JP2005508642A - 試験サンプル中のMycoplasmapneumoniaeおよび/またはMycoplasmagenitaliumの存在を決定するための組成物、方法およびキット - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、試験サンプル中のMycoplasma Pneumoniaeおよび/またはMycoplasma Genitaliumの存在の決定に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブ、増幅プライマー、核酸組成物、方法およびキットに関連する。
本明細書で引用されるすべての参考文献は、その全体が参考として援用される。これらの参考文献(単独で、発明者らによりこれらの参考文献すべての内容の任意の部分が主張もしくは承認として構成されるべきではない)または任意の参考文献の援用は、特許出願に必要とされる任意の国もしくは地域の法令開示を満たすために必要な材料であると考えられる。にもかかわらず、本発明者らは、検査を行う権限もしくは法廷によって必要であると判断された材料を提供するために適切なこれらの参考文献のいずれかに依存する権利を保持している。本明細書で引用された参考文献は、請求項に係る発明に対して先行技術であると認められない。
マイコプラズマは、Mollicutes綱に属する小さな原核生物(0.2〜0.3μm)であり、そのメンバーは、細胞壁がなく、小さなゲノムサイズを有する。Mollicutes綱には、少なくとも100種のマイコプラズマ(そのうち13種が人間に感染することが既知である)が含まれる。これらの種のうちの一つ、M.pneumoniaeは、院外感染性肺炎(非肺炎球菌性細菌性肺炎)の主要な原因である。この型の肺炎は、アメリカ合衆国で毎年200万人に至る呼吸器感染症を引き起こす。マイコプラズマ非肺炎球菌性呼吸器感染の発生率は、この数字より10〜20倍高いと推定されている。GERALD L.MANDELLら、PRINCIPLES AND PRACTICE OF INFECTIOUS DISEASES §D(第5版 2000)を参照のこと;また、PATRICK R.MURRAYら、MANUAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY §V(第6版 1995)を参照のこと。
本発明は、オリゴヌクレオチドを特徴とすることによって、M.pneumoniaeに特異的な高感度アッセイのための臨床的な必要性に対する解決策を提供し、このアッセイは、M.pneumoniaeが試験サンプル(例えば、院外感染性肺炎有していると疑われる個体から得られた喉あるいは鼻咽頭の塗抹標本から得られる)中に存在するか否かを決定するのに有用である。よりまれに、M.pneumoniaeの存在を検出するための試料が、関節液吸引液、脳脊髄液、滑液、生殖管ならびに実験溶液、培養物および他サンプル培地から得られ得る。本発明はまた、オリゴヌクレオチドを特徴とすることによって、M.genitaliumに特異的な高感度アッセイのための臨床的な必要性に対する解決策を提供し、このアッセイは、M.genitaliumが試験サンプル(例えば、尿道、肛門管、女性の下部生殖器官もしくは気道から得られる)中に存在するか否かを決定するのに有用である。特徴とされるオリゴヌクレオチドは、試験サンプル中に存在するM.pneumoniae由来の標的核酸配列を検出、固定化および/または増幅するのに有用である、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、ヘルパープローブ、捕捉プローブおよび/また増幅プライマー中に含まれ得る。
本発明は、試験サンプル中のM.pneumoniaeまたはM.genitaliumの存在または非存在を決定するために有用なMycoplasma生物に由来する核酸に標的化されるオリゴヌクレオチドを記載する。このオリゴヌクレオチドは、異なる方法で(例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブおよび/または増幅プライマ−として機能することによって)M.pneumoniaeまたはM.genitaliumを検出するのを援助し得る。本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、試験サンプル中にM.pneumoniaeおよびM.genitaliumの存在を示す検出可能な二重鎖を形成するためにストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下のM.pneumoniaeまたはM.genitaliumに由来する核酸に存在する標的核酸配列に優先的にハイブリダイズし得る。このプローブのいくつかは、標的生物とそれに系統発生的に最も近い公知の生物との間を識別することができると考えられる。本発明の捕捉プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下でMycoplasma生物に由来する核酸に存在する核酸配列にハイブリダイズし得、そして臨床的な試料から標的核酸を分離するために使用され得る。本発明の増幅プライマーは、増幅条件下でMycoplasma生物に由来する核酸に存在する標的核酸配列にハイブリダイズし得、そしてM.由来核酸を生成するための増幅反応にプライマ−として使用され得る。このプローブおよび増幅プライマ−は、試験サンプル中にM.pneumoniaeまたはM.genitaliumの検出および/または定量に対するアッセイに使用され得る。
(A.定義)
以下の用語は、異なる意味を有することを特別に示されない限り、本明細書中において示された意味を有する。
「RNAおよびDNA等価物」は、同じ相補的な塩基対ハイブリダイゼーションの性質を有するRNA分子およびDNA分子を意味する。RNA等価物およびDNA等価物は、異なる糖の部分(すなわちリボースに対してデオキシリボース)を有し、そしてRNAではウラシルの存在およびDNAではチミンの存在によって異なり得る。それら等価物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、RNA等価物とDNA等価物との間の相違は、相同性の相違に寄与しない。
(B.ハイブリダイゼーション条件およびプローブ設計)
ハイブリダイゼーション反応条件、最も重要なものとしてハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション溶液中の塩濃度は、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブがM.pneumoniaeまたはM.genitaliumのいずれかに由来する標的核酸(target nucleic)配列を有する核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にするために、そして試験サンプル中に存在し得る非標的核酸にはハイブリダイズしないことを可能にするために選択され得る。減少した塩濃度および/または上昇した温度(ストリンジェンシーを増加した条件)では、二本鎖ハイブリッド分子において対をなしたヌクレオチド塩基の間での水素結合が崩壊するにつれて、核酸ハイブリダイゼーションの程度が減少する。このプロセスは「融解」として公知である。
遠い関係の生物の対応するrRNAの種々の領域は、系統発生的により近い生物のrRNAが示すよりもこれらの生物のrRNAから大きな相違を示す。M.pneumoniaeおよびM.genitaliumならびに他の生物との間の十分なバリエーションは、好ましい標的部位を識別し、そして他の密接に関連する生物よりM.pneumoniaeとM.genitaliumとの間の区別に有用なハイブリダイゼーションアッセイプローブを設計することが観察された。
1つのこのような数式は以下である:
Tm=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(分画G+C)−(600/N)
(ここでN=ヌクレオチドの数におけるオリゴヌクレオチド長)。これは、14から60〜70の範囲のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて良好なTmの概算を提供する。このような計算から、その後の実験的な証明またはTmの「細かい調整(fine tuning)」は、当該分野で周知のスクリーニング技術を使用してなされ得る。ハイブリダイゼーションおよびオリゴヌクレオチドプローブの参照についてのさらなる情報は、SAMBROOKら、上記、ch.11でなされ得る。当該分野で周知の他のものであるが、とりわけ、この参考文献はまたハイブリッドのTmにおけるミスマッチの影響の概算を提供する。このように2つまたはそれ以上の生物のリボソームRNA(またはrRNA)所定の領域にある公知のヌクレオチド配列から、これらの生物を互いに区別するオリゴヌクレオチドが設計され得る。
本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマーおよび捕捉プローブは、当該分野において公知の方法によって容易に調製され得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは固体相法を使用して合成される。例えば、Caruthersは、標準的なホスホラミダイト固体相化学を使用してホスホジエステル結合によってヌクレオチドを繋ぐことを記述している。例えば、Caruthersら,「Chemical Synthesis of Deoxynucleotide by the Phosphoramidite Method」,Methods Enzymol,154:287(1987)を参照のこと。シアノエチルホスホラミダイト前駆体を使用する自動的な固体相化学的合成は、Baroneによって記述されている。Baroneら,「In Situ Activation of bis−dialkylaminephospines−a New Method for Synthesizing Deoxyoligonucleotides on Polymer Supports」Nuclec Acids Res,12(10):4051(1984)を参照のこと。Battは、ホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドの合成するための手順を「Method and Reagent for Sulfurization of Organophosphorous Compounds」と題される米国特許第5,449,769号で開示している。さらにRileyらは、メチルホスホネート結合を含む異なる結合を有するオリゴヌクレオチドの合成を、「Process for the Purification of Oligomers」と題される米国特許第5,811,538号で開示している。これらオリゴヌクレオチドの有機的合成法についての方法は、当業者で公知であり、そして例えばSAMBROOKら、上記、ch.10に記載されている。
(D、核酸増幅)
好ましくは、本発明の増幅プライマーはオリゴデオキシヌクレオチドであり、そして核酸ポリメラ−ゼによって伸長産物の合成の基質として使用されるように十分に長い。最適のプライマー長はいくつかの因子を考慮に入れるべきであり、これには反応温度、構成およびプライマーの塩基組成ならびにプライマーの使用法が挙げられる。例えば、最適な特異性のためにオリゴヌクレオチドプライマーは、通常少なくとも12塩基長であるべきであり、これは、標的核酸配列の複雑性に依存する。もしこのような特異性が重要でなければ、より短いプライマーが使用され得る。このような場合、テンプレート核酸と安定したハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度で反応を実施することが所望され得る。
(E.サンプル処理)
標的配列の増幅、または検出に先立つサンプル処理は、サンプルに存在する非標的核酸から標的配列を区別するために、必要または利用され得る。サンプル処理は、例えば不均質アッセイにおける液相からの核酸および/またはオリゴヌクレオチドの直接的または間接的な固定を含み得る。いくつかの手段において、このような固定は多数のハイブリダイゼーションの現象を必要とし得る。例えば、Rankiら、「Detection of Microbial Nucleic Acids by a One−Step Sandwich Hybridization Test」、米国特許第4,486,539号および同第4,563,419号は、標的の相補配列を有する固相結合核酸および、標的核酸の異なる領域に相補的な標識核酸プローブの使用を含む一段階核酸「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション法を開示する。Stabinsky、「Methods and Kits for Performing Nucleic Acid Hybridization Assays」米国特許第4,751,177号は、記載されるところでは、固体支持体からの固定したプローブの漏洩から生じるRankiの方法に関連する感受性の問題を克服する「メディエーター」ポリヌクレオチドを含む方法を開示している。標的核酸の直接的な固定の代わりに、Stabinskyのメディエーターポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド:プローブポリヌクレオチド複合体(溶液中で遊離して形成される)に結合し、間接的に固定化するために使用される。
(F. M.リボソーム核酸を分離するための捕捉プローブ)
本発明の捕捉プローブは、非標的核酸の存在下でMycoplasma生物の16Sリボソーム核酸由来の核酸に結合して、分離するように設計されている。このように、捕捉プローブは標的結合領域および固定プローブ結合領域を含む。捕捉プローブの標的結合領域は、アッセイ条件下でMycoplasma生物由来の16Sリボソーム核酸に由来する標的配列にハイブリダイズする塩基配列を含む。必須ではないが、標的結合領域は、好ましくはアッセイ条件下で非標的核酸配列が存在する中で標的配列に対する特異性を示す。固定プローブ結合領域はポリヌクレオチドを含む固定プローブ、または直接的または間接的に試験サンプルに存在する固体支持体と結合する、ポリヌクレオチド配列を含むキメラにハイブリダイズする塩基配列を有する。標的結合領域および固定プローブ結合領域はお互いに、直接的または(例えば、ヌクレオチド塩基配列、無塩基配列もしくは非ヌクレオチドリンカー)によって結合し得る。
本発明の増幅プライマーは、Mycoplasma生物体由来の16Sリボソーム核酸の領域に方向付けられている。増幅プライマーは、核酸増幅アッセイにおいてMycoplasma生物体の存在を検出するのに使用されるハイブリダイゼーションアッセイプローブ(またはその相補鎖)の標的核酸配列の少なくとも一つと隣接し得るか、重なり得るか、またはこの配列の内部に含まれ得る。上述のように、増幅プライマーはまた、RNAポリメラーゼに結合し、標的核酸を鋳型として用いるRNA転写を方向付けることを可能にするプロモーター配列を含むプローブの5’末端に、非相補的な塩基をも含み得る。配列番号41のようなT7プロモーター配列が使用され得る。
本発明のこの実施形態は、新規ハイブリダイゼーションアッセイプローブに関する。ハイブリダイゼーションとは、水素結合された2本鎖を形成するための、相補的核酸の2つの1本鎖の会合である。検出されようとする核酸配列(「標的配列」)とハイブリダイズすることが可能な核酸配列は、標的配列に対するプローブとして役立ち得る。ハイブリダイゼーションは、DNA/DNA、DNA/RNA、およびRNA/RNAを含む相補的核酸鎖の間で起こり得る。ヌクレオチド(塩基アデニン(A)、シトシン(C)、チミジン(T)、グアニン(G)、ウラシル(U)、イノシン(I)、およびそのアナログを含む)から形成されるデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)の2つの1本鎖は、2本の鎖が相補的な塩基の対の間の水素結合により一緒に保持される、2本鎖構造を形成するようにハイブリダイズし得る。一般的に、AはTまたはUと水素結合され、一方でGはCと水素結合される。従って、ハイブリダイズされた鎖に沿ったどの点においても、古典的な塩基対ATまたはAU、TAまたはUA、GCまたはCGが見出され得る。したがって、核酸の第一の1本鎖が、十分な隣接する、第二の1本鎖に相補的な塩基を含み、その2本の鎖が、それらのハイブリダイゼーションを促進する条件下で合わさるとき、2本鎖核酸が得られる。好ましい条件において、DNA/DNA、RNA/DNA、またはRNA/RNAハイブリッドが形成され得る。
特に好ましい実施形態において、本発明によるM.pneumoniaeプローブは、標的結合部位を有するオリゴヌクレオチド(ここで、標識結合部位の塩基配列は、配列番号1または配列番号2の塩基配列から成るか、あるいは配列番号1または配列番号2の塩基配列内に含まれる)、および必要に応じて配列番号1または配列番号2の(5’から3’ヘ読んで)改変したヌクレオチド14と15との間に位置する非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合されたアクリジニウムエステル標識を含む。標的結合領域の塩基配列が、配列番号3または配列番号4の中に含まれる場合、アクリジニウムエステル標識は、好ましくは配列番号3または配列番号4の(5’から3’へ読んで)改変されたヌクレオチド18と19との間に位置している非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合されている。プローブにアクリジニウムエステル標識を結合することは、好ましくは、Arnoldら(米国特許第5,185,439および同第6,031,091)、の教示にしたがって、図5に示されている非ヌクレオチドリンカーアームを用いて行われる。
(I.M.pneumoniaeおよびM.genitaliumの検出に使用されるヘルパープローブ)
この発明の別の実施形態は、ヘルパープローブに関する。上述したように、ヘルパープローブは、それらの意図される標的核酸に対するハイブリダイゼーションアッセイプローブのハイブリダイゼーションを容易にするために使用され得、その結果、ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、ヘルパープローブの不在において形成されるよりも、容易にプローブ:標的核酸二本鎖を形成する(ヘルパープローブは、Hoganら、米国特許第5,030,557号により開示されている)、各ヘルパープローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でヘルパープローブ:標的核酸二本鎖を形成するために標的核酸配列に対して十分に相補的なオリゴヌクレオチドを含む。所定のヘルパープローブと共に使用されるストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件は、標的核酸に対する関連するハイブリダイゼーションアッセイプローブを優先的にハイブリダイスするために使用される条件によって決定される。
(J.核酸組成物)
関連する別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションアッセイ条件下で、ブリダイゼーションアッセイプローブと標的核酸との間で形成される核酸ハイブリット(「プローブ:標的」)を含む組成物を特徴とする。プローブと標的核酸との間に形成されるハイブリットの1つの使用は、試験サンプルにおいて、存在の指標または標的生物または生物群の量を提供することである。例えば、核酸ハイブリットに存在するアクリジニウムエステル(AE)は、アルカリ溶液中で加水分解に対して耐性であるのに対して、一本鎖核酸中に存在するAEは、アルカリ溶液中で加水分解しやすい(Arnoldら、米国特許第5,283,174を参照)。したがって、結合しなかったAE標識プローブの加水分解後に、核酸ハイブリットと結合したままであるアクリジニウムエステルの化学発光を測定することにより、標的核酸の存在が、検出され得る。
(K.アッセイ方法)
本発明は、試験サンプル中のM.pneumoniaeまたはM.genitaliumに由来する核酸の存在または量をアッセイするための様々な方法を意図する。使用される正確なアッセイ条件、プローブおよび/またはプライマーが、使用される特定のアッセイ形式およびサンプルの供給源に依存して変化することは当業者に理解されている。
本発明はまた、キットの形態で診断システムを企図する。本発明の診断システムは、キットを含み得る。このキットは、梱包材料中に、本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブ、捕捉プローブおよび/または増幅プローブのいずれかを、少なくとも1回のアッセイに対して十分な量で含む。代表的に、そのキットは、試験サンプル中にM.pneumorniaeまたはM.genitaliumの存在または量を決定するための増幅および/または検出アッセイにおいて、梱包されたプローブおよび/またはプライマ−を使用するために、有体の形態で記録された取扱説明書(例えば、紙または電子媒体に含まれる)もまた含む。さらに、ヘルパープローブが、キット内に含まれ得る。
実施例は、下で図解した異なる局面および本発明の実施形態を提供する。当業者は、これらの実施例が、ここに記載される特定の実施形態に本発明を制限するようには意図されないことを理解する。
下記の実施例における全細胞は、下記の「試薬」の節に記載される輸送媒体中で化学的に溶解した。この輸送媒体は、界面活性剤を含む緩衝化溶液である。これは、細胞の溶解に加えて、試験サンプルに存在するRNAseの活性を阻害することによって、放出されたRNAを保護する。
以下の数多くの実施例は、標的核酸配列の増幅の前に標的核酸を単離および精製するために設計された、標的捕捉アッセイを組込んでいる。これらの実施例の捕捉プローブは、配列番号13の塩基配列を有する5’標的結合領域およびポリdAテールの30ヌクレオチド長を有する3’固定プローブ結合領域を含んでいた。捕捉プローブの標的結合領域は、プライマー、プロモーター−プライマーおよびハイブリダイゼーションアッセイプローブによって結合される領域とは異なる標的核酸の領域に結合するよう、設計された。この標的捕捉アッセイの固体支持体は、Sera−MagTMMG−CM Carboxylate Modified(Seradyn、Inc.;Indianapolis、Indiana;Cat.No.24152105−050450)という、1ミクロンの、ハイブリダイゼーション状態下で捕捉プローブのポリdAテールに結合することが出来た、共有結合したオリゴ(dT)14を有する超常磁性粒子であった。同様な磁性粒子が、Sutor、「Process for Preparing Magnetically Responsive Microparticles」、米国特許第5,648,124号により、開示されている。懸濁液から粒子を引き出し、これらをサンプルチューブの内壁に沿って固定するために、チューブを、米国特許第6,254,826号において、Acostaらにより開示された、磁気分離ラックに移動した。分子を固定しながら、流体をチューブから吸引し、チューブを以下に記されたWash Bufferで洗浄した。この洗浄工程を、標的配列を増幅するために以下に述べる増幅試薬(Amplification Reagent)および酵素試薬(Enzyme Reagent)を加える前に、二度繰り返した。洗浄工程の間に、粒子を、Water Buffer中に再度懸濁した。標的捕捉アッセイのさらなる詳細を、以下の実施例4において示す。
以下の実施例の標的配列の増幅は、例えば、米国特許第5,399,491号および第5,480,784号におけるKacianら、およびLeeら、前出、第8章によって開示された、転写媒介増幅(TMA)手順であった。TMAは、逆転写酵素およびRNAポリメラーゼ(以下の酵素試薬(Enzyme Reagents)を参照のこと)を用いる、標的配列のコピー数における10億倍を超える増加を可能にする等温的な増幅手順である。TMA反応は、1本鎖標的配列を、5’RNAポリメラーゼ特異的プロモーター配列を有する、センスプライマーおよびアンチセンスプライマーの存在下、逆転写酵素によって、2本鎖DNA中間体へと転換することを含む。このDNA中間体に含まれるのは、RNAポリメラーゼによって認識され、数百コピーのRNAへと転写される二本鎖プロモーター配列である。次に、これらの転写されたRNA分子の各々は、追加のRNAを産生するために用いられる二本鎖DNA中間体に転換され得る。従って、TMA反応は指数関数的に進行する。以下の実施例で用いられるTMA反応の詳細を、以下において示す。
(4.ハイブリダイゼーションアッセイプローブ)
M.pneumoniaeまたはM.genitaliumに対して特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを、M.pneumoniae(ATCC受託番号15531)または公開された16S rRNA配列(M.pneumoniaeのrRNA(GenBank登録番号M29061)およびM.genitaliumのrRNA(GenBank登録番号X77334)を含む)のリボソーム核酸に相補的なプライマーを用いて、予想標的領域を最初に配列決定することによって設計した。可変領域を決定するために、これらの配列をM.bovis(GenBank登録番号U02968)、M.capricolum(GenBank登録番号AB000401)、M.collis(GenBank登録番号X64727)、M.faucium(GenBank登録番号U83663)、M.fermentans(GenBank登録番号AF031374)、M.gallisepticum(GenBank登録番号M22441)、M.hyopneumoniae(GenBank登録番号Y00149)、M.hominis(GenBank登録番号M24473)、M.iowae(GenBank登録番号M24293)、M.liphophilum(GenBank登録番号M24581)、M.muris(GenBank登録番号M23939)、M.orale(GenBank登録番号M24659)、M.pirum(GenBank登録番号M23940)、M.primatum(GenBank 登録番号AF013997)、M.salivarium(GenBank登録番号M24661)を含む、系統発生的に近いもののrRNA配列に対して比較した。Acholeplasma laidlawii(GenBank登録番号M23932)、Spiroplasma mirum(GenBank登録番号M24662)およびUreaplasma urealyticum(GenBank登録番号L08642)のrRNA配列に対してもまた、比較した。
ハイブリダイゼーション試薬、選択試薬、増幅試薬、再構成緩衝液、酵素試薬、酵素希釈緩衝液および油試薬を含め、様々な試薬が、以下の実施例において指定される。別の所で指し示していない限り、これらの試薬の処方および(関連がある所での)pH値は以下の通りであった。
(改善された示差的加水分解特性を示すM.pneumoniaeプローブ)
本実施例は、Hammondら、「Nucleic Acid Hybridization Assay Probes,Helper Probes and Amplification Oligonucleotides Targeted to M.pneumoniae Nucleic Acid」、米国特許第5,656,427号によって開示された先行技術のプローブと比較して改善された示差加水分解特性を示すことが明らかである、M.pneumoniae 16S rRNAについてのハイブリダイゼーションアッセイプローブを例示する。本実施例で用いられた本発明のハイブリダイゼーションアッセイプローブは、配列番号1のヌクレオチド配列を有し、上記の通り、5’から3’へ読む場合、ヌクレオチド14とヌクレオチド15との間(「プローブ1」)、またはヌクレオチド16とヌクレオチド17との間(「プローブ2」)のいずれかに位置する、非ヌクレオチドリンカーを含むように合成された。ハモンドプローブ(「プローブ3」)は、配列番号42のヌクレオチド塩基配列gcattggaaactattaatctagagtgtgを有し、上記のように、ヌクレオチド17とヌクレオチド18との間(5’から3’へ読む)に非ヌクレオチドリンカーを含むように合成された。
(M.pneumoniaeプローブに対する示差的加水分解率の比較)
本実施例は、二つのハモンドプローブおよび本発明による二つのプローブの示差的加水分解率を比較する。これらのハモンドプローブは、上記実施例1のプローブ3、およびプローブ3とヌクレオチド配列を共有するが、5’から3’へ読んだ場合、ヌクレオチド15とヌクレオチド16との間に位置する非ヌクレオチドリンカーを含むプローブ(「プローブ4」)であった。本発明による二つのプローブは、上記実施例1のプローブ1およびプローブ2であった。プローブ1とプローブ2、およびプローブ3とプローブ4を別々の実験で研究したが、これらの別々の実験の記述および結果を、比較を容易にするため、本実施例に共に示す。用いられた4つ全てののプローブを、「オリゴヌクレオチドの調製」と題された節において上記の通り、化学発光アクリジニウムエステルで標識した。
(M.pneumoniae核酸の増幅および検出)
本実施例は、M.pneumoniae由来の核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いて、M.pneumoniae核酸の標的配列の増幅および増幅されたrRNAの検出を説明する。詳細には、5’から3’へ読む場合、ヌクレオチド15とヌクレオチド16との間に位置した非ヌクレオチドリンカーを含むように、上記の通り、配列番号42の塩基配列を有するM.pneumoniaeハイブリダイゼーションアッセイプローブを合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、M.pneumoniae標的rRNAと同じセンスであり、六つの異なる転写媒介増幅の生成物を検出するために用いた。
(標的捕捉システムを用いるM.pneumoniae核酸の増幅および検出)
本実施例は、M.pneumoniae核酸の標的配列の固定および増幅、その後のM.pneumoniae由来の核酸に特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを用いる増幅されたrRNAの検出を示す。詳細には、配列番号1の塩基配列を有するM.pneumoniaeハイブリダイゼーションアッセイプローブを、5’から3’に読む場合、ヌクレオチド14とヌクレオチド15との間に位置した非ヌクレオチドリンカーを含むように、上記の通り、合成した。このハイブリダイゼーションアッセイプローブは、M.pneumoniae標的rRNAと同じセンスであり、転写媒介増幅の生成物を検出するために用いられた。
(標的捕捉系を使用した、異なる初期濃度のM.pneumoniae標的RNAを含むサンプルからのシグナル)
(標的捕捉系を使用した、M.pneumoniae核酸の増幅および特異的検出)
実施例4と同様に、この実施例は、M.pneumoniae核酸の標的配列の固定化および増幅、その後の、核酸に由来するM.pneumoniaeに特異的なハイブリダイゼーションアッセイプローブを使用した増幅されたrRNAの検出を示している。しかし、実施例4とは異なって、この実験は、M.pneumoniaeに加えて、M.fermentans、M.gallisepticum、M.genitalium、M.hominis、M.orale、Streptococcus pneumoniae、Ureaplasma urealyticum、Chlamydiae pneumoniae、Chlamydia psittaci、および、Chlamydia trachomatisを含む非標的生物由来の試験サンプル中に全RNAを含んでいた。この非標的生物の群は、M.pneumoniaeおよび共通の咽喉培養生物と密接に関連している生物を示す。この実験のハイブリダイゼーションアッセイプローブは実施例4のプローブと一致し、そしてこれを、転写媒介増幅産物を検出するのに使用した。
(標的捕捉系を使用した、異なる初期濃度のM.pneumoniae標的RNAと非標的RNAを含むサンプルからのシグナル)
(非標的生物由来のRNAの存在下でのM.pneumoniae標的捕捉アッセイの感受性)
この実施例は、密接に関連した生物および共通の咽喉病原体由来の非標的核酸の存在下でM.pneumoniae標的核酸を検出するための、上記の実施例4で述べられた標的捕捉アッセイの有効性を示している。この実験では、試験された各サンプルは、M.pneumoniaeの1細胞相当のRNAおよび以下の一つに等しいRNA(C.pneumoniaeの100細胞、C.psittaciまたはC.trachomatisの1,000細胞、およびM.fermentans、M.gallisepticum、M.genitalium、M.hominis、M.orale、S.pneumoniaeまたはU.urealyticumの10,000細胞)を含んでいた。それぞれ、付加された核酸を含まず、M.pneumoniaeの1細胞相当のRNAを含む、ネガティブコントロールおよびポジティブコントロールもまた、この実験中に含まれていた。100fmol/100μlの濃度での100μlハイブリダイゼーションアッセイプローブを、100fmol/μlの濃度での20μlハイブリダイゼーションアッセイプローブの代わりに使用したこと、および、200μlオイル試薬を100μlオイル試薬の代わりに使用したこと以外は、この実験は、実施例4の基本的なプロトコルに従った。この実験の結果を、以下の表15に示す。
(標的捕捉系を使用した、M.pneumoniae標的RNAおよび非標的RNAを含むサンプルからのシグナル)
(実施例7)
(M.pneumoniaeおよびM.genitalium由来のRNAの様々な濃度でのM.pneumoniae標的捕捉アッセイの感受性)
この実施例は、さらに、M.genitalium由来の非標的核酸の存在下でM.pneumoniae標的核酸の存在を検出するための、上記の実施例4で述べられた標的捕捉アッセイの有効性を実験している。この実験について、試験された各サンプルは、M.genitaliumの1個,10個または100個細胞相当のRNAを含み、そして試験されたM.pneumoniae RNAの各濃度に対し、サンプルは、M.genitaliumの100個、1,000個または10,000個細胞相当のRNAを含んでいた。各組み合せを、5つのセットで試験した。付加された核酸を含まないネガティブコントロールも含まれていた。上記の実施例6で示された相違を除いて、実施例4のプロトコルに、一般的に従った。この実験の結果を以下の表16で示す。
(標的捕捉系を使用した、M.pneumoniae標的RNAおよび非標的RNAの異なる組み合わせを含むサンプルからのシグナル)
(実施例8)
(Mycoplasma genitaliumに由来する核酸の増幅および発現)
この実施例は、4つの異なるハイブリダイゼーションアッセイプローブが異なる温度でM.genitaliumとM.pneumoniaeの単位複製配列との間で分化する能力を説明している。この実施例では、配列番号5の塩基配列を有する3つのハイブリダイゼーションアッセイプローブ(プローブ1〜3)および配列番号9の塩基配列を有する1つのハイブリダイゼーションアッセイプローブ(プローブ4)を、上記のように、非ヌクレオチドのリンカーを含むように合成した。5’〜3’を読むと、非ヌクレオチドのリンカーは、以下のような各プローブ配列の中に含まれていた:(i)プローブ1についてヌクレオチド13と14との間;(ii)プローブ2についてヌクレオチド14と15との間;(iii)プローブ3についてヌクレオチド16と17との間;そして(iv)プローブ4についてヌクレオチド9と10との間。ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、M.genitalium標的rRNAと同じセンスのものであり、および、それを、転写媒介増幅産物を検出するために使用した。
(試験された標的核酸/プローブの組み合せ)
(60℃のハイブリダイゼーション温度におけるM.genitaliumに由来する標的RNAおよびM.Pneumoniaeに由来する非標的RNAを含むサンプルからのシグナル)
Claims (92)
- 試験サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの存在決定における使用のためのハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、該プローブは、第1標的結合領域を有する第1オリゴヌクレオチドを含み、該第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3、および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなるかまたはこの塩基配列内に含まれ、
ここで、該第1標的結合領域は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成する能力があり、
ここで、該プローブは、該条件下で、Mycoplasma genitaliumに由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成する能力がなく、そして
ここで、該プローブは、該条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第1標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第1標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。 - 請求項1に記載のプローブであって、前記第1標的結合領域の前記塩基配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4の塩基配列からなる、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、前記第1標的結合領域の前記塩基配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4の塩基配列の少なくとも29の隣接する塩基を含む、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、該プローブの塩基配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4の塩基配列からなるかまたはその塩基配列内に含まれる、プローブ。
- 請求項4に記載のプローブであって、該プローブの塩基配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4の塩基配列からなる、プローブ。
- 請求項4に記載のプローブであって、該プローブの塩基配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3または配列番号4の塩基配列の少なくとも29の隣接する塩基を含む、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、該プローブは、前記第1標的結合領域に加えて少なくとも1つの塩基配列領域を含む、プローブ。
- 請求項7に記載のプローブであって、該プローブは、該プローブが前記条件下でMycoplasma pneumoniaeに由来する核酸にハイブリダイズしない場合、互いにハイブリダイズする一対の塩基配列領域を含む、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、前記第1標的結合領域は、リボフラノシル部分に対する2’−O−メチル置換を含むように改変された少なくとも1つのリボヌクレオチドを含む、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、偽ペプチド骨格は、前記第1標的結合領域の塩基の少なくとも1部分で連結する、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、検出可能な標識をさらに含む、プローブ。
- 請求項1に記載のプローブであって、前記条件が、50mM コハク酸、1%(w/v)LLS、7.5mM アルドリチオール(aldrithiol)−2、0.6M LiCl、50mM LiOH、10mM EDTA、1.5%(v/v)エチルアルコール(無水)、5.0と6.0との間のpH、および約60℃の温度を含む、プローブ。
- 前記条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸にハイブリダイズされる請求項1に記載のプローブを含む、組成物。
- 増幅条件下で、Mycoplasma由来の核酸に存在する標的配列を増幅するのに用いるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、40塩基長までであり、かつ、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35および配列番号36からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第1標的結合領域を含み、ここで、該オリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼによって認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始もしくは伸長を亢進する5’配列を必要に応じて含む、オリゴヌクレオチド。
- 請求項14に記載のオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、前記条件下で、Mycoplasmaに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、前記第1標的結合領域と重複する塩基配列領域も、該第1標的結合領域に加えて塩基配列領域も含まない、オリゴヌクレオチド。
- 前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、請求項15に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して完全に相同である、請求項15に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記5’配列を含む、請求項14に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記5’配列が、T7プロモーター配列である、請求項18に記載のオリゴヌクレオチド。
- 増幅条件下で、Mycoplasma由来の核酸に存在する標的配列を増幅するのに用いるオリゴヌクレオチドのセットであって、該一対は、以下:
40塩基長までの第1オリゴヌクレオチドであって、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第1標的結合領域を含む、第1オリゴヌクレオチド;ならびに
40塩基長までの第2オリゴヌクレオチドであって、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第2標的結合領域を含むオリゴヌクレオチド、を含み、ここで、該第1オリゴヌクレオチドおよび該第2オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、RNAポリメラーゼによって認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始もしくは伸長を亢進する5’配列を必要に応じて含む、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して少なくとも80%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32の塩基配列に対して少なくとも80%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して少なくとも80%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して少なくとも80%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して少なくとも80%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号37、配列番号38、配列番号39または配列番号40の塩基配列に対して少なくとも80%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して少なくとも80%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32の塩基配列に対して少なくとも80%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して少なくとも80%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して少なくとも80%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して少なくとも80%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号37、配列番号38、配列番号39または配列番号40の塩基配列に対して少なくとも80%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドのどちらも、前記条件下でMycoplasmaに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第1または第2標的結合領域と重複する塩基配列も、該第1または第2標的結合領域に加えて塩基配列領域も含まない、オリゴヌクレオチドのセット。
- 請求項27に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して少なくとも90%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項28に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して完全に相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32の塩基配列に対して完全に相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項27に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して少なくとも90%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項30に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して完全に相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して完全に相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項27に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して少なくとも90%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号37、配列番号38、配列番号39または配列番号40の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項32に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号21、配列番号22、配列番号23または配列番号24の塩基配列に対して完全に相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号37、配列番号38、配列番号39または配列番号40の塩基配列に対して完全に相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項27に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して少なくとも90%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項34に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して完全に相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号29、配列番号30、配列番号31または配列番号32の塩基配列に対して完全に相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項27に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して少なくとも90%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項36に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して完全に相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号33、配列番号34、配列番号35または配列番号36の塩基配列に対して完全に相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項27に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して少なくとも90%相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号37、配列番号38、配列番号39または配列番号40の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 請求項38に記載のオリゴヌクレオチドのセットであって、前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号25、配列番号26、配列番号27または配列番号28の塩基配列に対して完全に相同であり、かつ
前記第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号37、配列番号38、配列番号39または配列番号40の塩基配列に対して完全に相同である、オリゴヌクレオチドのセット。 - 前記第2オリゴヌクレオチドが、前記5’配列を含む、請求項20に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
- 前記5’配列が、T7プロモーター配列を含む、請求項40に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
- 試験サンプル中のMycoplasma生物の存在を決定するために用いるオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは、第1標的結合領域を含み、ここで、該第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも85%相同であり、該第1標的結合領域は、ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasmaに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力があり、そして、該オリゴヌクレオチドは、該条件下で、Mycoplasmaに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある該第1標的結合領域と重複する別の塩基配列も、該第1標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、オリゴヌクレオチド。
- 前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19または配列番号20の塩基配列に対して少なくとも90%相同である、請求項42に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19または配列番号20の塩基配列に対して少なくとも95%相同である、請求項42に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記第1標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19または配列番号20の塩基配列に対して完全に相同である、請求項42に記載のオリゴヌクレオチド。
- アッセイ条件下で、前記試験サンプル中において、固体支持体に直接的にかまたは間接的に結合された固定化プローブと安定なハイブリッドを形成する能力がある固定化プローブ結合領域をさらに含む、請求項42に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記固定化プローブ結合領域が、前記オリゴヌクレオチドの3’末端に位置するホモポリマー領域を含む、請求項46に記載のオリゴヌクレオチド。
- 試験サンプル中にMycoplasma pneumoniaeが存在するか否かを決定する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)該試験サンプルと請求項1に記載の前記プローブをストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で接触させ、その結果、該プローブが、該試験サンプル中のMycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成し、そしてMycoplasma genitaliumに由来する核酸とは検出可能なハイブリッドを形成しない工程:ならびに
b)該試験サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの存在または非存在の指標として、該試験サンプル中に該ハイブリッドが存在するか否かを決定する工程を包含する、方法。 - Mycoplasmaに由来する核酸に存在する標的配列を増幅する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)Mycoplasmaに由来する核酸の含有が疑われる試験サンプルと請求項14に記載のオリゴヌクレオチドを接触させる工程:および
b)該試験サンプルを該標的配列を増幅するのに十分な条件に暴露する工程を包含する、方法。 - 請求項49に記載の方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、前記試験サンプルにハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供し、ここで、該プローブが、該ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と検出のために安定なハイブリッドを形成し、そしてMycoplasma genitaliumに由来する核酸と検出のために安定なハイブリッドを形成しない工程をさらに含む、方法。
- 請求項50に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブが、第2標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなるかまたはこの塩基配列内に含まれ、ここで、該プローブは、前記ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第2標的結合領域と重複する別の塩基配列も、該第2標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、方法。
- 請求項51に記載の方法であって、ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある捕捉プローブを前記試験サンプルに提供する工程をさらに含む、方法。
- 請求項52に記載の方法であって、前記捕捉プローブは、第3標的結合領域を含み、ここで、該第3標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも85%相同であって、ここで、該捕捉プローブは、前記ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasmaに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第3標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第3標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、方法。
- Mycoplasmaに由来する核酸に存在する標的配列を増幅する方法であって、該方法は、以下の工程:
a)Mycoplasmaに由来する核酸を含むことが疑われる試験サンプルと請求項20に記載の第1オリゴヌクレオチドおよび第2オリゴヌクレオチドを接触させる工程:ならびに
b)該試験サンプルを該標的配列を増幅するのに十分な条件に暴露する工程を包含する、方法。 - 請求項54に記載の方法であって、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、前記試験サンプルにハイブリダイゼーションアッセイプローブを提供し、ここで、該プローブは、該ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と検出のために安定なハイブリッドを形成し、そして、Mycoplasma genitaliumに由来する核酸と検出のために安定なハイブリッドを形成しない工程をさらに含む、方法。
- 請求項55に記載の方法であって、前記ハイブリダイゼーションアッセイプローブは、第3標的結合領域を有するオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第3標的結合領域の塩基配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3および配列番号4からなる群から選択される塩基配列からなるかまたはこの塩基配列内に含まれ、ここで、該プローブは、前記ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第3標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第3標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、方法。
- 請求項56に記載の方法であって、ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある捕捉プローブを前記試験サンプルに提供する工程をさらに含む、方法。
- 請求項57に記載の方法であって、前記捕捉プローブは、第4標的結合領域を含み、ここで、該第4標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に少なくとも85%相同であって、ここで、該捕捉プローブは、前記ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasmaに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第4標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第4標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、方法。
- 試験サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの存在の決定において使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項1に記載のプローブ;ならびに
40塩基長までの第2オリゴヌクレオチドであって、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第2標的結合領域を含み、ここで、該第2オリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼによって認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始もしくは伸長を亢進する5’配列を必要に応じて含む、第2オリゴヌクレオチド、
をパッケージ化された組み合わせ中に含む、キット。 - 第3オリゴヌクレオチドをさらに含む請求項59に記載のキットであって、該第3オリゴヌクレオチドは、第3標的結合領域を含み、ここで、該第3標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に少なくとも85%相同であって、該第3標的結合領域は、ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力があり、そして該第3オリゴヌクレオチドは、該条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第3標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第3標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、キット。
- 試験サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの存在の決定において使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項1に記載の前記プローブ;
40塩基長までの第2オリゴヌクレオチドであって、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第2標的結合領域を含む、第2オリゴヌクレオチド;ならびに
40塩基長までの第3オリゴヌクレオチドであって、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第3標的結合領域を含み、ここで、該第2オリゴヌクレオチドおよび第3オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、RNAポリメラーゼによって認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始もしくは伸長を亢進する5’配列を必要に応じて含む、第3オリゴヌクレオチド、
をパッケージ化された組み合わせ中に含む、キット。 - 第4オリゴヌクレオチドをさらに含む請求項61に記載のキットであって、該第4オリゴヌクレオチドは、第4標的結合領域を含み、ここで、該第4標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に少なくとも85%相同であって、該第4標的結合領域は、ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力があり、そして該第4オリゴヌクレオチドは、該条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第4標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第4標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、キット。
- 試験サンプル中のMycoplasma pneumoniaeの存在の決定において使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項1に記載の前記プローブ;ならびに
第2オリゴヌクレオチドであって、該第2オリゴヌクレオチドは、第2標的結合領域を含み、ここで、該第2標的結合領域の塩基配列が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも85%相同であり、ここで、該第2標的結合領域は、ハイブリダイゼーション条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力があり、そして、該第2オリゴヌクレオチドは、該条件下で、Mycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成する能力がある、該第2標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も、該第2標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、第2オリゴヌクレオチド、
をパッケージ化された組み合わせ中に含む、キット。 - 試験サンプル中のMycoplasmaに由来する核酸の存在の決定において使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項42に記載のオリゴヌクレオチドからなる第1オリゴヌクレオチド;ならびに
40塩基長までの第2オリゴヌクレオチドであって、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第2標的結合領域を含み、ここで、該第2オリゴヌクレオチドは、RNAポリメラーゼによって認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始もしくは伸長を亢進する5’配列を必要に応じて含む、第2オリゴヌクレオチド、
をパッケージ化された組み合わせ中に含む、キット。 - 試験サンプル中のMycoplasmaに由来する核酸の存在の決定において使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項42に記載のオリゴヌクレオチドからなる第1オリゴヌクレオチド;
40塩基長までの第2オリゴヌクレオチドであって、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第2標的結合領域を含む、第2オリゴヌクレオチド;ならびに
40塩基長までの第3オリゴヌクレオチドであって、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対して少なくとも80%相同な塩基配列を有する第3標的結合領域を含み、ここで、該第2オリゴヌクレオチドおよび第3オリゴヌクレオチドの少なくとも1つは、RNAポリメラーゼによって認識されるか、またはRNAポリメラーゼによる開始もしくは伸長を亢進する5’配列を必要に応じて含む、第3オリゴヌクレオチド、
をパッケージ化された組み合わせ中に含む、キット。 - 試験サンプル中でMycoplasma genitaliumの存在を決定する際に使用するためのハイブリダイゼーションアッセイプローブであって、該プローブは第一標的結合領域を有する第一オリゴヌクレオチドを含み、ここで、該第一標的結合領域の塩基配列は、配列番号5、配列番号6、配列番号7および配列番号8からなる郡から選択される塩基配列からなるか、または、これらの中に含まれており、
ここで、該第一標的結合領域は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができ、
ここで、該プローブは、該条件下でMycoplasma pneumoniaeに由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成することができず、そして、
ここで、該プローブは、該条件下でMycoplasma genitaliumから由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる該第一標的結合領域と重復する別の塩基配列領域も、該第一標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、
ハイブリダイゼーションアッセイプローブ。 - 請求項66に記載のプローブであって、ここで、前記第一標的結合領域の塩基配列は、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8の塩基配列からなる、
プローブ。 - 請求項66に記載のプローブであって、ここで前記第一標的結合領域の塩基配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12の塩基配列を含む、
プローブ。 - 請求項68に記載のプローブであって、ここで、前記第一標的結合領域の塩基配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12の塩基配列からなる、
プローブ。 - 請求項66に記載のプローブであって、ここで、前記プローブの塩基配列は、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8の塩基配列からなるか、あるいは、これらの中に含まれる、
プローブ。 - 請求項70に記載のプローブであって、ここで、前記プローブの塩基配列は、配列番号5、配列番号6、配列番号7または配列番号8の塩基配列からなる、
プローブ。 - 請求項70に記載のプローブであって、ここで、前記プローブの塩基配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12の塩基配列を含む、
プローブ。 - 請求項72に記載のプローブであって、ここで、前記プローブの塩基配列は、配列番号9、配列番号10、配列番号11または配列番号12の塩基配列からなる、
プローブ。 - 請求項66に記載のプローブであって、ここで、前記プローブが、前記第一標的結合領域に加えて少なくとも一つの塩基配列領域を含む、
プローブ。 - 請求項74に記載のプローブであって、ここで、前記プローブが、前記条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸にハイブリダイズされない場合、該プローブは互いにハイブリダイズする一対の塩基配列領域を含む、
プローブ。 - 請求項66に記載のプローブであって、ここで、前記第一標的結合領域は、リボフラノシル部分に対する2’−O−メチル置換を含むように改変された、少なくとも一つのリボヌクレオチドを含む、
プローブ。 - 請求項66に記載のプローブであって、ここで、偽ペプチド骨格が、前記第一標的結合領域の塩基の少なくとも一部分と結合する、
プローブ。 - 検出可能な標識をさらに含む、請求項66に記載のプローブ。
- 請求項66に記載のプローブであって、ここで、前記条件は、50mM コハク酸、1%(w/v)LLS、7.5mM アルドリチオール(aldrithiol)−2、0.6M LiCl、50mM LiOH、10mM EDTA、1.5%(v/v)エチルアルコール(無水)、5.0と6.0との間のpH、そして、約60℃の温度を含む、
プローブ。 - 前記条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸にハイブリダイズされた請求項66に記載のプローブを含む、組成物。
- Mycoplasma genitaliumが試験サンプル中に存在するか否かを決定するための方法であって、該方法は以下の工程:
a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項66に記載のプローブと試験サンプルとを接触させる工程であって、その結果、該プローブは、該試験サンプル中に存在するMycoplasma genitaliumに由来する核酸と検出可能なハイブリッドを形成し、かつ該試験サンプル中に存在するMycoplasma pneumoniaeに由来する核酸とは検出可能なハイブリッドを形成しない、工程;および
b)該ハイブリッドが、該試験サンプル中に存在するか否かを、該試験サンプル中のMycoplasma genitaliumの存在または非存在の指標として決定する工程、
を包含する、方法。 - Mycoplasma genitaliumが、試験サンプル中に存在するか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
a)40塩基長までであり、そして、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35および配列番号36からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも80%相同である塩基配列を有する第2標的結合領域を含む第2オリゴヌクレオチドと該試験サンプルとを接触させる工程であって、ここで、該オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、RNAポリメラ−ゼによって認識されるかまたはRNAポリメラ−ゼによる開始もしくは伸長を高める5’配列を含む、工程;
b)M.genitaliumに由来する核酸中に存在する標的配列を増幅するために十分な条件に対し、該試験サンプルを暴露する工程;および
c)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項66に記載のプローブを該試験サンプルに提供する工程、
を包含する、方法。 - 請求項82に記載の方法であって、ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成できる捕捉プローブを前記試験サンプルに提供する工程をさらに包含する、
方法。 - 請求項83に記載の方法であって、ここで、前記捕捉プローブは、第3標的結合領域を含み、ここで、該第3標的結合領域の塩基配列は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも85%相同であり、ここで、該捕捉プローブは、前記ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる該第3標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も該第3標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、
方法。 - Mycoplasma genitaliumが、試験サンプル中に存在するか否かを決定するための方法であって、該方法は、以下の工程:
a)第2オリゴヌクレオチドおよび第3オリゴヌクレオチドと該試験サンプルとを接触させる工程であって、ここで:
該第2オリゴヌクレオチドは、40塩基長までであり、そして、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも80%相同である塩基配列を有する第2標的結合領域を含み;そして
該第3オリゴヌクレオチドは、40塩基長までであり、そして、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択された塩基配列に対し、少なくとも80%相同である塩基配列を有する第3標的結合領域を含み、ここで、該第2オリゴヌクレオチドおよび第3オリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、必要に応じて、RNAポリメラ−ゼによって認識されるかまたはRNAポリメラ−ゼによる開始もしくは伸長を高める5’配列を含む、工程;
b)M.genitaliumに由来する核酸中に存在する標的配列を増幅するために十分な条件に対し、該試験サンプルを暴露する工程;および
c)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で請求項66に記載のプローブを該試験サンプルに提供する工程、
を包含する、方法。 - 請求項85に記載の方法であって、ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成できる捕捉プローブを前記試験サンプルに提供する工程をさらに包含する、
方法。 - 請求項86に記載の方法であって、ここで、前記捕捉プローブは、第4標的結合領域を含み、ここで、該第4標的結合領域の塩基配列は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択された塩基配列に対し、少なくとも85%相同であり、ここで、該捕捉プローブは、前記ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる該第4標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も該第4標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、
方法。 - 試験サンプル中でMycoplasma genitaliumの存在を決定する際に使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項66に記載のプローブ;および
40塩基長までであり、そして、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも80%相同である塩基配列を有する第2標的結合領域を含む第2オリゴヌクレオチドであって、ここで、該第2オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、RNAポリメラ−ゼによって認識されるかまたはRNAポリメラ−ゼによる開始もしくは伸長を高める5’配列を含む、第2オリゴヌクレオチド、
をパッケージされた組み合せの中に含む、キット。 - 第3オリゴヌクレオチドをさらに含む請求項88に記載のキットであって、該第3オリゴヌクレオチドは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択された塩基配列に対し、少なくとも85%相同である塩基配列を有する第3標的結合領域を含み、ここで、該第3オリゴヌクレオチドは、該条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができ、そして、ここで、該第3オリゴヌクレオチドは、該条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる該第3標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も該第3標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、
キット。 - 試験サンプル中でMycoplasma genitaliumの存在を決定する際に使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項66に記載のプローブ;および
40塩基長までであり、そして、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27および配列番号28からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも80%相同である塩基配列を有する第2標的結合領域を含む、第2オリゴヌクレオチド;および
40塩基長までであり、そして、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39および配列番号40からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも80%相同である塩基配列を有する第3標的結合領域を含む第3オリゴヌクレオチドであって、ここで、該第2オリゴヌクレオチドおよび第3オリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、必要に応じて、RNAポリメラ−ゼによって認識されるかまたはRNAポリメラ−ゼによる開始もしくは伸長を高める5’配列を含む、第3オリゴヌクレオチド、
をパッケージされた組み合せの中に含む、キット。 - 第4オリゴヌクレオチドをさらに含む請求項90に記載のキットであって、該第4オリゴヌクレオチドは、第4標的結合領域を含み、ここで、該第4標的結合領域の塩基配列は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも85%相同であり、ここで、該第4標的結合領域は、ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができ、そして、ここで、該第4オリゴヌクレオチドは、該条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができ、そして、ここで、該第4オリゴヌクレオチドは、該条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる該第4標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も該第4標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、
キット。 - 試験サンプル中でMycoplasma genitaliumの存在を決定する際に使用するためのキットであって、該キットは、以下:
請求項66に記載のプローブ;および
第2オリゴヌクレオチドであって、該第2オリゴヌクレオチドは第2標的結合領域を含み、ここで、該第2標的結合領域の塩基配列は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19および配列番号20からなる群から選択される塩基配列に対し、少なくとも85%相同であり、ここで、該第2標的結合領域は、ハイブリダイゼーション条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができ、そして、ここで、該第2オリゴヌクレオチドは、該条件下でMycoplasma genitaliumに由来する核酸と安定なハイブリッドを形成することができる該第2標的結合領域と重複する別の塩基配列領域も該第2標的結合領域に加えて別の塩基配列領域も含まない、第2オリゴヌクレオチド、
をパッケージされた組み合せの中に含む、キット。
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