JP2005512542A - 化合物をスクリーニングする方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、新薬発見に対する新規標的盲検アプローチに関する。ゼブラフィッシュのような硬骨魚においてヒト表現型のモデルを作製して、化合物、例えば低分子を、その表現型を変化させる能力についてスクリーニングするという構想である。スクリーニングは、脊椎生物全身について行われ、そのアウトプットとして表現型を用いるために、まず標的遺伝子を同定する必要性がなくなる。たとえ標的が未だ特徴づけられていない場合であっても、観察する表現型に関連する任意の標的に影響を及ぼす薬物を理論的に一回のスクリーニングで検出できるので、このアプローチは強力である。

Description

発明の背景
新薬の発見に対する従来のアプローチは、疾患に関係する標的遺伝子を同定して、標的の機能の変化に関して低分子をスクリーニングするためのインビトロアッセイをデザインすることである。従来のアプローチは、コストが高いことのみならず、利用できる動物モデルによる無効果、および標的遺伝子の同定に関係して時間がかかるという欠点を有するのみならず、ほとんどの製薬産業アッセイ系において用いられるタンパク質の形状（タンパク質は典型的に、単純な水溶液中、結晶型であり、固定床に結合しているか、またはトランスフェクトされた細胞において過剰発現される）が、インビボ状態とは根本的に異なるという事実から見ても欠点を有する。Horrobin, D.F.、「Realism in drug discovery−could Cassandra be right?」、Nature Biotech. 19、1099〜1100（2001）。このように、費用がより安価でより効率がよく、標的がその本来の形状で認められるシステムが望ましい。
マウスおよびショウジョウバエはいずれも、癌などの疾患の表現型を含むヒト表現型の発生においてどの遺伝子が重要であるかを決定するための強力なモデルであることが証明されている。マウスは、対象となる遺伝子が過剰発現または欠失され、その後に表現型分析を行う逆遺伝学にとって特に有用である。例えば、多くの腫瘍抑制遺伝子および腫瘍遺伝子がこれらのアプローチによって研究されており、これらのマウスにおいて発生する癌は組織学的にヒト新生物に類似している。McClatchey, A. and T. Jacks、「Tumor suppressor mutations in mice：the next generation.」、Curr. Opin. Genet. Develp. 8、304〜310（1998）；Eva, A.、「Use of transgenic mice in the study of proto-oncogene functions」、Semin. Cell Bio. 3、137〜145（1992）。しかし、マウスにおける劣性変異に関するフォワード遺伝子スクリーニングは、高い費用と膨大な空間が必要であるため、困難である。さらに、胚全体に基づく低分子スクリーニングは現実的ではない。
ショウジョウバエは、フォワード遺伝子スクリーニングにとって強力な生物である。例えば、様々な遺伝子スクリーニングによって、変異すると過形成または新生物増殖を引き起こす50個を超える遺伝子が同定されている。Watson, K.L., R.W. Justice, and P.J. Bryant、「Drosophila in cancer research：the first fifty tumor suppressor genes」、Cell Sci. Suppl. 18、19〜33（1994）。これらの遺伝子のいくつかは、哺乳類の新生物に関連することが証明された。例えば、大腫瘍抑制（LATS）遺伝子をマウスにおいて欠失させると、軟組織肉腫および卵巣腫瘍が起こる。Mechler, B.M., W. McGinnis, and W.J. Gehring、「Molecular cloning of lethal(2)giant larvae, a recessive oncogene of Drosophila melanogaster」、EMBO J. 4、1551〜1557（1985）；St. John, M.A., W. Tao, X. Fei, R. Fukumoto, M.L. Carcangiu, D.G. Brownstein, A.F. Parlow, J. McGrath, and T. Xu、「Mice deficient of Lats1 develop soft-tissue sarcomas, ovarian tumours and pituitary dysfunction.」、Nat. Genet. 21、182〜186（1999）。しかし、ショウジョウバエにおいて認められる新生物は、哺乳類の新生物に組織学的に類似せず、悪性の挙動（すなわち、転移）も示さない。さらに、マウスの場合と同様に、ショウジョウバエは、生物全身に基づく低分子アプローチと容易に適合しない。
したがって、新薬発見に対する従来のアプローチに関連した無効性と費用のために、そしてインビトロでのタンパク質の取り扱いに関連する難しさのために、改善された薬物発見法がなおも必要である。
発明の概要
本発明は、新薬発見に対する新規標的盲検アプローチに関する。ゼブラフィッシュのような硬骨魚においてヒト表現型、例えば疾患表現型のモデルを作製して、化合物、例えば低分子を、その表現型を変化させる能力についてスクリーニングするという構想である。スクリーニングは、脊椎生物の全身について行われ、そのアウトプットとして表現型を用いることから、最初に標的遺伝子を同定する必要性がなくなる。たとえそれらの標的が未だ特徴付けられていない場合であっても、観察する疾患表現型に関連する任意の標的に影響を及ぼす薬物を理論的に一回のスクリーニングで検出できるので、このアプローチは強力である。
一つの局面において、本発明は、ヒト表現型に類似する表現型を化合物が変化させることができるか否かに関して試験化合物をスクリーニングする方法に向けられる。方法は、（a）表現型を遺伝した少なくとも一匹の硬骨魚を試験化合物に接触させる段階、および（b）表現型が変化した、段階（a）からの硬骨魚を検出する段階。「変化」という用語は、硬骨魚の遺伝した表現型の変化を指すことを意図する。化学化合物は、統計学的に予想される表現型遺伝パターンが、試験化合物の存在下で、予想される変異体より少ない方向に向かう場合、表現型を変化させると見なされる。例えば、致死的な劣性表現型を有するヘテロ接合ゼブラフィッシュを互いに接合させることによって産生される胚において変化を検出することができる。その後、下記の実施例において詳細に説明するように、得られた胚を試験化合物に接触させて、例えば光学顕微鏡下でP-H3染色の増加または減少に関して肉眼的に調べる。試験化合物に接触させた約75％、最も好ましくは約95％を超える胚が、野生型表現型パターン、例えば野生型P-H3染色パターンを示す場合、化学化合物は表現型を変化させると見なされる。
観察される「観察可能な」表現型は、用いる硬骨魚モデルに依存し、硬骨魚について観察可能な任意の物理的または生化学的特徴が含まれる。表現型は、例えば、臓器の発達、タンパク質のリン酸化状態、分裂紡錘体形成、タンパク質発現、細胞形態、または疾患全般に関連しうる。表現型は例えば、形態の変化、遺伝子発現の変化、腫瘍形成感受性の変化でありうる。全般的に、表現型の変化は、免疫組織化学染色およびRNA定量を行うまたは行わない、顕微鏡を含む様々な適した手段を用いて観察することができる。
例えば、癌のモデルにおいて、変化対野生型、すなわち細胞周期タンパク質の変化または細胞周期タンパク質のリン酸化状態を調べることができるであろう。本発明の方法の好ましい態様において、表現型は、リン酸化または脱リン酸化細胞周期タンパク質を特徴とする。
一つの態様において、表現型は疾患表現型である。本発明の方法によって企図される疾患の表現型は、とりわけ癌、血液疾患、免疫疾患、血管新生、骨疾患、心血管疾患、肥満、糖尿病、または神経変性疾患に関連する。
本明細書において用いられるように、「硬骨魚」という用語は、硬骨の骨格および放射状のひれを有する多数の魚からなる群である、真骨下綱または真口亜綱を意味するまたはそれらに属することを意味する。硬骨魚には、例えば、ゼブラフィッシュ、メダカ、ジャイアント・レリオ（Giant rerio）、およびフグ類が含まれる。本発明の一つの態様において、硬骨魚はゼブラフィッシュである。硬骨魚は、胚、幼生、または成体でありうる。特定の好ましい態様において、硬骨魚はゼブラフィッシュの胚である。
本発明の一つの態様において、硬骨魚は、マイクロタイターウェル中の水性培地に含まれうる。
本発明のもう一つの態様において、試験化合物は、硬骨魚を含む培地に試験化合物を溶解することによって硬骨魚に投与される。
本明細書において用いられる「試験化合物」という用語は、例えば、水性混合物において混合または溶解することができる、薬剤、治療物質、薬理物質、環境もしくは農業汚染物質もしくは化合物、水生汚染物質、化粧品、薬物、毒素、天然物、合成化合物、もしくは化学化合物、またはその混合物を含むがこれらに限定されない任意の要素、化合物、または実体を含む。試験化合物にはさらに、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖質、脂質、または糖脂質、およびその混合物が含まれうる。硬骨魚の表現型、例えば疾患表現型を変化させることが示された試験化合物はさらに、他の動物の疾患モデルにおいて調べることができる。
本発明の方法において、試験化合物は、注射することによって、または担体と共に投与することによって硬骨魚に投与される。担体は、溶媒、脂質、またはペプチドでありうる。
本発明の方法において、一つより多い試験化合物を、同時または連続的にスクリーニングすることができる。
本方法は、（a）表現型を有する硬骨魚を様々な濃度の試験化合物に接触させる段階、および（b）段階（a）の硬骨魚において表現型が変化するか否かを検出または観察する段階を含み、段階（b）において変化が検出されれば試験化合物が有効であることが示される。
さらにもう一つの局面において、本発明は、試験化合物が細胞周期関連表現型を変化させることができるか否かに関して、試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。方法は、少なくとも一匹の野生型硬骨魚を試験化合物に接触させる段階、および表現型が変化した硬骨魚を検出する段階を含む。好ましい表現型は、細胞周期関連タンパク質発現または細胞周期関連タンパク質のリン酸化状態である。細胞周期関連タンパク質の例には、ヒストンH3、MAPキナーゼ、MEK-1、BM28、サイクリンE、p53、Rb、およびPCNAが含まれるがこれらに限定されない。
本発明にはまた、先に概説したスクリーニング法によって得られた化合物も含まれる。
本発明にはさらに、先に概説したスクリーニング法によって得られた化合物を被験体に投与することを含む、細胞周期障害表現型を有する、ヒトなどのそれを必要とする被験体を治療する方法が含まれる。検出可能な細胞周期障害表現型には癌が含まれるが、これらに限定されない。
特に明記していない限り、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書の記載と類似または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料を下記に記述する。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照として本明細書に組み入れられる。さらに、材料、方法、および例は、説明するためのものであって、制限することを意図しない。矛盾する場合は、定義を含めて本発明が優先する。
本明細書に組み入れられ、本明細書の一部である添付の図面は、本発明の態様を図示し、詳説すると共に、本発明の目的、長所、および原理を説明するために役立つ。
詳細な説明
本発明は、ヒト表現型がゼブラフィッシュのような硬骨魚においてモデル化され、化合物、例えば低分子が表現型を変化させるか否かに関してスクリーニングする、新薬発見に対する新規標的盲検アプローチを提供する。
一つの局面において、本発明は、化合物が硬骨魚の表現型を変化させるか否かに関して、試験化合物をスクリーニングする方法に向けられる。好ましい態様において、表現型は疾患表現型である。方法は、（a）観察可能な表現型を有する少なくとも一匹の硬骨魚を試験化合物に接触させる段階、および（b）表現型の変化により、該表現型を変化させることができる化合物が示される、段階（a）の硬骨魚を検出する段階を含む。
本発明の方法は、全般的に硬骨魚に用いるために適用可能である。適した硬骨魚には、例えばゼブラフィッシュ（Danio rerio）、メダカ、ジャイアント・レリオ、およびフグ類が含まれる。ゼブラフィッシュが好ましい。用いるモデルに応じて、ゼブラフィッシュは胚、幼生、または成体でありうる。最も好ましくは、特定の態様に関して、ゼブラフィッシュの胚が用いられる。
本発明の方法によって企図される疾患の表現型は、中でも、癌、血液疾患、免疫疾患、血管新生、骨疾患、心血管疾患、肥満、糖尿病、または神経変性疾患に関連する。
癌：ゼブラフィッシュの細胞周期変異体をスクリーニングするため、および同定された変異体の特徴を調べるために、多くのマーカーを用いることができ、ゼブラフィッシュの胚全体における増殖細胞を染色できるか否かに関して、様々な細胞周期マーカーを調べることができる。リン酸化ヒストンH3、リン酸化MAPキナーゼ、リン酸化MEK-1、BM28、サイクリンE、p53、Rb、およびPCNAを含む哺乳類の細胞周期タンパク質に結合するいくつかの抗体を、発生の12〜48時間でゼブラフィッシュ胚全体について用いることができる。
例えば、ヒストンH3の10位のリン酸化セリンに対するポリクローナル抗体は、発生における適当な時期で特定の胚分裂ドメインにおける細胞を染色した。例えば、眼および発達途中の神経系が分裂的に活性であることが知られている時期である受精後24〜36時間（hours post-fertilization, hpf）では、これらの組織に高いpH3染色が見られる。眼において、pH3陽性細胞を有する領域は、細胞死が起こっているドメインとは異なる。ホスホ-H3染色は、合理的なことに、電離放射線の結果として細胞周期を出た細胞には存在しない。放射線を照射した胚におけるpH3染色細胞の数は、放射線照射後30分で最低に達し、約2時間までに徐々に正常な染色に回復した。
このように、好ましい態様において、抗pH3抗体は、本発明の方法を用いるゼブラフィッシュにおける細胞周期マーカーとして用いられる。胚の細胞周期障害は、原発性（例えば、CDKにおける変異）、または二次的（例えば、チェックポイント活性化を引き起こすDNA修復または複製に関与する遺伝子の変異）でありうる。理論に拘束する意図はないが、本発明者らは、胚の細胞周期障害は成体における癌発生率の増加に相関すると考えている。例えば、pH3染色の変化に関する予備的な半数体エチルニトロソウレア（ENU）変異誘発スクリーニングが行われている。ENU変異誘発雄性魚（WIK系統）を野生型WIK雌性魚と交配させた。F1子孫を成体まで生育させて、F1雌性魚を圧搾してその卵を採取した。次に、これらの1腹卵を、UV照射した精子と受精させて、半数体の胚を作製した。発生36時間で、1腹卵をパラホルムアルデヒド（PFA）において固定して、pH3抗体によって免疫染色した。1腹卵は半数体であるために、如何なる所定の変異も胚の半数に影響を及ぼすはずである。スクリーニングしたF1雌性魚750匹中、41匹からの1腹卵が、1腹卵の50％にpH3染色の変化を示した。これらの21個は、pH3陽性細胞数が増加して、11個は、pH3陽性細胞数が減少し、そして9個は、より大きい核の出現（pH3によって染色される）のような他の表現型を示した。対象となる推定の変異を有するF1雌性魚41匹を野生型WIK雄性魚と交配させて、F2子孫を成体まで生育させ、ヘテロ接合対を再度同定した。F2世代の半数が変異に関してヘテロ接合であるはずであり、このように、それぞれの推定の変異体に関して、多数（少なくとも20個）のランダムF2同胞種近交系間交配を行った。F3胚を36時間でpH3染色して、変異が二倍体の魚において回復しているか否かを決定した。F1雌性魚41匹から変異体7匹を回収した。
癌に関連した表現型には、例えば、野生型すなわち正常な魚と比較して、細胞周期タンパク質の遺伝子発現の変化、または細胞周期タンパク質のリン酸化状態の変化が含まれる。そのようなモデルの例を下記の実施例において考察する。それらおよび他のモデルを作製する方法は、その内容が参照として本明細書に組み入れられる、2001年1月10日に提出された米国特許出願第09/758,007号に開示されている。
血液疾患：血球の発達に影響を及ぼすことが特定されたゼブラフィッシュの変異は50個を超える。Ransom, D.G.ら、「Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.」、Development 123：311〜319（1996）；Weinstein, B.M.ら、「Hematopoietic mutations in the zebrafish.」、Development 123：303〜309（1996）。これらの変異は、幹細胞変異体、血球分化／増殖変異体、低色素性変異体、および光感受性変異体に分類することができる。幹細胞および血球分化／増殖変異体は、様々な型のヒト貧血の優れたモデル系である。Brownlie, A., A. Donovan, S.J. Pratt, B.H. Paw, A.C. Oates, C. Brugnara, H.E. Witkowska, S. Sassa, and L.I. Zon、「Positional cloning of the zebrafish sauternes gene：a model for congenital sideroblastic anemia.」、Nat. Genet. 20：244〜250（1998）。低色素性変異体は、ヒト異常ヘモグロビン症、およびヘモクロマトーシスのような鉄輸送欠損のモデルである。Donovan, A.ら、「Positional cloning of zebrafish Ferroportin 1 identifies a conserved vertebrate iron exporter.」、Nature 403：776〜781（2000）。光感受性変異体は、ヒトポルフィリン症のモデルである。Ransom, D.G.ら、「Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis.」、Development 123：311〜319（1996）。血球表現型は、解剖顕微鏡を用いて発生1〜5日のあいだに胚の肉眼的観察によって容易に評価される。同上を参照されたい。例えば、O-ジアニソジン染色をヘム存在のマーカーとして用いることができる。同上を参照されたい。ポルフィリン症の表現型は、解剖顕微鏡を用いて紫外線下、赤血球の自己蛍光を探すことによって認めることができる。同上を参照されたい。最後に、例えば、インサイチューハイブリダイゼーションを用いて、GATA-1、GATA-2、およびヘモグロビンのような血液遺伝子のRNA発現を追跡することができる。同上を参照されたい。RNA量はまた、多数の異なるRT-PCRに基づくRNA定量法を用いて観察することができる。これらの方法は当業者に一般的であり、転写物の検出および定量のための方法が含まれ、ノザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）に基づく方法が含まれる。本発明に従って有用な定量的RT-PCRに基づく方法には、PCRおよび相補的DNA（cDNA）アレイを用いるRNA定量（Shalonら、Genome Research 6(7)：639〜45、1996；Bernardら、Nucleic Acids Research 24(8)：1435〜42、1996）、プライマーの伸長反応に基づく固相ミニシークエンシン技術（米国特許第6,013,431号、Suomalainenら、Mol. Biotechnol. 6月；15(2)：123〜31、2000）、イオン対高速液体クロマトグラフィー（Dorisら、J. Chromatogr. A、5月 8：806(1)：47〜60、1998）、および5'ヌクレアーゼアッセイまたはリアルタイムRT-PCR（Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：7276〜7280、1991）が含まれるがこれらに限定されない。
上記の血液障害の薬物候補物質は、本発明の方法および適当な表現型のマーカーを用いて同定することができる（幹細胞欠損および貧血に関する血球の肉眼的観察、低色素症に関するo-ジアニソジン、ならびにポルフィリン症に関する自己蛍光の肉眼的観察）。
免疫障害：Tリンパ球マーカーである胚Rag-1発現の変化をスクリーニングすることによって、ゼブラフィッシュT細胞変異体を同定するために遺伝子スクリーニングが行われている。Trede, N.S., Zon, L.I.、「Development of T-cells during fish embryogenesis.」、Dev. Comp. Immunol. 253〜263（1998）；Trede, N.S., A. Zapata, and L.I. Zon、「Fishing for lymphoid genes.」、Trends Immunol. 22：302〜307（2001）。T細胞発達の欠損を有する変異体は、ヒト免疫不全症のモデルとなる可能性がある。本明細書に記述の方法は、例えば、T細胞変異体における胸腺のRag-1発現を改善する化合物をスクリーニングするために用いることができる。Rag-1発現の変化を検出する一つの方法は、Rag-1プローブによるインサイチューハイブリダイゼーションを用いることである。
ゼブラフィッシュにおける現行の遺伝子スクリーニングは、骨髄形成の欠損を有する変異体を同定することを目的としている。Bennett, C.M.ら、「Myelopoiesis in the zebrafish, Danio rerio」、Blood 98：643〜51（2001）。そのような骨髄形成変異体は、ヒト顆粒球障害のモデルとして用いることができる。本発明の化学抑制物質のスクリーニングは、そのような障害に関するリード化合物を同定するために有用である。従って、一つの態様において、本発明は、試験化合物の存在下で、ミエロペルオキシダーゼまたはPu.1のような骨髄マーカーの発現の改善／増加を検出する方法を提供する。
心血管疾患：心血管型および機能の欠損を有する多数のゼブラフィッシュ変異体が記述されている。Stanier, D.Y.R.ら、「Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.」、Development 123：285〜292（1996）；Chen, J.N.、「Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish」、Development 123：293〜302（1996）。心血管機能および形態は、発生の最初の5日以内に解剖顕微鏡を用いて肉眼的に評価することができる。本発明の方法を用いて、試験化合物は、これらの変異体における心機能（例えば、心拍数または壁の運動）または形態のいずれかの改善能に関してスクリーニングすることができる。本発明の方法を用いて同定された心機能または形態のいずれかの改善能を有する化合物または化学物質は、成人における心不全の治療、心発達欠損を有する子供の心機能の強化、および遺伝的素因に基づく高リスク胎児における心発達欠損の予防にとって有望である。
血管新生：クローシュ様表現型のような血管形成の欠損を有するゼブラフィッシュ変異体はさらに、血管新生を刺激する化学物質または化合物を同定するために、本発明のゼブラフィッシュ化学抑制物質スクリーニングにおいて用いることができる。Stanier, D.Y.R.ら、「Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo.」、Development 123：285〜292（1996）。血管新生は、単純に透明な胚を通して観察することができ、または血管マーカー、例えばflk-1プローブとのインサイチューハイブリダイゼーションによって検出することができる。本発明の方法において血管新生を刺激する化学物質または化合物は、例えば、ヒト虚血障害に関する治療の開発において有用である可能性がある。例は、心筋血管発達の刺激によって、残っている心筋の健康が改善される可能性がある心筋梗塞の例であろう。Chiu, R.C.、「Therapeutic cardiac angiogenesis and myogenesis：the promises and challenges on a new frontier.」、J. Thorac Cardiovasc Surg 122：963〜971（2001）。
神経変性疾患：神経生存欠損を示す多数のゼブラフィッシュ変異体が存在する。本発明の方法において、これらの変異体は、ヒトにおける神経変性障害のモデルとして用いることができる。例えば、DNA断片化を同定するためにアクリジンオレンジ染色またはTUNEL染色を用いて神経細胞アポトーシスの化学物質抑制剤をスクリーニングすることができるであろう。Abdelilah, S.ら、「Mutations affecting neural survival in the zebrafish, Danio rerio.」、Development 123：217〜227（1996）；Furutani-Seiki, M.、「Neural degeneration mutants in the zebrafish, Danio rerio.」、Development 123：229〜239（1996）。
骨疾患：現行のゼブラフィッシュ遺伝子スクリーニングは、ヒト疾患のモデルである骨発達変異体を発見しようとしている。ジョンホプキンス大学のShannon Fisher研究室は、骨形成不全症のゼブラフィッシュモデルを発見した。レントゲン写真を用いる魚のスクリーニングは、異常な骨密度を有する魚を同定するために役立つ。骨密度が変化した魚は、骨形成不全症のような遺伝子障害のみならず、骨粗鬆症および骨化石症のような成人疾患のモデルとなりうるであろう。化学抑制物質のスクリーニングは、若い魚についてレントゲン写真を撮影して、化学物質を処置した魚における骨密度の改善を調べることことによって行うことができる。
糖尿病：いくつかのゼブラフィッシュ変異体は膵島発達の欠損を有する。例えば、浮動児頭様（floating head）変異体は、ごく小さい内分泌膵臓残遺物を発達するに過ぎない。そのような魚はヒト糖尿病のモデルとなる可能性があり、したがって本発明の方法において有用な魚である。本発明に記述する方法を用いて、例えば浮動児頭様変異体において内分泌膵臓の発達を改善させる化学試験化合物を探すことによって薬物スクリーニングを行うことができる。検出方法として、内分泌膵臓マーカー、例えばインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、islet-1を用いたインサイチューハイブリダイゼーションを使用することができるであろう。
肥満：ゼブラフィッシュのような硬骨魚における過食は、一つの色の餌を与えた後、直ちに異なる色の餌を再度与えることによって検出することができる。Liedtke, W.ら、「Large-scale screening for alterations in zebrafish thermoregulation and food intake behavior.」、「Zebrafish Development and Genetics」、2000年4月26〜30日のニューヨーク、コールドスプリングハーバーでの会議抄録、168頁。色は、ゼブラフィッシュの透明な胃を通して観察することができる。過食挙動を有する変異体の魚は、野生型が停止しても食べ続けるであろう。本発明のスクリーニングにより、過食挙動を改善する化合物が探索されると考えられる。
本発明の方法において、多様な起源からの多様な試験化合物を、疾患に関連する表現型を化合物が変化することができるか否かに関して、または疾患の治療において有用であると考えられる化合物の有効性を試験するためにスクリーニングすることができる。スクリーニングすべき化合物は、天然に存在する、または合成分子でありうる。スクリーニングすべき化合物はまた、海洋微生物、藻類、植物、および菌類のような天然資源から得ることができる。試験化合物はまた、無機質または小物質（oligo agent）でありうる。または、試験化合物は、ペプチドもしくは低分子を含む作用物質のコンビナトリアルライブラリーから、または産業、例えば化学、製薬、環境、農業、海洋、化粧品、医薬品、および生物工学産業において合成された化学化合物の既存のレパートリーから得ることができる。試験化合物には、例えば、薬剤、治療物質、農業または工業物質、環境汚染物質、化粧品、薬物、有機および無機化合物、脂質、グルココルチコイド、抗生物質、ペプチド、タンパク質、糖、糖質、キメラ分子、ならびにその組み合わせが含まれうる。
段階的に合成することができる多くのタイプの化合物に関してコンビナトリアルライブラリーを作製することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、タンパク質、核酸、βターン模倣体、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーN-置換グリシン、およびオリゴカルバメートが含まれる。本発明の方法において、好ましい試験化合物は、低分子、核酸および改変核酸、ペプチド、ペプチド模倣体、タンパク質、糖タンパク質、糖質、脂質、または糖脂質である。好ましくは、核酸はDNAまたはRNAである。
化合物の大規模なコンビナトリアルライブラリーは、Affymaxの国際公開公報第95/12608号、Affymaxの国際公開公報第93/06121号、コロンビア大学の国際公開公報第94/08051号、薬局方、国際公開公報第95/35503号、およびスクリプスの国際公開公報第95/30642号（そのそれぞれが全ての目的に関して全文が参照として本明細書に組み入れられる）に記述されるコードされた合成ライブラリー（encoded synthetic library, ESL）法によって構築することができる。ペプチドライブラリーはまた、ファージディスプレイ法によって作製することができる。例えば、Devlin、国際公開公報第91/18980号を参照されたい。スクリーニングすべき化合物も同様に、例えばケンブリッジ社（ChemBridge Corporation、サンディエゴ、カリフォルニア州）のDIVERSet Eライブラリー（化合物16,320個）、国立癌研究所（NCI、ベセスダ、メリーランド州）の天然物貯蔵所（Natural Product Repository）、NCIの公開合成化合物コレクション（Open Synthetic Compound Collection、ベセスダ、メリーランド州）、NCIの発達治療プログラム（Developmental Therapeutics Program）等の政府または私的な起源から得ることができる。
本発明の方法において、疾患に関連する表現型を化合物が変化させることができるか否かに関して、または疾患を治療するために有用であると考えられる化合物の有効性を調べるためにスクリーニングされる化合物は、生きた硬骨魚を含む培地に試験化合物を直接加えることによって硬骨魚に投与することができる。または、試験化合物を最初に培地に溶解して、生きた硬骨魚をその後培地に加えることができる。そのようなアプローチは、魚の胚に麻酔薬および他の化学物質を導入するために用いられている。例えば、全ての目的に関してその全文が参照として本明細書に組み入れられる、M. Westerfield、「THE ZEBRAFISH BOOK：A GUIDE FOR THE LABORATORY USE OF ZEBRAFISH」、（第3版、1995）を参照されたい。試験化合物はまた、生きた硬骨魚に物質を直接注入するマイクロインジェクション技術によって硬骨魚に投与することもできる。例えば、試験化合物は、硬骨魚の胚の卵黄もしくは実質のいずれかまたは双方に注入することができる。
試験化合物はまた、電気穿孔、リポフェクション、もしくは摂取によって、または、生体分子をコーティングした粒子が、高圧銃を用いて細胞または対象となる組織に「バイオリスティック」に撃ち込まれるバイオリスティック細胞ローディング技術を用いて硬骨魚に投与することができる。そのような技術は当業者に周知である。例えば、Sambrookら、上記；Chowら、Amer. J. Pathol. 2(6)：1667〜1679（1998）を参照されたい。
試験化合物は、単独で、または多様な溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド等）もしくは担体（例えば、ペプチド、脂質、もしくは溶媒担体を含む）と共に、または他の化合物と共に投与することができる。試験化合物は、特定の活性（例えば、細胞死活性、血管新生活性、毒性活性）を示す動物において反応を検出するために用いられる色素の投与前、投与と同時、または投与後に硬骨魚に投与することができる。
多様な技術を用いて、表現型の変化を検出することができる。そのような技術には、例えば、インサイチューハイブリダイゼーション、特定のタンパク質の抗体染色（例えば、P-H3染色）、シグナル伝達タンパク質を標識する抗体マーカー含まれる。表現型の変化はまた、例えば肉眼による検分、比色法、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、化学発光、デジタル画像分析、標準的なマイクロプレートリーダー技術、時間分解蛍光光度法、肉眼的観察、CCDカメラ、ビデオカメラ、写真フィルム、もしくはレーザー走査装置、蛍光光度計、光ダイオード、量子カウンター、プレートリーダー、エピ蛍光顕微鏡、走査型顕微鏡、共焦点顕微鏡、フローサイトメーター、毛細管電気泳動検出器のような現行の機器の使用を含む蛍光光度法、または光電子増倍管のようなシグナルを増幅する手段等によって検出することができる。反応は、パターン認識ソフトウェアを用いることによって識別および／または分析することができる。化合物は、それらが産生する活性および反応に従うスクリーニング法を用いて同定および選択される。
自動化法は、市販の自動計測およびソフトウェア、ならびに既知の自動観察および検出技法を用いることによって容易に行うことができる。ハイスループットの自動化合物スクリーニングに関しては、マルチウェルフォーマットが特に魅力的である。スクリーニング法は、例えば、マイクロプレートのそれぞれのウェルにゼブラフィッシュの胚を少なくとも一個入れて、標準的なマイクロプレートウェルのフォーマットを用いて行うことができる。このフォーマットによって、標準的なマイクロプレート技法およびマイクロプレートリーダーを用いてスクリーニングアッセイを自動化することができ、ウェルにおいてゼブラフィッシュの胚の表現型の変化を検出することができる。マイクロプレートリーダーには、マイクロプレート（例えば、96ウェルプレート）からの色、蛍光、発光、放射活性、または物体の形状のようなシグナルを読み取ることができる任意の装置が含まれる。検出法には、エンドポイントまたは動態アッセイのいずれかとしての蛍光光度法（標準的または時間分解）、発光測定法、または光測定法が含まれる。そのような技術を用いて、多数の硬骨魚（例えば、硬骨魚の胚）に及ぼす特定の物質の作用を迅速に確認することができる。さらに、そのような配置によって、広範囲の化合物を、ウェルに含まれる硬骨魚の細胞に対するそのそれぞれの作用に関して迅速かつ効率よくスクリーニングすることができる。
試料の取り扱いおよび検出技法は、色素および物質の迅速な再現性のよい応用、液体の交換、および標的化合物の自動化スクリーニングのために市販の計測およびソフトウェアシステムを用いて自動化することができる。化合物投与の処理量を増加させるために、現在利用可能なロボットシステムを用いることができる。そのようなシステムには、例えば、キアゲンインク（Qiagen Inc.、バレンシア、カリフォルニア州）のBioRobot 9600、ザイマーク社（Zymark Corporation、ホプキントン、マサチューセッツ州）のZYMATE（登録商標）、およびベックマンインストルメンツインク（Beckman Instruments, Inc.、フュラートン、カリフォルニア州）のBIOMEK（登録商標）が含まれる。ロボットシステムの多くは、マルチウェル培養プレートフォーマットを用いる。自動システムは、既定の時点で行わなければならない液体交換を多数含む処理技法において有用である。
さらにもう一つの局面において、本発明は、上記のように試験化合物の有効性をスクリーニングして調べる方法によって得られる化合物を提供する。有用な化合物には、図11A〜11Cに記述の化合物が含まれるが、これらに限定されない。図11Aは、「8G16」（I群）が正常な胚に影響を及ぼすことなく24時間の発生のあいだに潰れた火傷様（crash and burn）細胞周期表現型を防止することを示す。この化合物、アダマンタン-1-カルボン酸(3-ヒドロキシ-ピリジン-2-イル)-アミドは、癌化学療法および／または化学的予防のための候補物質である。図11Bは、以下を含むII群の化合物8個（2〜9）を示す：
（2）4-(4-アリルオキシ-3,5-ジブロモ-ベンゼンスルホニル)-2,6-ジブロモ-フェノール
（3）4-ヒドロキシ-3-[3-(4-ヒドロキシ-フェニル)-アクリロイル]-6-メチル-ピラン-2-オン
（4）2-ベンゾイル-3a,7a-ジヒドロ-インデン-1,3-ジオン
（5）トルエン-4-スルホン酸2,4-ジニトロ-フェニルエステル
（6）3,5-ジヨード-N-[2-クロロ-5-(4-クロロ-ベンゼンスルホニル)-フェニル]-2-ヒドロキシ-ベンズアミド
（7）1-(2-アミノ-4-ニトロ-フェニルアミノ)-3-フェニル-ウレア
（8）1-(3,4-ジクロロ-フェニル)-2-(2-イミノ-2H-ピリジン-1-イル)-エタノン
（9）2-(2-o-トリルオキシ-アセチルアミノ)-安息香酸、
これらは潰れた火傷様の胚においてP-H3染色を減少させ、野生型胚の染色も同様に減少させる。したがって、それらはヒストンH3がリン酸化されないG1、Sまたは初期G2において細胞周期を停止させている可能性がある。この活性は、図4におけるアフィジコリンの活性と類似である。これらの化合物は、癌化学療法の候補物質である。図11Cは、III群の化合物を示す。これらの化合物6個（10〜15）は、野生型の胚においてP-H3染色を増加させ、以下が含まれる：
（10）N-(2-クロロ-フェニル)-スクシナム酸メチルエステル
（11）4-(2-クロロ-5-トリフルオロメチル-フェニルカルバモイル)-酪酸
（12）4-(ナフタレン-1-イルアミノ)-3,5-ジニトロ安息香酸
（13）2-[1-(3-クロロ-フェニル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イルスルファニル]-N-(3-フルオロ-フェニル)-アセトアミド
（14）2-(5-ヒドロキシメチル-8-メチル-3-オキサ-ビシクロ[3.3.1]ノン-7-エン-2-イル)-フェノール
（15）5-アセチル-4-(3-ヒドロキシ-フェニル)-6-メチル-3,4-ジヒドロ-1H-ピリミジン-2-オン。
ICCBでの他の研究者らによる同じライブラリーのスクリーニングに基づいて、これらの結果により、これらの化学物質の新規活性が示される。これらの化合物は、癌化学療法の候補物質である。
最終的な脱保護段階の前に誘導体を作製してもよい図11A〜11Cに示した式の化合物の特定の保護された誘導体は、そのような薬理活性を有さなくてもよいが、それらを非経口または経口投与して、その後体において代謝されて、薬理学的に活性である本発明の化合物を形成してもよいことは当業者によって認識されるであろう。したがって、そのような誘導体は、「プロドラッグ」として記述してもよい。そのようなプロドラッグは全て、本発明の範囲内に含まれる。
本発明はさらに、図11A〜11Cに示される化合物と構造的に類似である化合物、例えば構造類似体またはその誘導体を含む。好ましくは、誘導体は、参照化合物の生物活性の少なくとも75％、85％、95％、99％、または100％を有する。いくつかの場合において、誘導体の生物活性は、参照化合物の活性レベルを超えてもよい。誘導体はまた、参照化合物が保有しない特徴または活性を有してもよい。例えば、誘導体は毒性の減少、臨床半減期の延長、または血液-脳関門の通過能の改善を有してもよい。
本発明にはまた、本発明を用いて得られた化合物または図11A〜11Cに記載した化合物1〜15を投与することを含む、細胞周期障害、例えば癌を有する宿主を治療する方法が含まれる。
本明細書に開示の方法は、ヒトなどの、治療を必要とする被験体に化合物を非経口または経口投与することを提供する。非経口投与には、静脈内（IV）、筋肉内（IM）、皮下（SC）、腹腔内（IP）、鼻腔内、および吸入経路が含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法において、化合物は好ましくは経口投与される。IV、IM、SC、およびIP投与は、ボーラスもしくは注入によって行ってもよく、またはポンプ、徐放性製剤、および機械的装置を含むがこれらに限定されない徐放性埋め込み型装置によって行ってもよい。製剤、投与経路および方法、ならびに用量は、治療すべき障害および患者の既往に依存するであろう。非経口または経口投与の場合、化合物の組成物は、半固体または液体、懸濁剤等のような液体調製物であってもよい。
本発明はさらに、本発明を用いて得られたまたは図11A〜11Cに記載した化合物を含む薬学的組成物を提供する。好ましい組成物は、化合物の他に、薬学的溶媒、賦形剤、または媒体として作用する薬学的に許容される担体（すなわち、滅菌および非毒性）液体、半固体、または固体希釈剤を含む。当技術分野で既知の如何なる希釈剤を用いてもよい。例としての希釈剤には、水、生理食塩液、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、メチル-およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルジネート、デンプン、乳糖、蔗糖、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、鉱油、およびカカオバターが含まれるがこれらに限定されない。適した担体または希釈剤は、例えば、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、当技術分野における標準的な参照テキストである、「Remington：The Science and Practice of Pharmacy」、Alfonso R. Gennaro編、A.L. Gennaro、リッピンコット、ウィリアムス＆ウィルキンス；ISBN：0683306472、第20版、2000年12月15日に記述されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩液、リンゲル液、デキストロース液、および5％ヒト血清アルブミンが含まれるがこれらに限定されない。リポソームおよび固定油のような非水性溶媒も同様に用いてもよい。製剤は一般的に用いられる技術によって滅菌される。
本明細書に記述のスクリーニング法によって同定される核酸分子、ベクター、ポリペプチド、抗体、および化合物を含む組成物または薬学的組成物は、経口、静脈内、皮内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内を含むがこれらに限定されない任意の投与経路のために調製することができる。担体または他の成分の性質は、特定の投与経路および投与される本発明の特定の態様に依存するであろう。この状況において有用な技術およびプロトコールの例は、とりわけ同上文献において認められる。
これらの化合物の用量は、治療すべき疾患状態または病態ならびにヒトまたは動物の体重および状態、ならびに化合物の投与経路のような他の臨床要因に依存するであろう。ヒトまたは動物を治療する場合、化合物の約0.25μg/kg体重〜100mg/kg体重を投与することができる。治療は典型的には低用量で投与され、望ましい治療転帰が認められるまで継続される。
本発明はまた、薬学的組成物を、哺乳類における癌、血液疾患、免疫疾患、血管新生欠損、骨疾患、心血管疾患、肥満、糖尿病、または神経変性疾患を治療および／または予防するために、有効量で十分な期間投与してもよいことを示すラベルをパッケージング材料が含み、薬学的組成物が、本発明を用いて得られるまたは図11A〜11Cに記載の化合物を含む、パッケージング材料と該パッケージング材料に含まれる薬学的組成物とを含む製品を提供する。
本発明は、さらに制限的であると決して解釈されない以下の実施例によってさらに説明される。実施例を含む本明細書を通して引用された全ての参考文献、係属中の特許出願、および公表された特許出願の内容物は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
参考となる実施例
本明細書において考察した魚の変異のみならず、新しいモデル疾患を表す変異体は、以下のように概要される方法を用いて作製することができる。
ENU変異誘発：wikバックグラウンドの成体雄性ゼブラフィッシュをENUによって変異誘発して、同じバックグラウンドの野生型雌性魚と交配させた。ENU変異誘発は、van Eedenら[Methods Cell Biol. 60：21〜41、1999]に本質的に記述される通りに行った。簡単に説明すると、雄性ゼブラフィッシュを胚培地（Embryo medium）において約2.5〜3.0mM ENUに25℃で1時間曝露する。魚に、魚用アクアリウム水による1回1時間の洗浄を行い、これを2回交換する。この処置を約3〜6日後に繰り返すことができる。変異誘発物質に暴露後、雄性魚を野生型の雌性魚に毎週交配させる。最後のENU処置後4〜24週で産生されたF1子孫をスクリーニングのために用いる。
半数体の胚の作製：上記のENU変異誘発を用いて作製された点突然変異を有するF1ヘテロ接合雌性魚を圧搾して半数体の卵を得、これをUV不活化精子と受精させて半数体の胚を得た。
F1雌性魚を、雄性魚と共に単離チェンバーに一晩入れた。翌朝、産卵の前に雄性魚を除去した。雌性魚を0.02％トリカヘ（Tricahe）によって個々に麻酔して、腹部に軽く圧をかけて卵を採取した。卵をVU不活化精子の2.0ミクロフィルターと共に混合した。1分後、胚水（embryo water）を加えた。次に、胚を28.5℃でインキュベートした。
ゼブラフィッシュ胚の全身免疫組織化学染色：可能性がある細胞周期変異体をスクリーニングするために、抗ホスホヒストンH3抗体によって半数体の胚を36時間でスクリーニングした。1腹卵を定位解剖顕微鏡下で分析して、胚の50％における異常な染色細胞数に関して評価した。異常な染色胚50％を有するそれらの1腹卵からの親のF1雌性魚を残しておいた。
F1雌性ゼブラフィッシュ750匹をスクリーニングすることによって変異体1腹卵41個が同定され；21個は染色の増加を示し、11個は染色の減少、および9個は集中的な染色などの他の表現型を示した。
染色の前に用いることができるいくつかの代替的な固定法が存在する。本明細書においては、胚を4％パラホルムアルデヒドにおいて4時間固定した。固定後、リン酸化ヒストンH3（pH3）を認識する抗体によって胚を染色した。
染色は、ペルオキシダーゼ法を用いて行った。胚を固定して、5mlガラスバイアルにおいて保存した。時計工鉗子またはプロナーゼ処置を用いて、まず胚の塩素を除去した（dechlorinate）。大きいバッチの胚に関しては、プロナーゼ処理のほうが速い。プロナーゼを用いて胚の塩素を除去する（dechlorinate）ため、プロナーゼ2mgをE3培地においてそれらに加えた。
絨毛膜の約80％が除去されるまで調製物を室温で旋回させた後、調製物をE3によって3〜4回すすいだ。
胚を4％パラホルムアルデヒド/PBSによって4℃で一晩固定した後、PBSにおいて2回洗浄した。
染色は、固定した胚をまずガラスバイアルにおき、-20℃のアセトン中で7分間インキュベートすることによって行った。胚を2回蒸留水（double distilled water）中1回、PBS中2回、それぞれ1分間すすいだ後、0.1％Tween-20を含むPBS（PBST）中5分間の洗浄を2回行った。
非特異的結合は、PBSTおよびブロッキング試薬（10％熱処理仔ヒツジ血清、10％保存液から希釈した2％ブロッキング試薬（ベーリンガー・マンハイムバイオケミカルズ（Boehringer-Mannheim Biochemicals）（ロシュ））および1％DMSOと共に胚を室温で30分から1時間インキュベートすることによってブロックした。
一次抗ホスホヒストンH3抗体をPBST/ブロック試薬/DMSOにおいて1μg/mlに希釈し、4℃または室温で2〜4時間インキュベートした。一次抗体を除去し、調製物にPBST中15分間の洗浄を4回行った。PBST/ブロック試薬/DMSOにおいて300倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP；ジャクソンイムノリサーチ（Jackson Immunoresearch））に結合させた二次抗ウサギIgG抗体を胚調製物に加えて、4℃で一晩または室温で4時間インキュベートした。
染色の検出は、1回すすいでPBSTおよび10％熱処理仔ヒツジ血清によって30分間洗浄して、PBST中30分間の洗浄を3回行った後に行った。DAB染料を適当な希釈で加えて、遮光するためにホイルに包んで10分から一晩染色した。染色時間は1〜5分間で十分なことが多かった。染色後、調製物をPBSTにおいて5分の染色を2回行い、4％パラホルムアルデヒド/PBSにおいて4℃で一晩固定した。染色した調製物を4℃の固定液またはメタノールにおいて保存した。調製物を90％グリセロール、10％1×PBSにおいて封入して写真を撮影した。または、調製物を脱水して封入することができる。脱水は、100％メタノールによって2回、それぞれ10分間洗浄した後、ベンジルベンゾエート：ベンジルアルコールの2：1混合液によって洗浄することによって行うことができる。この混合物は、卵黄と同じ屈折率を有し、胚を十分にはっきりとさせるが、グリセロールのように粘性ではなく、胚の位置を固定することは難しい。
ヒストンH3のリン酸化は長い間、染色体凝縮に関係するとされてきた（Strahl, B.D.ら、Nature 403：41〜45、2000）。ヒストンH3での10位のセリンのリン酸化は、分裂および減数分裂の双方において染色体凝縮に密接に相関している（Hendzelら、Chromosome 106：348〜360、1997）。この部位でのリン酸化はまた、染色体凝縮状態の開始のみならず、c-jun、c-fos、およびc-mycのような最初期遺伝子の誘導に必要とされる（Strahl, B.D.ら、Nature 403：41〜45、2000；Spencer, V.A.ら、Gene 240：1〜12、1999）。PKA、Rsk-2、およびMSK1は、H3のリン酸化にとって必要である（同上）。ホスホ-ヒストン（セリン10位）抗体は、セリン10位がリン酸化されたヒストンH3を検出する。これは、H3のリン酸化を同定するため、ならびに細胞分裂および減数分裂を免疫細胞化学によってモニターするために有用なツールである。
pH3抗体は、ゼブラフィッシュ胚において増殖していることがわかる細胞を染色する。染色された細胞は、受精後12および16時間（hpf）で胚全体に分布し、24〜48hpfから数が増加した。それぞれの臓器が異なる発生段階で増殖し始めると、pH3染色は増加する。24〜48hpfの眼および発達中の神経系において特に高濃度の染色を認めた。これらの染色された胚を高倍率で見ると、pH3抗体が分裂中の細胞を染色することを示す多くの分裂中の図が示された。眼における染色細胞は、アポトーシスを受ける水晶体の細胞とは違っていた。後の段階の胚の染色は失敗に終わったが、これがpH3レベルの減少の結果であるのか、またはpH3抗体に対する胚の透過性の減少の結果であるのかは不明である。
半数体の胚について行われた染色も同様に、分裂細胞を明確に表した。細胞周期に入っている細胞のpH3抗体の特異性を証明するために、本発明者らは、放射線照射した胚におけるpH3染色を調べた。放射線照射はチェックポイント（細胞はその後細胞周期を開始する）を誘導する。放射線照射後、pH3染色は、30分で最低値まで減少し、2時間でほぼ正常レベルまで回復する。
ゼブラフィッシュ胚の全身封入インサイチュー分析：全身封入インサイチュー分析は、本質的にS. Schulte-Merker, J.H. Odenthal, and C. Nusslein-Volhard（「The Zebrafish Science Monitor 2」、1992年9月21日、zfish.uoregon.edu/zf_info/monitor/vol2.1/vol2.1.html）に記述されたとおりに実施した。
時計工鉗子またはプロナーゼ処理を用いて胚の絨毛膜を除去して（dechorionate）、上記のように4％パラホルムアルデヒド/PBSにおいて4℃で一晩固定した。絨毛膜を除去した胚に、PBSにおいて室温で5分間の洗浄を2回行った。洗浄した胚を100％メタノールと共にバイアルに移して5分間インキュベートした。メタノールを新しい100％メタノールに交換して、-20℃で少なくとも20分間放置した。
絨毛膜を除去した胚を、室温で再度水和して固定した。胚を年齢に従ってバッチ毎に処理して（プロテイナーゼK処置）、後に分離した。5mlバイアルまたは12ウェルプレートのいずれかを用いた。それぞれの洗浄は、バイアルでは2〜3mlまたはウェルトレーでは50mlで、50％メタノールのPBST溶液5分、30％メタノールのPBST溶液5分、およびPBST 5分の洗浄を2回行った（胚の絨毛膜除去はこの時点でも行うことができるが、絨毛膜はMeOH中におかれた後は粘着性となる）。再水和した胚は4％パラホルムアルデヒドのPBS溶液において20分間固定して、PBST（PBS、0.1％Tween）において2回、それぞれ5分間洗浄した。
絨毛膜を除去した調製物をプロテイナーゼK（10μg/ml PBST溶液）によって室温で約5分間（時間は1分〜10時間まで変化しうる）、10分間（10〜24時間）、または15分間（20μg/ml PBST溶液）（＞24時間）消化した。消化後、調製物をPBSTにおいて簡単にすすぎ、上記のように、PBSTにおいて1回5分間洗浄して固定し、上記のようにPBSTにおいて再度2回洗浄した。
200個までの胚を、PBSTを含む1.5ml微量遠心チューブに移した。PBSTを除去して胚を回収し、約500μg HYB-溶液（50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％Tween20）を加えた。ハイブリダイゼーション段階は、水浴中または好ましくはハイブリダイゼーションオーブンにおいて揺り動かさずに行った。調製物を60℃で5分間インキュベートして、その後HYB-を等量のHYB+（HYB-、5mg/ml torula（酵母）RNA、50μg/mlヘパリン）に交換した。HYB+において60℃で4時間プレハイブリダイゼーションを行った（一晩プレハイブリダイゼーションが好ましい場合もあった）。直線化プラスミド約5〜10μgを用い、2500ヌクレオチドより短いプローブは加水分解されなかった。
ハイブリダイゼーションは、100ng RNAプローブを新鮮なHYB+ 500μlに加えて、68℃で5分間加熱することによって行った。プローブのHYB+溶液を加えて、調製物を60℃で一晩または約12時間インキュベートした後、プローブを除去した。
以下のGATA-2およびTTG2段階は、予め温めた溶液を用いて24ウェルプレートにおいて行った。
GATA-2プローブは最も一般的な開始点であった。以下のインキュベーションを行った：50％ホルムアミド/2×SSCT（SSC、0.1％Tween）において60℃で2×30分；2×SSCTにおいて60℃で1×15分；および0.2×SSCTにおいて60℃で2×30分。
TTG2プローブを用いてバックグラウンドを減少させた。以下のインキュベーションを行った：50％ホルムアミド/50％2×SSCTにおいて60℃で30分；2×SSCTにおいて37℃で3×10分；PBSTにおいて37℃で1×5分；20μg/ml RNアーゼA、100U/ml RNアーゼT1のPBST溶液において37℃で30分；2×SSCTにおいて37℃で10分；50％ホルムアミド/50％2×SSCTにおいて60℃で60分；2×SSCTにおいて60℃で15分；および0.2×SSCTにおいて50℃で2×15分。
染色の検出は以下のように行った。胚の調製物をMABT（100mMマレイン酸、シグマ（Sigma）M0375、セントルイス、ミズーリ州；150mM NaCl、55gトリスを0.1％Tween-20と混合して、最終的に2L、pH7.5にする）において2×5分洗浄した。調製物をMABT＋ブロッキング試薬（10％熱処理仔ヒツジ血清、2％BMB 1096 176、ベーリンガーマンハイム・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ州；100mMマレイン酸、シグマM0375；150mM NaCl、55gトリスを最終的に2L、pH7.5にした溶液中のブロッキング試薬）によって室温で1時間ブロックした。Fab-AP（ベーリンガーマンハイム・バイオケミカルズ）を5000倍希釈で加えて、MABT＋ブロッキング試薬において4℃で一晩振とうした。
調製物を1回すすいだ後MABTおよび10％熱処理仔ヒツジ血清によって30分間洗浄して、MABTにおいて5×30分間再度洗浄した。胚を染色緩衝液、100mMトリス、pH9.5、50mM MgCl2、100mM NaCl、0.1％Tween-20、1mMレバミソールにおいて3×5分間洗浄した。胚を室温でBMB紫（ベーリンガーマンハイム・バイオケミカルズ）および新鮮な5mM塩酸レバミソールにおいて室温で30分から一晩染色した。PBSTによる5分間の洗浄を胚に2回行って、一晩固定し、4％パラホルムアルデヒド/PBSTにおいて4℃で保存した。写真を撮影する場合には、胚を70％グリセロール/30％1×PBSTに入れた。
細胞周期障害を同定するためのゼブラフィッシュ胚のフローサイトメトリー細胞ソーティング分析：胚のDNA含有量を分析するために、野生型および変異体胚細胞にDNAフローサイトメトリー細胞ソーティング（FACS）を行った。本発明者らは、DNA含有量に関するFACS分析を、単一の胚からの細胞について行い、それによって変異体および野生型細胞周期表現型の分析および比較を行うことができることを示した。
胚をトリカイン（エチルm-アミノベンゾエートとも呼ばれる3-アミノ安息香酸エチルエステルをシグマから粉末型で、カタログ番号A-5040）によって麻酔した。魚を麻酔するためのトリカイン溶液は、400mgトリカイン粉末、97.9ml DD水、および約2.1ml 1Mトリス（pH9）を組み合わせて調製し、pHを約7に調節した。使用前にトリカイン溶液4.2mlをきれいなタンクの水100mlと混合した。
上記のように胚の絨毛膜を除去して、マイクロチューブにおいて少量のDMEM-20％FBSに再浮遊させた。胚の凝集を分離して、DMEM＋20％FBS 1〜2mlに再浮遊させた。溶液を105μmメッシュを通過させて、その後40μmメッシュを通過させた。全量を5mlにして、試料中の細胞を血球計算盤を用いて計数した。細胞2×106個に等しい容積を15mlコニカルチューブに移して、PBSを加えて全量を5mlとした。試料を1200rpmで10分間遠心して、液体を吸引除去した。PI溶液（0.1％クエン酸ナトリウム、0.05mg/mlヨウ化プロピジウム、0.0002％トライトンX100およびRNアーゼ2μg）2mlを加えた。試料を室温の暗所で30分間インキュベートしてから、氷中に移し、FACSアナライザでのソーティングを行った。
γ線照射は、FACSによるDNA含有量分析によって認められるように、ゼブラフィッシュの胚において細胞周期の停止を誘導した。初期G2で停止した細胞周期により、4N DNA含有量を有する細胞が増加し、分裂細胞数が減少した。受精後24時間のゼブラフィッシュ胚のフローサイトメトリー分析は、G2期での細胞の蓄積を示し、このことはG2 DNA損傷チェックポイントの活性化を示している。真核細胞DNA修復に関する既知の動態と一致して、G2停止の逆転は、放射線照射後2時間で始まることが認められた。この同じ期間に、pH3免疫反応性は強く抑制され、G2放射線照射チェックポイントが染色質の凝縮およびH3リン酸化の開始前に存在することを示唆している。
SQW226（潰れた火傷様変異体魚）およびSQW280の分析から、神経芽細胞腫などのヒト腫瘍において一般的に認められる特徴である核内倍加が示され、全身におけるpH3染色の増加が真にインビボでのG2/M境界域での細胞の増加を示すことが示唆された。変異体SQW226、SQW319（活動停止様（standstill）変異体魚）、およびSQW61のDNA含有量分析は、以下の特徴を含む異常な細胞周期を示した：核内倍加（SQW226）、より大きい細胞集団（SQW226およびSQW61）、G2/M集団の増加（SQW319）、およびG1集団の増加（SQW61）。SQW61分析においてG2が減少してG1集団が増加したことは、細胞がG1段階で停止したことを示唆した。
アポトーシス障害を同定するためのゼブラフィッシュ胚におけるアポトーシスマーカーの分析：胚をアクリジンオレンジによって1時間染色して、PBSにおいて洗浄し、フルオレセインフィルターを通して観察した。
ゼブラフィッシュ胚のアポトーシスは、多様な技術を用いて検出することができる。例えば、SQW226のアクリジンオレンジ染色によって、24または36時間で変異体の細胞死が有意に増加することが示された。細胞周期障害を有する細胞はアポトーシス死に至った。変異体SQW226は、野生型と比較して細胞死に至る細胞数の増加を示した。SQW226のヘテロ接合近交系間交配を行った。24時間では、1腹卵の4分の1が「尾を上げた（tail up）」表現型を示すことが明白であった。次に、これらのホモ接合胚を生体色素であるアクリジンオレンジによって染色してエピ蛍光顕微鏡下で調べ、アポトーシスの程度を評価した。
リソトラッカー（Lysotracker）（モレキュラープローブス（Molecular Probes）、ユージン、オレゴン州）は、生きた胚においてアポトーシス細胞も染色するアルデヒド固定可能な赤色色素であり、これによって本発明者らは他のプローブと共に変異体をさらに調べることができた。アクリジンオレンジ染色を用いて、様々なゼブラフィッシュ胚変異体におけるアポトーシスの有意な増加が示された。
S期障害を同定するためのゼブラフィッシュ胚のBrdU染色：BrdUは、S期の細胞によってDNAに取り込まれる。BrdUアッセイによって、細胞周期表現型をさらに詳しく分類することが可能であった。受精後24時間の生きた胚を10mM BrdUと共に氷中でインキュベートしてすすぎ、28.5℃で0、10、30、および60分間追跡した。眼および尾における標識の詳細から、インキュベーション時間が長くなると標識細胞が次第に増加することが示された。
SQW226および319ゼブラフィッシュ変異体はいずれも、BrdUの取り込みの減少を示した。10分間追跡後の野生型および変異体胚のBrdU取り込みから、S期の細胞がSQW226ではある程度減少し、SQW319では強く減少することが示された。pH3染色、アポトーシスマーカー、BrdU取り込み、およびFACSを用いたゼブラフィッシュ変異体の分析の概要を、以下の表1に示す。
（表1）SQW変異体の特徴付け
n.d.＝決定していない；↑＝細胞染色数の増加；↓＝染色数の減少。
Figure 2005512542
分裂障害を同定するためのゼブラフィッシュ胚のチューブリン染色：分裂紡錘体は細胞周期において肝要な役割を果たし、変異体はこのプロセスに障害を表す可能性がある。分裂を調べるためにゼブラフィッシュのチューブリン染色を行った。破壊されたゼブラフィッシュ胚をポリリジンコーティングスライドガラスにおいてインキュベートして空気乾燥させた。スライドガラスをPBST/ブロック（上記のように）においてインキュベートした後、100倍希釈したフルオレセイン結合モノクローナル抗α-チューブリン抗体（シグマ社）中でインキュベートした後、PBSTにおいて洗浄した。スライドガラスをフルオレセインフィルターによって顕微鏡下で観察した。紡錘体形成の欠損は、二つの変異体、SQW280およびSQW226において示された。
チェックポイント欠損変異体を同定するためのゼブラフィッシュ胚の放射線照射分析：ゼブラフィッシュ胚に受精後24〜36時間に800〜1600radのγ線を照射すると細胞周期の停止を引き起こすが、胚は回復して、少なくとも約24時間齢まで通常の発生を継続する。pH3染色は、放射線照射後30分までに実質的にほとんど検出不能まで減少したが、pH3は放射線照射後2時間で正常レベルに回復する。DNAフローサイトメトリー分析によって、放射線照射15分後から放射線照射後4時間までのあいだにG2/M期の細胞の比率が増加することが示され、G2停止を示唆している。
変異を有するF1雌性魚100匹から卵を圧搾して、不活性な精子に曝露して、半数体の胚を作製した。胚を12時間で評価して、14時間目に1600radの放射線を照射した。1時間後、胚を上記のように固定して、pH3に関して染色した。一つの変異体R176は、50％の変異体胚が持続的なpH3染色を示し、放射線照射チェックポイントの損傷を示唆した。
本発明者らは、SQW226変異体ゼブラフィッシュ系統が、チェックポイント欠損を有するか否かを評価するためにSQW226に放射線を照射した。ホモ接合変異体がpH3染色の減少を示さず、SQW226変異体ゼブラフィッシュは分裂細胞数の減少を示さなかった。したがって、SQW226はチェックポイントを無効にすることができるか、または出口の遮断を示し、このことは、SQW226が放射線誘導細胞周期停止に対して耐性であるか、または細胞周期がブロックされて放射線照射によって影響を受けないことを示している。対照的に、野生型の胚（+/-または+/+）は、放射線照射後にpH3染色が減少した。それぞれの変異体を、この放射線照射スクリーニングにおいて細胞周期チェックポイント障害に関して評価した。
さらに、この放射線照射スクリーニングは、ゼブラフィッシュ胚に対するチェックポイントまたは出口ブロックスクリーニングを行うための基礎となる。実施された半数体スクリーニングは、観察された放射線誘導細胞周期停止に基づいた。ENU処置雄性魚と野生型雌性魚との子孫であるF1雌性魚からの半数体の胚に放射線を照射して、照射後45分で固定した。これらの胚をpH3抗体によって染色したところ、分裂細胞の正常な減少を示さなかった変異体を同定することができる。これらの変異体は、細胞周期機構またはチェックポイント制御遺伝子に影響を及ぼす可能性があり、癌形成を調べるための、およびさらなる改変剤のスクリーニングの主題としての優れたモデルである。
半数体胚の作製および分析：可能性がある変異を表すF1 wik-ENU雌性ゼブラフィッシュ41匹をwik雄性魚と異系交配させた。得られたF2子孫を成体まで生育させて、ヘテロ接合対を再度確認するため、およびpH3表現型が二倍体状態で反復（recapitulate）できることを確認するために、近交系間交配させた。
本発明者らは、近交系間交配させたF1雌性魚29匹からの子孫を同定した（それぞれ20交配）。この分析において、変異7個（SQW61、213、226、280、319、332、333）を同定した。SQW226変異体は、pH3染色が増加した。体および尾における細胞数の計数から（n=5）、野生型と比較して変異体では染色細胞が2.2倍多いことが示された。これらの変異体の二倍体表現型は半数体表現型と類似した。SQW213も同様に染色が増加したが、神経細胞および前腎管において局所的に分布した。SQW319はpH3染色が減少したが、SQW61は染色がわずかに増加したに過ぎなかった；SQW280は、核染色のより大きいドメインを有し、細胞染色はより少なかった。F1雌性魚41匹全てのマップ交配（野生型AB雄性魚と交配したwik.ENUヘテロ接合雌性魚）も同様に作製した。
本発明者らが行った半数体スクリーニングからの平均変異体回収率を考慮すると、予備的スクリーニングは、細胞周期に影響を及ぼす変異体少なくとも15〜20個を回収するであろう。いくつかの変異体において、散在的なpH3染色を認めた。これらの変異体では、頭部の大きさが減少して、尾部がそり上がった。他の変異体は、pH3染色が減少し、対照となる同胞より小さいように思われた。
細胞周期調節に関係する遺伝子の位置クローニング：半4分染色体（half-tetrad）分析（Johnson, S.L.ら、Genetics 139：1727〜1735、1995）によって動原体連鎖を決定するか、または連鎖に関するミクロサテライトを走査することによって、変異体をゼブラフィッシュ連鎖群にマッピングした。この半4分染色体法は、野生型および変異体雌性発生二倍体胚に関して既知のSSLP動原体マーカーの分離に従うことを含んだ（Streisinger, G.ら、Nature 291：293〜296、1981；Streisinger, Gら、Genetics 112：311〜319、1986）。
変異はまた、CAリピートマーカーとのバルク分離分析によって連鎖群に割付することができる（Talbot, W.ら、Methods in Cell Biology、H.I. Detrich, M.Westerfield, L. Zon編、アカデミック出版、サンディエゴ、260〜284、1999；Liao, E.ら、同上、181〜183）。変異を有するwikバックグラウンドの魚（ヘテロ接合体）を、多形性系統（AB）と交配させる。卵をUV照射精子と受精させることによって、ヘテロ接合wik/ABハイブリッド雌性魚から半数体の胚を作製する。または、ヘテロ接合ハイブリッド雄性魚と雌性魚とを交配させることによって、二倍体胚を作製することができる。固定して抗pH3抗体によって染色することによって、半数体または二倍体の胚は、野生型または変異体のいずれかであると評価される。次に、DNAを個々の胚から作製する。20個のDNA試料に関する野生型および変異体プール（野生型プール2個と変異体プール2個）に関してバルク分離分析を行う。次に、これらのプールについて、示した連鎖群からのCAリピートプライマーを用いてPCRを行う。ABおよびwik DNAの双方から増幅するバンドは情報価値がないが、二つの系統間で多形であるバンドは位置マーカーとして用いることができる。連鎖したマーカーは、プールにおいて分離するマーカーであると同定され、変異体プールと比較して野生型からは異なる大きさのバンドが増幅されることを意味する。連鎖マーカーが認められる場合、マーカーと変異のあいだの組み換え頻度を決定するために個々の胚についてこれを試験する。
このアプローチを用いて、本発明者らは、変異体の胚600個の遺伝子型を調べ、SQW226（潰れた火傷様表現型）をゼブラフィッシュの第11染色体にマッピングした。変異の1.2cM以内のマーカーを単離した（胚612個中8個）。現在利用可能なCAマーカーは3000個に過ぎないことから、密接に隣接するマーカーが認められない場合には、他のマーカーをスクリーニングする必要があるかもしれない。AFLP分析は多くのマーカーを同時に試験する有用な方法であることが証明されている。プライマーの組み合わせ256個を試験することにより、6400遺伝子座に関する情報を得ることができる（Ghebranious, N.ら、Oncogene 173385〜3400、1990）。
連鎖分析を用いて、以下の変異体6個をゼブラフィッシュゲノムマップにおいて位置を特定した：SQW61は、第2染色体にマッピングされた；SQW213は、第8染色体にマッピングされた；SQW226は、第11染色体にマッピングされた；SQW280は第6染色体にマッピングされた；SQW319（活動停止様表現型）は、第13染色体にマッピングされた；そしてSQW333は、第15染色体にマッピングされた。変異体SQW61およびSQW213は、アガロースゲルにおいて分析することができるマーカーに隣接する。
SQW226変異体ゼブラフィッシュ系統に関する変異体胚1664個を採取して、臨界区間におけるESTを、連鎖分析を用いて組み換えに関して調べた。調べた変異体胚DNA1664個から組み換え体6個を得た。組み換え型の魚を染色体歩行に用いてSQW226遺伝子を同定した（Talbot and Schier、Methods Cell Biol. 60：260〜287、1999）。
未知の遺伝子のクローニングは、Amemiyaら（Methods Cell Biol. 60：236〜259、1999）において記述されるようにBAC、PCA、またはYACを含むライブラリーから行う。変異の検出、核酸のシークエンシング、および配列分析は、当技術分野で周知の技術を用いて行うことができ、例えば、「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」、第3版、Joe Sambrook、Peter MacCallum, David Russell編、CSHL出版、2001に詳細に記述されている。
発癌アッセイ：発癌アッセイは、どの変異体が腫瘍または癌の発生に関連するかを決定するために用いられる。アッセイにより、上記の半数体胚スクリーニングによって異常な細胞周期を有するゼブラフィッシュ変異体が、その野生型同胞より癌を発症する傾向が高いか否かが示されるであろう。発癌物質は、これらの魚において腫瘍の発生を加速するはずである。
変異体と野生型の3週齢の魚をいずれも、発癌物質である7,12ジメチルベンズアントラセン（DMBA）の用量約1.0、2.0、5、および10ppm、ならびにN-メチル-N-ニトロ-N-ニトロソグアニジン（MNNG）の用量約0.5、1.0、2.0、および3.0ppmに約24時間曝露した後、新鮮な水に移し、成体まで生育させた。魚の生存をモニターして、死亡または病気に見える魚は切片形成のために固定する。または、通常約7ヶ月間である任意の時点で組織の切片形成および組織学分析のためにコホート全体を固定することができる。
発癌物質処置ゼブラフィッシュは、例えば、図4に示すようにヒト疾患に密接に類似する髄芽細胞腫または生殖細胞腫瘍を発症する。野生型の魚をDMBAおよびMNNGによって処置した。DMBAによって処置した魚86匹中9匹すなわち10.4％が腫瘍を発症し、MNNGによって処置した魚128匹中10匹すなわち7.8％が腫瘍を発症した。DMBAによってより多くの脳および肝臓腫瘍が得られたが、MNNGは、より多くの間葉および精巣腫瘍を生じた。Mung：0.5、1.0、および2.0ppm；DMBA：2.5、5.0、および10.0ppm。
変異体系統における自然発生および発癌物質誘発腫瘍発生率を評価するために、近交系間交配による21日齢の稚魚を溶媒対照（DMSO）または5.0ppm DMBAのいずれかに24時間曝露した。変異体において早期での死亡率を認めたことから、最初に適切であると推定された6ヶ月ではなく、3ヶ月で魚を分析した。変異体のいくつかは、下記の表2において認められるように野生型と比較して腫瘍の発生率の増加を示す。
（表2）発癌アッセイの結果の要約
n.d.＝決定していない；*野生型データは処置後6ヶ月のデータである。変異体の系統は、処置後3ヶ月で分析した。
Figure 2005512542
(7,12)ジメチルベンズアントラセンによって処置した魚における髄芽細胞腫からの組織切片を、光学顕微鏡下で低倍率で野生型と比較した。低倍率は、40倍を示し、中程度の倍率は200倍、および高倍率は400倍を示す。中程度および高倍率で調べると、魚とヒトの腫瘍の類似性が示される。例えば、N-メチル-N'-ニトロソグアニジンによって処置した魚における生殖細胞腫瘍はそれぞれ、肝臓腫瘍および精巣腫瘍に酷似していた。
実施例
ゼブラフィッシュの細胞周期：細胞周期の基礎分子機構は、進化を通して十分に保存されているため、酵母は哺乳類細胞周期の良好なモデルとなっている。ゼブラフィッシュにおける細胞周期機構のいくつかは、哺乳類の系と相同であることが示されている。例えば、サイクリンD1がゼブラフィッシュにおいてクローニングされており、そのアミノ酸配列はヒト相同体と77％同一である。Yarden, A., D. Salomon, and B. Geiger、「Zebrafish cyclin D1 is differentially expressed during early embryogenesis.」、Biochim. Biophys. Acta. 1264、257〜60（1995）。サイクリンのボックス領域（G1サイクリンの特徴）では相同性はさらにより顕著で、88％同一である。同様に、ミズーリ州セントルイスのワシントン大学のゼブラフィッシュのデータベースには、細胞周期遺伝子の多数の発現された配列タグ（EST's）が存在する。
ゼブラフィッシュの胚の細胞周期は、アフリカツメガエル（Xenopus）およびショウジョウバエ（Drosophila）の細胞周期と類似性を示す。ゼブラフィッシュの胚は、それらが約10回の細胞分裂後に起こる中期胞胚変移（MBT）に達するまで、同期してしかも迅速に（細胞周期約15分）分裂し始める。Kane, D.A.、「Cell cycles and development in the embryonic zebrafish.」、Methods Cell Biol. 59：11〜26（1999）。その時点で、接合体の転写が始まり、細胞周期は非同期となり、より遅くなる。三つの分裂ドメインが確立されており、それぞれが異なる平均細胞周期を有する。Kane, D.A, R.M. Warga, and C.B. Kimmel、「Mitotic domains in the early embryo of the zebrafish.」、Nature 360：735〜737（1992）。同様に、特徴的なチェックポイントタイプの反応の開始および細胞周期障害化学物質に反応してアポトーシスに至る能力が、MBTでは顕著である。例えば、MBT後の胚をノコダゾールによって処置すると、分裂中期停止およびアポトーシスを引き起こす。Ikegami, R., J. Zhang, A.K. Rivera-Bennetts, and T.D. Yager.、「Activation of the metaphase checkpoint and an apoptosis programme in the early zebrafish embryo, by treatment with the spindle-destabilising agent nocodazole.」、Zygote 5：329〜350（1997）。分裂中期停止細胞は、カルシウム特異的イオノフォアA23187を加えることによってG1に入るよう促進することができる。カンプトテシン、ヒドロキシウレア、およびアフィジコリンのような哺乳類細胞においてS期停止およびアポトーシスを引き起こすいくつかの化学物質は、ゼブラフィッシュの胚においてアポトーシスを引き起こすことが示されている。Ikegami, R., P. Hunter, and T.D. Yager、「Developmental activation of the capability to undergo checkpoint induced apoptosis in the early zebrafish embryo.」、Dev. Biol. 209：409〜433（1999）。
本発明者らは、上記の参照実施例において記述された方法を用いて作製されたゼブラフィッシュ細胞周期変異体8個を同定した。細部周期の障害は、ホモ接合変異体の胚において認められ、これは発生の5日までに死滅する。ヘテロ接合体は全体的に影響を受けていないように見えるが、現行の発癌アッセイにより、いくつかの細胞周期変異体では癌の発生率が増加することが示されている。潰れた火傷様表現型のヘテロ接合体（SQW226）は、自然発生的におよび発癌物質の存在下で癌が統計学的に有意に増加する（図1）。したがって、潰れた火傷様表現型は癌のモデルであると見なすことができると仮定して、本発明者らは、潰れた火傷様ホモ接合変異体胚における細胞周期障害を逆転できる化学物質のスクリーニングに重点を置いた。細胞周期障害を逆転または改善する化学物質を、化学予防または化学療法活性に関してヘテロ接合体について試験する。興味深い細胞周期障害を有する活動停止様変異体（SQW319）についても、いくつかのスクリーニングを行った。活動停止様ヘテロ接合体による発癌データは、癌に対する感受性の増加を示唆するが、データはこの時点で統計学的に有意ではない。
魚：変異体は全て胚の5日までに致死的であると仮定して、ホモ接合変異体の胚を、成体ヘテロ接合体の近交系間交配によって作製した。潰れた火傷様表現型（または場合によっては活動停止様表現型）ヘテロ接合対約50個を毎週交配させて、毎週約3000個の胚を生成した（図2）。これらの胚は、ホモ接合変異体25％、ヘテロ接合変異体50％、および野生型25％のメンデルの分布からなった。標準的な胚培養培地において1腹卵を回収して、発生約3時間目に注意深く、如何なる非受精、死亡、または変形胚も除去してきれいにした。Westerfield, M.、「The zebrafish book：a guide for the laboratory use of zebrafish（Danio rerio）.」、1989、ユージン；オレゴン大学出版。発生3〜5時間のあいだに、胚の培地をデカントして、胚をすくって、低分子のプールを含む（化学物質の章を参照されたい）スクリーニング培地（胚用培地＋1％DMSO、0.5Mメトロニダゾール、50U/mlペニシリン、および50μg/mlストレプトマイシン）300μlを含む48ウェルプレート（ファルコン（Falcon））に移した。化学秤量スパテラを用いてウェル1個あたり胚約15個を加えた。次に、胚を化学物質中で28.5℃で一晩培養した。潰れた火傷様および活動停止様表現型は最初にそれぞれ、発生の19時間および12時間目で細胞周期マーカーによる免疫染色によって検出される。発生の24時間までに、免疫染色および形態によって、双方の変異体について強い表現型が認められる。このため、エンドポイントとして24時間を選択した。絨毛膜は、胚の培地に5mg/mlプロナーゼ（ロシュ（Roche））150μlを加えることによって除去した。プロナーゼ中10分後、プレートを軽く振とうさせて、絨毛膜を破壊した。化学物質およびプロナーゼを含むスクリーニング培地をピペットによって除去して、4％パラホルムアルデヒドを加えて、全身免疫染色のために胚を固定した。
化学物質：化学物質は、ハーバードメディカルスクールの化学細胞生物学研究所（ICCB）との共同を通じて得た。化学物質ライブラリーは、ケムブリッジ社（ChemBridge Corporation、サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入したDIVERSet Eライブラリー（化合物16,320個）であった。TECAN液体取り扱いロボットを用いて、スクリーニング培地80μlをポリスチレン384ウェルプレート（ヌンク）に移した。これらのプレートをICCBに運び、ここで、化合物1μl（5mg/mlのDMSO溶液）をスクリーニング培地にロボットによって少量移入した。これらのプレートを、化学物質をプールして48ウェルプレートに少量ずつ加えるようにプログラムされたTECANロボットに戻した。化学物質16個が横方向および縦方向にプールされるマトリクスプール戦略を用いて、4文字のプール8個を作製した（図3を参照されたい）。マトリクスプール戦略において、化学物質は、一つの横方向プールおよび一つの縦方向プールに表現型が出現する場合に限ってヒットであると見なされる。グリッドにおけるプールの交点が関心対象の化学物質を同定する。マトリクスのプールにおいて、それぞれの化学物質は2つ組（duplicate）で調べた。このように、1ウェルあたり胚は15個存在したが、実際には化学物質1個あたり胚は30個であった。プレート幾何学の拘束と、スループットを増加させたいという要求を考慮して、8×10マトリクスを利用した。プールにおけるそれぞれの化学物質の平均濃度は、20μMであった。全体で化学物質8,000個、すなわち潰れた火傷様の胚に5,560個と活動停止様胚に2,440個を、8週間でスクリーニングした。
全身免疫染色：免疫染色はスクリーンのある底を有する48ウェルグリッドにおいて行った。胚を48ウェルプレートから染色グリッドに移した。胚をPBSですすいでから、-20℃のアセトンにおいて7分間インキュベートした後、水によってすすぎ、PBSTによって2回すすいだ。胚をPBST＋5％仔ヒツジ血清、10％ブロッキング溶液（ロシュ）および1％DMSOにおいて室温で30分間ブロックした。リン酸化ヒストンH3（P-H3）に対するポリクローナル抗体（サンタクルズ（Santa Cruz））を後期G2/M期細胞のマーカーとして用いた。胚のグリッドをブロック溶液において1000倍希釈した一次抗体中で4℃で一晩インキュベートした後、PBSTにおいて3回すすいだ。次に、グリッドを、ブロック溶液において1〜300倍希釈した二次抗体-ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ジャクソンイムノケミカルズ（Jackson Immunochemicals））に移して、室温で2時間インキュベートした。PBSTにおいて4回すすいだ後、0.7mg/mlジアミノベンジジン（DAB、シグマ）のPBS溶液を色素原として用いた。胚をPBSにおいてすすいで、可溶性のDABを除去し、次に、グリッドを4％パラホルムアルデヒドに移した。パラホルムアルデヒド中の胚を、評価および保存のためにアガロースコーティング48ウェルプレートに移した。
評価：それぞれのウェルにおける胚を、解剖顕微鏡（ライカ（Leica））を用いてP-H3染色の増加または減少に関して肉眼的に観察した。変異体表現型の救出を発見することがスクリーニングの目的であったが、いくつかの他の分類の活性を検出、または理論的に検出することができ、その全てを下記のスクリーン結果に詳細に説明する。
結果
効果なし：化学物質は、胚の25％がP-H3染色の変異体パターンを有し、残りの75％が野生型パターンを有する場合に効果なしと見なされた。当然、変異体胚の正常な分布は25％に集中した。たとえ30個中変異体が1個のみであったとしても、化学物質は効果を有しないと見なされた（変異体が何らかの部分的救出の証拠を示さない限り）。予想されたように、ほとんどの化学物質は効果がなかった。
毒性効果：胚のほとんどが死亡、形態形成遅延、または何らかの形態学的異常を示した場合、化学物質は毒性であると見なした。化合物の約2％が毒性であった。
完全な救出：全ての胚が野生型表現型を有する場合、その化学物質をさらなる分析のために選択した。一つの可能性は、化学物質が変異体表現型の完全な救出を生じたことであった。他の可能性は、ウェルに如何なる変異体も存在しなかったことであった。化学物質1個あたり胚30個の場合、後者の可能性は0.01％の発生率で起こると計算することができる。化学物質8000個中12個は、「完全な救出」分類に評価されたが、化学物質あたり胚を100個用いた再試験では、一つを除く全てがこの分類から除外された。一つの化学物質（図11A〜11C）を、9、12、16、および20μMの用量で潰れた火傷様の胚について再試験した。発生の24時間後、それぞれの用量で胚30〜60個について潰れた火傷様変異体は検出されなかったが、化学物質を有しない対照コホートは、非常に明確な変異体を40個中13個示した（図4A〜4C）。20μM用量での胚の遺伝子タイピングによって、細胞周期表現型がないにもかかわらず、胚56個中「変異体」が12個存在することが証明された。全体として、胚はわずかな発達の遅延を示したが、P-H3染色は正常であり、化学物質が、野生型胚に対して明白な毒性または細胞周期作用を示すことなく、潰れた火傷様表現型を遅延／救出できることを示唆しており、これは、化学物質が潰れた火傷様表現型に関連した特定の経路に作用する可能性があることの指標である。化学物質が化学療法または化学予防活性を有するか否かを決定するために、ヘテロ接合体を8G16によって処置する。
部分的救出：変異体が存在したが、P-H3染色表現型が通常認められる場合よりも重度ではない場合に部分的救出であると見なされた。予想されたように、主観的な評価を考慮すると、この分類には有意な数の擬陽性が存在した。化学物質約20個が部分救出候補物質であると見なされたが、ほとんどは再試験によって除外された。化学物質8個（図11B）は、潰れた火傷様胚におけるP-H3染色を部分的に減少させることが判明したが、野生型胚の染色も減少させた。
このパターンは、細胞周期をS期で遅らせる既知の化学物質について認められている。例えば、潰れた火傷様ヘテロ接合体の子孫がDNA合成の阻害剤であるアフィジコリンの存在下で培養される場合、P-H3染色は潰れた火傷様表現型を含む全ての胚において減少する（図4）。この分類における化学物質は、蛍光活性化細胞ソーティングによってさらに特徴を調べることができるであろう。
全般的作用：任意の期において細胞周期の停止を引き起こす化学物質は、このスクリーニングにおいて同定されると予想される。部分救出分類において先に言及した化学物質8個も同様にこの全般的分類に入る。さらに、化学物質11個は、全般的にP-H3染色の増加を引き起こした。これらの化学物質の5個は、同じ化学ライブラリーをスクリーニングするために哺乳類細胞を用いて他の研究室によって行われた分裂停止アッセイにおいて検出されたが、本明細書ではこれ以上説明しない。残る化合物6個（III群；図11C）に関して、この活性は新規であるようである。
総合致死的：総合的作用を有する化学物質が、ヘテロ接合体において変異体表現型を誘導するが、野生型では誘導しない可能性がある。そのような化学物質は、変異体に影響を及ぼすこともあれば、及ぼさないこともあろう。変異体に対して作用を及ぼさないと仮定すると、胚の75％が変異体表現型を有するであろう（変異体およびヘテロ接合体）。または、変異体に作用を及ぼす場合、おそらく、表現型はより重度となり、胚の50％が変異体表現型を有し、25％（ホモ接合変異体）はより重度の表現型を有するであろう。この場合も、統計学的に擬陽性率が存在する。化学物質7個が総合致死分類に評価されたが、全て再試験によって除外された。
選択毒性：化学物質は変異体に対して選択的に毒性となりうる。この場合、ウェルは、野生型の胚と、死亡がいつ起こったかによって、認識可能な死亡変異体または断片化した胚の破片とを含むであろう。そのような化合物は、多数の胚について再試験を行い、変異体の喪失を確認するために、遺伝子タイピングを行うことができるであろう。この分類に評価された化学物質はなかった。
本発明に様々な改変および変更を行うことができるが、それらも本発明の趣旨および範囲に含まれることは、当業者に明らかであろう。このように、本発明は、それらが添付の請求の範囲およびその同等物の範囲内に入る限り、本発明の改変および変更を含むと意図される。
潰れた火傷様表現型の腫瘍の遺伝子型による発生率を示す（+/+＝野生型；+/-ヘテロ接合体）。 本発明によって企図されるスクリーニング系の一つの態様の図である。 マトリクスをプールする戦略を示す。スクリーニング効率を改善するために、マトリクスのプールを行った。例えば、化学物質16個を横方向および縦方向にプールして、4（文字）のプール8個を生成することができる。このようにすると、評価する必要があるウェルの数は半分になる。化合物は、表現型が横方向プール1個および縦方向プール1個に出現する場合に限って「ヒット」であると見なされる。グリッドにおけるプールの交点は、対象となる化合物を同定する（灰色）。この方法は、ヒットの割合と毒性率がいずれも低い場合に最も有効である。 潰れた火傷様の表現型の出現を8G16が防止するが、遺伝子型はなおも潰れた火傷様（crb）変異を反映しているることを示す。図4Aは、無処置野生型ゼブラフィッシュの胚を示す。図4Bは、無処置の潰れた火傷様表現型の変異体ゼブラフィッシュの胚を示し、図4Cは、10μM 8G16によって処置した潰れた火傷様表現型を示す。染色は、P-H3抗体によって行い、これを黒い点として示す。 ゼブラフィッシュの胚を8G16によって処置した場合に細胞周期のG1/S期に細胞が蓄積されることを示す。図5Aは、無処置胚のP-H3染色を示し、図5Bは、100μM 8G16によって処置した胚のP-H3染色を示す。図5Cは、無処置胚（対照）の細胞からの細胞周期のFACS分析である、特に、右側のピーク、ならびに10および100μM 8G16を処置した胚に注目されたい。 8G16が、野生型の無処置の胚（図6A）と比較して、潰れた火傷様（crb）表現型のゼブラフィッシュ変異体（図6B、無処置crb変異体、および6D、8G16処置crb変異体）を救出することができるが、別の多倍体ゼブラフィッシュ変異体cds（図6C、無処置cds変異体、および6E、8G16処置cds変異体）は救出しないことを示す。 無処置胚（図7A）、図11CのII群の化合物によって処置した胚（図7B、P-H3染色の減少）、およびIII群の化合物によって処置した胚（図7C、P-H3染色の増加）の例を示す。 8G16の構造（図8A）および8G16との構造相同性を有する不活性化合物（図8B）を示す。 化合物AおよびLの構造活性相関を示す。図9Aは、活性を示さない化合物L1、L2、およびL8を示す。図9Bは、Lと類似の活性を有する化合物L、L4、L5、およびAを示す。図9Cは、図9Bの化合物と比較して5倍高い濃度に限って活性を示す化合物L3、L7、L9、およびL10を示す。 図10Aの化合物と部分的相同性を有するが、異なる結果を示す化合物を示す。図10Bの化合物は、上記の濃度で分裂停止を引き起こすが、図10Cの化合物は、1.5mMまでの調べた濃度で分裂停止を引き起こさない。 ゼブラフィッシュ変異体に投与した場合に作用を有する化学化合物構造の例を示す。図11Aは、「8G16」（I群、化合物番号（1））が正常な胚に影響を及ぼすことなく、発生の24時間を通して潰れた火傷様細胞周期表現型を防止することを示す。この化合物、アダマンタン-1-カルボン酸(3-ヒドロキシ-ピリジン-2-イル)-アミドは、癌化学療法および／または化学予防の候補物質である。図11Bは、以下を含むII群の化合物8個（2〜9）を示し：（2）4-(4-アリルオキシ-3,5-ジブロモ-ベンゼンスルホニル)-2,6-ジブロモ-フェノール（3）4-ヒドロキシ-3-[3-(4-ヒドロキシ-フェニル)-アクリロイル]-6-メチル-ピラン-2-オン（4）2-ベンゾイル-3a,7a-ジヒドロ-インデン-1,3-ジオン（5）トルエン-4-スルホン酸2,4-ジニトロ-フェニルエステル（6）3,5-ジヨード-N-[2-クロロ-5-(4-クロロ-ベンゼンスルホニル)-フェニル]-2-ヒドロキシ-ベンズアミド（7）1-(2-アミノ-4-ニトロ-フェニルアミノ)-3-フェニル-ウレア（8）1-(3,4-ジクロロ-フェニル)-2-(2-イミノ-2H-ピリジン-1-イル)-エタノン（9）2-(2-o-トリルオキシ-アセチルアミノ)-安息香酸、これらは、潰れた火傷様表現型の胚においてP-H3染色を減少させ、野生型胚の染色も同様に減少させる。したがって、それらはヒストンH3がリン酸化されないG1、Sまたは初期G2において細胞周期を停止する可能性が高い。この活性は、図4におけるアフィジコリンの活性と類似である。これらの化合物は、癌化学療法の候補物質である。図11Cは、III群の化合物を示す。これらの化合物6個（10〜15）は、野生型の胚においてP-H3染色を増加させ、以下が含まれる：（10）N-(2-クロロ-フェニル)-スクシナム酸メチルエステル（11）4-(2-クロロ-5-トリフルオロメチル-フェニルカルバモイル)-酪酸（12）4-(ナフタレン-1-イルアミノ)-3,5-ジニトロ安息香酸（13）2-[1-(3-クロロ-フェニル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イルスルファニル]-N-(3-フルオロ-フェニル)-アセトアミド（14）2-(5-ヒドロキシメチル-8-メチル-3-オキサ-ビシクロ[3.3.1]ノン-7-エン-2-イル)-フェノール（15）5-アセチル-4-(3-ヒドロキシ-フェニル)-6-メチル-3,4-ジヒドロ-1H-ピリミジン-2-オン。ICCBでの他の研究者らによる同じライブラリーのスクリーニングに基づき、これらの結果により、これらの化学物質の新規活性が示される。これらの化合物は、癌化学療法の候補物質である。

Claims (19)

  1. 以下の段階を含む、遺伝表現型を変化させる化合物の能力に関して試験化合物をスクリーニングする方法：
    （a）表現型を遺伝した少なくとも一匹の硬骨魚を試験化合物に接触させる段階；および
    （b）遺伝された表現型の変化を検出する段階。
  2. 表現型が疾患に関連し、疾患が癌、血液疾患、免疫疾患、血管新生、骨疾患、心血管疾患、肥満、糖尿病、および神経変性疾患からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
  3. 硬骨魚がゼブラフィッシュである、請求項1記載の方法。
  4. 硬骨魚がゼブラフィッシュの胚である、請求項1記載の方法。
  5. 硬骨魚が、胚、幼生、または成体である、請求項1記載の方法。
  6. 硬骨魚がマイクロタイターウェルに含まれる、請求項1記載の方法。
  7. 試験化合物が、硬骨魚を含む培地に試験化合物を溶解することによって硬骨魚に投与される、請求項1記載の方法。
  8. 試験化合物が、試験化合物を硬骨魚に注射することによって硬骨魚に投与される、請求項1記載の方法。
  9. 試験化合物が、担体と共に硬骨魚に投与される、請求項1記載の方法。
  10. 担体が、溶媒、脂質、またはペプチドである、請求項9記載の方法。
  11. 試験化合物が、低分子、核酸、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、糖質、脂質、または糖脂質である、請求項1記載の方法。
  12. 表現型がリン酸化または脱リン酸化細胞周期タンパク質により特徴づけられる、請求項1記載の方法。
  13. 核酸がDNAまたはRNAである、請求項11記載の方法。
  14. 一つより多い試験化合物をスクリーニングすることを含む、請求項1記載の方法。
  15. 請求項1または14記載の方法によって得られる化合物。
  16. 請求項1または14記載の方法によって得られる化合物と、薬学的に許容される担体とを投与することを含む、細胞周期障害を有する宿主を治療する方法。
  17. アダマンタン-1-カルボン酸(3-ヒドロキシ-ピリジン-2-イル)-アミド、4-(4-アリルオキシ-3,5-ジブロモ-ベンゼンスルホニル)-2,6-ジブロモ-フェノール、4-ヒドロキシ-3-[3-(4-ヒドロキシ-フェニル)-アクリロイル]-6-メチル-ピラン-2-オン、2-ベンゾイル-3a,7a-ジヒドロ-インデン-1,3-ジオン、トルエン-4-スルホン酸2,4-ジニトロ-フェニルエステル、3,5-ジヨード-N-[2-クロロ-5-(4-クロロ-ベンゼンスルホニル)-フェニル]-2-ヒドロキシ-ベンズアミド、1-(2-アミノ-4-ニトロ-フェニルアミノ)-3-フェニル-ウレア、1-(3,4-ジクロロ-フェニル)-2-(2-イミノ-2H-ピリジン-1-イル)-エタノン、2-(2-o-トリルオキシ-アセチルアミノ)-安息香酸、N-(2-クロロ-フェニル)-スクシナム酸メチルエステル、4-(2-クロロ-5-トリフルオロメチル-フェニルカルバモイル)-酪酸、4-(ナフタレン-1-イルアミノ)-3,5-ジニトロ安息香酸、2-[1-(3-クロロ-フェニル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イルスルファニル]-N-(3-フルオロ-フェニル)-アセトアミド、2-(5-ヒドロキシメチル-8-メチル-3-オキサ-ビシクロ[3.3.1]ノン-7-エン-2-イル)-フェノール、5-アセチル-4-(3-ヒドロキシ-フェニル)-6-メチル-3,4-ジヒドロ-1H-ピリミジン-2-オンからなる群より選択される化合物と、薬学的に許容される担体とを投与することを含む、細胞周期障害を有する宿主を治療する方法。
  18. パッケージング材料と該パッケージング材料に含まれる薬学的組成物とを含む製品であって、該パッケージング材料が、哺乳類における癌、血液疾患、免疫疾患、血管新生、骨疾患、心血管疾患、肥満、糖尿病、および神経変性疾患を治療および／または予防するために有効量で十分な期間、該薬学的組成物が投与されうることを示すラベルを含み、薬学的組成物が、薬学的に許容される担体と共に、請求項1または14に記載の方法によって得られる化合物を含む、製品。
  19. パッケージング材料と該パッケージング材料に含まれる薬学的組成物とを含む製品であって、該パッケージング材料が、哺乳類における癌、血液疾患、免疫疾患、血管新生、骨疾患、心血管疾患、肥満、糖尿病、および神経変性疾患を治療および／または予防するために有効量で十分な期間、該薬学的組成物が投与されうることを示すラベルを含み、薬学的組成物が、薬学的に許容される担体と共に、アダマンタン-1-カルボン酸(3-ヒドロキシ-ピリジン-2-イル)-アミド、4-(4-アリルオキシ-3,5-ジブロモ-ベンゼンスルホニル)-2,6-ジブロモ-フェノール、4-ヒドロキシ-3-[3-(4-ヒドロキシ-フェニル)-アクリロイル]-6-メチル-ピラン-2-オン、2-ベンゾイル-3a,7a-ジヒドロ-インデン-1,3-ジオン、トルエン-4-スルホン酸2,4-ジニトロ-フェニルエステル、3,5-ジヨード-N-[2-クロロ-5-(4-クロロ-ベンゼンスルホニル)-フェニル]-2-ヒドロキシ-ベンズアミド、1-(2-アミノ-4-ニトロ-フェニルアミノ)-3-フェニル-ウレア、1-(3,4-ジクロロ-フェニル)-2-(2-イミノ-2H-ピリジン-1-イル)-エタノン、2-(2-o-トリルオキシ-アセチルアミノ)-安息香酸、N-(2-クロロ-フェニル)-スクシナム酸メチルエステル、4-(2-クロロ-5-トリフルオロメチル-フェニルカルバモイル)-酪酸、4-(ナフタレン-1-イルアミノ)-3,5-ジニトロ安息香酸、2-[1-(3-クロロ-フェニル)-2,5-ジオキソ-ピロリジン-3-イルスルファニル]-N-(3-フルオロ-フェニル)-アセトアミド、2-(5-ヒドロキシメチル-8-メチル-3-オキサ-ビシクロ[3.3.1]ノン-7-エン-2-イル)-フェノール、5-アセチル-4-(3-ヒドロキシ-フェニル)-6-メチル-3,4-ジヒドロ-1H-ピリミジン-2-オンからなる群より選択される化合物を含む、製品。
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