JP2005507868A - 虚血後の白血球内皮相互作用の調節 - Google Patents

Abstract

本発明は、虚血（例えば、発作）後の再灌流によって引き起こされる、組織または器官（例えば、脳）に対する損傷の減少または予防のための方法および組成物に関する。本発明はまた、Ｐ−セレクチンアンタゴニストを投与することによる被験体における虚血および／または再灌流から引き起こされる梗塞の大きさの減少のための方法および組成物を提供する。本発明はさらに、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドまたはそのフラグメント、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体または抗Ｐ−セレクチン抗体を投与することにより、被験体における白血球ローリング、細胞間接着、および血管への細胞接着を調節（例えば、減弱）するための方法を提供する。本発明はまた、虚血性障害および再灌流損傷により引き起こされる組織または器官に対する損傷を減少または予防し得る化合物を同定する方法を提供する。

Description

【背景技術】
【０００１】
本願は、２００１年８月３日に出願された、米国仮出願第６０／３０９，８１６号からの優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
発作は、米国における死亡および成人障害の最大の要因である。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｏｋｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによると、発作は、米国における３番目の死因であり、ほぼ１６０，０００人が死亡している。米国において、毎年、約７２０，０００人が発作に苦しんでおり、そのうちの６００，０００以上が、虚血性発作である。虚血性発作は、血液塊が、脳への血流をブロックする場合に生じる。生じる酸素枯渇（すなわち、虚血）は、細胞死を導く。脳の罹患した領域への血流が、自然にかまたは血栓溶解薬による処置を通して回復され得る。脳の罹患した領域への血流の回復は、再灌流と呼ばれる。再灌流は、しばしば、急性炎症応答を誘発し、これは、発作関連脳損傷の重要な部分を導くと考えられる。この損傷（再灌流損傷と呼ばれる）は、主に、好中球により引き起こされる。
【０００３】
白血球細胞が、一過性の虚血の後の脳に対する損傷の悪化に寄与していることを示す、多くの証拠が存在する。接着分子が、虚血および再灌流損傷に対する重要な寄与分子であるという証拠もまた存在する。多くの動物研究は、虚血および再灌流損傷における白血球の関与の調節が、その後の脳への損傷の大きさに影響を与えることを実証した。白血球は、病巣および全体的な虚血モデルにおける虚血／再灌流損傷に対する保護を提供することが実証された（Ｂｅｄｎａｒら（１９９１）Ｓｔｒｏｋｅ ２２：４４−５０；Ｄｕｋｔａら（１９８９）Ｓｔｒｏｋｅ ２０：３９０−５；Ｍａｔｓｕｏら（１９９４）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓａｒｃｈ ６５６：３４４−５２）。後の研究者は、ブロッキングインテグリンが、一過性の虚血後の脳に対する損傷の大きさに対する効果を有することを実証した（Ｂｏｗｅｒｓら（１９９３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １１９：２１５−９；Ｃｈｏｐｐら（１９９４）Ｓｔｒｏｋｅ ２５：８６９−７５；Ｊｉａｎｇら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １５：８５−９３；Ｚｈａｎｇら（１９９４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４４：１７４７−５１）。
【０００４】
セレクチン（例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、およびＬ−セレクチン）は、標的細胞（例えば、血小板および白血球）の表面上に存在するリガンドとの特異的相互作用を通して細胞間接着を媒介すると考えられている。一般的には、セレクチンのリガンドは、炭化水素部分の少なくとも一部（例えば、シアリルＬｅｗｉｓ^ｘ（ｓＬｅ^ｘ）およびシアリルＬｅｗｉｓ^ａ（ｓＬｅ^ａ））を含む。Ｐ−セレクチンは、非シアレート形態のＬｅｗｉｓ^ｘ血液型抗原を含み、シアリルＬｅｗｉｓ^ｘに対するより高い親和性を有する炭化水素に結合する。Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）（Ｅ−セレクチンおよびＬ−セレクチンにも結合し得る高親和性Ｐ−セレクチンリガンド）は、白血球により発現され、そして白血球、血小板、および内皮細胞型の間の細胞接着を媒介する（米国特許第５，８４３，７０７号および米国特許第５，８２７，８１７号）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、一部、Ｐ−セレクチンアンタゴニスト（例えば、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）が、一過性虚血後の大脳皮質における細静脈に沿った白血球ローリングおよび血小板への白血球接着と干渉するという発見に基づく。例えば、虚血前、再灌流前、または再灌流中に被験体にＰ−セレクチンアンタゴニスト（例えば、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）を投与することによる、Ｐ−セレクチンとＰ−セレクチンリガンドとの相互作用のブロックは、脳への損傷（一過性虚血により引き起こされる、脳における梗塞体積を含む）の大きさを減少するのに効果的である。
【０００６】
従って、本発明は、被験体において、虚血（例えば、発作）後の再灌流損傷により引き起こされる組織または器官（例えば、脳）への損傷を減少するために使用するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、被験体において、虚血後の再灌流から生じる梗塞（例えば、皮質梗塞）の大きさを減少するために使用するための方法および組成物を提供する。虚血を生じ、従って再灌流損傷を生じ得る他の虚血性障害としては、例えば、腸間膜および末梢血管疾患、器官移植、循環性ショック、および血栓性障害（例えば、血栓塞栓症、深静脈血栓症、肺性塞栓症、発作、心筋梗塞、流産、抗トロンビンＩＩＩ不全と関連する血栓形成傾向、プロテインＣ不全、プロテインＳ不全、活性化プロテインＣに対する耐性、異常フィブリノーゲン血症、フィブリン溶解性障害、ホモシスチン尿症、妊娠、炎症性障害、骨髄増殖性障害、動脈硬化、アンギナ（例えば、不安定アンギナ）、汎発性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球疾患、および糸球体腎炎が挙げられる。
【０００７】
本発明は、少なくとも一部、対象（Ｐ−セレクチンリガンド分子もしくはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質、抗Ｐ−セレクチン抗体、および抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体）を含む）にＰ−セレクチンアンタゴニストを投与することによるＰ−セレクチンアンタゴニズムが、細胞接着（例えば、細胞間接着、（例えば、白血球内皮接着および白血球血小板接着）および血管への細胞（例えば、白血球）接着）を阻害すること、および一過性の虚血後の脳の表面上の細静脈における白血球ローリングを減弱することによって、一過性虚血および再灌流により引き起こされる脳への損傷および梗塞の大きさを効果的に減少させるという発見に基づいている。本発明のＰ−セレクチンリガンド分子は、本明細書中で、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）分子と称される。
【０００８】
１つの局面において、本発明は、例えば、虚血後の被験体の脳における、再灌流損傷を予防または減少させるための方法を提供する。この方法は、Ｐ−セレクチンアンタゴニストを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する。１つの実施形態において、被験体は、発作に罹患している。別の実施形態において、再灌流損傷は、皮質梗塞である。さらなる実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、虚血前に被験体に投与される。別の実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、再灌流の間に被験体に投与される。好ましい実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、再灌流の前に被験体に投与される。なお別の実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、有効量の接着分子の１つ以上のインヒビター（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、またはＣＤ−１８のインヒビター）と組み合わせて被験体に投与される。さらなる実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、またはストレプトキナーゼ、抗血小板剤（例えば、アスピリンまたはヘパリン）、抗凝固剤（例えば、ワルファリン）、または細胞保護剤と組み合わせて投与される。
【０００９】
１つの実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質である。別の実施形態において、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、ヒトＰ−セレクチンリガンドタンパク質である。好ましい実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質もしくはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１）、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ）である。別の実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、抗Ｐ−セレクチン抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメントである。なお別の実施形態において、この組成物はさらに、薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【００１０】
１つの実施形態において、被験体は哺乳動物（例えば、ヒト）である。別の実施形態において、本発明の方法は、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の細胞外ドメインの少なくとも一部（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸４２〜６０、４２〜８８、４２〜１１８、４２〜１８９、または４２〜３１０）を含む、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の投与を包含する。別の実施形態において、このタンパク質は、配列番号２に示されるＰ−セレクチンリガンドタンパク質の少なくとも細胞外ドメインを含む、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質である。さらなる実施形態において、本発明は、免疫グロブリン（例えば、ヒトＩｇＧ）のＦｃ部分をさらに含む、可溶性タンパク質を提供する。関連する実施形態において、この可溶性タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ酸６０のアミノ酸配列を含み、そのＣ末端で、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されている可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質である。関連する実施形態において、この可溶性タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ酸８８のアミノ酸配列を含み、そのＣ末端で、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されている可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質である。さらなる実施形態において、免疫グロブリンのＦｃ部分は、連結配列を通して、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質に融合されている。
【００１１】
別の局面において、本発明は、有効量のＰ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ）、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または抗Ｐ−セレクチン抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント）を含む組成物を投与することによる、被験体における虚血後の脳における梗塞を予防または減少する方法を提供する。さらなる局面において、本発明は、有効量のＰ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ）、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または抗Ｐ−セレクチン抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント）を含む組成物を投与することによる、被験体における発作後の脳に対する損傷を予防または減少するための方法を提供する。なお別の局面において、本発明は、有効量のＰ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１、または組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ）、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント、またはＰ−セレクチン抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント）を含む組成物を投与することによる、虚血後の被験体における血管に対する細胞接着を阻害する方法を提供する。１つの実施形態において、血管は、被験体の脳に存在する。別の実施形態において、細胞は、白血球である。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、有効量のＰ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ）、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または抗Ｐ−セレクチン抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント）を含む組成物を投与することによる、虚血後の被験体における、細胞間接着（例えば、白血球血小板接着）を阻害するための方法を提供する。
【００１３】
なお別の局面において、本発明は、例えば、一過性虚血後の、例えば、大脳皮質における細静脈に沿った血管における再灌流損傷を予防もしくは減少し得る、および／または白血球ローリングを減弱し得る化合物を同定する方法を提供する。この方法において、ＰＳＧＬ−１ポリペプチド活性を調節する化合物の能力がアッセイされる。１つの実施形態において、ＰＳＧＬ−１ポリペプチド活性を調節する化合物の能力は、細胞接着（例えば、細胞間接着（例えば、白血球内皮細胞接着または白血球血小板接着）および血管への細胞（例えば、血小板または白血球）の接着）における減少を検出することにより決定される。
【００１４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかである。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド分子が、虚血発作の動物モデルにおける一過性虚血後の大脳皮質における細静脈に沿った白血球ローリングを調節（例えば、減弱）するという発見に基づく。本明細書中で使用する場合、「白血球ローリング」は、接着細胞を強固にする前およ「び内皮組織への白血球の移動の前の、血管の内皮細胞への白血球の弱い接着および血管の内皮細胞に沿った白血球のローリングを含む。被験体への可溶性Ｐ−セレクチンリガンド分子の投与はまた、虚血後の再灌流から生じる皮質梗塞の大きさを有意に減少させる。従って、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド分子の投与は、虚血（例えば、発作）および再灌流損傷により引き起こされる損傷から被験体の脳を保護する。
【００１６】
従って、本発明は、虚血（例えば、発作）の後の再灌流により引き起こされる損傷、例えば、組織または器官（例えば、脳）への損傷の予防または減少のための方法および組成物を提供する。本発明はまた、Ｐ−セレクチンアンタゴニスト（例えば、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質、もしくはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１）、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体、もしくは生物学的に活性なそのフラグメント、または抗Ｐ−セレクチン抗体もしくは生物学的に活性なそのフラグメント）の投与による、インビボでの再灌流損傷の調節（例えば、予防または減少）のための方法および組成物を提供する。Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、虚血の前、再灌流の前、または再灌流の間に投与され得る。本発明の方法において使用されるＰ−セレクチンリガンドタンパク質は、本明細書中で、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）分子と称される。
【００１７】
本明細書中で使用される場合、虚血障害は、血流が遮断または中断されて、任意の器官、組織または細胞への血液供給および酸素供給の欠如を生じる、任意の障害または状態である。多数の医療的介入（例えば、バイパス手術）の間の血流の中断は、虚血を生じ得る。虚血は、罹患した心血管組織によって引き起こされ得、そして虚血心疾患におけるように、心血管組織に影響を与え得る。しかし、虚血は、酸素供給の欠如に苦しむ任意の器官で生じ得る。虚血を生じ、従って、再灌流損傷を生じ得る他の虚血障害としては、例えば、以下が挙げられる：心筋虚血、腸間膜および腹腔の血管疾患、臓器移植、循環器発作および血栓障害（例えば、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症）、心筋梗塞、流産、抗トロンビンＩＩＩ欠損、プロテインＣ欠損、プロテインＳ欠損、活性化プロテインＣに対する耐性、異常フィブリノーゲン血症、フィブリン溶解性障害に関連する血栓形成傾向、ホモシスチン尿症、妊娠、炎症障害、骨髄増殖性障害、アテローム硬化症、アンギナ（例えば、不安定狭心症）、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球症および糸球体腎炎。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「再灌流」とは、天然にかまたは血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼまたは他の薬剤（例えば、抗凝固剤もしくは抗血小板剤））による誘導によってかのいずれかでの、虚血血管への血流の回復を含む。本明細書中で使用する場合、「再灌流損傷」は、組織不全および組織梗塞（例えば、皮質梗塞）を生じ得る虚血および再灌流から生じる、器官、組織（例えば、血管）もしくは細胞の破壊またはこれらの損傷のいずれかを含む。おそらく、血小板および内皮を白血球に対して接着性にするトロンビンおよびサイトカインによる血小板および内皮の活性化に一部起因して、再灌流損傷は、被験体における炎症応答（細胞−細胞接着（例えば、白血球−内皮細胞接着および白血球−血小板接着）および虚血領域における白血球浸潤（白血球ローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）））によって、少なくとも一部、引き起こされる（Ｒｏｍｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ６７：１０１６−１０２３、１９８３）。白血球ローリングの後、これらの接着性白血球は、内皮を通って遊走して、再灌流の間に虚血組織を破壊し得る。従って、白血球ローリングの減少は、再灌流によって引き起こされる組織および器官に対する損傷の減少を生じる。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「Ｐ−セレクチンアンタゴニスト」は、例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンとＰ−セレクチンリガンドタンパク質との間の相互作用を阻害することによって、例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンを発現する内皮細胞とＰＳＧＬ発現白血球で活性化された血小板との間の相互作用を阻害することによって、Ｐ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンをアンタゴナイズし得る、任意の薬剤を含む。例えば、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、Ｐ−セレクチンリガンド分子またはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、組換えＰＳＧＬ−Ｉｇ））および低分子、抗Ｐ−セレクチン抗体ならびにＰ−セレクチンリガンド抗体が挙げられる。好ましい実施形態において、Ｐ−セレクチンリガンドは、可溶性である。
【００２０】
本明細書中で交換可能に使用される場合、「Ｐ−セレクチンリガンド活性」、「ＰＳＧＬ−１活性」、「ＰＳＧＬ−１の生物学的活性」または「ＰＳＧＬ−１の機能的活性」は、標準的な技術に従ってインビボまたはインビトロで測定されるような、ＰＳＧＬ−１応答性細胞（例えば、血小板、白血球または内皮細胞）に対して、ＰＳＧＬ−１タンパク質、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドまたはＰＳＧＬ−１核酸分子によって発揮される活性を含む。ＰＳＧＬ−１活性は、直接的活性（例えば、ＰＳＧＬ−１標的分子（例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン）との会合）であり得る。本明細書中で使用される場合、「基質」または「標的分子」または「結合パートナー」は、ＰＳＧＬ−１タンパク質が天然に相互作用または結合して、ＰＳＧＬ−１媒介性の機能（例えば、細胞遊走または細胞接着の調節）が達成される分子（例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン）である。ＰＳＧＬ−１標的分子は、非ＰＳＧＬ−１分子またはＰＳＧＬ−１タンパク質もしくはＰＳＧＬ−１ポリペプチドであり得る。このような標的分子の例としては、ＰＳＧＬ−１タンパク質と同じシグナル伝達経路中のタンパク質（例えば、このタンパク質は、Ｐ−セレクチン結合の調節に関与する経路中のＰＳＧＬ−１タンパク質の上流（活性の刺激因子およびインヒビターの両方を含む）または下流で機能し得る）が挙げられる。あるいは、ＰＳＧＬ−１活性は、間接的活性（例えば、ＰＳＧＬ−１標的分子（例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン）とＰＳＧＬ−１との相互作用によって媒介される細胞シグナル伝達活性）である。Ｐ−セレクチンの生物学的活性は、本明細書中に記載され、そしてこれには、例えば、以下の１つ以上の活性が挙げられる：１）Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合するかまたはこれらと相互作用する活性；２）Ｐ−セレクチン結合またはＥ−セレクチン結合を調節する活性；３）細胞接着（例えば、細胞間接着（例えば、白血球−内皮細胞接着および白血球−血小板接着）および血管（例えば、脳の血管）への細胞（例えば、白血球）の接着）を調節（例えば、減少または減弱）する活性；４）血小板および内皮細胞への白血球の補給を調節する活性；５）細胞（例えば、白血球または血小板）の遊走を調節する活性；６）例えば、脳の血管における白血球のローリングを調節（例えば、減少または減弱）する活性；７）虚血後の再灌流損傷を調節（例えば、減少または減弱）する活性；ならびに８）再灌流後の、例えば、脳内の梗塞の大きさを調節（例えば、減少または減弱）する活性。
【００２１】
被験体へのＰ−セレクチンアンタゴニストの投与は、虚血前、再灌流前または再灌流の間であり得る。好ましい実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストの投与は、虚血後かつ再灌流前である。Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、特定の時間（例えば、再灌流前および再灌流の間）で、単一用量または複数用量で投与され得る。好ましい実施形態において、Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、静脈内投与される。
【００２２】
Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、単独でか、あるいは血栓溶解剤（例えば、組織プラスミノゲンアクチベータ（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼ）、抗血小板剤（例えば、アスピリンまたはヘパリン）、抗凝固剤（例えば、ワルファリン）もしくは細胞保護剤と組み合わせてか、または接着分子の１以上のインヒビター（例えば、Ｅ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１またはＣＤ−１８のインヒビター）と組み合わせて、投与され得る。
【００２３】
本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１分子は、米国特許第５，８２７，８１７号（この内容は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００２４】
本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１分子は、以下の末端糖質の１つ以上を含み得る糖タンパク質である：
【００２５】
【化１】

【００２６】
【化２】

ここで、Ｒは、糖質鎖（これは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質に直接共有結合する）または脂質部分（これは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質に共有結合する）のいずれかの残りを示す。本発明の方法において使用されるＰ−セレクチンリガンド糖タンパク質は、さらに、硫酸化され得るかあるいは翻訳後修飾され得る。ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞中で発現される場合、全長Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質（配列番号２のアミノ酸１〜４０２）または成熟Ｐ−セレクチン（配列番号２のアミノ酸４２〜４０２）は、非還元的ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって示されるような、２２０ｋＤの見かけの分子量を有するホモダイマーまたは二価のタンパク質である。
【００２７】
ＰＳＧＬ−１は、内皮細胞および血小板に対して、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンについてのリガンドとして作用する糖タンパク質である。ＰＳＧＬ−１のＤＮＡ配列は、配列番号１に示される。ＰＳＧＬ−１の完全アミノ酸配列（すなわち、成熟ペプチド＋リーダー配列）は、配列番号２のアミノ酸１〜アミノ酸４０２において示されるアミノ酸配列によって特徴付けられる。成熟ＰＳＧＬ−１タンパク質は、配列番号２のアミノ酸４２〜４０２において示されるアミノ酸配列によって特徴付けられる。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質」または「可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質」は、ｓＬｅ^ｘを構成する糖質を含む、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１、またはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント）をいう。本発明の方法において使用される可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、好ましくは、ＰＳＧＬ−１の細胞外ドメイン（配列番号２のほぼアミノ酸１８〜ほぼアミノ酸３１０）またはその生物学的に活性なフラグメントを少なくとも含む。Ｐ−セレクチンリガンド分子の他の可溶性形態は、例えば、配列番号２のアミノ酸４２〜３１０において示されるアミノ酸配列またはその生物学的に活性なフラグメントによって特徴付けられる。ＰＳＧＬ−１の細胞外ドメインの生物学的に活性なフラグメントとしては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の、アミノ酸４２〜６０、４２〜８８、４２〜１１８および４２〜１８９が挙げられる。本発明の方法において使用される可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質は、好ましくは、モノマーまたはダイマーのＰＳＧＬ−１タンパク質である。
【００２９】
本発明の方法の１実施形態において、本発明の方法のＰ−セレクチンリガンド分子の可溶性形態は、「リンカー」配列を介して、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ分子）のＦｃ部分と融合されて、融合タンパク質を形成し得る。他の免疫グロブリンアイソタイプもまた、このような融合タンパク質を生成するために使用され得る。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、ＰＳＧＬ−１タンパク質分子の細胞外ドメイン、ｓＬｅ^ｘを構成する糖類からなるキメラ分子であり、そしてリンカー配列を介してヒトＩｇＧのＦｃ部分へと融合される。
【００３１】
ＰＳＧＬ−１のモノマー形態は、例えば、配列番号２の３１０位のシステインがセリンまたはアラニンで置換されるように、ＰＳＧＬ−１のアミノ酸配列を変更することによってか、あるいは当該分野で公知の他の方法によって、生成され得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、ダイマーＰＳＧＬ−１（ｄｉｍＰＳＧＬ−１）融合タンパク質は、成熟ＰＳＧＬ−１のＮ末端の４７アミノ酸によって生成され、それによって、Ｐ−セレクチンに対しては高い親和性を維持するが、Ｌ−セレクチンおよびＥ−セレクチンに対する結合を低減する。ＰＳＧＬ−１のＮ末端の４７アミノ酸は、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ_１）のＦｃ部分に連結され、それによって、ネイティブのＰＳＧＬ−１分子において観察される二価の提示を回復する。最後に、Ｆｃレセプター結合および補体固定効果または機能を無効にするために、ＩｇＧ−Ｆｃ領域の２つのアミノ酸が変異される（実施例１を参照のこと）。
【００３３】
本発明の方法は、遺伝子コードの縮重に起因して配列番号１に示されるヌクレオチド配列とは異なり、従って、配列番号１に示されるヌクレオチド配列によってコードされるのと同じＰＳＧＬ−１タンパク質をコードする、核酸分子の使用を包含する。別の実施形態において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００３４】
本発明の方法は、ヒトＰＳＧＬ−１の対立遺伝子改変体（例えば、機能的対立遺伝子改変体または非機能的対立遺伝子改変体）の使用をさらに含む。機能的対立遺伝子改変体は、本明細書中に記載されるＰＳＧＬ−１活性（例えば、Ｐ−セレクチン結合またはＥ−セレクチン結合）を維持するヒトＰＳＧＬ−１タンパク質の、天然に存在するアミノ酸配列改変体である。機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号２の１つ以上のアミノ酸の保存的置換、またはこのタンパク質の非必須領域中の非必須残基の置換、欠失もしくは挿入のみを含む。非機能的対立遺伝子改変体は、ＰＳＧＬ−１活性を有さない、ヒトＰＳＧＬ−１タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である。非機能的対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号２のアミノ酸配列の非保存的な置換、欠失もしくは挿入または未成熟短縮、あるいはこのタンパク質の必須領域もしくは非必須領域中の置換、挿入もしくは欠失を含む。
【００３５】
本発明の種々の局面を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。
【００３６】
（Ｉ．本発明の方法において使用される、単離されたＰＳＧＬ−１タンパク質、抗ＰＳＧＬ−１抗体および抗Ｐ−セレクチン抗体）
本発明の方法は、単離されたＰ−セレクチンリガンドタンパク質（例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質）およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗Ｐ−セレクチン抗体を惹起するための免疫原としての使用に適切なポリペプチドフラグメントの使用を含む。１実施形態において、ネイティブのＰＳＧＬ−１タンパク質が、標準的なタンパク質生成技術を使用して、適切な精製スキームによって、細胞供給源または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＰＳＧＬ−１タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって生成される。組換え発現の代わりに、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成され得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、ＰＳＧＬ−１タンパク質の「生物学的に活性な部分」は、ＰＳＧＬ−１活性を有する、ＰＳＧＬ−１タンパク質のフラグメントを含む。ＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的に活性な部分としては、ＰＳＧＬ−１タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）と十分に同一であるかまたはこのアミノ酸に由来するアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、これは、全長ＰＳＧＬ−１タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、そしてＰＳＧＬ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。代表的に、生物学的に活性な部分は、ＰＳＧＬ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を有する、ドメインまたはモチーフを含む（例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外ドメインを含むフラグメント、またはＰ−セレクチンおよび／もしくはＥ−セレクチンと相互作用し得るそのフラグメント）。ＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１８、２０、２２、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００またはそれ以上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。ＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、ＰＳＧＬ−１活性を調節する薬剤を開発するための標的として使用され得る。
【００３８】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１タンパク質は、少なくとも、配列番号２に示されるアミノ酸配列の細胞外ドメインまたはＰＳＧＬ−１の細胞外ドメインのＰ−セレクチン結合フラグメント、あるいは配列番号２の細胞外ドメインを有する。他の実施形態において、ＰＳＧＬ−１タンパク質は、以下のサブセクションＩＩにおいて詳細に記載されるように、配列番号２と実質的に同一であり、そして配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子改変体または変異に起因してアミノ酸配列においては異なる。従って、別の実施形態において、本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１タンパク質は、配列番号２と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一なアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００３９】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１タンパク質は、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質である。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の可溶性形態をコードするＤＮＡは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインをコードする領域が欠失されているか、そして／または停止コドンが細胞外ドメインのカルボキシ末端のアミノ酸についてのコドンに対して３’側に導入されている、改変ＤＮＡの発現によって調製され得る。例えば、疎水性分析は、配列番号２に示されるＰ−セレクチンリガンドタンパク質が、配列番号２のアミノ酸３１１〜３３２からなる膜貫通ドメインおよび配列番号２のアミノ酸３３３〜４０２からなる細胞質ドメインを有することを予測する。上記のような改変ＤＮＡは、標準的な分子生物学の技術（例えば、当該分野で公知の部位特異的変異誘発を含む）または適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、作製され得る。種々の可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質をコードするいくつかのＤＮＡを生成するための方法は、本明細書中で参考として援用される米国特許第５，８２７，８１７号に示される。
【００４０】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性％を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のために整列される（例えば、ギャップは、最適なアラインメントのために第一および第二のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方中に導入され得、そして非同一配列は、比較目的のために無視され得る）。好ましい実施形態において、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％または９０％である（例えば、第二の配列を、４００アミノ酸残基を有する配列番号２のＰＳＧＬ−１アミノ酸配列に対して整列させる場合、少なくとも２８０、好ましくは少なくとも２４０、より好ましくは少なくとも２００、なおより好ましくは少なくとも１６０、そしてなおより好ましくは少なくとも１２０、８０もしくは４０またはそれ以上のアミノ酸残基が、整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列中の位置が、第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、これらの分子は、その位置で同一である（本明細書中で使用する場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と等価である）。２つの配列間の同一性％は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数、各ギャップの長さを考慮した、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。
【００４１】
配列比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズム（これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）中のＧＡＰプログラムに組み込まれている）を使用して、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４およびレングスウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。さらに別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスならびにギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０およびレングスウェイト１、２、３、４、５、または６を用いて決定される。別の実施形態において、２種のアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性が、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に組み込まれたＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティー１２およびギャップペナルティー４を用いて決定される。
【００４２】
本発明の方法はまた、ＰＳＧＬ−１キメラタンパク質またはＰＳＧＬ−１融合タンパク質を使用し得る。本明細書中で使用される場合、ＰＳＧＬ−１「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＰＳＧＬ−１ポリペプチドに作動可能に連結されたＰＳＧＬ−１ポリペプチドを含む。「ＰＳＧＬ−１ポリペプチド」は、ＰＳＧＬ−１分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＰＳＧＬ−１ポリペプチド」は、ＰＳＧＬ−１タンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質とは異なり、かつ同一または異なる生物体に由来するタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＰＳＧＬ−１融合タンパク質において、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１タンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。好ましい実施形態において、ＰＳＧＬ−１融合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分（例えば、ＰＳＧＬ−１の細胞外ドメインまたはそのＰ−セレクチン結合フラグメント）を含む。別の好ましい実施形態において、ＰＳＧＬ−１融合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドおよび非ＰＳＧＬ−１ポリペプチドが、互いにインフレームで融合されていることを示すことが意図される。非ＰＳＧＬ−１ポリペプチドは、ＰＳＧＬ−１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【００４３】
例えば、１つの実施形態において、この融合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１タンパク質の組換え可溶性形態であり、ここでＰＳＧＬ−１分子の細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ（例えば、可溶性ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）に融合される。
【００４４】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端で異種シグナル配列を含むＰＳＧＬ−１タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＰＳＧＬ−１の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加され得る。
【００４５】
本発明の方法において使用される可溶性ＰＳＧＬ−１融合タンパク質（例えば、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）は、薬学的組成物に組み込まれ、インビボで被験体に投与され得る。可溶性ＰＳＧＬ−１融合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１基質（例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン）のバイオアベイラビリティーに影響するように使用され得る。
【００４６】
さらに、本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１融合タンパク質は、被験体において抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体を産生するための免疫原として、Ｐ−セレクチンリガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイにおいて、Ｐ−セレクチンリガンド分子とＰ−セレクチン分子の相互作用を阻害する分子を同定するために使用され得る。
【００４７】
好ましくは、本発明の方法において使用されるＰＳＧＬ−１キメラタンパク質またはＰＳＧＬ−１融合タンパク質は、標準的組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技術に従って（例えば、連結のために平滑末端または付着末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）を使用すること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合は付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）を埋めること（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結によって）インフレームでともに連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続する遺伝子フラグメント間の相補的オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生じるアンカープライマーを使用して実施され得、これらのフラグメントは、引き続いてキメラ遺伝子配列を生成するためにアニールされ、そして再増幅され得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードする、多くの発現ベクターが、市販されている。ＰＳＧＬ−１をコードする核酸は、このような発現ベクターへクローン化され得、その結果、融合部分は、インフレームでＰＳＧＬ−１タンパク質に連結される。
【００４８】
本発明はまた、ＰＳＧＬ−１タンパク質の改変体の使用に関し、このＰＳＧＬ−１タンパク質の改変体は、ＰＳＧＬ−１アゴニスト（模倣物）またはＰＳＧＬ−１アンタゴニストのいずれかとして機能する。ＰＳＧＬ−１タンパク質の改変体を、変異誘発（例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質の個別の点変異または短縮化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ））により作製し得る。ＰＳＧＬ−１タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的活性と実質的に同一な活性か、またはそのサブセットを保持し得る。ＰＳＧＬ−１タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＰＳＧＬ−１タンパク質の１つ以上の活性を、例えば、このＰＳＧＬ−１タンパク質のＰＳＧＬ−１媒介活性を競合的に調節することによって阻害し得る。従って、特定の生物学的効果を、制限された機能の改変体で処理することにより誘発し得る。１つの実施形態において、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、天然に存在する形態のＰＳＧＬ−１タンパク質での処置と比較して、被験体においてより少ない副作用を有する。
【００４９】
１つの実施形態において、ＰＳＧＬ−１アゴニスト（模倣物）またはＰＳＧＬ−１アンタゴニストのいずれかとして機能するＰＳＧＬ−１タンパク質の改変体は、ＰＳＧＬ−１タンパク質アゴニスト活性またはＰＳＧＬ−１タンパク質アンタゴニスト活性について、ＰＳＧＬ−１タンパク質の変異体（例えば、短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施形態において、ＰＳＧＬ−１改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルにおけるコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。ＰＳＧＬ−１改変体の多様なライブラリーは、例えば、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することによって産生され得、その結果、潜在的なＰＳＧＬ−１配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、または代替的に、そこにＰＳＧＬ−１配列のセットを含む、より大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能である。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＰＳＧＬ−１改変体のライブラリーを産生するために使用され得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機において実行され、次いで合成遺伝子は、適切な発現ベクターに連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物中での、潜在的なＰＳＧＬ−１配列の所望のセットをコードする配列のすべての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３，Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【００５０】
さらに、ＰＳＧＬ−１タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、ＰＳＧＬ−１タンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためにＰＳＧＬ−１フラグメントの多様な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＰＳＧＬ−１コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニックが１分子あたり約１つだけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて、異なるニックを有する生成物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いる処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結すること、によって生成され得る。この方法によって、ＰＳＧＬ−１タンパク質のＮ末端、Ｃ末端および種々のサイズの内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
【００５１】
点変異または短縮化によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、ＰＳＧＬ−１タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングのために適合可能である。高スループット分析に従う、大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための最も広範に使用される技術は、代表的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出が、遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。帰納的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓａｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高める技術であり、ＰＳＧＬ−１改変体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
【００５２】
本発明の方法は、抗ＰＳＧＬ−１抗体および抗Ｐ−セレクチン抗体の使用をさらに包含する。単離されたＰＳＧＬ−１タンパク質もしくはＰ−セレクチンタンパク質、またはその一部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を使用して、ＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンを結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。Ｐ−セレクチンリガンド抗体は、例えば、米国特許第５，８５２，１７５号に記載されている。Ｐ−セレクチンに特異的な抗体は、例えば、Ｋｕｒｏｍｅ Ｔ．ら、（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１５（３）：６０８−６１４に記載されている。
【００５３】
全長ＰＳＧＬ−１タンパク質または全長Ｐ−セレクチンタンパク質が使用され得るか、あるいは、ＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンの抗原性ペプチドフラグメントが、免疫原として使用され得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６：１０３３−１０４４）。ＰＳＧＬ−１の抗原性ペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そしてＰＳＧＬ−１のエピトープを含み、その結果、このペプチドに対して惹起された抗体は、ＰＳＧＬ−１タンパク質との特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【００５４】
その抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、そのタンパク質の表面に位置するＰＳＧＬ−１の領域（例えば、親水性領域）ならびに高い抗原性を有する領域である。
【００５５】
代表的には、ＰＳＧＬ−１免疫原またはＰ−セレクチン免疫源を使用して、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫原で免疫することにより抗体を調製する。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現されたＰＳＧＬ−１タンパク質もしくはＰ−セレクチンタンパク質または化学合成されたＰＳＧＬ−１ポリペプチドもしくはＰ−セレクチンポリペプチドを含み得る。この調製物は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、または同様な免疫刺激剤）をさらに含み得る。適切な被験体を免疫原性ＰＳＧＬ−１調製物で免疫することにより、ポリクローナル抗ＰＳＧＬ−１抗体応答またはポリクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体応答が誘導される。
【００５６】
用語「抗体」とは、本明細書中で用いられる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部（すなわち、抗原（例えば、ＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチン）を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、酵素（例えば、ペプシン）で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）_２フラグメントが挙げられる。本発明は、ＰＳＧＬ−１分子を結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書中で使用される場合、ＰＳＧＬ−１の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、これが免疫反応する特定のＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンに対する単一の結合親和性を提示する。
【００５７】
ポリクローナル抗ＰＳＧＬ−１抗体またはポリクローナルＰ−セレクチン抗体は、適切な被験体をＰＳＧＬ−１免疫原またはＰ−セレクチン免疫源で免疫することにより、上記のように調製され得る。免疫した被験体における抗ＰＳＧＬ−１抗体力価または抗Ｐ−セレクチン抗体力価は、標準的技術により（例えば、固定化したＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンを用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて）経時的にモニターされ得る。所望であれば、いずれの抗原に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そしてさらに周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）により精製され得る。免疫後、適切な時間に、例えば、抗体力価が最も高いときに、抗体生成細胞を被験体から獲得し得、そしてこれを使用して、標準的技術（例えば、初めは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５もまた参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術）によりモノクローナル抗体を調製し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技術は、周知である（一般には、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡潔には、不死細胞株（代表的には骨髄腫）を、上記のように免疫原で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（代表的には、脾臓細胞）と融合し、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養物上清をスクリーニングして、ＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンを結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【００５８】
リンパ球と不死化細胞株とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルは、抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体または抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体を生成する目的で適用され得る（例えば、Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５２；Ｇａｌｆｔｅｒら（１９７７）上記；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）上記；およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）上記、を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションが存在し、これらは、やはり有用であることを理解する。代表的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株とを融合することにより作製され得る。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。任意の多くの骨髄腫細胞株は、標準的技術に従う融合パートナーとして使用され得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾臓細胞に融合する。次いで、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択する（このことにより、融合していない細胞および生成性でない融合骨髄腫細胞は死ぬ（融合していない脾臓細胞は、形質転換していないので数日後に死ぬ））。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、ＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンを結合する抗体について、ハイブリドーマ培養物上清をスクリーニングすることにより（例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して）検出される。
【００５９】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するかわりに、モノクローナル抗ＰＳＧＬ−１抗体またはモノクローナル抗Ｐ−セレクチン抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をそれぞれＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンを用いてスクリーニングすることにより同定および単離し得、それによってＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ^ＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際の使用に特になじみやすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭａｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４に見出され得る。
【００６０】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含む組換え抗ＰＳＧＬ−１抗体または組換えＰ−セレクチン抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の技術範囲内であり、これらは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら 欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ 米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を使用して）生成され得る。
【００６１】
本明細書中に記載される抗体は、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンの発現の量およびパターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）このタンパク質を検出するために使用され得る。このような抗体は、例えば、所定の処置レジメの効力を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、またはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生体発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして、適切な放射活性物質の例には、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、または^３Ｈが挙げられる。
【００６２】
（ＩＩ．本発明の方法において使用される、単離された核酸分子）
単離されたヒトＰＳＧＬ−１ ｃＤＮＡのコード配列およびヒトＰＳＧＬ−１ポリペプチドのアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示される。ＰＳＧＬ−１配列はまた、米国特許第５，８２７，８１７号および同第５，８４３，７０７号に記載されている（これらの内容は、本明細書中に参考として援用される）。
【００６３】
本発明の方法は、ＰＳＧＬ−１タンパク質、またはその生物学的に活性な部分をコードする、単離された核酸分子、ならびに、ＰＳＧＬ−１をコードする核酸分子（例えば、ＰＳＧＬ−１ ｍＲＮＡ）を同定するための、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用に足りる核酸フラグメント、およびＰＳＧＬ−１核酸分子を増幅または変異誘発するためのＰＣＲプライマーとしての使用のためのフラグメントの使用を、包含する。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを含むことを意図される。この核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６４】
本発明の方法において使用される核酸分子（例えば、配列番号１、またはその一部分のヌクレオチド配列を有する核酸分子）を、標準的な分子生物学的技術および本明細書中に提供される配列情報を使用して単離し得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１の核酸配列の全部または一部を使用して、ＰＳＧＬ−１核酸分子を、（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるような）標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離し得る。
【００６５】
さらに、配列番号１の全部または一部を含有する核酸分子を、配列番号１の配列に基づいて設計した合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、単離し得る。
【００６６】
本発明の方法において使用される核酸を、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、増幅し得る。さらに、ＰＳＧＬ−１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成技術（例えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用すること）によって、調製し得る。
【００６７】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分を含む。配列番号１に示されるヌクレオチド配列に相補的である核酸分子とは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的である核酸分子であり、その結果、この核酸分子は配列番号１に示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし得、それによって安定な二重鎖を形成する。
【００６８】
なお別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列の全長、またはこのヌクレオチド配列の任意の部分に、少なくとも約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上同一であるヌクレオチド配列を含有する。
【００６９】
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号１の核酸配列の部分（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント）、またはＰＳＧＬ−１タンパク質の部分（例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的に活性な部分）をコードするフラグメント）のみを含み得る。代表的に、プローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。代表的に、オリゴヌクレオチドは、配列番号１のセンス配列、配列番号１のアンチセンス配列、あるいは配列番号１の天然に存在する対立遺伝子の改変体または変異体の少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５または７５個連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの実施形態において、本発明の方法において使用される核酸分子は、１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、１３００〜１４００、１４００〜１５００、１５００〜１６００以上のヌクレオチド長よりも長く、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
【００７０】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、お互いに有意に同一または相同であるヌクレオチド配列が、お互いにハイブリダイズされたままである状態でハイブリダイゼーションおよび洗浄するための条件を記載することを意図する。好ましくは、この条件は、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、なおより好ましくは少なくとも約８５％または９０％で、互いに同一な配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），２節，４節および６節に見出され得る。さらなるストリンジェントな条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９），７節、９節および１１節に見出され得る。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５℃〜７０℃での、１×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。好ましい、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での、１×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃での、１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約６５℃〜７０℃での、０．３×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。好ましい、低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約５０〜６０℃での、４×ＳＳＣ中でハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃での、６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でハイブリダイゼーション）、次いで約５０℃〜６０℃での、２×ＳＳＣで１回以上の洗浄が挙げられる。上記の値の中間の範囲（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）もまた、本発明に含まれることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄緩衝液中でＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）に置き換わり得る；洗浄は、各ハイブリダイゼーションが終了した後で、１５分間実行される。５０塩基対長未満であることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、ここでＴ_ｍが以下の式に従って決定される。１８塩基対長未満であるハイブリッドについて、Ｔ_ｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。１８塩基対長と４９塩基対長の間のであるハイブリッドについて、Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、そして［Ｎａ^＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣに対する［Ｎａ^＋］＝０．１６５Ｍ）。膜（例えば、ニトロセルロース膜、またはナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、さらなる試薬が、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄緩衝液に添加され得ることが当業者によってまた認識され、この試薬としては、限定されないが以下が挙げられる：ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、もしくはサケまたはニシンの精子キャリアＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなど。ナイロン膜が使用される場合、特にさらなる好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５℃での、０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、７％ ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション、次いで６５℃での、０．０２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１％ ＳＤＳで１回以上の洗浄である（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５，（または代替的に０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ）。
【００７１】
好ましくは、ストリンジェンシー条件下で、配列番号１の配列にハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」核酸分子は、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をいう。
【００７２】
好ましい実施形態において、プローブは、さらに、プローブに結合される標識基を含み、例えば、この標識基は、放射線同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば、被験体からの細胞のサンプル中のＰＳＧＬ−１コード核酸のレベルを測定すること（例えば、ＰＳＧＬ−１ ｍＲＮＡレベルを検出すること）、またはゲノムＰＳＧＬ−１遺伝子が変異または欠失しているか否かを決定することによって、ＰＳＧＬ−１タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断用試験キットの一部として使用され得る。
【００７３】
本発明の方法は、ヒトＰＳＧＬ−１タンパク質の非ヒトオルソログを使用し得る。ヒトＰＳＧＬ−１タンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離され、そして同一のＰＳＧＬ−１活性を有するタンパク質である。
【００７４】
本発明の方法は、さらに、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはその一部の使用を含み、ここで、変異が導入される。この変異は、「非必須」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導き得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、ＰＳＧＬ−１の野生型配列（例えば、配列番号２の配列）から変更され得る残基であり、それに対して「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、Ｐ−セレクチンと相互作用し得るか、あるいはＰ−セレクチン媒介性膜接着または細胞移動を阻害し得るフラグメントを含むアミノ酸残基は、そう簡単に変更に影響を受けない。
【００７５】
変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異およびＰＣＲ媒介変異）によって、配列番号１に導入され得る。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、１個以上の推定非必須アミノ酸残基から作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、ＰＳＧＬ−１タンパク質中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、ＰＳＧＬ−１コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入され得（例えば、飽和変異誘発によって）、そして得られる変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、ＰＳＧＬ−１生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１の変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてタンパク質の活性が、本明細書中に記載されるアッセイを使用して、決定され得る。
【００７６】
本明細書中に開示されるＰＳＧＬ−１をコードするコード鎖配列を考慮して、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソンおよびクリックの塩基対形成の法則に従って設計し得る。アンチセンス核酸分子は、ＰＳＧＬ−１ ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であり得るが、より好ましくは、ＰＳＧＬ−１ ｍＲＮＡのコード領域全体または非コード領域のうちの一部分のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＳＧＬ−１ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野において公知の手順を使用する化学合成および酵素的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が、天然に存在するヌクレオチドまたは種々に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成され得、この種々に改変されたヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を増加させるように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計される（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る）。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸が、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成され得る（すなわち、以下の節でさらに記載されるように、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【００７７】
なお別の実施形態において、本発明の方法において使用されたＰＳＧＬ−１核酸分子を、塩基部分、糖部分またはホスフェート骨格において改変し、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を改善し得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースホスフェート骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースホスフェート骨格が偽ペプチド骨格により置換され、そして４つの天然の核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にし得ることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出、およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４６７０−６７５に記載のような、標準的固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施され得る。
【００７８】
ＰＳＧＬ−１核酸分子のＰＮＡは、本明細書中に記載される治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、遺伝子発現の配列特異的調節（例えば、転写または翻訳の停止を誘導すること、または複製を阻害することによる）のためのアンチセンス剤またはアンチジーン（ａｎｔｉｇｅｎｅ）剤として使用され得る。ＰＳＧＬ−１核酸分子のＰＮＡはまた、（例えば、ＰＮＡ指向ＰＣＲクランピング（ＰＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＰＣＲ ｃｌａｍｐｉｎｇ）による）遺伝子内の一塩基対変異の分析において、他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合の人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）前出）；またはＤＮＡ配列決定またはハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）、前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）、前出）使用され得る。
【００７９】
別の実施形態において、ＰＳＧＬ−１のＰＮＡは、ＰＮＡに対して脂肪親和性基または他のヘルパー基を付着することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは当該分野で公知の薬物送達の他の技術の使用によって、（例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために）改変され得る。例えば、ＰＳＧＬ−１核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得、これは、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を合わせ得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能にし、一方ＰＮＡ部分は、高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および方向の点において選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、１９９６）、前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら、（１９９６）、前出、およびＦｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７〜６３に記載されるように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホロアミダイト結合化学および改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイト）を使用して固体支持体上で合成され得、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ，Ｍら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的な様式で結合されて、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９６）前出）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９〜１１１２４）。
【００８０】
他の実施形態において、本発明の方法において使用されるオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付属基（例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を横切る輸送を容易にする薬剤を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ）切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６を参照のこと）または挿入剤（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９）を用いて改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、またはハイブリダイゼーション誘発切断剤）に結合体化され得る。
【００８１】
本発明の方法において使用されるＰ−セレクチンリガンドタンパク質の他のフラグメントおよび改変形態をコードするＤＮＡは、全長配列の一部分が欠失または変更されている改変されたＤＮＡの発現によって調製され得る。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質配列の実質的な欠失は、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性を保持する間になされ得る。例えば、配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ鎖１８９、配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ酸１１８、または配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ酸８９を含むＰ−セレクチンリガンドタンパク質の各々は、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチンに結合する能力を保持する。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（例えば、配列番号２のアミノ酸６５、１１１および２９２のＮ連結グリコシル化部位）が、他のアミノ酸に置換されたかまたは欠失されたＰ−セレクチンリガンドタンパク質もまた、Ｐ−セレクチンタンパク質結合活性およびＥ−セレクチンに結合する能力を保持する。配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ酸６０を含むＰ−セレクチンリガンドタンパク質（これは、配列番号２のアミノ酸４５〜アミノ酸５８由来のタンパク質の高度にアニオン性の領域を含む）もまた、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性を保持する；しかし、このような配列に限定されたＰ−セレクチンリガンドタンパク質は、Ｅ−セレクチンに結合しない。好ましくは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、配列番号２のアミノ酸４６、４８、および５１に見出されるチロシン残基の少なくとも１つ（より好ましくは、少なくとも２つ、そして最も好ましくは全３つ）を保持し、これらの硫酸化は、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質活性に寄与し得る。これらおよび他の活性なフラグメントをコードするＤＮＡの構築またはＰ−セレクチンリガンドタンパク質の変更された形態は、当業者に公知の方法によって達成され得る。
【００８２】
本発明の方法において使用される単離されたＤＮＡは、Ｐ−セレクチンリガンド組換えを生成するために、ｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクター（Ｋａｕｆｉｎａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９，４４８５−４４９０（１９９１）に開示される）のような発現制御配列に作動可能に連結され得る。多くの適切な発現制御配列は当該分野に公知である。発現組換えベクタータンパク質の一般的な方法はまた、公知であり、そしてＲ．Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，５３７−５６６（１９９０）に例示されている。本明細書中に規定される場合、「作動可能に連結された」は、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質が（連結されたＤＮＡ／発現制御配列で形質転換（トランスフェクト）された）宿主細胞によって発現されるような方法で、本発明の単離されたＤＮＡと発現制御配列との間に共有結合を形成するために、酵素的または化学的に連結されることを意味する。
【００８３】
いくつかの内在性タンパク質分解酵素は、対のアミノ酸配列（例えば、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−および−Ａｒｇ−Ａｒｇ−）のカルボキシル側で前駆体ペプチドを切断し、成熟タンパク質を生じることが公知である。このような酵素は、一般的に、対の塩基性アミノ酸転換酵素またはＰＡＣＥとして公知であり、成熟タンパク質の組換え的生産におけるこれらの使用は、ＷＯ ９２／０９６９８および米国特許出願番号０７／８８５，９７２（これら両方とも、本明細書中に参考として援用される）に広範に開示される。酵素のＰＡＣＥファミリーは、組換え宿主細胞における前駆体ポリペプチドのタンパク質分解プロセシングの効率を高めることが知られている。特定の実施形態において、本発明のＰ−セレクチンリガンドタンパク質は、このようなＰＡＣＥ切断部位を含む。
【００８４】
本発明の方法において使用される可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質は、本明細書中に記載されるような任意の可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質をコードするＤＮＡ配列、ならびにＷＯ ９２／０９６９８および米国特許出願番号０７／８８５，９７２（本明細書中に参考として援用される）に記載されるようなＰＡＣＥをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞によって作製され得る。このような宿主細胞は、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質ＤＮＡおよびＰＡＣＥ ＤＮＡをそれぞれ含む、別個の発現ベクターの同時形質転換または連続形質転換の結果として生じたＤＮＡを含み得る。３／４ＦＴをコードする第３のＤＮＡはまた、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質およびＰＡＣＥをコードするＤＮＡで同時形質転換され得る。あるいは、宿主細胞は、可溶性Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質ＤＮＡおよびＰＡＣＥ ＤＮＡの両方を含む、単一の発現ベクターの形質転換の結果として生じたＤＮＡを含み得る。このような発現ベクターの構築は、分子生物学における当業者のレベルの範囲内である。同時形質転換および形質転換の方法はまた、公知である。
【００８５】
ＰＡＣＥをコードする、多くのＤＮＡ配列は公知である。例えば、ＰＡＣＥの１形態（フリン（ｆｕｒｉｎ）として知られている）をコードするＤＮＡは、Ａ．Ｍ．Ｗ．ｖａｎ ｄｅｎ Ｏｕｗｅｌａｎｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８，６６４（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に開示されている。ＰＡＣＥの可溶形態をコードするｃＤＮＡは、ＰＡＣＥＳＯＬとして公知である。ＰＡＣＥの他の形態をコードするＤＮＡもまた存在し、任意のこのようなＰＡＣＥコードＤＮＡは、ＰＡＣＥがＰ−セレクチンリガンドタンパク質をアミノ酸３８〜４１で切断し得る限り、本発明の可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質を生成するために使用され得る。好ましくは、ＰＡＣＥの可溶性形態をコードするＤＮＡは、本発明の可溶性成熟Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質を生成するために使用され得る。
【００８６】
Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質およびＰＡＣＥの可溶性形態を（別個にか、または一緒に）コードするＤＮＡは、上で議論されたｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクターに含まれるような発現制御配列に作動可能に連結して、ＰＡＣＥ−切断可溶性Ｐ−セレクチンリガンド組換えを生じ得る。さらに適切な発現制御配列は、当該分野で公知である。
【００８７】
（ＩＩＩ．本発明の方法に用いられる組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の方法（例えば、本明細書中で記載されるスクリーニングアッセイ）としては、ＰＳＧＬ−１タンパク質（またはその部分）をコードする核酸を含む、ベクター（好ましくは、発現ベクター）の使用が挙げられる。本明細書中で用いられる場合、用語「ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。１つの型のベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、これはさらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムへと連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自発的に複製され得る。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へと導入される際に宿主細胞のゲノムへと組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されるゲノムの発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。一般的に、組換え発現技術において有用な発現ベクターは、頻繁に、プラスミドの形態である。本明細書中では、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられ得る。なぜならば、プラスミドは、最も一般的には、ベクターの形態で用いられるからである。しかし、本発明は、等価な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような、発現ベクターの他の形態を含むことが意図される。
【００８８】
本発明の方法において用いられる組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態の本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現のために用いられる宿主細胞を基準に選択され、発現される核酸配列に作動可能に連結される、１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」とは、目的のヌクレオチド配列が、（ベクターが、宿主細胞に導入される場合、例えば、インビトロでの転写／翻訳系または宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式において調節配列に連結されることを意味する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御配列（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載される。調節配列としては、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向するものおよび特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織特異的調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計が、形質転換される選抜きの宿主細胞の機能、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者により理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書中に記載される核酸によりコードされる、融合タンパク質またはペプチド（例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質、ＰＳＧＬ−１タンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を含む、タンパク質またはペプチドを産生し得る。
【００８９】
本発明の方法において用いられる組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＰ−セレクチンリガンドタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現系を用いる）、酵母細胞、または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）前出においてさらに議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、インビトロにおいて（例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて）転写および翻訳され得る。
【００９０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中で実行される。融合ベクターは、多数のアミノ酸をそれらの中でコードされるタンパク質に（通常は、組換えタンパク質のアミノ末端に）加える。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増大させるため；２）組換えタンパク質の可溶性を増大させるため；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより組換えタンパク質の精製を補助するため。頻繁に、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解切断部位は、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入され、融合部分からの組換えタンパク質の分離、引き続いての、融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素、およびそれらの同族認識配列としては、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられ、これらは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、標的組換えタンパク質に融合する。
【００９１】
精製した融合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１活性アッセイ（以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合アッセイ）において、またはＰＳＧＬ−１に特異的な抗体を産生するするために利用され得る。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｔｎａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、頻繁に、ウイルス調節エレメントにより提供される。例えば、一般的に用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物の両方に適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと。
【００９３】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸を発現するために用いられる）。
【００９４】
本発明の方法は、アンチセンス方向で発現ベクターへとクローン化された本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターをさらに使用し得る。すなわち、このＤＮＡ分子は、ＰＳＧＬ−１ ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の（ＤＮＡ分子の転写による）発現を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス方向でクローン化された核酸に作動可能に連結される調節配列としては、種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を指向するもの（例えば、ウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサー）が選択され得るか、あるいは調節配列としては、アンチセンスＲＮＡの構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向するものが選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化ウイルスの形態であり得、これらの活性はベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の議論については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【００９５】
本発明の別の局面は、本発明のＰＳＧＬ−１核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内のＰＳＧＬ−１核酸分子または宿主細胞のゲノムの特定の部位に相同的に組換えされ得る配列を含むＰＳＧＬ−１核酸分子）が導入される宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中において、互換的に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞をいうだけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫もいうことが理解される。突然変異または環境の影響のいずれかに起因する特定の改変体が、次の世代を生じ得るので、このような子孫は、実際に、親細胞と同一でないかもしれないが、本明細書中に使用される用語の範囲内になお含まれる。
【００９６】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞））において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００９７】
多くの細胞の型は、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の発現に適切な宿主細胞として働き得る。適切な宿主細胞は、機能的Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質に特徴的な炭水化物側鎖を結合し得る。このような能力は、天然に存在するか、化学的突然変異によって誘導されるか、またはグリコシル化酵素をコードするＤＮＡ配列を含む適切な発現プラスミドを有する宿主細胞のトランスフェクションによるかのいずれかによる、宿主内の適切なグリコシル化酵素の存在によって生じ得る（ａｎｉｓｅ）。宿主細胞としては、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、通常の二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養由来の細胞株、一次外植片、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、またはＨａＫ細胞が挙げられる。
【００９８】
Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質はまた、本発明の単離ＤＮＡおよび適切なグリコシル化酵素をコードする１つ以上のＤＮＡを、１つ以上の昆虫発現ベクターにおいて適切な制御配列に、作動可能に連結し、そして昆虫発現ベクターを使用することによって産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての材料および方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（ｔｈｅ ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）製のキットの形態で市販されており、そしてこのような方法は、本明細書中に参考として援用される、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されるように当該分野において公知である。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質の可溶性形態はまた、上記されるように適切な単離ＤＮＡを使用して昆虫細胞中で産生され得る。ＰＡＣＥのある形態をコードするＤＮＡはさらに、昆虫宿主細胞において同時発現され、ＰＡＣＥ切断形態のＰ−セレクチンリガンドタンパク質を産生する。
【００９９】
あるいは、Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質を下等真核生物（例えば酵母）または原核生物（例えば細菌）において産生することは可能であり得る。潜在的に適切な酵母株としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種タンパク質を発現し得る任意の酵母株が挙げられる。潜在的に適切な細菌株としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を発現し得る任意の細菌株が挙げられる。Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質が酵母または細菌中で作製される場合、グリコシル化Ｐ−セレクチンリガンドタンパク質を得るために、適切な炭水化物をタンパク質部分の適切な部位に共有結合する必要がある。このような共有結合は、公知の化学的方法または酵素的方法を使用して達成され得る。
【０１００】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術によって、原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための、種々の当該分野で認識される技術をいうことを意図され、これらとしては、リン酸カルシウム共沈降法、または塩化カルシウム共沈降法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション法、リポフェクション法、あるいはエレクトロポレーション法が挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０１０１】
本発明の方法において使用される宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞培養物および真核生物宿主細胞培養物）は、ＰＳＧＬ−１タンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてＰＳＧＬ−１タンパク質を産生する方法を提供する。１つの実施形態において、本方法は、ＰＳＧＬ−１タンパク質が産生されるように、適切な培地中で、（ＰＳＧＬ−１タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を培養する工程を包含する。別の実施形態において、本方法はさらに、培地または宿主細胞からＰＳＧＬ−１タンパク質を単離する工程を包含する。
【０１０２】
（ＩＶ．使用方法）
本発明は、虚血障害および／または再灌流損傷（発作を含む）の危険のある（またはそうであることが疑われる）被験体（例えば、ヒト）において、組織損傷を処置、予防、または低減する予防方法および治療方法の両方を提供する。処置の予防方法および／または治療方法の両方に関して、このような処置は、薬物ゲノム学分野から得られた知見に基づき、特異的に仕立てられ得るかまたは改変され得る。本明細書中で使用する場合、「処置」は、患者への治療因子の適用もしくは投与、あるいは疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の徴候、または疾患もしくは障害に対する素因を有する患者から、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の徴候、または疾患もしくは障害に対する素因を治療（ｃｕｒｅ）、治癒（ｈｅａｌ）、緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、解放（ｒｅｌｉｅｆ）、変更（ａｌｔｅｒ）、救済（ｒｅｍｅｄｙ）、改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、改善（ｉｍｐｒｏｖｅ）、もしくは影響を与える（ａｆｆｅｃｔ）目的での、単離された組織もしくは細胞株への治療因子の適用もしくは投与として定義される。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、「薬物ゲノム学」は、臨床的開発および市場での薬物へのゲノム学技術（例えば、遺伝子配列決定、統計遺伝学、および遺伝子発現分析）の応用をいう。より詳細には、この用語は、患者の遺伝子が薬物に対する応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」、または「薬物応答遺伝子型」）を決定する方法の研究をいう。
【０１０４】
従って、本発明の別の局面は、本発明のＰ−セレクチンアンタゴニストまたは個体の薬物応答遺伝子型に従うＰ−セレクチンリガンドモジュレーターを用いて、被験体の予防的処置または治療的処置を仕立てる方法を提供する。薬物ゲノム学は、臨床医または内科医が、予防的処置または治療的処置を、その処置から最も利益を受ける患者に標的化すること、および毒性の薬物に関連する副作用を経験する可能性のある患者の処置を回避することを可能にする。
【０１０５】
（Ａ．予防方法および治療方法）
Ｐ−セレクチンは、血管損傷および血栓症に関連するいくつかの機能を有する。これらの機能としては、血管内皮上での白血球のローリングの媒介、白血球活性化を引き起こす白血球と血小板との相互作用の促進、およびこれらの活性化細胞からの、組織因子の豊富な微粒子の放出、ならびに／または内皮細胞を活性化してより多くの白血球の捕捉；血餅および血餅増殖を促進する内皮上の白血球由来微粒子の捕捉；および虚血の領域に延ばすための微小血管の閉塞を促進する炎症前メディエーター、が挙げられる。Ｐ−セレクチンとそのリガンドＰＳＧＬ−１との相互作用の特異的インヒビターは、これらの現象を有意に減少させると考えられる。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇの場合、この可溶性リガンド構築物は、内皮および血小板上で発現されたＰ−セレクチンに結合し、従って、白血球または白血球由来微粒子の表面上のネイティブＰＳＧＬ−１の結合能を減少させると考えられる。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇの存在の効果は、Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用の増加を引き起こす状況における、炎症応答および血栓応答を減少させることである。
【０１０６】
Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用の阻害は、血栓性発作において特に有用であり得る。ｒＰＳＧＬ−１との活性化血小板／白血球複合体の形成の減少は、Ｐ−セレクチン／ＰＳＧＬ−１相互作用の結果として形成される血小板／白血球複合体に起因する血管閉塞を減少させることにより、血管閉塞の下流の微小血管の流れを改善し得る。この改善された微小血管の流れは、脳梗塞の成長を低減し、従って、脳に対する長期間の損傷の程度を低減し得る。線維素溶解因子による介入は、主に、出血のより高い危険性およびより長い発作後期間の明らかな治療的利益の欠如に起因して、発作の臨床的徴候の３時間後までに制限される。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、明らかな出血傾向を促進しないが、組織因子経路および血餅付着に対するその影響を介して溶解の改善を促進し得るので、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇと線維素溶解処置との組み合わせは、溶解応答を加速するのに有益であり得る。さらに、白血球／内皮細胞ローリングを減少することにより、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、血餅溶解後の再灌流損傷の程度を減少させ、従って、梗塞の大きさを有意に減少させ得る。最後に、発作後の脳の浮腫は、セレクチンにより媒介される、ゆっくりと進行する血管炎症現象の結果であり得、そして微小血管の完全性を破壊する。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、これらの長期間の現象を阻害することによって、浮腫が進行する傾向を低減し得る。浮腫の減少は、血栓性発作に関連する疾患率および死亡率を有意に減少させ得る。
【０１０７】
ｒＰＳＧＬ−Ｉｇの使用はまた、出血性発作を患う患者の処置に有益であり得る。ｒＰＳＧＬ−Ｉｇに関連する低度の出血〜無出血は、発作を起こした患者への早期投与に対して、この出血を比較的安全にする。出血は、活性化血液細胞からの炎症性メディエーターの放出および／またはセロトニン、トロンビンおよびロイコトリエンＣ４を含む凝集経路を介して、組織炎症を亢進することが公知である。これらの因子は、血小板および内皮細胞に対してＰセレクチンの発現を亢進することが公知である。セレクチンアンタゴニストを用いる初期治療によりこれらの二次的な炎症応答を低減することは、出血性発作に関連した罹病率および致死率を低減するのに非常に有益であることを証明し得る。
【０１０８】
１つの局面において、本発明は、ＰＳＧＬ−１発現またはＰＳＧＬ−１活性を調節する因子（例えば、Ｐセレクチン結合またはＥセレクチンの結合を調節する因子、細胞接着（例えば、細胞−細胞間接着（例えば、脳における白血球−内皮細胞の接着または白血球−血小板の接着、および血管への細胞（例えば、白血球）の接着））を調節する因子、ならびに例えば脳細静脈において白血球のローリング（ｒｏｌｌｉｎｇ）を調節する因子）を含む組成物を被験体に投与することによって、被験体において、出血（例えば、発作）の後の再灌流傷害により引き起こされる器官損傷または組織損傷（例えば、脳損傷）を、例えば処置、予防または低減するための方法を提供する。虚血および／または再灌流傷害の危険にある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるかまたは当業者に公知の、いずれかの診断アッセイまたは予知（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）アッセイ、またはそれらの組み合わせによって同定され得る。
【０１０９】
虚血および再灌流によって引き起こされる組織損傷または器官損傷の危険に患者をさらし、そしてそれら虚血および再灌流を本発明のＰセレクチンを用いる処置のための標的とする虚血性障害としては、例えば、発作、腸間膜血管疾患および末梢血管疾患、組織移植、循環器ショックおよび血栓障害（例えば、血栓塞栓症、重度静脈血栓、肺動脈塞栓症、発作、心筋梗塞、流産、抗トロンビンＩＩＩ不全、プロテインＣ不全、プロテインＳ不全、活性化プロテインＣ耐性に関連する血栓症、原線維生成不全症（ｄｙｓｆｉｂｒｉｏｎｏｇｅｎｅｍｉａ）、フィブリン溶解性障害、ホモシスチン尿症、妊娠、炎症障害、骨髄増殖性障害、動脈硬化症、アンギナ（例えば、不安定狭心症）、汎発性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、癌転移、鎌状赤血球病、および糸球体腎炎）が挙げられる。
【０１１０】
予防因子または治療因子（例えば、Ｐ−セレクチンリガンド分子もしくはＰ-セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメント（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１）、または可溶性組換えＰＳＧＬ融合タンパク質（例えば、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）、抗Ｐ−セレクチン抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント、または抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体もしくはその生物学的に活性なフラグメント）の投与は、再還流の前に起こり得、その結果、組織および器官（例えば、脳）、ならびに梗塞の大きな塊り（ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ）に対する損傷が阻害または減少される。
【０１１１】
虚血および／または再還流の後の器官損傷または組織損傷を処置、予防、または低減するための、Ｐ−セレクチンアンタゴニスト（例えば、抗Ｐ−セレクチン抗体、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体、可溶性Ｐ−セレクチンリガンド、可溶性ＰＳＧＬ−１、もしくはそのフラグメント、または可溶性ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）の被験体への投与方法としては、以下の方法が挙げられるが、これらに制限されない。
【０１１２】
本発明の可溶性Ｐ−セレクチンアンタゴニストは、このような投与に適切な薬学的組成物の形態で被験体に投与される。このような組成物は、代表的に、有効量の活性薬因子（例えば、タンパク質または抗体）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で用いられる場合、語句「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性の、任意かつ全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質についてのこのような媒質および因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒質または因子が、活性化合物と不適合である範囲を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補助的な活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０１１３】
本発明の治療方法として使用される薬学的組成物は、意図する投与経路と適合するように処方される。
【０１１４】
投与経路の例としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与のような非経口投与が挙げられる。非経口用途、皮内用途、または皮下用途のために使用される溶液または懸濁液としては、以下の成分が挙げられ得る：注射のための無菌希釈物（例えば、水、生理食塩水、固定油、ポリエチレン、グリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（アスコルビン酸、重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸）および張性の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調製され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラスもしくはプラスチックからなる複数回投与バイアルに封入され得る。
【０１１５】
注射用途のための適切な薬学的組成物としては、無菌注射溶液または分散物の即時調製剤ための無菌水溶液（ここでは水に可溶である）または分散剤および無菌散剤が挙げられる。静脈内投与のために、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴ^ＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、この組成物は無菌でなければならず、かつ容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）存続する程度まで流動性であるべきである。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌類のような微生物の夾雑作用に対して保護されるべきである。このキャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散物の場合に必要とされる粒径の維持、および界面活性剤によって維持され得る。微生物の作用を防ぐことは、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖類、ポリアルコール（例えば、マンニトール）、ソルビトールおよび塩化ナトリウム）をその組成物中に含むことが好ましい。注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）をその組成物中に含むことによって生じ得る、
無菌注射可能溶液は、１成分または上で列挙された成分の組み合わせで必要とされる量にてＰＳＧＬ−１活性を調節する薬剤（例えば、可溶性のＰＳＧＬ−１タンパク質のフラグメント）を取り込むことによって、必要とされる場合には、その後の濾過による無菌化によって調製され得る。一般的に、分散物は、基礎となる分散媒体および上で列挙した成分に由来する必要とされる他の成分を含む無菌性ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌散剤の場合において、活性成分の散剤および、任意のさらに所望される成分をそれらの溶液から予め無菌濾過することによって生じる調製の好ましい方法は、減圧乾燥および凍結乾燥である。
【０１１６】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食性キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るかまたは錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、活性化合物が賦形剤と組み込まれ得、っそして、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄剤としての用途のための流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中の化合物は、経口適用され、スウッシュ（ｓｗｉｓｈ）され、そして吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的適合可能な結合剤、および／またはアジュバント物質は、この組成物の一部として含まれ得る。この錠剤、丸薬、カプセル、トローチなどは、以下の成分のいずれかまたは類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微晶質セルロース、トラガカントガム、またはゼラチン）；賦形剤（デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコムスターチ（ｃｏｍ ｓｔａｒｃｈ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド二酸化ケイ素）；甘味料（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香料（例えば、ペパーミント、メチルサリチレートまたは有機香料）。
【０１１７】
吸入目投与のために、これらの化合物は、圧力容器または適切な推進剤（例えば、二酸化炭素のような気体）で収容するディスペンサーまたは噴霧器からエアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０１１８】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段になされ得る。経粘膜または経皮による投与のために、通過する障壁に対して適切な透過剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｅ）が処方物の中に使用される。このような透過剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして例えば、経粘膜投与のために、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸の誘導体が含まれ得る。経粘膜投与は、鼻腔噴霧または坐剤の使用によって達成され得る。経皮膚投与のために、活性化合物が、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリームが一般的に当該分野で公知であるように処方される。
【０１１９】
ＰＳＧＬ−１活性を調製するための薬剤はまた、坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような坐剤のための従来の基剤が用いられる）または直腸送達のための停留性の浣腸の形態で調製され得る。
【０１２０】
１実施形態において、ＰＳＧＬ−１活性を調節する薬剤が身体からの迅速な排出に対して化合物を保護するキャリア（例えば、制御放出処方剤（移植物およびマイクロカプセル化送達システムを含む））とともに調製される。生体分解性で、生体適合性であるポリマーが使用され得る（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）。このような処方物の調製のための方法は、当業者によって明らかである。これらの物質はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから市販されている。リポソーム性懸濁物（これは、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染させた細胞に対して標的化されたリポソームを含む）はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１２１】
投与の簡便性および投薬の一様性たのめの投薬単位形態で経口組成物および非経口組成物を処方することが特に有利である。本明細書中で使用されるような投薬単位形態は、処置を受ける被験体に対する一元的な投薬として適切な物理的な分離されている単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的なキャリアを伴って所望の治療効果を生じるために計算された予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位のための詳細な説明は、ＰＳＧＬ−１活性を調節する薬剤の固有の性質および達成されるべき特定の治療効果、および被験体を処置するるためのこのような薬剤を配合する技術にもともと伴う限界によって決定付けられるかまたは直接的に依存する。
【０１２２】
このような薬剤の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％における致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定付けられ得る。毒性と治療効果との間での用量比が、治療指数であり、そして、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表される。大きな治療指数を提示する薬剤が好ましい。毒性の副作用を提示する薬剤が使用される一方で、罹患していない細胞に対する潜在的な損傷を最小化してそれにより副作用を最小化するために、罹患した組織の部位にこのような薬剤を標的化するような送達系を設計することに注意がなされるべきである。
【０１２３】
このような細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬範囲を処方するのに使用され得る。このようなＰＳＧＬ−１調節薬剤の投薬量は、毒性が殆ど無いかまたたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲で存在することが好ましい。この投薬量は、使用される投薬量および利用される投薬経路に依存するこの範囲内で変化し得る。本発明の治療方法において使用される任意の薬剤について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に見積もられ得る。投薬量が、細胞培養物において決定されるような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて処方され得る。このような情報が、ヒトにおける有用な投薬量をより正確に決定付けるために使用され得る。血漿におけるレベルが、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【０１２４】
本明細書中に記載されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、およびさらにより好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、２ｍｇ／ｋｇ体重〜９ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重〜８ｍｇ／ｋｇ体重、４ｍｇ／ｋｇ体重〜７ｍｇ／ｋｇ体重または５ｍｇ／ｋｇ体重〜６ｍｇ／ｋｇ体重に及ぶ。当業者は、特定の因子が被験体を有効に治療するのに必要とされる用量に影響を与え得ることを理解し得、その特定の因子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：被験体の、疾患または障害の重篤度、以前の処置、全身の健康状態および／または年齢ならびに現存する他の疾患。さらに、治療有効量のタンパク質、ペプチド、または抗体を用いる被験体の処置は、単回の処置を含み得、好ましくは、一連の処置を含み得る。
【０１２５】
好ましい例においては、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ細胞増殖の範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドを用いて、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間の間、１週間に１回、処置される。処置のために使用される抗体、タンパク質またはポリペプチドの有効投与量が、特定の処置の経過にわたって増大し得るかまたは減少し得ることもまた、明らかである。投与量の変化が生じ得、そして本明細書中に記載されているような診断アッセイの結果から生じ得ることは明白となり得る。
【０１２６】
本発明は、発現または活性を調節する因子を含む。因子は、例えば、低分子であり得る。例えば、このような低分子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約１０，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物（すなわち、へテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約５，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約１，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約５００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および薬学的に受容可能な他の形態。低分子因子の適切な用量が当該分野の医師、獣医師または研究者の知識内の多くの要因に依存することが、理解される。低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの正体、サイズおよび状態に依存して変化し、適用可能な場合、この組成物が投与される経路、およびこの低分子が有していることを開業医が所望する、本発明の核酸またはポリペプチドに対する効果にさらに依存して、変化する。
【０１２７】
代表的な用量は、被験体またはサンプル重量１ｋｇあたりｍｇまたはμｇの量の低分子を含む（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ）。低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性に対するこの低分子の効力に依存することがさらに理解される。このような適切な用量は、本明細書中で記載されるアッセイを使用して、決定され得る。これらの低分子の１つ以上が、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医または研究者は、例えば、初めに比較的低い用量を処方し、続いて、適切な応答が得られるまで、この用量を増加し得る。さらに、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、被験体の年齢、細胞増殖、身体全体の健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む種々の因子に依存することが、理解される。
【０１２８】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）が、治療的部分（例えば、細胞毒、治療剤または放射性金属イオン）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性剤としては、細胞に対して有害な任意の因子を含む。治療剤としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにｃｉｓ−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２９】
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を調節するために使用され得、薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス体外毒素またはジフテリア毒素）；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベータ；または生物学的応答調節因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子）が挙げられる。
【０１３０】
このような治療的部分を抗体に結合するための技術は、周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），ｐｐ．２４３〜５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５），およびＴｈｏｒｐｅら、「Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号においてＳｅｇａｌにより記載されるように、第２の抗体と結合体化して、抗体ヘテロ結合体を形成する。
【０１３１】
本発明の方法において使用される核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）が組換え細胞からインタクトで産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
【０１３２】
（Ｂ．薬物ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本発明の治療方法と共に、薬物ゲノム学（すなわち、被験体の遺伝子型とこの被験体の外来化合物または薬物に対する応答との間の関係の研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することにより、重篤な毒性または治療不良をもたらし得る。従って、医師または臨床医は、Ｐ−セレクチンアンタゴニスト（例えば、可溶性ＰＳＧＬ−１）を投与するか否かを決定する際、ならびにＰＳＧＬ−１活性を調節する薬剤を用いる処置の投薬量および／または治療レジメンを変更する際に、関連の薬物ゲノム学研究において得られた知識を適用することを考慮し得る。
【０１３３】
薬物ゲノム学は、変更された薬物処置および罹患した個人における異常な作用に起因する薬物に対する応答における、臨床学的に有意な遺伝的変異を処置する。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理遺伝学的条件が、区別され得る。
【０１３４】
遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する（変更された薬物作用）単一因子としてか、または身体が薬物に作用する様式を変更する（変更された薬物代謝）単一因子として伝わった。これらの薬理遺伝学的条件は、稀な遺伝子欠損としてかまたは天然に存在する多型としてかの、いずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−ホスフェートアミノペプチダーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化薬剤（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０１３５】
「ゲノムワイドアソシエーション（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための、１つの薬物ゲノム学アプローチは、すでに知られているゲノム関連マーカー（例えば、「二座対立遺伝子」遺伝子マーカーマップ（これは、６０，０００〜１００，０００の多型またはヒトゲノム上の可変性部位からなり、これらの各々が、２つの改変体を有する））からなるヒトゲノムの高解像度マップに、主に依存する。このような高解像度ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、第ＩＩ期／第ＩＩＩ期の薬物試験に参加した、統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高解像度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万の公知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ」は、ＤＮＡのストレッチにおいて、単一ヌクレオチド塩基において生じる一般的な変更である。例えば、ＳＮＰは、ＤＮＡの１０００塩基毎に１回起き得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連しないかもしれない。このようなＳＮＰの発生に基づくゲノムマップが与えられると、個体は、個々のゲノムにおいて、ＳＮＰの特定のパターンに依存して、遺伝子のカテゴリーに分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝子学的に類似の個体の間で共通であり得る特性を考慮して、このような遺伝子学的に類似の個体の群に対して変更され得る。
【０１３６】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法は、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物の標的（例えば、本発明のＰＳＧＬ−１タンパク質）をコードする遺伝子が既知である場合、その遺伝子の全ての共通の改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対して１つの遺伝子バージョンを有することが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
【０１３７】
例示的実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見は、標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に、予測される薬物効果を得ることも過大な薬物応答および重篤な毒性を示すこともない患者が存在する理由に関する説明を提供した。これらの多型は、その集団中で２つの表現型（代謝が速い者（ＥＭ）および代謝が遅い者（ＰＭ））で表わされる。ＰＭの普及率は、種々の集団間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、非常に多型性であり、そしていくつかの変異が、ＰＭにおいて同定されており、そのすべてが、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝速度が遅い者は、標準的用量を受けたときに、過大な薬物応答および副作用を非常に頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６が形成した代謝物であるモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について示されるような、治療応答を示さない。その他の極端な者は、標準的用量に対して応答しない、いわゆる代謝が著しく速い者である。最近、著しく速い代謝の分子的基礎が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定された。
【０１３８】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物（例えば、本発明のＰＳＧＬ−１分子またはＰ−セレクチンアンタゴニスト）を投薬された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路が作動したか否かの指標を与え得る。
【０１３９】
上記薬物ゲノム学的アプローチのうちの１つより多くから得られる情報が、被験体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定するために使用され得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、それによって、Ｐ−セレクチン活性を調節する薬剤で、虚血およびまたは再灌流傷害によって引き起こされる組織または器官の損傷を処置、予防、または低減する場合、治療効果または予防効果を増強し得る。
【０１４０】
（Ｖ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、モジュレーター（すなわち、ＰＳＧＬ−１タンパク質に結合するか、ＰＳＧＬ−１発現またはＰＳＧＬ−１活性に対する刺激効果または阻害効果を有するか、あるいはＰＳＧＬ−１標的分子（例えば、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン）の発現または活性に対する刺激効果または阻害効果を有するか、あるいはＰＳＧＬ−１標的分子を発現する細胞（例えば、内皮細胞および活性化血小板）に対する影響（例えば、細胞の移動または接着の阻害）を有する、候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子、リボザイム（ｎｉｂｏｚｙｍｅ）またはＰＳＧＬ−１アンチセンス分子））を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」ともいわれる）を提供する。本明細書中に記載されるアッセイを使用して同定される化合物は、虚血の後に再灌流を生じる組織および器官の損傷を処置、予防、または低減するために有用であり得る。
【０１４１】
候補化合物／試験化合物としては、例えば、以下が挙げられる：１）可溶性ペプチドのようなペプチド（Ｉｇをテイルとする融合ペプチドならびにランダムペプチドライブラリー（例えば、Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６を参照のこと）およびＤ立体配置アミノ酸および／またはＬ立体配置アミノ酸から作製されるコンビナトリアルケミストリー由来の分子ライブラリーのメンバーが挙げられる）；２）リンペプチド（例えば、ランダムかつ部分的に分解した特異的リンペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇ，Ｚ．ら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８を参照のこと）；３）抗体（例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体、および単鎖抗体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメント、および抗体のエピトープ結合フラグメント）；ならびに４）有機低分子および無機低分子（例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然物ライブラリーから得られる分子）。
【０１４２】
本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれか（生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並列固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）を使用して取得され得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１４３】
分子ライブラリーの合成方法の例としては、例えば、以下のような当該分野で見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
【０１４４】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、あるいはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ前出）上で調製され得る。
【０１４５】
ＰＳＧＬ−１活性およびＰ−セレクチン活性を調節する化合物を同定するために使用され得るアッセイとしては、以下が挙げられる：^５１Ｃｒ標識細胞（例えば、白血球）を使用する細胞接着についてのアッセイ（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙら（２０００）Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １３０（１）：９５に記載される）、ならびに細胞移動（例えば、血小板、好中球および白血球の移動）についてのアッセイ（例えば、Ｋｏｇａｋｉら（１９９９）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓ ４３（４）：９６８およびＢｅｎｇｔｓｓｏｎら（１９９９）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ５９（６）：４３９に記載される）。
【０１４６】
１つの局面において、アッセイは、ＰＳＧＬ−１タンパク質、またはＥ−セレクチンもしくはＰ−セレクチンの結合に関与すると考えられるＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的に活性な部分（例えば、配列番号２のアミノ酸残基４２〜６０）を発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてＰＳＧＬ−１活性を調節する試験化合物の能力が決定される、細胞ベースのアッセイである。好ましい実施形態において、ＰＳＧＬ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、Ｐ−セレクチンと相互作用し得るかまたはＰ−セレクチン媒介細胞接着を阻害し得るドメインまたはモチーフを含む。ＰＳＧＬ−１活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、細胞接着または細胞移動をモニタリングすることによって達成され得る。例えば、細胞は、哺乳動物起源であり得る（例えば、内皮細胞または白血球）。
【０１４７】
試験化合物が、基質へのＰＳＧＬ−１の結合を調節する能力またはＰＳＧＬ−１に結合する能力もまた、決定され得る。基質へのＰＳＧＬ−１の結合を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、ＰＳＧＬ−１へのＰＳＧＬ−１基質の結合が、複合体中の標識化ＰＳＧＬ−１基質を検出することによって決定され得るように、放射性同位元素標識または酵素標識とＰＳＧＬ−１基質とを結合することによって達成され得る。あるいは、複合体中でＰＳＧＬ−１基質へのＰＳＧＬ−１の結合を調節する試験化合物の能力をモニターするために、ＰＳＧＬ−１が、放射性同位元素標識または酵素標識と結合され得る。ＰＳＧＬ−１に結合する試験化合物の能力を決定することは、例えば、ＰＳＧＬ−１への化合物の結合が、複合体中の標識化ＰＳＧＬ−１化合物を検出することによって決定され得るように、放射性同位元素標識または酵素標識と化合物とを結合することによって達成され得る。例えば、ＰＳＧＬ−１基質は、直接的かまたは間接的にかのいずれかで、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３Ｈで標識化され得、そして放射性同位元素は、電波放出の直接的な計数またはシンチレーション計数によって検出され得る。あるいは、化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素的に標識化され得、そして酵素的標識は、適切な基質の産物への変換の決定によって検出され得る。
【０１４８】
化合物が、いずれの相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）の標識化もなしでＰＳＧＬ−１と相互作用する能力を決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、微小生理機能測定器（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化合物またはＰＳＧＬ−１のいずれの標識化もなしで、ＰＳＧＬ−１との化合物の相互作用を検出し得る（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書中で使用される場合、「微小生理機能測定器」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光でアドレス可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物とＰＳＧＬ−１との間の相互作用の指標として使用され得る。
【０１４９】
別の実施形態において、本発明のアッセイは、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分（例えば、Ｐ−セレクチンに結合し得るＰＳＧＬ−１のフラグメント）が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物がＰＳＧＬ−１タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分に結合する能力、またはこれらの活性を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）能力が決定される、無細胞アッセイである。本発明のアッセイにおいて使用されるＰＳＧＬ−１タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分としては、非ＰＳＧＬ−１分子との相互作用に関与するフラグメント（例えば、高い表面確率スコアを有するフラグメント）が挙げられる。試験化合物がＰＳＧＬ−１タンパク質に結合する能力を決定することはまた、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５ならびにＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を用いて達成される。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用体も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用体を検出するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る。
【０１５０】
本発明の上記のアッセイ方法の１つ以上の実施形態において、ＰＳＧＬ−１またはＰ−セレクチンのいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易にし、そしてこのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物のＰＳＧＬ−１タンパク質への結合、または試験化合物の存在下および非存在下でのＰＳＧＬ−１タンパク質のＰ−セレクチンとの相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを追加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＳＧＬ−１の融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的の融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらを、試験化合物と混ぜ合わせるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質またはＰＳＧＬ−１タンパク質のいずれかと混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成を招く条件下（例えば、塩およびｐＨに関する生理学的条件）でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そしてＰＳＧＬ−１結合レベルまたはＰＳＧＬ−１活性レベルを標準的な技術を使用して決定し得る。
【０１５１】
タンパク質をマトリクス上に固定するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチン分子は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を使用して固定され得る。ビオチン化されたＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンタンパク質を、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定し得る。あるいは、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンと反応性であるが、ＰＳＧＬ−１タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＰＳＧＬ−１タンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定化複合体に関しての上記のものに加えて、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンと反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびにＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンに関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０１５２】
本発明のなお別の局面において、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはそのフラグメント（例えば、Ｐ−セレクチンもしくはＥ−セレクチンを結合し得るフラグメント）は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において、ＰＳＧＬ−１と結合または相互作用する他のタンパク質（「ＰＳＧＬ−１結合タンパク質」または「ＰＳＧＬ−１−ｂｐ」）、およびＰＳＧＬ−１活性に関与する他のタンパク質を同定するために「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され得る。そのようなＰＳＧＬ−１結合タンパク質は、例えば、ＰＳＧＬ−１媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントとして、ＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰＳＧＬ−１標的によるシグナルの伝達に関与している可能性もある。あるいは、このようなＰＳＧＬ−１結合タンパク質は、ＰＳＧＬ−１インヒビターである可能性がある。
【０１５３】
このツーハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子のモジュラー型の性質に基づく。ほとんどの転写因子は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡単に述べると、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物において、ＰＳＧＬ−１タンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とがインビボで相互作用してＰＳＧＬ−１依存性複合体を形成し得る場合、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは、近接する。このように近くにあることにより、その転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。そのレポーター遺伝子の発現が検出され得、そしてその機能的な転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そしてＰＳＧＬ−１タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得るために使用され得る。
【０１５４】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節剤が、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そしてその因子がＰ−セレクチンリガンドアンタゴニストの活性を調節する能力が、例えば、動物モデル（例えば、虚血についての動物モデル（例えば、発作についての動物モデル））においてインビボで確認され得る。虚血および再灌流についての動物モデルとしては、本明細書中に記載される動物モデルおよび少なくとも以下に記載される動物モデルが挙げられる：例えば、Ｓａｒａｂｉら（２００１）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１７０（２）：２８３−９；Ｄｅｓｃｈｅｅｒｄｅｒら（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒ １４（７）：６９１−７；Ｏｈａｒａら（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｒｅｒ．８（１１）：８３７；およびＤａｍｍｅｒｓら（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．８８（６）：８１６−２４．
さらに、本明細書中に記載されるように同定されたＰＳＧＬ−１調節因子（例えば、アンチセンスＰＳＧＬ−１核酸分子、ＰＳＧＬ−１特異的抗体、または低分子）が、そのような調節因子を用いる処置の効力、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定されたＰＳＧＬ−１調節因子が、このような調節因子の作用機構を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。
【０１５５】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、この実施例は、限定と解釈されるべきではない。本願全体にわたって引用される全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容、ならびに図面および配列表は、本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０１５６】
（実施例１：Ｐ−セレクチンリガンドタンパク融合体）
この実施例は、二量体Ｐ−セレクチンリガンド融合タンパク質（本明細書中で、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇとも称される）の生成を記載する。シグナルペプチド、ＰＡＧＥ切断部位、およびネイティブＦｃ配列のＨｉｓ２２４でヒトＩｇＧ１の変異Ｆｃ領域成熟に融合されたＰ−セレクチンリガンド配列の最初の４７アミノ酸をコードするｃＤＮＡを構築した。ｃＤＮＡ構築物の配列を、配列番号３として報告する。その融合点は、ヌクレオチド２６１の新規ＮｏｔＩ部位である。このｃＤＮＡ構築物によりコードされるアミノ酸配列を、配列番号４として報告する。コードされる融合タンパク質の成熟アミノ酸配列は、配列番号４のアミノ酸４２で開始する。Ｆｃ部分における変異は、ネイティブＦｃ配列のＬｅｕ２３４およびＧｌｙ２３７のＡｌａへの変更であった。
【０１５７】
（実施例２：脳に対する虚血／再灌流損傷の減弱における可溶性Ｐ−セレクチン（ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）の効果）
この実施例は、虚血の動物モデルにおける脳に対する虚血／再灌流損傷の減弱における可溶性Ｐ−セレクチン（ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）の効果を試験する研究の結果を記載する。この動物モデルにおける結果は、ヒトにおける結果の推定となるということが有望である。
【０１５８】
（材料および方法）
頭蓋骨ウィンドウ（ｃｒａｎｉａｌ ｗｉｎｄｏｗ）を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００グラム）に移植した。ウィンドウを配置した日に、ラットを、ペントバルビタール（４０ｍｇ／ｋｇＩ．ｐ．）で麻酔した。この動物を、虚血の誘導の前に少なくとも４日間回復させた。全ての動物を、虚血発作の前夜に絶食させた。麻酔を、ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）の１：１混合物を、０．１ｍｌ／１００ｇ体重でｉ．ｍ．誘導した。中大脳動脈の一過性の閉塞についてＢｅｌａｙｅｖ，Ｌら（１９９６）Ｓｔｒｏｋｅ ２７（９）：１６１６−２２に記載されるような、Ｋｏｉｚｕｍｉらにより開発された技術の改良版を用いて、限局的虚血発作を生成した。縫合を、外頸動脈を介して、内頸動脈に導入した。この縫合を、３０分または１２０分維持し、次いで除去した。中大脳動脈が各々の動物において十分に閉塞されたことを確認するために、体性感覚誘発電位（ＳＳＥＰ）を、縫合の配置の前後でモニタリングした。縫合を配置した場合に誘発応答の損失を示した動物のみを含めた。脳の温度を、３７℃で維持した。
【０１５９】
これらのラットを、各々の研究において、２つの群（処置群および非処置群）に分けた。第１の研究において、処置動物は、中大脳動脈からの縫合の除去の１分前にｒＰＳＧＬ−Ｉｇ（１ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に受けた。第２の研究において、それらは、虚血の前に薬物（４ｍｇ／ｋｇ）を受けた。非処置動物は、薬物の代わりに、等量のビヒクルを静脈内に受けた。落射照明顕微鏡を、頭蓋骨表面の生体内顕微鏡試験のために使用した。中央密度フィルターを使用して、光強度を減少し、そして光毒性を回避した。Ｇｅｎｉｓｙｌ画像増感子に接続されたＣＣＤカメラを用いて、微小血管床のビデオ画像をビデオテープレコーダーに送信した。画像増感子の使用により、組織の低強度の曝露でビデオ画像を記録することが可能になった。証明強度は、白血球ローリングおよび接着に直接的に影響する。２０倍水浸レンズを、微血管床の拡大に使用した。２０〜４５μｍの範囲の毛細後細静脈（Ｐｏｓｔ−ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｅｎｕｌｅ）を観察のために選択した。測定を、血管分枝点の２００μｍ下流で行った。細静脈を、白血球ローリングおよび接着の分析のためにビデオテープに録画した。
【０１６０】
この研究の最後に、これらの動物を、ペントバルビタールで麻酔し、そして断頭した。脳を直ちに取りだし、そして切片化を容易にするために冷たい（４℃）生理食塩水中に配置した。５つの冠状切片を作製した。次いで、各々の切片を、この溶液中で、暗所にてインキュベートし（３７℃で３０分間）、次いで、１０％リン酸緩衝生理食塩水中で固定した。固定された切片を解剖顕微鏡下に置きそして写真撮影した。５つの切片の各々を頭側と尾側の両方で写真撮影した。写真画像を、梗塞サイズのコンピュータ分析のために、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｆｉｌｍｗｏｒｋｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）によってデジタル化した。
【０１６１】
（結果）
この結果は、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇが、一過性の虚血後の脳の表面上での細静脈における白血球ローリングを減弱する傾向を有することを示した。細静脈における白血球ローリングは、中大脳動脈の閉塞の３０分後の再灌流の間の測定のために選択された全ての時間の間により低い傾向を有する（図１を参照のこと）閉塞の１２０分後、ローリングは、再灌流の６０分後により低い傾向を有する（図２を参照のこと）。このことは、少なくとも一部、剪断率の差に起因し得る。
【０１６２】
閉塞の３０分の持続時間は、信頼できる脳への梗塞を生成するのに不十分であった。１２０分間の中大脳動脈の閉塞は、非処置動物における同側大脳半球の薬３２％の梗塞を引き起こした。この梗塞の大きさは、再灌流の１分前のｒＰＳＧＬ−Ｉｇの投与によりわずかに（同側半球の約２６％まで）減少した。これらの動物における梗塞の大きさは、再灌流の間により低い用量を受けた梗塞よりもわずかに小さかった（２２％）が、この結果は、大きくは異ならない。
【０１６３】
これらの結果は、Ｐ−セレクチンの発現が、虚血および／または再灌流損傷に対する重要な寄与因子であることを示す。この結果はまた、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇは、一過性の虚血後の大脳皮質における細静脈に沿った白血球ローリングと干渉したことを示す。虚血の前または再灌流の間のいずれかでの、Ｐ−セレクチンアンタゴニスト（例えば、ｒＰＳＧＬ−Ｉｇ）によるＰ−セレクチンのブロッキングは、一過性の虚血により引き起こされる脳への損傷の大きさを減少するのに効果的である。
【０１６４】
当業者は、慣用にすぎない実験を用いて、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識または確認する。このような等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、中大脳動脈の閉塞の３０分後の再灌流障害の間の脳の表面上の細静脈における白血球ローリングに対するｒＰＳＧＬ−Ｉｇの効果を示すグラフである。
【図２】図２は、中大脳動脈の閉塞の１２０分後の再灌流障害の間の脳の表面上の細静脈における白血球ローリングに対するｒＰＳＧＬ−Ｉｇの効果を示すグラフである。

Claims (28)

1. 虚血後の被験体の脳における再灌流損傷を予防または低減する方法であって、Ｐ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメントを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
2. 前記被験体が、発作に罹患している、請求項１に記載の方法。
3. 前記再灌流損傷が、皮膚梗塞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記Ｐ−セレクチンアンタゴニストが、抗Ｐ−セレクチンリガンド抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
5. 前記Ｐ−セレクチンアンタゴニストが、可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質またはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメントである、請求項１に記載の方法。
6. 前記可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質が、ヒトＰＳＧＬ−１である、請求項５に記載の方法。
7. 前記可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質が、組換えタンパク質である、請求項５に記載の方法。
8. 前記可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質が、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項５に記載の方法。
9. 前記免疫グロブリンが、ヒトＩｇＧ_１である、請求項８に記載の方法。
10. 前記可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質が、組換えヒトＰＳＧ−Ｉｇ融合タンパク質である、請求項５に記載の方法。
11. 前記フラグメントが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸４２〜アミノ酸６０を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記フラグメントが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸４２〜アミノ酸８８を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記フラグメントが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸４２〜アミノ酸１１８を含む、請求項１０に記載の方法。
14. 前記フラグメントが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸４２〜アミノ酸１８９を含む、請求項１０に記載の方法。
15. 前記フラグメントが、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸４２〜アミノ酸３１０を含む、請求項１０に記載の方法。
16. 前記可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４２〜アミノ酸８８までのアミノ酸配列を含み、そのＣ末端が、免疫グロブリンのＦｃ部分と融合されている、請求項４に記載の方法。
17. 前記可溶性ＰＳＧＬ−１タンパク質がさらに、免疫グロブリンのＦｃ部分を含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記被験体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
19. 前記Ｐ−セレクチンアンタゴニストが、再灌流の前に被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
20. 前記Ｐ−セレクチンアンタゴニストが、有効量の接着分子の１つ以上のインヒビターと組み合わせて被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
21. 前記Ｐ−セレクチンアンタゴニストが、再灌流の間に被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
22. 前記Ｐ−セレクチンアンタゴニストが、有効量の接着分子の１つ以上のインヒビターと組み合わせて被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
23. 被験体において、該虚血後の被験体の脳における梗塞を予防または低減する方法であって、Ｐ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメントを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
24. 被験体において発作後の脳に対する損傷を予防または低減する方法であって、Ｐ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメントを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
25. 再灌流後の被験体の脳における血管に対する細胞接着を阻害する方法であって、Ｐ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメントを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
26. 前記細胞が白血球である、請求項２５に記載の方法。
27. 被験体の脳において再灌流後の該被験体における細胞間接着を阻害する方法であって、Ｐ−セレクチンアンタゴニストまたはＰ−セレクチンリガンド活性を有するそのフラグメントを含む有効量の組成物を投与する工程を包含する、方法。
28. 前記細胞が、白血球および血小板である、請求項２７に記載の方法。

Images