なヌクレオチド変化を含む当該栽培化生物におけるポリヌクレオチド配列を選択し、そして当該ポリヌクレオチドが栽培化生物の野生祖先におけるストレス抵抗性形質と関連しており、それにより当該ポリヌクレオチド中の進化的中立変化が同定される工程：
    を含む、前記方法。
  59. 栽培化生物が、メイズ、コメ（イネ）、トマト、ポテトおよびその祖先がわかっている他の栽培化植物より成る群から選択された植物である、請求項５８の方法。
  60. 栽培化生物がメイズであり、そして前記野生祖先がテオシンテである、請求項５８の方法。
  61. 栽培化生物のタンパク質コードヌクレオチド配列がｃＤＮＡに相当する、請求項５８の方法。
  62. ヌクレオチド変化が非同義置換である、請求項５８の方法。
  63. 栽培化生物が植物であり、そして関連形質が、乾燥抵抗性、疾病抵抗性、有害生物抵抗性、高塩濃度抵抗性、および商業的に関心のある他のストレス抵抗性形質より成る群から選択される、請求項５８の方法。
  64. 栽培化生物の野生祖先のポリペプチドコードヌクレオチド配列と当該栽培化生物からのポリペプチドコード配列との間の大規模配列比較のための方法であって、ここで当該野生祖先生物ポリペプチドは、栽培化生物に比べて野生祖先において独特で、亢進または変更されているストレス抵抗性形質を付与する、または付与するのではないかと思われ、
    ａ）野生祖先配列を、栽培化生物からの対応配列と、配列相同性に従って整列させる工程；そして
    ｂ）それぞれ、野生祖先または栽培化生物からの相同配列に比較して、栽培化生物配列または野生祖先配列内に何らかのヌクレオチド変化を同定する工程：
    を含む、前記方法。
  65. 栽培化生物が、メイズ、コメ（イネ）、トマト、およびその祖先がわかっている他の栽培化植物より成る群から選択された植物である、請求項６４の方法。
  66. 栽培化生物がメイズであり、そして野生祖先がテオシンテである、請求項６５の方法。
  67. 栽培化種のタンパク質コードヌクレオチド配列がｃＤＮＡに相当する、請求項６４の方法。
  68. 進化的に中立のヌクレオチド変化を、栽培化生物の野生祖先において独特で、亢進または変更されているストレス抵抗性形質に相関させるための方法であって、
    ａ）請求項４８に従ってヌクレオチド配列を同定する工程：そして
    ｂ）当該栽培化生物または祖先生物で同定された配列の存否の機能効果を分析する工程：
    を含む、前記方法。
  69. トランスフェクト植物細胞またはトランスジェニック植物を製造するための方法であって、
    ａ）請求項４８の野生祖先のストレス抵抗性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、トランスジェニックタンパク質の発現に有効に使うことができるプロモーターに機能可能に連結されて含むように植物細胞を形質転換する工程；
    ｂ）場合により、当該細胞をそこからトランスジェニック植物が再生される条件下で増殖させ、そして維持する工程：
    を含む、前記方法。
  70. 請求項６９の方法により製造されたトランスフェクト細胞。
  71. 請求項６９の方法により製造されたトランスジェニック植物。
  72. ａ）配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１７、および配列番号１８より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  73. ａ）配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および、配列番号９０より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  74. ａ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号６４より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  75. ａ）配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７７、配列番号５９、および配列番号７８より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  76. ａ）配列番号８０、配列番号８１、および配列番号８２より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  77. ａ）配列番号８４および配列番号８５より成る群から選択されたポリヌクレオチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチド：
    より成る群から選択された単離ポリヌクレオチド。
  78. ａ）配列番号１、配列番号９１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、および配列番号１７、および配列番号１８より成る群から選択されたポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド；および
    ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに少なくとも８５％の相同性をもち、そしてそれが実質的にａ）のポリヌクレオチドと同じ収量を与えるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド：
    より成る群から選択された単離ポリペプチド。
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