JP2005514582A - 自動化ハイブリダイゼーション用の試薬および方法 - Google Patents
自動化ハイブリダイゼーション用の試薬および方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005514582A JP2005514582A JP2002585675A JP2002585675A JP2005514582A JP 2005514582 A JP2005514582 A JP 2005514582A JP 2002585675 A JP2002585675 A JP 2002585675A JP 2002585675 A JP2002585675 A JP 2002585675A JP 2005514582 A JP2005514582 A JP 2005514582A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- surfactant
- hybridization
- phosphate
- microarray
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6841—In situ hybridisation
Abstract
Description
本出願は2001年4月30日に出願された「自動化免役組織化学用およびIn Situハイブリダイゼーションアッセイ用配合物(Automated Immunohistochemical and In Situ Hybridization Assay Formulations)」という表題の米国仮特許出願第60/287,325号の優先権を主張する。本出願は引用により米国仮特許出願第60/287,325号を全部包含する。
発明の背景
発明の分野
本発明は医学、遺伝学、生化学および分子生物学の分野に関する。特に本発明は自動化ハイブリダイゼーション用の試薬、試薬キットおよび方法に関する。より詳細には本発明は自動化in situハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイでの自動化ハイブリダイゼーション用の試薬、試薬キットおよび方法に関する。
核酸ハイブリダイゼーション反応は両DNAおよびRNA分子中の特別なヌクレオチド配列を検出し、そして特性決定するために使用することができる。例えばサザンブロッティングは細胞または組織からのDNAの抽出を含み、そして特定の染色体の遺伝子構造を決定するために使用することができる。同様にノーザンブロッティングは細胞または組織からのRNAの抽出を含み、そして特定のmRNAが特定の組織中に存在するかどうか、およびどのくらい存在するかを決定するために使用することができる。ハイブリダイゼーションにより核酸を検出するためのさらなるアッセイ形式には以下が含まれる:核のラン−オン(run−on)アッセイ;スロットブロットアッセイ;磁気粒子分離;逆ノーザンブロットアッセイ;ドットブロットアッセイ;RNase保護アッセイ;リガーゼ連鎖反応(LCR);ポリメラーゼ連鎖反応(PCR);逆転写酵素−PCR(RT−PCR);ディファレンシャル ディスプレイ(differential display)RT−PCR(DDRT−PCR);in situハイブリダイゼーション;およびより最近では微小組み立て(microfabricated)アレイ(「マイクロアレイ」または「遺伝子チップ」とも呼ばれる)。これらの各形式で使用することができる検出法には、とりわけ放射性標識;酵素標識;化学発光標識;および蛍光標識を含む。
本発明は自動化ハイブリダイゼーション用の試薬、試薬キットおよび方法に関する。より詳細には本発明は自動化in situハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイでの自動化ハイブリダイゼーション用の試薬、試薬キットおよび方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明の方法、試薬およびキットは自動化ハイブリダイゼーション用である。用語「自動化ハイブリダイゼーション(Automated hybridization)」とは、自動化装置の使用が関与するハイブリダイゼーションの方法を称する。自動化ハイブリダイゼーションには限定するわけではないが、自動化in situハイブリダイゼーションおよび自動化マイクロアレイハイブリダイゼーションを含む。
1.クロンテックIおよびII型(カタログ番号7880−1および7881);
2.コーニング(カタログ番号2549);
3.シグマ(カタログ番号P0425);
4.テレケム(Telechem)(カタログ番号CSS100);
5.NEN(カタログ番号MPS620)。
組織サンプルを中性−緩衝化ホルマリン(NBF)またはパラホルムアルデヒド(PFA)のいずれかの中で固定し、パラフィンに包埋し、そして5mm切片に切断する。次いでパラフィン切片を顕微鏡スライドに置き、そしてISH技法を使用して1以上の標的について染色する。従来からのISHプロトコールは大変時間がかかり、そして技術を要するものである。しかしいったんスライドが調製されれば、残りのISHプロトコールはDISCOVERY(商標)システムで自動化される。
A.組織調製:採集、NBF/PFA固定、組織プロセッサーを使用した処理、そしてミクロトームを使用した切片化;
B.DISCOVERY(商標)ISHプロトコール:焼成、脱パラフィン化;RIBOPREP(商標)、RIBOCLEAR(商標)、RIBOCC(商標)を使用した前処理、そしてプロテアーゼI、IIまたはIII(ベンタナメディカルシステムズ社:それぞれカタログ番号760−2018、760−2019および760−2020)を使用したプロテアーゼ消化;DIG−標識リボプローブおよびRIBOHYBE(商標)を使用したハイブリダイゼーション;RIBOWASH(商標)の連続希釈を使用したストリンジェンシー洗浄;RIBOFIX(商標)を使用した後処理;サンプルを1次抗体とインキューベーションし、ビオチン−標識抗−DIG抗体および抗体希釈物をインキューベーションし、そして強化V−BLUE(商標)キット(ベンタナメディカルシステムズ社)を使用することによるシグナル検出(SA−AP結合体のインキューベーションおよびV−BLUE(商標)基質インキューベーション);そしてカウンター染色。次いでサンプルを顕微鏡により分析する。
1.ベーキング:パラフィン切片について予めプログラムする。
2.脱パラフィン化:予めプログラムする。
3.前処理:
a.RIBOPREP(商標):37℃で30分;
b.RIBOCLEAR(商標):37℃で10分;
c.RIBOCC(商標)を使用した細胞コンディショニング;「マイルドCCl」設定;
d.プロテアーゼIIを使用した酵素消化:37℃で2分。
4.ハイブリダイゼーション;
a.プローブの適用:「マニュアルアプリケーションウェット」
b.変性:70℃で10分;
c.RIBOHYBE(商標)を使用したハイブリダイゼーション;高度に発現するmRNAについては60℃で2時間;「中程度」に発現するmRNAについては60℃で6時間;
d.ストリンジェンシー洗浄:RIBOWASH(商標)を用いた2回の洗浄;65℃で6分;
e.後処理:RIBOFIX(商標)、37℃で20分間;
f.シグナル検出:
i.抗−DIG抗体:37℃で20分;
ii.V−BLUE(商標)強化検出キット(ベンタナメディカルシステムズ社;キットの強化SA−AP、強化エンハンサー、強化NBTおよび強化BCIPを自動的に適用するプログラム);高度に発現するmRNAについては基質を2時間インキューベーションし;「中程度」に発現するmRNAについては基質を5時間インキューベーションする。
マウス卵管のホルマリンで固定した、パラフィンに包埋した切片を、前処理工程で以下のRIBOMAP(商標)試薬を用いて処理する:RIBOPREP(試薬)、RIBOCLEAR(試薬)およびRIBOCC(商標)。さらにプロテアーゼI、IIまたはIII(ベンタナメディカルシステムズ社;それぞれカタログ番号760−2018、760−2019および760−2020)をこのプロトコールに使用することができる。
DISCOVERY(商標)ISHプロトコールは、DISCOVERY(商標)システムのコンピューターユニットでDISCOVERY(商標)ISHソフトウェアで作成することができ、以下の通りである:
1.NEXES(商標)ソフトウェアを開く。
2.プロトコールを作成するために、メインスクリーン上の「プロトコール」ボタンをクリックする。「作成/編集プロトコール」および「削除プロトコール」を含むウインドがスクリーン上に現れる。使用者は「作成/編集プロトコール」をクリックして「NEXES(商標)プロトコール−編集者−DISCOVERY(商標)染色モジュール」ウインドを開く。
3.ファイルされた「手順」下で「リサーチISH Blue Plus」手順を選択する。
前処理工程を設定するために:
1.「脱パラフィン化」の隣のチェックボックスをクリックする。
2.「固定剤」の隣のチェックボックスをクリックする。新たなフィールドがスクリーン上に現れる。「低温」フィールドで、「37度C」を選択する。「固定剤」フィールドで、「RIBOPREP(商標)」を選択する。「プラスインキューベーション時間」で「20分」を選択する。
3.「前処理#1」の隣のチェックボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「PT1にEZバッファーを使用する」の隣のボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「PT1−EZ用にスライドを加熱する」の隣のボックスをクリックする。3つの新たなフィールドがスクリーン上に現れる。「低温」フィールド下で「37度C」を選択する。「前処理」で「RIBOCLEAR(商標)」を選択する。「インキューベーション時間」下で「10分」を選択する。
4.「細胞コンディショニング」の隣のチェックボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「コンディショナー#1」の隣のチェックボックスをクリックする。1つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れ、そして使用者は「マイルドCC1」をクリックする。「標準CC1」について新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる(使用者はこのボックスをクリックしない)。
5.「前処理#2」の隣のボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「PT2用の反応バッファーを使用する」の隣のボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「PT2−RBのためにスライドを加熱する」の隣のボックスをクリックする。3つの新たなフィールドがスクリーン上に現れる。「低温」下で「37度C」を選択する。「酵素」下で「プロテアーゼ2」を選択する。使用者は「インキューベーション時間」で「2分」を選択する。
1.「プローブ」の横のチェックボックスをクリックする。上記「プローブ」のスクリーン上に2つの新たなチェックボックスが現れ、そして4つの新たなフィールドが現れる。「タイトレーション」の隣のチェックボックスをクリックする。「プローブ自動分配」がスクリーンから消え、そして2つの新たなチェックボックスが「タイトレーション」の下に現れる。「マニュアルアプリケーションウェット」の隣のボックスをクリックする。
2.スクリーン上の「プローブ」パネルは、変性およびハイブリダイゼーション条件を設定するためのものである。「変性」に関する「高温」フィールド下で、「65度C」を選択し、そして「変性インキューベーション時間」下フィールドで「6分」を選択する。「ハイブリダイゼーション」に関する「低温」フィールド下で、「60度C」を選択し、そして「ハイブリダイゼーションインキューベーション時間」フィールド下で「2時間」(高いmRNA発現)または「6時間」(中程度のmRNA発現)を選択する。
3.「ストリンジェンシー洗浄#1」の隣のチェックボックスをクリックする。新しいフィールド「ストリンジェンシー洗浄」および「高温ストリンジェンシー#1」の隣のチェックボックスがスクリーン上に現れる。「ストリンジェンシー洗浄」フィールド下で「0.1X SSC」を選択する。「高温」の隣のチェックボックスは無視し、そして「低温」ウインド下で「60度C」を選択し、そして「インキューベーション時間」のフィールド下で「6分」を選択する。
4.「ストリンジェンシー洗浄#2」について上記の工程3を繰り返す。
5.「固定剤後」の隣のボックスをクリックし、そしてスクリーン上に2つのフィールドが現れる。固定剤の下で、「RIBOFIX(商標)」を選択し、そして「インキューベーション時間」で「20分」を選択する。
1.「抗体」の隣のボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「抗体自動分配」の隣のボックスをクリックする。2つの新たなチェックボックスがスクリーン上に現れる。「標準Abインキューベーション」の隣のボックスをクリックする。2つの新たなフィールドがスクリーン上に現れる。「抗体」フィールドで、「抗体#1(あなたの抗−DIG抗体を含む分配器に関する番号に相当する)」を選択する。「プラスインキューベーション時間」下で「20分」を選択する。
2.チェックボックスが無い「基質」フィールドでは、「長いインキューベーション時間」で「2時間」(高いmRNA発現)または「5時間」(中程度のmRNA発現)を選択する。
1.「保存(Save As)」ボタンをクリックする。名前およびプロトコール番号に関するフィールドが現れる。プロトコールに関する名前をタイプし、そして適当なボックス中の番号を選択する。「閉じる」ボタンを再度クリックし、そしてプロトコールが保存される。
1.メインスクリーンの下のツールバーから、バーコード記号をクリックする。「プロトコール」ボタンをクリックする。「DISCOVERY(商標)を選択」プロトコールフィールドで望むプロトコール番号および名前をマークする。印刷したい各プロトコールバーコードラベルについて、「付加>>」ボタンを1回クリックする。閉じる/印刷ボタンをクリックする。「ユーザープロンプト」フィールドからラベル上に示したい任意のさらなる情報を入力する。「印刷」ボタンをクリックする。最後のバーコードが印字された時、「出る」ボタンをクリックする。
2.バーコード(1つまたは複数)をスライド(1つまたは複数)上に配置し、それらを慎重に装置に乗せ、ドアを閉じ、そして「ラン」ボタンをクリックする。「試薬/乗せる試薬皿」ボックスおよび「除去する試薬カップ」ボタンをクリックする。乗せるスライドの番号を入力し、そして「スタートラン」をクリックする。
以下の装置および試薬を使用する:
1.清浄で適切なサイズの混合容器;
2.0.2μmフィルターシステムまたは0.2μmフィルターおよび適切なポンプ装置;
3.調製のサイズに適する混合装置;
4.適切なサイズのクラスAメスシリンダー;
5.電子天秤および計量機;
6.清浄で適切なサイズの保存容器;
7.脱イオン水;
8.20X SSPE(シグマP/N S8140);
9.TWEEN(商標)20(シグマP/N P7949);
以下の工程を行う:
1.清浄で適切なサイズの混合容器に、日付を付け、そして頭文字を付した「CHIPPREP(商標)1イン−プロセス バルク(In−Process−Bulk)」のラベルを貼る。
2.容器の種類およびサイズを記録する;
3.加える脱イオン水の容量を計算して以下のように80%の最終バッチ容量のCHIPPREP(商標)1とする:バッチ容量x0.8=容器に加える脱イオン水の全量。
4.磁気撹拌棒を使用して激しい撹拌を行う;
5.最終濃度が6Xとなるように20X SSPEの必要な容量を以下のように加える:20x6で除算した最終バッチ容量=加える20X SSPEの容量;
6.TWEEN(商標)20(シグマP/N P7949)を以下のように10%の最終濃度になるように加える:最終バッチ容量x0.1=加えるTWEEN(商標)20の容量;
7.少なくとも20分間混合する;
8.溶液に脱イオン水を加えて最終バッチ容量とする;
9.少なくとも30分間混合する;
10.0.2μmフィルターユニットの保存容器に、日付をつけ、そして頭文字を付した「CHIPPREP(商標)1ファイナルバルク」、L/Nのようなラベルで標示する;保存容器の種類およびサイズを記録する;
11.0.45μmフィルターユニットを通して溶液を濾過する;
12.ラベルを付した保存容器に付いている0.2μmフィルターを通して溶液を濾過する;
13.CHIPPREP(商標)1のバルク溶液を室温で保存する。
1つの態様では、CHIPPREP(商標)2は任意の総塩濃度のリン酸バッファー;タンパク質様材料(例えばガンマグロブリン、カゼイン、または非特異的結合を遮断するために適当な任意の他のタンパク質);および非イオン性界面活性剤を含んでなる。好適な態様では、CHIPPREP(商標)2は、10〜200mMの総塩濃度のリン酸バッファー;0.5〜6%ヤギガンマグロブリン;5〜15%加水分解カゼイン;および0.005〜1%の非イオン性界面活性剤を含んでなる。最も好適な態様では、CHIPPREP(商標)は、75mMのリン酸カリウム;25mMのリン酸ナトリウム;55mMのNaCl;3%ヤギガンマグロブリン;13.4%の加水分解カゼイン;および0.05%BRIJ(商標)35を含んでなる。
CHIPHYBE(商標)溶液は好ましくは6X SSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;および10%ホルムアミドからなる。脱イオン化ホルムアミドは、20XのSSPE(シグマ製品番号S8140)および平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩(シグマ製品番号D6924)のようにシグマ社(製品番号F9037)から得ることができる。CHIPHYBE(商標)を調製するために必要な装置は以下の通りである:
1.清浄で適切なサイズの混合容器;
2.0.2μmフィルターシステムまたは0.2μmフィルターおよび適切なポンプ装置;
3.調製のサイズに適する混合装置;
4.適切なサイズのクラスAメスシリンダー;
5.電子天秤および計量機;
6.清浄で適切なサイズの保存容器。
DISCOVERY(商標)CHIPMAP(商標)キットは、ベンタナのDISCOVERY(商標)装置を使用してDNAマイクロアレイに対して標識した標的をハイブリダイゼーションさせるための試薬を提供する。
1.CHIPPREP(商標)1(スプレッディングエンハンサー;周囲の室温で保存);
2.CHIPPREP(商標)2(スプレッディングエンハンサーおよびブロッキング溶液;開封するまで室温で保存、その後は2〜8℃);
3.CHIPHYBE(商標)(ハイブリダイゼーションバッファー、室温で保存);
4.CHIPCLEAN(商標)(アレイクリーニング溶液);
5.(キットは場合により含む)使用者が充填できる分配器
6.使用説明書を含む包装挿入物。
1.LCS(商標)(ベンタナカタログ番号650−010);
2.EZ PREP(商標)(ベンタナカタログ番号950−100);
3.RIBOWASH(商標)(ベンタナカタログ番号760−105);
4.反応バッファー(ベンタナカタログ番号760−105)。
1.マイクロアレイ;
2.標識した標的;
3.遠心または窒素銃。
核酸標的の正しい調製およびラベリングは、一環したハイブリダイゼーションの結果に必須である。蛍光的に標識したヌクレオチドを含むヌクレオチド三リン酸(dNTP)ミックスを使用した逆転写は標的ラベリングの常法である。逆転写の出発材料として全RNAまたはポリA RNA(mRNA)のいずれかを使用することができる。
a.ポリdTプライマーを使用した第1鎖cDNA合成
i.10μlの全RNA(5〜10μg)と1μlのT7−(T)24プライマー(100pmol/μl)を混合する;プライマー配列(カスタムプライマー):
GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG−T(24)
ii. 70℃で10分間加熱;氷上に置く。
1)4μlの5X第1鎖バッファー;
2)2μlの0.1mM DTT;
3)1μlの10mM dNTPを加える。
を加える。
b.第2鎖cDNA合成
i. PCR機または水浴を16℃に設定する。
1)91μlのギブコの水(ギブコカタログ番号10977)
2)30μlの5X第2鎖バッファー(ギブコカタログ番号10812014)
3)3μlの10mM dNTPミックス(ギブコカタログ番号18427−013)
4)1μlの大腸菌(E.coli)リガーゼ(ギブコカタログ番号18052−019)
5)4μlの大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI(ギブコカタログ番号18010−017)
6)1μlの大腸菌(E.coli)RNaseH(ギブコカタログ番号18021−014)
iii. 16℃で2時間インキューベーションする。
c.dscDNAの浄化(clean−up)
i. dscDNA反応(150μl)に、等量のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)(ギブコカタログ番号15593−031)を加え、そして30秒間、ボルテックス混合する。
a.アンビオン(Ambion)の Megascript T7キット(アンビオンカタログ番号1334)を使用する
i. 酵素ミックスを除くすべての試薬を入れる。
1)2μlの75mM ATP
2)2μlの75mM CTP
3)2μlの75mM GTP
4)2μlの75mM UTP
5)2μlの10X T7バッファー
6)2μlの10X T7酵素ミックス
iii. 12μlのミックスを8μlのcDNAに加え、そして十分に混合する。
b.IVT浄化
i.RNA精製用のRNEaseキットを使用し(キアジェン(Qiagen)カタログ番号74104)、そして製品に供給されたプロトコールに従う。
c.cRNAの濃度は、以下の転換式を使用して260/280のOD読み取りにより決定する:A260×希釈因子×40= μg/μl。増幅工程はラベリングに利用できるRNAの量を3〜5倍増加するはずである(5〜10μgの出発材料を用いて)。
a.4μgのcRNA(上記プロトコールから)を4μgのランダムへキサマー(オペロンテクノロジーズ(Operon Technologies)カタログ番号SP200−10D)と混合し、そして容量をギブコの水を使用して14μlにする。
b.70℃で10分間インキューベーションし、そして氷上に置く。氷上でcRNA/プライマーミックス:
i. 6μlの5×第1鎖バッファー(ギブコ)
ii. 3μlの0.1M DTT
iii. 0.6μlの50×dNTPミックス(50×dNTPミックス:25mMのdCTP、25mMのdGTPおよび10mMのdTTPの最終濃度:ロッシュカタログ番号1969064;すべてのヌクレオチド保存溶液は100mM)
iv. 1.4μlのギブコ水
v. 1μlのSSII(ギブコ)、
を加える。
c.3mlの1mM cy3−dUTP(100mMの最終(NENカタログ番号NEL578)または1mMのcy5−dUTP(NENカタログ番号577)。
d.42℃で30分間インキューベーションし、そして次に1μlのSSIIを加える。e.42℃でさらに1時間インキューベーションする。
f.サンプルを氷上に置く。
g.RNA分解
i. 試験管あたり1.5μlの1M NaOH、2mMのEDTA溶液(各月に新しくするべき)を加え、そして65℃で10分間インキューベーションする。サンプルを氷上に置く。
h.ssDNAの浄化
i. 500μlの10mM Tris pH7.4を標識したプローブに加え、そしてそれをミイクロコン(microcon)30カラム(ミリポア(Millipore)カタログ42410)に乗せる。
標識した標的を20倍に希釈し、そしてcy3およびcy5についてOD測定を以下のように測定する。cy3プローブに関して、A260およびA550を測定する。A260を使用して工程2に記載したように標的濃度を算出する。A550はラベリング効率の尺度である。典型的なA550は0.4以上高いはずである(20倍の希釈で)。cy5プローブに関しては、A260およびA650を測定する。典型的なA650は0.03以上高いはずである(20倍の希釈で)。
標識した標的がポリ−dTプライマー(ランダムヘキサマーの代わりに)を使用してmRNAから直接調製される場合、cDNAの長さはランダムプライマーを使用した時よりも有意に長い。大きな長い標的はガラススライドに非特異的に結合する傾向がより高く、分析を妨害し得る「ざらざらした(granular)」バックグラウンドを与える。この問題は標的cDNAを適用する前に断片化することにより克服することができる。したがって大きな標的cDNAを使用している場合、標的の断片化が好ましい。標的の断片化のための工程は以下の通りである。
a.試験管中での混合:RNase/DNaseを含まない79μlの水(ギブコカタログ番号10977);20μlの5×第1鎖バッファー(ギブコカタログ番号18064−014);および1μlのDNaseI(アンビオンカタログ番号2222)
b.1μlの上記ミックスを30μlのプローブに加え、そして37℃で15分間インキューベーションする。
c.95℃で5分間変性させて酵素を変性させ、そして氷上に置く。
システムでの最初のアレイ作動は以下に概説するプロトコールに従うことを薦める。これらの条件下で得られる結果に基づき、次にプロトコールを修飾して特定のアレイの応用に条件を至適するために必要なパラメーターを微調整することができる。DISCOVERY(商標)プラットホームで応用を作動させるために、以下の段階を取る:
1.NEXES(商標)ソフトウェアを開く。
2.メインスクリーンの「プロトコール」ボタンをクリックすることによりプロトコールを作成する。「作成/編集プロトコール」および「削除プロトコール」を含むスクリーン上にボックスが現れる。「作成/編集プロトコール」をクリックして「NEXES(商標)プロトコール−編集者」ウインドを開く。
3.「手順」ウインドで「マイクロアレイ」手順を選択する。
4.CHIPPREP(商標)1および2を順次使用した前処理工程はDISCOVERY(商標)システムで自動的に行われ、そして選択することはできない。
5.ハイブリダイゼーション条件を設定する:「プローブ」の横のボックスをクリックする。上記「プローブ」のスクリーン上に2つの新たなボックスが現れ、そして4つの新たなウインドが現れる。「タイトレーション」の隣のボックスをクリックする(選択したばかりのプローブボックスの上)。「プローブ自動分配」がスクリーンから消え、そして2つの新たなボックスが「タイトレーション」の下に現れる。「マニュアルアプリケーションウェット」の隣のボックスをクリックする。
6.「プローブ」ウインドは変性およびハイブリダイゼーション条件の設定に関する。「変性」に関する「高温」ウインド下で、「70度C」を選択し、そして「変性インキューベーション時間」ウインド下で「6分」を選択する。70℃を越える変性温度で6分間は薦められない。「ハイブリダイゼーション」に関する「低温」フィールド下で、「42度C」を選択し(DNA標的に関しては42℃〜50℃の間に維持するべきである)、そして「ハイブリダイゼーションインキューベーション時間」ウインドで「6時間」を選択する。
7.「ストリンジェンシー洗浄#1」の隣のボックスをクリックする。新しいウインドの「ストリンジェンシー洗浄」および「高温ストリンジェンシー#1」の隣のボックスがスクリーン上に現れる。「ストリンジェンシー洗浄」ウインド下で「1×のSSC」を選択する。「高温」の隣のボックスは無視し、そして「低温」ウインドで「42度C」を選択し、そして「インキューベーション時間」ウインドで「10分」を選択する。
8.「ストリンジェンシー洗浄#2」および「ストリンジェンシー洗浄#3」について上記の工程を繰り返す。
9.「CHIPCLEAN(商標)」の隣のボックスをクリックする。
10.「保存」ボタンをクリックすることによりプロトコールを保存する。プロトコール名およびプロトコール番号に関するウインドが現れる。プロトコールに関する名前をタイプし、そして適当なボックス中の番号を選択する。「閉じる」ボタンを再度クリックし、そしてプロトコールが保存される。
11.ラベルを調製し、およびスライドへの付加は以下の通り:メインスクリーンの下のツールバーから、バーコード記号をクリックする。「プロトコール」ボタンをクリックする。「選択DISCOVERY(商標)」プロトコールウインドで望むプロトコール番号および名前をマークする。印刷したい各プロトコールバーコードラベルについて、「付加>>」ボタンを1回クリックする。「閉じる/印刷」ボタンをクリックする。ラベル上に現れる任意のさらなる情報を、ユーザープロンプトボックスに入力する。「印刷」ボタンをクリックする。最後のバーコードが印字された時、「出る」ボタンをクリックする。次いですべてのバルク溶液の容器が正しく充填されいることを確認する。マイクロアレイ手順を使用して20枚のスライドを流すために、2×SSC容器をRIBOWASH(商標)で完全に充填しなければならない。
12.スライド(1つまたは複数)上にバーコード(1つまたは複数)を配置し、それらを慎重に装置に乗せ、ドアを閉じ、そして「ラン」ボタンをクリックする。「試薬/乗せる試薬皿」ボックスおよび「除去する試薬カップ」ボタンをクリックする。乗せるスライドの番号を入力し、そして「スタートラン」をクリックする。
13.最初にスプレッディングエンハンサー(CHIPPREP(商標)1)そして次にブロッキング溶液(CHIPPREP(商標)2)でのスライドの自動化前処理の後に、標識した標的を手動でスライドに適用する。典型的には0.5〜2μgの標識した標的を200μlのCHIPHYBE(商標)で希釈するべきであり、そしてスライドに適用する。スライド上のバーコードラベルの縁の直下までピペットチップを用いてガラススライドに触れることにより、全溶液をスライドに適用するべきである。次いでハイブリダイゼーション混合物を気泡を回避するように注意しながらスライド上にピペットで加える。これで自動化ハイブリダイゼーションプロトコールが完了する。
14.操作が完了した時、スライドを装置から慎重に取り出し、そしてスライドの裏側をKIMWIPES(商標)(キンバリークラーク(Kimberly−Clark)社)を使用して拭く。次いでスライドはバーコード側を下にして反応バッファー中のスライドホルダーに入れる。次いでスライドは2回変えた反応バッファー中に30回浸し、続いて水中に30回浸し(2つの別れた容器)、次いで窒素銃でアレイ表面の水を吹き飛ばすか、または1000rpmで5分間遠心することによるいずれかで直ちに乾燥させる。乾燥後、スライドは光を遮断した容器に走査するまで保存するべきである。
例として上げた実施例の結果を図2に示す。図では手動による技法に比べてDISCOVERY(商標)装置での自動化ハイブリダイゼーションの優れた感度を示す比較実験の結果を表す。データは8個のマイクロアレイで19種の遺伝子から作成した:4回は手動で作動させ、そして4回は自動化法を使用して行った。図2に示すように、本発明による自動化ハイブリダイゼーションは、試験した19種の遺伝子のほとんどについて手動プロトコールよりも有意に高いシグナル対バックグラウンド比を生じた。
Claims (38)
- 塩化ナトリウム;リン酸二ナトリウム;リン酸一ナトリウム;EDTA;第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;およびホルマリンを含んでなる水性組成物。
- 0.15〜1.5Mの塩化ナトリウム;8〜80mMのリン酸二ナトリウム;2〜20mMのリン酸一ナトリウム;1〜10mMのEDTA;0.0125〜0.125%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;0.00375〜0.0375%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および10〜40%のホルマリンを含んでなる請求項1に記載の組成物。
- 0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;0.0075%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および30%のホルマリンを含んでなる請求項2に記載の組成物。
- クエン酸ナトリウム;クエン酸;細胞コンディショニング用保存剤;および非イオン性界面活性剤を含んでなる水性組成物。
- 非イオン性界面活性剤が細胞コンディショニング用界面活性剤である請求項4に記載の組成物。
- 0.4〜8.2mMのクエン酸ナトリウム;1.8〜10mMのクエン酸;0.1〜1%の細胞コンディショニング用保存剤;および0.05〜5%の細胞コンディショニング用界面活性剤を含んでなる請求項5に記載の組成物。
- 8.2mMのクエン酸ナトリウム;1.8mMのクエン酸;0.05%の細胞コンディショニング用保存剤;および0.1%の細胞コンディショニング用界面活性剤を含んでなる請求項6に記載の組成物。
- 塩化ナトリウム;リン酸バッファー;EDTA;および1以上の非イオン性界面活性剤を含んでなる水性組成物。
- 非イオン性界面活性剤が第1の洗浄用界面活性剤および第2の洗浄用界面活性剤である請求項8に記載の組成物。
- 0.1〜0.5Mの塩化ナトリウム;5〜30mMのリン酸二ナトリウム;1〜10mMのリン酸一ナトリウム;0.5〜5mMのEDTA;0.01〜0.1%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0025〜0.025%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる請求項9に記載の組成物。
- 0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0075%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる請求項10に記載の組成物。
- 0.5〜2.5Mの塩化ナトリウム;25〜150mMのリン酸二ナトリウム;5〜50mMのリン酸一ナトリウム;2.5〜25mMのEDTA;0.05〜0.5%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0125〜0.125%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる請求項9に記載の組成物。
- 1.5Mの塩化ナトリウム;80mMのリン酸二ナトリウム;20mMのリン酸一ナトリウム;10mMのEDTA;0.125%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0375%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる請求項12に記載の組成物。
- 4X〜8XのSSPEおよび8〜12%のスプレッディングエンハンサー用界面活性剤を含んでなる水性組成物。
- 6XのSSPEおよび10%のスプレッディングエンハンサー用界面活性剤を含んでなる請求項14に記載の組成物。
- 任意の総塩濃度のリン酸バッファー;タンパク質様材料および非イオン性界面活性剤を含んでなる水性組成物。
- 10〜200mMの総塩濃度のリン酸バッファー;0.5〜6%のヤギガンマグロブリン;5〜15%の加水分解カゼイン;および0.005〜1%の非イオン性界面活性剤を含んでなる請求項16に記載の組成物。
- 75mMのリン酸カリウム;25mMのリン酸ナトリウム;55mMのNaCl;3%ヤギガンマグロブリン;13.4%の加水分解カゼイン;および0.05%のブロッキング用界面活性剤を含んでなる請求項17に記載の組成物。
- (a)0.15〜1.5Mの塩化ナトリウム;8〜80mMのリン酸二ナトリウム;2〜20mMのリン酸一ナトリウム;1〜10mMのEDTA;0.0125〜0.125%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;0.00375〜0.0375%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および10〜40%のホルマリンを含んでなる水性組成物;
(b)0.1〜1NのHClを含んでなる水性組成物;および
(c)1X〜5XのSSPE;10〜50%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;50〜80%ホルムアミド;および0.01〜1%のin situハイブリダイゼーション用界面活性剤を含んでなる水性組成物、
を含んでなる自動化in situハイブリダイゼーションに使用するための試薬キット。 - (a)0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;0.0075%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および30%のホルマリンを含んでなる水性組成物;
(b)0.3NのHClを含んでなる水性組成物;および
(c)2XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;80%ホルムアミド;および0.05%のin situハイブリダイゼーション用界面活性剤を含んでなる水性組成物、
を含んでなる請求項19に記載の試薬キット。 - (a)4X〜8XのSSPEおよび8〜12%のスプレッディングエンハンサー用界面活性剤を含んでなる水性組成物;
(b)10〜200mMの総塩濃度のリン酸バッファー;0.5〜6%のヤギガンマグロブリン;5〜15%の加水分解カゼイン;および0.005〜1%の非イオン性界面活性剤を含んでなる水性組成物;
(c)2X〜6XのSSPE;17.5〜22.5%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;および10〜50%ホルムアミドを含んでなる水性組成物;および
(d)0.1〜5%のマイクロアレイクリーニング用界面活性剤を含んでなる水性組成物、を含んでなる自動化マイクロアレイハイブリダイゼーションに使用するための試薬キット。 - (a)6XのSSPEおよび10%のスプレッディングエンハンサー用界面活性剤を含んでなる水性組成物;
(b)75mMのリン酸カリウム;25mMのリン酸ナトリウム;55mMのNaCl;3%のヤギガンマグロブリン;13.4%の加水分解カゼイン;および0.05%のブロッキング用界面活性剤を含んでなる水性組成物;
(c)6XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;および10%ホルムアミドを含んでなる水性組成物;および
(d)1%のマイクロアレイクリーニング用界面活性剤を含んでなる水性組成物、
を含んでなる請求項21に記載の試薬キット。 - (a)細胞または組織サンプルをプレハイブリダイゼーション溶液に暴露し;
(b)サンプルを細胞コンディショニング試薬に暴露し;
(c)サンプルをハイブリダイゼーション溶液中の核酸プローブに暴露し;
(d)サンプルを洗浄溶液に暴露し;
(e)サンプルをハイブリダイゼーション後の固定溶液に暴露し;そして
(f)サンプルをプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションについて分析する、
ことを含んでなり、ここで工程(a)〜(e)は自動化装置を使用して行う、自動化in situハイブリダイゼーションのための方法。 - プレハイブリダイゼーション溶液が0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および0.0075%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および30%ホルマリンを含んでなる請求項23に記載の方法。
- プレハイブリダイゼーション溶液が0.3NのHClを含んでなる請求項23に記載の方法。
- 細胞コンディショニング試薬が8.2mMのクエン酸ナトリウム;1.8mMのクエン酸;0.05%の細胞コンディショニング用保存剤;および0.1%の細胞コンディショニング用界面活性剤を含んでなる、請求項23に記載の方法。
- ハイブリダイゼーション溶液が2XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;80%のホルムアミド;および0.05%のin situハイブリダイゼーション用界面活性剤を含んでなる、請求項23に記載の方法。
- ハイブリダイゼーション溶液が6XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;および10%のホルムアミドを含んでなる、請求項23に記載の方法。
- 洗浄溶液が0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0075%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる、請求項23に記載の方法。
- (a)細胞または組織サンプルを、0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;0.0075%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および30%ホルマリンを含んでなる組成物に暴露し;
(b)サンプルを、0.3NのHClを含んでなる組成物に暴露し;
(c)サンプルを、8.2mMのクエン酸ナトリウム;1.8mMのクエン酸;0.05%の細胞コンディショニング用保存剤;および0.1%の細胞コンディショニング用界面活性剤を含んでなる組成物に暴露し;
(d)サンプルを、2XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;80%のホルムアミド;および0.05%のin situハイブリダイゼーション用界面活性剤を含んでなる組成物中の核酸プローブに暴露し;
(e)サンプルを、0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0075%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる組成物に暴露し;
(f)サンプルを、0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;0.0075%の第2の主要なプレハイブリダイゼーション用界面活性剤;および30%ホルマリンを含んでなる組成物に暴露し;そして
(g)サンプルをプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションについて分析する、
ことを含んでなり、ここで工程(a)〜(f)は自動化装置を使用して行う請求項23に記載の方法。 - (a)マイクロアレイをスプレッディングエンハンサー溶液に暴露し;
(b)マイクロアレイをブロッキング溶液に暴露し;
(c)マイクロアレイをハイブリダイゼーション溶液中の標的核酸に暴露し;
(d)マイクロアレイを洗浄溶液に暴露し;
(e)マイクロアレイをマイクロアレイクリーニング溶液に暴露し;そして
(f)マイクロアレイを、核酸プローブと核酸標的との間のハイブリダイゼーションについて分析する、
ことを含んでなり、ここで工程(a)、(b)、(d)および(e)は自動化装置を使用して行う自動化マイクロアレイハイブリダイゼーションの方法。 - スプレッディングエンハンサー溶液が6XのSSPEおよび10%スプレッディングエンハンサー用界面活性剤を含んでなる請求項31に記載の方法。
- ブロッキング溶液が75mMのリン酸カリウム;25mMのリン酸ナトリウム;55mMのNaCl;3%ヤギガンマグロブリン;13.4%加水分解カゼイン;および0.05%ブロッキング用界面活性剤を含んでなる請求項31に記載の方法。
- ハイブリダイゼーション溶液が6XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;および10%のホルムアミドを含んでなる請求項31に記載の方法。
- 洗浄溶液が0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0075%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる請求項31に記載の方法。
- マイクロアレイクリーニング溶液が0.1〜5%のマイクロアレイクリーニング用界面活性剤を含んでなる請求項31に記載の方法。
- マイクロアレイクリーニング溶液が1%のマイクロアレイクリーニング用界面活性剤を含んでなる請求項31に記載の方法。
- (a)マイクロアレイを、6XのSSPEおよび10%スプレッディングエンハンサー用界面活性剤を含んでなる組成物に暴露し;
(b)マイクロアレイを、75mMのリン酸カリウム;25mMのリン酸ナトリウム;55mMのNaCl;3%ヤギガンマグロブリン;13.4%加水分解カゼイン;および0.05%ブロッキング用界面活性剤を含んでなる組成物に暴露し;
(c)マイクロアレイを、6XのSSPE;20%の平均分子量10,000の硫酸デキストランナトリウム塩;および10%のホルムアミドを含んでなる組成物中の標的核酸に暴露し;
(d)マイクロアレイを、0.3Mの塩化ナトリウム;16mMのリン酸二ナトリウム;4mMのリン酸一ナトリウム;2mMのEDTA;0.025%の第1の洗浄用界面活性剤;および0.0075%の第2の洗浄用界面活性剤を含んでなる組成物に暴露し;
(e)マイクロアレイを、1%マイクロアレイクリーニング用界面活性剤を含んでなる組成物に暴露し;そして
(f)マイクロアレイを、核酸プローブと核酸標的との間のハイブリダイゼーションについて分析する、
ことを含んでなり、ここで工程(a)、(b)、(d)および(e)は自動化装置を使用して行う請求項31に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US28732501P | 2001-04-30 | 2001-04-30 | |
US28732401P | 2001-04-30 | 2001-04-30 | |
PCT/US2002/013698 WO2002088396A2 (en) | 2001-04-30 | 2002-04-30 | Reagents and methods for automated in situ or microarray hybridization |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005514582A true JP2005514582A (ja) | 2005-05-19 |
Family
ID=26964393
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2002585675A Pending JP2005514582A (ja) | 2001-04-30 | 2002-04-30 | 自動化ハイブリダイゼーション用の試薬および方法 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6933117B2 (ja) |
EP (1) | EP1385999B1 (ja) |
JP (1) | JP2005514582A (ja) |
AU (1) | AU2002305300B2 (ja) |
CA (1) | CA2445881C (ja) |
ES (1) | ES2400448T3 (ja) |
WO (1) | WO2002088396A2 (ja) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7569344B2 (en) * | 1998-10-26 | 2009-08-04 | Ventana Medical Systems, Inc. | Detection of human papilloma virus in papanicolaou (Pap) smears |
US20060275784A1 (en) * | 1999-10-26 | 2006-12-07 | Ventana Medical Systems, Inc. | Detection of Human Papilloma Virus in Papanicolaou (Pap) Smears |
US20040265870A1 (en) * | 2003-04-09 | 2004-12-30 | Invitrogen Corporation | Methods of synthesizing and labeling nucleic acid molecules |
JPWO2004104196A1 (ja) * | 2003-05-20 | 2006-07-20 | G&Gサイエンス株式会社 | 緩衝剤組成物 |
ATE485396T1 (de) * | 2003-08-11 | 2010-11-15 | Univ Georgia State Res Found | Rna-nachweis und quantifizierung |
US20050170401A1 (en) * | 2004-01-29 | 2005-08-04 | Canon Kabushiki Kaisha | Hybridization apparatus and method |
JP2007532918A (ja) * | 2004-04-16 | 2007-11-15 | チュー,ウェイシン | 組織標本からの生体分子抽出装置 |
US20060040377A1 (en) * | 2004-08-17 | 2006-02-23 | Biocept, Inc. | Protein microarrays |
US7258990B2 (en) * | 2004-08-19 | 2007-08-21 | Biocept, Inc. | Alleviation of non-specific binding in microarray assays |
US20070048747A1 (en) * | 2005-09-01 | 2007-03-01 | Leslie Thomas M | Methods for assaying analytes |
DK2442107T3 (da) | 2006-11-01 | 2014-05-19 | Ventana Med Syst Inc | Haptener, haptenkonjugater, sammensætninger deraf og fremgangsmåde til deres fremstilling og anvendelse |
CA2687178C (en) | 2007-05-23 | 2014-02-04 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymeric carriers for immunohistochemistry and in situ hybridization |
WO2009147537A2 (en) | 2008-05-27 | 2009-12-10 | Dako Denmark A/S | Compositions and methods for detection of chromosomal aberrations with novel hybridization buffers |
CA2720728C (en) | 2008-06-05 | 2018-04-03 | Ventana Medical Systems, Inc. | Compositions comprising nanomaterials and method for using such compositions for histochemical processes |
EP2401395A1 (en) | 2009-02-26 | 2012-01-04 | Dako Denmark A/S | Compositions and methods for rna hybridization applications |
PL2556171T3 (pl) | 2010-04-05 | 2016-04-29 | Prognosys Biosciences Inc | Oznaczenia biologiczne kodowane przestrzennie |
US20190300945A1 (en) | 2010-04-05 | 2019-10-03 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially Encoded Biological Assays |
US10787701B2 (en) | 2010-04-05 | 2020-09-29 | Prognosys Biosciences, Inc. | Spatially encoded biological assays |
GB201106254D0 (en) | 2011-04-13 | 2011-05-25 | Frisen Jonas | Method and product |
WO2013057310A2 (en) | 2011-10-21 | 2013-04-25 | Dako Denmark A/S | Hybridization compositions and methods |
EP3901280A1 (en) | 2012-10-17 | 2021-10-27 | Spatial Transcriptomics AB | Methods and product for optimising localised or spatial detection of gene expression in a tissue sample |
DK3013984T3 (da) | 2013-06-25 | 2023-06-06 | Prognosys Biosciences Inc | Metode til bestemmelse af spatiale mønstre i biologiske targets i en prøve |
ES2935860T3 (es) | 2015-04-10 | 2023-03-13 | Spatial Transcriptomics Ab | Análisis de ácidos nucleicos múltiplex, espacialmente distinguidos de especímenes biológicos |
DK3133166T4 (da) * | 2015-08-21 | 2023-03-20 | 42 Life Sciences Gmbh & Co Kg | Sammensætning og fremgangsmåde til hybridisering |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
US5002867A (en) | 1988-04-25 | 1991-03-26 | Macevicz Stephen C | Nucleic acid sequence determination by multiple mixed oligonucleotide probes |
US6054270A (en) | 1988-05-03 | 2000-04-25 | Oxford Gene Technology Limited | Analying polynucleotide sequences |
US5700637A (en) | 1988-05-03 | 1997-12-23 | Isis Innovation Limited | Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays |
US5225326A (en) * | 1988-08-31 | 1993-07-06 | Research Development Foundation | One step in situ hybridization assay |
US5143854A (en) | 1989-06-07 | 1992-09-01 | Affymax Technologies N.V. | Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof |
US5688290A (en) * | 1989-10-19 | 1997-11-18 | Genencor International, Inc. | Degradation resistant detergent compositions based on cellulase enzymes |
WO1992010092A1 (en) | 1990-12-06 | 1992-06-25 | Affymax Technologies N.V. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
DE69333650T2 (de) | 1992-02-19 | 2006-01-12 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Neue anordnungn von oligonukleotiden und ihr nutzen zum sortieren, isolieren, sequenzieren und manipulieren von nukleinsäuren |
EP0662153A1 (en) * | 1992-07-17 | 1995-07-12 | Aprogenex, Inc. | Free radical scavengers useful for reducing autofluorescence in fixed cells |
US5861242A (en) | 1993-06-25 | 1999-01-19 | Affymetrix, Inc. | Array of nucleic acid probes on biological chips for diagnosis of HIV and methods of using the same |
US6045996A (en) | 1993-10-26 | 2000-04-04 | Affymetrix, Inc. | Hybridization assays on oligonucleotide arrays |
US5487975A (en) * | 1993-11-15 | 1996-01-30 | Ventana Medical Systems, Inc. | Biotin/avidin formulation |
US6136607A (en) | 1995-11-02 | 2000-10-24 | Bayer Corporation | Multi-analyte reference solutions with stable pO2 in zero headspace containers |
ATE467690T1 (de) | 1997-08-01 | 2010-05-15 | Bio Rad Laboratories | Synthetisches antigen zum nachweis von hiv- immunreaktiven antikörpern |
WO1999023254A1 (en) | 1997-10-31 | 1999-05-14 | Affymetrix, Inc. | Expression profiles in adult and fetal organs |
AU763354B2 (en) | 1998-02-27 | 2003-07-17 | Ventana Medical Systems, Inc. | Automated molecular pathology apparatus having independent slide heaters |
US6004755A (en) | 1998-04-07 | 1999-12-21 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Quantitative microarray hybridizaton assays |
AU766614B2 (en) * | 1998-09-03 | 2003-10-23 | Ventana Medical Systems, Inc. | Removal of embedding media from biological samples and cell conditioning on automated staining instruments |
US6521237B2 (en) * | 1998-11-12 | 2003-02-18 | Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. | Skin care composition |
AU783246C (en) * | 1999-12-14 | 2007-03-15 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Stabilizing diluent for polypeptides and antigens |
US6656685B2 (en) * | 2001-01-29 | 2003-12-02 | Ventana Medical Systems, Inc. | Hybridization buffers using low molecular weight dextran sulfate and methods for their use |
-
2002
- 2002-04-30 ES ES02734110T patent/ES2400448T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 AU AU2002305300A patent/AU2002305300B2/en not_active Expired
- 2002-04-30 US US10/136,714 patent/US6933117B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 JP JP2002585675A patent/JP2005514582A/ja active Pending
- 2002-04-30 CA CA2445881A patent/CA2445881C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-30 WO PCT/US2002/013698 patent/WO2002088396A2/en active IP Right Grant
- 2002-04-30 EP EP02734110A patent/EP1385999B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002305300B2 (en) | 2006-06-01 |
CA2445881A1 (en) | 2002-11-07 |
US20030044823A1 (en) | 2003-03-06 |
WO2002088396A3 (en) | 2003-11-20 |
EP1385999A2 (en) | 2004-02-04 |
WO2002088396A2 (en) | 2002-11-07 |
ES2400448T3 (es) | 2013-04-10 |
CA2445881C (en) | 2010-06-22 |
EP1385999B1 (en) | 2012-12-12 |
US6933117B2 (en) | 2005-08-23 |
WO2002088396A9 (en) | 2003-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6933117B2 (en) | Reagents and methods for automated hybridization | |
AU2002305300A1 (en) | Reagents and methods for automated in situ or microarray hybridization | |
US6500620B2 (en) | Methods for amplifying and detecting multiple polynucleotides on a solid phase support | |
JP4718181B2 (ja) | マイクロアレイ上での逆転写 | |
US20020081597A1 (en) | Compositions and methods for detecting and quantifying gene expression | |
US6656685B2 (en) | Hybridization buffers using low molecular weight dextran sulfate and methods for their use | |
JP2001512697A (ja) | 疾患に関連する遺伝的変更の整列に基く検出 | |
US20240084395A1 (en) | Single-stranded oligonucleotide probes for chromosome or gene copy enumeration | |
JP2005521410A (ja) | 核酸分析試料の検出と定量化のための方法及び組成物 | |
AU2002240180A1 (en) | Hybridization buffers using low molecular weight dextran sulfate and methods for their use | |
JP6337470B2 (ja) | 核酸の検出方法および核酸検出キット | |
US20060199181A1 (en) | Compositions and methods for the treatment of immune related diseases | |
JP2003144172A (ja) | メチル化検出用オリゴヌクレオチド固定化基板 | |
JP2005503753A5 (ja) | ||
JP3713461B2 (ja) | 遺伝子発現を指標にしたエストロゲン活性抑制効果評価法 | |
Carr et al. | In situ hybridization | |
JP2002233364A (ja) | 被検物質の毒性判定方法 | |
WO2002015770A2 (en) | Methods of cancer prognosis and assessment | |
JP2003093100A (ja) | 細胞のカウンティングによる核酸の定量方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070417 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070717 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070724 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071017 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20080202 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090303 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090701 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090807 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20090818 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20091120 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110712 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110719 |