JP2005509416A - ５７７、２０７３９、または５７１４５を使用して疼痛および有痛性傷害を処置するための方法および組成物 - Google Patents

５７７、２０７３９、または５７１４５を使用して疼痛および有痛性傷害を処置するための方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、疼痛または有痛性障害の診断および処置のための方法に関する。詳細には、本発明は、正常すなわち、有痛疾患でない状態でありそして／または疼痛に関する操作に応答した５７７遺伝子、２０７３９遺伝子または５７１４５遺伝子の発現に対して、痛覚に関連する組織におけるそれらの示差的な発現を同定する。本発明は、種々の心臓血管疾患の診断的評価および予後診断のため、およびそのような状態の素因を示す被験体の同定のための方法を記載する。本発明はまた、疼痛または有痛性障害を調節し得る化合物を同定するための方法を提供する。本発明はまた、疼痛および有痛性障害の処置としての、化合物の同定および治療的使用のための方法を提供する。

Description

本出願は、２００１年１１月６日に出願した米国仮特許出願番号６０／３３３，０７３に対する優先権を主張する。この米国仮特許出願の内容全体が、本明細書中に参考として援用される。
疼痛の感覚は、２つの型（末梢疼痛および中枢疼痛）に分類され得る。末梢疼痛は、広範な３つの領域（侵害受容疼痛、炎症疼痛、および神経障害性疼痛）に分類され得る。侵害受容疼痛はまた、生理学的疼痛とも呼ばれる。この侵害受容疼痛は、動物界全体にわたる防御機構として作用する。炎症疼痛は、重篤な創傷から生じ、そして／または炎症浸潤物と関連している。この炎症疼痛は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＡＳＡＩＤ）様薬物、ステロイド類、およびアヘン剤によって十分に制御され得る。しかし、神経障害性疼痛の病因および管理は、十分には理解されていない。神経障害性疼痛は、感覚における固有の欠損から交感ニューロンにおける結果として生じると考えられている。神経障害性疼痛は、外傷に従属し得る。
末梢疼痛は、２つの型の一次交感ニューロンのクラス（Ａｄ線維およびＣ線維）により媒介される。これらの線維の細胞体は、脊髄神経節内部に存在する。神経障害性疼痛の発生機構は十分には理解されていないが、いくつかの要因（すなわち、化学的環境の変化、感覚ニューロン発射の異所性発生および交感神経放電）が、有痛性刺激の知覚および伝達に影響することは、明らかである。神経障害性疼痛に関連する最も一般的な症候群のうちのいくつかは、小感覚線維の破壊（または、おそらく小線維対大線維比の変化）から生じる。なぜなら、この破壊は、外傷後状況において一般的であるからである。他の疼痛病因は、糖尿病性ニューロパシーに起因する小線維損傷、薬物誘導性損傷（化学療法薬物）、アルコール症、癌に起因する損傷、ならびに種々の遺伝性小線維ニューロパシーおよび遺伝性大線維ニューロパシーから生じる。本発明者らは、末梢神経系に由来する標的は、候補化合物が血液脳関門を通過する必要がなく、それらの標的は、中心的な副作用を誘導することなく疼痛開始部位に対して作用し得るという点で、戦略的に有益でありうることを合理的に説明する。
中心機構が痛覚の認識および調節に関与することは、長い間立証されてきた。中脳水道周囲灰白質（ＰＡＧ）領域の電気的刺激は、他の感覚的様相の欠損なしに無痛を生じる。ＰＡＧから発する下向性痛覚経路および大縫線核は、最初に侵害受容性求心性神経が終結する背面の脊髄領域に影響を与える。また、例えば延髄の巨大細胞核近傍（ｐａｒａｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）のような領域の刺激は、無痛を生じる。最後に、アヘン剤レセプターは、オピオイドアルカロイドおよびオピオイドペプチドにより刺激された場合、無痛を媒介し、これらの部位は、ＰＡＧ、視床核および皮質領域を含む脳内の重要な「痛覚中心」に位置する。痛覚の動物モデルからのこれらのＣＮＳ領域および脊髄視床路における遺伝子の同定は、痛覚調節の重要な標的を解明し得る。
本発明は、痛みを経験しているかまたは疼痛性障害に罹患した被験体の診断および処置のための方法および組成物を提供する。好ましくは、被験体はヒト（例えば、本明細書で開示されている疼痛または疼痛関連疾患を有する患者）である。例えば、被験体は組織損傷（例えば、炎症、感染、虚血）から誘発される疼痛；筋骨格疾患に関連する疼痛（例えば、関節痛）；歯痛；頭痛（例えば、片頭痛）；手術に関連した疼痛；炎症に関係する疼痛（例えば，過敏性腸症候群）；または胸部疼痛を有する患者であり得る。被験体は、複合局部疼痛症候群（ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＣＲＰＳ），反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）、カウザルギー、神経痛、中心性疼痛および感覚不全症候群、頚動脈圧痛、神経原性疼痛、難治性頚腕部疼痛症候群、筋膜疼痛症候群、頭蓋下顎疼痛機能不全症候群（ｃｒａｎｉｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｐａｉｎ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性特発性疼痛症候群、コステン疼痛機能不全、急性胸部疼痛症候群、婦人科疼痛症候群、膝蓋大腿疼痛症候群（ｐａｔｅｌｌｏｆｅｍｏｒａｌ ｐａｉｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、前膝疼痛症候群、小児反復性腹痛、疝痛、腰痛症候群、神経因性疼痛、切断による幻肢痛、幻歯痛、または象徴不能痛を有する患者であり得る。被験体は、癌患者（例えば、脳の癌、骨の癌、または前立腺癌を有する患者）であり得る。他の実施形態において、被験体は、非ヒト動物（例えば、実験動物（例えば、慢性疼痛の関節炎ラットモデル、神経因性疼痛の慢性狭搾傷害（ＣＣＩ）ラットモデル、またはフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の胸膜腔内注射による片側炎症痛のラットモデル））である。
本明細書で使用される場合、「処置」は、疾患もしくは障害、疾患もしく障害の症状または疾患もしくは障害に対する疾病素質を療養する、治癒、軽減、緩和、変化、治療、回復、改善するか、またはこれらに影響する目的で、患者（疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害に対する疾病素質を有する）への治療薬の適用もしくは投与、またはその患者から単離した組織もしくは細胞への治療薬の適用もしくは投与として定義される。治療薬としては、本明細書に記載される小分子、ペプチド、抗体、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これに限定されない。
本発明は、核酸分子およびタンパク質分子（下記）が、疼痛の動物モデル、ならびに疼痛に関連することが知られている末梢神経系組織および中枢神経系組織（例えば、後根神経節（ＤＲＧ））において示差的に発現されるという発見に少なくとも一部基づく。本発明の方法に従って同定される、本発明の分子のモジュレーターを使用して、疼痛および有痛性状態を調節（例えば、阻害、処置または予防）し得る。
本明細書中で使用される場合、「示差的発現」は、遺伝子の一時性発現パターンおよび／または組織発現パターンにおける、定量的差異および定性的差異の両方を含む。従って、示差的に発現される遺伝子は、有痛性疾患状態に対して正常状態において（例えば、疼痛に対する動物モデルのような実験的疼痛モデル系において）活性化される発現または不活性化される発現を有し得る。正常状態 対 処置状態または制御状態 対 実験状態で発現が異なる程度は、標準的な特徴付け技術（例えば、定量的ＰＣＲ、ノーザン分析、減算ハイブリダイゼーション）によって可視化されるのに十分な大きさのみを必要とする。示差的に発現される遺伝子の発現パターンは、予後評価もしくは診断評価の一部として使用され得るか、または疼痛および有痛性障害を処置するために有用な化合物を同定するための方法において使用され得る。さらに、心臓血管疾患に関与する示差的に発現される遺伝子は、標的遺伝子を表し、その結果、標的遺伝子の発現レベルまたは標的遺伝子産物活性の調節は、有痛性疾患状態を改善するように作用し得る。標的遺伝子発現またはこの標的遺伝子産物の活性を調節する化合物は、疼痛または有痛性状態の処置において使用され得る。本明細書中に記載される遺伝子は、疼痛に関して示差的に発現され、かつ／またはそれらの産物は、疼痛に重要な遺伝子産物と相互作用し得るが、この遺伝子はまた、さらなる細胞プロセスに重要な機構にも関与し得る。
（本発明の分子）
本発明の分子としては、イオンチャネル（例えば、カリウムチャネル）、トランスポーター（例えば、アミノ酸トランスポーター）、レセプター（例えば、Ｇタンパク質共役レセプター）および酵素（例えば、キナーゼ）が挙げられる。
ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンおよび塩化物イオンの伝導度を選択的に媒介する膜貫通型イオンチャネルタンパク質は、感覚神経の電気的活性を直接的に調節し、従って、侵害受容に重要である。特に、カリウムチャネルは、神経発射（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｆｉｒｉｎｇ）の頻度およびパターンの制御における主要因子（ｐｌａｙｅｒ）である。カリウムチャネルの発現およびピーク電流は、炎症および慢性疼痛の異なるモデルの後に調節されることが示されている。さらに、カルシウムイオンは、他のイオンチャネルの調節ならびにプロテインキナーゼおよび他の酵素の活性の制御を含む、重要な細胞内シグナル伝達の役割を果たす。構築された三次元構造および作用機序を有する細胞表面タンパク質として、イオンチャネルの孔形成（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ）αサブユニットは、理想的な薬物標的を構成する。αサブユニットに加えて、これらのチャネルは、βサブユニットおよびチャネル活性を調節し、かつチャネルの薬理学的操作のための優れた標的である他の相互作用タンパク質から構成され得る。従って、イオンチャネルは、疼痛および有痛性の状態を処置するのに有用である。
内因性の可溶性因子は、侵害受容神経の周辺末端上またはこれらの侵害受容器から入力を受ける中枢神経上のいずれかの特異的膜貫通型レセプターに結合することによって、痛覚を媒介する。これらの可溶性因子としては、セロトニン、ヒスタミン、ブラジキニン、タキキニン（物質ＰおよびニューロキニンＡ）、オピオイド、エイコサノイド（ロイコトリエン、プロスタグランジン、トロンボキサン）、プリン、興奮性アミノ酸および種々のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、人における臨床試験を含む、成長する体の徴候は、ＩＬ−１、ＴＮＦａ、およびニューロトロフィンファミリーのメンバーが、有痛性刺激の伝達におけるいくつかの段階に関与することを示す。水素イオン（プロトン）は、痘瘡様レセプターカルシウムチャネルまたはアミロライド感受性ナトリウムチャネルの活性化によって、炎症（およびまた酸味）に付随する疼痛を媒介し得る。さらに、多数の外因性の薬剤は、内因性の可溶性因子を模倣することによって疼痛を調節する。例えば、アヘン剤の乱用は、内因性のオピオイドのためのレセプターに結合することによって無痛覚効果を及ぼし、そしてカプサイシンは、痘瘡様レセプターに結合することによって痛覚を刺激する。これらの可溶性因子のためのレセプターは、チロシンキナーゼ活性（例えば、ニューロトロフィンレセプター）、細胞質内チロシンキナーゼの漸増（例えば、ＴＮＦａおよびＩＬ−１のためのサイトカインレセプター）、イオンチャネル開口、およびＧタンパク質結合レセプターを含むいくつかのシグナル伝達機構にリンクされる。これらの細胞表面レセプターは、それらの膜貫通型配置に起因して理想的な薬物標的であり、目的は、疼痛機構の制御における重要な因子（ｐｌａｙｅｒ）であり得る既知のリガンドまたは代理のリガンドを有するＧタンパク質結合レセプターを発見することである。
プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣのような細胞内キナーゼは、感覚神経における疼痛の応答に関与している。同様に、シクロオキシゲナーゼおよびトロンボキサンシンテターゼのような酵素は、プロスタグランジン、ロイコトリエンおよびトロンボキサンの生成に重要であると知られている。これらの特定の標的は、炎症性疼痛において重要であり得るが、長期間においてか、または神経障害性の疼痛においてのこの遺伝子ファミリーの役割は、重要である。
（遺伝子番号５７７）
非翻訳領域を含む約１９０８ヌクレオチド長であるヒト５７７配列（配列番号１）（ＧＩ：１８３９２６９、ナトリウム依存プロリントランスポーターとしても知られる）は、約１９１１ヌクレオチドの配列の推定メチオニン開始コード配列を含み、終止コドンを含む（配列番号１および２のコードとして示されるヌクレオチド）。このコード領域は、６３６アミノ酸タンパク質をコードする（配列番号３）（ＧＩ:８１７６７７９）。
ＴａｑＭａｎ分析によって推定されるように、５７７は、脳および後根神経節（ＤＲＧ）において発現される。従って、それは、侵害受容に関与し、そして疼痛および有痛性障害の処置に対する治療を発見するような潜在的な標的でありうる。
（遺伝子番号２０７３９）
非翻訳領域を含む約１６３５ヌクレオチド長であるヒト２０７３９配列（配列番号４）（ＧＩ：３６０８３８５）、Ｐ２１活性化キナーゼ３（ＰＡＫ−３）としても知られる）は、終止コドンを含む約１６３２ヌクレオチドの配列の推定メチオニン開始コード配列を含む（配列番号４および５のコードとして示されるヌクレオチド）。このコード配列は、５４４アミノ酸タンパク質をコードする（配列番号６）（ＧＩ:３６０８３８６）。
ＴａｑＭａｎ分析によって推定されるように、２０７３９は、脳、後根神経節（ＤＲＧ）、上頚神経節（ＳＣＧ）、尿管、精巣、卵巣および脊髄において発現される。さらなるＴａｑＭａｎ分析は、２０７３９ｍＲＮＡが疼痛、ＣＦＡ注入および軸索切断（ａｘｏｍｏｍｙ）の２つのラットモデルにおいてアップレギュレートされたことを示唆した。インサイチュハイブリダイゼーションにおいて、ＤＲＧにおける２０７３９の発現が、ニューロンのすべての大きさに制限されることを示唆した。ＤＲＧ、ＳＣＧおよび脳における２０７３９の発現に起因して、疼痛の２つの動物モデルで制御されるのとともに、２０７３９は、疼痛および有痛性の障害の処置に対する治療を発見するための潜在的な標的であり得る。
（遺伝子番号５７１４５）
非翻訳領域を含む約２５６１ヌクレオチド長であるヒト５７１４５配列（配列番号７）（ＯＣＴ−５としても知られる）は、終止コドンを含む約１６４４ヌクレオチドの推定メチオニン開始コード配列を含む（配列番号７および８のコードとして示されるヌクレオチド）。このコード領域は、５４８アミノ酸タンパク質（配列番号９）をコードする。
ＴａｑＭａｎ分析によって評価されるように、５７１４５は、脳、脊髄神経節（ＤＲＧ）、上頸神経節（ＳＣＧ）、尿管、卵巣および脊髄において発現される。従って、これは、侵害知覚に関係し、そして疼痛および有痛性障害の処置に関する治療剤を発見するための潜在的な標的である。
本発明の種々の局面が、以下の節においてさらに詳細に記載される。
（Ｉ．スクリーニングアッセイ）
本発明は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質もしくは５７１４５タンパク質に結合するか、あるいは例えば、５７７発現、２０７３９発現もしくは５７１４５発現または５７７活性、２０７３９活性もしくは５７１４５活性に対する刺激効果もしくは阻害効果を有するか、あるいは例えば、５７７基質、２０７３９基質または５７１４５基質の発現または活性に対する刺激効果もしくは阻害効果を有するモジュレーター、すなわち候補または試験化合物または因子（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子（有機もしくは無機）または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中で「スクリーニングアッセイ」ともいわれる）を提供する。本明細書中に記載されるアッセイを使用して同定された化合物は、疼痛および有痛性の状態を処置するために有用であり得る。
これらのアッセイは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質に結合する化合物、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質と相互作用する他の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質に結合する化合物、および５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質と他の細胞内タンパク質または細胞外タンパク質との相互作用を妨害する化合物を同定するために設計される。例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質（これらは、膜貫通レセプター型タンパク質である）の場合、このような技術は、このようなレセプターに対するリガンドを同定し得る。５７７タンパク質リガンド、２０７３９タンパク質リガンドもしくは５７１４５タンパク質リガンド、または５７７タンパク質基質、２０７３９タンパク質基質もしくは５７１４５タンパク質基質は、例えば、疼痛および有痛性状態を改善するために使用され得る。このような化合物としては、ペプチド、抗体、有機低分子化合物または無機低分子化合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物としては、他の細胞タンパク質も挙げられ得る。
本明細書中に記載されるようなアッセイを介して同定された化合物は、例えば、疼痛および有痛性の状態を処置するために有用であり得る。有痛性の状態が、細胞または組織における全体的に低いレベルの５７７遺伝子発現、２０７３９遺伝子発現もしくは５７１４５遺伝子発現、および／または５７７タンパク質、２０７３９タンパク質もしくは５７１４５タンパク質から生じる場合、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質と相互作用する化合物としては、結合した５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の活性を強調または増幅する化合物が挙げられ得る。このような化合物は、５７７タンパク質活性、２０７３９タンパク質活性または５７１４５タンパク質活性のレベルの有効な増加をもたらし、従って、症状を改善する。
他の場合において、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子または５７１４５遺伝子内の変異は、疼痛を導く有害な効果を有する、異常な型または過剰量の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質を生じさせ得る。同様に、生理学的状態は、疼痛を導く５７７遺伝子発現、２０７３９遺伝子発現または５７１４５遺伝子発現を過剰に増加させ得る。このような場合において、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質に結合する化合物は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の活性を阻害する化合物を同定し得る。この節に記載されるような技術により同定された化合物の有効性を試験するためのアッセイは、本明細書中に論じられる。
１つの実施形態において、本発明は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質もしくは５７１４５タンパク質または５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドまたは５７１４５ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な部分の基質である候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態において、本発明は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質もしくは５７１４５タンパク質または５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドもしくは５７１４５ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性な部分に結合するかまたはその活性を調節する候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれか（生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相ライブラリーまたは液相ライブラリー；逆重畳を必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティクロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む）を使用して取得され得る。生物学的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチドライブラリー、非ペプチドオリゴマーライブラリーまたは低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ、Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成方法の例としては、例えば、以下において当該分野で見い出さられ得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３。
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１）、あるいはビーズ（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ ５，２２３，４０９）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ ＵＳＰ’４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）またはファージ（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ前出）上に提示され得る。
１つの実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質もしくは５７１４５タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分を発現する細胞は、試験化合物と接触され、そして５７７活性、２０７３９活性もしくは５７１４５活性を調節する試験化合物の能力が決定される。５７７活性、２０７３９活性もしくは５７１４５活性を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば、細胞内カルシウム、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、またはジアシルグリセロールの濃度、細胞内タンパク質のリン酸化プロファイル、細胞増殖および／または遊走、例えば、無痛と関連する細胞表面接着分子または遺伝子の遺伝子発現、あるいは５７７調節転写因子、２０７３９調節転写因子もしくは５７１４５調節転写因子の活性をモニタリングすることによって、達成され得る。細胞は、哺乳動物起源の細胞（例えば、神経細胞）であり得る。１つの実施形態において、レセプタードメインと相互作用する化合物は、リガンドとして機能する（すなわち、レセプターに結合し、シグナル伝達経路を調節する）能力についてスクリーニングされ得る。リガンドの同定、およびリガンド−レセプター複合体の活性の測定は、この相互作用のモジュレーター（例えば、アンタゴニスト）の同定を導く。このようなモジュレーターは、疼痛および有痛性の状態の処置において有用であり得る。
試験化合物が、基質に結合する５７７、２０７３９、もしくは５７１４５を調節するか、または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５に結合する能力もまた決定され得る。試験化合物が、基質に結合する５７７、２０７３９、もしくは５７１４５を調節する能力の決定は、例えば、５７７基質、２０７３９基質、もしくは５７１４５基質を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され、その結果、基質の５７７、２０７３９、もしくは５７１４５への結合が、複合体中に標識された５７７基質、２０７３９基質、もしくは５７１４５基質を検出することによって、決定され得る。５７７、２０７３９、または５７１４５はまた、試験化合物が、複合体中の５７７基質、２０７３９基質、または５７１４５基質に結合する５７７、２０７３９、または５７１４５を調節する能力をモニターするために、放射性同位体または酵素標識とカップリングされ得る。試験化合物が５７７、２０７３９、または５７１４５に結合する能力を決定することは、例えば、化合物を放射性同位体または酵素標識とカップリングさせることによって達成され得、その結果、５７７、２０７３９、または５７１４５に対する化合物の結合が、複合体中の標識された５７７化合物、２０７３９化合物、もしくは５７１４５化合物を検出することによって決定され得る。例えば、化合物（例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５のリガンドまたは基質）は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで、直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてこの放射性同位体が、放射線放射の直接的な計数によってか、またはシンチレーション計数によって検出され得る。試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的にさらに標識され得、そしてこの酵素標識は、適切な基質の産物への転換を決定することによって検出され得る。
化合物（例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５のリガンドまたは基質）が、任意の相互作用体（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔ）の標識化を有さない５７７、２０７３９、または５７１４５と相互作用する能力を、決定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、微小生理機能測定器（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を使用して、化合物または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５のいずれかの、標識化を有さない５７７、２０７３９、または５７１４５と化合物との相互作用を検出し得る。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６−１９１２。本明細書中で使用される場合、「微小生理機能測定器」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）は、光でアドレス可能な電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する、分析装置である。この酸性化速度の変化は、化合物と５７７、２０７３９、または５７１４５との間の相互作用の指標として使用され得る。
別の実施形態において、アッセイは、５７７、２０７３９、または５７１４５の標的分子（例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５の基質）を発現する細胞と試験化合物とを接触させること、およびこの試験化合物の、５７７、２０７３９、または５７１４５の標的分子の活性を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）能力を決定することを包含する、細胞ベースのアッセイである。５７７、２０７３９、または５７１４５の標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５の標的分子に結合するか、または５７７、２０７３９、または５７１４５の標的分子と相互作用する５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の能力を決定することによって達成され得る。
５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントが、５７７、２０７３９、または５７１４５の標的タンパク質に結合するか、または５７７、２０７３９、または５７１４５の標的分子と相互作用する能力を決定することは、直接的な結合を決定するための上記の方法のうちの１つによって達成され得る。好ましい実施形態において、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の標的タンパク質に結合するか、または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の標的分子と相互作用する能力を決定することは、標的分子の活性を決定することによって達成され得る。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞性の第２のメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３、ｃＡＭＰ）の誘導を検出すること、適切な基質に対する標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出マーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に連結された標的反応調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、あるいは標的調節型細胞内応答（例えば、遺伝子発現）を検出することによって決定され得る。
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触され、そして試験化合物の、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力が決定される、無細胞アッセイである。本発明のアッセイにおいて使用されるための、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の好ましい生物学的に活性な部分は、非５７７分子、非２０７３９分子、もしくは非５７１４５分子との相互作用に関与するフラグメント（例えば、高表面確立スコア（ｈｉｇｈ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を有するフラグメント）を含む。５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質への試験化合物の結合は、上記のように直接的にかまたは間接的にかのいずれかで決定され得る。好ましい実施形態において、このアッセイは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、５７７、２０７３９、または５７１４５に結合しアッセイ混合物を形成する既知の化合物とを接触させること、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させること、および試験化合物が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質と相互作用する能力を決定することを包含し、ここで、試験化合物が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質と相互作用する能力を決定することは、この試験化合物が、既知の化合物と比較して、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する能力を決定することを包含する。５７７、２０７３９または５７１４５と既知の標的タンパク質との相互作用を調節する化合物は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質、特に変異５７７タンパク質、変異２０７３９タンパク質、もしくは変異５７１４５タンパク質の活性を調節する際に有用であり得る。
別の実施形態において、このアッセイは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質またはその生物学的に活性な部分が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物の、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の活性またはその生物学的に活性な部分を調節する（例えば、刺激するかまたは阻害する）能力が決定される、無細胞アッセイである。試験化合物が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質が５７７標的分子、２０７３９標的分子、もしくは５７１４５標的分子に結合する能力を決定することにより、直接的な結合を決定するための上記の方法のうちの１つにより決定することによって達成され得る。５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質が５７７標的分子、２０７３９標的分子、もしくは５７１４５標的分子に結合する能力を決定することはまた、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）．（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５ならびにＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）のような技術を用いて達成され得る。本明細書中で使用される場合、「ＢＩＡ」は、いずれの相互作用体（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）も標識することなく、リアルタイムで生体特異的相互作用体を試験するための技術である。表面プラズモン共鳴の光学的現象（ｏｐｔｉｃａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）（ＳＰＲ）の変化は、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として使用され得る。
別の実施形態において、試験化合物が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質が５７７標的分子、２０７３９標的分子、もしくは５７１４５標的分子の下流エフェクターの活性をさらに調節する能力を決定することによって達成され得る。例えば、この適切な標的についてのエフェクター分子の活性が決定され得るか、または適切な標的へのエフェクターの結合は、以前記載したように決定され得る。
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質またはその生物学的に活性な部分と、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質と結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物とを接触させること、このアッセイ混合物と試験化合物とを接触させること、および試験化合物が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質と相互作用する能力を決定することを包含し、ここで試験化合物が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質と相互作用する能力を決定することは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の、５７７標的タンパク質、２０７３９標的タンパク質、もしくは５７１４５標的タンパク質に優先的に結合するか、または５７７標的タンパク質、２０７３９標的タンパク質、もしくは５７１４５標的タンパク質の活性を調節する能力を決定することを包含する。
本発明の上記のアッセイ方法の１つ以上の実施形態において、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５またはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合体化形態からの複合体化形態の分離を容易にし、そしてこのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質への結合、または候補化合物の存在下および非存在下での５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するのに適切な任意の容器内で達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、そのタンパク質の一方または両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを追加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的の融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いで、これらを、試験化合物と混ぜ合わせるか、あるいは試験化合物および非吸着の標的タンパク質または５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質のいずれかと混ぜ合わせ、そしてこの混合物を、複合体形成を実施する条件下（例えば、塩およびｐＨに関する生理学的条件）でインキュベートする。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ得、そして５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の結合レベルまたは５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性レベルを標準的な技術を使用して決定し得る。
タンパク質をマトリクス上に固定するための他の技術はまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の標的分子は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合体化を使用して固定され得る。ビオチン化された５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または標的分子を、当該分野において公知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し得（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、そしてストレプトアビジンでコーティングした９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定し得る。あるいは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または標的分子と反応性であるが、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体は、プレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的または５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質が、抗体の結合体化によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定化複合体に関しての上記のものに加えて、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
別の実施形態において、５７７発現、２０７３９発現、もしくは５７１４５発現の調節因子が、１つの方法において同定される。その方法において、細胞が、候補化合物と接触させられ、そして細胞中の５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現が、測定される。候補化合物の存在下での５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現レベルが、候補化合物の非存在下での５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現レベルと比較される。その後、その候補化合物は、この比較に基づいて、５７７発現、２０７３９発現、もしくは５７１４５発現の調節因子として同定され得る。例えば、５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現が、その候補化合物の非存在下よりもその存在下で多い（統計学的に有意に多い）場合、その候補化合物は、５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現が、その候補化合物の非存在下よりもその存在下で少ない（統計学的に有意に少ない）場合、その候補化合物は、５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現のインヒビターとして同定される。その細胞における５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の発現レベルは、５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡ、もしくは５７１４５ ｍＲＮＡまたは５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質を検出するための本明細書中に記載される方法によって測定され得る。
本発明のなお別の局面において、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら、（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３〜２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６〜１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０〜９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３〜１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）において、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５と結合または相互作用し、５７７活性、２０７３９活性、もしくは５７１４５活性に関与する他のタンパク質（「５７７結合タンパク質、２０７３９結合タンパク質、もしくは５７１４５結合タンパク質」または「５７７−ｂｐ、２０７３９−ｂｐ、もしくは５７１４５−ｂｐ」）を同定するために「ベイト（ｂａｉｔ）タンパク質」として使用され得る。そのような５７７結合タンパク質、２０７３９結合タンパク質、もしくは５７１４５結合タンパク質は、例えば、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の媒介性シグナル伝達経路の下流エレメントのような、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または５７７標的、２０７３９標的、もしくは５７１４５標的によるシグナルの伝播に関与している可能性もある。あるいは、そのような５７７結合タンパク質、２０７３９結合タンパク質、もしくは５７１４５結合タンパク質は、５７７インヒビター、２０７３９インヒビター、もしくは５７１４５インヒビターである可能性がある。
このツーハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子のモジュラー型の性質に基づく。ほとんどの転写因子は、別個のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡単に述べると、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築において、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質をコードする遺伝子が、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「プレイ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリー由来のＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質とがインビボで相互作用して５７７依存性複合体、２０７３９依存性複合体、もしくは５７１４５依存性複合体を形成し得る場合、その転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインとは、近接する。このように近くにあることにより、その転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結したレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。そのレポーター遺伝子の発現が検出され得、そしてその機能的な転写因子を含む細胞コロニーが、単離され得、そして５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質と相互作用するタンパク質をコードするクローン遺伝子を得るために使用され得る。
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるアッセイのうちの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節因子が、細胞ベースのアッセイまたは無細胞アッセイを用いて同定され得、そしてその因子が５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の活性を調節する能力が、例えば、動物（例えば、本明細書に記載される疼痛についての動物モデル）においてインビボで確認され得る。
本発明は、さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規因子に関する。従って、適切な動物モデルにおいて、本明細書中に記載されるように同定された因子をさらに使用することは、本明細書中に範囲内にある。例えば、本明細書中に記載されるように同定される因子（例えば、５７７調節因子、２０７３９調節因子、もしくは５７１４５調節因子、アンチセンス５７７核酸分子、アンチセンス２０７３９核酸分子、もしくはアンチセンス５７１４５核酸分子、５７７特異的抗体、２０７３９特異的抗体、もしくは５７１４５特異的抗体、または５７７結合パートナー、２０７３９結合パートナー、もしくは５７１４５結合パートナー）が、そのような因子を用いる処置の効力、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。あるいは、本明細書中に記載されるように同定される因子が、そのような因子の作用機構を決定するために動物モデルにおいて使用され得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載されるような処置のために、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規な因子の使用に関する。
これらの化合物（上記のアッセイ系において同定される化合物のような化合物が挙げられるが、それらに限定されない）のいずれもが、疼痛を軽減する能力について試験され得る。疼痛を軽減する能力を示す化合物の同定のための細胞ベースのアッセイおよび動物モデルベースのアッセイは、本明細書中に記載される。
さらに、本明細書中で記載されるような、疼痛の動物ベースのモデルを使用して、疼痛および有痛性の状態を処置し得る化合物を同定し得る。このような動物モデルは、疼痛処置において有効であり得る薬物、薬品、治療および介入の同定のための試験基質として使用され得る。例えば、動物モデルは、曝露される動物において、疼痛のこのような改善を誘発するのに十分な濃度および時間で、疼痛を処置する能力を示すと推定される化合物に曝露され得る。この曝露に対する動物の応答は、処置の前後に疼痛の症状の逆転を評価することによってモニターされ得る。
介入に関して、疼痛の任意の局面を逆転する（すなわち、無痛覚効果を有する）任意の処置は、ヒト疼痛の治療的介入のための候補とみなされるべきである。試験薬剤の投薬量は、用量応答曲線を導くことにより決定され得る。
さらに、遺伝子発現パターンが、化合物が疼痛を改善する能力を評価するために利用され得る。例えば、１以上の遺伝子の発現パターンは、「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」の一部を形成し得、次いで、これは、このような評価に用いられ得る。「遺伝子発現プロフィール」または「転写プロフィール」は、本明細書中で使用される場合、所定のセットの条件下で所定の組織型または細胞型について得られたｍＲＮＡ発現のパターンを含む。遺伝子発現プロフィールは、例えば、差次的ディスプレイ手順、ノーザン分析および／またはＲＴ−ＰＣＲを利用することにより、生成され得る。１つの実施形態において、５７７遺伝子配列、２０７３９遺伝子配列、もしくは５７１４５遺伝子配列は、このような遺伝子発現プロフィールの生成および確証のために、プローブおよび／またはＰＣＲプライマーとして使用され得る。
遺伝子発現プロフィールは、細胞ベースのモデル系および／または動物ベースのモデル系内で、既知の状態（心臓血管疾患あるいは正常状態のいずれか）について、特徴付けられ得る。続いて、これらの既知の遺伝子発現プロフィールは、このような遺伝子発現プロフィールの改変に対する試験化合物の効果を確認するために比較され得、そしてこのプロフィールを、より所望のプロフィールにより近くに似るようにされる。
例えば、化合物の投与は、疼痛疾患のモデル系の遺伝子発現プロフィールを、コントロール系により近くへと似せ得る。あるいは、化合物の投与は、コントロール系の遺伝子発現プロフィールに対して、疼痛または有痛性の疾患への模倣を開始させ得る。このような化合物は、例えば、目的の試験化合物をさらに特徴付ける際に使用され得るか、またはさらなる動物モデルの作製に使用され得る。
（ＩＩ．細胞ベースのモデル系および動物ベースのモデル系）
疼痛に対するモデルとして機能する細胞ベースの系および動物ベースの系が本明細書中に記載される。これらの系は、種々の適用において使用され得る。例えば、細胞ベースのモデル系および動物ベースのモデル系を使用して、心臓血管疾患に関連する示差的に発現される遺伝子（例えば、５７７、２０７３９または５７１４５）をさらに特徴付け得る。さらに、動物ベースのアッセイおよび細胞ベースのアッセイは、以下に記載されるように、疼痛を改善し得る化合物を同定するようにに設計されるスクリーニングストラテジーの一部として使用され得る。従って、動物ベースのモデルおよび細胞ベースのモデルを使用して、心臓血管疾患を処置する際に有効であり得る薬物、薬品、治療および介入を同定し得る。さらに、このような動物モデルは、動物被験体においてＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するために使用され得、そしてこのようなデータは、潜在的な疼痛処置のインビボ効力を決定するために使用され得る。
（Ａ．動物ベースの系）
疼痛の動物ベースのモデル系としては、非組み換え動物および操作されたトランスジェニック動物が挙げられ得るが、これらに限定されない。
疼痛についての非組み換え動物モデルとしては、例えば、遺伝的モデルが挙げられ得る。
さらに、疼痛を示す動物モデルは、例えば、当業者に周知のトランスジェニック動物を作製するための技術とともに、上記５７７遺伝子配列、２０７３９遺伝子配列または５７１４５遺伝子配列を使用することによって、操作され得る。例えば、５７７遺伝子配列、２０７３９遺伝子配列または５７１４５遺伝子配列は、目的の動物のゲノム内に導入され得、そして過剰発現され得るか、あるいは内因性の５７７遺伝子配列、２０７３９遺伝子配列または５７１４５遺伝子配列が存在する場合、これらが、過剰発現され得るか、または５７７遺伝子発現、２０７３９遺伝子発現または５７１４５遺伝子発現を過小発現するかもしくは不活化するために破壊されるかのいずれかであり得る。
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、５７７、２０７３９または５７１４５コード配列が導入された受精された卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞を使用して、内因性５７７、２０７３９または５７１４５配列が変更されたそれらのゲノム組換え動物または相同性組換え動物へ、外因性５７７、２０７３９または５７１４５配列が導入された非ヒトトランスジェニック動物を作製し得る。このような動物は、５７７、２０７３９または５７１４５の機能および／または活性を研究するため、そして５７７、２０７３９または５７１４５活性のモジュレータ−を同定するためおよび／または評価するために有用である。本明細書で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、非ヒト動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのようなげっ歯類であり、この動物の細胞の１つ以上は、トランスジーンを含む。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。トランスジーンは、トランスジェニック動物が発生し細胞のゲノムへ一体化され、そして成熟動物のゲノム中に残っている外因性ＤＮＡであり、それによって、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する。本明細書で使用される場合、「相同性組換え動物」は、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウスであり、ここで、内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子は、動物の発生より前の、動物の細胞（例えば、動物の胚性細胞）へ導入された内因性遺伝子と外因性ＤＮＡ分子との間での相同性組換えによって改変されている。
本発明の方法において使用されるトランスジェニック動物は、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって５７７、２０７３９または５７１４５コード核酸を受精した卵母細胞の雄の前核へ導入することにより、そして卵母細胞を偽妊娠雌育成動物において発生させることによって、作製され得る。５７７、２０７３９または５７１４５ｃＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムへトランスジーンとして導入され得る。あるいは、ヒト５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の非ヒトアナログ（例えば、マウス５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子またはラット５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子）が、トランスジーンとして使用され得る。あるいは、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子ホモログ（例えば、別の５７７、２０７３９または５７１４５ファミリーメンバー）が、５７７、２０７３９または５７１４５配列に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得、そしてトランスジーンとして使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルはまた、トランスジーンに含まれ、トランスジーンの発現の効率を増加させ得る。組織特異的調節配列は、５７７、２０７３９または５７１４５トランスジーンに作動可能に連結し、特定の細胞への５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の発現を指示し得る。胚操作およびマイクロインジェクションを介しての、トランスジェニック動物、特に、マウスのような動物を作製するための方法は、当該分野において慣用的であり、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（共にＬｅｄｅｒらによる）、同第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒらによる）およびＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）に記載されている。類似の方法が、他のトランスジェニック動物の生成ために使用される。トランスジェニック始祖動物は、その動物の組織または細胞中の５７７、２０７３９または５７１４５ｍＲＮＡの発現および／または、そのゲノムにおける５７７、２０７３９または５７１４５トランスジーンの存在に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック始祖動物を使用して、トランスジーンを保有するさらなる動物を育種し得る。さらに、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質をコードするトランスジーンを保有するトランスジェニック動物は、さらに、他のトランスジーンを保有する他のトランスジェニック動物に対して育種され得る。
相同性組換え動物を作製するために、欠失、付加または置換が導入された５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の少なくとも一部を含むベクターを調製し、それによって、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子を改変する（例えば、機能的に破壊する）。５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子は、ヒト遺伝子であり得るが、より好ましくは、ヒト５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の非ヒトホモログであり得る。例えば、ラット５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子を使用して、相同性組換え核酸分子（例えば、マウスゲノム中の内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子を改変するのに適したベクター）を構築し得る。好ましい実施形態において、相同性組換え核酸分子は、相同性組換えの際に、内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、もはや機能的タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。あるいは、相同性組換え核酸分子は、相同性組換えの際に、内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子が、変異されるか、またはそうでなければ、改変されるが依然として機能的タンパク質をコードする（例えば、上流調節領域を改変し、それによって、内因性５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質を改変し得る）ように設計され得る。相同性組換え核酸分子において、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の改変された部分は、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子のさらなる核酸配列によって５’側および３’側に近接し、相同性組換え核酸分子によって保有される内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子と細胞（例えば、胚性幹細胞）中の外因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子との間で相同性組換えが生じることを可能にする。さらなる近接する５７７、２０７３９または５７１４５核酸配列は、内因性遺伝子を有する好結果の相同性組換えにとって十分な長さである。代表的に、数キロ塩基の近接ＤＮＡ（５’末端と３’末端の両方）は、相同性組換え核酸分子に含まれる（例えば、相同性組換えベクターの記載についてのＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと）。相同性組換え核酸分子は、細胞（例えば、胚性幹細胞株）に（例えば、電気穿孔によって）導入され、そして導入された５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子が、内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子による相同的に組換えられている細胞が、選択される（例えば、Ｌｉ，Ｅら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の未分化胚芽細胞へインジェクションされ、凝集キメラを形成し得る（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ． Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）１１３〜１５２ページを参照のこと）。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠雌育成動物へ移植され得、胚が妊娠期間に入る。生殖細胞において相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫を使用して、動物の全細胞が、トランスジーンの生殖伝達による相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させる。相同性組換え核酸分子（例えば、ベクター）または相同性組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２：８２３〜８２９およびＬｅ ＭｏｕｅｌｌｅｃらによるＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＳｍｉｔｈｉｅｓらによるＷＯ９１／０１１４０；ＺｉｊｌｓｔｒａらによるＷＯ９２／０９６８；ならびにＢｅｒｎｓらによるＷＯ９３／０４１６９においてさらに記載される。
別の実施形態において、本発明の方法における使用のための、トランスジーンの調節された発現を可能にする選択されたシステムを含むトランスジェニック非ヒト動物が、作製され得る。このようなシステムの１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６２３２〜６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１〜１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用して、トランスジーンの発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードするトランスジーンを含む動物が、必要である。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物をつがわせることによって、「二重」トランスジェニック動物の構築を介して提供され得、そのうちの１種は、選択されたタンパク質およびリコンビナーゼをコードするトランスジーンを含む他のタンパク質を含む。
本明細書に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０〜８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載の方法に従って作製され得る。簡単には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）が単離され、そして導入されて、成長サイクルから出て、そしてＧ０相に入り得る。次いで、休止細胞は、例えば、休止細胞が単離される同じ種の動物由来の除核された卵母細胞に対して、電気パルスを介して融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、桑実胚または未分化胚芽細胞を発生するように培養され、次いで偽妊娠雌育成動物へ移送される。この雌育成動物が産む子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
次いで、５７７、２０７３９または５７１４５ｍＲＮＡまたは５７７、２０７３９または５７１４５ペプチド（５７７、２０７３９または５７１４５エピトープに対して指向された抗体を用いて免疫細胞化学的に検出された）を、容易に検出可能なレベルで発現する５７７、２０７３９または５７１４５トランスジェニック動物をさらに評価して、特徴的な痛みを提示する動物を同定するべきである。
（Ｂ．細胞ベースの系）
５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質をコードする５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子配列を含み、発現し、さらに侵害知覚と関連する細胞表現型を示す細胞は、鎮痛性活性を示す化合物を同定するために使用され得る。このような細胞としては、非組換え単球細胞株（例えば、ＵＳ９３７（ＡＴＣ番号ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣ番号ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣ番号ＴＩＢ−６３））；内皮細胞（例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）、およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ））；ならびに一般的な哺乳動物細胞株（例えば、Ｈｅｌａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣ番号ＣＲＬ−１６５１）））そして神経細胞株が挙げられ得る。さらに、このような細胞としては、組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、上記の本発明の疼痛動物モデルは、この障害についての細胞培養モデルとして使用され得る、侵害知覚に関連する１つ以上の細胞型を含む細胞株を作製するために使用され得る。本発明の疼痛モデルトランスジェニック動物由来の初代培養物が利用され得る一方で、継続的な細胞株の作製が好ましい。トランスジェニック動物から継続的な細胞株を導くために使用され得る技術の例については、Ｓｍａｌｌら，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：６４２−６４８を参照のこと。
あるいは、侵害知覚に関与することが既知である細胞型の細胞は、その細胞内の５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子発現の量を増大または減少し得る配列を用いてトランスフェクトされ得る。例えば、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子配列は、目的の細胞のゲノムに導入され得、そしてこの細胞において過剰発現されるか、または内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子配列が存在する場合、そのような配列が過剰発現され得るか、代わりに５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子発現を過小発現または不活性化するために破壊され得る。
５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子を過剰発現させるために、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子のコード部分は、目的の細胞型（例えば、内皮細胞）において遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は、当業者に周知であり、過度な実験なくして、利用され得る。標的遺伝子を発現するための組換え法は、上記される。
内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子配列の過小発現のために、このような配列は、目的の細胞型のゲノムに再び導入される場合に、内因性５７７、２０７３９または５７１４５対立遺伝子が不活性化されるように、単離および操作され得る。好ましくは、操作された５７７、２０７３９または５７１４５配列は、内因性５７７、２０７３９または５７１４５配列が、細胞ゲノムに操作された５７７、２０７３９または５７１４５配列を組み込む際に破壊されるように、遺伝子標的化を介して導入され得る。宿主細胞の５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子を用いたトランスフェクションは、上記で議論される。
化合物で処理されるかまたは５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子でトランスフェクトされる細胞は、侵害知覚と関連する表現型について試験され得る。
５７７、２０７３９または５７１４５核酸のトランスフェクションは、標準的な技術（本明細書中に記載され、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９）前出に記載される技術）を使用することにより達成され得る。トランスフェクトされた細胞は、組換え５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子配列の存在について、５７７、２０７３９または５７１４５ｍＲＮＡの発現および蓄積について、ならびに組換え５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質産生の存在について評価されるべきである。５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子発現の減少が所望される場合において、標準的な技術は、内因性５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子発現における減少および／または５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質産生における減少が達成されるか否かを実証するために、使用され得る。
（ＩＩＩ．予測医学）
本発明はまた、予測医学の分野に関する。この分野において、診断アッセイ、予後アッセイ、およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）目的のために使用され、それによって個体を予防的に処置する。従って、本発明の１つの局面は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞（例えば、内皮細胞）、組織（例えば、脈管組織））の状況において、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質および／または核酸の発現、ならびに５７７、２０７３９または５７１４５活性を決定し、それによって、個体が、素因に悩んでいるか、または疼痛を経験しているか否かを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が疼痛性の障害を発症する危険性があるか否かを決定するための、診断（または予測）アッセイを提供する。例えば、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子における変異が、生物学的サンプル中でアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後目的または予測目的のために使用され得、それによって個体は、疼痛性の関連する障害の発症前に、予防的に処置される。
本発明の別の局面は、臨床試験における、５７７、２０７３９または５７１４５の発現または活性に対する５７７、２０７３９または５７１４５モジュレーター（例えば、抗５７７、２０７３９または５７１４５抗体または５７７、２０７３９または５７１４５リボザイム）の影響のモニタリングに関する。
これらおよび他の薬剤は、以下の節で、さらに詳細に記載される。
（Ａ．診断アッセイ）
患者が疾患に悩んでいるか否かを決定するために、被験体からの生物学的サンプルが獲得され得、そしてその生物学的サンプルは、生物学的サンプル中で、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質または５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物または薬剤を接触され得る。５７７、２０７３９または５７１４５ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するのに好ましい薬剤は、５７７、２０７３９または５７１４５ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る標識核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、配列番号１、４もしくは７に示される５７７、２０７３９または５７１４５核酸またはそれらの一部（例えば、少なくとも１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、５７７、２０７３９または５７１４５ ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチド）であり得る。本発明の診断アッセイにおいて使用するのに適切な他のプローブが、本明細書中に記載されている。
サンプル中の５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質を検出するのに好ましい薬剤は、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であり得、より好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体、またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が、使用され得る。用語「標識」は、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をプローブまたは抗体に連結（すなわち、物理的に連結）することによるプローブまたは抗体の直接的な標識、ならびに直接的に標識された別の試薬との反応性によるこのプローブまたは抗体の間接的な標識を包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を使用する一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るように、ビオチンでＤＮＡプローブの末端を標識する一次抗体の検出が挙げられる。
用語「生物学的サンプル」は、被験体から単離された組織、細胞、および生物学的流体、ならびに被験体内に存在する組織、細胞、および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を使用して、インビトロおよびインビボで、生物学的サンプル中の５７７、２０７３９または５７１４５ ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出し得る。例えば、５７７、２０７３９または５７１４５ ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。５７７、２０７３９または５７１４５のタンパク質を検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、および免疫蛍光検査法が挙げられる。５７７、２０７３９または５７１４５のゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、５７７、２０７３９または５７１４５のタンパク質を検出するためのインビボ技術としては、被験体への標識抗５７７、２０７３９または５７１４５抗体の導入が挙げられる。例えば、抗体は、被験体における存在および位置が、標準的な画像化技術によって検出され得る放射活性マーカーを用いて、標識され得る。
別の実施形態において、本方法はさらに、コントロール被験体からのコントロール生物学的サンプルを獲得する工程、コントロールサンプルと、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤とを接触させる工程（その結果、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質、ｍＲＮＡ、または核酸の存在が、生物学的サンプルにおいて検出される）、およびコントロールサンプル中の５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在と、試験サンプル中の５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
（Ｂ．予後アッセイ）
本発明はさらに、異常な５７７、２０７３９または５７１４５発現または活性に関連する疾患を有するかまたは発症する危険を有する被験体を同定するための方法に関する。
本明細書中で使用される場合、用語「異常な」は、野生型の５７７、２０７３９または５７１４５の発現または活性から逸脱した、５７７、２０７３９または５７１４５の発現または活性を含む。異常な発現または活性としては、発現または活性の増加または減少、ならびに野生型の発現の発生的パターンまたは細胞下の発現のパターンに従わない、発現または活性が挙げられる。例えば、異常な５７７、２０７３９または５７１４５の発現または活性は、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子が、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子における変異によって過少発現または過剰発現される場合、ならびにこのような変異によって、非機能的５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質または野生型の様式で機能しないタンパク質（例えば、５７７、２０７３９または５７１４５基質と相互作用しないタンパク質、または非５７７、２０７３９または５７１４５基質と相互作用するタンパク質）を生じる場合を含むことが意図される。
本明細書中で記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは後述のアッセイ）は、疾患を有するかまたはそれを発症する危険を有する被験体を同定するために使用され得る。生物学的サンプルは、被験体から得られ得、そして遺伝子変更の存在または非存在について試験され得る。例えば、このような遺伝的変更は、以下のうちの少なくとも１つの存在を特定することによって検出され得る：１）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、２）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加、３）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、４）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の染色体再配置、５）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写のレベルの変更、６）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の異常な改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターン）、７）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写の非野生型スプラシングパターンの存在、８）５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の非野生型レベル、９）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子の対立遺伝子損失、および１０）５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の不適切な翻訳後改変。
本明細書中に記載されるように、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子における遺伝的変更を検出するために使用され得る当該分野において公知の多くのアッセイが、存在する。例えば、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子における遺伝的変更は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーを使用して検出され得、これらのうちの後者は、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、被験体から生物学的サンプルを収集する工程、このサンプルの細胞から核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはこれらの両方）を単離する工程、（存在するならば）５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、この核酸サンプルを、５７７、２０７３９または５７１４５遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーと接触させる工程、ならびに増幅産物の存在または非存在を検出するかあるいは増幅産物のサイズを検出しそしてコントロールサンプルと長さを比較する工程を包含する。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲが、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される任意の技術と組合わせて予備的増幅工程として使用するに好ましくあり得ることが、予測される。
代替の増幅法としては以下が挙げられる：自己維持的配列複製（ｓｅｌｆ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、または他の核酸増幅法のいずれか、その後の当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在する場合に、核酸分子の検出に特に有用である。
代替の実施形態において、生物学的サンプル由来の５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールＤＮＡが、単離され、（必要に応じて）増幅され、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、そしてフラグメント長サイズが、ゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長サイズの差異は、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号）の使用は、リボザイム切断部位の発生または喪失によって、特異的変異の存在についてスコア付けするために使用され得る。
他の実施形態において、５７７、２０７３９、または５７１４５における遺伝的変異は、生物学的サンプル由来の核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、何百個または何千個のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３−７５９）。例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５における遺伝的変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）（上述）に記載されるような光生成ＤＮＡプローブを含む２次元アレイにおいて同定され得る。簡単には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、連続的で重複するプローブの線状アレイを作製することによって、サンプルおよびコントロールにおけるＤＮＡの長鎖を通して走査して配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程の後、検出される全ての改変体または変異に相補的なより小さな特定化されたプローブアレイを使用することによって、特異的変異の特徴付けを可能にする第２のハイブリダイゼーションアレイが続く。各変異アレイは、パラレルプローブセット、野生型遺伝子に対するある相補体および変異遺伝子に対する他の相補体から構成される。
なお別の実施形態において、当該分野において公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、生物学的サンプル中の５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子を直接的に配列決定し得、そして生物学的サンプル中の５７７、２０７３９、または５７１４５の配列を、対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３によって開発された技術に基づく反応が挙げられる。種々の自動化配列決定手順のいずれかが、質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）を含む診断アッセイ（Ｎａｅｖｅ，Ｃ．Ｗ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８−５３）を行う場合に利用され得ることもまた、企図される。
５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護がＲＮＡ／ＲＮＡ異種二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ異種二重鎖中でミスマッチした塩基を検出するために使用される方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の分野の技術は、野生型５７７配列、２０７３９配列、または５７１４５配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルより得られた潜在的変異ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成される異種二重鎖を提供することによって開始する。二本鎖二重鎖は、コントロール鎖とサンプル鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するような二重鎖の一本鎖領域を切断する因子で処理される。例えば、ミスマッチ領域を酵素的に消化するために、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖はＲＮａｓｅで処理され得、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはＳ１ヌクレアーゼで処理され得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかが、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムで処理され、そして、ミスマッチ領域を消化するためにピペリジンで処理される。ミスマッチ領域の消化後、次いで、生じた物質が、変異部位を決定するために変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズで分けられる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：４３９７およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好ましい実施形態において、コントロールＤＮＡまたはＲＮＡが、検出のために標識され得る。
さらに別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、細胞のサンプルより得られた５７７ ｃＤＮＡ、２０７３９ ｃＤＮＡ、または５７１４５ ｃＤＮＡ中の点変異を検出およびマッピングするために規定された系において二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素と呼ばれる）を使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７−１６６２）。例示的実施形態に従って、５７７配列、２０７３９配列、または５７１４５配列（例えば、野生型の５７７配列、２０７３９配列、または５７１４５配列）に基づくプローブは、試験細胞からのｃＤＮＡ産物または他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理され、そして存在する場合、切断産物は、電気泳動的プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
他の実施形態において、電気泳動的移動度の変更を使用して、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子における変異を同定する。例えば、一本鎖コンフォーメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と野生型核酸との間の電気泳動的移動度の差異を検出し得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９もまた参照のこと）。サンプルおよびコントロールの５７７核酸、２０７３９核酸、または５７１４５核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動的移動度において生じた変更は、単一の塩基変化の検出さえ可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識されたプローブで標識されても検出されてもよい。このアッセイの感度は、（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを用いることにより増強され得、ここで二次構造は、配列の変化により感受性である。好ましい実施形態において、目的の方法は、電気泳動的移動度の変化に基づいて二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離するためにヘテロ二重鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５）。
なお別の実施形態において、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中での変異体フラグメントまたは野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５）を使用してアッセイされる。ＤＧＧＥが分析法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高温融解ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することにより完全には変性していないことを確認するために改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールＤＮＡおよびサンプルＤＮＡの移動度の差異を同定するための変性勾配の代わりに使用される（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３）。
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーが調製され得、ここで、公知の変異が中心におかれ、次いで、完全な一致が見出される場合にのみハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズする（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６２３０）。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に結合しそして標識標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合に、ＰＣＲ増幅標的ＤＮＡまたは多くの種々の変異にハイブリダイズされる。
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と組み合わせて使用され得る。増幅に特異的なプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心に目的の変異を保有し得るか（その結果、増幅は、示差的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、または適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼ伸長を防ぎ得るかまたは低減し得る場合、一方のプライマーの３’末端で目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）。さらに、切断ベース検出を作製するために、変異領域中に新規の制限部位を導入することが、好ましくあり得る（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１）。特定の実施形態において、増幅のためにＴａｑリガーゼを使用して増幅が行われ得ることもまた、明らかである（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９）。このような場合に、連結は、５’配列の３’末端で完全なミスマッチが存在する場合にのみ生じ、これにより、増幅の存在または非存在を探索することによって特定の部位で既知の変異の存在を検出し得る。
さらに、本明細書中に記載される診断アッセイを使用して、疾患を効果的に処置するために、被験体が５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーター、または５７１４５モジュレーター（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子）を投与され得るか否かを、決定し得る。
（Ｃ．臨床試験の間の効果のモニタリング）
本発明はさらに、５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーター、または５７１４５モジュレーター（例えば、本明細書中において同定された５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーター、または５７１４５モジュレーター）の、疾患の処置に対する有効性を決定するための方法を提供する。例えば、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子の発現増加、タンパク質レベル増加、あるいは５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性のアップレギュレートにおいて、５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーター、または５７１４５モジュレーターは、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子の発現減少、タンパク質レベル減少、あるいは５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性のダウンレギュレートを示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。あるいは、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子の発現減少、タンパク質レベル減少、あるいは５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性のダウンレギュレートにおける５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーター、または５７１４５モジュレーターの有効性は、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子の発現増加、タンパク質レベル増加、あるいは５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性の増加を示す被験体の臨床試験においてモニタリングされ得る。このような臨床試験において、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子、好ましくは、痛覚に関与する他の遺伝子の発現または活性が、「読み出し」すなわち特定の細胞の表現型のマーカーとして使用され得る。
例えば（限定のためではなく）、（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性を調節する因子での処置によって細胞において調節される、５７７、２０７３９、または５７１４５を含む遺伝子が、同定され得る。よって、疼痛障害を罹患する被験体に対する５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性を調節する因子の効果を（例えば、臨床試験において）研究するために、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、５７７、２０７３９、または５７１４５、および疼痛障害に関連する他の遺伝子の発現レベルについて分析され得る。遺伝子発現レベル（例えば、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるようなノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによって、あるいは本明細書中に記載される方法の１つによって生成されるタンパク質の量を測定することによって、または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５、または他の遺伝子の活性レベルを測定することによって、定量され得る。この方法において、遺伝子発現パターンは、５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性を調節する因子に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。この応答状態は、個体を５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性を調節する因子で処置する前、あるいはその間の種々の時点で測定され得る。
好ましい実施形態において、本発明は、５７７活性、２０７３９活性、または５７１４５活性を調節する因子（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される低分子）での被験体の処置の有効性をモニタリングするための方法を提供し、以下の工程を包含する：（ｉ）この因子の投与前に予め投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｉ）この予め投与するサンプル中の５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する工程；（ｉｉｉ）１つ以上の後に投与するサンプルを被験体から得る工程；（ｉｖ）これらの後に投与するサンプル中の５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程；（ｖ）予め投与するサンプル中の５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルを、後に投与するサンプル中の５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルまたは活性レベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）よって被験体に対する因子の投与を変更する工程。例えば、因子の投与増加は、５７７、２０７３９、または５７１４５の発現または活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を増加させる）レベルよりも高いレベルに増加することが、望ましくあり得る。あるいは、因子の投与減少は、５７７、２０７３９、または５７１４５の発現または活性を、検出された（すなわち、因子の有効性を減少させる）レベルよりも低いレベルに減少することが、望ましくあり得る。この実施形態に従って、５７７、２０７３９、または５７１４５の発現または活性は、観察可能な表現型応答の非存在下ですら、因子の有効性の指標として使用され得る。
（ＩＶ．処置方法）
本発明は、被験体（例えば、疾患の危険性のある（または疾患を罹患しそうな）ヒト）を処置する予防法および治療法の両方を提供する。処置の予防法および治療法の両方の観点で、このような処置は、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）の分野から得られる知識に基づいて、特異的に仕立てられ（ｔａｉｌｏｒｅ）得るかまたは改変され得る。本明細書中で使用される場合、「薬理ゲノム学」は、遺伝子配列決定、統計的遺伝学および遺伝子発現分析のようなゲノム技術の、臨床開発および市場での薬物に対する適用をいう。より詳細には、この用語は、患者の遺伝子がどのように薬物に対する患者の応答（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）を決定するのかについての研究をいう。
従って、本発明の別の局面は、個々の薬物応答遺伝子型に従って、本発明の５７７分子、２０７３９分子、または５７１４５分子、あるいは、５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーター、または５７１４５モジュレーターのいずれかを用いる被験体の予防処置または治療処置を仕立てるための方法を提供する。薬理ゲノム学によって、臨床医（ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）または内科医（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ）は、この処置から最も利益を得る患者に対して予防処置または治療処置を標的化することが可能になり、そして毒性薬物関連副作用を被る患者の処置を避けることが可能になる。
（Ａ．予防法）
１つの局面において、本発明は、５７７、２０７３９、または５７１４５の発現、あるいは５７７、２０７３９、または５７１４５の活性を調節する因子を被験体に投与することによって、被験体において疾患を予防するための方法を提供する。心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および／または血栓）の危険性のある被験体は、例えば、本明細書中に記載される診断アッセイまたは予防アッセイのいずれかまたはその組み合わせによって、同定され得る。予防薬の投与は、異常な５７７、２０７３９、または５７１４５の発現または活性に特徴的な症状の徴候の前に生じ得、その結果、疾患が、その進行において予防、あるいは遅延される。５７７、２０７３９、または５７１４５の異常の型に依存して、例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５、５７７、２０７３９、または５７１４５のアゴニスト剤、あるいは５７７、２０７３９、または５７１４５のアンタゴニスト剤が、被験体の処置のために使用され得る。適切な因子は、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
（Ｂ．治療法）
疼痛が改善され得る方法および組成物が、本明細書中に記載される。特定の疼痛障害が、過剰なレベルの遺伝子産物によってか、または異常な活性もしくは過剰な活性を示す遺伝子産物の存在によって、少なくとも部分的にもたらされる。それ自体、このような遺伝子産物のレベルおよび／または活性の減少は、疼痛の改善をもたらす。遺伝子発現レベルまたはタンパク質活性の減少のための技術は、以下に議論される。
あるいは、特定の他の疼痛障害が、遺伝子発現レベルの非存在または減少によってかまたはタンパク質活性レベルの減少によって、少なくとも部分的にもたらされる。それ自体、このようなタンパク質の遺伝子発現および／または活性のレベルの増加は、疼痛の改善をもたらす。
いくつかの場合において、疾患状態における遺伝子のアップレギュレートは、疾患状態に対応するその遺伝子産物についての保護的役割を反映する。このような遺伝子発現の増加、または遺伝子産物の活性の増加は、それが発揮する保護的効果を強化する。いくつかの疼痛状態は、このような保護的遺伝子の異常に低いレベルの活性から生じ得る。これらの場合においてもまた、遺伝子発現のレベルの増加および／またはこのような遺伝子産物の活性の増加は、疼痛の改善をもたらす。標的遺伝子発現レベルまたは標的遺伝子産物活性レベルを増加するための技術は、本明細書中に議論される。
従って、本発明の別の局面は、治療目的で５７７、２０７３９、または５７１４５の発現または活性を調節する方法に関する。よって、例示的実施形態において、本発明の調節方法は、細胞を、５７７、２０７３９、または５７１４５、あるいは細胞（例えば、内皮細胞または卵巣細胞）に関連する５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質活性の１つ以上の活性を調節する因子と接触させる工程を、包含する。５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質活性を調節する因子は、本明細書中に記載されるような因子（例えば、核酸またはタンパク質、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５のタンパク質の天然に存在する標的分子（例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５のリガンドまたは基質）、５７７、２０７３９、または５７１４５の抗体、５７７、２０７３９、または５７１４５のアゴニストまたはアンタゴニスト、５７７、２０７３９、または５７１４５のアゴニストまたはアンタゴニストのペプチド模倣物、あるいは、他の低分子）であり得る。１つの実施形態において、この因子は、１つ以上の５７７、２０７３９、または５７１４５の活性を刺激する。このような刺激因子の例としては、活性な５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質、および細胞中に導入された５７７、２０７３９、または５７１４５をコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この因子は、１つ以上の５７７、２０７３９、または５７１４５の活性を阻害する。このような阻害因子の例としては、アンチセンス５７７核酸分子、アンチセンス２０７３９核酸分子、またはアンチセンス５７１４５核酸分子、抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、または抗５７１４５抗体、および５７７、２０７３９、または５７１４５のインヒビターが挙げられる。これらの調節法は、（例えば、細胞を因子とともに培養することによって）インビトロで、あるいは（例えば、因子を被験体に投与することによって）インビボで行われ得る。それ自体、本発明は、５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質または核酸分子の、異常な発現もしくは活性または所望されない発現もしくは活性によって特徴付けられる疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、因子（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される因子）、あるいは５７７、２０７３９、または５７１４５の発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）因子の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、５７７、２０７３９、または５７１４５の減少した発現もしくは活性、異常な発現もしくは活性または所望されない発現もしくは活性を補う治療薬として、５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質または核酸分子を投与する工程を包含する。
５７７、２０７３９、または５７１４５の活性の刺激は、５７７、２０７３９、または５７１４５が異常にダウンレギュレートされる状況および／または５７７、２０７３９、または５７１４５の増加した活性が有益な効果を有するようである状況において望ましい。同様に、５７７、２０７３９、または５７１４５の活性の阻害は、５７７、２０７３９、または５７１４５が異常にアップレギュレートされる状況および／または５７７、２０７３９、または５７１４５の減少した活性が有益な効果を有するようである状況において望ましい。
（（ｉ）標的遺伝子の発現、合成、または活性を阻害するための方法）
上で考察されるように、心臓血管障害に関連する遺伝子は、遺伝子活性の増加したレベルを介してこのような障害を引き起こし得る。いくつかの場合において、このようなアップレギュレーションは、疾患状態に対して原因となるかまたは増悪させる影響を有し得る。種々の技術が、このような遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を阻害するために使用され得る。
例えば、上記のアッセイを介して同定される化合物のような化合物（阻害性活性を示す）は、本発明に従って、疼痛を軽減するために使用され得る。このような分子としては、有機低分子、ペプチド、抗体などが挙げられ得るが、これらに限定されない。
例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質に対する内因性リガンドと競合する化合物が投与され得る。リガンド結合した５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の量に生じる減少は、内皮細胞生理学を調節する。この目的のために特に有用であり得る化合物は、例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の可溶性タンパク質または可溶性ペプチド、例えば、１つ以上の細胞外ドメインを含むペプチド、またはその一部および／もしくはアナログ（例えば、Ｉｇ−テールド（ｔａｉｌｅｄ）融合タンパク質のような可溶性融合タンパク質を含む）が挙げられる（Ｉｇ−テールド融合タンパク質の産生の考察について、例えば、米国特許第５，１１６，９６４号を参照のこと）。あるいは、５７７レセプター部位、２０７３９レセプター部位、または５７１４５レセプター部位に結合するが、タンパク質を活性化しない、リガンドアナログまたは抗体のような化合物（例えば、レセプター−リガンドアンタゴニスト）は、５７７タンパク質活性、２０７３９タンパク質活性、または５７１４５タンパク質活性を阻害するのに有効であり得る。
さらに、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子の発現を阻害するアンチセンス分子およびリボザイム分子もまた、本発明に従って、異常な５７７遺伝子活性、２０７３９遺伝子活性、または５７１４５遺伝子活性を阻害するために使用され得る。なおさらに、３重らせん分子は、異常な５７７遺伝子活性、２０７３９遺伝子活性、または５７１４５遺伝子活性を阻害する際に利用され得る。
本発明の方法に使用されるアンチセンス核酸分子は、代表的に、被験体に投与されるかまたはインサイチュで産生され、その結果、これらは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡにハイブリダイズするかまたは結合して、それによって、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって、タンパク質の発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によって、または、例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子を改変して、選択された細胞を標的化し、次いで、全身に投与し得る。例えば、全身投与に関して、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に、アンチセンス核酸分子を連結することによって、このアンチセンス分子が、選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中で記載されるベクターを使用して、細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が、強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が、好ましい。
なお別の実施形態において、本発明の方法に使用されるアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここでは、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は互いに対して平行に走る（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含み得る。
なお別の実施形態において、本発明の方法に使用されるアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、これらのリボザイムが相補的領域を有する、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１に記載される））は、５７７ｍＲＮＡ転写物、２０７３９ｍＲＮＡ転写物、または５７１４５ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するために使用されて、それによって、５７７ｍＲＮＡ、２０７３９ｍＲＮＡ、または５７１４５ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。５７７コード核酸、２０７３９コード核酸、または５７１４５コード核酸に対して特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示される５７７ｃＤＮＡ、２０７３９ｃＤＮＡ、または５７１４５ｃＤＮＡ（すなわち、配列番号１または配列番号３）のヌクレオチド配列に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体は、活性部位のヌクレオチド配列が５７７コードｍＲＮＡ、２０７３９コードｍＲＮＡ、または５７１４５コードｍＲＮＡにおいて切断されるべきヌクレオチド配列に対して相補的であるように構築され得る（例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと）。あるいは、５７７ｍＲＮＡ、２０７３９ｍＲＮＡ、または５７１４５ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと）。
５７７、２０７３９、または５７１４５の遺伝子の発現はまた、標的細胞中で５７７、２０７３９、または５７１４５の遺伝子の転写を阻害する三重ヘリックス構造を形成するために、５７７、２０７３９、または５７１４５の調節領域（例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５のプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化することによって阻害され得る（例えば、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃら（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４（１２）：８０７−１５を参照のこと）。
５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質に特異的であり、かつその活性を妨害する抗体もまた、５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質機能を調節または阻害するために使用され得る。このような抗体は、５７７、２０７３９、または５７１４５のタンパク質自体、あるいはこのタンパク質の部分に対応するペプチドに対して、本明細書中に記載される標準的技術を使用して作製され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、単鎖抗体、またはキメラ抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
標的遺伝子タンパク質が細胞内であり、かつ全抗体が使用される例において、内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）抗体が好ましくあり得る。リポフェクチンリポソームは、標的エピトープに結合するＦａｂ領域の抗体またはフラグメントを細胞に送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害性フラグメントが、好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは、当該分野で周知の方法を使用して、化学的に合成され得るかまたは組換えＤＮＡ技術を介して産生され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８３）、上記；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）上記に記載される）。細胞内標的遺伝子エピトープに結合する単鎖中和抗体もまた、投与され得る。このような単鎖抗体は、例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：７８８９−７８９３に記載されるような技術を利用することにより、例えば、標的細胞集団内で単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、投与され得る。
いくつかの場合において、標的遺伝子タンパク質は、細胞外であるか、または膜貫通タンパク質（例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質）である。５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の１つ以上の細胞外ドメインに特異的な抗体、および例えば、その活性を妨害する抗体は、疼痛または痛有性障害を処置する際に特に有用である。このような抗体は、血流から直接標的ドメインに接近できるので、特に効率的である。ペプチド投与に適切である、以下に記載の投与技術のいずれかが、それらの作用部位に対する阻害性標的遺伝子抗体を有効に投与するために使用され得る。
（ｉｉ）標的遺伝子活性を回復または増強するための方法
疼痛を引き起こす遺伝子は、心臓血管疾患状態では過少発現され得る。あるいは、このような遺伝子のタンパク質産物の活性が減少され、疼痛の発生に至り得る。このような遺伝子発現のダウンレギュレーションまたはタンパク質活性の減少は、疾患状態に対する原因となる効果または悪化する効果を有し得る。
いくつかの場合、疾患状態においてアップレギュレートされる遺伝子が、防御効果を発揮し得る。種々の技術は、疼痛状態に応答して防御効果を発揮する遺伝子および／またはタンパク質の発現、合成、または活性を増加させるために使用され得る。
この節に記載されるのは、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性のレベルが、疼痛が改善されるレベルに増大され得る方法である。５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性のレベルは、例えば、５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、もしくは５７１４５遺伝子の発現のレベルを増加させることにより、または存在する活性な５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質のレベルを増加させることにより増加させ得る。
例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質は、疼痛を改善するのに十分なレベルで、このような症状を示す患者に投与され得る。以下に議論する技術のいずれかが、このような投与のために使用され得る。当業者は、以下に記載するような技術を用いて、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の有効な無毒の投薬の濃度をいかにしして決定するかを容易に理解する。
さらに、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質をコードするＲＮＡ配列は、疼痛を緩和されるように５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質のレベルを生じさせるのに十分な濃度で、疼痛を示す患者に投与され得る。例えば、リポソーム投与のような化合物の細胞内投与を達成する以下に議論した技術のいずれかが、このようなRNA分子の投与のために使用され得る。RNA分子は、例えば、本明細書中に記載のような組み換え技術によって生成され得る。
さらに、被験体は、遺伝子置換療法によって処置され得る。５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の機能を有する正常な５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質の産生を指向する５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、もしくは５７１４５遺伝子、またはそれらの部分の１つ以上のコピーが、ＤＮＡを細胞に導入する他の粒子（例えば、リポソーム）に加えて、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルスベクターを含むが、これらに限定されないベクターを用いて細胞に挿入され得る。さらに、上記の技術のような技術が、ヒト細胞への５７７遺伝子配列、２０７３９遺伝子配列、もしくは５７１４５遺伝子配列の導入について用いられ得る。
５７７発現遺伝子配列、２０７３９発現遺伝子配列、もしくは５７１４５発現遺伝子配列を含む細胞、好ましくは、自家細胞は、疼痛の改善を可能にする位置で被験体に導入または再導入され得る。このような細胞置換技術は、例えば、遺伝子産物が分泌される場合、すなわち、細胞外遺伝子産物の場合、好ましいとされ得る。
（Ｃ．薬学的組成物）
本発明の別の局面は、疾患を罹患する被験体を処置するための方法に関する。これらの方法は、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の発現または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する因子（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される因子）、あるいはこのような因子の組合わせを、被験体に投与する工程を包含する。別の実施形態において、本方法は、減少した５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の発現または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性、異常な５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の発現または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性、あるいは所望されない５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の発現または５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を補うための治療剤として５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または５７７核酸分子、２０７３９核酸分子、もしくは５７１４５核酸分子を被験体に投与する工程を包含する。
５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性の刺激は、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５が異常にダウンレギュレートされる状況、および／または増加した５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性が有利な効果を有しそうである状況において、所望される。同様に、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性の阻害は、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５が異常にアップレギュレートされる状況、および／または減少した５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性が有利な効果を有しそうである状況において、所望される。
５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する因子は、このような投与に適切な薬学的組成物を用いて被験体に投与され得る。このような組成物は、典型的には因子（例えば、核酸分子、タンパク質または抗体）および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬剤投与に適合可能な溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などのいずれかおよび全てを含むことが意図される。このような媒体及び因子の、薬学的に活性な物質への使用は、当該分野において周知である。任意の慣用的な媒体または因子が活性化合物に適合し得ない場合を除いて、組成物におけるこれらの使用が意図される。補充される活性化合物はまた、組成物中に組み込まれ得る。
本発明の治療法において使用される薬学的組成物は、その意図される投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、吸入投与）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注入水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、酢酸、クエン酸またはリン酸）および張性の調整のための因子（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーサブルシリンジまたは複数用量のバイアル中に封入され得る。
注入可能な用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（水溶性）または滅菌水性分散物、および滅菌注入可能な溶液もしくは分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理学的生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、そして容易な注射可能性が存在する程度に流体であるべきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対して保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性が、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用からの保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖）、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）および塩化ナトリウムを組成物中に含むことが、好ましい。注入可能な組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
滅菌注入可能な溶液は、上記で列挙した成分の１つまたは組合わせとともに、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する因子（例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質のフラグメントまたは抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、もしくは抗５７１４５抗体）を適切な溶媒中に必要とされる量で組み込み、必要ならば、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒体および上記で列挙された成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注入可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、以下のいずれかの成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する因子はまた、直腸送達のための坐剤の形態（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤基剤と共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
１つの実施形態において、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する因子は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する、感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単位投薬量として適切な、物理的に個々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する因子の固有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに被験体の処置のためのこのような因子を調合する当該分野に固有の制限によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
このような因子の毒性および治療効率は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療効果との間での用量比は、治療指数であり、そしてこれは、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表され得る。大きな治療指数を示す因子が好ましい。毒性の副作用を示す因子が使用され得るが、治療は、感染していない細胞に対する可能性のある損傷を最少にし、それによって副作用が減少するように、患部組織の部位に対してそのような因子を標的化する送達システムを設計するように、行われるべきである。
細胞培養アッセイおよび動物実験によって得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を処方する際に使用され得る。このような５７７調節因子、２０７３９調節因子、もしくは５７１４５調節因子の投与量は、好ましくは、わずかな毒性を有するかまたは毒性を全く有さないでＥＤ５０を含む、循環している濃度の範囲内である。投与量は、使用される投与量形態および利用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。本発明の治療方法において使用される任意の因子については、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に概算され得る。用量は、細胞培養物中で決定されるような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む、循環している血漿濃度の範囲を達成するように、動物モデルにおいて処方し得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中でのレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
本明細書中に規定されるように、タンパク質またはポリペプチドの治療有効量（すなわち、有効投薬量）は、体重１ｋｇ当たり約０．００１〜３０ｍｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．０１〜２５ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり約０．１〜２０ｍｇ、およびさらにより好ましくは体重当たり約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、５〜６ｍｇ／ｋｇの範囲である。疾患または障害の重篤度、事前の処置、被験体の一般的な健康状態および／もしくは年齢、ならびに他の疾患の存在を含むがこれらに限定されない特定の要因が、被験体を効果的に処置するために必要とされる投与量に影響を与え得ることが、当業者に明らかである。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体での被験体の処置は、単回の処置を含み得るか、または好ましくは、一連の処置を含み得る。
好ましい例においては、被験体は、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の抗体、タンパク質またはポリペプチドを用いて、約１〜１０週間の間、好ましくは２〜８週間の間、より好ましくは約３〜７週間の間、およびさらにより好ましくは約４、５、または６週間の間、１週間に１回、処置される。処置のために使用される抗体、タンパク質またはポリペプチドの有効投与量が、特定の処置の経過にわたって増大し得るかまたは減少し得ることもまた、明らかである。投与量の変化が生じ得、そして本明細書中に記載されているような診断アッセイの結果から明白となる。
本発明は、発現または活性を調節する因子を含む。因子は、例えば、低分子であり得る。例えば、このような低分子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ペプチド、ペプチド模倣物、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、約１０，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物（すなわち、へテロ有機化合物および有機金属化合物を含む）、約５，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約１，０００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、約５００ｇ／モル未満の分子量を有する有機化合物または無機化合物、ならびにこのような化合物の塩、エステル、および薬学的に受容可能な他の形態。低分子因子の適切な用量が当該分野の医師、獣医師または研究者の知識内の多くの要因に依存することが、理解される。低分子の用量は、例えば、処置される被験体またはサンプルの正体、サイズおよび状態に依存して、適用可能な場合、この組成物が投与される経路、およびこの低分子が有していることを開業医が所望する、本発明の核酸またはポリペプチドに対する効果にさらに依存して、変化する。
代表的な用量は、被験体またはサンプル重量１ｋｇあたりｍｇまたはμｇの量の低分子を含む（例えば、約１μｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、または約１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ）。低分子の適切な用量は、調節されるべき発現または活性に対するこの低分子の効力に依存することがさらに理解される。このような適切な用量は、本明細書中で記載されるアッセイを使用して、決定され得る。これらの低分子の１つ以上が、本発明のポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために、動物（例えば、ヒト）に投与される場合、医師、獣医または研究者は、例えば、初めに比較的低い用量を処方し、続いて、適切な応答が得られるまで、この用量を増加し得る。さらに、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、被験体の年齢、細胞増殖、身体全体の健康状態、性別および食餌、投与時間、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、ならびに調節されるべき発現または活性の程度を含む種々の因子に依存することが、理解される。
さらに、抗体（またはそのフラグメント）が、治療的部分（例えば、細胞毒、治療剤または放射性金属イオン）に結合され得る。細胞毒または細胞毒性剤としては、細胞に対して有害な任意の因子を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびプロマイシン、ならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療剤としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロランブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の結合体は、所定の生物学的応答を調節するために使用され得、薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。このようなタンパク質としては、例えば、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、プセウドモナス体外毒素またはジフテリア毒素；タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノゲンアクチベータ；または生物学的応答調節因子（例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子が挙げられる。
このような治療的部分を抗体に結合するための技術は、周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版），Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５），およびＴｈｏｒｐｅら、“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。あるいは、抗体は、米国特許第４，６７６，９８０号（Ｓｅｇａｌ）により記載されるように、第２の抗体と結合して、抗体ヘテロ結合体を形成する。
本発明の方法において使用される核酸分子は、ベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれる徐放マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが組換え細胞（例えば、レトロウイルスベクター）からインタクトで産生され得る場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
（Ｄ．薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
本発明の治療方法と共に、薬理ゲノム学（すなわち、被験体の遺伝子型とこの被験体の外来化合物または薬物に対する応答との間の関係の研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血液濃度との間の関係を変更することにより、重篤な毒性または治療不良をもたらし得る。従って、医師または臨床医は、５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する薬剤を投与するか否かを決定する際、ならびに５７７、２０７３９、もしくは５７１４５の活性を調節する薬剤を用いる処置の投薬量および／または治療レジメンを変更する際に、関連の薬理ゲノム学研究において得られた知識を適用することを考慮し得る。
薬理ゲノム学は、変更された薬物処置および罹患した個人における異常な作用に起因する薬物に対する応答における、臨床学的に有意な遺伝的変異を処置する。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．ら、（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５およびＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．ら、（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理遺伝子学条件は、区別され得る。遺伝的条件は、薬物が身体に作用する様式を変更する（変更された薬物作用）単一因子として伝わったか、または遺伝的条件は、身体が薬物に作用する様式を変更する（変更された薬物代謝）単一因子として伝わった。これらの薬理遺伝子学条件は、稀な遺伝子欠損としてかまたは天然に存在する多型としてかの、いずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−ホスフェートアミノペプチダーゼ欠損（Ｇ６ＰＤ）は、一般的な遺伝性酵素病であり、ここで、主な臨床学的合併症は、酸化薬剤（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
「ゲノムワイドアソシエーション（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」として知られている、薬物応答を予測する遺伝子を同定するための、１つの薬理ゲノム学アプローチは、すでに知られているゲノム関連マーカー（例えば、「二座対立遺伝子」遺伝子マーカーマップ（これは、６０，０００〜１００，０００の多型またはヒトゲノム上の可変性部位からなり、これらの各々が、２つの改変体を有する））からなるヒトゲノムの高解像度マップに、主に依存する。このような高解像度ゲノムマップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連したマーカーを同定するために、第ＩＩ期／第ＩＩＩ期の薬物試験に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較され得る。あるいは、このような高解像度マップは、ヒトゲノムにおいて、数千万の公知の一塩基多型（ＳＮＰ）の組み合わせから生じ得る。本明細書中で使用される場合、「ＳＮＰ」は、ＤＮＡの伸長において、単一ヌクレオチド塩基において生じる一般的な変更である。例えば、ＳＮＰは、ＤＮＡの１０００塩基毎に１回起き得る。ＳＮＰは、疾患プロセスに関与し得るが、大部分は、疾患に関連しないかもしれない。このようなＳＮＰの発生に基づくゲノムマップが与えられると、個体は、個々のゲノムにおいて、ＳＮＰの特定のパターンに依存して、遺伝子のカテゴリーに分類され得る。このような様式において、処置レジメンは、遺伝子学的に類似の個体の間で共通であり得る特性を考慮して、このような遺伝子学的に類似の個体の群に対して変更され得る。
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法は、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。この方法に従って、薬物の標的をコードする遺伝子が既知である場合（例えば、本発明の方法において使用される５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質）、その遺伝子の全ての共通の改変体は、その集団においてかなり容易に同定され得、そして別の遺伝子バージョンに対して１つの遺伝子バージョンを有することが特定の薬物応答に関連するか否かが決定され得る。
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続時間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）ならびにシトクロムＰ４５０酵素のＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、なぜ何人かの患者が推定される薬物効果を得られないか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および重篤な毒性を示すかについての説明を提供した。これらの多型は、集団における２つの表現型である、代謝が速やかな人（ＥＭ）および代謝が遅い人（ＰＭ）において現れる。ＰＭの罹患率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、高度に多型性であり、いくつかの変異が、ＰＭにおいて同定されており、これらの全ては、機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在を生じる。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の代謝が乏しい人は、標準的な投薬量を投与された場合、かなり頻繁に、過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が、活性な治療的部分である場合、ＰＭは、ＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物のモルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果について証明されるように、治療的応答を示さない。他の極端な例は、標準的な投薬量に対して応答しない、いわゆる代謝が超迅速な人である。最近、超迅速な代謝の分子的根拠が、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因することが同定された。
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法が、薬物応答を予測する遺伝子を同定するために用いられ得る。例えば、薬物（例えば、本発明の方法において使用される５７７分子、２０７３９分子または５７１４５分子または５７７モジュレーター、２０７３９モジュレーターまたは５７１４５モジュレーター）を投与された動物の遺伝子発現は、毒性に関連する遺伝子経路のスイッチがオンになるか否かの指標を与え得る。
１より多い上記薬理ゲノム学アプローチから生成される情報を使用して、被験体の予防的処置または治療的処置のための、適切な投薬量および処置レジメンを決定し得る。この知識は、投薬または薬物選択に適用される場合、有害反応または治療の失敗を回避し得、従って、５７７活性、２０７３９活性または５７１４５活性を調節する薬剤で、心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）に罹患した被験体を処置するときの治療効果または予防効果を増強させ得る。
（Ｖ．本発明の方法において使用される組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の方法（例えば、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイ）は、ベクター、好ましくは発現ベクター（５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質（またはそれらの部分）をコードする核酸を含む）の使用を含む。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」とは、連結されている別の核酸を輸送する能力を有する核酸分子をいう。ベクターの１つのタイプは、「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、このウイルスベクターにおいて、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製する能力を有する。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）が、宿主細胞に導入された場合に、この宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それによりこの宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向する能力を有する。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」と称される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用される形態のベクターである場合、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等な機能を果たすこのような他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス））を含むことを意図する。
本発明の方法で使用される組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で、本発明の核酸を含む。この適切な形態とは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される１つ以上の調節配列を含むことを意味し、この調節配列は、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロでの転写／翻訳系において、またはベクターが宿主細胞に導入されている場合は、宿主細胞において）このヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、調節配列に連結されていることを意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載される。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列（例えば、組織特異的調節配列）の発現を指向する配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者に認識される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞内に導入され得、これにより本明細書中に記載されるような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチド（融合タンパク質または融合ポリペプチドを含む）（例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を産生し得る。
本発明の方法において使用される組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、さらにＧｏｅｄｄｅｌ（１９９０）（前出）において議論される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
原核生物におけるタンパク質発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、ほとんどＥ．ｃｏｌｉにて行われる。融合ベクターは、多くのアミノ酸を、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、典型的に以下の３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）組換えタンパク質の安定性を増加させること；および３）アフィニティ精製におけるリガンドとして作用させることによって組換えタンパク質の精製を補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解性切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との連結部に導入され、その融合部分からの組換えタンパク質の分離、続く融合タンパク質の精製を可能にする。このような酵素およびこれらの同族認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（これらはそれぞれ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する）が挙げられる。
精製された融合タンパク質は、５７７活性、２０７３９活性または５７１４５活性のアッセイ（例えば、以下に詳細に記載される直接アッセイまたは競合アッセイ）において、または５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質に特異的な抗体を生成するために使用され得る。好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルス発現ベクターにおいて発現される５７７融合タンパク質、２０７３９融合タンパク質または５７１４５融合タンパク質を使用して、骨髄細胞を感染し続いて照射したレシピエントに移植し得る。次いで、被験体レシピエントの病理学は、十分な時間が経過した後（例えば、６週間）に試験される。
別の実施形態において、本発明の核酸を、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現させる。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合、この発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０由来である。原核生物細胞および真核生物細胞の両方に適切な他の発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターが、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントが核酸の発現に使用される）。
本発明の方法は、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターをさらに使用し得る。すなわち、このＤＮＡ分子は、（このＤＮＡ分子の転写によって）５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡまたは５７１４５ ｍＲＮＡに対するアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結される。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列が選択され得、この調節配列は、種々の細胞型においてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を指向し、例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的な発現、組織特異的な発現または細胞型特異的な発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはウイルスエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率調節領域の制御下で産生される、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、これらのベクターが導入される細胞型により決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
本発明の別の局面は、本発明の５７７核酸分子、２０７３９核酸分子または５７１４５核酸分子（例えば、組換え発現ベクター内の５７７核酸分子、２０７３９核酸分子または５７１４５核酸分子、あるいは５７７核酸分子、２０７３９核酸分子または５７１４５核酸分子が宿主細胞ゲノムの特定の部位中に相同組換えされることを可能とする配列を含む５７７核酸分子、２０７３９核酸分子または５７１４５核酸分子）が導入される宿主細胞の使用に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の被験体細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫もいう。特定の改変は、変異または環境的影響のいずれかに起因して次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でなくてもよく、本明細書中で使用されるようなこの用語の範囲内になお含まれる。
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウム共沈殿もしくは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、および他の実験説明書において見出され得る。
培養物中の本発明の方法で使用される宿主細胞（例えば、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞）を使用して、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質を産生（すなわち、発現）し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（この中に、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養する工程を、包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞から５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質を単離する工程を包含する。
（ＶＩ．本発明の方法において使用される単離された核酸分子）
本発明の方法は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質をコードする単離された核酸分子またはその生物学的に活性な部分、ならびに５７７、２０７３９または５７１４５をコードする核酸分子（例えば、５７７ ｍＲＮＡ、２０７３９ ｍＲＮＡまたは５７１４５ ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸フラグメント、および５７７核酸分子、２０７３９核酸分子または５７１４５核酸分子の増幅または変異のためのＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントの使用を含む。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して産生されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
本発明の方法において使用される核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号４もしくは配列番号７のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはその部分）は、本明細書中で提供される標準的な分子生物学的技術および配列情報を使用して単離され得る。配列番号１、配列番号４または配列番号７の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、５７７核酸分子、２０７３９核酸分子または５７１４５核酸分子は、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を使用して単離され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されるようにして）。
さらに、配列番号１、配列番号４または配列番号７の全てまたは一部を含む核酸分子が、配列番号１、配列番号４または配列番号７の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。
本発明の方法において使用される核酸は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って使用して、増幅され得る。さらに、５７７ヌクレオチド配列、２０７３９ヌクレオチド配列または５７１４５ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によって、例えば、自動化ＤＮＡ合成器を使用して、調製され得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号４または配列番号７で示されるヌクレオチド配列、配列番号１、配列番号４または配列番号７で示されるヌクレオチド配列の相補体、あるいはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部、を含む。配列番号１、配列番号４または配列番号７で示される核酸配列に相補的な核酸分子は、配列番号１、配列番号４または配列番号７で示されるヌクレオチド配列に対して十分に相補的である核酸分子であり、その結果、この核酸分子は、配列番号１、配列番号４または配列番号７で示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズし、それにより、安定な二重鎖を形成し得る。
さらに別の好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号４または配列番号７で示されるヌクレオチド配列の全長、あるいはこのヌクレオチド配列のいずれかの一部と、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を含む。
さらに、本発明の方法において使用される核酸分子は、配列番号１、配列番号４または配列番号７の核酸配列の一部のみを含み得る（例えば、プローブもしくはプライマーとして使用され得るフラグメント、または５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の一部（例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の生物学的に活性な部分）をコードするまたはフラグメント）。プローブ／プライマーは、代表的に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的に、配列番号１、配列番号４または配列番号７のセンス配列、配列番号１、配列番号１、配列番号４または配列番号７のアンチセンス配列、あるいは配列番号１、配列番号４または配列番号７の天然に存在する対立遺伝子の改変体または変異体のうち、少なくとも約１２個または１５個、好ましくは、約２０個または２５個、より好ましくは約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個、約５５個、約６０個、約６５個、または約７５個の保存的ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。１つの実施形態において、本発明の方法において使用される核酸分子は、１００より長く、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜１１００、１１００〜１２００、１２００〜１３００、またはそれを超えるヌクレオチドの長さであり、かつ配列番号１、配列番号４または配列番号７の核酸分子に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、互いに対して有意に同一であるかまたは相同であるヌクレオチド配列が、互いに対してハイブリダイズしたまま残存するハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載することが意図される。好ましくは、この条件は、互いに対して、少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８５％または９０％同一である配列が、互いに対してハイブリダイズしたまま残存する条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５），第２節，第４節および第６節に見出され得る。さらなるストリンジェント条件は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９），第７節，第９節および第１１節に見出され得る。好ましい、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約６５〜７０℃における４×の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃における４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、続く約６５〜７０℃における１×ＳＳＣでの１回以上の洗浄を含む。好ましい、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約６５〜７０℃における１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃における１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、続く約６５〜７０℃における０．３×ＳＳＣでの１回以上の洗浄を含む。好ましい、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限例は、約５０〜６０℃における４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（あるいは、約４０〜４５℃における６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、続く約５０〜６０℃における２×ＳＳＣでの１回以上の洗浄を含む。上で引用した値（例えば、６５〜７０℃または４２〜５０℃）に対する中間の範囲もまた、本発明によって包含されることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）を、ハイブリダイゼーションにおいて、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）および洗浄緩衝液に置き換え得；ハイブリダイゼーションの完了後に、洗浄を、それぞれ１５分間実施する。５０未満の塩基対長であると予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低いはずであり、ここで、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。１８未満の塩基対長のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）である。１８塩基対長と４９塩基対長との間のハイブリッドに関しては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、ここで、Ｎは、ハイブリッドにおける塩基の数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。さらなる試薬が、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液に添加され、核酸分子の膜（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜）への非特異的なハイブリダイゼーションを減少させ得ることもまた、当業者によって理解され得、これらの試薬としては、遮断剤（例えば、ＢＳＡまたはシャケ精子キャリアＤＮＡまたはニシン精子キャリアＤＮＡ）、洗浄剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィコール、ＰＶＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。ナイロン膜を使用する場合、特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらに好ましい非制限実施形態は、約６５℃において０．２５〜０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、７％ ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、続く、６５℃における０．０２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、１％ ＳＤＳでの１回以上洗浄（または、代わりに０．２×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ）である（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１９９１−１９９５）を参照のこと）。
好ましい実施形態において、プローブは、さらに、このプローブに結合される標識基を含み、例えば、この標識基は、放射線同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば、被験体由来の細胞サンプル中の５７７コード核酸、２０７３９コード核酸または５７１４５コード核酸のレベルを測定すること（例えば、５７７ ｍＲＮＡレベル、２０７３９ ｍＲＮＡレベルまたは５７１４５ ｍＲＮＡレベルを検出すること）、またはゲノム５７７遺伝子、ゲノム２０７３９遺伝子またはゲノム５７１４５遺伝子が変異または欠失しているか否かを決定することによって、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための一組の診断用試験キットとして使用され得る。
本発明の方法は、さらに、ゲノムコードの縮重に起因して、配列番号１、配列番号４または配列番号７に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子の使用を含み、従って、配列番号１、配列番号４または配列番号７に示されるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と同一の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の方法に含まれる単離された核酸分子は、配列番号３、配列番号６または配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
本発明の方法はさらに、ヒト５７７、ヒト２０７３９またはヒト５７１４５の対立遺伝子改変体（例えば、機能的または非機能的な対立遺伝子改変体）の使用を含む。機能的な対立遺伝子改変体は、５７７活性、２０７３９活性または５７１４５活性を維持するヒト５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の、天然に存在するアミノ酸配列改変体である。機能的な対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号３、配列番号６または配列番号９の１個以上のアミノ酸の保存的置換のみ、あるいはタンパク質の非必須領域にある非必須残基の置換、欠失または挿入を含む。
非機能的な対立遺伝子改変体は、５７７活性、２０７３９活性または５７１４５活性を有さないヒト５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質の天然に存在するアミノ酸配列改変体である。非機能的な対立遺伝子改変体は、代表的に、配列番号３、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列の非保存的置換、欠失、もしくは挿入または成熟前切断、あるいはタンパク質の必須残基または必須領域の置換、挿入または欠失を含む。
本発明の方法は、さらに、ヒト５７７タンパク質、ヒト２０７３９タンパク質またはヒト５７１４５タンパク質の非ヒトオルソログを使用し得る。ヒト５７７タンパク質、ヒト２０７３９タンパク質またはヒト５７１４５タンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離され、そして同一の５７７活性、２０７３９活性または５７１４５活性を有するタンパク質である。
本発明の方法は、さらに、配列番号１、配列番号４または配列番号７のヌクレオチド配列を含む核酸分子、あるいはその一部の使用を含み、ここで、変異が導入される。この変異は、「非必須」アミノ酸残基または「必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換を導き得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変更することなく、５７７、２０７３９または５７１４５の野生型配列（例えば、配列番号３、配列番号６または配列番号９の配列）から変更され得る残基であり、それに対して「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質中で保存されるアミノ酸残基は、変更に対して影響を受けにくいようである。
変異は、標準的な技術（例えば、部位特異的変異およびＰＣＲ媒介変異）によって、配列番号１、配列番号４または配列番号７に導入され得る。好ましくは、保存的なアミノ酸置換は、１個以上の推定非必須アミノ酸残基から作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で規定されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質または５７１４５タンパク質中の推定非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、例えば、飽和変異誘発によって、５７７コード配列、２０７３９コード配列または５７１４５コード配列の全てまたは一部に沿って無作為に導入され得、そして得られる変異体は、活性を保持する変異体を同定するために、５７７、２０７３９または５７１４５の生物学的活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１、配列番号４または配列番号７の変異誘発の後、コードされるタンパク質は、組換え発現され得、そしてタンパク質の活性が、本明細書中に記載されるアッセイを使用して、決定され得る。
本発明の別の局面は、配列番号１、配列番号４または配列番号７のヌクレオチド配列に対してアンチセンスである、単離された核酸分子の使用に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であるか、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的である）ヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合し得る。このアンチセンス核酸は、全５７７コード鎖、全２０７３９コード鎖または全５７１４５コード鎖、あるいはその一部のみに対して相補的であり得る。一つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、５７７、２０７３９または５７１４５をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、５７７、２０７３９または５７１４５をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’配列および３’配列をいう（５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいう）。
本明細書中で開示される５７７、２０７３９または５７１４５をコードするコード鎖配列を考慮すると、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋの塩基対形成の法則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、５７７、２０７３９または５７１４５ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、アンチセンス核酸分子は、５７７、２０７３９もしくは５７１４５ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５７７、２０７３９または５７１４５ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺の領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を使用して、化学合成および酵素的連結反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは、分子の生物学的安定性を高めるためにか、またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を高めるために設計された、多様に改変されたヌクレオチドを使用して化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変されたヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオジン（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチルー２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンスの方向にサブクローニングされた発現ベクター（すなわち、核酸が挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）を使用して、生物学的に生成され得る。本発明の方法で使用されるアンチセンス核酸分子は、第ＩＶ節でさらに上述される。
なお別の実施形態において、本発明の方法で使用される５７７、２０７３９または５７１４５核酸分子は、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を向上させるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）で改変され得る。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成するために改変され得る（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４（１）：５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」すなわち「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格により置換され、４つの天然核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物（例えばＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの天然骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的なハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、前出のＨｙｒｕｐ Ｂ．ら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に記載されているとおりの標準固相ペプチド合成プロトコールを使用して実施され得る。
５７７、２０７３９または５７１４５核酸分子のＰＮＡは、本明細書中で記載する治療的適用および診断的適用に使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳の停止を誘導することによってか、または複製を阻害することによって、遺伝子発現の配列特異的な調節のためのアンチセンス因子またはアンチ遺伝子（ａｎｔｉｇｅｎｅ）因子として使用され得る。５７７、２０７３９または５７１４５核酸分子のＰＮＡはまた、他の酵素（例えばＳ１ヌクレアーゼ（前出のＨｙｒｕｐ Ｂ．ら（１９９６）））と組み合せて使用される場合「人工制限酵素」として；またはＤＮＡ配列決定もしくはハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（前出のＨｙｒｕｐ Ｂ．ら（１９９６）またはＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）；前出）、遺伝子における１塩基対変異の分析（例えば、ＰＮＡ指向性のＰＣＲクランピングによる）において；も使用され得る。
別の実施形態において、親油性基もしくは他のヘルパー基をＰＮＡに付着することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野で公知の他の薬物送達技術の使用によって、５７７、２０７３９または５７１４５のＰＮＡは改変され得る（例えば、それらの安定性または細胞取り込みを亢進するために）。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合わせ得る、５７７、２０７３９または５７１４５核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが作製され得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用することを可能にし、一方でＰＮＡ部分が高い結合親和性および結合特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキングに関して選択された適切な長さのリンカー、多数の核酸塩基間の結合および配向を使用して連結され得る（前出のＨｙｒｕｐ Ｂ．ら（１９９６））。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、前出のＨｙｒｕｐ Ｂ．ら（１９９６）およびＦｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７)：３３５７−６３に記載されているように実施され得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準のホスホラミダイト結合化学を使用する固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間として使用され得る（Ｍａｇ，Ｍ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次いで、ＰＮＡモノマーは、段階的な様式で結合され、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生する（前出のＦｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら（１９９６））。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子が合成され得る（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
他の実施形態において、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加された基（例えば、インビボにおいて宿主細胞レセプターを標的化するための）、または細胞膜を横断する輸送を促進する因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）、もしくは血液−脳関門を横断する輸送を促進する因子（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと）を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが引き金を引く切断因子（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−９７６を参照のこと）または、インターカレート因子（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を使用して改変され得る。この目的を達成するために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションが引き金を引く架橋因子、輸送因子、またはハイブリダイゼーションが引き金を引く切断因子）と結合体化され得る。
（ＶＩＩ．本発明の方法に使用される単離された５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質および抗５７７、２０７３９または５７１４５抗体）
本発明の方法は、単離された５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質およびそれらの生物学的活性部分、ならびに抗５７７、２０７３９または５７１４５抗体を産生させるための免疫原として使用されるのに適したポリペプチドフラグメントの使用を含む。１つの実施形態において、ネイティブの５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質は、標準のタンパク質精製技術を使用した適切な精製スキームによって細胞供給源または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生される。組換え発現に代わり、５７７、２０７３９もしくは５７１４５タンパク質または５７７、２０７３９もしくは５７１４５ポリペプチドは、標準のペプチド合成技術を使用して化学的に合成され得る。
本明細書中で使用される場合、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の「生物学的活性部分」は、５７７、２０７３９または５７１４５活性を有する５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質のフラグメントを含む。５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の生物学的活性部分は、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるアミノ酸配列を含むペプチド、または５７７、２０７３９もしくは５７１４５タンパク質のアミノ酸配列由来のペプチド（例えば、配列番号３、６、９に示されるアミノ酸配列であって、全長５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質よりは少ないアミノ酸を含みかつ、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の活性を少なくとも１つ示すアミノ酸配列）を含む。代表的に、生物学的活性部分は、５７７、２０７３９もしくは５７１４５タンパク質の活性を少なくとも１つ有するドメインまたはモチーフ（例えば、アポトーシス活性の調節に関与していると考えられる５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質のＮ末端領域）を含む。５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の生物学的活性部分は、例えば２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００またはそれより多くのアミノ酸長である、ポリペプチドであり得る。５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の生物学的活性部分は、５７７、２０７３９または５７１４５活性を調節する開発中の薬剤についての標的として使用され得る。
好ましい実施形態において、本発明の方法に使用される５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質は、配列番号３、６、９に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質は配列番号３、６、９と実質的に同一であり、配列番号３、６、９のタンパク質の機能的な活性を保持するが、上記の小節Ｖで詳細に記載するように、天然の対立遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因して、アミノ酸配列において異なる。従って、別の実施形態において、本発明の方法に使用される５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質は、少なくとも、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を、配列番号３、６、９に対して有するアミノ酸配列を含むタンパク質である。
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は最適な比較目的（例えば、最適な配列のために、ギャップが第一および第二のアミノ酸配列もしくは核酸配列の１つまたは両方に導入され得、そして非同一配列が比較目的について無視され得る）について整列される。好ましい実施形態において、比較目的のために整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの、少なくとも３０％であり、好ましくは少なくとも４０％であり、より好ましくは少なくとも５０％であり、なおより好ましくは少なくとも６０％であり、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％である（例えば、５００アミノ酸残基を有する配列番号３、６、９の５７７、２０７３９または５７１４５アミノ酸配列に対して第二の配列を整列する場合、少なくとも７５、好ましくは少なくとも１５０、より好ましくは少なくとも２２５、なおより好ましくは少なくとも３００、なおさらに好ましくは少なくとも４００以上のアミノ酸残基が整列される）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドが、比較される。第一配列における位置が、第二配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、これらの分子は、従って、その位置において同一である（本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同等である）。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適な整列のために導入が必要とされたギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数である。
２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ニードルマンおよびブンシュ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズム（このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている）を使用し、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用し、ギャップウェイト（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）は１６、１４、１２、１０、８、６または４であり、長さのウェイト（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）は１、２、３、４、５または６で決定される。なお別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）のＧＡＰプログラムを使用し、決定される。ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用し、ギャップウェイトは４０、５０、６０、７０または８０であり、長さのウェイトは１、２、３、４、５または６で決定される。別の実施形態において、２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７（１９８８））（このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０または２．０Ｕ）に組み込まれている）を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ長ペナルティ（ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｐｅｎａｌｔｙ）および４のギャップペナルティ（ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ）を使用して決定される。
本発明の方法はまた、５７７、２０７３９もしくは５７１４５キメラタンパク質または５７７、２０７３９もしくは５７１４５融合タンパク質を使用し得る。本明細書中に使用される場合、５７７、２０７３９もしくは５７１４５「キメラタンパク質」または５７７、２０７３９もしくは５７１４５「融合タンパク質」は、非５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドに作動可能に連結された５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドを含む。「５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチド」は、５７７、２０７３９または５７１４５分子に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうのに対し、「非５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチド」は、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質と実質的に相同でないタンパク質（例えば、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質と異なるタンパク質、および、同じまたは異なる生物体由来のタンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドのことをいう。５７７、２０７３９または５７１４５融合タンパク質において、５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドは、５７７、２０７３９もしくは５７１４５タンパク質のすべてまたは一部に対応し得る。好ましい実施形態において、５７７、２０７３９または５７１４５融合タンパク質は、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の少なくとも１つの生物的活性部位を含む。別の好ましい実施形態において、５７７、２０７３９または５７１４５融合タンパク質は、５７７、２０７３９または５７１４５タンパク質の少なくとも２つの生物的活性部位を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結される」は、５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドおよび非５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドがお互いにインフレームで融合されるということを示すことが企図される。非５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドは、５７７、２０７３９または５７１４５ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
例えば、１つの実施形態において、融合タンパク質は、ＧＳＴ−５７７融合タンパク質、ＧＳＴ−２０７３９融合タンパク質、ＧＳＴ−５７１４５融合タンパク質であり、ここで、５７７配列、２０７３９配列または５７１４５配列は、ＧＳＴ配列のＣ末端に融合されている。そのような融合タンパク質は、組換え５７７、組換え２０７３９、または組換え５７１４５の精製を容易にし得る。
別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含む、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、５７７、２０７３９、または５７１４５の発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を通じて増加され得る。
本発明の方法において用いられる５７７融合タンパク質、２０７３９融合タンパク質、または５７１４５融合タンパク質は、薬学的組成物へと組み込まれ得、そしてインビボで被験体に投与され得る。５７７融合タンパク質、２０７３９融合タンパク質、または５７１４５融合タンパク質が、使用されて、５７７基質、２０７３９基質、または５７１４５基質のバイオアベイラビリティーに影響し得る。５７７融合タンパク質、２０７３９融合タンパク質、または５７１４５融合タンパク質の使用は、例えば、（ｉ）５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質をコードする遺伝子の異常な改変または変異、（ｉｉ）５７７遺伝子、２０７３９遺伝子、または５７１４５遺伝子の誤調節（ｍｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）；および（ｉｉｉ）５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の異常な翻訳後修飾により引き起こされる障害の処置のために治療的に有用であり得る。
さらに、本発明の方法において使用される５７７融合タンパク質、２０７３９融合タンパク質、または５７１４５融合タンパク質は、被験体において抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、または抗５７１４５抗体を産生するため、５７７リガンド、２０７３９リガンド、または５７１４５リガンドを精製するため、およびスクリーニングアッセイにおいて、５７７、２０７３９または５７１４５と５７７基質、２０７３９基質または５７１４５基質との相互作用を阻害する分子を同定するための免疫原として用いられ得る。
好ましくは、本発明の方法において用いられる５７７キメラタンパク質もしくは５７７融合タンパク質、２０７３９キメラタンパク質もしくは２０７３９融合タンパク質、または５７１４５キメラタンパク質もしくは５７１４５融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、慣用的な技術に従い、例えば、連結のための平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切であるように付着末端のはめ込み（ｆｉｌｌｉｎｇ ｉｎ）、所望されない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を用いて、インフレームで、互いに連結される。別の実施形態において、この融合遺伝子は、慣用的な技術（自動ＤＮＡ合成器が挙げられる）により合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを用いて実施され、このアンカープライマーは、２つの連続する遺伝子フラグメントの間に相補的な突出部を生じ、次いで、この遺伝子フラグメントが、アニーリングおよび再増幅されてキメラ遺伝子配列を作製し得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）を予めコードしている多くの発現ベクターが、市販されている。５７７コード核酸、２０７３９コード核酸、または５７１４５コード核酸は、そのような発現ベクターへとクローニングされ得、その結果、この融合部分は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質にインフレームで連結される。
本発明はまた、５７７のアゴニスト（模倣物）、２０７３９のアゴニスト（模倣物）、もしくは５７１４５のアゴニスト（模倣物）または５７７のアンタゴニスト、２０７３９のアンタゴニスト、もしくは５７１４５のアンタゴニストのいずれかとして機能する、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の改変体の使用に関する。５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の改変体は、変異誘発（例えば、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の別個の点変異または短縮）により作製され得る。５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の生物学的活性と実質的に同一な活性か、またはそのサブセットを保持し得る。５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の１つ以上の活性を、例えば、この５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の５７７媒介活性、２０７３９媒介活性、または５７１４５媒介活性を競合的に調節することによって阻害し得る。従って、特定の生物学的効果を、制限された機能の改変体で処理することにより誘発し得る。１つの実施形態において、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、天然に存在する形態の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質での処置と比較して、被験体においてより少ない副作用を有する。
１つの実施形態において、５７７アゴニスト（模倣物）、２０７３９アゴニスト（模倣物）、もしくは５７１４５アゴニスト（模倣物）または５７７アンタゴニスト、２０７３９アンタゴニスト、もしくは５７１４５アンタゴニストのいずれかとして機能する５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の改変体は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質のアゴニスト活性または５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質のアンタゴニスト活性について、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の変異体（例えば、短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施形態において、５７７改変体、２０７３９改変体、または５７１４５改変体の多様なライブラリーは、核酸レベルにおけるコンビナトリアル変異誘発によって生成され、そして多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。５７７改変体、２０７３９改変体、または５７１４５改変体の多様なライブラリーは、例えば、潜在的な５７７配列、２０７３９配列、または５７１４５配列の縮重セットが個々のポリペプチドとして、または代替的に、そこに５７７配列、２０７３９配列、もしくは５７１４５配列のセットを含む、より大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現可能であるように、遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素的に連結することによって産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的な５７７改変体、２０７３９改変体、または５７１４５改変体のライブラリーを産生するために使用し得る種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化ＤＮＡ合成機において実行され、次いで合成遺伝子は、適切な発現ベクターに連結され得る。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的な５７７配列、２０７３９配列、または５７１４５配列の所望のセットをコードする配列のすべての提供を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３，Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
さらに、５７７タンパク質コード配列、２０７３９タンパク質コード配列、または５７１４５タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のために５７７フラグメント、２０７３９フラグメント、または５７１４５フラグメントの多様な集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態において、コード配列フラグメントのライブラリーは、５７７コード配列、２０７３９コード配列、または５７１４５コード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、ニックが１分子あたり約１つだけ生じる条件下でヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、ＤＮＡを再生させて、異なるニックを有する生成物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いる処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結すること、によって生成され得る。この方法によって、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の種々のサイズのＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導し得る。
点変異または短縮化によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が、当該分野で公知である。このような技術は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングのために適合可能である。高スループット分析に従う、大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのための最も広範に使用される技術は、代表的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られるベクターのライブラリーでの適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出が、遺伝子産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含む。帰納的アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を高める新たな技術であり、５７７改変体、２０７３９改変体、または５７１４５改変体を同定するためにスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７−３３１）。
本発明の方法は、抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、または抗５７１４５抗体の使用をさらに包含する。単離された５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質、またはその一部分もしくはフラグメントは、ポリクローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的な技術を使用して、５７７、２０７３９、または５７１４５を結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。全長５７７タンパク質、全長２０７３９タンパク質、または全長５７１４５タンパク質が使用され得るか、または代替的に、５７７、２０７３９、または５７１４５の抗原性ペプチドフラグメントは、免疫原として使用され得る。５７７、２０７３９、または５７１４５の抗原性ペプチドは、配列番号３、配列番号６、配列番号９に示されるアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、そして５７７、２０７３９、または５７１４５のエピトープを含み、その結果、そのペプチドに対して惹起された抗体は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質との特異的な免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１５アミノ酸残基、なおより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、そして最も好ましくは、少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
その抗原性ペプチドによって含まれる好ましいエピトープは、そのタンパク質の表面に位置する５７７、２０７３９、または５７１４５の領域（例えば、親水性領域）ならびに高い抗原性を有する領域である。
代表的には、５７７免疫原、２０７３９免疫原、または５７１４５免疫原を使用して、適切な被験体（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）に免疫原を免疫することにより抗体を調製する。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換え発現された５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、もしくは５７１４５タンパク質または化学合成された５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチド、または５７１４５ポリペプチドを含み得る。この調製物は、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、または同様な免疫刺激剤）をさらに含み得る。適切な被験体を免疫原性５７７調製物、免疫原性２０７３９調製物、または免疫原性５７１４５調製物で免疫することにより、ポリクローナル抗５７７抗体応答、ポリクローナル抗２０７３９抗体応答、またはポリクローナル抗５７１４５抗体応答が惹起される。
用語「抗体」とは、本明細書中で用いられる場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部（すなわち、抗原（例えば、５７７、２０７３９、または５７１４５）を特異的に結合する（この抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）をいう。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、酵素（例えば、ペプシン）で抗体を処理することにより生成され得るＦ（ａｂ）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明は、５７７分子、２０７３９分子、または５７１４５分子を結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書中で使用される場合、５７７、２０７３９、または５７１４５の特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、代表的には、これが免疫反応する特定の５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質に対する単一の結合親和性を提示する。
ポリクローナル抗５７７抗体、ポリクローナル抗２０７３９抗体、またはポリクローナル抗５７１４５抗体は、適切な被験体に５７７免疫原、２０７３９免疫原、または５７１４５免疫原を免疫することにより、上記のように調製され得る。免疫した被験体における抗５７７抗体力価、抗２０７３９抗体力価、または抗５７１４５抗体力価は、標準的技術により（例えば、固定化した５７７、２０７３９、または５７１４５を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて）経時的にモニターされ得る。所望であれば、５７７、２０７３９、または５７１４５に対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そしてさらに周知の技術（例えば、ＩｇＧ画分を得るためのプロテインＡクロマトグラフィー）により精製され得る。免疫後、適切な時間に、例えば、抗５７７抗体力価、抗２０７３９抗体力価、または抗５７１４５抗体力価が最も高いときに、抗体生成細胞を被験体から獲得し得、そしてこれを使用して、標準的技術（例えば、初めは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７により記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ２９：２６９−７５もまた参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６頁）またはトリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術）によりモノクローナル抗体を調製し得る。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する技術は、周知である（一般には、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｒ．Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｌｅｒｎｅｒ，Ｅ．Ａ．（１９８１）Ｙａｌｅ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．５４：３８７−４０２；Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡潔には、不死化細胞株（代表的には骨髄腫細胞）を、上記のように５７７免疫原、２０７３９免疫原、または５７１４５免疫原で免疫した哺乳動物由来のリンパ球（代表的には、脾臓細胞）と融合し、そして得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、５７７、２０７３９、または５７１４５を結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを同定する。
リンパ球と不死化細胞株とを融合するために使用される任意の多くの周知のプロトコルは、抗５７７モノクローナル抗体、抗２０７３９モノクローナル抗体、または抗５７１４５モノクローナル抗体を生成する目的で適用され得る（例えば、Ｇ．Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）上記；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）上記；およびＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０）、上記を参照のこと）。さらに、当業者は、このような方法の多くのバリエーションが存在し、これらは、やはり有用であることを理解する。代表的には、不死化細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。例えば、マウスハイブリドーマは、本発明の免疫原性調製物で免疫したマウス由来のリンパ球と不死化マウス細胞株とを融合することにより作製され得る。好ましい不死化細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養培地（「ＨＡＴ培地」）に感受性であるマウス骨髄腫細胞株である。任意の多くの骨髄腫細胞株は、標準的技術に従う融合パートナーとして使用され得る（例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株）。これらの骨髄腫株は、ＡＴＣＣから入手可能である。代表的には、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウス脾臓細胞に融合する。次いで、融合から得られたハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ培地を用いて選択する（このことにより、融合していない細胞および生成性でない融合骨髄腫細胞は死ぬ（融合していない脾臓細胞は、形質転換していないので数日後に死ぬ））。本発明のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞は、５７７、２０７３９、または５７１４５を結合する抗体について、ハイブリドーマ培養上清をスクリーニングすることにより（例えば、標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して）検出される。
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製するかわりに、モノクローナル抗５７７抗体、モノクローナル抗２０７３９抗体、またはモノクローナル抗５７１４５抗体を、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を５７７、２０７３９、または５７１４５を用いてスクリーニングすることにより同定および単離し得、それによって５７７、２０７３９、または５７１４５を結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離し得る。ファージディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングするためのキットは、市販されている（例えば、ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；およびｔｈｅ Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰＴＭ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーを生成し、そしてスクリーニングする際の使用に特になじみやすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｋａｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５４に見出され得る。
さらに、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含む組換え抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、または抗５７１４５抗体（例えば、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の方法の範囲内であり、これは、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら 欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願番号第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ 米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載される方法を使用して）生成され得る。
抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、または抗５７１４５抗体は、５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質の発現の量およびパターンを評価するために、（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）５７７タンパク質、２０７３９タンパク質、または５７１４５タンパク質を検出するために使用され得る。抗５７７抗体、抗２０７３９抗体、または抗５７１４５抗体は、例えば、所定の処置レジメの効力を決定するために、臨床試験の手順の一部として、組織におけるタンパク質レベルをモニターするために診断的に使用され得る。検出は、抗体を検出可能な物質と結合させる（すなわち、物理的に連結させる）ことによって容易にされ得る。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、またはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例には、ルミノールが挙げられ；生体発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして、適切な放射活性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
本発明はさらに、以下の実施例により例示される。以下の実施例は、限定すると解釈されない。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許、および公開された特許出願の内容ならびに図および配列表は、本明細書中に参考として援用される。
（実施例１：ＴａｑｍａｎTM分析を使用する組織分布）
この実施例は、ＴａｑＭａｎTM手順を記載する。ＴａｑｍａｎTM手順は、ｍＲＮＡを検出するための、定量的逆転写ＰＣＲベースのアプローチである。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＰＣＲの間にＴａｑＭａｎTMプローブを切断するために、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄTM ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用する。簡潔には、ｃＤＮＡを、目的のサンプル（例えば、心臓、腎臓、肝臓、骨格筋、および種々の脈管）から生成して、ＰＣＲ増幅のための出発物質として使用した。５’側および３’側の遺伝子特異的プライマーに加えて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（これは、増幅される領域に相補的である）（すなわち、ＴａｑｍａｎTMプローブ）を、この反応中に含めた。ＴａｑＭａｎTMプローブは、このプローブの５’末端に共有結合した蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４，５−ジクロロ−２，７−ジメトキシフルオレセイン）、またはＶＩＣ）を有し、かつプローブの３’末端にクエンチャー色素（ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルローダミン）を有するオリゴヌクレオチドを含む。
ＰＣＲ反応の間に、プローブの切断は、レポーター色素およびクエンチャー色素を分離し、レポーターの蛍光の増大を生じる。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加をモニタリングすることによって直接検出される。プローブがインタクトである場合、レポーター色素がクエンチャー色素に近いことは、レポーター蛍光の抑制を生じる。ＰＣＲの間、目的の標的が存在する場合、このプローブは、順方向プライマー部位と逆方向プライマー部位との間に特異的にアニーリングする。ＡｍｐｌｉＴａｑTM Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’ヌクレオチド分解（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）活性は、プローブが標的にハイブリダイズする場合にのみ、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。次いで、このプローブフラグメントは、標的から移動され、そして鎖の重合が続く。プローブの３’末端は、ＰＣＲの間のプローブの伸長を防止するためにブロックされる。このプロセスは、どのサイクルにおいても生じ、かつ産物の指数関数的蓄積を妨害しない。ＲＮＡを、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）法を用いて調製し、そしてＤＮａｓｅで処理して、混入しているゲノムＤＮＡを除去した。ｃＤＮＡを、標準的な技術を使用して合成した。コントロール遺伝子の検出可能なＰＣＲ増幅を有さないサンプルにおいて生じた、逆転写酵素の非存在下でのモックｃＤＮＡ合成は、ゲノムＤＮＡ混入物の効果的な除去を確認する。
（等価物）
当業者は、慣用的実験に過ぎない実験を使用して、本明細書中に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、または確認し得る。このような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されると意図される。
【配列表】
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Claims (13)

  1. 疼痛障害を処置し得る化合物を同定するための方法であって、該化合物が５７７核酸、２０７３９核酸もしくは５７１４５核酸の発現または５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドもしくは５７１４５ポリペプチドの活性を調節する能力をアッセイし、それによって、疼痛障害を処置し得る化合物を同定する工程を包含する、方法。
  2. 疼痛シグナル伝達機構を調節し得る化合物を同定するための方法であって、以下：
    ａ）５７７、２０７３９または５７１４５を発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程；および
    ｂ）該試験化合物が、５７７核酸、２０７３９核酸もしくは５７１４５核酸の発現または５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドまたは５７１４５ポリペプチドの活性を調節する能力をアッセイし、それによって、疼痛シグナル伝達を調節し得る化合物を同定する工程、
    を包含する、方法。
  3. 細胞中の疼痛シグナル伝達を調節するための方法であって、細胞を５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子と接触させ、それによって、該細胞中の疼痛シグナル伝達を調節する工程を包含する、方法。
  4. 前記細胞が、脳細胞、神経細胞、または脊髄もしくは脊髄神経節由来の細胞である、請求項２に記載の方法。
  5. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドまたは５７１４５ポリペプチドの活性を調節し得る、請求項３に記載の方法。
  7. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、５７７核酸、２０７３９核酸または５７１４５核酸の発現を調節し得る、請求項６に記載の方法。
  9. ５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドもしくは５７１４５ポリペプチドの異常な活性または５７７核酸、２０７３９核酸もしくは５７１４５核酸の異常な発現によって特徴付けられる疼痛障害を有する被験体を処置するための方法であって、５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子を該被験体に投与し、それによって、該疼痛障害を有する被験体を処置する工程を包含する、方法。
  10. 前記疼痛障害が、炎症性疼痛、慢性疼痛、神経障害性疼痛、カウザルギー、線維素血症、癌性疼痛、片頭痛／頭痛、および組織疼痛を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、薬学的に受容可能な処方物中で投与される、請求項９に記載の方法。
  12. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、有機低分子、ペプチド、抗体またはアンチセンス核酸分子である、請求項９に記載の方法。
  13. 前記５７７調節因子、２０７３９調節因子または５７１４５調節因子が、５７７ポリペプチド、２０７３９ポリペプチドまたは５７１４５ポリペプチドの活性を調節し得る、請求項９に記載の方法。
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