JP2005508947A - Stat−1の阻害 - Google Patents
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Abstract
Description
1.デコイ−オリゴヌクレオチドによる活性化された転写因子の中和、
2.アンチセンス−オリゴヌクレオチドによるSTAT−1タンパク質発現の阻害、
3.アンチセンス発現ベクターによるSTAT−1タンパク質発現の阻害、および
4.2本鎖RNA−オリゴヌクレオチド(dsRNA干渉)の適用によるSTAT−1タンパク質発現の阻害。
5'-ATTACCGGAAG-3'(配列番号:3)、
5'-ATTCCGGTAAG-3'(配列番号:5)、
5'-ATTCCTGGAAG-3'(配列番号:7)、
5'-ATTCCTGTAAG-3'(配列番号:9)、
5'-GTTCCAGGAAC-3'(配列番号:11)、
5'-GTTCCCGGAAG-3'(配列番号:13)、
5'-GTTCCGGGAAC-3'(配列番号:15)、
ここで、それぞれの相補鎖はここには図示していない。しかし、シス−エレメント−デコイは上記した配列とは異なる配列を示してもよく、11マーより長くてもよい。
(配列番号:17):5'-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3'、21マー、2つの結合部位、
(配列番号:19):5'-TGTGAATTACCGGAAGTG-3'、18マー、2つの結合部位、
(配列番号:21):5'-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3'、21マー、2つの結合部位、
(配列番号:23):5'-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3'、23マー、2つの結合部位、
(配列番号:25):5'-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3'、19マー、2つの結合部位、
(配列番号:27):5'-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3'、19マー、2つの結合部位、
(配列番号:29):5'-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3'、18マー、2つの結合部位、
(配列番号:31):5'-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3'、21マー、2つの結合部位、
(配列番号:33):5'-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3'、25マー、2つの結合部位、
(配列番号:35):5'-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3'、21マー、2つの結合部位、
(配列番号:37):5'-TGCATATTCCTGTAAGTG-3'、18マー、2つの結合部位、
(配列番号:39):5'-ATATTCCTGTAAGTG-3'、15マー、2つの結合部位。
ヒト内皮細胞は、HEPES−変法タイロード液中で1.6U/mlのディスパーゼで37℃において30分間処理することにより、臍帯静脈から単離し、ゼラチンをコーティングした6ウェル組織培養皿(2mg/mlゼラチンを0.1M HClに加えたもので室温において30分間)で、20%ウシ胎仔血清、50U/mlペニシリン、50μg/mlストレプトマイシン、10U/mlナイスタチン、5mM HEPESおよび5mM TES、1μg/mlヘパリン並びに40μg/ml内皮増殖因子を含有するM199培地(Gibco Life Technologies、Karlsruheドイツ)中で培養した。ヒト内皮細胞は、典型的な敷石形態、von Willebrandt−因子(vWF)の陽性の免疫染色およびPECAM−1(CD31)の蛍光定量的検出(FACS)並びに平滑筋α−アクチンの陰性の免疫染色によって同定した(Krzeszら、(1999),FEBS Lett.453,191)。
内皮細胞の総RNAは、製造業者のプロトコールにより、Qiagen RNeasyキット(Qiagen、Hilden、ドイツ)で単離し、合計容量20μlにおいて3μgのRNAおよび200UのSuperscript(商標)II逆転写酵素(Life Technologies)でcDNA合成した。cDNA負荷量を調節するために、5μl(約75ngのcDNA)の得られたcDNA溶液および伸長因子1(EF−1:elongation factor-1)PCRのプライマー対(Gibco)を1UのTaq DNAポリメラーゼ(Gibco)と共に総容量50μlで使用した。EF−1はPCRの内部標準として作用した。0.1%臭化エチジウムを含有する1.5%アガロース−ゲルでPCR産物を分離し、以下のPCR分析におけるcDNAの容量を調節するために、CCDカメラシステムおよびScanalytics社(マサチューセッツ州ビレリカ、米国)のOne-Sdcanゲル分析ソフトウェアで濃度測定した。
核抽出物および[32P]標識2本鎖コンセンサス−オリゴヌクレオチド(Santa Cruz Biotechnologie、ハイデルベルグ、ドイツ)の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、オートラジオグラフィーおよびスーパーシフト分析を、Krzeszら(1999),FEBS Lett.453,191に記載されているように実施した。以下の1本鎖配列(コア結合配列には下線をつけてある)を有する2本鎖DNA−オリゴヌクレオチドを使用した:SIE、5'-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3'(配列番号:56)。種々のシス−エレメント−デコイによるサイトカイン刺激したTHP−1細胞(前単球ヒト細胞株)の核抽出物における内因性STAT−1放出(extrusion)を分析するためには、30:1の比(STAT−1シス−エレメント−デコイ:[32P]標識SIEオリゴヌクレオチド(11fmol))をEMSA結合方法に選択した。
Krzeszら、(1999),FEBS Lett.453,191に記載されているように、相補的な1本鎖ホスホロチオエート結合オリゴヌクレオチド(Eurogentec社、ケルン、ドイツ)を用いて、2本鎖デコイ−オリゴヌクレオチドを作製した。培養ヒト内皮細胞は、10μM濃度のそれぞれのデコイ−オリゴヌクレオチドと共に4時間事前インキュベーションした。これらは、EMSAおよびRT−PCR分析に基づいて以前にすでに最適化されている条件であった。この後、デコイ−オリゴヌクレオチドを含有する培地を、通常どおり、新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチドの1本鎖配列は以下のようであった(下線つきの文字はホスホロチオエート結合塩基を示し、それらは各々5’−3’方向で示す):
GATA-2, CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT (配列番号:57)
NF-κB, AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC (配列番号:58);
STAT-1, CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG (配列番号:33);
STAT-1-19mut, GACAGTGCAGTGAACTGTC (配列番号:59);
STAT-1-25mut, CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG (配列番号:60)。
アンチセンス方法については、100mlのOPTI-MEM(登録商標)I培養培地に15μlのリポフェクチン(Gibco Life Technologie社、Karlsruhe、ドイツ)を添加し、室温(RT:room temperature)において45分間インキュベーションした(溶液A)。その後、アンチセンス−ODN(Eurogentec社、ケルン、ドイツ)を、最終濃度0.5μMまで100μlのOPTI-MEM(登録商標)I培養培地に添加した(溶液B)。溶液AおよびBをプールした後、さらに15分間インキュベーションした(RT)。実験開始時に、内皮細胞培養液の0.8mlの従来の細胞培養培地(ヘパリンおよび内皮増殖因子を含有しない)を、リポフェクチン−アンチセンス−ODN−複合体を含有するエッペンドルフチューブに添加し、内皮細胞培養液の細胞培養培地をアンチセンス−リポフェクチン培地と交換した。4時間後アンチセンス−リポフェクチン培地を除去し、新鮮な細胞培養培地(ヘパリンおよび内皮増殖因子を含有する)と交換した。STAT−1−アンチセンス−ODNの配列は5'-T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A*T*CC*T*GCC*A*C-3'(*ホスホロチオエート改変塩基、配列番号:41)。
臍帯由来のヒト内皮細胞および胸腺静脈由来の平滑筋細胞は、液体窒素中で凍結させ、37℃において融解すること(サーモブロック(thermoblock)、Kleinfelden、ドイツ)を5回反復することによって破壊した。タンパク質抽出液は、Heckerら、(1994),Biochem J.299,247に記載されているように調製した。標準的なプロトコールに従って、20〜30μgのタンパク質を、SDSの存在下において変性条件下において10%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、BioTrace(商標)フッ化ポリビニリデン転移膜(Pall Corporation、Rosdorf、ドイツ)に移した。以下の一次抗体を免疫学的タンパク質検出に使用した:CD40タンパク質(ポリクローナル、2000倍稀釈、Research Diagnostics Inc.ニュージャージー州フランダース、米国)、STAT−1タンパク質(モノクローナル、5000倍稀釈、BD Transduction Laboratories、ハイデルベルグ、ドイツ)、IRF−1タンパク質(ポリクローナル、2000倍稀釈、Santa Cruz Biotechnology、ハイデルベルグ、ドイツ)、iNOSタンパク質(ポリクローナル、3000倍稀釈、BD Transduction Laboratories、ハイデルベルグ、ドイツ)。タンパク質バンドは、ペルオキシダーゼ−結合抗−ウサギ−IgGを添加することにより検出し、モノクローナル一次抗体を使用する場合には、化学発光方法(スーパーシグナル化学発光基質(SuperSignal Chemiluminescent Substrate)、Pierce Chemical、イリノイ州ロックフォード、米国)およびその後のオートラジオグラフィー(Hyperfilm(商標)MP、Amersham Pharmacia, Biotech、Buckinghamshire、英国)により、それぞれの抗−マウス−IgG(3000倍、Sigma、Deisenhofen、ドイツ)によって検出した。βアクチンの等しいタンパク質バンドをモノクローナル一次抗体およびペルオキシダーゼ−結合抗−マウスIgG(共にSigma-Aldrich製、3000倍稀釈)で検出することによって、転移膜の「ストリッピング」(0.2N NaOHで5分間、その後H2Oで10分間洗浄を3回)により、等しいタンパク質量のローディングおよび転移が示された。
そうでないことを示さない限り、図面および本文中のデータは全て、n回の実験の平均値±SEMとして示す。統計学的評価は、対応のないデータについては、統計学的に有意であると考えられるp値<0.05を用いてスチューデントのt検定を実施した。
8.1 マウス
本願において開発したデコイ−オリゴヌクレオチドに基づいた治療方法の有効性を検出するために、1群あたり8〜10匹の動物を用いたマウスにおける動物実験に関連する概念検証試験を抗原誘導性関節炎の徴候について実施した(モデルはHenzgenら、Exp.Toxicol.Pathol.(1996),48,255を参照)。0.25nmolのSTAT−1−デコイ−オリゴヌクレオチド(配列番号:33)を関節に1回適用すると(関節内注射)、関節の抗原誘導性膨潤(35%)、炎症性応答の強度(70%)、関節破壊(80%)、総関節炎スコアー(70%)および血清中の前炎症性サイトカイン濃度(例えば、インターロイキン6は80%)を3〜14日目においてかなり有意に低下した。一方、それぞれの対照オリゴヌクレオチドは治療作用を示さなかった。
モルモット(Hartley、雄、体重350g)に7日間の間に2回アレルギー化した後(10%DNCBの50%アセトン/50%オリーブオイル溶液50μlで1日目に一方の耳に、2日目に他方の耳に抗原投与し、7日目に2%DNCBの95%アセトン/5%オリーブオイル溶液15μlで頚部の皮膚に追加抗原投与した)、動物の剃毛した背中のそれぞれサイズが約1cm2の1箇所以上の領域に13日目に2,4−ジニトロクロロベンゾール(DNCB、0.5%DNCBの95%アセトン/5%オリーブオイル溶液10μl)を再度適用することによって接触皮膚炎を誘発し、24時間後に肉眼的および組織学的に評価した。このような方法で誘発した接触皮膚炎は、表皮領域の浮腫および海綿状変化の顕著な形成、アポトーシス細胞の増加並びに白血球の広範囲の浸潤によって組織学的に(ギムザ染色)特徴づけられた(図8)。最後のDNCB暴露の1時間前にSTAT−1−デコイ−オリゴヌクレオチド(配列番号:19)を皮内適用すると、記載した組織学的なパラメーターが明確に低下した、すなわち、全体的に炎症性応答の有意な低減を生じたが、突然変異型対照オリゴヌクレオチド(5'-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3'、配列番号:61)は生じなかった。
Claims (2)
- 経皮的血管形成後の再狭窄および静脈バイパスの狭窄のような循環器系合併症、移植片対宿主反応、外科的介入および臓器移植のそれぞれに関連する虚血/再注輸による障害、免疫学的過敏反応、特に、アレルギー性鼻炎、薬剤および食物アレルギー、特に蕁麻疹および小児脂肪便症(スプルー)、接触皮膚炎および免疫複合体病、特に肺胞炎、関節炎、糸球体腎炎およびアレルギー性血管炎、炎症性軟骨疾患および骨疾患、特に関節症、痛風、骨炎および骨髄炎、多発性神経炎並びに敗血症性ショックを含む、急性および亜急性の感染症、偶発的、特に感染後炎症性疾患、特に気管支炎、心内膜炎、肝炎、心筋炎、腎炎、心外膜炎、腹膜炎および膵炎を予防または治療するための薬剤を製造するためのSTAT−1活性の阻害剤の使用。
- 前記阻害剤が、2本鎖DNA−オリゴヌクレオチド、1本鎖アンチセンス−オリゴヌクレオチド、アンチセンス−発現ベクターまたは2本鎖RNA−干渉−オリゴヌクレオチドである請求項1に記載の使用。
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