JP2005517174A - 単一細胞内の多数の蛋白質の活性化状態を検出する方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、米国予防衛生研究所のグラント番号P01-AI39646号、AR44565号、AI35304号、N01-AR-6-2227号及びA1/GF41520-01により米国政府の援助を受けて達成された。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は一般にフローサイトメトリーを使用して蛋白質を検出する分野に関する。より詳細には、本発明は、単一細胞内の多数の蛋白質の活性化状態をフローサイトメトリーを使用し、より具体的には多染フローサイトメトリーを使用して同時に検出することに関する。
蛋白質は細胞の主要成分である。蛋白質の空間的時間的発現パターン及び細胞内分布は、細胞の形状、構造及び機能を決定する。蛋白質は20個の異なるアミノ酸(各々が別個の側鎖及び化学的特性を有する)から組み立てられる。これによって、蛋白質の化学的特性及び前記蛋白質が示す活性に非常な多様性が提供される。
更に、多くの蛋白質は動的な態様で調節され、それによって蛋白質の活性は一定の固有又は外来の指令に反応して変化することができる。調節の形態の1つには調節される蛋白質の共有結合による修飾が含まれる。そのような共有結合による修飾の例は、アミノ酸側鎖におけるヒドロキシル基のリン酸基による置換(リン酸化)である。そのような修飾はしばしば蛋白質活性における変化を伴なう。プロテインキナーゼは固有の蛋白質基質を認識する能力を有し、それらの蛋白質基質上のセリン、スレオニン又はチロシン残基のリン酸化を触媒する。被リン酸化が可能なそのような基質蛋白質はリン蛋白質と称される。いったんリン酸化されると、基質蛋白質は、特異的に前記基質タンパク質を認識するプロテインフォスファターゼによって前記リン酸化された残基をヒドロキシル化残基に戻すことができる。プロテインホスファターゼは、セリン、スレオニン又はチロシン残基上でリン酸基のヒドロキシル基への置換を触媒する。キナーゼとホスファーターゼの作用により、蛋白質は多数の残基上で可逆的にリン酸化され、それによってその活性を調節することができる。
多くの細胞内キナーゼ及びホスファターゼが、細胞表面でレセプターを刺激する細胞外シグナルに反応してシグナルを変換する。結果として、細胞外シグナルは、受容細胞の多くの蛋白質のリン酸化及び活性化状態における変化を誘発する。例えば、多くのマイトジェンは、細胞の分裂をひき起こすJNK及びMAPKを誘発する。別の例として、好中球因子は、ニューロン生存を促進するAKTシグナリング活性を誘発することが示された。更に、多くの疾患(例えば癌)は、多数のシグナリング蛋白質の活性化状態における変化を伴なう。多くの事例において、癌細胞で観察されるシグナリング活性は、非癌細胞の増殖因子刺激シグナリング活性を連想させる。
キナーゼシグナリング連鎖事象は、細胞内のほとんど全ての重大な決定プロセスにおいて重要な役割を果たすことが認識されている(概説については以下を参照されたい:Cell 100:113-127, 2000)。ある系における固有のシグナルトランスダクション経路の役割の決定は、固有のキナーゼに対する薬理学的阻害剤の出現によって促進された。しかしながら、そのようなキナーゼ(例えばプロテインキナーゼB/AKT、cJun−N末端キナーゼ(JNK)、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(p38)、p44/42ERK1/2(ERK)、PKA、PKC又はTYK2)に対する活性のモニタリングは、通常in vitroキナーゼアッセイを必要とし、最近ではイムノブロッティングによってこれら蛋白質のリン酸化状態がリン特異的抗体を用いて決定される。今日まで、希少な細胞亜集団と重要なシグナリング経路のキナーゼの活性化状態との関係を知ることは可能ではなかった。
タンパク分解により活性化される酵素にはカスパーゼがある。カスパーゼは、プログラムされた細胞死(当業界では“アポトーシス”と称される)を達成させる重要な部類のプロテアーゼである。カスパーゼはほとんどの細胞に構成的に存在し、単鎖プロエンザイムとしてサイトゾルに分布する。これらは、最初のタンパク分解切断によって大カスパーゼサブユニット及び小カスパーゼサブユニットに分割され、更に第二の切断によってN末端ドメインを除去されて完全な機能を有するプロテアーゼに活性化される。前記サブユニットは集合して2つの活性部位を有するテトラマーを形成する(Green, Cell 94:695-698, 1998)。
特に抗体を用いて、あるタンパク質の特定のアイソフォームの存在を、特に前記タンパク質の他のアイソフォームに存在しない抗原を前記アイソフォームが保有するとき、又は前記タンパク質の他のアイソフォームに存在しない抗原を前記アイソフォームが欠いているときに決定することができる。従って、前記アイソフォームは同じタンパク質の他のアイソフォームとは抗原的に異なるであろう。抗原的に異なるアイソフォームは共有結合した固有の成分を保有又は欠いているか、又は他のアイソフォームと異なる構成を有し、従って抗原的に区別することができる態様で同じアミノ酸配列を提示することができる。
タンパク質の発現及び機能に関する生化学的研究では伝統的に1つ又はいくつかのタンパク質に同時に焦点が当てられてきた。これは主に利用可能な研究技術による制約のためであった。正常又は異常な細胞生理は、多数の分子の相互作用に参画する多数のタンパク質の産物であることはよく知られている。治療方法を考案するためには、疾患の基礎となるメカニズムを理解することが望ましい。そのような理解には多数のタンパク質及びそれら分子の経時的な相互作用を考慮することが要求される。これに関して、重要な実験上の障害物の1つは、いかにして多数のタンパク質を単一の実験で分析し、例えば単一のタンパク質サンプルについて又は更に云えば単一細胞についてタンパク質発現プロフィルを決定するかということである。
細胞内でのタンパク質発現の定性的測定の他に、タンパク質発現の定量的測定も所望される。多くのタンパク質が多様な発現レベルで様々に機能することができ、更にタンパク質機能におけるそのような相違は細胞の生理における相違をもたらすことができるということはよく知られている。
更にまた、タンパク質の発現及び機能の研究のために、タンパク質を固相に固定することがしばしば必要である。ウェスタンブロット分析では、問題のタンパク質は電気泳動によってまず分離され、続いてニトロセルロース又はポリビニリデンジフロリド(PVDF)膜に固定される。タンパク質発現ライブラリーのファージディスプレースクリーニングでは、ファージによって発現された数百万個のタンパク質が膜上に固定される。ウェスタンブロッティング及びファージディスプレースクリーニングの両方で、タンパク質は非共有結合により固定される。続いて、問題のタンパク質をその固有の特性(すなわち抗体との相互作用)により選別する。他のいくつかの応用(例えば免疫沈澱及びアフィニティー精製)では、薬剤(例えば抗体、リガンド)は、それらの第一アミン、スルフヒドリル又は他の反応基を介して固相(例えばアガロースビーズ)に共有結合により結合される。一般には、固定後にもタンパク質は他のタンパク質又はリガンドと反応するそれらの能力を保持している。しかしながら、1つのサンプルから多数のタンパク質を固定したとしても、多数のタンパク質についてのタンパク質の発現、形態及びそのレベルの同時検出に関する問題は残っている。
従って、本発明の目的は上記に記載した問題を克服することである。従って、本発明は、1個の細胞内の複数のタンパク質の活性化状態を同時に検出するためのアプローチを提供する。本アプローチによって、複雑な細胞集団内の不均一性の迅速な検出がタンパク質の活性化状態を基準にして可能になり、前記細胞集団内のタンパク質の活性化状態において相関する変化を示す細胞サブセットの特定が可能になる。更にまた、本アプローチは、細胞の活性又は特性(例えば表面の分子の発現又は細胞の顆粒化度)と単一細胞レベルでのタンパク質の活性化との対比を可能にする。
上記の目的にしたがえば、本発明は、単一の細胞内の複数の活性化することができるタンパク質の活性化状態をフローサイトメトリーを使用して同時に検出する方法及び組成物を提供する。本発明は更に、単一細胞内の活性化できる複数のタンパク質の活性又は活性化状態を協調的に調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法及び組成物を提供する。前記方法及び組成物を用いて、病的状態の予想又は診断のために、及び病的状態の治療をモニターするために細胞内のタンパク質の活性化プロフィールを決定することができる。更にまた、本発明の方法及び組成物は、場合によって、単一細胞内の活性化できる複数のタンパク質の活性化状態を連続的に検出するために用いることができる。更に、本発明の方法及び組成物は、場合によって、単一タンパク質の活性化状態を検出するために、又は単一タンパク質の活性又は活性化状態を調節するために用いることができる。
本発明は、本発明の方法において有用な細胞集団、単一細胞、細胞溶解物、タンパク質、及び細胞集団、単一細胞、細胞溶解物、タンパク質を含むサンプルを提供する。特に本発明は、活性化できるタンパク質、及び活性化できるタンパク質の特定のアイソフォームと結合する活性化状態特異的抗体を提供する。ある特徴では、活性化状態特異的抗体は標識、好ましくは蛍光標識、より好ましくはFRET標識と結合される。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はキナーゼである。更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はカスパーゼである。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質は第一のカスパーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質は第二のカスパーゼである。更にまた別の特徴では、前記第一のカスパーゼのアイソフォームは第一のプロカスパーゼの切断生成物であり、更に前記第二のカスパーゼのアイソフォームは第二のプロカスパーゼの切断生成物である。別の特徴では、前記複数の活性化部位特異的抗体は、第一のカスパーゼのアイソフォームと結合する第一の活性化部位特異的抗体及び第二のカスパーゼのアイソフォームと結合する第二の活性化部位特異的抗体を含む。
更に別の特徴では、前記細胞集団は更に第二の活性化できるタンパク質を含み;前記複数の基質は更に、前記細胞集団内の第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み;更に工程c)はフローサイトメトリーを用いて、前記細胞集団の単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、ここで、前記第二の基質の修飾は前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。
更に別の特徴では、前記細胞集団は更に第二の活性化できるタンパク質を含み;前記複数の基質は更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み;更に工程d)はフローサイトメトリーを用いて、前記単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、ここで、前記修飾は前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。
また別の特徴では、本発明は、細胞内の少なくとも1つの第一の活性化できるタンパク質の活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む:a)その細胞の各々が少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質、第二の活性化できるタンパク質、及び第三の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供し(ここで前記第一の活性化できるタンパク質は第二の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第二の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム(アイソフォーム−2)を形成することができ、更に前記第二の活性化できるタンパク質は第三の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第三の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム(アイソフォーム−3)を形成することができる);b)前記細胞を第二の活性化状態特異的抗体、第三の活性状態特異的抗体及び生体活性候補物質と接触させ(ここで前記第二の活性化状態特異的抗体は前記アイソフォーム−2と結合することができ、更に前記第三の活性化状態特異的抗体は前記アイソフォーム−3と結合することができる);c)蛍光活性化細胞分類(FACS)を用い、前記アイソフォーム−2及びアイソフォーム−3の存在を基準にして前記細胞集団の単一細胞を分類し;更にd)生体活性候補物質の存在下及び非存在下で単一細胞内の前記アイソフォーム−2対アイソフォーム−3の比率を決定し、ここで生体活性候補物質の存在下及び非存在下におけるアイソフォーム−2対アイソフォーム−3の比率の相違は、前記第一の活性化できるタンパク質の活性を修飾する前記生体活性候補物質の能力の指標である。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はカスパーゼである。別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はキナーゼであり、更に別の特徴では、前記キナーゼはPI3Kであり、更に別の特徴では、前記PI3Kは増殖因子によって、又は細胞表面レセプターの活性化によって活性化される。
別の特徴では、前記キナーゼはPI3Kであり、前記第二の活性化できるタンパク質はPIP2であり、前記第三の活性化できるタンパク質はPIP3であり、アイソフォーム−2はPIP4,5ビスホスフェートであり、更にアイソフォーム−3はPIP3,4,5である。
更に別の特徴では、前記第一の活性化できるタンパク質はICAM−2であり、前記活性はアポトーシスであり、前記第二の活性化できるタンパク質はPIP2であり、前記第三の活性化できるタンパク質はPIP3であり、前記アイソフォーム−2はPIP4,5ビスホスフェートであり、更に前記アイソフォーム−3はPIP3,4,5である。更に別の特徴では、工程a)は更にICAM−2とICAM−3とのクラスター形成を含む。
更に別の特徴では、前記複数の活性化状態特異的抗体は、以下から成る抗体群から選択される少なくとも1つの抗体を含む:抗AKT−ホスホ(phospho)−Ser473、抗AKT−ホスホ−Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、抗TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ−Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン、抗PIP2及び抗PIP3。
更に別の特徴では、工程a)は更に、第一及び第二の活性化できるタンパク質の少なくとも1つの活性化を誘発する物質と細胞集団を接触させることを含む。
請求項15−22のいずれかに記載の方法では、工程a)は更に、第一、第二及び第三の活性化できるタンパク質の少なくとも1つの活性化を誘発する物質と細胞集団を接触させることを含む。
更に別の特徴では、前記方法は更に、第一の活性化できるタンパク質の活性化状態及び第二の活性化できるタンパク質の活性化状態を基準にして細胞を分類することを含む。
更に別の特徴では、第一の活性化状態特異的抗体は第一の標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は第二の蛍光標識を含み、更に前記分類は蛍光活性化細胞分類(FACS)による。
更に別の特徴では、第一の活性化状態特異的抗体は第一のFRET標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は第二のFRET標識を含み、更に前記分類は蛍光活性化細胞分類(FACS)による。
更に別の特徴では、第一の活性化状態特異的抗体はFRET標識を含み、第二の活性化状態特異的抗体は一標識を含み、更に前記分類は蛍光活性化細胞分類(FACS)による。
更に別の特徴では、工程a)は更に細胞を固定することを含む。
更に別の特徴では、細胞は哺乳類細胞である。
シグナリング系の細胞内アッセイは、シグナリング物質の活性(例えばキナーゼの活性)を基準にして複雑な集団内の機能的細胞亜集団の相関性を知ることができないことで制約を受ける。そのような相関性は、シグナル発生又は病的状態出現時に希少な細胞集団で生じるシグナリング状態における変化を識別するために重要である。本発明は、単一細胞内の複数の活性化できるタンパク質の活性化状態をフローサイトメトリーにより同時に検出する方法及び組成物を提供することによってこれらの問題を解決する。本発明は更に、単一細胞内の複数の活性化できるタンパク質の活性又は活性化状態を協調的に調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法及び組成物を提供する。本方法及び組成物を用いて、病的状態を予測又は診断するために、及び病的状態の治療をモニターするために細胞のタンパク質活性化プロフィールを決定することができる。更にまた、本発明の方法及び組成物を用いて、場合によって単一細胞内の複数の活性化できるタンパク質の活性化状態を連続的に検出することができる。更に、本発明の方法及び組成物を用いて、場合によって単一細胞内のただ1つのタンパク質の活性化状態を検出するか、又はただ1つのタンパク質の活性又は活性化状態を調節することができる。
本明細書で用いられるように、“活性化状態特異的抗体”又は“活性化状態抗体”という用語は、対応する特異的な抗原と特異的に結合する抗体を指す。好ましくは、前記対応する特異的な抗原は活性化できるタンパク質の特定のアイソフォームである。また好ましくは、活性化状態特異的抗体の結合は特定の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である。従って、好ましい実施態様では、活性化状態特異的抗体と活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームとの結合は、前記活性化できるタンパク質そのもの、及び前記活性化できるタンパク質の活性化状態の指標である。
種々の認識構造が当業界で公知で(例えば以下を参照されたい:Cochran et al. J. Am. Chem. Soc. (2001) 123:625-32; Boer et al. Blood (2002) 100:467-73、前記文献は各々参照により本明細書に含まれる)、当業界で知られている方法を用いて作製することができる(例えば以下を参照されたい: Boer et al. Blood (2002) 100:467-73; Gualillo et al. Mol. Cell Endocrinol. (2002) 190:83-9、前記文献は各々参照により本明細書に含まれる)。前記方法には例えば、認識構造物、例えば活性化できるタンパク質の標的構造に対して親和性をもつポリマーを製造するコンビケム(combi chem)法が含まれる(例えば以下を参照されたい:Barn et al. J. Comb. Chem. (2001) 3:534-41; Ju et al. Biotechnol. (1999) 64:232-9、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる)。別の好ましい実施態様では、前記活性化状態特異的抗体は、特定の活性化できるタンパク質のリン酸化されたアイソフォームとのみ結合し、前記活性化できるタンパク質がリン酸化されていないか又は脱リン酸化された前記活性化できるタンパク質のアイソフォームとは結合しないタンパク質である。別の好ましい実施態様では、前記活性化状態特異的抗体は、細胞内に存在する活性化できるタンパク質のアイソフォームとのみ結合し、細胞外に存在するものとは結合しないタンパク質であり、逆の場合もまた同様である。
好ましい実施態様では、前記認識構造は抗ラミニン単鎖抗体フラグメント(scFv)である(例えば以下を参照されたい:Sanz et al. Gene Therapy (2002) 9:1049-53; Tse et al. J. Mol. Biol. (2002) 317:85-94、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる)。
好ましい実施態様では、前記活性化できるタンパク質の前記生物学的、生化学的又は物理的特性(例えば酵素活性、修飾又は構造)は、活性惹起物質によって又は細胞のシグナリング事象によって誘発することができる。活性惹起物質の例には、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ(例えばカスパーゼ)及びホルモンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。細胞シグナリング事象の例には、レセプターのクラスター形成又は同系分子もしくはリガンドの結合が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では、活性化されたアイソフォーム又は活性化できるタンパク質の活性化された状態は、固有の又は特定の生物学的、生化学的又は物理的特性(活性化できるタンパク質の少なくとも1つの他の形態が所有しない特性)を有する前記活性化できるタンパク質の一形態である。そのような特性の例には、酵素活性(例えばキナーゼ活性及びプロテアーゼ活性)及びタンパク質結合活性が含まれるが、ただしこれらに限定されない。従って、そのような固有の又は特定の特性もしくは活性は活性化できるタンパク質の活性化されたアイソフォームに附随している。そのような特性又は活性は本明細書では時に活性化状態の活性と称される。
活性化状態の活性のまた別の例は活性化されたプロテアーゼのプロテアーゼ活性である。本明細書で用いられるように、プロテアーゼは、活性化されたときにアミノ酸配列を含むポリペプチド内のペプチド結合を加水分解することができるタンパク質を指すであろう。好ましいプロテアーゼは、カスパーゼとして知られるシステインプロテアーゼ類である。カスパーゼ活性はカスパーゼの基質を提供し、カスパーゼの存在下で基質の切断を決定することによって判定することができる。本発明の方法を用いてモニターすることができる活性化状態を有する他のシステインプロテアーゼにはカテプシンが含まれるが、ただしこれに限定されない。同様に、本発明の方法を用いてモニターできる更に別の種類のプロテアーゼにはセリンプロテアーゼが含まれ、前記プロテアーゼに関して適切な種々の種類が知られている。
リン酸化されたタンパク質アイソフォームと特異的に結合するが、非リン酸化アイソフォームとは特異的に結合しない多くの抗体(その多くが市販されている、例えば以下を参照されたい:Cell Signaling Technology, www.cellsignal.co.(前記の内容は参照により本明細書に含まれる))が製造されてきた。そのような多くの抗体は、可逆的にリン酸化されるシグナル誘発タンパク質の研究のために製造されてきた。特に、タンパク質キナーゼのリン酸化され活性化されたアイソフォームと特異的に結合する前記のような多くの抗体がこれまでに作製され、それらは本明細書では時にキナーゼ活性化状態抗体と称される。本発明で用いることができる特に好ましい抗体には以下が含まれる:ホスホ−AKTSer473モノクローナル抗4E2、ホスホ−p44/42 MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)モノクローナル抗体、ホスホ−TYK2(Tyr1054/1055)抗体、ホスホ−p38 MAPキナーゼ(Thr180/Tyr182)モノクローナル抗体28B10、ホスホ−PKC−PAN基質抗体、ホスホ−PKA−基質、ホスホ−SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)G9モノクローナル抗体、ホスホ−チロシンモノクローナル抗体(P-tyr-100)、-44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK/SAPK及びホスホ−AKT−Thr308。
失活アイソフォーム及び活性化アイソフォームとして存在することができ、前記アイソフォームが抗原的に区別できるまた別のタンパク質の例はカスパーゼである。カスパーゼは、タンパク質内のペプチド結合の加水分解を触媒するプロテアーゼである。カスパーゼは、タンパク分解活性のないカスパーゼ前駆体であるプロカスパーゼとして合成される。プロカスパーゼはプロテアーゼによって特異的に切断されて活性なカスパーゼを生じる。当業界で知られているように、前記は多様な他のプロテアーゼについても正しいことが判明している。前記にはシステイン及びセリンの両方のプロテアーゼ、例えばカテプシン、組織プラスミノーゲン活性化因子などが含まれ、当業界で周知のようにプロプロテアーゼとして存在することが知られている。
本発明は、あるサンプルについてカスパーゼの活性化状態プロフィールを判定する方法を提供する。前記方法は、多数のカスパーゼと特異的に結合するが前記カスパーゼが誘導された関連するプロカスパーゼとは結合しない多数の抗体を用いて多数のカスパーゼの活性化アイソフォームの存在を同時に判定することを含む。例えば、カスパーゼと特異的に結合するが、前記カスパーゼが誘導されたプロカスパーゼとは特異的に結合しない抗体は本発明の方法で有用である。前記のような抗体が多数市販されている(例えば以下を参照されたい:Cell Signaling Technology, www.cellsignal.co.(前記の内容は参照により本明細書に含まれる))。
好ましい実施態様では、本発明はあるサンプルについてキナーゼの活性化状態プロフィールを決定する方法を提供する。前記方法は、複数の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供し、更に前記細胞を少なくとも1つのリン酸化されていないタンパク質キナーゼの基質と、前記活性化されたキナーゼが存在する場合は前記キナーゼによって基質のリン酸化が提供される条件下で接触させ、リン酸化された基質と特異的に結合するリン基質抗体を用いてリン酸化されたタンパク質キナーゼ基質の存在を判定することを含む。好ましい実施態様では、本発明はあるサンプルについてキナーゼの活性化状態プロフィールを決定する方法を提供する。前記方法は、多数のタンパク質キナーゼ基質、多数のリン基質抗体及び多数の活性化状態抗体を使用し、多数のキナーゼの活性化状態を同時に判定することを含む。
別の実施態様では、本発明は、サンプル中の1つ又は2つ以上のタンパク質キナーゼ及び1つ又は2つ以上のカスパーゼの活性化状態を決定する方法を提供する。前記方法は、ここに提供したそれぞれの活性化状態プロフィールの決定方法を1つにまとめることによって達成される。好ましくは、前記サンプルは細胞の集団、1つの細胞、細胞溶解物又はタンパク質群を含む。
同様に、本発明は、キナーゼ及びプロテアーゼの任意の他の組合せ及び他の全ての組合せ(例えばキナーゼとカスパーゼ、キナーゼとカテプシン、キナーゼとセリンプロテアーゼ、カスパーゼとカテプシンなど)を用いる方法を提供する。
DNAチップと同様なチップを本発明の方法で使用することができる。アレー体及び予め形成したアレー中のチップに核酸をスポットする方法は知られている。更に、タンパク質チップ及び合成方法も知られている。これらの方法及び材料は、予め形成したアレー中のチップに活性化状態抗体を固定するために応用することができる。
好ましい実施態様では、そのようなチップは、多数のキナーゼ活性化状態抗体を含み、前記を用いてサンプルのキナーゼ活性化状態プロフィールを決定することができる。好ましい実施態様ではそのようなサンプルは細胞抽出物である。そのような方法では、活性化キナーゼの検出は当業界で知られているように“サンドイッチアッセイ”によって実施される。簡単に記せば、多数の固定されたキナーゼ活性化状態抗体が同時に多数の活性化キナーゼ(サンプルにそれらが存在する場合)と結合することができる条件下でサンプル(好ましくは細胞抽出物)をチップ上に通す。前記固定された抗体−キナーゼ複合体を場合によって洗浄し、更に、活性化されたキナーゼと特異的に結合することができる失活状態抗体を含む第二の複数の抗体と前記複合体を接触させ、一方前記キナーゼはキナーゼ活性化状態特異的抗体と特異的に結合する。そのような失活状態特異的抗体は、キナーゼ活性化状態特異的抗体によって認識されないエピトープを介して活性化キナーゼと特異的に結合する。失活状態特異的抗体と活性化状態抗体−活性化キナーゼ複合体との結合が判定され、サンプル中の活性化キナーゼの存在が示される。サンドイッチアッセイにおける第二の抗体の結合の判定は多くの多様な方法で実施できることは理解されよう。好ましくは、多数の失活状態特異的抗体は固有の標識を付され、検出が促進される。
また別の実施態様では、チップは多数の失活状態特異的抗体を含む。そのようなチップをサンプル(好ましくは細胞抽出物)と接触させ、更にキナーゼ活性化状態特異的抗体を含む第二の多数の抗体をサンドイッチアッセイで用い、サンプル中の多数の活性化キナーゼの存在を同時に決定する。好ましくは、多数の活性化状態特異的抗体は固有の標識を付されて検出が促進される。
“標識”とは、直接的に(すなわち一次標識)又は間接的に(すなわち二次標識)検出することができる分子を指す。例えば標識は可視化及び/又は測定可能で、そうでなければその有無を知ることができるように識別することができる。化合物は検出可能なシグナルを提供する標識と直接又は間接的に結合させることができる。前記標識は、例えば放射性同位元素、蛍光物、酵素、抗体、磁性粒子のような粒子、化学発光物質、又は特異的な結合分子などである。特異的な結合分子には対を形成するもの、例えばビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどが含まれる。好ましい標識には、蛍光標識、標識酵素及び放射性同位元素が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
別の好ましい実施態様では、蛍光標識はGFPであり、より好ましくはウミシイタケ(renilla)、プチロサルクス(ptilosarcus)又はオワンクラゲ(aequorea)のGFPである。
好ましい実施態様では、本発明の方法及び組成物で多数の蛍光標識が用いられる。好ましい実施態様では、少なくとも2つの蛍光標識が用いられ、それらは蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)対のメンバーである。
本発明で有用なFRET対(ドナー/アクセプター)にはEDANS/フルオレセイン、IAEDANS/フルオレセイン、フルオレセイン/テトラメチルローダミン、フルオレセイン/LCレッド640、フルオレセイン/Cy5、フルオレセイン/Cy5.5及びフルオレセイン/LCレッド705が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
蛍光消光は標識分子の経時的なモニタリングを可能にし、結合反応の経時的な連続情報を提供することは当業者には理解されよう。
“放射性同位元素”とは任意の放射性分子を指す。本発明で使用される適切な放射性同位元素には、14C、3H、32P、35S、125I及び131Iが含まれるが、ただしこれらに限定されない。標識としての放射性同位元素の使用は当業界では周知である。
ある結合対のパートナーはまた別の結合対のパートナーにもなりえることは当業者には理解されるところである。例えば抗原(第一の成分)は第一の抗体(第二の成分)と結合することができ、前記第一の抗体は次に第二の抗体(第三の成分)のための抗原となることができる。前記のような環境は、第一の成分と第三の成分が中間の第二の成分(前記第一及び第三の各々にとって結合対パートナーである)を介して間接的に結合することを可能にすることもまた理解されよう。
“表面基質結合分子”又は“付着用タグ”とは、特定の表面基質に対して結合親和性を有する分子を指す。一般に前記基質は、表面に適用され、取り込まれ又は付着させられる結合対の一方である。適切な表面基質結合分子及びそれらの表面基質には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない:ポリヒスチジン(ポリ−his)又はポリホスチジングリシン(ポリ−his−gly)タグとニッケル基質;グルタチオンSトランスフェラーゼタグとその抗体基質(Pierce Chemicalから入手できる);fluHAタグポリペプチドとその抗体12CA5基質(Field et al. Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165(1988));c−mycタグとそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体基質(Evan et al. Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616(1985));及び単純疱疹ウイルス糖タンパク質D(gD)タグとその抗体基質(Paborsky et al. Protein Engineering, 3(6):547-553(1990))。一般に、本発明で有用な表面結合基質分子には以下が含まれるが、ただしこれらに限定されない:ニッケル基質と結合するポリヒスチジン構造物(His−タグ)、抗体を含む表面基質と結合する抗原、アビジン基質と結合するハプテン(例えばビオチン)、及びカルモデュリンを含む表面基質と結合するCBP。
本発明のタグ成分は、前記タグの形態に大きく左右されるが多様な方法で製造できることは当業者には理解されよう。本発明の成分及びタグは好ましくは共有結合によって付着させられる。
タグもまたポリペプチドである場合、遺伝子組換えによるタグ−ポリペプチドの製造は下記で述べる。タグ標識タンパク質の製造は当業界では周知であり、そのような製造のためのキットは市販されている(例えば、Kodak及びSigmaから入手できる)。タグ標識タンパク質の例には、Flag−ポリペプチド及びHis−ポリペプチドが含まれるが、ただしこれらに限定されない。タグ標識タンパク質の製造及び使用方法は例えば下記Winstonらの文献の他に上記のキットの製品ハンドブックで見つけることができる(Winston et al. Genes and Devel. 13:270-283(1999)、前記文献は参照により本明細書に含まれる)。
タンパク質の放射性同位元素による標識方法は当業界で公知である。例えば、そのような方法は以下の文献で見出される:Ohta et al. Molec. Cell 3:535-541(1999)(前記文献は参照により本明細書に含まれる)。
遺伝子組換えによるタグ含有タンパク質の製造は周知であり、そのようなタンパク質を製造するキットが市販されている。例えばそのようなキット及びその使用は以下に記載されている:Qiaexpress Handbook(Joanne Crowe et al., Qiagen)(前記文献は参照により本明細書に含まれる)。
抗体の結合は標準的な方法(http://drmr.com.abcon)を用いるか、又はタンパク質−タンパク質/タンパク質−染料架橋キット(Molecular Probes, Eugene, Oregon)を用いて実施できる。
失活状態抗体もまた本発明で用いることができる。好ましい実施態様では、失活状態抗体はタンパク質の活性化形及び失活形の両方のエピトープと結合する。そのような抗体を用いてサンプル中の失活タンパク質プラス活性化タンパク質の量を決定できる。別の好ましい実施態様では、失活状態抗体は、タンパク質の失活形には存在するが、タンパク質の活性化形には存在しないエピトープと結合する。そのような抗体を用いて、サンプル中の失活タンパク質の量を決定することができる。両タイプの失活状態抗体を用いて、例えば本明細書に記載するように生体活性候補物質による処理の前後で活性化状態のタンパク質の量の変化が失活状態のタンパク質の量の変化と一致するか否かを決定することができる。例えば、そのような抗体を用いて、活性化タンパク質の増加が失活状態タンパク質の活性化によるものであるのか、又はタンパク質の発現増加によるものであるのか、又はその両方であるのかを決定することができる。
好ましい実施態様では、本発明は、単一細胞についてタンパク質の活性化状態プロフィルを決定する方法を提供する。前記方法は、少なくとも2つのタンパク質の活性化状態を基準にしてFACSにより細胞を分類することを含む。活性化状態特異的抗体を用い、タンパク質の活性化状態を基準にして細胞を分類する。
サンプル中の蛍光は蛍光測定装置を用いて測定できる。一般には、第一の波長をもつ励起供給源から発する励起放射線は励起装置を通過する。前記励起装置によって励起放射線はサンプルを励起させる。それに反応してサンプル中の蛍光性タンパク質は、前記励起波長とは異なる波長をもつ放射線を放出する。続いて集光装置はサンプルから放出されたものを採集する。前記装置は、スキャンニング中に固有の温度でサンプルを維持するために温度制御装置を含むことができる。ある実施態様では、多軸トランスレーションステージが、種々のウェルが暴露されるように多数のサンプルを保持するマイクロタイタープレートを移動させる。前記多軸トランスレーションステージ、温度制御装置、自動焦点設定装置並びに画像化及びデータ収集に附随する電子装置は、適切なプログラムによって制御されるデジタルコンピュータによって管理することができる。前記コンピュータはまたアッセイ中に収集したデータを表示のために別のフォーマットに変換することができる。
好ましい実施態様では、FRETは細胞内のタンパク質の活性化状態をモニターする方法として用いられる。FRETの程度は、励起される構築物に特徴的なスペクトル又は蛍光存続時間によって決定できる。前記は、例えばドナーの発する蛍光シグナルの強さ、アクセプターの蛍光シグナルの強さ、アクセプターの最大発光近くの蛍光の振幅対ドナーの最大発光近くの蛍光の振幅の比、又はドナーの励起状態存続時間を測定することによって決定することができる。例えば、リンカーの切断はドナーの蛍光の強さを増大させ、アクセプターの蛍光の強さを減少させ、アクセプターの蛍光の振幅対ドナーの蛍光の振幅の比を減少させ、更にドナーの励起状態の存続時間を増加させる。
好ましくは、FRETの程度における変化はドナー及びアクセプター成分の蛍光量の比における変化の関数として測定される(前記のプロセスは“レーショニング”(rationing)と称される)。基質の絶対量、励起の強さ及び濁度又はサンプル中の他のバックグラウンドの吸収における変化は、ほぼ平行であるドナー及びアクセプターからの蛍光の強さに影響を与える。従って、2つの発光の強さの比はより劇的で、どちらか一方の強さよりも好ましい切断の測定である。
本発明の方法の検出、分類又は単離工程は蛍光活性化細胞分類(FACS)技術を必要とするか(この場合FACSは特定の表面マーカーを含む集団から細胞を選別するために用いられる)、又は選別工程は、標的細胞の捕捉及び/又はバックグラウンドの除去のために捕捉支持体として磁性反応性粒子の使用を必要とするであろう。多様なFACS系が当業界で公知で、本発明の方法で使用することができる(例えば以下を参照されたい:WO99/54494(1999年4月16日出願);U.S.A.N. 20010006787(2001年7月5日出願)、前記文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる)。
別の実施態様では、陽性細胞は、活性化できるタンパク質のアイソフォームの存在を基準に細胞の磁性分離を用いて分離することができる。そのような分離技術では、陽性であることによって選択されるべき細胞を先ず特異的な結合物質(例えば抗体又は活性化できるタンパク質のアイソフォームと結合する試薬)と接触させる。続いて前記細胞を捕捉粒子(例えば磁性反応性粒子)と接触させる(前記捕捉粒子は特異的な結合物質(前記陽性細胞と結合している)と結合する試薬に結合されている)。続いて細胞−結合物質−粒子複合体を非陽性又は非標識細胞から、例えば磁場を用いて物理的に分離することができる。磁性反応性粒子を用いるときは、陽性又は標識細胞は磁場を用いて容器に保持し、一方陰性細胞は除去することができる。
前記の分離方法及び類似の分離方法は例えば以下の文献に記載されている:Baxter Immunotherapy Isolex training manual。
単一細胞内のリン酸化キナーゼの直接検出の他に、本方法は、キナーゼに特異的な基質及びリン基質抗体を本明細書に記載したように用いて、単一細胞内の活性化キナーゼの検出を提供する。好ましい実施態様では、細胞をそのような少なくとも2つの基質と接触させ、更にリン基質と接触させ、続いてFACSを用いてキナーゼの活性化を基準に分類する。特に好ましいものは、PKC基質PANリン基質(前記は、PKCβIIのSer660と相同なカルボキシ末端残基でリン酸化されたときにのみ、PKCのα、βI、βII及びδアイソフォームのための基質である)と特異的に結合するリン基質抗体、及びPKAリン基質(−3位のアルギニンとともにスレオニンのPKAリン酸化のコンセンサスリン酸化部位)と特異的に結合するリン基質抗体である。
好ましい実施態様では、少なくとも2つのタンパク質、好ましくはキナーゼ及び/又はカスパーゼの活性化状態を基準にしたFACSによる細胞分類は、FACSで読み出すことができる他の出力情報、例えば表面マーカーの存在、顆粒性及び細胞サイズと組み合わされて、多数のタンパク質の活性化状態とFACSによって単一細胞について測定できる他の細胞の特質との間の相関性が提供される。
本発明はまた、複雑な細胞混合物(例えば末梢血単核細胞)内の相関するタンパク質の活性化、好ましくはキナーゼ活性化を基準にして細胞の亜集団の存在を決定するために用いることができる。これらの亜集団は、異なる分化状態もしくは活性化状態又は異なる細胞系列もしくは亜系列を示しているかもしれない。
細胞間のシグナリングの変動がシグナル変換事象を定性的及び定量的でない状態で隠蔽することがないように、均質な細胞集団がシグナルトランスダクションの研究には要望されることは理解されよう。究極の均質な系は単一細胞である。本発明は、単一細胞でシグナルトランスダクションを分析する方法を提供する。前記方法では、中心的に関与するシグナル誘発タンパク質の活性化状態は失活状態と抗原的に区別される。
これらの方法では、複雑な細胞集団(例えば末梢血単核細胞又は未感作(naive)及び記憶保持(memory)リンパ球)で人工的条件及び刺激付与条件の両方について別個のシグナリング連鎖事象の特定が提供される。
好ましい実施態様では、単一細胞についてカスパーゼの活性化状態プロフィールを決定する方法が提供される。前記方法は細胞の集団を提供し、細胞集団をFACSによって分類することを含む。好ましくは、細胞は少なくとも1つのカスパーゼの活性化状態を基準にして分離される。好ましい実施態様では、本明細書に記載するカスパーゼ切断生成物の抗体を用いて、少なくとも1つのカスパーゼの活性化状態が決定される。
好ましい実施態様では、前記方法は、複数の細胞を複数の生体活性候補物質と接触させ、少なくとも1つのキナーゼの活性化を基準にして前記細胞をFACSによって分類することを含む。
好ましい実施態様では、カスパーゼ活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法が提供される。前記方法は、細胞を生体活性候補物質と接触させ、前記細胞内のカスパーゼの活性化をFACSによって前記細胞を分類することによって決定することを含む。
好ましい実施態様では、前記方法は、複数の細胞を複数の生体活性候補物質と接触させ、少なくとも1つのカスパーゼの活性化を基準にして前記細胞をFACSによって分類することを含む。
候補物質は多数の化学物質類を包含する。好ましい実施態様では候補物質は小分子である。別の好ましい実施態様では、候補物質は有機分子、特に小有機分子であり、タンパク質との構造的な相互反応(特に水素結合)に必要な官能基を含み、典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル又はカルボキシル基、好ましくは前記官能基の少なくとも2つを含む。候補物質はしばしば炭素環式又は複素環式構造、及び/又は芳香環もしくはポリ芳香環構造を含み、前記は1つ又は2つ以上の官能基で置換されている。
当業者には理解されように候補物質は多様な供給源から得られ、前記供給源には合成又は天然の化合物ライブラリーが含まれる。当業者には理解されるところであるが、本発明は、任意の調節候補物質ライブラリー(多様な公知の組合せ理論化学型ライブラリーを含む)をスクリーニングするために迅速で容易な方法を提供する。
また別には、好ましい実施態様では、候補物質として、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態をもつ天然の化合物ライブラリーが利用される。前記ライブラリーは入手可能であるか又は容易に製造できる。
更にまた、天然又は合成されたライブラリー及び化合物は、通常の化学的物理的及び生化学的手段により容易に改変される。公知の薬理学的物質を特定の又はランダムな化学的修飾(酵素的改変を含む)に付して構造的類似物を製造することができる。
好ましい実施態様では候補物質にはタンパク質、核酸及び化学物質が含まれる。
好ましい実施態様では、候補物質は約2から約50アミノ酸のペプチドであり、約5から約30アミノ酸が好ましく、約8から約20が特に好ましい。前記ペプチドは、天然に存在するタンパク質の消化物(上記で概略した)、ランダムペプチド、又は“偏向した”ランダムペプチドであろう。“任意抽出”とは、各核酸及びペプチドがそれぞれ本質的にランダムなヌクレオチド及びアミノ酸から成ることを意味する。一般的にはこれらランダムなペプチド(又は核酸、下記で説明する)は化学的に合成されるので、それらは任意のヌクレオチド又はアミノ酸を任意の位置に取り込むことができる。合成プロセスを任意抽出されたタンパク質又は核酸を生成するためにデザインして、配列の全長にわたって可能な組合せの全部又はほとんどを作製し、従ってランダムなタンパク質性の生体活性候補物質ライブラリーを作製できる。
好ましい実施態様では、前記偏向は、公知の種類の分子と相互作用するペプチド又は核酸に偏向する。例えば、候補物質がペプチドであるとき、細胞内シグナリングの多くは、小さなペプチドドメインにより他のポリペプチドと相互作用するポリペプチドの短い領域を介して実行されることが知られている。例えば、HIV−1エンベロープの細胞質ドメインの短い領域は細胞のカルモデュリンの作用を阻害することが以前に示された。Fasの細胞質ドメインの領域(前記はスズメバチのマストパラン毒素との相同性が示されている)は、致死的アポトーシス又はGタンパク質誘発機能をもつ短いペプチド領域に限定される。マガイニン(アフリカツメガエル(Xenopus)に由来する天然のペプチド)は強力な抗腫瘍活性及び抗菌活性を有する。タンパク質キナーゼCイソ酵素(βPKC)の短いペプチドフラグメントは、刺激後にアフリカツメガエルの卵母細胞でβPKCの核内移動を阻害することが示された。更に短いSH−3標的ペプチドが、SH−3タンパク質との特異的結合のための擬似基質として用いられた。この領域には文献が多数存在するので、前記はもちろん生物学的活性を有する利用可能なペプチドの簡単なリストである。従って、細胞内シグナル誘発連鎖事象に活性を有する小ペプチドの潜在的能力について多くの先例が存在する。更に、任意の分子の作動薬及び拮抗薬を調節候補物質の偏向抽出の基礎として用いることができる。
好ましい実施態様では調節候補物質はポリペプチドである。別の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは少なくとも4から20のアミノ酸をもつ環式ペプチドである。更に別の好ましい実施態様では、前記ポリペプチドは触媒活性のないポリペプチドである。触媒活性のないポリペプチドの例には、触媒活性のない活性化できるタンパク質、より具体的には触媒活性のないキナーゼ(例えばPI3K)又はカスパーゼが含まれるが、ただしこれらに限定されない。更に別の特徴では、調節候補物質は活性化できるタンパク質のペプチドフラグメントであり、前記ペプチドフラグメントは、前記活性化できるタンパク質の完全長アミノ酸配列のサブ配列であるアミノ酸配列を含む。
前記核酸は、具体的には一本鎖でも二本鎖でも、又は二本鎖もしくは一本鎖配列の両部分を含んでいてもよい。核酸は、DNA(ゲノムDNAでもcDNAでもよい)、RNA又はハイブリッドでもよい(ハイブリッド核酸はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組合せ及び塩基(ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサタニン、ヒポキサタニン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む)の任意の組合せを含む)。本明細書で用いられるように、“ヌクレオシド”という用語は、ヌクレオチド及びヌクレオシド並びにヌクレオチド類似体、並びに修飾ヌクレオシド(例えばアミノ修飾ヌクレオシド)を含む。更に、“ヌクレオシド”は天然に存在しない類似体構造を含む。従って、例えばペプチド核酸の個々の単位(各々は塩基を含む)は本明細書ではヌクレオシドと称される。
好ましい実施態様では、調節候補物質は触媒活性をもたないポリペプチドをコードする変異体cDNAである。そのような触媒活性をもたないポリペプチドの例には、触媒活性のない活性化できるタンパク質、及びより具体的には触媒活性のないキナーゼ(例えばPI3K)又はカスパーゼが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
好ましい実施態様では、調節候補物質はRNA、例えばアンチセンスRNA又はsiRNA(小さな抑制性(small inhibitory)RNA)である。別の好ましい実施態様では、siRNAは活性化できるタンパク質をコードするRNAを切断する。siRNAは本明細書で述べる方法及び当業界で公知の方法を用いて調製できる。
当業者には理解されるところであるが、2つ以上のタイプの候補物質を一度に、例えば本発明の方法で候補物質を一緒にすることによってスクリーニングすることができる。従って、使用される候補物質のライブラリーは、ただ1つのタイプの物質(すなわちペプチド)又は多数のタイプ(ペプチド及び有機物質)を含むことができる。
“一緒にする”とは、公知の方法を用いるか、又は本発明の方法を用いて検出できる活性を促進する条件下で、多様な成分を1つの反応混合物にin vitroで、又は1つの細胞にin vivoで一緒にすることを意味する(前記の促進される活性とは、例えば対応する抗原又は活性化できるタンパク質のアイソフォーム、又は活性化状態への抗体の結合である)。
好ましい実施態様では、反応混合物又は細胞は、96ウェルのプレート又は他の市販の多穴プレートの1つのウェルに収められる。また別の好ましい実施態様では、反応混合物又は細胞はFACS装置内に存在する。本発明で有用な他の多穴プレートには、384ウェルプレート及び1536ウェルプレートが含まれるが、ただしこれらに限定されない。本発明の方法で有用な、反応混合物又は細胞を入れる他の容器も当業者には明白であろう。
活性化できるタンパク質の活性化状態もしくは活性、又はそのような活性化状態もしくは活性の調節を検出するアッセイ成分の添加は、アッセイされる活性に適した条件下で連続的に又は予め定めた順序もしくはグループで実施できる。前記の適切な条件は本明細書に記載され、更に当業界で公知である。更なる手引きは下記に提供される(例えば実施例を参照されたい)。
好ましい実施態様では、本発明の方法は液体を操作する構成成分の使用を含む。前記液体操作系は、任意の数の構成成分を含む自動機械化システムを含むことができる。更に、ここに概略した任意の又は全ての工程を自動化することができる。従って、例えば本システムは完全に又は部分的に自動化できる。
完全に機械化されたシステム又は微量液体システムは、自動液体操作、粒子操作、細胞操作及び微生物操作装置(高処理ピペット操作装置を含む)を含み、スクリーニングの全工程を実施する。これには液体、粒子、細胞及び生物の取り扱い操作が含まれ、例えば吸引、分配、混合、希釈、洗浄、正確に測定した容積の移動、回収、及びピペットチップの廃棄、並びに単一サンプルの吸引物からマルチデリバリーのために同一容積を繰返しピペットで分配することが含まれる。前記の操作は、液体、粒子、細胞及び生物の移動で相互に夾雑することはない。前記装置は、マイクロプレートのサンプルのフィルター、メンブレン、及び/又は娘プレートへの自動複製、高密度の移動、全プレートの段階希釈、及び高性能操作を達成する。
好ましい実施態様では、アッセイの構成成分に対して固有の化学誘導粒子、プレート、カートリッジ、試験管、磁性粒子、又は他の固相マトリックスが用いられる。マイクロプレート、試験管又は任意の固相マトリックスの結合表面は、非極性表面、高度に極性をもつ表面、共有結合を促進する修飾デキストランコーティング、抗体コーティング、融合タンパク質又はペプチドを結合させるアフィニティー媒体、表面固定タンパク質(例えばリコンビナントプロテインA又はG)、ヌクレオチド樹脂又はコーティングを含み、更に他の親和性マトリックスも本発明で有用である。
好ましい実施態様では、サーモサイクラー及び温度調節システムを、熱交換器(例えば温度制御ブロック又はプラットフォーム)の温度の安定化に用いて、インキュベートサンプルの0℃から100℃の正確な温度制御を提供する。
好ましい実施態様では、単一磁性プローブもしくはマルチ磁性プローブ、アフィニティプローブを含む相互交換可能ペピットヘッド(シングル又はマルチチャネル)又はピペッターは液体、粒子、細胞及び生物を自動機械により操作する。マルチウェル又はマルチチューブ式磁性分離装置又はプラットフォームは、単一サンプル様式又はマルチサンプル様式で液体、粒子、細胞及び生物を操作する。
いくつかの実施態様では、本装置は検出装置を含み、前記検出装置は標識及びアッセイに応じて多様な種々の検出装置が可能である。好ましい実施態様では、有用な検出装置には、マルチ蛍光チャネルを有する顕微鏡;単波長並びに二重波長のエンドポイント及びカイネティクス性能をもつに蛍光、紫外光及び可視光の分光測定検出を提供するプレート読取装置、蛍光共鳴エネルギー伝達(FRET)、ルミネセンス、消光、二光量子励起、及び強度再配分;データ及び画像を捕捉し定量可能なフォーマットに変換するCCDカメラ;及びコンピューターワークステーションを含む。
好ましい実施態様では検出はFACSによる。別の特徴では、検出は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、例えば逆相HPLCである。更に別の特徴では検出は質量分析法による。
フローサイトメトリー又は毛細管電気泳動様式を磁性又は他のビーズ、粒子、細胞及び生物の個々の捕捉に用いることができる。
融通性をもつハード及びソフトウェアは装置が多数の応用に対して適合することを可能にする。ソフトのプログラムモジュールは方法の新たな作製、改変及び実施を可能にする。システム診断モジュールは、装置のアラインメント、正しい連結及び駆動を可能にする。カスタマイズされたツール、検査室器具、並びに液体、粒子、細胞及び生物の移動パターンは種々の用途での実施を可能にする。データベースは方法及びパラメーターの保存を可能にする。自動機械化インターフェース及びコンピュータインターフェースは装置間の情報のやり取りを可能にする。
好ましい実施態様では、自動機械化装置は、メモリーと一組の入出力装置(例えばキーボード、マウス、モニター、プリンターなど)間で母線を介して情報をやり取りする中央演算ユニットを含む。繰り返せば、下記に概略するように前記は本発明の多重複合装置のためにCPUに付加するか又はCPUの代用とすることができる。中央演算ユニット、メモリー、入出力装置及び母線間の一般的な相互作用は当業界では公知である。従って、実施される実験に応じた多様な種々の手順がCPUメモリーに保存される。
機械化液体操作システムによって任意の数の試薬(緩衝液、試薬、サンプル、洗浄液、アッセイ成分(例えば標識プローブ)などを含む)の利用が可能である。
以下の実施例は、上記に記載した発明の使用態様をより完全に述べるために、更に本発明の種々の特徴を実施するために意図される最良の態様を説明するために役立つ。これらの実施例は全く本発明の範囲を限定するものではなく、説明のために提供されることは理解されよう。本明細書に引用した全ての参考文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる。
実施例1
単一細胞における機能的なシグナリング分析:多染フローサイトメトリーを用いる多数のキナーゼ活性の同時測定
シグナリング系の細胞内アッセイは、キナーゼ活性を基準にして複雑な細胞集団内の機能的な細胞亜集団の相関性を決定することが不可能であるために制約を受けてきた。そのような相関性は、シグナル発生時又は疾患の出現時に希少な細胞集団で生じるシグナリング状態の変化を識別するために重要であろう。本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者ら(本明細書では“我々”ともいう)は、マルチパラメーターフローサイトメトリー分析によって複雑な細胞集団内の亜集団で以下のメンバーのキナーゼ活性を同時に検出する能力を示す:マイトジェン活性化タンパク質キナーゼファミリーのメンバー(p38MAPK, p44/42MAPK, JNK/SAPK)、細胞生存経路のメンバー(PKA, AKT/PKB)、T細胞活性化経路のメンバー(TYK2, PKC)。更に本実施例で、本発明者らは、以下に対する異なるシグナル発生連鎖事象を特定するこれらプローブの有用性を明らかにする:1)末梢血単核細胞(PBMC)の人工的及び生理学的刺激条件の両刺激条件;2)5つの異なるマーカーによって特定されるヒトの記憶保持リンパ球及び未感作リンパ球サブセットにおけるサイトカイン刺激;及び3)可能なシグナリング階層におけるキナーゼ活性化の順序決定。多染フローサイトメトリーによるキナーゼ活性測定(PFC−KA)によって、シグナリング経路の相互作用の多次元分析は機能的なシグナリング経路の単一細胞レベルでの評価を可能にすることが示された。
複雑な細胞集団(例えば末梢血)における単一細胞レベルでの多数の活性化されたシグナリング経路の研究は以前には不可能であった。マルチパラメーターによるフローサイトメトリー分析は、小さな細胞亜集団(異なる細胞のサブセット、分化又は活性化状態を示す)を細胞表面マーカーを用いて区別することを可能にする。シグナリング経路の下流の活性化は、p−ガラクトシド1,2及びβ−グルクロニダーゼ3に対する酵素活性の細胞内検出を含むレポーター系によって情報を読み出し、特定のプロモーター及び緑色蛍光タンパク質(GFP)の転写を調べることができる。タンパク質間の相互作用は蛍光共鳴エネルギー伝達及びバイオルミネセンス共鳴エネルギー伝達4,5,6,7の両方法によって決定することができる。これら後者の方法のいずれかでは内因性キナーゼの活性化状態にアクセスできないので、シグナリング系の活性化は、レポータータンパク質の過剰発現を介して決定される。
キナーゼシグナリング連鎖事象は、細胞のほとんど全ての重大な決定プロセスで重要な役割を果たすことが知られている8。ある系における固有のシグナルトランスダクション経路の役割決定は、固有のキナーゼに対する薬理学的阻害剤の出現によって促進されてきた。タンパク質キナーゼB/AKT、c-Jun-N末端キナーゼ(JNK)、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(p38)のようなキナーゼの活性、p44/42 ERK1/2(ERK)活性、PKA活性、PKC活性、TYK2活性のモニタリングは通常はin vitroキナーゼアッセイに依存するか、又はより最近ではリン特異的抗体を用いて前記キナーゼのリン酸化状態を決定するイムノブロッティングに依存している。今日まで、重要なシグナリング経路で希少な亜集団とキナーゼの活性化状態との相関性を知ることは不可能であった。11色のフローサイトメトリー9の最近の出現により、我々は生物学的に関連する細胞のサブセットを特定のキナーゼ活性状態を基準に分析することを試みた。
これらプローブの生物学的に関連するシグナリング事象を表す能力を示すために、我々は、末梢血単核細胞(PBMC)(潜在的キナーゼ活性についておそらく不均質であろうと考えられる細胞集団)を活性化し、細胞のサブセットが異なるキナーゼ活性化のカイネティクスを示すか否かを調べた。混合培養中の全PBMCをCD3及びCD28モノクローナル抗体で刺激し、表面レセプターの生理的T細胞活性化を摸倣した。また別の刺激形態として、我々はこれらの細胞を人工的なT細胞活性化物質、ホルバルミリスチルアセテート(PMA)及びイオノマイシンで活性化した。細胞サブセットをCD4+(T細胞サブセットマーカー)又はCD19+(B細胞マーカー)に対してゲートコントロールした。T細胞及びB細胞サブセットを比較して、ある刺激に対してこれら2つの細胞タイプ間における異なるキナーゼ活性プロフィールを見出した。図2Aは、初代B及びT細胞が、非刺激状態でp38 MAPK及びp44/42 MAPKのキナーゼ活性に関して固有の相違を有し、用いた種々の刺激条件に対して異なる反応をもつことを示している。p38及びp44/42活性の両活性のT細胞に対する劇的な相違は、PMA/イオノマイシン刺激及びCD3/CD28刺激を比較したときに認められ、CD3/CD28はp38又はp44/42経路でCD4+のT細胞の完全な活性化を保証しないことを示唆している。CD19+のB細胞のある程度の活性化がCD3及びCD28の組合せで観察され、我々は、T細胞の活性化及びそれらがB細胞に対する刺激性サイトカインを生成したためであると考える。また別には他のT細胞ヘルパーとB細胞との相互作用がCD3及びCD28で観察される活性をもたらしたのかもしれない。
キナーゼ活性のゲートコントロール分析によって得ることができる情報タイプの例として、伝統的なヒストグラム分析及びキナーゼ活性ゲートコントロール分析の両分析を実施し、下記に提示する。培養液中又はPMA/イオノマイシンで刺激中のJurkat細胞を多数の細胞内キナーゼ活性及びCD69発現について調べた(図2C)。PKC、p38及びp44/42の基礎活性は観察されるが、JNK、p38、p44/42、PKC及びPKAに対するキナーゼ活性はPMA/イオノマイシン刺激細胞について劇的に変化する(図2C)。このことは、CD69+のPBMCについての観察(図2B)と一致する。従って、無傷の細胞のリン酸化事象をモニターすることによって、活性を他のパラメーター(例えば表面分子発現、細胞サイズ又は細胞の顆粒化)と相関させることができる(前記はキナーゼリン酸化状態の通常の溶解物分析では不可能である)。
これら後者の結果によって、我々は、観察された亜集団の変化は細胞タンパク質とキナーゼとの結合における変化を示していると考える。従って、標準化用抗体を基準にして細胞内染色を標準化するために複数の抗体を同時に使用することには潜在的な混乱が存在し、このことはそのようなデータの解釈に注意が必要であることの正当性を示す。しかしながら、これらの結果は、同じタンパク質上の異なるエピトープを認識する一連の抗体は、細胞の結合パートナーの存在、それらが標的タンパク質構造上で相互作用するマップを推論し、そのような結合に附随する特定の機能的相関性を引き出すことを可能にするであろう。我々は、複雑な細胞集団で細胞毎に内因性タンパク質に関してタンパク質の相互作用をマッピングすることを可能にする他の技術を知らない。
マルチパラメーターフローサイトメトリーを利用して、我々は、リンパ球サブセットを5つもの細胞内キナーゼ活性のレベルを基準にして区別することができることを明らかにした。本アプローチの能力は、細胞内シグナリング経路の詳細な分析で評価されるだけでなく、フローサイトメトリーによって単一細胞で多数のキナーゼ活性を測定する能力を初めて示すことができた。単一細胞レベルでの機能的シグナリングの詳細な分析は、希少な細胞集団(例えば幹細胞又は幹細胞の原始細胞)に応用することが可能であり、更に一定の細胞サブセットの希少性のためにin vitroでの機能の性状決定のための細胞単離を妨げている多くの系にも広げることができる。これらキナーゼ特異的プローブの応用は以下のとおりである:(1)種々の細胞プロセスの生物学を理解するためにある刺激に対する固有のシグナリングプロフィールを得る、(2)発生、分化又は細胞の発育維持に関して希少細胞集団でシグナリングメカニズムをモニターする、(3)哺乳類細胞内の特定のキナーゼ活性の薬理学的阻害剤について高処理性能をもつFACSによるスクリーニングでこれらキナーゼプローブ(及び他のキナーゼプローブ)を利用する潜在的能力、(4)全体的なスケールでキナーゼ活性化連鎖事象を時間的及び空間的に分解する潜在的能力、及び(5)適切な抗体セットを用いて刺激の前後に結合パートナーを推論することができる可能性。他の細胞内キナーゼプローブの開発はシグナリングネットワークの解明に寄与することができ、更に多染フローサイトメトリー(11色、13パラメーター)技術9との組合せによって、免疫系の複雑な細胞シグナルの理解を促進することができるであろう。更にまた、これらプローブの用途を臨床的な応用に拡大し、疾患をもつ患者に由来する細胞の細胞内キナーゼ活性を疾患の進行の診断のためのインジケーターとして測定することができるかもしれない。
細胞培養及び初代細胞の単離
Jurkat細胞は、RPMI 1640、10%FCS、1%PSQ(10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン(1000単位/mL及び2mMのL−グルタミン、PSQ))中で維持した。NIH3T3細胞はDMEM(ダルベッコー改変イーグル培養液)、10%ドナー仔牛血清、1%PSQ中で維持した。初代細胞の調製では、単核細胞は健常ドナーの血液(Stanford Blood Bank, Stanford, California)から単離した。ヒト末梢血単球は、全血のフィコール−プラーク密度遠心分離(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)及びプラスチック培養皿への粘着による粘着性細胞の除去によって得た。単離した細胞は完全な培溶液中で維持した。磁気活性化細胞分類(MACS, Miltenyl Biotech, Baraisch-Gladbach, Germany)は記載のようにいくつかの実験で用いて、CD16、CD14、CD44、HLA-DR又はCD19ビオチン付加抗体(Dynal, Oslo, Norway)及びストレプトアビジン−磁性ビーズ(Dynal, Oslo, Norway)の組合せを用いて陰性単離によってCD3+のT細胞を濃縮した。使用した化学物質及び生物学的物質は以下のいずれかから得た:Sigma, St. Louis, Missouri; Cell Signaling Technologies, Beverly, Massachusetts; Roche Biochemicals, Indianapolis, Indiana; 又はPeprotech, Rocky Hill, New Jersey: イオノマイシン(1μM、Sigma)、フォルバルミリスチルアセテート(1μM、Sigma)、アニソマイシン(10μM、Sigma)、PDGF10pg/mL又は表示の量(Roche Biochemicals)、SB203580(10μM、Cell Signaling Technology)、LY294002(10μM、Cell Signaling Technology)、U0126(10μM、Cell Signaling Technology)、ビスインドリルマレイミド(Bisindolymaleimeide)II(10μM、Sigma)、カリクリンA(10μM、Sigma)、スタウロスポリン(1μM、Sigma)、ジェニステイン(10μM、Sigma)、IL−2(10pg/mL、Peprotech)、IL−3(10pg/mL、Peprotech)、IL−1α(Roche Biochemicals(10pg/mL))、上皮増殖因子(EGF, Roche Biochemicals)、ラムダホスファターゼ及びウシ腸ホスファターゼ(CIP, New England Biolabs, Beverly, Massachusetts)、CD40L(Dr. Strobl(Department of Molecular Pharmacology, Stanford University)より寄贈)、CD3(OKT3)及びCD28エンドトキシン/アザイド非含有モノクローナル抗体(PharMingen, La Jolla, California)。
2X106細胞を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって細胞抽出物を調製した。溶解緩衝液は以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX100、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim, Basel, Switzerland。抽出物を14000rpmで5分4℃で遠心し、細胞溶解物(BCAタンパク質アッセイ(Pierce, Rockford)で測定したとき20g)を12%から15%のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、PVDFメンブレンに標準的な方法を用いて移した。使用した抗体はブロットの側に表示されている(Cell Signaling Technologies(Beverly, Massachusetts)から購入)。細胞の処理は適切な場合には表示されている。
キナーゼ活性のアッセイプロトコルはAKT、p38、p44/42、JNKについて同様で、代用した使用試薬はそれぞれのキナーゼアッセイについて記載されている。キナーゼ活性のアッセイに使用した全ての試薬はCell Signaling Technologies(Beverly, Massachusetts)から入手した。キナーゼ活性は、それぞれ固定AKT1G1モノクローナル抗体、固定ホスホ−p38MAPKモノクローナル抗体、固定ホスホ−p44/42モノクローナル抗体、又はc-Jun融合タンパク質ビーズを用い細胞からキナーゼAKT、p38、p44/42又はJNKを免疫沈澱させることによって検出した。固定されたキナーゼは、それぞれGSK3融合タンパク質、ATF-2融合タンパク質、Elk-1融合タンパク質又はc-Jun融合タンパク質ビーズによるキナーゼアッセイで使用した。2X106のNIH3T3又は2X106のJurkat細胞をPBSで2回洗浄し、固定キナーゼ抗体又はビーズ(1:200)とともに4℃で2時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。免疫複合体を4回細胞溶解緩衝液で洗浄し、40μLのキナーゼ緩衝液(25mMトリス(pH7.5)、5mMβ−グリセロホスフェート、2mMのDTT、0.1mMのNa3VO4、10mMのMgCl2)に30℃で30分再懸濁させた。前記キナーゼ緩衝液は、200μMのATP及び1μgの融合タンパク質を補充されていた(JNK活性アッセイは除く、前記ではATPは活性誘発に十分であった)。キナーゼ反応はSDSサンプル緩衝液で5分間煮沸して停止させ、GSK3、ATF、Elk-1又はcJunのリン酸化状態は、リン特異的抗体、ホスホ−GSK3αβ(ser21/9)、ホスホ−Elk-1ser383)、ホスホ−ATF2(thr71)又はホスホ−cJun(ser63)をそれぞれ用いてイムノブロッティングを実施し、ECL検出(Amersham)を用いて可視化することによって検出した。
抗体の共役は標準的方法(http://drmr.com.abcon)を用いて実施するか、又はタンパク質−タンパク質/タンパク質−染料架橋キット(Molecular Probes, Eugene, Oregon)を用いて実施した。リン特異的及び非リン特異的抗体はCell Signaling Technologies(Beverly, Massachusetts)から入手するか、又は表示したとおりであった。共役を実施した抗体は以下のものであった:ホスホ−AKTSer473モノクローナル抗4E2、ホスホ−p44/42 MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)モノクローナル抗体、ホスホ−TYK2(Tyr1054/1055)抗体、ホスホ−p38 MAPキナーゼ(Thr180/Tyr182)モノクローナル抗体28B10、ホスホ−PKC−PAN基質抗体、ホスホ−PKA−基質、ホスホ−SAPK/JNK(Thr183 Tyr185)G9モノクローナル抗体、ホスホ−チロシンモノクローナル抗体(P-tyr-100)、-44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK/SAPK及びホスホ−AKT−Thr308。抗TYK2はSanta Cruz Biotechnologies(Santa Cruz, California)から入手した。ホスホ−PYK2(pY402)抗体及びホスホ−FAK(pY397)はBiosource(Carillo, California)から入手した。アレキサ−フルアー染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680)、カスケードブルー、カスケードイェロー及びR−フィコエリスリン(PE)はMolecular Probes( Eugene, Oregon)から購入した。FITC、ローダミン及びテキサスレッドはPierce(Rockford, Illinois)から購入した。Cy5、Cy 5.5、Cy7はAmersham Life Science(Pittsburgh, Pennsylvania)から入手した。Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APCのための縦並び共役プロトコルはwww.drmr.com/abconで見つけることができる。蛍光プローブ共役の定量を算定して標識の程度を決定する。染料のスペクトル特性を含むプロトコルはwww.metazoa.com/UPL3419で見つけることができる。一般的に、使用プローブはタンパク質1moleにつき29moleの蛍光染料を有していた。
細胞内及び細胞外染色は初めに記載(www.metezoa.com/UPL3287)されたように実施したが改変されてあった。約1−10X107個の末梢血単核細胞を磁気活性化細胞分類によって入手し、刺激条件で12時間処理し、フローサイトメトリーのために調製した。表面を20分染色し、更に細胞内染色試薬(詳細は下記参照)のために部分標本に分割した。細胞内染色は、サイトフィクス/サイトパーム(CytoFix/CytoPerm)緩衝液(PharMingen, La Jolla, California)による透過性付与、氷上で細胞内染色30分、及び1%のパラホルムアルデヒドに最終的懸濁により実施した。アイソタイプコントロールマッチ抗体を染色コントロールのために用いた。下記のものの他に表1に挙げた細胞表面マーカーに対する精製抗体はPharMingen(La Jolla, California)から入手するか、又はHerzenberg laboratory(Department of Genetics, Stanford University)で表示の蛍光発光団と共役させた:CD69-APC、CD69-PE、CD4-FITC、CD4-APC、CD4-PE、CD3-APC、CD3-PE、CD3-PERCP、CD19-FITC、CD19-APC。
単色及び四色フローサイトメトリーデータ採取をセルクェスト(CELLQuest)ソフトを用いてファックスカリバー(FACSCalibur)マシーン(Beckton Dickinson, San Jose, California)で収集し、フロージョ(Flowjo)ソフト(Tree Star, San Carlos, California)を用いて分析及び提示した。四色以下についてのデータは、106細胞/サンプルを含む3つの別個の実験の代表的なもので、50000例を収集し、カリブライト(Calibrite)ビーズ(Becton Dickinson, San Jose, Califonia)を用いて修正した。11色データ採取は、モフロー(MoFlo)エレクトロニクス(Cytomation, Fort Collins, Colorado)に連結した改変ファックスタープラス(FacstarPlus, Becton Dickison, San Jose, California)で収集した。データはファックスデスク(FACSDesk)ソフトで収集し、フロージョソフトを用いて補正、分析及び提示した。11色フローサイトメトリーのためのデータは最小限200000例を収集した。
下の表はこれらの実験で用いたアレキサ蛍光染料プローブを示している。種々のキナーゼを、アレキサ染料で標識した7つの異なるリン特異的抗体の1つ又は2つ以上と共役させた。前記抗体は、前記の色でリン特異的プローブが用いられたことを示すために、上記の表でp−プローブとして示されている。それらは、表1の上段で種々の染色で用いられ、マルチパラメーター分析のために相補的染料組合せを可能にする。
表2は、血清枯渇Jurkat細胞で特定のキナーゼ活性を誘発及び阻害するために用いた試薬を示している(Jurkat細胞は文献3、20−32に記載されている)。24時間の血清枯渇はバックグラウンドのリン酸化を顕著に減少させた。表示された濃度以外の濃度は適切な場所に示されている(処理プロトコルのための方法の項を参照されたい)。
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者ら(本明細書ではまた“我々”と称する)は、LFA1のICAM−2による刺激は、免疫表現型、リンタンパク質シグナリング、サイトカイン産生及び転写活性の同時多次元(33パラメーター)評価によって判定したとき、CD3/CD28の共働刺激の存在下でヒト未感作T細胞(CD3+CD4+CD8-CD62L+CD45RA+CD28+CD27+CD11adim)の活性化に機能的に寄与することを示す。可溶性ICAM−2(sICAM−2)は、LFA−1との相互作用時に、リン酸化及びLFA−1結合タンパク質(サイトヘシン−1及びJAB1、前記はp44/42 MAPK経路の活性化及びcJunの活性化をそれぞれ誘発する)を開始した。sICAM−2は、CD3/CD28刺激と一緒にしたとき、多数の活性キナーゼ(p44/42、p38、JNK MAPK、lck、AKT、PLCg)の急速なカイネティクスを強化し、活性化マーカー、CD25及びCD69によって決定したときCD3/CD28刺激の閾値を10000倍低下させた。CD3/CD28/LFA−1シグナルの統合は、NF−kB、Creb、Atf2、c−Fos及びc−Relの核内分布の増加をもたらす。これらの条件は、IL−2発現、NFAT、NF−kB及びAP−1活性、並びに細胞周期の進行によって測定したときT細胞活性化を最適化させた。更にまた、CD3/CD28/LFA−1の三重刺激は未感作ヒトT細胞をTH1表現型に偏向させ、CD3/CD28刺激はTH2表現型を優先させた。これらの結果は、ICAM−2とLFA−1との相互作用は、T細胞の活性化及び分化に機能的に寄与することができることを示している。
特に、本実施例は、本発明の方法及び組成物による多染フローサイトメトリーは、多数の細胞内キナーゼ活性の同時測定により特定のリンパ球サブセットの迅速な特定を可能にすることを示している。本アプローチは、単一細胞レベルで固有の細胞プロセス(例えばT細胞活性化)に関して機能的なシグナリングの情報を提供する。
T細胞活性化は、抗原レセプター(TCR-CD3)シグナルと共働刺激シグナル(例えばB7/CD28)との統合を含む多段プロセスである(Croft and Dubey, 1997)。抗原特異的TCR-CD3複合体と抗原提示細胞(APC)上の被認識ペプチド−MHC複合体との嵌合がin vivoのT細胞活性化に必要である。T細胞共働刺激表面分子CD28、CD2(LFA-2)及びそれらのAPCカウンターレセプターB7(CD80-86)、CD58(LFA-3)はT細胞の活性化を開始させる(Bjorndahl et al. 1989; Cefai et al., 1996; Cerdan et al. 1992; Chambers and Allison, 1999; Lenschow et al. 1996)。T細胞とAPCとの間の粘着は免疫学的シナプスの形成に必要であり、T細胞表面分子LFA-1(CD11a/CD18)(de Fougerolls et al. 1991; Dustin et al.1989; Koopman et al. 1992)及び細胞内粘着分子リガンド(ICAM)によって仲介される。
TCR-CD3及びCD28連結に必要なシグナルに関する利用可能なデータが大量に存在するのとは対照的に、T細胞とAPCとの接触に必要な粘着仲介事象によって生じる特異的なシグナルについては少ししか判明していない。しかしながら、最適なT細胞の増殖及びIL-2産生の強化が、T細胞上の共働刺激レセプターとそれらのAPC上のカウンターリガンドとの間の粘着性相互作用から生じる、TCR-CD3及びCD28以外の刺激を要求するということを示す証拠が存在する(Fine and Kruisbeek, 1991; Salomon and Bluestone, 1998; Simmons, 1995; Starling et al. 1995; Zhang et al. 1997)。T細胞の活性化を調べるために用いられた昆虫及び線維芽細胞モデル系は、10000倍以上の抗原濃度の増加は未感作CD4+のT細胞の増殖又はICAM/LFA-1相互作用の非存在下でのサイトカイン合成を開始させることができないことを明らかにした(Abraham et al. 1999; Ragazzo et al. 2001)。更にまた、ICAM-1/LFA-1相互作用はTCRζ鎖の過剰リン酸化p23形の出現を促進させることがまた観察された(Ragazzo et al. 2001)。これらの観察及び他の観察(TCR-CD3との共同連結で、LFA-1/ICAM相互作用は持続的細胞内カルシウム反応をもたらし、イノシトールリン脂質加水分解を増加させることができる(van Seventer 1982; Wulfing 1998; Rovere 1996))にもかかわらず、LFA-1仲介“共働刺激”シグナルに対する特異的な機能的帰結は完全には理解されていない。更にまた、これら後者の研究は、LFA-1/ICAM相互作用は単により長いTCR嵌合を可能にするという主張を軽視し、むしろLFA-1/ICAM相互作用は単独で重要なシグナリング事象を開始させる能力をもつということを我々に示唆した。
ICAM-2/LFA-1相互作用はJAB1及びサイトヘシン−1の放出及びリン酸化を誘発する
一連のキナーゼプロファイリングの実験で、我々は、膜−ICAM-2の可溶化型(sICAM-2、材料と方法の項参照)はLFA-1の活性化を介してp44/42 MAPKの活性化を誘発することを観察した(Perez and Nolan, 原稿は提示、添付のコピーを参照されたい)(前記の活性化はCD3及びCD28刺激とはカイネティクスが異なっている(データは示されていない))。更にまた、JNK活性の非存在下でLFA-1刺激はc-Junリン酸化を誘発することが観察された(データは示されていない)。従って、我々は、ヒト未感作CD4+T細胞でICAM-2誘発シグナリングの機能的な相違を調べることにした。
LFA-1刺激はc-Junのリン酸化及び核内移動(CD3/CD28刺激に関する付加的作用)を誘発した(図6A)。特異的な化学的阻害剤SP600125(Bennett et al. 2001)によるJNKの阻害は、単一細胞分析で調べたときsICAM誘発c-Junリン酸化を停止させなかった(図6B上段)。最近になって、JAB1は、JNK活性の非存在下でc-Junのリン酸化を仲介するLFA-1結合タンパク質として特定された(Bianchi et al. 2000)。α−JAB1抗体(材料と方法の項参照)の細胞内デリバリーはLFA-1誘発c-Junリン酸化を停止させた(図6B、下段)。T細胞内のサイトヘシン−1及びJAB-1の両者は、LFA-1刺激に際して膜から移動することが可視化によって明らかになった(図6C)。人工的に抗JAB1をロードした細胞は刺激の非存在下で膜から移動したJAB1を示し、更にサイトヘシン−1の分布には変化がないことを示した(図6C)。従って、LFA-1からJAB1の抗体の分裂はLFA-1誘発c-Junリン酸化を阻害し、レセプター−リガンド相互作用が、JAB1を介するc-Junへのレセプターシグナリングに必要であることを示唆した。
我々は、CD3、CD28及びLFA-1刺激に対する多数の活性キナーゼのカイネティクス分析をフローサイトメトリーによって実施した(補充の図6を参照されたい)。活性化速度は調べた個々の刺激について変動する(データは示されていない)ので、我々は、リンタンパク質による分析でCD3/CD28対CD3/CD28/LFA-1の組合せを調べることにした。我々は、精製ヒト未感作CD4T細胞でCD3/CD28対CD3/CD28/LFA-1刺激によって誘発されるシグナリングタンパク質の別個の分析のために96のリン及び非リン特異的抗体の組合せをスポットすることによりリンタンパク質アレイを開発した(図7A)。初代未感作T細胞の濃縮は、CD8、CD19、CD16、CD14、HLA-DR及びCD44マーカーを用いてそれぞれ細胞毒性T細胞、B細胞、NK細胞、マクロファージ及び活性化T細胞をヒトPBMCから除去し磁気活性化細胞分類により実施した。細胞を溶解させた後、等量のタンパク質溶解物をアレキサ532又はアレキサ680で標識し、サンプルをアレイに同時ハイブリダイズさせた。両染料の蛍光強度を蛍光プレート読取装置で読み取り、ログ比をコンピューターで算出し検査した刺激間で識別されるシグナルを得た。両チャンネルの蛍光強度をXY座標グリッドに表した(図7A)。リン酸化における倍数(fold)誘発(ログ比から決定)をカラーコード化して倍数変化を表し(赤の0倍数誘発から緑の5倍数誘発まで)、CD3/CD28及びCD3/CD28/LFA-1刺激について得られた蛍光強度座標図上で表した(図7A)。分析によって2−5倍のリン誘発がとりわけ以下のキナーゼにで特定された:MAPKキナーゼ(p44/42、p38、JNK、raf、mek1/2、mek3/6、rsk、raf)、src関連キナーゼ(src、pyk2)及びインテグリンシグナリングキナーゼ(FAK)(図7A)。これらのキナーゼに対する非リンタンパク質(p44/42 MAPK、p38 MAPK、JNK、mek1/2、mek3/6、rsk、raf、sac、pyk、fak)の内部リファレンスコントロールは0.8から1.5倍の範囲で誘発を示し、検査した終点では顕著な変化は期待されなかった(データは示されていない)。構造タンパク質(アクチニン、アクチン、チューブリン)に対する抗体を用いて、同等量のタンパク質量を確認した(データは示されていない)。これらの結果は、CD3/CD28/FLA-1の三重刺激は、CD3/CD28刺激よりも極めて強く多数のタンパク質(キナーゼ及び転写因子)の全体的なリン酸化を誘発することを示した。
我々は、CD3/CD28共働刺激と連係して未感作T細胞活性化のために惹起されるLFA-1シグナリングの寄与を決定することに興味をもった。下記で明示するように、我々は、磁気活性化細胞分類、13−次元マルチパラメーターフローサイトメトリー(表面免疫表現型決定、活性キナーゼ及びサイトカインの細胞内産生)を分泌サイトカインのプロファイリング(サイトメトリービーズアレイ)及び核内分布転写因子のプロファイリングとともに多重化して、T細胞活性化及びエフェクター細胞機能の多次元評価を達成した。図8は、機能分析のために多重化した種々の技術の工程図を示している。これらのデータセットは細胞表面レセプターの活性化、細胞内シグナリング及び機能的所産の相関性を知るために相互に参照した。
転写因子の核内位置決定及び活性化プロフィール決定を単一CD3、CD28及びLFA-1刺激の他にCD3/CD28対CD3/CD28?LFA-1刺激で実施した。
ルシフェラーゼレポーター構築物を用いて、NFAT、NF-κB及びAP-1活性を確認した。CD3/CD28/LFA-1刺激は、CD3又はCD3/CD28刺激よりもより高い倍数のNFAT、NF-κB及びAP-1転写活性を示した(図10A)。転写因子NF-κB p65、NF-κB p50、cFos、CREB、aft2及びcRelに対するコンセンサス配列をスポットした96ウェルのプレートに、刺激した未感作CD4T細胞の核抽出物を結合させた。結合した転写因子の検出は標準的なELISA技術で実施した。CD3、CD28及びLFA-1の刺激は核内局在転写因子のそれぞれ別個のプロフィールを誘発した(データは示されていない、補充の図8Aを参照されたい)。CD3/CD28刺激は、ここで調べた全ての転写因子の核内局在を誘発し、CD3/CD28/LFA-1刺激では幾分より高いレベルで検出された(図5B)。LFA-1刺激の存在は、CD3/CD28刺激に対して核内局在転写因子レベルの強化でわずかな付加を示した。NFAT活性の滴定実験によって、LFA-1シグナリングはCD3/CD28の濃度増加によって代償されないことが確認され(図10C)、IL-2の発現と一致する結果であった(図9A参照)。従って、LFA-1シグナリングの付加は、CD3及びCD28の共働刺激のシグナリングを統合し、ここで調べた少なくともT細胞の転写活性の遺伝子発現を強化する。
我々は、CD3対CD28及びCD3/CD28対LFA-1刺激の両方について滴定実験を実施し、IL-4及びINFγの細胞内産生をモニターした。活性化T細胞はTH1又はTH2エフェクターT細胞のどちらかに分化し、サイトカイン又は付加刺激によって一方の経路に優先的に誘導される(Asnagli and Murphy, 2001; Moser and Murphy, 2000)。エフェクター細胞はそれらのサイトカイン分泌プロフィールによって特定することができる。TH1細胞は高IFNγ及び低IL-4を特徴とし、一方、TH2細胞は高IL4及び低IFNγを特徴とする(Murphy et al. 2000)。IL-4/IFNγの平均蛍光の比をコンピュータで計算したとき、調べた全ての濃度でLFA-1刺激は低IL-4/IFNγ比を優先的にもたらすことが示された(図11)。これはTH1表現型と一致する。LFA-1刺激の非存在下では、CD3及びCD28の滴定は優先的にTH2表現型を示した。
我々はサイトメトリービーズアレイを用いて、24時間刺激後に未感作T細胞でIFNγ、IL-10、IL-2、IL-4、IL-5及びTNFαの分泌を調べた。CD3/CD28の組合せは高レベルのIL-4並びに低レベルのIL-5及びIL-10を提供した。これは、CD3/CD28/LFA-1刺激と対照的で、前記刺激は同様なレベルのIFNγを示したが、IL-4レベルは顕著に低かった(図12)。三重刺激は、24時間ではIL-5及びIL-10のレベルの上昇を示し、IL-2のレベルは同様であった(図12)。いずれの刺激もTNFαレベルの上昇は示さず、この作用は単一刺激細胞では観察されなかった(データは示されていない、補充の図8Bを参照されたい)。従って、LFA-1による刺激は、CD3/CD28刺激の存在下でT細胞分化をTH1表現型に偏向させる。
提示した実験は、ICAM-2/LFA-1相互作用はCD3/CD28共働刺激に別個のシグナルを提供し、迅速で最適な未感作T細胞活性化をもたらすことを示した。更にまた、本実験は、この追加刺激は、CD3及びCD28と一緒になって、更に付加的刺激の非存在下でT細胞分化をTH1表現型に偏向させることを示した。T細胞シグナリングは、未感作環境内の多数の付加的シグナル統合すると予想されるが、前記の発見は、ICAM-2LFA-1シグナリングは未感作T細胞の成熟において表現型出現の重要な決定因子であるというこ
とを強く示唆する。
T細胞活性化の開始は細胞対細胞接触(白血球機能抗原1(LFA-1)によって仲介される粘着プロセス)を必要とする。T細胞接触に中心的に関与する粘着事象は、T細胞機能を強化できる変換シグナルとしてはこれまでほとんど理解されていない。しかしながら、最適なT細胞活性化における粘着仲介事象の重要性についての証拠が増しつつある(Neelson et al. 2000; Somersalo et al. 1995; Wulfing et al. 1998)。昆虫又は線維芽細胞のトランスフェクト細胞を用いるT細胞刺激モデル系で、ICAM/LFA-1相互作用がT細胞増殖に必要であることが報告された(Damle et al. 1992a; Damle et al. 1993; Damle et al. 1992b; Damle et al. 1992c; Deeths and Mescher, 1999)。ICAM-2はLFA-1の活性形を仲介してカルシウムの流入を誘発することができるので(Prez and Nolanの投稿原稿で性状が決定されている。添付の原稿を参照されたい)、我々は、LFA-1、ICAM-2の通常は表面に結合しているリガンドの可溶化型を用いて未感作T細胞活性化に対するLFA-1の寄与を調べた。我々はここで、2つのLFA-1結合タンパク質(JAB1及びサイトヘシン1)は放出され、続いてICAM-2結合に際してリン酸化されることを報告する。JAB1及びサイトヘシン1への特異的抗体/ペプチドの細胞内デリバリーを利用して、これらLFA-1相互作用タンパク質は刺激に際して別個のシグナリング経路に配置されることが示された。
免疫学的試薬及び化学試薬
以下のリン抗体(p−Ab)をCell Signaling Technologies(CST)から入手した:p-Raf1(Ser259)、p-MEK1/2(Ser217/221)、p-p44/42 MAPKキナーゼ(Thr202/Tyr204)、p-p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204) mAb、p-Elk-1(Ser383)、p-p38 MAPKキナーゼ(Thr180/Tyr182)、p-cJun(S63)、上記タンパク質に対する非リン特異的抗体もまたCSTから入手した。抗Ki-67mAb(Transduction Laboratories)、全ての表面抗体、サイトカイン抗体及びアイソタイプコントロールはPharMingenから入手した:FITC/PE/PerCp/APC上のCD3、CD4、CD8、CD69、CD25、IL-2、IL-4、IFNγ。アレキサ−フルア染料(350、430、482、532、546、568、594、633、660、680)、カスケードブルー、カスケードイェロー及びR−フィコエリスリン(PE)はMolecular Probes(Eugene, Oregon)から購入した。FITC及びテキサスレッドはPierce(Rockford, Illinois)から購入した。Cy5、Cy 5.5、Cy7はAmersham Life Science(Pittsburgh, Pennsylvania)から入手した。Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APCのための縦並び共役プロトコルはwww.drmr.com/abconで見つけることができる。CD62L、CD28、CD27、CD45RA、CD11a、CD3、CD4、CD8、IL-2、IL-4、IFNγに対する抗体(PharMigen)は、必要に応じてFITC、PE、Cy5PE、Cy5.5PE、Cy7PE、Cy5.5APC、Cy7APC、カスケードブルー、カスケードイェロー又はアレキサフルア染料と結合させた。蛍光プローブ結合を定量して標識の程度を決定する。染料のスペクトル特性を含むプロトコルはwww.metazoa.com/UPL3419で見つけることができる。一般的に、使用したアレキサ結合物はタンパク質1moleにつき2−12moleの蛍光染料を含んでいた。以下の抗体は種々の販売業者から入手した:CD102-FITC(Research Diagnosis)、抗ウサギIgG(CST)、抗マウス/ウサギアレキサ488/568/633(Molecular Probes)、抗JAB1、抗サイトヘシン−1C末端サイトヘシン1−ペプチド及び抗マウスIgG HRP(Santa Cruz Biotechnologies)。使用タンパク質試薬及び化学試薬:DMSO、フォーボルミリスチル化アセテート(PMA)イオノマイシン、フィトへマグルチニン、ヨウ化プロピジウム(PI)RNAアーゼ(Sigma)、U0126、PD98059、SB600125(Calbiochem)、抗CD3(OKT3, NA/EN)及び抗CD28 mAb(NA/NE, PharMingen)。ICAM-2-FCはGenzymeから購入した。
JurkatT細胞は、RPMI 1640、10%FCS、1%PSQで維持した。細胞は5%CO2/37℃で湿潤なインキュベーターで維持し、リン分析のためには12時間血清を枯渇させた。初代細胞の調製では、単核細胞は健常ドナーの血液(Stanford Blood Bank, Stanford, California)から単離した。ヒト末梢血単球は、全血のフィコール−プラーク密度遠心分離(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)及びプラスチック培養皿への粘着によって得た。単離した細胞は完全な培溶液中で維持した。磁気活性化細胞分類によって、CD16、CD14、CD44、HLA-DR、CD9又はCD19ビオチン付加抗体(Dynal, Oslo, Norway)及びストレプトアビジン−磁性ビーズ(Dynal, Oslo, Norway)の組合せを用いて陰性単離によって未感作CD4T細胞を濃縮した。
細胞抽出物は、2X106細胞(表示のように処理)を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって細胞抽出物を調製した。溶解緩衝液は以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX100、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim)。抽出物を14000rpm(5分、4℃)で遠心し、10μg(BCAタンパク質アッセイ(Pierce))を標準的な方法を用いてイムノブロットに付した。免疫沈澱(IP)は、プロテインA/G+アガロースビーズによって予備清澄化を実施し、一次抗体(1時間)、プロテインA/G+アガロースビーズ(1時間)でインキュベートし、更に溶解緩衝液で4回洗浄した。ブロットは表示の抗体とインキュベートし、ECL(Amersham)で現像した。
キナーゼ活性のアッセイプロトコルはAKT、p38、p44/42、JNKについて同様で、代用した使用試薬はそれぞれのキナーゼアッセイについて記載されている。キナーゼ活性のアッセイに使用した全ての試薬はCell Signaling Technologies(Beverly, Massachusetts)から入手した。キナーゼ活性は、それぞれ固定AKT1G1モノクローナル抗体、固定ホスホ−p38MAPKモノクローナル抗体、固定ホスホ−p44/42モノクローナル抗体、又はc-Jun融合タンパク質ビーズを用い細胞からキナーゼAKT、p38、p44/42又はJNKを免疫沈澱させることによって検出した。固定されたキナーゼは、それぞれGSK3融合タンパク質、ATF-2融合タンパク質、Elk-1融合タンパク質又はc-Jun融合タンパク質ビーズによるキナーゼアッセイで使用した。2X106のNIH3T3又は2X106のJurkat細胞をPBSで2回洗浄し、固定キナーゼ抗体又はビーズ(1:200)とともに4℃で2時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。免疫複合体を4回細胞溶解緩衝液で洗浄し、40μLのキナーゼ緩衝液(25mMトリス(pH7.5)、5mMβ−グリセロホスフェート、2mMのDTT、0.1mMのNa3VO4、10mMのMgCl2)に30℃で30分再懸濁させた。前記キナーゼ緩衝液は、200μMのATP及び1μgの融合タンパク質を補充されていた(JNK活性アッセイは除く、前記ではATPは活性誘発に十分であった)。キナーゼ反応はSDSサンプル緩衝液で5分間煮沸して停止させ、GSK3、ATF、Elk-1又はcJunのリン酸化状態は、リン特異的抗体、ホスホ−GSK3αβ(ser21/9)、ホスホ−Elk-1ser383)、ホスホ−ATF2(thr71)又はホスホ−cJun(ser63)をそれぞれ用いてイムノブロッティングを実施し、ECL検出(Amersham)を用いて可視化することによって検出した。
細胞内及び細胞外染色はリン染色について記載されたように(Perez and Nolan, 2002)実施した。約1−10X107個の末梢血単核細胞(非活性化CD4+T細胞)を磁気活性化細胞分類(陰性単離)によって入手し、刺激条件で表示の時間処理してフローサイトメトリー用に調製した。ブレファルディンA(10μM)を細胞内サイトカインの検出のために6時間(又は表示の時間)添加した。アイソタイプコントロールマッチ抗体を染色コントロールのために用いた。カイネティクス分析はシンクロナイズさせた96ウェルで実施し、記載(Perez and Nolan, 投稿)に従って直接固定した。四色以下のフローサイトメトリーデータ捕捉はセルクェスト(CELLQuest)ソフトを用いてファックスカリバー(FACSCalibur)マシーン(Beckton Dickinson, San Jose, California)で収集し、フロージョ(FlowJo)ソフト(Tree Star, San Carlos, California)を用いて分析及び表示した。四色以下についてのデータは、106細胞/サンプルを含む3つのそれぞれ別個の実験の典型例で、50000事象を収集し手動で計算した。11色データ捕捉は、モーフロー(MoFlo)エレクトロニクス(Cytomation, Fort Collins, Colorado)に連結した改変ファックスタープラス(FacstarPlus, Becton Dickison, San Jose, California)で収集した。データはファックスデスク(FACSDesk)ソフトで収集し、フロージョソフトを用いて補正、分析及び表示した。11色フローサイトメトリーのためのデータは最小限200000事象を収集した。サイトメトリービーズアレイ(CBA)はPharMingenから得た。細胞内フローサイトメトリー測定の比率は以下の等式(式中、MFIは平均蛍光強度である)から算出した:Log[(MFIexperimental−MFIisotype mAb)/(MFIcontrol−MFIisotypemAb)]。続いて2つの選択した色の濃度を数値で明示して高低を表現し、適切な場合には表示した。
プロテインA被覆96ウェルプレートをリン特異的及び非リン特異的抗体(1μg/mL)で1時間被覆した。プレートを2回PBSで洗浄し、更に製造元(Pierce)の推奨にしたがい抗体をヂスクシミジルコハク酸エステルと共有結合により共役させた。プレートを3回(PBS)洗浄し、4%のBSAでブロックした(PBS中で30分)。刺激したCD4+の未感作T細胞から得たタンパク質サンプルを定量し、同等量をスクシミジルエステル反応性アレキサ532又は680染料と0.1Mの重炭酸ナトリウム(pH8.0)中で結合させた。1時間後反応を停止させ(100μLの1Mトリス(pH8.0))、セントリコンYM-10スピンカラムで洗浄した。標識したタンパク質サンプルをPBST(+1%BSA)に再懸濁した。プレートを30μgのアレキサ532及びアレキサ680結合タンパク質サンプルで1時間、25℃でハイブリダイズさせた。プレートをPBST(PBS、0.1%トウィーン-20)で3回、PBSで3回洗浄した。
蛍光強度をジェミニ(Gemini)Xs(Molecular Devices)マシーンを用いて検出し、誘発倍数をCD3/CD28/LFA-1とCD3/CD28刺激の平均蛍光強度(MFI)のログ比としてコンピュータで以下の等式から算出した:
Log[(MFICD3/CD28/LFA)/(MFICD3/CD28)]
NF-κB p50、NF-κB p65、c-Rel、c-Fos、CREB及びATF2のコンセンサス配列のためにスポットしたマーキュリートランスファクター(Mercury TransFactor)キット(Clontech)を用いて1X107の刺激CD4+未感作T細胞(製造元に推奨に従って調製)の核抽出物由来の転写因子とハイブリダイズさせた。DNA複合体への結合タンパク質の検出は標準的ELISA法によって実施した。
レーザー走査共焦点顕微鏡法
細胞を表示のように処理し、ポリ−L−リジン(Sigma)被覆滅菌カバースリップ(10mg/mL、30分)に穏やかに遠心することによって粘着させ(1000rpm、10分)、リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)で2回洗浄し、2.7%のパラホルムアルデヒド(PBS中)で固定した。フローサイトメトリーのために細胞を記載のように染色した(4%FCS中で、0.1mg/mLで一次染色、1:1000希釈で二次染色、間で洗浄工程あり)。染色したカバースリップをガラススライドに長期抗退色試薬(Prolong Antifade reagent, Molecular Probes)を用いてマウントし、ツァイスのレーザー走査共焦点顕微鏡510で可視化した。ツァイスLSM510ソフトを用いて画像を得て、アドーブフォトショップ(Adobe Photoshop)6.0を用いてコンパイルした。
抗体/ペプチドの細胞内デリバリー
スピンダイアリーシス(セントリコンYM-100スピンカラム)によって抗体をPBSに緩衝液交換し、1:20の割合のヒュ−ジーン(Fugene; Roche)中で30分混合した。リポソーム/抗体複合体を血清非含有媒体中で 1X105の細胞と1時間混合した。細胞を2回洗浄し(RPMI/4%FCS)、2−4時間以内に細胞アッセイに用いた。FACS分析によるIgG−FITCのトランスフェクション効率は30−40%であった。
レポーター遺伝子アッセイ
Jurkat細胞に5μgのNF-κB駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子(S. Kinoshita(Stanford University)より贈与)又はAP-1駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子(J.F. Fortin(Stanford University)より贈与)をヒュージーン(Fugene)6試薬(Boehringer Mannheim)を用いてトランスフェクトした。NFAT−ルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞はJ.F. Fortin(Stanford University)より贈与された。トランスフェクション後24時間で細胞を表示のように37℃で6時間刺激した。ルシフェラーゼ活性を1X104の細胞溶解物(Promega)で分析した。
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者ら(ここではまた“我々”と称する)は、白血球機能抗原1(LFA-1)はICAM-2との嵌合に際してRAS/RAF/MEK/MAPKカスケードを活性化させることが見出されたことを示す。シグナリング経路の詳細な分析によって、RICAM-2/LFA-1相互作用はPYK2及びSYKチロシンキナーゼの両方に依存することが明らかにされた。PYK2及びSYKは両方とも、ICAM-2との相互反応後にのみLFA-1と結合することが見いだされた。生化学的分析及び共焦点顕微鏡検査によって明らかにされたように、それらはPKK2及びSYKの附随するリン酸化とともに迅速に細胞質膜に再配分される。化学的遺伝学的アプローチによって、LFA-1仲介シグナルはPYK2をリン酸化し、続いてシグナルはSYKに中継されるがPCK及びPLCy活性を条件とする。更にまた、ICAM-2+細胞とLFA-1+細胞との細胞対細胞接触によって、LFA-1発現細胞でp44/42 MAPK経路のトランスアクチベーションが開始され、同時にAKT細胞生存経路がICAM-2提示細胞で活性化される。前記はマルチパラメーターフローサイトメトリーによって単一細胞キナーゼプロファイリングによって決定された。これらの結果は、固有のトランスシグナリング事象が、ICAM-2及びLFA-1の相互作用によって仲介される細胞粘着事象に際して生じることを強調し、結果として生じるプロセス(例えば細胞粘着とT細胞活性化)におけるICAM相互作用の重要性を示唆する。
白血球の仲介機能は、それら白血球が標的組織上のリガンドの粘着分子認識により適切な組織の小区画に局在することができる能力に大きく左右される。異常な細胞環境への白血球の誘導は、細胞性プロセス、例えば血液凝塊形成(Bowes et al. 1995; Nagaoka et al. 2000; Schleef et al. 2001)、免疫監視(Patarroyo and Makgoba, 1989; Plate et al. 2000)、炎症性反応(Chihara et al. 2000; Cid et al. 2000; Krull et al. 1999; Zhang et al. 1999)、血管形成(Griffoen et al. 1998; Melder et al. 1996; Patey et al. 1996; Radisavljevic et al. 2000; Verkarre et al. 1999)及び細胞遊走(All et al. 2000; Sans et al. 2001)できわめて重要である。白血球の標的への誘導及び粘着は、主として1つから複数のインテグリンサブユニット及びそれらの細胞間粘着分子(ICAM)−1、−2、−3、−4、−5リガンドによって仲介される(Douglas et al. 2000; Kruger et al. 2001; Sixt et al. 2001; Tian et al. 2000; van den Berg et al. 2001; Wang and Springer, 1998)。α及びβインテグリンサブユニットはヘテロダイマー型ICAMレセプター、例えば白血球機能抗原−1(LFA-1、CD11a/CD18又はLβB2)、MAC-1(マクロファージレセプター1、CD11β/CD18又はMβB2)、CD11c/CD18(αXβB2又はp150,95)及び最近特定されたCD11d/CD18(αDβB2)を形成する(Binnerts and van Kooyk, 1999; de Fougerolles et al. 1995; Gahmberg et al. 1998; Hayflick et al. 1998; Hermand et al. 2000)。ICAMは、カドヘリン、インテグリン及びセレクティングを含む粘着分子サブクラスである、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ICAMは細胞のタイプによって異なる分布を示し、このことはそれらの多様な機能を反映していると考えられている。更にまた、ICAMは種々の炎症性サイトカインによって弁別的に誘発される(Hayflick et al. 1998; Simmons, 1995; Somersalo, 1996)。ICAM分子は、B細胞、T細胞、赤血球細胞、マクロファージを含む類リンパ系列で発現され(Hayflick et al. 1998)、更に血管内皮細胞サブセット(Grifffioen et al. 1996)及びニューロン(Tian et al. 2000)でも発現される。
ICAM-2のクラスター形成はRAF/MEK/ERK経路を活性化する
レトロウイルスによって形質転換させたNIH3T3を用いてヒトICAM-2を過剰発現させる以前の実験は、PKB/AKTに依存し、更にその細胞内C末端を介して仲介されるICAM-2誘発シグナリングの詳細な分析を可能にした。前記実験では、モノクローナル抗体による表面発現ICAM-2分子のクラスター形成は、それぞれ異なる別個のRAF/MEK/ERKマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(p44/42 MAPK)の活性化を明示した(前記活性化はP13K阻害剤の存在下で停止しない(データは示されていない))。ICAM-2の細胞外部分はMAPK活性の誘発に十分であった。なぜならば、ICAM-2のC末端切断短縮分子(ICAM-AC)及び完全長ICAM-2の両分子が、細胞表面にクラスターを形成したときp44/42 MAPKの活性化を誘発したからである。別の実験で、ICAM2-DC分子は、ICAM-2に特徴的であるPI3K/AKT細胞内シグナルの変換をもたらすことができなかった。ヒトICAM-2及びICAM2-ACの発現は細胞膜に誘導されることがフローサイトメトリーで証明され(図13A)、更にウェスタンブロット分析によってJurkat細胞の内因性ICAM-2タンパク質と類似の電気泳動移動度を示すことが確認された(図13B)。NIH3T3線維芽細胞はネズミのICAM-3レベルを発現しないが、低レベルのネズミICAM-1及びICAM-2は発現する。しかしながら、レトロウイルスによって強制されるエコトピックなヒトICAM-2の発現は、定量的フローサイトメトリーで測定したとき内因性レベルより5倍高いことが見出された。
P44/42 MAPKファミリーは、細胞の増殖、生存及び分化を調節する多様な細胞プロセスで重要である(Chang and Karin, 2000)。いくつかのアッセイを用いて、p44/42 MAPK仲介事象を評価した。細胞周期の分析を実施して、ICAM-2誘発p44/42 MAPK活性が細胞周期の再エントリーを開始できるか否かを調べた。ICAM-2、ICAM2-ΔC、ベクターコントロール及び種々の細胞タイプで血清を72時間枯渇させ、化学物質の非存在下で細胞をシンクロナイズさせた。続いてモノクローナル抗体を用いて細胞をICAM-2に対して架橋し、18時間後に分析した。S期の細胞のパーセンテージはICAM-2架橋に続いて増加した(図14A)。細胞周期の再エントリーはICAM-2ACできわめて明瞭であった(ベクターコントロール及びICAM-2細胞と比較して)。細胞周期の再エントリーの継続刺激は、増殖抑制シグナルを覆すために十分で、しばしば接触抑制によって増殖を停止させる能力を失い、癌性細胞の転移拡散を示す細胞事例である。ICAM-2及びICAM2-ACは、ICAM-2のクラスター形成に際してp44/42 MAPK活性を示したので、我々は、p44/42 MAPK経路の構成的活性化は潜在的に増殖カイネティクスを強化し、その結果細胞周期の再エントリーが観察され、前記は接触抑制機構を逃れるために十分であろうと解釈した。これについて、我々は、細胞密度の関数として細胞呼吸をモニターし、誘発された増殖停止の程度を(もし存在するとして)接触抑制により測定することによって調べた。我々は、接触抑制は粘着細胞の増殖抑制を誘発し、従って細胞密度が増加するにつれて細胞呼吸の減少を誘発すると予測した。ベクターコントロール細胞(陰性コントロール)は、Jurkat細胞(接触抑制することができない浮遊細胞)及び293T細胞(接触抑制することができない形質転換線維芽細胞)と比較したとき、高い細胞密度で細胞呼吸の低下を示した(図14B)。ICAM-2及びICAM2-ΔC発現細胞は両細胞とも高い細胞密度でベクターコントロールよりも高い細胞呼吸を示した(図14B)。これらの観察にもかかわらず、トップアーガー形質転換アッセイを用いたときICAM-2及びICAM2-ΔC発現細胞は形質転換細胞(接触抑制を喪失した細胞の特性)であるとは認められず、更に、ヌードマウスの皮下に移植したとき腫瘍を形成しなかった(データは示されていない)。前記にもかかわらず、ICAM-2及びICAM2-ΔC発現細胞の両細胞ともベクターコントロール細胞よりも増殖カイネティクスの強化を示した(図14C)。ICAM2-ΔC構築物はp44/42 MAPK活性を誘引し、ベクターコントロールと比較して強力な細胞の再エントリーを開始させることができたので、このことはICAM-2表面相互作用タンパク質はp44/42 MAPKの活性化に必要であることを示唆した。P44/42 MAPK誘発作用は、ICAM-2がC末端細胞骨格相互作用から遊離されたときに強化されるという観察(図14A)は、ICAM表面タンパク質のシグナルトランスダクションの細胞骨格仲介調節に対する潜在的な役割を示している(Heiska et al. 1998; Heiska et al. 1996; van Kooyk et al. 1999)。
ICAM-2の可溶形を用いて、ICAM-2の細胞表面と結合する能力を実証した。完全長のICAM-2をICAM-2形質導入細胞溶解物から免疫的に除き、FITCと結合させた(図15A)。前記ICAM-2−FITCプローブを用いてNIH3T3線維芽細胞、Jurkat細胞及びBaF3プロB細胞の表面を染色した(図14B)。前記は、ICAM-2はこれら細胞上の少なくともその正常なリガンドパートナー、B2インテグリンと結合するであろうという推定に基づいている。細胞のプロテアーゼ(トリプシン)との予備処理によってICAM-2−FITC結合は劇的に低下し、ICAM-2は表面結合タンパク質と結合することが示唆された。ICAM-2−FITCプローブは、NIH3T3線維芽細胞(LFA-1αの発現を欠く細胞株)上でβ2インテグリンに対する抗体と部分的に競合することが見出された(データは示されていない)。ICAM2−FITC結合はエピフルオレセンス蛍光顕微鏡法によって確認され、定量が可能であり、更に競合アッセイで非標識コントロールを抑制した(データは示されていない)。ICAM2−FITC結合は、LFA-1αの発現を欠く前記細胞の他にNIH3T3で抗β2インテグリン抗体により完全には抑制されないので、ICAM-2と結合するまた別の分子がこれら細胞の表面に存在することが示唆された。
LFA-1からRaf(更に続いてp44/42 MAPK)へのシグナル伝達に必要な上流のキナーゼを特定するために、一連のキナーゼ阻害剤のスクリーニングを実施した。チロフォスチンA9及びピセアタンノール(プロリン−チロシンキナーゼ2(PYK2)の特異的阻害剤)及び脾臓−チロシンキナーゼ(SYK)は、それぞれRafのICAM-2誘発活性化更に続いてp44/42 MAPKを停止させた(図16A)(Avdi et al. 2001; Fuortes et al. 1999)。p38 MAPKを含む他のタンパク質キナーゼ及びsrc関連チロシンキナーゼの2つのメンバー、p56Lck及びSrcは、ICAM-2p44/42 MAPK活性をブロックするこれらキナーゼの特異的な薬理学的阻害剤としての能力を欠いていることから関与しないことが判明した。更にまた、T細胞活性化に必要な免疫沈澱させたチロシンキナーゼ(すなわちLAT及びZAP-70)、並びにインテグリンシグナリングに必要なチロシンキナーゼ、FAK及びSrcのホスホチロシン残基のイムノブロッティングは、ICAM-2/LFA-1仲介シグナルにこれらキナーゼの関与を示さなかった(データは示されていない)。しかしながら、p44/42 MAPKのICAM-2/LFA-1活性化はグアノシン三リン酸に依存し、Rasの関与が暗示された(データは示されていない)。
共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて、PYK2及びSYKの細胞分布を調べ、更にJurkat細胞を可溶性ICAM-2で処理した後それらの各々の分布及び/又はリン酸化を調べた。ICAM-2/LFA-1の相互作用に際してPYK2及びSYKの両者の細胞内再分布が、細胞質に拡散したPYK2及び細胞質膜に局在したSYKとして観察された(図17、パネルC及びL)。PYK2のリン酸化は、PYK2に対するリン特異的抗体によりチロシン402で検出されたとおり、ICAM-2刺激が提供された後にのみ細胞質膜で観察された(図17、パネルF及びI)。ICAM-2とLFA-1との相互作用によるPYK2の細胞質膜への補充はPYK2のリン酸化をもたらした(なぜならばPYK2のリン酸化はICAM-2刺激の非存在下では観察されなかったからである)。どの特異的な事象が、リガンドとの相互作用に際してLFA-1へのPYK2又はSYKの補充を仲介するのかは明らかではない。現時点では、我々は、LFA-1へのリガンド誘発構造変化によってPYK2及びSYKとの相互作用のためのタンパク質結合部位が露出されると仮説をたてている。
LFA-1及びICAM-2は、白血球の細胞粘着で、以下を含む極めて重要なプロセスに関連していた:リンパ球のトラフィッキング(Etienne-Manneville et al. 2000; Sato et al. 2000; Sigal et al. 2000)、T細胞:抗原提示細胞の接触の安定化(Hwang et al. 2000; Neeson et al. 2000)、転移による拡散(Dosquet et al. 1997; Griffoen et al. 1996; Griffoen et al. 1996; Regidor et al. 1998; Tang and Honn, 1994)及び器官移植拒絶(Rentsch et al. 2000)。ICAM-2/LFA-1相互作用の欠損に附随する疾患の重篤性を考慮して、我々は、ICAM-2及びLFA-1を利用する細胞対細胞接触に際して開始されるシグナリングメカニズムを理解すべきである。前記の考えに従って、我々は、とりわけAKT及びp44/42 MAPKに特異的なキナーゼプローブを開発し、個々の細胞内のキナーゼ活性を同時にモニターした。これらのプローブはリン酸化されたAKTser473及びリン酸化されたp44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)をフローサイトメトリーで検出し、更にイムノブロッティング及びキナーゼ活性アッセイによって、これらの残基のリン酸化はそれぞれのキナーゼ活性と相関することが見出された。特異的な細胞タイプのマーカーと一緒になってこれらのプローブは、我々が、不均質な細胞混合実験でサイトメトリーによってシグナリング経路の活性化について調べることを可能にした。
ここに示した結果は以下を示している:(1)ICAM-2/LFA-1相互作用はLFA-1発現細胞でp44/42 MAPKカスケードを活性化させ、aL及び02インテグリンの両者に対する抗体によってブロックすることができる、(2)LFA-1はリガンド結合に際してシグナルをPYK2及びSYKに伝達する、(3)ICAM-2/LFA-1嵌合はICAM-2発現細胞でAKTを、LFA-1発現細胞でp44/42を活性化させ、細胞対細胞接触に際して接触細胞をそれぞれ協調的にトランススティミュレートする。
我々は以前に、ICAM-2は線維芽細胞、T細胞及びB細胞をアポトーシスから保護するPKB/AKT経路を細胞内で活性化することができることを示した。最近、ICAM-1とフィブリノゲンとの相互作用はERK1/2を活性化し、内皮細胞の生存を調節することができることが示された(Pluskota and D'Souza, 2000)。従って、ICAMはLFA-1の嵌合に際してそれらのホスト細胞に固有のシグナルをトランスデュースすることができる。ICAMは免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるので、広範囲の研究がそれらの細胞対細胞接触における粘着性特性及びリンパ球の再循環について集中した(EtienneManneville et al. 2000; Geijtenbeek et al. 2000; Gerwin et al. 1999)。これは部分的には、ICAM及び炎症性サイトカインの存在時のそれらの減少によって示される細胞の固有発現パターンによるものである(McLaughlin et al. 1999; Wolf et al. 2001)。例えば、ICAM-1は低レベルで発現され、更に白血球、内皮細胞、線維芽細胞及び樹状突起細胞上の炎症性サイトカインによってアップレギュレートされる。前記はICAM-2と対照的で、ICAM-2は白血球、内皮細胞及び血小板で構成的に発現され(Staunton et al. 1989; Xu et al. 1996)、更に多くのリンパ球増殖性疾患で過剰に発現される(Eichelmann et al. 1992; Molica et al. 1996)。
免疫学的試薬及び化学試薬
以下の抗体をCell Signaling Technologies(CST)から入手した:ホスホ−Raf1(Ser259)ポリクローナル、ホスホ−MEK1/2(Ser217/221)ポリクローナル、ホスホ−p44/42 MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)、ホスホ−p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204) モノクローナル、ホスホ−p90RSK(Ser381)ポリクローナル、ホスホ−Elk-1(Ser383)ポリクローナル、ホスホ−p38 MAPキナーゼ(Thr180/Tyr182)ポリクローナル、固定ホスホ−p44/42(Thr202/Tyr204)モノクローナル、ホスホ−SAPK/JNK(Thr183/Tyr185)ポリクローナル、ホスホ−DREB(Ser133)ポリクローナル、ホスホ−SEK1/MKK4(Thr261)ポリクローナル、ホスホ−Jun(S63)ポリクローナル、ホスホ−MKK3/MKK6(Ser189/207)ポリクローナル、ホスホ−AKTSer473モノクローナル。上記タンパク質に対する非リン特異的抗体もまたCSTから入手した。以下の抗体はTransduction Laboratoriesから入手した:抗β1モノクローナル、抗β2モノクローナル、抗β3モノクローナル、抗αLモノクローナル、抗α4モノクローナル、抗α5モノクローナル、抗α6モノクローナル、抗LFA-1モノクローナル、抗α5モノクローナル、抗α1モノクローナル、抗α4モノクローナル、抗PYK2、抗SYK、抗CD3。以下の抗体は種々の販売業者から入手した:ICAM-2モノクローナル(IC2/2 Research Diagnostics)、ICAM-2 C末端ポリクローナル(Santa Cruz Biotechnollogies; SCBT)、抗PYK2p402(Biosource)、抗ホスホチロシン−FITC(CST)、CD3-APC(PharMingen)、CD4PerCP(PharMingen)、CD80-PE(PharMingen)、CD86-FITC(PharMingen)、CD54PE(PharMingen)、CD50(PharMingen)、CD102-FITC(Resear Diagnostics)、抗ウサギIgG HRP結合物(CST)、抗マウスIgG HRP結合物(SCBT)、抗マウスIgG FITC結合物(PharMingen)、抗ウサギ-PE結合物(PharMingen)、抗ヤギローダミン結合物(SCBT)、抗マウスアレキサフルア488結合物(Molecular Probes)、抗ウサギアレキサフルア488結合物(Molecular Probes)、抗ウサギアレキサフルア568結合物(Molecular Probes)、抗ラットIgG(PharMingen)。
以下のタンパク質試薬及び化学試薬を用いた:ストレプトアビジン−FITC(SCBT)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(Pierce)、R-フィコエリスリン(Molecular Probes)、アレキサ488(Molecular Probes)、アレキサフルア546(Molecular Probes)、Elk-1融合タンパク質(CST)、p42MAPキナーゼ(Erk2)(CST)、チロホスチンA9(Calbiochem)、チロホスチン18(Calbiochem)、SB203580(CST)、ハービマイシンA(Sigma)、エモジン(Sigma)、ピセアタンノール(Calbiochem)、ジェニステイン(Sigma)、ホルバルミリスチル化アセテート(PMA)(Sigma)、イオノマイシン(Sigma)、ヨウ化プロピジウム(PI)(Sigma)、RNASE(Sigma)、MTT(Sigma)、ストレプトアビジン−アガロース(SCBT)。
完全長のICAM2cDNAをJurkatのcDNAで作製したレトロウイルスcDNAライブラリーから入手し、レトロウイルスPBM-Z-INバックボーンのBamHI/Sal1部位でクローニングした。ICAM2-ACはPCRで生成し、BaMHI/Sal1部位でクローニングした。ICAM-2又はICAM2-ACを含むレトロウイルス構築物を用いて、NIH3T3ネズミ線維芽細胞を形質導入した。NIH3T3は、DMEM、10%DCS、1%PSQ(ダルベッコー改変イーグル培養液、10%ドナー仔牛血清、1%ペニシリンストレプトマイシン(1000単位/mL及び2mMのL-グルタミンPSQ)中で維持した。JurkatT細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQで維持した。BaF3プロB細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQ、400U/mLのIL-3(Peprotech)中で維持した。HL60骨髄白血病細胞はOpti-Mem1、10%FCS、1%PSQで維持した。293Tヒト線維芽細胞は、DMEM、10%FCS、1%PSQで維持した。細胞は5%CO2/37℃加湿インキュベーターで維持した。形質導入細胞は500 1μg/mLのG418(Sigma)で維持し、構築物の適切な発現は、表示したようにウェスタンブロット及び完全長のICAM-2及びICAM2-ACの分析によって確認した。ベクターコントロールは表示したようにpBMN-Z-IN(空ベクター)の形質導入から成る。pBMN-Z-INの感染頻度は、3つの別々のウイルス形質導入について48%±10であった。タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより日常的にモニターしたとき、持続的なネオマイシン選別は、均質なICAM-2、ICAM2-AC又はコントロールベクター集団を生じた。
抗体架橋実験はマウス抗ICAM-2モノクローナル抗体を用いて実施した(前記抗体は10μg/mLでN末端領域(細胞外ドメイン)(IC2/2 Research Diagnostics)を認識した)。スピン透析(Biorad)を用いて、アジ化物含有抗体(0.01%)の緩衝液をリン酸緩衝食塩水(pH7.4)と交換した。抗マウスIgG(Sigma)を架橋実験のコントロール抗体として用いた。106の表示した細胞の血清を3時間又は4時間それぞれ枯渇させた。細胞をICAM-2(10μg/mL)又はマウスIgG(10μg/mL)のどちらかと一緒に表示した時間37℃でインキュベートした。時間は、シグナリング経路の大半を減弱させるために血清枯渇後に開始するか、又は表示のとおりであった。細胞抽出物を作製し、免疫沈澱又はイムノブロッティングのどちらかを実施した。
細胞増殖アッセイ
細胞周期の分析は記載のように実施し(http://www.metazoa.com/upl2072)、更にフローサイトメトリーによって分析した。細胞の呼吸は代謝インジケーター染料、3−(4,5−シメチルチアゾチ2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)によって決定した(http://www.metazoa.com/upl2102)(Sigma)。
ICAM-2、ICAM2-ΔC及びベクターコントロールの表面タンパク質を、製造元の推奨に従ってスルホ−NHS−LC−ビオチン(Pierce)を用いてビオチン付加し、フローサイトメトリー及びウェスタンブロット技術によって確認した(データは示されていない)。製造元の指示に従って、抗ICAM2 C末端抗体をアフィ−プレップ(Affi-Prep)10固相(Biorad)に結合させることによってICAM-2固相を合成した。抗ICAM-2固相を用いて、レトロウイルスによって形質導入したICAM-2発現NIH3T3細胞からICAM-2を単離し、十分に洗浄し、製造元の推奨に従ってビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(Pierce)で化学的に架橋することによって抗体/タンパク質複合体を安定化させた。低/高pH溶液で交互に洗浄して夾雑タンパク質及び/又は化学物質を除去した。固相をイムノブロット技術によってヒトICAM-2カップリングについてテストした(データは示されていない)。ICAM-2固相はC末端(抗体を介して)によって固定ICAM-2分子の方向を揃え、細胞外N末端が自由に通過物質と相互作用することを可能にした(詳細については材料と方法の項を参照されたい)。
細胞内及び細胞外染色は記載されたように(http://www.metazoa.com/UPL3287)実施した。AKT及びp44/42 MAPK活性のための細胞内プローブは、抗AKTser473モノクローナル抗体又は抗p44/42ホスホ(Thr202/Tyr204)モノクローナル抗体(Cell Signaling Technology)を、それぞれアレキサ568染料又はアレキサフルア488(Molecular Probes)にアレキサフルアタンパク質結合キット(Molecular Probes)を用いて結合させて作製した。リン特異性はウェスタンブロッティング及びFACS分析によって、AKT活性に対しては多様なPI3Kの活性化物質(血小板由来増殖因子)及び阻害剤(LY294002)、並びにp44/42 MAPK活性については上皮増殖因子及びMEK1/2阻害剤U0126(CST)に対して調べた(データは示されていない)。ホスホ−AKTser473アレキサ568及びホスホ−-44/42-アレキサ488による細胞内染色は、刺激したとき及び刺激前に阻害したとき、Jurkat細胞内のAKT活性及びp44/42 MAPK活性を反映した。定量的FACS分析は記載されたように実施した(Davis et al. 1998; Lyer et al. 1998; Lenkei et al. 1998)。
表示のようにJurkat細胞を処理し、ポリ−L−リジン(Sigma)被覆滅菌カバースリップ(10mg/mL、30分)に穏やかに遠心することによって粘着させ(1000rpm、10分)、リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)で2回洗浄し、2.7%のパラホルムアルデヒド(PBS中)で固定した。細胞を5分間0.1%のサポニン(PBS中)で透過性にし、PBSで2回洗浄し、4%のウシ血清アルブミン(BSA、PBS中)でブロックし、更に以下のように抗体とインキュベートした:0.1mg/mLで一次染色、1%のBSA中で1:1000希釈で二次染色、その間に数回の洗浄工程を含む)。使用した一次抗体は以下のとおり:抗PYK2モノクローナル、抗SYKポリクローナル、抗PYKptyr402モノクローナル、抗SYKポリクローナル、ホスホ−チロシン−FITC。使用した二次抗体は以下のとおり:抗マウスアレキサ488、抗ウサギアレキサ488、抗ウサギアレキサ568。染色したカバースリップをガラススライドに長期抗退色試薬(Prolong Antifade reagent, Molecular Probes)を用いてマウントし、Molecular Dynamics Multiprobe 2010共焦点レーザー走査顕微鏡で可視化した。画像は、アドーブフォトショップ(Adobe Photoshop)6.0を用いてコンパイルした。
MAPK活性は、細胞から活性を有するリン酸化p44/42を免疫沈澱させて検出し、更にElk-1融合タンパク質(Cell Signaling Technologies; CST)によるキナーゼアッセイで用いた。NIH3T3又はJurkat細胞を固定したホスホ−p44/42モノクローナル抗体(mAb)(1:200、CST)と4℃で2時間穏やかに揺らしながらインキュベートした。免疫複合体を4回細胞溶解緩衝液で洗浄し、40μLのキナーゼ緩衝液(25mMトリス(pH7.5)、5mMβ−グリセロールホスフェート、2mMのDTT、0.1mMのNa3VO4、10mMのMgCl2)に再懸濁し、200μMのATP及び1μgのElk-1融合タンパク質(CST)を30分30℃で補充した。キナーゼ反応はSDSサンプル緩衝液で停止させ、5分間煮沸した。Elk-1のリン酸化状態は免疫沈澱で検出し、ECL検出(Amersham)を用いて可視化した。イムノブロットは、各々3回繰り返した3つのそれぞれ別個のウイルス形質導入細胞集団の典型例である(n=9)。MAPK活性は、リン特異的抗体を用いたイムノブロッティングによるMAPKのリン酸化によって実証した。
細胞抽出物は、2X106細胞(表示のように処理)を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX100、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロールホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim)。抽出物を14000rpm(5分、4℃)で遠心し、細胞溶解物(BCAタンパク質アッセイ(Pierce)で決定したとき20μg)を、標準的な方法を用いて15%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、更にPNDFメンブレンに移した。免疫沈澱(IP)は、プロテインA/Gプラスアガロースビーズ(Santa Cruz Biotechnologies; SCBT)によって予備清澄化した。IPは、一次抗体(1時間)、プロテインA/Gプラスアガロースビーズ(1時間)でインキュベートし、更に溶解緩衝液で4回洗浄した。ブロットは表示した抗体でインキュベートし、ECL(Amersham)で現像した。蛍光ブロットは、コダックデジタルイメージステーション440Cステーション上で可視化した。イムノブロットを剥がし、再度(表示のように)プローブで調べた。前記はストリッピング緩衝液(62.5mMトリス(pH6.8)、10%SDS、1%β-メルカプトエタノール)を用い55℃で30分インキュベートし、更に完全なイムノブロットプロトコールを繰り返すことによって実施した。
免疫細胞生存:PKB/AKT経路の細胞内粘着分子−2(ICAM-2)の活性
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用い、本発明者ら(ここでは“我々”とも称する)は、機能的遺伝子のスクリーニングでレトロウイルスcDNAを用いて細胞内粘着分子−2(ICAM-2)(粘着分子のイムノグロブリンファミリーのメンバー)を、種々の細胞タイプにおけるアポトーシスのいくつかの活性物質及び誘発セッティングの強力な阻害剤として特定した。抗アポトーシス作用を、PI3K/AKT経路の活性化に対して調べた。エズリンのICAM-2誘発チロシンリン酸化はPI3キナーゼを膜に補充し、更にホスファチジルイノシトール3,4,5の生成、PDK-1活性、AKTのメンブレントランスロケーション及び活性化、並びにそれに続くAKT標的(BAD、GSK3、FKHR及びAFX)のリン酸化をもたらす。ICAM-2仲介生存機能は、Srcの薬理学的阻害剤(ハービマイシンA)、Rho依存キナーゼの同阻害剤(Y-27632)、ホスホイノシチド消長の同阻害剤(Psi-テクトリゲニン)及びPI3期ナーゼの同阻害剤(ウォルトマンニン及びLY294002)によって停止させられ、AKT及びその下流のエフェクターの活性化は、ICAM-2誘発エズリン活性化によるPI3Kの細胞質膜への補充に依存することを示している。初代CD19+細胞は、ICAM-2のクラスター形成に続くTNFa及びFas仲介アポトーシスから保護され、細胞内AKTキナーゼ活性及びホスファチジルイノシトールレベルを単一細胞の直接フローサイトメトリー測定で検出したとき、AKT活性及びホスファチジルイノシトール3,4,5(PIP3)の上昇を示した。ICAM-2とその天然のレセプター、LFA-1との嵌合は、抗体架橋のそれと同様なAKT活性を誘発した。この細胞生存シグナルは、初代B細胞のICAM-3によってのみ共有され、ICAM-1、CD43及びCD44とは共有されない。このことは、エズリンの結合又はLFA-1との相互作用は、ICAM-2で観察された細胞生存シグナルの開始のために十分ではないことを示している。これらの結果によって、B細胞リンパ腫におけるICAM-2の過剰発現及びICAM-2が種々の免疫的シナプスにおいて細胞対細胞接触で細胞内コミュニケーションのシグナルを生じるメカニズムの両方についての説明を提供する可能性がある、新規な生存シグナリング機能はICAM-2によるものと考えられる。
細胞増殖又はプログラムされた細胞死に細胞を拘束するものは、直近の環境、例えば細胞外マトリックス(ECM)との相互作用、細胞対細胞接触からコミュニケートされるか、又は内分泌因子もしくはパラクリン因子を介したより離れた部位からコミュニケートされる生存及び致死シグナルのバランスである(Ruoslahti and Reed, 1994)。生存経路は、アポトーシスが器官発生の決定に重要な役割を果たす初期発生時に機能すると提唱され(Raff, 1992)、更に免疫系の成熟でも重要である。抗体形成細胞のクローン選別及びメモリーB細胞の維持は、細胞生存経路の活性化を必要とする極めて重要なプロセスである。同様に、生存シグナルの欠如はアノイキスの現象で実証され、この場合上皮細胞は、ECM付着がブロックされるときアポトーシスを受ける(Frisch and Ruoslahti, 1997)。ECM生存シグナルはおそらくインテグリンのクラスター形成を介して細胞表面レセプターの活性化によって仲介され、細胞/細胞−マトリックス相互作用の特異性に寄与し、更にECM−インテグリンシグナリングの脱調節は足場非依存性増殖をもたらす(Hulleman and Boonstra, 2001)。細胞死と拮抗することができるか、又は増殖抑制プログラムを覆すことができる分子と類似の分子を類リンパ球で特定することは、リンパ系疾患で間違って進行し、おそらく転移による分散に寄与する細胞の本質的な生存プログラムの理解に極めて重要であろう。
抗アポトーシス機能アッセイでのトロウイルスcDNAライブラリーのスクリーニング
我々は、アポトーシスシグナリングを変更し、抗アポトーシス分子をコードするcDNAをスクリーニングするためにレトロウイルスライブラリーによる研究手法を考案した(図19A)。レシピエントの非悪性細胞(線維芽細胞)で悪性細胞タイプ(JurkatT細胞白血病)由来のcDNAを抗アポトーシス機能についてスクリーニングした。アポトーシスは、スタウロスポリン(STP、植物由来キナーゼ阻害アルカロイドであり、ほとんどの細胞タイプでカスケード依存細胞死の強力な誘発物質である)で誘発された。偶発的バックグラウンドを制限し、一方アポトーシス死の程度を最大にする誘発条件を決定した(出発細胞約104個のSTP処理擬似ライブラリーコントロールで最少バックグラウンドは生存細胞1個)。107個のNIH3T3線維芽細胞をJurkat細胞に由来するレトロウイルスcDNAライブラリーで、組み込み数を細胞当たり1回に制限するために感染頻度40%で感染させた。LacZ-又はBcl2を発現するコントロールのレトロウイルスを調製し、同様な数のNIH3T3細胞に感染させた。アポトーシスは形質導入細胞培養でスタウロスポリン処理によって誘発し、続いて細胞を回復させた(図19A)。生存細胞クローンを増やし、再培養し、スタウロスポリンで再処理した。生存集団で発現されたcDNAのコンプレキシティーをRT-PCRで評価した。主要ないくつかのバンドが3回選別後に観察された(図19B)。
複製能をもつモロニ−ネズミ白血病ウイルス(MMLV)を前記濃縮細胞集団に適用した。組み込み及びMMLVタンパク質の発現に際して、ライブラリーに由来する定住レトロウイルス構築物が感染性ビリオンに一緒にパッケージされ、未感作標的NIH3T3細胞に移された。続いてスタウロスポリン選別プロセスを再度適用した。このようにして、本物の表現型誘発クローンを1/バックグラウンドの割合で濃縮する(詳細は材料と方法の項を参照されたい)。一緒にプールしたライブラリーのうち3つがPCR後に特異的なバンドの濃縮を示した(図19B、レーン1及び2)。いくつかのバンドはPCRクローニングによってレスキューされ、これらバンドのうち1つの配列を決定して完全長のICAM-2cDNAをコードすることが明らかにされた(Staunton et al. 1989)。ICAM-2はそのインテグリンカウンターレセプターであるLFA-1との相互作用を介して白血球の粘着を調節する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである(de Fougerolles et al. 1991; Simmons, 1995)。
内部リボソームエントリーサイト(IRES)をネオマイシン耐性遺伝子の上流に含むレトロウイルスベクターでICAM-2cDNAをクローニングした。NIH3T3線維芽細胞にICAM-2遺伝子を発現することができるレトロウイルスを、適切なコントロールベクター、pBMN-Z-IN(ベクターコントロール)及びpBMN-Z-IN-GFP(GFPベクターコントロール)とともに感染させた。pBMN-Z-IN-ICAM-2構築物を感染させたネオマイシン選別NIH3T3線維芽細胞(ICAM-2細胞と称する)での60kDのICAM-2の発現は、免疫ブロッティング(図19C)、フローサイトメトリー(図19D3A)及び免疫沈澱(図22A)で確認した。発現されたICAM-2タンパク質はJurkat細胞由来の天然のタンパク質と一緒に泳動した(データは示されていない)。
スタウロスポリン処理は細胞内の因子排除(factor-withdrawal)に類似し(Raff, 1992)、他のキナーゼと較べとりわけPKC、PKA及びPKGをナノモル濃度で阻害することによってアポトーシスを誘発する(Meggio et al. 1995)。NIH3T3細胞におけるICAM-2発現は、アネキシン−V結合アッセイ(図20A)、濃縮核カウント(図20B)及びBrdU TUNELアッセイ(データは示されていない、補充図19A−Bを参照されたい)によって判定したとき、スタウロスポリン処理によって誘発されるアポトーシスの程度を制限し、スクリーニングで表現型によりクローンが選別されたことが確認された。興味深いことには、全てのアポトーシスの形態が過剰発現によって阻害されたわけではなかった。ICAM-2過剰発現JurkatT細胞は、スタウリスポリン誘発アポトーシスの阻害とは対照的に、Fasレセプターに対するモノクローナル抗体の一連の濃度範囲でアポトーシスを阻害しなかった(図19E、パネル2−3、下記で詳述する)。
従って、種々の細胞死誘発物質はJurkat細胞で固有の生理学的特徴を有し、観察された相違が支持される(Johnson et al. 2000)。しかしながら、我々は後でICAM-2の二相性機能についての証拠を提供する。前記証拠では、Jurkat細胞の内因性ICAM-2の連結は、Fas誘発アポトーシスの阻止に十分であり、過剰発現はこの細胞タイプで生存を開始するためには不十分であることを示唆している(下記で説明する)。
多くの粘着分子を介する生存シグナルはPI3キナーゼを必要とするので(Frisch and Ruoslahti, 1997; Khwaja et al. 1997)、我々は、ICAM-2の抗アポトーシスシグナルでこの経路の役割を調べた。ICAM-2発現BaF3細胞のPI3キナーゼ阻害剤、ウォルトマンニンによる予備処理によってICAM-2仲介アポトーシス作用は阻止され(図21A、左パネル)、ICAM-2生存シグナリングカスケードにおけるPI3キナーゼの関与が示唆された。前記の条件下で、賦形剤処理ICAM-2発現BaF3細胞はスタウロスポリン誘発アポトーシスに耐性を示した。同様に、ICAM-2形質導入NIH3T3のLY294002による処理は、アネキシン−V結合及びBrdU TUNELアッセイによりフローサイトメトリーを用いて判定したときICAM-2の抗アポトーシス作用を停止させた(図21A、データは示されていない、補充図19を参照されたい)。抗アポトーシス作用は、p44/42 MAPKに対する阻害剤(U0126及びPD98059)、p38 MAPKに対する阻害剤(SB203580)、PCKイソ酵素に対する阻害剤(ビスインドリルマレイミドI及び11)、又はPKAに対する阻害剤(H-89)では停止せず、前記シグナルトランスダクション経路におけるこれら酵素の関与を排除した(データは示されていない)。
単一細胞でのホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸(PIP3)及びホスファチジルイノシトール4,5二リン酸(PIP2)検出の開発によって、無傷の細胞内でのPIP3/PIP2レベルを評価し、PI3K及びPI4K/PLCy1キナーゼ活性を示すことが可能になった(Perez and Nolan, 原稿準備中)。ベクターコントロールでのPIP3の非同調的産生に対して、ICAM-2細胞は均一に高レベルのPIP3を提示し、更に血清枯渇及びLY294002とのインキュベーションによって抑制された(図22B)。PIP3の産生は、プレックストリン(pleckstrin)ドメイン含有タンパク質(例えばAKT)の細胞質膜への補充のための二次的メッセンジャーとして機能し、更に他のもの、すなわちホスファチジルイノシトール依存キナーゼ(PDK-1及びPDK-2)を活性化させるために機能する(Blume-Jensen and Hunter, 2000)。ICAM-2細胞でのPIP3の産生は、活性なPI3Kで予測されたようにAKTの分布パターンと対応していた。
線維芽細胞における活性化AKTのICAM-2依存上昇はリガンドとの相互作用とは無関係である。前記は、ICAM-2ΔNはアポトーシスから細胞を保護し、ICAM2-ΔCはAKTを活性化できないという事実によって決定された。このことは、表面ICAM-2分子のオリゴマー形成(粘着分子のごく一般的な作用態様である)によって発動されるシグナリングメカニズムを示唆している。表面オリゴマーはそれらの細胞質ドメイン内に相互作用部位を創出し、シグナリング分子を補充して膜基部での相互作用に参画させることができるであろう。定量的FACS分析によって、細胞表面上のICAM-2分子の密度は細胞タイプ間で大きく変動することが示され(図23A、添付文書参照、定量方法の詳細については実験方法の項を参照されたい)、先に記載されたように多様な発現パターンと相関性を示す(de fougerolles et al. 1991)。リンパ球でのICAM-2の基礎発現レベルは、ICAM-2表面分子の数で決定したときレトロウイルスベクターによる強制発現の1/100から1/10000未満であった。我々は、抗体架橋はICAM-2とそのレセプターとの相互作用に匹敵できると説明し、従って架橋されたとき内因性ICAM-2が過剰発現系で観察されたような表現型を付与できるか否かを調べようとした。
ICAM-2連結の関数としてエズリンのチロシンをリン酸化することができる上流のキナーゼを特定するために、我々は、ホスホチロシンタンパク質によるELISAを開発し、公知の種々のタンパク質キナーゼ阻害剤によってin vivoでのエズリンのチロシンリン酸化阻害についてスクリーニングした(Perez and Nolan, 原稿準備中)。スクリーニングした阻害剤のうち、ハービマイシンA(srcチロシンキナーゼファミリーメンバーであるsrc及びp62yesの強力な阻害剤(Haas et al. 2000; Schieven et al. 1992))は、ジェニステインと比較してエズリンのチロシンリン酸化を阻害することが見出された(ジェニステインは一般的なチロシンキナーゼ阻害剤として機能した)(図23C)。驚くべきことには、我々はまた、ROCK(Rho依存セリン/スレオニンキナーゼ)の阻害剤(Y-27632)、GTPアーゼの阻害剤、及びホスホイノシチド代謝回転の阻害剤(Psi-テクトリゲニン)がエズリンのチロシンリン酸化を阻害し、PKCイソ酵素阻害剤、ビスインドリルマレイミドI及びIIは小さな影響しか与えないことを見出した。チロシン残基のリン酸化を検出するスクリーニングのデザインを与えられたと仮定して、我々は、Rho依存プロセスの活性化は、エズリンチロシンがsrcによってリン酸化されるための前提条件であろうと推測した(以下で詳述する)。
AKT活性についての結果は再現性があったが、我々は全血由来細胞についてのウェスタンブロット分析/キナーゼ活性アッセイに関しては満足していなかったので、下記に述べるフローサイトメトリーによるAKT活性の単一細胞分析の新規な方法を開発した(Prez and Nolan、投稿中、添付の原稿を参照されたい)。我々はまた、ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸及びホスファチジルイノシトール4,5二リン酸(単一細胞内でのリン脂質の代謝回転、PI3K及びPI4K/PLCyの活性をそれぞれ反映する)検出のためのFACSによる方法も開発した(Prez and Nolan、原稿準備中)。我々は、FACSによるAKTキナーゼアッセイ及びFACSによるPIP3及びPIP2測定を用い、in vivoでのICAM-2に対する生理学的な関連を調べた。TNFa及び抗Fasモノクローナル抗体による処理の前にヒトPBMCをICAM-2で架橋した。処理したPBMCをフローサイトメトリーに付し、CD4(T細胞マーカー)及びCD19(B細胞マーカー)の免疫表現型によってゲートコントロールし、続いてAKT活性及びアポトーシスについてマルチパラメーターFACSによってアッセイした。細胞内AKTキナーゼ活性の測定は、FACSで検出可能なAKT上のAKT-ホスホser473リン酸化部位に対するリン特異的蛍光プローブの開発によって達成された(Prez and Nolan、投稿中)。CD4+のT細胞及びCD19+のB細胞はともに、ICAM‐2がクラスターを形成したときにAKT活性を示し、誘発されたAKT活性は優先的にB細胞をFas及びTNF-a誘発アポトーシスから防御した(図25A)。CD4+T細胞では明白な抗アポトーシス作用は認められなかったが、これは、おそらく我々が用いた条件下ではこれらT細胞はFas又はTNF-aによってアポトーシスが強力に誘発されず、IL‐2又はPMA/イオノマイシンの前処理を要求するという事実によるためであろう(データは示されていない)。初代B細胞におけるアポトーシスからの防御は、セリン473でのAKTリン酸化と完全に相関し、Fas及びTNF-a誘発アポトーシスに対するAKTの保護作用におけるこの標的セリンについて以前に示した役割が確認された。FACSによるAKTのキナーゼ活性測定によって、異なるリンパ球集団の固有の活性化プロフィールを評価することが可能になり、そのような細胞集団の予備分類でしばしば観察される機能的増強が回避できるようになった(データは示されていない)。違いは、ICAM-2を他のエズリン結合表面分子(すなわちICAM-1、3、CD43及びCD44)と比較したときに認められた。PIP3及びPIP2のFACSによる測定によって、ICAM-2がPIP3/PIP2の比を増加させることが確認され、PI3K活性と一致した(図25B)。ICAM-3はPIP3及びPIP2の両者を増加させ、ICAM-1によるホスホイノシチドレベルには影響を与えないことが見出された(図25B)。しかしながら、ICAM-2、3、CD44及びCD43はCD4+及びCD19+の初代細胞でAKTを様々な程度で活性化することが見出されたが(図25B、下段)、ICAM-2及びICAM3のみが、CD19+のB細胞でTNFa誘発アポトーシス(図25C)及びFas誘発アポトーシス(データは示されていない)を効果的に阻止し、ICAM-3、CD44及びCD43の機能的に異なる特性を示唆した。ICAM-2の抗アポトーシス作用は、CD19+ヒトB細胞でPsi-テクトリゲニン及びY-27632とインキュベートすることによって停止し(図25E)、初代ヒト細胞におけるRhoキナーゼ及びホスホイノシチド依存性が立証された。GTPγSローディング条件及びハービマイシンAによるインキュベーションは理由は不明であるが初代細胞でアポトーシスを誘発した(データは示されていない)。従って、ICAM-2オリゴマー形成は、PI3‐キナーゼの膜への明瞭な補充をもたらし、PIP3の産生及びそれに続くAKTキナーゼの活性化を生じ、Jurkat細胞、BaF3プロB細胞及びヒト初代類リンパ球細胞で強力なアポトーシス抑制を開始させる。
我々は、その天然のレセプター、LFA-1との相互作用によるICAM-2のオリゴマー形成が、抗体架橋実験によって説明されたようにPI3K/AKT経路の活性化のために十分であるか否かをテストすることを決定した。我々は、オーバーレイアッセイを開発した。前記アッセイでは、LFA-1+のJurkat細胞へのICAM-2提示細胞としてICAM-2をレトロウイルスにより形質導入したNIH3T3細胞を用いて、これら2つの細胞集団の混合がICAM-2発現細胞でのAKT活性化を誘発するか否かを調べた。ICAM-2細胞とLY294002との予備インキュベーションによって、これら細胞内でのICAM-2過剰発現の結果として固有のAKT活性が停止された。長期間のPI3K阻害は不可逆的な阻害をもたらすかもしれないということを仮定して、オーバーレイアッセイは、前記化合物のIC50に近い濃度(2μM)でPI3Kを1時間ブロックした後でICAM-2細胞のAKT活性を特定するようにデザインした。前記の時間及び濃度はコントロール実験でAKT活性を阻止し、更にICAM-2架橋に際して誘発可能であることが判明した(データは示されていない)。前記オーバーレイアッセイは、免疫表現型マーカーとともに、最近我々が開発したFACSによるAKTアッセイを利用し、不均一な混合物中のどの特定の細胞がAKTキナーゼ活性を提示するかを特定する。Jurkat細胞は低レベルのLFA-1を発現し、検出可能なMac-1は発現しない(前記はICAM-2の2つの内因性レセプターである)(データは示されていない)。ICAM-2細胞は完全長のヒトICAM-2を発現し、前記のNIH3T3由来細胞は低レベルのマウスICAM-1、-2を発現し、検出可能レベルのマウスICAM-3は発現せず(データは示されていない)、種及びヒトICAM-2対ネズミICAM-1、-2の化学量論比を考えるならば、これらとヒトLFA-1との相互作用は顕著なものではないと考えられる(図23C、データは示されていない)。我々は、モノクローナル抗体とのインキュベーションによってJurkat表面のLFA-1及びMac-1タンパク質をブロックする前に混合する条件下でJurkat細胞をベクターコントロール及びICAM2細胞と混合した。ICAM-2細胞はサイズの相違とCD4T細胞マーカーが存在しないことによって特定した。我々は、LFA-1陽性Jurkat細胞のインキュベーションはICAM-2発現細胞でAKTを活性化し、Jurkat細胞のLFA-1モノクローナル抗体による前処理は、ベクターコントロール細胞と混合したJurkatと比較して抑制されることを観察した(図25E、不均一な類リンパ球集団での類似の実験に関する添付の原稿を参照されたい)。
細胞生存シグナルを仲介するICAM-2のモデル
我々の結果は、多様な細胞タイプにおけるICAM-2の異所性発現、及び類リンパ球細胞(CD19+の初代B細胞を含む)での内因性ICAM-2の連結は生存シグナルを開始させることができることを示した。ICAM-2誘発AKT活性化は、細胞を化学物質(スタウロスポリン及びエトプシド)及び生理学的(TNFa及びFasリガンド)アポトーシス誘発物質に対して耐性にさせることができる生存シグナルであり、更に、エズリン活性化、チロシンリン酸化事象(srcチロシンキナーゼ及びRho-依存セリン/スレオニンキナーゼの両者を要求する)に依存する。これは、細胞質膜へのPI3Kの補充、PIP3産生及びそれに続くAKTの活性化をもたらす(前記は多様な細胞生存シグナルを下流の標的のリン酸化を介して開始させることができる)。
重要な膜−細胞骨格リンカータンパク質、a-アクチニン及びエズリンとの相互作用は同時免疫沈澱実験によって示されたが、我々は、これらリンカータンパク質の類線維芽細胞及び類リンパ球細胞タイプでのICAM-2生存シグナルの伝達についての依存性の明白な相違を観察した。ICAM-2の抗アポトーシス作用は、a-アクチニンと結合することが知られている21アミノ酸細胞質ドメインに左右された。特に、α−アクチニンはp85SH3−ドメインを介してPI3キナーゼと直接相互作用することが示され(Shibasaki et al. 1994)、ICAM-2を過剰発現する形質導入NIH3T3中のPI3Kと同時免疫沈澱し、更にICAM-2架橋Jurkat細胞中のPI3Kと結合することが見出された(図24E)。我々はα−アクチニンのリン酸化は観察しなかったが(データは示されていない)、ICAM-2の架橋の関数としてエズリンのリン酸化を確かに観察し(図23B)、ICAM-2誘発エズリン活性化メカニズムが提唱された。
粘着分子の普遍的な阻止による癌細胞の粘着をブロックする抗転移アプローチの開発は、そのような薬剤の開発は、細胞対細胞接触相互作用(例えばICAM/LFA-1によって仲介されるもの)に依存する正常な生理学的プロセスで有害な作用をもつ可能性があるために注意が必要であることを正当化する。従って、ICAM-2又は他の粘着分子の発現、分布及び活性化の調節に関与する経路は、抗腫瘍療法の開発のための、更に潜在的な免疫抑制剤としてのまた別の標的となろう。
抗体及び化学物質
以下の抗体をCell Signaling Technologies(Beverly, MA)から入手した:抗ホスホ−AKT−Ser473mAb、抗ホスホ−AKT−thr308、抗AKT、抗ホスホ−FKHR、抗FKHR、抗ホスホ−Gsk3 alp21、抗切断PARP、抗切断カスパーゼ9、抗切断カスパーゼ3、抗切断カスパーゼ7、抗カスパーゼ9、抗カスパーゼ7、抗pAFX、抗PARP、抗BAD、抗BADser112、抗BADser136、抗ホスホ−BADser155、抗ウサギ−HRP。抗ICAM2 IC2/2 mAb、抗ICAM−2−FITC mAb(IC2/2)はResearch Diagnostics(Flanders, NJ)から購入した。抗ICAM-2 N末端、抗ICAM-2 C末端、抗a-アクチニン、抗Bcl2、抗Bclx/s、抗p27、抗p21、抗cFLIP、抗MYC、抗p53、抗NFKB、抗IKKα、抗Ikkβ、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン、抗マウスIgG−HRP、抗ヤギ−HRP、アネキシンV−ビオチンはSanta Cruz Biotechnologies(Santa Cruz, CA)から購入した。抗エズリンmAb、抗PI3KはTransduction Laboratories(San Diego, CA)から購入した。抗PDK−ホスホ−セリン、抗PDK−ホスホ−スレオニン、Y-27362、U0126、ビスインドリルマレミドI及びII、psi−テクトリゲニン、エトプシド、PD98059、LY294002、TNFα、IL-2はCalbiochem(San Diego, CA)から購入した。スタウロスポリン、ウォルトマンニン、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、GTPγSはSigma(St. Louis, MO)から購入した。抗マウスアレキサフルア568、抗ウサギアレキサフルア488、抗マウスアレキサフルア488、抗ウサギアレキサフルア568、プロロングアンチフェード(Prolong antifade)、アネキシン633、アネキシン488、ストレプトアビジンアレキサフルア488、ストレプトアビジンアレキサフルア633、抗ホスホイノシチド3,4,5三リン酸、抗ホスホイノシチド4,5二リン酸はMolecular Probes(Eugene, OR)から購入した。アネキシンV−FITC、抗ウサギPE、抗マウス−FITC、抗ヤギFITC、抗ヤギテキサスレッド、ストレプトアビジン−PEはBD Biosciences(San Jose, CA)から購入した。CD4−APC、CD19−PerCP、抗ICAM-1、抗ICAM-3、抗CD43、抗CD44、抗LFA-1、抗Mac-1はPharMingen(San Diego, CA)から購入した。更に別の試薬は適切な場所に記載される。
レトロウイルスの産生及び感染は記載に従って実施した(Kitamura et al. 1995; Onishi et al. 1996; Rayner and Gonda, 1994)。cDNAライブラリーはJurkat T細胞からpBabe-Sベクターで調製した(Hitoshi et al. 1998)。前記ライブラリー(2x106一次形質転換体)を用いて約107のPHOENIX-Eパッケージング細胞にトランスフェクトした。pBMN-LacZコントロールベクターを1:10の割合で前記ライブラリーに加えトランスフェクション/感染効率をモニターした。ウイルス上清を採集し、約107の指数関数増殖期のNIH3T3細胞に感染させた。感染後48時間で細胞を分割しβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ライブラリーにより形質導入したNIH3T3細胞を合流度(confluency)約25%で播種し、24時間後に培養液を1μMのスタウロスポリン(STP)を含むDMEMに交換した。24時間処理した後、前記STP含有培養液を完全なDMEM/ドナーウシ血清と交換した。生存細胞を約80%の合流度に到達させた(7日)。生存細胞を更に2ラウンド記載したように再処理した。
表現型トランスファーアッセイ
ライブラリー感染生存細胞の部分標本にモロニーネズミ白血病ウイルス(T. Kinsella (Stanford)より贈与)を重感染させた。重感染細胞を2週間継代してヘルパーウイルスを効率的に拡散させた。未感作NIH3T3細胞をウイルス上清で感染させ、48時間発現させた。続いて再感染細胞を上記で述べたようにスタウロスポリンで処理した。生存細胞を7日間培養し、RT-PCRによってトランスファーについて分析した。
プロウイルスcDNA挿入物のRT-PCRクローニング及び構築物の作製
RNAは酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法によって記載のように(Chomczynski and Sacchi, 1987)調製した。cDNAは4μgの熱変性全RNAから50μLの反応容積で作製し(Primega, Madison, WI)、42℃及び55℃で45分インキュベートした。cDNA反応生成物(5μL)を50μLのPCR反応ミックス(Perkin-Elmer, Foster City, CA)で95℃/30秒;55℃/60秒;72℃/2分で25サイクル増幅させた(プライマー:5'-GATCCTCCCTTTATCCAG;5'-GAATGAAAGACCCCACCTGT)。完全長のICAM2cDNAをレトロウイルスベクターpBM-Z-IN骨格(Kinoshita et al. 1998)のBamHI/Sal1部位でクローニングした。ICAM2-ΔC、ICAM2-ΔN及びICAM2-C末端スクランブルをPCRで作製し、BamHI/Sal1部位でクローニングした。
NIH3T3ネズミ線維芽細胞は、DMEM、10%DCS、1%PSQ(ダルベッコー改変イーグル培養液、10%ドナー仔牛血清、1%ペニシリンストレプトマイシン(1000単位/mL及び2mMのL-グルタミンPSQ)中で維持した。JurkatT細胞及びCH27形質転換B細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQで維持した。BaF3プロB細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQ、400U/mLのIL-3(Peprotech)中で維持した。70Z/3プレB細胞はRPMI-1640、10%FCS、1%PSQ、50μmのβ-メルカプトエタノール中で維持した。HL60骨髄白血病細胞はOpti-Mem I、10%FCS、1%PSQで維持した。293Tヒト線維芽細胞は、DMEM、10%FCS、1%PSQで維持した。細胞は5%CO2/37℃加湿インキュベーターで維持した。形質導入細胞は500 1μg/mLのG418(Sigma)で維持し、構築物の適切な発現は、表示したようにウェスタンブロット及び完全長のICAM-2、ICAM-2ΔC、ICAM-ΔNのFACS分析によって確認した。スタウロスポリン処理は特に表示がないかぎり1μMで24時間であった。LY294002処理は、以後の全ての処理の前に10μMで30分実施した。ウォルトマンニン処理は100nMで24時間であった。化学物質はDMSOに溶解させ(溶媒希釈について最終的に1:1000であった)、ベクターコントロールは陰性コントロールとして1%のDMSOとともにインキュベートした。ベクターコントロールは表示したようにpBMN-Z-IN(空ベクター)の形質導入又はpBMN-Z-IN-GFPから成る。pBMN-Z-IN-GFPの感染頻度は、3つの別々のウイルス形質導入について48%±10であった。タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより日常的にモニターしたとき、持続的なネオマイシン選別によって、均質なICAM-2、ICAM2-ΔCICAM-ΔN又はコントロールベクター集団が得られた。初代細胞の調製の場合、単核細胞はヒトの末梢血からフィコール−プラーク密度遠心分離及び粘着プラスチック培養皿上での粘着細胞の排除によって単離した。単離細胞は完全培養液で維持し、CD4、CD3、CD19、及びICAM-2発現についてFACSによって分析した。
抗体架橋実験は、10μg/mLでN末端領域(細胞外ドメイン)を認識する、抗ICAM-1、抗ICAM-2、抗ICAM-3、抗CD43又は抗CD44のmAbを用いて実施した。スピン透析(Biorad)を用いて、アジ化物含有抗体(0.01%)の緩衝液をリン酸緩衝食塩水(pH7.4)と交換した。抗マウスIgG(Sigma)を架橋実験のコントロール抗体として用いた。1x106のJurkat、1x106のBaF3又は1x107のPBMC細胞の血清をそれぞれ3時間枯渇させた(PBMCを除く)。細胞をいずれかのmAb(10μg/mL)又はマウスIgG(10μg/mL)で表示した時間37℃でインキュベートした。時間は、シグナリング経路の大半を減弱させるために血清枯渇後に開始するか、又は表示のとおりであった。血清枯渇4時間では、カスパーゼ3活性、細胞周期分析、アネキシンV/PI染色によって調べたときアポトーシスの生化学的開始は認められなかった(データは示されていない)。細胞抽出物を作製し、免疫沈澱又はイムノブロッティングのどちらかを実施した。初代細胞をアポトーシス処理に付し、続いてフローサイトメトリーのために調製した。GTPγSは、細胞に適用する前に25℃で30分ヒュージーン(Fugene, Roche Biochemicals)と1:4のモル比で予備インキュベーションすることにより細胞透過性にした。放射能標識/蛍光性三リン酸のリポゾーム仲介デリバリーによって高度にチャージされた分子種の大量の細胞内取り込みが達成された(Perez, O,D、未発表データ)。
アポトーシスは、濃縮核、フローサイトメトリーによるアネキシン-V結合、又は表示に従ってフローサイトメトリーによるTUNEL BrdU染色の計測のいずれかによって決定した。アポトーシスは以下のいずれかで誘発した:適切な実験で表示に従ってスタウロスポリン(1μm)、抗マウスFas(5μg/mL, Santa Cruz Biotechnology (SCB))、抗マウスFas(5μg/mL Jo2 Biomed)又は抗ヒトFas(10ng/mL CH11 Kamiya Biomedical)による処理、IL-3排除(24時間又は表示のとおり)。濃縮核の計測の場合、NIH3T3細胞をガラスのカバースリップに増殖させ、アポトーシスについて調べた。浮遊細胞は、25μMのアクリジンオレンジ/25μMの臭化エチジウム又は5μg/mLのヘキスト33342(Molecular Probes, Eugene, OR)による核染色によって分析した。アポトーシスは、報告されたように(Jacobson and Raff, 1995)特徴的な濃縮核の存在によって確認された。少なくとも5つの個々の視野を写真撮影し、ツァイスアキシオスコープ(axioscope)蛍光顕微鏡を用いて計数した。生存アッセイの場合、106のNIH3T3細胞を10cmの皿に播種し、37℃で一晩培養した。前記細胞を1μMのスタウロスポリンで24時間処理した。前記細胞を洗浄し完全培養液で24時間培養した。細胞をトリプシン処理し、生細胞をトリパンブルー染色の後で計数した。未処理細胞は処理時に計数した。%生存は、(処理後の生細胞の数)/(処理前の生細胞の数)を表す。FACSによるアネキシン-V-FITC/PI染色は記載のように実施した(PharMingen)。TUNELアッセイはアポトーシスBrdUキット(Promega)の製造元の記載に従って実施した。フローサイトメトリーのデータ採取は、BrdU(10,000事象採集)及び濃縮核カウントの両者についてスタウロスポリン処理(1μM)後24時間、アネキシン-V結合(100,000事象採集)についてスタウロスポリン処理後12時間で実施した。アネキシン-V陽性細胞は処理後24時間で膜の抵抗性は減弱(compromised)しているであろう。フローサイトメトリー分析はCELLクェストを用いてBD FACSカリバー(FACSCalibur)で実施し、フロージョ(FlowJo, Tree Star)ソフトを用いて分析した。
PDK-1活性はPDK-1免疫沈澱キナーゼアッセイキット(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)によって製造元の推奨に従って決定した。簡単に記せば、PDK-1を1x106の処理細胞から免疫沈澱させ、不活化SGK酵素とともにインキュベートし、SGKペプチド基質への(γ−32P)ATPの取り込みをシンチレーション計測で測定した。PI3K活性は開発したPI3K FACSによるアッセイによって検出した(下記参照)。AKT活性は細胞からAKT1を免疫沈澱させ、GSK3融合タンパク質(CST)によるキナーゼアッセイを用いて検出した。2x106のNIH3T3、2x106のJurkat又は5x105のBaF3細胞を、固定したAKT 1G1モノクローナル抗体(mAb)(1:200、CST)とともに4℃で穏やかに揺らしながら2時間インキュベートした。免疫複合体を細胞溶解緩衝液で4回洗浄し、40μLの200μMのATP及び1μgのGSK-3融合蛋白質(CST)を補充したキナーゼ緩衝液(25mMトリス(pH7.5)、5mMのp-グリセロホスフェート、2mMのDTT、0.1mMのNa3VO4、10mMのMgCl2)に30℃で30分再懸濁した。キナーゼ反応は、SDSサンプル緩衝液で停止させ、5分間煮沸した。GS3Kのリン酸化状態は免疫ブロッティングによって検出し、ECL検出(Amersham)を用いて可視化した。イムノブロットは3つのそれぞれ別個にウイルスによって形質導入した細胞集団のそれぞれ3回繰り返した典型例である(n=9)。AKT活性は、ser473及びthr308に対するリン特異的抗体(NEB)を用いてイムノブロッティングによりAKTのリン酸化によって実証した。キナーゼアッセイは、少なくとも3つのそれぞれ別個の測定の典型例で、標準偏差が適切に表されている。
トリトンX-100分画を記載に従って実施した(参考文献xxx)。細胞抽出物は、2X106細胞を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX100、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロールホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim)。抽出物を14000rpm(5分、4℃)で遠心し、細胞溶解物(BCAタンパク質アッセイ(Pierce)で決定したとき20μg)を、標準的な方法を用いて12%又は15%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、更にPVDFメンブレンに移した。免疫沈澱は、プロテインA/Gプラスアガロースビーズ(SBC)によって予備清澄化した。IPは、一次抗体で1時間又は一晩、プロテインA/Gプラスアガロースビーズで1時間インキュベートし、更に溶解緩衝液で4回洗浄した。ブロットは表示した抗体でインキュベートした。以下の二次抗体を用い:抗ウサギHRP(1:5000、NEB)、抗マウスHRP又は抗ヤギHRP(1:5000、SBC)、ECL検出(Amersham)、又はコダックデジタルサイエンス440Cステーションで可視化した。ブロットは少なくとも3つのそれぞれ別個の実験の典型例である。
細胞内及び細胞外染色は表示した抗体を用いて記載(www.metezoa.com/UPL3287)されたように実施した。AKT活性のための細胞内プローブは、抗AKTser473モノクローナル抗体(Cell Signaling Technology)をアレキサ568染料(Molecular Probes)にアレキサ568タンパク質結合キット(Molecular Probes)を用いて結合させて作製した。リン特異性はウェスタンブロッティング及びFACS分析によって、多様なPI3Kの活性化物質及び阻害剤に対して調べた(データは示されていない、Perez and Nolan、投稿中)。ホスホ−AKTser473アレキサ568による細胞内染色は、NIHT3T細胞を血小板由来増殖因子で刺激したとき及び刺激前にLY294002で阻害したときAKTキナーゼ活性を表した。ホスファチジルイノシトール3,4,5三リン酸及びホスファチジルイノシトール4,5二リン酸に対する細胞内プローブは、PIP3又はPIP2に対するmAbをアレキサフルア488又はアレキサフルア633にアレキサ568タンパク質結合キット(Molecular Probes)を用いて結合させて作製した。PIP3及びPIP2のFACS測定はPI3K及びPI4Kキナーゼ活性を反映していた(Perez and Nolan、原稿準備中)。定量的FACS分析は記載されたように実施した(Davis et al. 1998; Lyer et al. 1998; Lenkei et al. 1998)。簡単に記せば、R-フィコエリスリン(PE)(Molecular Probes)をタンパク質架橋キット(Molecular Probes)の製造元の推奨に従って抗ICAM2 N末端モノクローナル抗体(Research Diagnostics IC2/2)と結合させ、化学量論的適切性を調べ(データは示されていない)、Quantibrite-PEビーズ(BD Systems)を用いて定量した。定量的カリブレーション曲線は既知量のPE分子/ビーズを含むQuantibrite-PEビーズを用いて作製した。直線回帰分析を以下の等式を用いて実施した:log10(PE蛍光)=勾配*log10(PE分子/ビーズ)+切片。PEの蛍光はPEチャネルの相乗平均を得ることによって決定される。定量は、PKと直接結合させた抗体についてのみ有効である。飽和量の抗体を用い、更に十分に洗浄することによって全表面抗原の結合が担保される。氷上でのサンプル調製は抗体の内在化を減少させる。未知の細胞集団に対する細胞の表面抗原は、カリブレーション曲線を用いてPEの相乗平均をコンピュータで処理して決定される。定量FACS分析は表面抗原の発現について概算を提供する。抗体の結合価は使用したモノクローナル抗体について調べられていないので、グラフの数字は相対的表面分子数を表し絶対数ではない。フローサイトメトリー分析はBD FACSCaliburマシーンで実施し、FlowJoソフト(Tree Star)を用いて分析した。CellQuestは、定量的フローサイトメトリー及びQuantibrite-PEビーズの直線回帰分析のために用いた。フローサイトメトリーのデータは、106細胞/分析サンプルによる3つのそれぞれ別個の実験の典型例である。100,000事象を収集するか、又は別に記載したようにカリブライトビーズ(BD systems)を用いて修正した。棒線グラフに示したデータは3通りの実験の平均値(棒線)±SDとして表されている。
細胞をカバースリップ上で増殖させ、リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)で2回洗浄し、2.7%のパラホルムアルデヒド(PBS中)で固定した。細胞を0.1%のトリトンX-100で5分間透過性にし、PBSで2回洗浄し、4%のウシ血清アルブミン(BSA、PBS中)でブロックし、以下のように抗体とインキュベートした(1%BSA中で、0.1mg/mLで一次抗体、1:1000希釈で二次抗体、間で数回の洗浄工程)。染色したカバースリップをガラススライドに長期抗退色試薬(Prolong Antifade reagent, Molecular Probes)を用いてマウントし、Molecular Dynamics Multiprobe 2010共焦点レーザー走査顕微鏡で可視化した。画像はアドーブフォトショップ(Adobe Photoshop)6.0を用いてコンパイルした。
細胞内粘着分子−2(ICAM-2)によるPKB/AKT依存細胞生存の活性化
本実施例では、本発明の方法及び組成物により、本発明者ら(ここではまた“我々”と称する)は、レトロウイルスcDNAライブラリーを用いた機能的な遺伝子スクリーニングによって、いくつかのアポトーシス活性化物質の強力な阻害剤として、細胞内粘着分子−2(ICAM-2)(粘着分子の免疫グロブリンファミリーのメンバー)を特定した。ICAM-2の発現はいくつかの細胞タイプでアポトーシスの開始及び誘発設定を阻止した。ICAM-2の抗アポトーシス作用はPI3K/AKT経路の活性化にマップされ、前記に続くBAD、GSK3及びFKHRのリン酸化をもたらした。ICAM-2の細胞生存シグナルは、カスパーゼ阻害タンパク質、細胞周期調節因子又はBcl-2による抗アポトーシス経路とは関係がないことが判明した。前記生存機能は、ICAM-2の細胞質テール(膜細胞骨格リンカータンパク質、α−アクチニン及びエズリンが結合した領域)に依存していた。ICAM-2仲介生存機能はPI3キナーゼの2つの薬理学的阻害剤、ウォルトマンニン及びLY294002によって停止し、AKT及びその下流のエフェクターの活性化がPI3Kの細胞質膜への補充に依存することが示唆された。BaF3プロB細胞及びJurkatT細胞上の内因性ICAM-2のクラスター形成は、AKTキナーゼ活性並びに下流のエフェクターBAD、GSK3、FKHR及びAFXを刺激し、異所性発現の結果と一致した。CD4+及びCD19+の初代細胞は、ICAM-2のクラスター形成に続いてTNFα及びFas仲介アポトーシスから保護され、細胞内AKTキナーゼ活性の直接単一細胞フローサイトメトリーによる測定により検出されたようにAKT活性の上昇を示した。これらの結果はICAM-2の新規な生存シグナリング機能に帰せられ、前記機能は、B細胞におけるICAM-2の過剰発現の役割、及びICAM-2が種々の重要な細胞タイプで細胞内コミュニケーションのシグナルを発するメカニズムの両方についての説明を提供するかもしれない。
細胞のホメオスタシスは、厳密に調節されている増殖とアポトーシスのバランスによって達成される。アポトーシスは、とりわけ、DNA損傷、増殖因子喪失、レセプター仲介致死シグナルを含む多数の事象によって又は生体異物による誘発によって開始される細胞死の明瞭に識別される一形態である。アポトーシスのシグナリング経路の調節は主に細胞のその環境を探知する能力によって管理される。細胞のアポトーシス死は、多様な細胞に致死メカニズムを開始させる別個のアポトーシス刺激により多くの経路によって発生する。例えば、化学的に誘発されるアポトーシスはチトクロームCの放出及びカスパーゼ9の活性化により発生する(Budihardjo et al. 1999)。レセプター誘発アポトーシス(Fas/TNFα)はカスパーゼ8の活性化を介して仲介され(Holmstrom and Eriksson, 2000; Kruidering and Evan, 2000; Rath and Aggarwal, 1999; Schneider and Tschopp, 2000)、ミトコンドリアに関係なく作動することができる(Gottlieb, 2000; Kroemer, 1999; Kuida, 2000)。カスパーゼ8も9もともにエフェクターカスパーゼ3及び7に集中して、アポトーシスの特質を仲介する(Earnshaw et al. 1999; Grutter, 2000)。
抗アポトーシス機能アッセイにおけるレトロウイルスcDNAのスクリーニング
アポトーシスシグナリングを変更する遺伝子を特定するために、我々は、抗アポトーシス分子をコードするcDNAをスクリーニングするためのレトロウイルスライブラリーによる解決手法を考案した(図26A)。悪性細胞タイプ(JurkatT細胞白血病)由来のcDNAを、レシピエントの非悪性細胞(線維芽細胞)での抗アポトーシス機能についてスクリーニングした。アポトーシスは、スタウロスポリン(STP、植物由来のキナーゼ阻害性アルカロイドであり、ほとんどの細胞タイプでカスケード依存細胞死の強力な誘発物質である)で誘発された。偶発的バックグラウンドレベルを制限し、一方アポトーシス死の程度を最大にする誘発条件を決定した(出発細胞約104個のSTP処理擬似ライブラリーコントロールで最少バックグラウンドは生存細胞1個)。107個のNIH3T3線維芽細胞をJurkat細胞に由来するレトロウイルスcDNAライブラリーで、組み込み数を細胞当たり1回に制限するために感染頻度40%で感染させた。LacZ-又はBcl2を発現するコントロールのレトロウイルスを調製し、同様な数のNIH3T3細胞に感染させた。アポトーシスは形質導入細胞培養でスタウロスポリン処理によって誘発し、続いて細胞を回復させた(図26A)。生存細胞クローンを増やし、再培養し、スタウロスポリンで再処理した。生存集団で発現されたcDNAのコンプレキシティーをRT-PCRで評価した。主要ないくつかのバンドが3回選別後に観察された(図26B)。
複製能をもつモロニ−ネズミ白血病ウイルス(MMLV)を前記濃縮細胞集団に適用した。組み込み及びMMLVタンパク質の発現に際して、ライブラリーに由来する定住レトロウイルス構築物が感染性ビリオンに一緒にパッケージされ、未感作標的NIH3T3細胞に移された。続いてスタウロスポリン選別プロセスを再度適用した。このようにして、本物の表現型誘発クローンを1/バックグラウンドの割合で濃縮する(詳細は材料と方法の項を参照されたい)。一緒にプールしたライブラリーのうち3つがPCR後に特異的なバンドの濃縮を示した(図26B、レーン1及び2)。いくつかのバンドはPCRクローニングによってレスキューされ、これらバンドのうち1つの配列を決定して完全長のICAM-2cDNAをコードすることが明らかにされた(Staunton et al. 1989)。ICAM-2はそのインテグリンカウンターレセプターであるLFA-1との相互作用を介して白血球の粘着を調節する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである(de Fougerolles et al. 1991; Simmons, 1995)。
内部リボソームエントリーサイト(IRES)をネオマイシン耐性遺伝子の上流に含むレトロウイルスベクター(pBMN-Z-IN)でICAM-2cDNAをクローニングした。NIH3T3線維芽細胞にICAM-2遺伝子を発現することができるレトロウイルスを、適切なコントロールベクター、pBMN-Z-IN(ベクターコントロール)及びpBMN-Z-IN-GFP(GFPベクターコントロール)とともに感染させた。pBMN-Z-IN-ICAM-2構築物を感染させたネオマイシン選別NIH3T3線維芽細胞(ICAM-2細胞と称する)での60kDのICAM-2の発現は、免疫ブロッティング(図27A)、フローサイトメトリー(図27B、28B)及び免疫沈澱(図28C)で確認した。発現されたICAM-2タンパク質はJurkat細胞由来の天然のタンパク質と一緒に泳動した(データは示されていない)。
スタウロスポリン処理は細胞内の因子排除(factor-withdrawal)に類似すると考えられ(Raff, 1992)、アポトーシスを誘発する。NIH3T3細胞におけるICAM-2発現は、アネキシン−V結合アッセイ(図27E)及びBrdU TUNELアッセイ(図29B)とともに核濃縮計測(図27C、27D)によって判定したとき、スタウロスポリン処理によって誘発されるアポトーシスの程度を制限し、スクリーニングで表現型によってクローンが選別されたことが確認された。興味深いことには、全てのアポトーシスの形態が抑制されたわけではなかった。ICAM-2過剰発現JurkatT細胞のFas誘発アポトーシスは、Fasレセプターに対するモノクローナル抗体の一連の濃度範囲で抑制されなかった(図27C、パネル3)。
最初のスクリーニングは線維芽細胞で実施し、従って、ICAM-2の抗アポトーシス作用はそのリンパ球特異的インテグリンリガンド、LFA-1(CD11a/CD18)を介して仲介されたとは考えにくい。この可能性を調べるために、我々は、ICAM-2の細胞外ドメイン欠失(ΔN)型を調製し、それをBaF3細胞で調べた。細胞質ドメインの発現は完全な抗アポトーシス作用を付与するために十分であった(図28A)。このことは、ICAM-2の細胞質ドメインは、異所性に過剰発現されたとき生存シグナルを提供し、更におそらくレセプター架橋を模倣することによってその作用を示すことが示唆される。ICAMファミリーの細胞質ドメインを介するシグナリングはほとんど理解されていないので、我々は、ICAM-2がアポトーシス耐性を付与するシグナリング経路を特定することを試みた。
ICAM-2は粘着分子と考えられ、リンカータンパク質、α−アクチニン及びエズリン(前記はICAM-2の細胞質ドメインと結合する)によってアクチン細胞骨格と互いに連結されることが示された(Heiska et al. 1996; Helamder et al. 1996)。ICAM-2の抗アポトーシスシグナル仲介におけるα−アクチニンの潜在的役割を評価するために、α−アクチニン認識配列をin vitroでα−アクチニンと結合することができないスクランブル配列に変化させた(Heiska et al. 1996)。ICAM-2、C末端欠失変異体(ICAM2-ΔC)及び変異α−アクチニン結合モチーフを含む完全長ICAM-2タンパク質(ICAM2Cスクランブル)をコードするレトロウイルス構築物を用いてNIH3T3細胞に形質導入した(図28B)。
天然のN末端ICAM-2のみを認識するICAM-2モノクローナル抗体(IC2/2)を用いて、感染細胞をFACSで分類した(de Fougerolles et al. 1991)。前記の方法によって、ICAM-2、ICAM2-ΔC又はICAM2-C-スクランブルタンパク質は適切に折り畳まれ、細胞質膜の外側面に誘導されることが確認された。エトポシド(また別の強力なNIH3T3細胞のアポトーシス誘発物質)処理及びスタウロスポリン処理の両処理の後で、ICAM-2変異体発現NIH3T3細胞を生存についてアッセイした。ICAM-2はNIH3T3細胞に強力な長期の生存を付与し、更に、ICAM-2のC末端欠失(ICAM2-ΔC)が細胞で発現されたとき生存シグナルは失われた(図28B)。ICAM-2の細胞質テールのα−アクチニン結合部位の変異もまた、エトポシド又はスタウロスポリン処理に対する防御を全く提供しなかった。更にまた、α−アクチニン及びエズリンはともに完全長ICAM-2とのみ同時免疫沈澱されるが、これら細胞骨格リンカータンパク質は抗アポトーシスシグナルの伝達に必要であったという説明を支持している。
多くの粘着分子を介する生存シグナリングはPI3キナーゼを必要とするので(Frisch and Ruoslahti, 1997; Khwaja et al. 1997)、我々は、ICAM-2の抗アポトーシスシグナルでこの経路の役割を調べた。ICAM-2発現BaF3細胞のPI3キナーゼ阻害剤、ウォルトマンニンによる予備処理によってICAM-2仲介アポトーシス作用は阻止され(図29A)、ICAM-2生存シグナリングカスケードにおけるPI3キナーゼの関与が示唆された。前記の条件下で、賦形剤処理ICAM-2発現BaF3細胞はスタウロスポリン誘発アポトーシスに耐性を示した。同様に、ICAM-2形質導入NIH3T3のLY294002による処理は、アネキシン−V結合及びBrdU TUNELアッセイの両者によりフローサイトメトリーを用いて判定したときICAM-2の抗アポトーシス作用を停止させた(図29A、29B、フローサイトメトリーグラフについては添付書類を参照されたい)。
PI3キナーゼは、その下流のエフェクターAKT(PKB)キナーゼを介してアポトーシスを調節することが知られている(Downward, 1998)。AKTキナーゼは、種々のアポトーシス刺激(スタウロスポリンを含む)の下流で強力な抗アポトーシス作用を有する(Marte and Downward, 1997)(データは示されていない)。我々は、AKTキナーゼについてICAM-2発現線維芽細胞を調べた。ICAM-2を発現しているNIH3T3線維芽細胞はAKT活性化レベルの上昇を示した(図30A)。このAKTキナーゼ活性の上昇は、ICAM2-ΔC又は擬似形質導入細胞では観察されなかった。我々は更に、活性化AKTにおけるこのICAM-2依存上昇は、STP処理後に維持されることを両キナーゼアッセイによって、更にser473及びthr308の両者のリン酸化の確認によって実証した(図30A)。AKTキナーゼの標的はプロアポトーシスBch2ファミリーのメンバー、BADである。BADはセリン112及び136のリン酸化によって通常は不活性な状態で維持され、14-3-3に結合している。アポトーシスの誘発に際して、BADはser112及びser136の両者で脱リン酸化され、Bc1-2とダイマーを形成する。結果として、BcL2/Bcl-XLの平衡がシフトしてBCL-XLの遊離を促進し、チトクロームCの放出及びアポトーシスを仲介する(Datta et al. 2000)。BADは、ICAM2-ΔC形質導入及び擬似形質導入NIH3T3細胞のスタウロスポリン処理後に脱リン酸化され、アポトーシスの誘発が同時に生じる(図30B)。しかしながら、ICAM-2発現はBADのリン酸化の維持をもたらし(図30B)、AKTキナーゼ活性の保持と一致する(図30A)。
線維芽細胞における活性化AKTレベルのICAM-2依存上昇はリガンドとの相互作用とは無関係である。前記は、ICAM-2ΔNはアポトーシスから細胞を保護し、ICAM2-ΔCはAKTを活性化できないという事実によって決定された。このことは、表面ICAM-2分子のオリゴマー形成(粘着分子のごく一般的な作用態様である)によって発動されるシグナリングメカニズムを示唆している。表面オリゴマーはそれらの細胞質ドメイン内に相互作用部位を創出し、シグナリング分子を補充して膜基部での相互作用に参画させることができるであろう。定量的FACS分析によって、細胞表面上のICAM-2分子の密度は細胞タイプ間で大きく変動することが示され(図30D、定量方法については添付文書を参照されたい;詳細については実験方法の項を参照されたい)、先に記載されたように多様な発現パターンと相関性を示す(de fougerolles et al. 1991)。リンパ球でのICAM-2の基礎発現レベルは、ICAM-2表面分子の数で決定したときレトロウイルスベクターによる強制発現の1/100から1/10000未満であった。我々は、従って架橋されたとき内因性ICAM-2が上記で観察された表現型を付与できるか否かを調べることにした。
考察
細胞生存シグナルを仲介するICAM-2のモデル
我々の結果は、CD19+の初代B細胞と同様に多様な細胞タイプにおける内因性ICAM-2の異所性発現又は架橋は、細胞に対し生存シグナルを開始させることができることを示した。ICAM-2誘発AKT活性化は、細胞を化学物質(スタウロスポリン及びエトポシド)及び生理学的(TNFα及びFasリガンド)アポトーシス誘発物質に対して耐性にさせることができる生存シグナルである。ICAM-2はα−アクチニン及びエズリンと同時免疫沈澱し、重要な膜−細胞骨格リンカータンパク質との相互作用を明らかにした。ICAM-2の抗アポトーシス作用は、α-アクチニンと結合することが知られている21アミノ酸細胞質ドメインに依存した。特に、α−アクチニンはp85SH3‐ドメインを介してPI3キナーゼと直接相互作用することが示された(Shibasaki et al. 1994)。更にまた、ICAM-2細胞質ドメインは、膜−細胞骨格リンカータンパク質のエズリン/ラジキシン/モエシン(ERM)ファミリーのメンバーと結合する(Helander et al. 1996)。ERM−タンパク質は、膜−細胞質リンケージを促進することによって細胞の形態、粘着及び増殖を調節し(Tsukita and Yobeura, 1997)、更に腫瘍抑制因子、マーリン/シュワンノミンを包含して神経線維芽種症II型での関与が示唆される。更に、エズリン及び他のERMタンパク質は種々の疾患で粘着分子の分布の調節についてそれらの関与が示唆されている(Ichikawa et al. 1998; Stokowski and Cox, 2000; Turunen et al. 1998; Vinores et al. 1995)。最近、粘着依存生存は、PI3-キナーゼとの直接相互作用及びそれに続くAKT活性化を介して上皮細胞でエズリンによって仲介されることが報告された(Gautreau et al. 1999)。興味深いことに、ICAM-2のクラスター形成はエズリンの過剰発現によって誘発され、不適切な表面タンパク質のクラスター形成及びそれに続くシグナリングはERMタンパク質によって強力な影響を受けることが示唆された。従って、我々は、ICAM-2細胞質ドメインは、膜−細胞骨格リンカータンパク質(例えばα‐アクチニン及び/又はエズリン)と相互作用し、PI3キナーゼの膜への補充と活性化、更にそれに続くAKTキナーゼ仲介生存活性をもたらすことを提唱する。
レトロウイルスcDNAスクリーニング
レトロウイルスの産生及び感染は記載に従って実施した(Kitamura et al. 1995; Onishi et al. 1996; Rayner and Gonda, 1994)。cDNAライブラリーはJurkat T細胞からpBabe-Sベクターで調製した(Hitoshi et al. 1998)。前記ライブラリー(2x106一次形質転換体)を用いて約107のPHOENIX-Eパッケージング細胞にトランスフェクトした。pBMN-LacZコントロールベクターを1:10の割合で前記ライブラリーに加えトランスフェクション/感染効率をモニターした。ウイルス上清を採集し、約107の指数関数増殖期のNIH3T3細胞に感染させた。感染後48時間で細胞を分割しβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ライブラリーにより形質導入したNIH3T3細胞を合流度約25%で播種し、24時間後に培養液を1μMのスタウロスポリン(STP; Sigma, St. Louis, MO)を含むDMEMに交換した。24時間処理した後、前記STP含有培養液を完全なDMEM/10%ドナーウシ血清と交換した。生存細胞を約80%の合流度に到達させた(7日)。生存細胞を前記に記載したように更に2ラウンド再処理した。
表現型トランスファーアッセイ
ライブラリー感染生存細胞の部分標本にモロニーネズミ白血病ウイルス(T. Kinsella (Stanford)より贈与)を重感染させた。重感染細胞を2週間継代してヘルパーウイルスを効率的に拡散させた。未感作NIH3T3細胞をウイルス上清で感染させ、48時間発現させた。続いて再感染細胞を上記で述べたようにスタウロスポリンで処理した。生存細胞を7日間培養し、RT-PCRによってトランスファーについて分析した。
プロウイルスcDNA挿入物のRT-PCRクローニング及び構築物の作製
RNAは酸−グアニジウム−フェノール−クロロホルム法によって記載のように(Chomczynski and Sacchi, 1987)調製した。cDNAは4μgの熱変性全RNAから50μLの反応容積で作製し(Primega, Madison, WI)、42℃及び55℃で45分インキュベートした。cDNA反応生成物(5μL)を50μLのPCR反応ミックス(Perkin-Elmer, Foster City, CA)で95℃/30秒;55℃/60秒;72℃/2分で25サイクル増幅させた(プライマー:5'-GATCCTCCCTTTATCCAG;5'-GAATGAAAGACCCCACCTGT)。完全長のICAM2cDNAをレトロウイルスベクターpBM-Z-IN骨格(Kinoshita et al. 1998)のBamHI/Sal1部位でクローニングした。ICAM2-AC、ICAM2-AN及びICAM2-C末端スクランブルをPCRで作製し、BamHI/Sal1部位でクローニングした。
NIH3T3ネズミ線維芽細胞は、DMEM、10%DCS、1%PSQ(ダルベッコー改変イーグル培養液、10%ドナー仔牛血清、1%ペニシリンストレプトマイシン(1000単位/mL及び2mMのL-グルタミンPSQ)中で維持した。JurkatT細胞及びCH27形質転換B細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQで維持した。BaF3プロB細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQ、400U/mLのIL-3(Peprotech)中で維持した。70Z/3プレB細胞はRPMI-1640、10%FCS、1%PSQ、50μmのβ-メルカプトエタノール中で維持した。HL60骨髄白血病細胞はOpti-Mem I、10%FCS、1%PSQで維持した。293Tヒト線維芽細胞は、DMEM、10%FCS、1%PSQで維持した。細胞は5%CO2/37℃加湿インキュベーターで維持した。形質導入細胞は500 1μg/mLのG418(Sigma)で維持し、構築物の適切な発現は、表示したように完全長のICAM-2、ICAM-2ΔC、ICAM-ΔNのウェスタンブロット及びFACS分析によって確認した。スタウロスポリン(Sigma)処理は特に表示がないかぎり1μMで24時間であった。LY294002処理は、以後の全ての処理の前に10μMで30分実施した。ウォルトマンニン(Sigma)処理は100nMで24時間であった。化学物質はDMSOに溶解させ(溶媒希釈について最終的に1:1000であった)、ベクターコントロールは陰性コントロールとして1%のDMSOとともにインキュベートした。ベクターコントロールは表示したようにpBMN-Z-IN(空ベクター)の形質導入又はpBMN-Z-IN-GFP(http://www.stanford.edu/group/nolan/plasmid_maps/pmaps.html)から成る。pBMN-Z-IN-GFPの感染頻度は、3つの別々のウイルス形質導入について48%±10であった。タンパク質発現についてフローサイトメトリーにより日常的にモニターしたとき、持続的なネオマイシン選別によって、均質なICAM-2、ICAM2-ΔC、ICAM-ΔN又はコントロールベクター集団が得られた。初代細胞の調製の場合、単核細胞はヒトの末梢血からフィコール−プラーク密度遠心分離及び粘着プラスチック培養皿上での粘着細胞の排除によって単離した。単離細胞は完全培養液で維持し、CD4、CD3、CD19、及びICAM-2発現についてFACSによって分析した。
抗体架橋実験は、10μg/mLでN末端領域(細胞外ドメイン)を認識する、マウス抗ICAM-2モノクローナル抗体を用いて実施した。スピン透析(Biorad)を用いて、アジ化物含有抗体(0.01%)の緩衝液をリン酸緩衝食塩水(pH7.4)と交換した。抗マウスIgG(Sigma)を架橋実験のコントロール抗体として用いた。106のJurkat又はBaF3細胞の血清をそれぞれ3時間又は4時間枯渇させた。細胞をICAM-2又はマウスIgG(10μg/mL)で37℃で表示した時間インキュベートした。時間は、シグナリング経路の大半を減弱させるために血清枯渇後に開始するか、又は表示のとおりであった。血清枯渇3又は4時間では、カスパーゼ3活性、細胞周期分析、アネキシンV/PI染色によって調べたときアポトーシスの生化学的開始は認められなかった(データは示されていない)。細胞抽出物を作製し、免疫沈澱又はイムノブロッティングのどちらかを実施した。初代細胞のICAM-2クラスター形成は、FITC結合抗ヒトICAM-2(IC2/2 Research Diagnostics)を用いて実施した。その後のICAM-2の染色によってICAM2のクラスター形成及びシグナルトランスダクションが生じた。
アポトーシスは、表示に従って、濃縮核、フローサイトメトリーによるアネキシン-V結合又はフローサイトメトリーによるTUNEL BrdU染色の計測のいずれかによって決定した。アポトーシスは以下のいずれかによって誘発した:適切な実験での表示に従ってスタウロスポリン(1μM)、抗マウスFas(5μg/mL, Santa Cruz Biotechnology (SCB))、抗マウスFas(5μg/mL Jo2 Biomed)又は抗ヒトFas(10ng/mL CH11 Kamiya Biomedical)による処理、IL-3排除(24時間又は表示のとおり)。濃縮核の計測の場合、NIH3T3細胞をガラスのカバースリップに増殖させ、アポトーシスについて調べた。浮遊細胞は、25μMのアクリジンオレンジ/25μMの臭化エチジウム又は5μg/mLのヘキスト33342(Molecular Probes, Eugene, OR)による核染色によって分析した。アポトーシスは、報告されたように(Jacobson and Raff, 1995)特徴的な濃縮核の存在によって確認された。少なくとも5つの個々の視野を写真撮影し、ツァイスアキシオスコープ蛍光顕微鏡を用いて計数した。生存アッセイの場合、106のNIH3T3細胞を10cmの皿に播種し、37℃で一晩インキュベートした。前記細胞を1μMのスタウロスポリンで24時間処理した。前記細胞を洗浄し完全培養液で24時間培養した。細胞をトリプシン処理し、生細胞をトリパンブルー染色の後で計数した。未処理細胞は前記処理時に計数した。%生存は、(処理後の生細胞の数)/(処理前の生細胞の数)を表す。FACSによるアネキシン-V-FITC(SCB)/PI(Clontech)染色は記載のように実施した(PharMingen)。TUNELアッセイはアポトーシスBrdUキット(Promega)の製造元の記載に従って実施した。フローサイトメトリーのデータ採取は、BrdU(10,000事象採集)及び濃縮核カウントの両者についてスタウロスポリン処理(1μM)後24時間、アネキシン-V結合(100,000事象採集)についてスタウロスポリン処理後12時間で実施した。アネキシン-V陽性細胞は処理後24時間で膜の抵抗性は減弱(compromised)しているであろう。フローサイトメトリー分析はCELLQuestを用いてBD FACSCaliburマシーンで実施し、フロージョソフト(Tree Star)を用いて分析した。
AKT活性は細胞からAKT1を免疫沈澱させて検出し、GSK3融合タンパク質(NEB)によるキナーゼアッセイで用いた。2x106のNIH3T3、2x106のJurkat又は5x105のBaF3細胞を、固定したAKT 1G1モノクローナル抗体(mAb)(1:200、NEB)とともに4℃で穏やかに揺らしながら2時間インキュベートした。免疫複合体を細胞溶解緩衝液で4回洗浄し、200μMのATP及び1μgのGSK-3融合蛋白質(CST)を補充した40μLのキナーゼ緩衝液(25mMトリス(pH7.5)、5mMのβ-グリセロホスフェート、2mMのDTT、0.1mMのNa3VO4、10mMのMgCl2)に30℃で30分再懸濁した。キナーゼ反応は、SDSサンプル緩衝液で停止させ、5分間煮沸し、GS3Kのリン酸化状態は免疫ブロッティングによって検出し、ECL検出(Amersham)を用いて可視化した。イムノブロットは3つのそれぞれ別個にウイルスによって形質導入した細胞集団のそれぞれ3回繰り返した典型例である(n=9)。AKT活性は、ser473及びthr308に対するリン特異的抗体(NEB)を用いてイムノブロッティングによりAKTのリン酸化によって実証した。
細胞抽出物は、2x106細胞を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX-100、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim)。抽出物を14000rpm(5分、4℃)で遠心し、細胞溶解物(BCAタンパク質アッセイ(Pierce)によって測定したとき20μg)を標準的な方法を用いて12%又は15%のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分画し、PVDFメンブレンに移した。免疫沈澱物は、プロテインA/G+アガロースビーズ(SBC)によって予備清澄化を実施した。IPを一次抗体で1時間又は一晩、プロテインA/G+アガロースビーズで1時間インキュベートし、更に溶解緩衝液で4回洗浄した。ブロットは以下の抗体とインキュベートした:ICAM-2 N末端(1:500、SBC)、抗ICAM C末端(1:500、SBC)、抗ICAM2 IC2/2 mAb(1:500、BD Biosciences)、抗α-アクチニン(1:500、SBC)、抗エズリンmAb(1:500、Transduction Laboratories)、抗Bcl2(1:500、SBC)、抗p27(1:500、SBC)、抗p21(1:500、SBC)、抗cFLIP(1:500、SBC)、抗ホスホ‐AKT-Ser473(1:1000、NEB)、抗ホスホ‐AKT‐thr308(1:1000、NEB)、抗AKT(1:1000、NEB)、抗ホスホ‐BADser155(1:1000、NEB)、抗FKHR(1:1000wb、1:200 IP NEB)、抗ホスホ‐FKHR(1:1000、NEB)、抗ホスホ‐Gsk3α/021(1:500、NEB)、抗切断PARP(1:1000、NEB)、抗切断カスパーゼ9(1:1000、NEB)、抗切断カスパーゼ3(1:1000、NEB)、抗切断カスパーゼ7(1:1000、NEB)、抗pAFX(1:1000、NEB)、抗カスパーゼ9(1:1000、NEB)、抗カスパーゼ7(1:1000、NEB)、抗PARP(1:1000、NEB)。BADリン酸化は全BADを免疫沈澱させ(1:200、NEB)、BADリン酸化検出キット(NEB)の製造元の推奨に従って、抗BADser112(1:1000、NEB)及び抗BADser136(1:1000、NEB)でイムノブロットを実施することによって決定した。使用した二次抗体は以下のとおりである:抗ウサギHRP(1:5000、NEB)、抗マウスHRP又は抗ヤギHRP(1:5000、SBC)。更にECL検出(Amersham)又はコダックデジタルサイエンス440Cステーションを用いて可視化した。ブロットは少なくとも3つの別個の実験の典型例である。
細胞内及び細胞外染色は記載(www.metezoa.com/UPL3287)されたように実施した。使用した抗体は以下のとおりである:抗ICAM2 N末端(SBC)、抗ICAM N末端(SBC)、抗ICAM2 FITC mAb(BD Biosciences)、アネキシン-V-FITC(BD、Biosciences)、アネキシン‐V-ビオチン(SBC)、PI(Clontech)。使用した二次抗体は以下のとおりである:抗ウサギPE(BD Biosciences)、抗マウス‐FITC(BD Biosciences)、抗ウサギFITC(PharMingen)、抗ヤギFITC(BD Biosciences)、抗ヤギテキサスレッド(BD Biosciences)、ストレプトアビジン‐PE(BD Biosciences)、ストレプトアビジン‐FITC(BD Biosciences)、抗ヒトCD4-APC(PharMingen)、抗ヒトCD19-PerCP(PharMingen)、抗ヒトICAM2-FITC(Research Diagnostics IC2/2)。AKT活性のための細胞内プローブは、抗AKTser473モノクローナル抗体(Cell Signaling Technology)をアレキサ568染料(Molecular Probes)にアレキサ568タンパク質結合キット(Molecular Probes)を用いて結合させて作製した。リン特異性はウェスタンブロッティング及びFACS分析によって、多様なPI3Kの活性化物質及び阻害剤に対して調べた(データは示されていない)。ホスホ−AKTser473アレキサ568による細胞内染色は、NIHT3T細胞を血小板由来増殖因子(Sigma)で刺激したとき及び刺激前にLY294002で阻害したときAKTキナーゼ活性を反映した。定量的FACS分析は記載されたように実施した(Davis et al. 1998; Lyer et al. 1998; Lenkei et al. 1998)。簡単に記せば、R-フィコエリスリン(PE)(Molecular Probes)をタンパク質架橋キット(Molecular Probes)の製造元の推奨に従って抗ICAM2 N末端モノクローナル抗体(Research Diagnostics IC2/2)と結合させ、化学量論的適切性を調べ(データは示されていない)、Quantibrite-PEビーズ(BD Systems)を用いて定量した。定量的カリブレーション曲線は既知量のPE分子/ビーズを含むQuantibrite-PEビーズを用いて作製した。直線回帰分析を以下の等式を用いて実施した:log10(PE蛍光)=勾配*log10(PE分子/ビーズ)+切片。PEの蛍光はPEチャネルの相乗平均を得ることによって決定される。定量は、PKと直接結合させた抗体についてのみ有効である。飽和量の抗体を用い、更に十分に洗浄することによって全表面抗原の結合が担保される。氷上でのサンプル調製は抗体の内在化を減少させる。未知の細胞集団に対する細胞の表面抗原は、カリブレーション曲線を用いてPEの相乗平均をコンピュータで処理して決定される。定量FACS分析は表面抗原の発現について概算を提供する。抗体の結合価は使用したモノクローナル抗体について調べられていないので、グラフの数字は相対的表面分子数を表し絶対数ではない。フローサイトメトリー分析はBD FACSCaliburマシーンで実施し、FlowJoソフト(Tree Star)を用いて分析した。CellQuestは、定量的フローサイトメトリー及びQuantibrite-PEビーズの直線回帰分析のために用いた。フローサイトメトリーのデータは、106細胞/分析サンプルによる3つのそれぞれ別個の実験の典型例である。100,000事象を収集するか、又は別に記載したようにカリブライトビーズ(BD systems)を用いて修正した。棒線グラフに示したデータは3通りの実験の平均値(棒線)±SDとして表されている。
ヒトCD56 + CD8 + T細胞の細胞毒性に必要なICAM-2(CD102)シグナリング事象
本実施例では、本発明の方法及び組成物を用いて本発明者ら(ここではまた“我々”と称する)は、白血球機能抗原−1(LFA-1)は免疫細胞シナプスの形成に必須であり、種々の自己免疫疾患の病理において役割をもつことを示す。本実施例では本発明の方法及び組成物を用いて、本発明者らは、ICAM-2は、微小管及びアクチン細胞骨格の両者によるレセプターのクラスター形成及び活性化につながるLFA-1シグナルトランスダクション経路を誘発することを示す。ICAM-2は、単一細胞分析によって測定したとき21.7pM/細胞結合親和性を示した。ICAM-2/LFA-1の嵌合は、PKCの活性化及びアクチンと微小管細胞骨格の両者の再編成を誘発した。前記の事象は、活性なLFA-1を介する細胞毒性T細胞エフェクター−標的細胞結合に際して、p44/42 MAPK経路のSyk依存活性化をもたらした。ICAM-2は、ヒトCD56+CD8+パーフォリン放出及びその結果としての標的白血病細胞に対する細胞毒性を仲介する。他のICAM類と比較して、ICAM-3はICAM-2の作用にもっとも類似し、ICAM-1と類似しない。IL-2予備活性化ヒトPBMCでは、CD56+CD8med集団のパーフォリン放出の仲介はICAM-2>ICAM-3>>ICAM-1であった。全てのICAM類は、CD56+CD8high集団でパーフォリン及びグランザイムAの低下に寄与した。これらの結果によって、サブセット特異的細胞毒性T細胞免疫におけるICAM-2/LFA-1の固有の機能的帰結が確認された。
白血球機能抗原−1(LFA-1)は、白血球の粘着に必要なα、βヘテロダイマーインテグリンである(van Kooyk and Figdor, 2000)。現時点で、LFA-1はリンパ球粘着に参画し、免疫学的シナプスの形成(Dustin and Shaw, 1999)並びにリンパ球の血管外遊出及び再循環(Volkov et al. 2001)で主要な役割をもつことはよく知られている。LFA-1粘着は細胞内粘着分子(ICAM)−1、−2及び3リガンドによって管理されている(van Kooyk and Figdor, 2000)。白血球粘着不全症(LAD)(LFA-1インテグリンの変異又は欠損を示す症状)の患者は、重篤な再発性細菌感染及び全体的免疫障害を示す(Bunting et al. 2002)。前記臨床症状の中で特に、LFA-1ノックアウトマウスは、LFA-1が養子免疫療法における腫瘍退縮の仲介で潜在的な役割を果たすことができることを示唆した(Mukai et al. 1999; Nishimura et al. 1999)。前記の研究は、遺伝的にリンパ球粘着分子と免疫機能障害とを結びつけたが、これら疾患の免疫病理を仲介する分子の詳細はほとんど理解されていない。
LFA-1の研究は最初 インテグリンの粘着の役割に向けられていた。LFA-1インテグリンの活性化及びレセプターのクラスター形成の生理的プロセスはどのように相互に関連し更にリガンド結合に際して細胞シグナルに変換されるかは明らかではない。これらの事象が存在しない場合、どのようにしてLADの破壊的な作用及びLFA-1ノックアウトマウスでの免疫障害反応がもたらされるのかはよく理解されていない。我々は、従ってICAM−LFA-1の相互反応モデルの分子的詳細を解明し、細胞対細胞接触で開始するLFA-1のシグナリングメカニズムを理解しようとした。可溶性ICAM-2による処理時のLFA-1レセプターの動的変化をモニターするためにマルチパラメーター単一細胞分析を利用し、我々は、アクチン及び微小管の両者によってICAM-2粘着がLFA-1の活性化及びクラスター形成と結びつけられることを見出した。微小管細胞骨格は、マルチパラメーターフローサイトメトリーで測定されるようにLFA-1の構造変化(活性化)(LFA-1のクラスター形成が進行する事象)を強制した。前記誘発されたLFA-1の活性化はp44/42マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK;RAF/MEK/ERK)経路の活性化(Pyk2及びSykキナーゼ活性の両者に依存する事象)をもたらす。
本発明者らは、細胞毒性T細胞と標的白血病細胞との間の粘着(細胞対細胞接触を必要とする事象)におけるICAM-2仲介LFA-1活性化についての分子的詳細を研究した。ヒトCD56+CD8+T細胞のICAM-2刺激は、白血病細胞のパーフォリン/グランザイム−A仲介細胞毒性を誘発することができた。この誘導細胞死は、ICAM-3及び前記よりも少ない程度でICAM-1、他の2つのLFA-1リガンドによって分担された。これらの結果はICAM-2/LFA-1誘導細胞毒性Tリンパ球免疫のためのシグナリングメカニズムの特徴を示し、腫瘍によるICAM-2及びおそらくはICAM-3の分泌は誘導細胞毒性T細胞免疫反応を回避させる可能なメカニズムを示唆する。
リコンビナントICAM-2はLFA-1仲介粘着を促進する
本発明者らは、Jurkat細胞株モデルを実験系として選択し、先ず初めにLFA-1シグナリングメカニズムを分析し、続いてヒトT細胞での発見を実証した。生化学的に精製したICAM-2タンパク質を調製し、他のリガンドの非存在下でICAM-2/LFA-1相互作用を調べた(補充図33A−Bを参照されたい)。我々は、レトロウイルスで形質導入したNHI3T3細胞から免疫親和性クロマトグラフィー及びそれに続くゲルろ過を用いてヒトICAM-2を精製し、それをNSOネズミミエローマ細胞で産生されたICAM2−FC融合タンパク質と比較した。これらのネズミ系哺乳類発現系は、それらがICAM-2の生物活性型を産生するということから選択された。ICAM2−FCタンパク質の生化学的分析は、融合タンパク質の予想される分子量と一致し(76kD、図33A)、精製ヒトICAM-2は72から74kDの分子量を示した(図33A)。このサイズは、JurkatT細胞から精製した75kDのICAM-2と類似していた(データは示されていない)。
本発明者らはFITC結合ICAM-2(ICAM2−FITC)を作製し、LFA-1レセプターの動的変化をフローサイトメトリー及びレーザー走査共焦点顕微鏡検査(LSCM)によって調べた(補充図33Cを参照されたい)。我々は、ICAM2−FITCの結合カイネティクスを単一細胞でモニターすることによって、LFA-1レセプターのリガンド結合について調べた。最初の150秒で低結合が観察され、それに対して750秒まで増加が続き、その後一定になった(図33B、中央パネル)。対照的に、α‐LFA-1抗体は、初めの50から100秒で最初の結合を示し、800秒まで均衡を保った(図33B、下パネル)。PMA処理によるLFA-1の予備活性化(McDowall et al. 1998)によって、ICAM-2の即時結合が示された(図33C、上パネル)。150秒後に徐々にICAM-2が結合するのは、何らかの結合誘発事象(α‐LFA-1又はPMA活性化LFA-1を用いたときには観察されない特質)の後で、LFA-1とそのICAM-2リガンドとの結合の強化が生じることを示唆した(図33B)。ICAM2−FITCの結合はトリプシン処理細胞では観察されず(データは示されていない)、LFA-1に対する抗体によってブロックされた(下記で説明する)。従って、時間の関数としてICAM-2リガンドの結合の増加があるようで、標的細胞上に誘発される結合部位が存在することが示唆された。
本発明者らは、LFAの嵌合が細胞骨格構造を変化させるか否かを調べ、ICAM-2刺激に際してアクチン及び微小管の両細胞骨格の再編成を観察した(図34A)。本発明者らは細胞骨格構造をフローサイトメトリーでモニターし、ICAM-2結合時にアクチン及び微小管の構成が同時に変化するのを観察した(図34B)。前記の作用は脱重合化と一致する。ICAM-2処理は1分以内のLFA-1の迅速なクラスター形成を誘発した(多数のクラスター形成事象が5分で生じる)(図34C、左パネル)。ICAM2−FITCリガンドを用いて細胞表面を可視化することによって、ICAM-2リガンドはLFA-1レセプターのクラスター形成を誘発することが示された(図34C、左パネル)。このクラスター形成事象はノンブロッキングβ2インテグリン抗体(クローンCTB104)を用いてある程度の同時局在を示した(図34C、右パネル)。従って、我々は、ICAM-2とLFA-1の結合は、LFA-1/ICAM-2複合体の再編成をもたらすシグナルを誘発すると推測した。我々は従って、アクチン/微小管細胞骨格で観察される変化との関係で前記の推測を調べることにした。
本発明者らは、ICAM-2結合時のLFA-1レセプターの動的変化をフローサイトメトリーによって調べ、LFA-1活性化とクラスター形成との相関性をみた。我々は、FACSCaliburマシーンで二重識別子(doublet discriminator)モジュールを用いて、単一細胞のレーザー励起時の分散及び集中蛍光パルス(FFP)間を識別した。4℃に対して37℃でのICAM-2のインキュベーションはFFPの現象を示した(前記はサイトカリシンD処理に際して大きく強化される作用である)(図34D)。ICAM2−FITCの表面結合を蛍光の強度でモニターし、蛍光パルス(FP)の飛行時間(time of flight, TOF)に対して標準化した。TOFはレーザー励起細胞面積と比例するので、我々は、ICAM2−FITCの強度/TOFの値をLFA-1のクラスター形成のための定量的評価と解釈した。前記の値をICAM-2刺激に対する時間の関数としてコンピュータで計算したとき(図34E)、前記時間はLSCMで観察されるクラスター形成事象の増加と比例している(図34C)。
ICAM-2の粘着強化及びLFA-1クラスター形成の誘発は、ICAM-2リガンドに対する全体的なアビディティーの増加を反映しているが、前記は必ずしもLFA-1の活性化状態(高親和性状態)を反映しているわけではない(McDowall et al. 1998)。LFA-1活性化に際して構造変化によってmAb24抗体によって認識されるエピトープが露出される(Neeson et al. 2000)。mAb24−アレキサフルア633結合物を用いてICAM-2刺激時のLFA-1の活性化状態をフローサイトメトリーで調べた。非刺激細胞はmAb24の結合を示さず、PMA処理により観察された誘発とは対照的であった(図34F)。ICAM-2刺激細胞は、活性なLFA-1で二形態性集団を示した(サイトカリシンによって減弱された作用である)(図34F)。微小管破壊剤(ノコダゾール及びタキソール)による処理は、ICAM-2刺激に際してLFA-1の完全な活性化をもたらした(図34F)。対照的に、サイトカリシンDによるアクチン細胞骨格の破壊はICAM-2誘発LFA-1活性化を減少させたが、LFA-1レセプターのクラスター形成及びそれに続くICAM-2結合は強化された(図34D参照)。従って、アクチン及び微小管細胞骨格ネットワークはLFA-1の活性及びアビディティーに弁別的に衝撃を与える。
本発明者らは、細胞をPKC阻害剤(ビスインドリルマレミドI(BIMI))で処理することによって、mAb24の結合を用いて測定したときICAM-2誘発LFA-1活性化が抑制されることを観察した(図35A)。ICAM2−FITCの結合によって測定したとき、ICAM-2の粘着は影響を受けなかった(図35A)。このことは、リガンドで誘発されるレセプター構造変化は細胞内キナーゼに左右されることを示唆した。興味深いことに、ICAM-2はカルシウムの流入を誘発した(カルシウムはPKC活性化に必要な成分である)(データは示されていない)。従って、これらの観察は、ICAM-2リガンドによって誘発されるmAb24のネオエピトープの露出は、PKC依存細胞内シグナリング事象の引き金となることを提唱している。我々は、ICAM-2とLFA-1との結合によって生じる下流のシグナリングの結果を調べることにした。
フローサイトメトリーによるキナーゼのプロファイリング実験を実施して、ICAM-2刺激時のPKC活性化の下流のシグナリング経路を特定した。ICAM-2による処理によってP44/42 MAPKのリン酸化及び活性化の両者が誘発された(図35B−D)。ICAM−2の力価は、単一細胞のフローサイトメトリー分析で判定したときP44/42 MAPKのリン酸化と相関性を示し(図35B、上パネル)、キナーゼ活性分析と一致する結果であった(図35C)。αL及びβ2インテグリンに対するmAbの力価はICAM-2結合と競合し、従って誘発P44/42 MAPKリン酸化を減少させた(図35B、下パネル)。前記の抑制は、β1、β3、αM又はαXインテグリンに対するmAbによる予備処理後には観察されず(図35C)、ICAM-2/LFA-1相互作用はP44/42 MAPK活性化を仲介していたことを示した。
本発明者らは、フローサイトメトリーによるP44/42 MAPKキナーゼ抑制プロファイリング及び活性化プロファイリングを実施し、LFA-1シグナリングに必要な成分を特定しようとした。PKC阻害剤(BIMI)、細胞骨格破壊剤(サイトカリシンD、タキソール、ノコダゾール)及びEDTAによる二価陽イオンの封鎖は、ICAM-2誘発P44/42 MAPKシグナルを減少させて(図35D)、LFA-1のリガンド誘発事象が、アクチン−微小管細胞骨格によってシグナルトランスダクションに機械的に連結されていることを示唆した。LFA-1からP44/42 MAPKへのシグナル伝達に必要な上流のキナーゼを特定するために、一連のキナーゼ阻害剤を用いて、ICAM-2誘発P44/42 MAPK活性を停止させるそれらの能力について調べた(補充表1及び補充図34を参照されたい)。一方、ハービマイシンA及びエモジン(src及びp56lckの阻害剤)は作用を示さなかった。チロフォスチンA9及びピセアタンノール(それぞれプロリン−チロシンキナーゼ2(Pyk2)及び脾臓チロシンキナーゼ(Syk)の特異的阻害剤)(Avdi et al. 2001; Furtes et al. 1999)は、ICAM-2で誘発されるP44/42 MAPK及びその上流のアクチベーターRaf-1の活性化を停止させた(図36A)。
本発明者らは、Pyk2及びSykがβ2インテグリンと相互作用するか否かを調べた。Pyk2及びSykは、ICAM-2の処理に際してリン酸化され、更にβ2インテグリンと同時免疫沈澱して(図36B)、Pyk2及びSykは膜へ移動することが示唆された(補充図35もまた参照されたい)。前記は、ICAM-2刺激に際して時間の関数としてPyk2及びSykと同時に発生した(図36B−C)。PKCα/βII及びPyk2のリン酸化は1分で検出され、続いてSykのリン酸化が5分で生じた(データは示されていない、補充図36)。上記の結果を総合すると、ICAM-2によって付与されるLFA-1シグナリングメカニズムは少なくともPKCによって開始され、Pyk2及びSykによってP44/42 MAPK経路に伝えられることが示唆された。
LFA-1はリンパ球間の粘着(いくつかの免疫学的シナプスで生じるプロセス)に必要であるので、我々は、生理学的状況でのICAM-2/LFA-1相互作用に関係する分子的事象の解明に興味をもった。クラスターを形成したICAM-2の局所分布は、発現レベルに関係なくナチュラルキラー細胞が細胞毒性を開始する効果的な標的構造であると提唱されている(Helander et al. 1996)。我々は先ず、FACSによるエフェクター−標的殺細胞アッセイを用い、種々のエフェクター:標的細胞比の刺激ヒトPBMCによる処理でHL60白血病細胞の標的細胞溶解を定量的にモニターした。標的細胞溶解のフローサイトメトリーによる検出は、標準的なクロム放出アッセイよりも感度が高いことが報告された(Lecoeur et al. 2001)。我々は、HL60細胞を蛍光染料CFSEで標識し、標準的なエフェクター−標的細胞によるアッセイでフローサイトメトリーによって細胞量をモニターした。可溶性ICAM-2はIL-2の存在下で標的細胞溶解を開始することができたが、IL-2の非存在下では開始することができなかった(図37A)。IL-2予備活性化細胞では、ICAM-1及びICAM-3は、ICAM-2とは対照的に強力な細胞毒性反応を開始させなかった(図37B)。
本報告では以下の事柄が観察された:(1)ICAM-2は、外因性活性化物質(例えばサイトカイン又はTCRシグナリング)の非存在下で、LFA-1のクラスター形成、活性化及び細胞骨格の再編成を誘発することができる;(2)LFA-1は、リガンド結合に際して、PKC、Pyk2及びSykを必要とするp44/42 MAPK経路にシグナルを伝達する;更に(3)LFA-1レセプターの動的変化は、アクチン及び微小管の両細胞骨格ネットワークによってシグナルトランスダクションに機械的に連結されている。これら分子的事象の生理学的な結果は、パーフォリン及びグランザイム‐Aによって仲介されるCD56+CD8+T細胞細胞毒性の引き金となり、前記細胞毒性はICAM-2及びICAM-3によって大半が共有されるが、ICAM-1はこれを共有しなかった。
β2インテグリンシグナリングメカニズムは実験系に応じて変動し、細胞の形態及び運動性における粘着性役割の中心に据えられている(Dib, 2000)。β2インテグリンシグナリングは、とりわけパキシリン、vav及びGTPアーゼ活性化タンパク質のチロシンリン酸化を介して細胞骨格の再編成に中心的に関与することが示された(Fuortes et al. 1994; Zheng et al. 1996)。LFA-1仲介白血球粘着に集中した研究は、LFA-1アビディティーにおけるPKCの調節的役割を示し(Bleijs et al. 2001; Hedman and Lundgren, 1992)、TCRシグナリングはLFA-1を活性化できることを明示した(Peterson et al. 2001)。更にまた、ケモカインは、TCRシグナリングが存在しないとき、リンパ球/内皮接触時にLFA-1の活性化因子として機能することができることが示された(Constantin et al. 2000)。外部刺激(ケモカイン)又は内部刺激(TCR又は共働刺激分子)の非存在下で、LFA-1インテグリンの粘着、クラスター形成及び活性化がどのようにして細胞内シグナリング事象と結び合わされるかは明らかではなかった。
我々はまた、エフェクター−標的細胞結合でパーフォリン及びグランザイム‐Aの放出によって実証されたように(前記の作用はICAM-1と対照的であった)、ICAM-2は細胞溶解活性の仲介でICAM-3と類似することを観察した。我々は、ICAM-2とICAM-3の細胞内シグナリングメカニズム(ICAM-1のそれとはまた異なっている)の類似性を以前に観察した(Perez et al. 2002)。しかしながら、高い細胞溶解活性がバルクPBMCで観察されたので、前記の結果は細胞毒性能力をもつ未確認の他のサブセットをICAM-2が刺激する可能性を排除できない(図37参照)。
免疫学試薬及び化学試薬
β1、β2、β3、β4、β5、β6、α1、α4、α5、αL、LFA-1、Pyk2、Syk、Mac-1、ICAM-1及びICAM-3に対するmAb(PharMingen)。CD3、CD4、CD8、CD19、CD56、CD45直接結合物(FITC/PE/PERCP/APC/ビオチン)、グランザイム‐A‐FITC(PharMingen)。パーフォリン‐CY5及びCD8-CY5PE(Herzenberg Laboratory, Stanford Universityから贈与)。ICAM-2 mAb及びICAM-2-FITC(IC2/2 Research Diagnostics)。抗ホスホPYK2(Y402)、抗ホスホ‐p44/42(pT185Py187)(Biosource)。抗ホスホPKCα/β(Thr638)、抗ホスホ‐Syk(Tyr525/526)、抗ホスホRaf1(Ser259)(Cell Signaling Technologies)。使用タンパク質及び化学試薬:フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(Pierce)、アレキサフルア染料シリーズ488、546、568、633、タキソール‐アレキサ546、ファロイジン‐アレキサ633及びCFSE(Molecular Probes)、チロフォスチンA9及び18、SB203580、ピセアタンノール、ビスインドリルマレイミドI及びII、ハービマイシンA(Calbiochem)。エモジン、ジェニステイン、DMSO、PMA、PHA、スタウロスポリン、イオノマイシン、ヨウ化プロピオジウム、サイトカリシンD(Sigma)、タンパク質A/Gアガロース(SCBT)、リコンビナントヒトIL-2(Roche)、リコンビナントヒトICAM1-FC、ICAM2-FC、ICAM3-FC(Genzyme)、マウス及びウサギIgGに対する二次抗体(Santa Cruz)、擬似処理は以下から成った:マウスIgG(抗体の場合)、1%BSA(タンパク質の場合)、又は0.001%DMSO賦形剤(化学物質の場合)。
NIH3T3細胞は、DMEM、10%DCS、1%PSQ(ダルベッコー改変イーグル培養液、10%ドナー仔牛血清、1%ペニシリンストレプトマイシン(1000単位/mL及び2mMのL-グルタミンPSQ)中で維持した。JurkatT細胞は、RPMI-1640、10%FCS、1%PSQ中で1x105細胞/mLで維持し、全ての機能アッセイのために血清は12時間枯渇させた。細胞は5%CO2/37℃加湿インキュベーターで維持した。ヒト末梢血単球は、健常なドナーの全血(Stanford Blood Bank)のフィコール−プラーク密度遠心分離(Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden)によって得た。磁気活性化細胞分類を用い、表示の実験のために未感作CD8+T細胞の陰性単離を実施した(Dynal, Oslo, Norway)。
完全長のICAM2 cDNAをJurkat細胞から入手し、記載のように(Perez et al. 2002)レトロウイルスベクターpBM-Z-INのBamHI/Sal1部位でクローニングした。ヒトICAM2をレトロウイルス感染によりNIH3T3細胞で過剰発現させ、免疫親和性クロマトグラフィーによって採集した。二段階溶解法を用いてICAM-2をアフィニティー精製し、続いて抗ICAM-2固相で精製した。細胞を緩衝液Aで5分間4℃で溶解させ、続いて50%(v/v)の緩衝液B(緩衝液Aプラス1%トリトンX-100)で30分間4℃で透過性にした。緩衝液Aは以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、0.1%NP40、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim)。そのC末端に対する抗ICAM-2pAb(4mg、Santa Cruz)を製造元の推奨にしたがいアフィ‐ゲル(Affi-Gel) Hz活性化支持体(Biorad)と結合させた。前記支持体はFc領域を介してIg分子を結合させ、より高い抗原結合性能をもたらす。採集した上清のバッチ溶解を実施し(4℃、2時間)、緩衝液C(0.1%トゥイーン‐20、PBS(pH7.4))で4回洗浄した。ICAM-2タンパク質を4.5MのNaCl(トリス、pH6.8)で溶出させ、一晩透析し(PBS(pH7.4)、0.001%アジ化物、0.01%グリセロール、4℃)、サイズ排除スピンクロマトグラフィーを用いて濃縮し、0.01%グリセロールを用いて安定化させた。
抗ICAM-2固相を緩衝液Cで再平衡化させて0.01%のチメロソールで保存し、3回まで再使用した。純度はクーマシーゲルで調べたとき98%を越えていた。サイズ排除クロマトグラフィーでより高分子量の凝集物は除去され、精製ICAM-2の非変性ゲル電気泳動で観察されなかった。前記の方法で20mgを精製し、本実験に使用した。ICAM2-FITCの合成は、NHS-フルオレセイン(Pierce)への化学的結合により実施し、未反応染料はゲルろ過によって除去した。ICAM2-FITCプローブは、フローサイトメトリーで判定したとき、トリプシン処理Jurkat細胞に組み入れられることはなく、またLFA-1抗体クローン(TS1/22又はTS1/18(Developmental Hybridoma Studies Bank)又は非標識ICAM-2タンパク質でブロックしたとき前記細胞と結合することもない。ICAM2-FITCの結合はβ2インテグリンクローン(CT104, Santa Cruz)によって阻止されなかった。精製ICAM-2は、NSOネズミミエローマ細胞(Genzyme)から精製されたリコンビナントICAM-2FC融合タンパク質に匹敵した。ICAM-1FC及びICAM-3FCもまたNSO細胞(Genzayme)から精製した。タンパク質は14,000RPMで5分使用前に遠心した。1mgのICAM-2タンパク質を製造元(Dynal)の推奨に従って2x108のエポキシ活性化ビーズと結合させた。総計2μgのICAM-2を含む4x105のビーズを表示のように使用した。ゲルの画像化はVersaDocマシーン(Biorad)で実施し、クォンティティワン(Quantity One)定量化ソフトを用いて分析した。
細胞内及び細胞外染色は記載(Perez and Nolan, 2002)したように実施した。活性なキナーゼのための細胞内プローブは、リン特異的抗体をアレキサフルア染料シリーズと記載したように結合させて作製し、リン−タンパク質最適化条件で使用した(perez and Nolan, 2002)。カイネティクス分析は、37℃に維持した時間同期化96ウェルで固定緩衝液を直接適用することによって実施した。細胞内アクチン及び微小管染色は、ファロイジン−アレキサ633及びタキソール−アレキサ546染料(Molecular Probes)を用いて実施した。粘着とクラスター形成分析は、本文に記載したようにICAM2-FITCを用いて実施した。LFA-1活性化は、mAb24−アレキサ633又はmAb−アレキサ546結合物のいずれかによって調べ、37℃で表面染色を実施した。フローサイトメトリーデータは、106細胞/サンプルによる3つの別個の実験の典型例である。10−50,000事象を収集し、FACSCaliburマシーンで手動により目盛り修正を実施した。棒グラフで示したデータは相乗平均蛍光強度(MFI)として表し、アイソタイプコントロールで標準化した。ログ比は、非刺激細胞のMFIに対する刺激細胞のMFIと定義される。データはフロージョ(Flowjo)ソフト(Treestar)を用いて分析した。
ICAM2-FITC結合パーセンテージは100*((MFIexp−MFIctl)/(MFIfinal−MFIctl))として表し、式中、MFIexpは実験濃度の平均蛍光強度に等しく、MFIctlは非染色細胞の平均蛍光強度に等しく、MFIfinalは結合が飽和した最終濃度の平均蛍光強度に等しい。サンプルは図に示した最終濃度で30分37℃で50μLの染色媒体(def RPMI, 4%FCS)中でインキュベートし、500μLのPBS(pH7.4、1mMのEDTAを含む)で1回洗浄し、100μLの1%パラホルムアルデヒドに再懸濁した。染色条件の希釈率及び72.1kDの分子量をモル濃度の決定に用いた。染色緩衝液は、2.4mMのカルシウム及び2mMのマグネシウムを含んでいた。データは、カレイダグラフ(Kaleidagraph)ソフトを用いて等式、V=Vmax[S]/(Km+[S])に適合させた。式中、Vは結合%であり、[S]はICAM2-FITC濃度であり、Kmはミハエリス−メンテンの結合定数である。
Jurkat細胞を表示のように処理し、ポリ-L-リジン(Sigma)被覆滅菌カバースリップに穏やかに遠心することにより(1000rpm、10分)付着させ(1mg/mL、30分)、リン酸緩衝食塩水(PBS、pH7.4)で2回洗浄し、2.7%パラホルムアルデヒド(PBS)で固定した。細胞をPBS中の0.1%トリトンX-100(5分)で透過性にし、PBSで2回洗浄し、4%のFCSでブロックし、更に表示のように抗体又は細胞内染色に付した。染色したカバースリップをマウントし、ツァイスレーザー走査共焦点顕微鏡510を用いて観察した。
免疫沈澱、イムノブロッティング及びキナーゼアッセイ
細胞抽出物は、2x106細胞(表示のように処理)を氷冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液に採集することによって調製した。溶解緩衝液は以下を含む:20mMトリス(pH7.5)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1%トリトンX-100、2.5mMのNa2PO4、1mMβ−グリセロホスフェート、1mMのNa3VO4、1μg/mLのロイペプチン、1mMのPMSF、プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤(Boehringer Mannheim)。抽出物を14000rpm(5分、4℃)で遠心し、10−20μg(BCAタンパク質アッセイ(Pierce)によって測定)を標準的な方法でイムノブロッティングに付した。免疫沈澱物(IP)は、プロテインA/G+アガロースビーズ(SBC)によって予備清澄化し、一次抗体で1時間、プロテインA/G+アガロースビーズで1時間インキュベートし、更に溶解緩衝液で4回洗浄した。ブロットを表示の抗体とインキュベートし、更にECL(Amersham)を用いて現像した。免疫ブロットのストリッピング及び(表示のような)プローブによる再検査は、ストリッピング緩衝液(62.5mMのトリス(pH6.8)、10%SDS、1%β-メルカプトエタノール)でインキュベートすることによって実施した(30分、55℃)。MAPK活性は、p44/42 MAPKキナーゼキットによって製造元(Cell Signaling Technologies)の推奨に従って検出した。
標的細胞溶解は、フローサイトメトリーによるCFSE標識HL60細胞の検出によって測定した。HL60細胞を1μgのCFSEで標識した(30分、37℃)。標的を2回洗浄し、擬似処理、IL-2活性化(100U/mL)、CD3/CD28活性化(1μg/mL)処理を施すか、又はICAM2ビーズもしくは可溶性ICAM-1、-2もしくは-3で処理し(10μg/mL、30分、37℃)、その後104標的細胞/ウェルで96ウェルの丸底プレートに播種した。CTLを50:1、25:1、及び12.5:1のE:T比で添加し、37℃で4時間インキュベートした。続いて細胞をマルチパラメーターフローサイトメトリー及び細胞内パーフォリン染色のために処理した。特異的溶解%を以下の等式から算出した:%特異的溶解=100−100x(実験のHL60カイント/全コントロールHL60カウント)。HL60カウントはCFSE蛍光によって検出した。パーフォリンの%は以下の等式から算出した:%パーフォリン=100x[(実験のパーフォリンMFI−アイソタイプmAbのMFI)/(全パーフォリンMFI−アイソタイプmABのMFI)]。MFIはフローサイトメトリーによる細胞内検出の平均蛍光強度を指す。細胞結合は、記載(Morgan et al. 2001)のようにフローサイトメトリーで決定した。化学物質による阻害は、表示した刺激の前に表示した化合物(10μM、30分、37℃)で実施した。全ての実験は3回づつ実施した。
Claims (32)
- 単一細胞内の少なくとも第一と第二の活性化できるタンパク質の活性化状態を検出する方法であって、以下の工程、
a)前記第一及び前記第二の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供する工程、
b)前記細胞集団を、複数の活性化状態特異的抗体と接触させる工程であって、前記複数の活性化状態特異的抗体が、以下のi)及びii)、
i)前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも1つの第一の活性化状態特異的抗体、及び
ii)前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも1つの第二の活性化状態特異的抗体、
を含む工程、及び
c)フローサイトメトリーを用い、前記細胞集団の単一細胞内で前記第一及び第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出する工程であって、前記第一の活性化状態特異的抗体の結合が、前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標であり、更に前記第二の活性化状態特異的抗体の結合が、前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記第一の活性化できるタンパク質が、キナーゼである請求項1に記載の方法。
- 前記第一の活性化できるタンパク質が、カスパーゼである請求項1に記載の方法。
- 前記第一の活性化できるタンパク質が第一のキナーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質が、第二のキナーゼである請求項1に記載の方法。
- 前記第一のキナーゼのアイソフォームが、第一のリン酸化されたキナーゼであり、更に前記第二のキナーゼのアイソフォームが、第二のリン酸化されたキナーゼである、請求項4に記載の方法。
- 前記第一の活性化部位特異的抗体が、前記第一のリン酸化キナーゼと結合し、更に前記第二の活性化部位特異的抗体が 、前記第二のリン酸化キナーゼと結合する、請求項5に記載の方法。
- 前記第一の活性化できるタンパク質が、第一のカスパーゼであり、更に前記第二の活性化できるタンパク質が、第二のカスパーゼである請求項1に記載の方法。
- 前記第一のカスパーゼの前記アイソフォームが第一のプロカスパーゼの切断生成物であり、更に前記第二のカスパーゼの前記アイソフォームが第二のプロカスパーゼの切断生成物である請求項7に記載の方法。
- 前記複数の活性化部位特異的抗体が、前記第一のカスパーゼの前記アイソフォームと結合する第一の活性化部位特異的抗体及び前記第二のカスパーゼの前記アイソフォームと結合する第二の活性化部位特異的抗体を含む請求項8に記載の方法。
- 単一細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性化状態を検出する方法であって、以下の工程、
a)少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質を含む細胞の集団を提供する工程、
b)前記細胞集団を複数の基質と接触させす工程であって、前記複数の基質が、前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも1つの第一の基質を含む工程、及び
c)フローサイトメトリーを用い、前記細胞集団の単一細胞内の前記第一の基質の修飾を検出する工程であって、前記修飾が前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記細胞集団が、更に第二の活性化できるタンパク質を含み、前記複数の基質が、更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み、更に工程c)が、フローサイトメトリーを用い、前記細胞集団の単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、前記第二の基質の修飾が、前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である請求項10に記載の方法。
- 単一細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性化状態を基準にして前記細胞のタンパク質の活性化状態プロフィールを検出する方法であって、以下の工程、
a)少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供する工程、
b)前記細胞集団を複数の基質と接触させる工程であって、前記複数の基質が、前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる少なくとも1つの第一の基質を含む工程、
c)前記細胞集団を複数の活性化状態特異的抗体と接触させる工程であって、前記活性化状態特異的抗体が、前記細胞集団内の前記第一の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合することができる少なくとも1つの第一の活性化状態特異的抗体を含む工程、及び
d)フローサイトメトリーを用いて、以下のi)及びii)、
i)前記細胞集団の単一細胞内の前記第一の活性化状態特異的抗体の結合であって、前記第一の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である結合、及び
ii)前記単一細胞内の前記第一の基質の修飾であって、前記第一の活性化できるタンパク質の前記特定の活性化状態の指標である前記修飾、
を同時に検出する工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記細胞集団が、更に第二の活性化できるタンパク質を含み、前記複数の基質が、更に前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームで修飾することができる第二の基質を含み、更に工程d)が、前記フローサイトメトリーを用い、前記単一細胞内の前記第二の基質の修飾を検出することを含み、前記修飾が、前記第二の活性化できるタンパク質の特定の活性化状態の指標である請求項12に記載の方法。
- 前記複数の活性化状態特異的抗体が、更に、前記細胞集団内の前記第二の活性化できるタンパク質の対応するアイソフォームと結合できる第二の活性化状態特異的抗体を含み、更に工程c)が、フローサイトメトリーを用いて前記細胞集団の前記単一細胞内の前記第二の活性化状態特異的抗体の結合を検出することを含み、前記第二の活性化状態特異的抗体の結合が、前記第二の活性化できるタンパク質の前記特定の活性化状態の指標である請求項13に記載の方法。
- 細胞内の少なくとも第一の活性化できるタンパク質の活性を調節することができる生体活性物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程、
a)前記細胞の各々が、少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質、第二の活性化できるタンパク質、及び第三の活性化できるタンパク質を含む細胞集団を提供する工程であって、前記第一の活性化できるタンパク質が、前記第二の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第二の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム(アイソフォーム−2)を形成することができ、更に前記第二の活性化できるタンパク質が、前記第三の活性化できるタンパク質を活性化し、それによって前記第三の活性化できるタンパク質の特定のアイソフォーム(アイソフォーム−3)を形成することができる工程、
b)前記細胞を第二の活性化状態特異的抗体、第三の活性状態特異的抗体及び生体活性候補物質と接触させる工程であって、前記第二の活性化状態特異的抗体が、前記アイソフォーム−2と結合することができ、更に前記第三の活性化状態特異的抗体が、前記アイソフォーム−3と結合することができる工程、
c)蛍光活性化細胞分類(FACS)を用い、前記アイソフォーム−2及びアイソフォーム−3の存在を基準にして前記細胞集団の単一細胞を分類する工程、及び
d)前記生体活性候補物質の存在下及び非存在下での前記単一細胞内の前記アイソフォーム−2対前記アイソフォーム−3の比率を決定する工程であって、前記生体活性候補物質の存在下及び非存在下における前記アイソフォーム−2対前記アイソフォーム−3の比率における相違が、前記第一の活性化できるタンパク質の活性を修飾する前記生体活性候補物質の能力の指標である工程、
を含むことを特徴とする方法。 - 前記第一の活性化できるタンパク質が、活性惹起物質によって活性化される請求項15に記載の方法。
- 前記第一の活性化できるタンパク質が、カスパーゼである請求項15に記載の方法。
- 前記第一の活性化できるタンパク質が、キナーゼである請求項15に記載の方法。
- 前記キナーゼが、PI3Kであり、前記第二の活性化できるタンパク質が、PIP2であり、前記第三の活性化できるタンパク質が、PIP3であり、前記アイソフォーム−2がPIP4,5ビスホスフェートであり、更に前記アイソフォーム−3が、PIP3,4,5である請求項18に記載の方法。
- 前記PI3Kが、増殖因子によって又は細胞表面レセプターの活性化によって活性化される請求項19に記載の方法。
- 前記第一の活性化できるタンパク質が、ICAM−2であり、前記活性が、アポトーシスであり、第二の活性化できるタンパク質が、PIP2であり、前記第三の活性化できるタンパク質が、PIP3であり、前記アイソフォーム−2が、PIP4,5ビスホスフェートであり、前記アイソフォーム−3が、PIP3,4,5である請求項20に記載の方法。
- 工程a)が、更にICAM−2とICAM−3とのクラスター形成を含む請求項21に記載の方法。
- 前記複数の活性化状態特異的抗体が、抗AKT−ホスホ−Ser473、抗AKT−ホスホ−Thr308、抗p44/42 MAPKホスホ−Thr202/Tyr204、抗TYK2ホスホ−Tyr1054/1055、抗p38 MAPKホスホ−Thr180/Tyr182、抗JNK/SAPKホスホ−Thr183/Tyr185、抗ホスホ−チロシン、抗ホスホ−スレオニン、抗PIP2及び抗PIP3から成る抗体群から選択される少なくとも1つの抗体を含む請求項1〜9及び12〜14のいずれかに記載の方法。
- 工程a)が、更に、少なくとも前記第一の活性化できるタンパク質の活性化を誘発する物質と前記細胞集団を接触させる工程を含む請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- 工程a)が、更に、前記第一及び前記第二の活性化できるタンパク質の少なくとも1つの活性化を誘発する物質と前記細胞集団を接触させることを含む請求項1〜9、11及び13〜22のいずれかに記載の方法。
- 工程a)が、更に、前記第一、前記第二及び前記第三の活性化できるタンパク質の少なくとも1つの活性化を誘発する物質と前記細胞集団を接触させることを含む請求項15〜22のいずれかに記載の方法。
- 更に、前記第一の活性化できるタンパク質の前記活性化状態及び前記第二の活性化できるタンパク質の前記活性化状態を基準にして前記単一細胞を区分する工程を含む請求項1〜9、11及び13〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記第一の活性化状態特異的抗体が第一の標識を含み、前記第二の活性化状態特異的抗体が第二の蛍光標識を含み、更に前記分類が蛍光活性化細胞分類(FACS)による請求項1〜9及び14〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記第一の活性化状態特異的抗体が第一のFRET標識を含み、前記第二の活性化状態特異的抗体が第二のFRET標識を含み、更に前記分類が蛍光活性化細胞分類(FACS)による請求項1〜9及び14〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記第一の活性化状態特異的抗体がFRET標識を含み、前記第二の活性化状態特異的抗体が一標識を含み、更に前記分類が蛍光活性化細胞分類(FACS)による請求項1〜9及び14〜22のいずれかに記載の方法。
- 工程a)が更に前記細胞を固定することを含む請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が哺乳類細胞である請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
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