【０００１】
本発明は、化合物が血液−脳関門を通過する能力を予測するための方法およびそのような方法における使用のための膜組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
治療剤として有効であるためには、中枢作用性医薬は血液−脳関門（ＢＢＢ）を通過しなければならない。逆に、望ましくない中枢神経系（ＣＮＳ）作用を回避するためには、末梢作用性医薬は制限されたＢＢＢ通過能力を示すべきである。いずれの場合にも、医薬候補物のＢＢＢ透過性を知る必要がある。しかし、血液−脳間の分配の実験的測定は困難で、時間を消費し、経費がかかり、そして多集団の化学物質をスクリーニングするには不適当である。医薬候補物のＢＢＢ透過性を予測するのに広く適用することができる方法は、医薬研究および開発において意義深い影響を持つ。発見／開発プロセスの初期の段階で多数の化合物のＢＢＢ透過性に関する信頼性ある予測可能なデータを作製する方法が、差し迫って必要とされている。
【０００３】
それゆえ、潜在的医薬などの試験化合物のＢＢＢ透過能力のインビトロ測定のための確かな、有効な予測方法を提供することが、本発明の目的である。
試験化合物のＢＢＰ透過能力のインビトロ測定に有用な膜組成物を提供することが、本発明の他の目的である。
ＢＢＢ透過性を測定する方法および組成物が、高い予測的評価および高処理能率を提供することが、本発明の態様である。
【０００４】
該方法および組成物が標準的な実験用ロボティクス プラットフォーム(laboratory robotics platforms)に適用可能であることが、本発明の他の態様である。
本発明のこれらおよび他の目的および形態は、以下に記載する詳細な記載により、より明らかとなろう。
【０００５】
本発明の概要
本発明により、化合物または化合物の混合物の血液−脳関門を透過する能力の測定のための方法であって、該化合物または化合物の混合物が、脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた多孔性フィルター膜を通過して受動拡散する速度を測定することを含む方法が提供される。
本発明によりさらに、脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた多孔固体支持体を含む膜組成物がさらに提供される。
【０００６】
本発明の詳細な記載
発見開発プロセスの初期段階で、多数、すなわち１日当たり５００−１，０００個の化合物の血液−脳関門（ＢＢＢ）透過性に関する信頼性ある予測可能データを集めることができる方法により、所望の脳透過特性に関し、医薬候補物の迅速かつ安価な選択および最適化が可能となり、能動、傍細胞、および細胞間プロセスの間の区別に役立て得る。ＢＢＢの透過性を予測する公知の方法には、数学的手段を用いるコンピューターを使用する方法、動物起源の内皮細胞培養物を用いる細胞培養法、固定人工膜カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、臨界ミセル濃度法を用いる表面活性の測定、外部ＨＰＬＣ分析のための生きた動物の脳から組織をサンプリングすることを含む顕微解剖法、死後のヒト脳毛細血管の使用、およびインビボ動物試験が含まれる。これらの公知の方法のいずれも、多数の試験化合物に関する経済的な、信頼性ある、および高度に予測性のあるＢＢＢ透過性データを得るのには、完全には適してはいない。
【０００７】
驚くべきことに、化合物または化合物の混合物の血液−脳関門を透過する能力を、該化合物または化合物の混合物が脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた多孔性フィルター膜を経由して受動拡散する速度を測定することにより、高度な予測性、再現性、信頼性、有効性、かつ経済性で、インビトロで測定し得ることが今回見出された。都合よくは、本発明の方法は、標準的な実験ロボティクス プラットフォームを用いる使用に適している。
【０００８】
明細書および請求の範囲に用いる受動拡散なる用語は、化合物または化合物混合物の個々の分子が半透膜を通過する移動のプロセスであって、ランダムな分子移動によりもたらされ、濃度勾配に関連するプロセスを意味する。修飾語である受動なる用語は、高圧、低圧、重量などの外部の力がないこと、および代謝、トランスポーターの使用などの能動プロセスがないことの両方を意味する。
【０００９】
発明の方法は、サンプルが血液−脳関門を透過する能力を正確に予測するために、非常に少量のサンプル、一般的には０．１ｍｇ未満を使用する、簡単な、高処理量の物理化学的方法である。実際の実施では、バッファー溶液中の化合物または化合物の混合物の公知濃縮物の溶液を、該化合物または化合物混合物を含んでいないバッファー溶液と、脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた多孔性フィルター膜で、各バッファー溶液の表面が染み込ませた膜の反対側に接するようにして分ける。適当な時間経過後、化合物または化合物の混合物の濃度を各バッファー溶液に関して測定し、拡散速度を算定する。
【００１０】
本発明の１つの具体例では、バッファー溶液中公知濃度の試験サンプルの溶液で満たした９６ウェルのプレート（ドナー）を、多孔フィルターメンブレンに脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた９６ウェルのフィルタープレートで覆い、各バッファー溶液の表面がその染み込ませたフィルターメンブレンの反対側に接するように、ウェルを試験サンプルを含んでいないバッファー溶液（アクセプター）で満たす。適当な期間後、ドナープレートおよびアクセプタープレートを分け、各バッファー溶液中のサンプルの濃度を測定し、透過速度を算定する。
【００１１】
本発明の他の具体例では、pION Inc., Woburn, MAにより製造されたＰＳＲ４ｐなどの高処理量の透過装置を用いてよい。この具体例では、パラレル人工膜アッセイ(a parallel artificial membrane assay)(ＰＡＭＰＡ）を、人工膜として脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた多孔フィルター膜を用いて用いる。
【００１２】
発明の方法における使用に適したバッファー溶液は、約ｐＨ６．０−８．０、好ましくは約７．２−７．６、およびより好ましくは約７．４のいずれかの常套のバッファー溶液を含む。
従って、本発明の方法により、当該分野で現在公知の方法よりも、血液−脳関門透過性に関して高い予測能が、より高処理量にて、より安価に、そして生きている動物を屠殺することなく示される。
【００１３】
本発明により、脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を染み込ませた多孔固体支持体を含む膜組成物がさらに提供される。発明の組成物における使用に適した脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物は、約１０％ｗｔ／ｖｏｌ〜３０％ｗｔ／ｖｏｌ、好ましくは約１５％ｗｔ／ｖｏｌ〜２５％ｗｔ／ｖｏｌ、より好ましくは約１９％ｗｔ／ｖｏｌ〜２１％ｗｔ／ｖｏｌの脳極性脂質抽出物ドデカン溶液であってよい。
【００１４】
発明の組成物における使用に適した多孔固体支持体には、９６ウェルのフィルタープレートにおいて用いられるものなどの、あらゆる一般に用いられる多孔性材料、例えば、ポリビニリデンフルオライドまたはその同等物、好ましくはポリビニリデンフルオライドが含まれる。
【００１５】
発明の組成物における使用に適した脳極性脂質抽出物は、文献に見出すことができる、または市場入手可能な、合成または天然いずれかの脳極性脂質抽出物、例えばブタ、ヒツジ、ウシなど、好ましくはブタの脳極性脂質抽出物であってよい。
【００１６】
発明の組成物は、多孔固体支持体に、脳極性脂質抽出物およびドデカンの混合物を、多孔固体支持体の領域当たり少なくとも４μＬ／３８ｍｍ２、好ましくは約４μＬ／３８ｍｍ２の該混合物のレベルで染み込ませることにより調製されてよい。
【００１７】
発明をより明確に理解するために、以下に実施例を示す。これらの実施例は、単なる例示であって、いずれにしても発明の範囲または基礎にある原則を制限するものと理解されるべきではない。実際、本明細書中に示す、および記載するものに加えて、発明の種々の変更が、以下の実施例および以下の記載から当業者には明らかとなろう。そのような変更も、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。
【００１８】
実施例１
公知化合物を用いた、発明の方法の血液−脳関門透過性に関する予測能の比較評価
この評価では、血液−脳関門透過能が公知である(P. Crivari, et al, ジャーナル オブ メディカル ケミストリー(Journal of Medical Chemistry), 2000, 43, 2204-2216)３０個の文献化合物を、５ｍｇ／ｍLの濃度でDMSOにそれぞれ溶解し、各化合物のストック溶液を得る。各ストック溶液の１００μL容積を９６ウェルのプレートの１つのウェルに入れ、ウェルプレートを、pION, Inc., Woburn, MAにより製造されたＰＳＲ４ｐ透過能分析器に入れる。１０μＬ容積のストック溶液を、２．０ｍＬのｐＨ７．４のバッファー溶液を含んでいる深い９６ウェルのプレートに機械的に添加する。生じた混合物を機械的に攪拌して、ドナー溶液を作製する。２００μＬ容積の各ドナー溶液を９６ウェルのプレートの３つのウェルに機械的に加え、ドナープレートを得る。Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, ALにより製造された、１ｍＬのドデカンに溶解した２０ｍｇのブタの極性脳脂質抽出物を含んでいるバイアルをＰＳＲ４ｐ装置のリザーバーに入れる。この脳脂質溶液の４μＬ容積をMillipore Corp, Bedford, MAにより製造された９６ウェルのマイクロタイターフィルターウェルプレートの各ウェルのフィルター表面にのせる（フィルターは、約１０４μｍの厚さの多孔性の（０．４５μｍ）のポリビニリデンフルオライド物質である）。マイクロタイタープレートを次いで１分間オービタルシェイカーにマニュアル通りに置き、ドデカン中のブタの極性脳脂質抽出物の２０％ｗｔ／ｖｏｌ溶液を染み込ませたフィルター膜を有する９６ウェルのマイクロタイタープレートを得る。２００μＬ容積のｐＨ７．４のバッファーをこうして調製したマイクロタイター９６ウェルのフィルタープレートのウェルに機械的に加え、このレセプタープレートをドナープレートの上に置いてサンドウィッチを形成し、室温に１８時間置いた。
【００１９】
Tecan, Hombrechintikon, Switzerlandにより製造されたプレート洗浄器を次いで用いて、ＵＶ透過性の９６ウェルのプレート（ＵＶプレート）を調製する。レセプタープレートをサンドウィチから外し、１５０μＬ容積のレセプター溶液をＵＶプレートに機械的に加え、各レセプターウェルの１９０−５００ｎｍでのＵＶ吸収を記録する。ＵＶプレートを次いでプレート洗浄器に戻し、再び洗浄し、１５０μＬ容積のドナー溶液をＵＶプレートに機械的に加え、各ドナーウェルの１９０−５００ｎｍでのＵＶ吸収を記録する。受動拡散の速度を透過性（Ｐｅ）の線形速度として測定する。ＰｅをpION Inc.からのＰＳＲ４ｐソフトウェアのバージョンＶ１．４を用いて各化合物に関して算定する。２つのスタンダード、べラパミルおよびトレオフィリンを各マイクロタイタープレートのために用いる。ＢＢＢ透過性は、Ｐｅ値＞４×１０−６ｃｍ／秒に関してはＣＮＳ＋として、および＜２×１０−６ｃｍ／秒に関してはＣＮＳ−として指定する。データを平均し、結果を表Ｉに示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
表Ｉのデータにより認めることができるように、発明の方法は、能動輸送プロセスに関与する化合物を含む全３０個の試験化合物の９０％の精度を示す。受動拡散に関与する化合物に関しては、本発明の方法は、１００％の精度を示す。
【００２３】
実施例２
実験化合物を用いた、発明の方法の血液−脳関門透過能に関する予測能の比較評価
実施例１に記載する本質的に同じ方法を用い、および３つの別個のＣＮＳプロジェクトから得た実験化合物に置き換えて、Ｐｅ値を測定し、標準的なラット脳アッセイ法により測定される血液−脳関門透過性またはインビボ試験からの生物学的なエンドポイントと比較する。結果を表ＩＩに示す。
【００２４】
【表３】
【００２５】
【表４】
【００２６】
表ＩＩのデータから認めることができるように、本発明の方法は１００％の精度を示す。[0001]
The present invention relates to methods for predicting the ability of a compound to cross the blood-brain barrier and membrane compositions for use in such methods.
[0002]
In order to be effective as a therapeutic agent, centrally acting drugs must cross the blood-brain barrier (BBB). Conversely, peripherally acting medications should exhibit limited ability to cross the BBB in order to avoid undesirable central nervous system (CNS) effects. In either case, it is necessary to know the BBB permeability of the drug candidate. However, experimental measurement of blood-brain partition is difficult, time consuming, expensive and unsuitable for screening large populations of chemicals. Methods that can be widely applied to predict the BBB permeability of pharmaceutical candidates have significant impact in pharmaceutical research and development. There is an urgent need for methods to generate reliable and predictable data regarding the BBB permeability of a large number of compounds early in the discovery / development process.
[0003]
Therefore, it is an object of the present invention to provide a reliable and effective prediction method for the in vitro measurement of BBB permeability of test compounds such as potential pharmaceuticals.
It is another object of the present invention to provide a membrane composition useful for the in vitro measurement of test compound BBP permeability.
It is an aspect of the present invention that the methods and compositions for measuring BBB permeability provide high predictive evaluation and high throughput.
[0004]
It is another aspect of the present invention that the methods and compositions are applicable to standard laboratory robotics platforms.
These and other objects and aspects of the invention will become more apparent from the detailed description set forth below.
[0005]
SUMMARY OF THE INVENTION According to the present invention, a method for determining the ability of a compound or mixture of compounds to penetrate the blood-brain barrier, wherein the compound or mixture of compounds comprises a brain polar lipid extract and A method is provided that includes measuring the rate of passive diffusion through a porous filter membrane impregnated with a mixture of dodecane.
The present invention further provides a membrane composition comprising a porous solid support impregnated with a mixture of brain polar lipid extract and dodecane.
[0006]
Detailed description of the invention Earlier in the discovery and development process, collect reliable and predictable data on blood-brain barrier (BBB) permeability of a large number, i.e. 500-1,000 compounds per day The possible methods allow for rapid and inexpensive selection and optimization of drug candidates for the desired brain permeation properties and can help distinguish between active, paracellular, and intercellular processes. Known methods for predicting the permeability of the BBB include a method using a computer using mathematical means, a cell culture method using an endothelial cell culture of animal origin, and high performance liquid chromatography (HPLC) using a fixed artificial membrane column. Includes surface activity measurement using critical micelle concentration method, microdissection including sampling tissue from live animal brain for external HPLC analysis, use of postmortem human brain capillaries, and in vivo animal studies It is. None of these known methods are perfectly suitable for obtaining economic, reliable and highly predictable BBB permeability data for a large number of test compounds.
[0007]
Surprisingly, the ability of a compound or mixture of compounds to permeate the blood-brain barrier is passively passed through a porous filter membrane in which the compound or mixture of compounds is impregnated with a mixture of brain polar lipid extract and dodecane. It has now been found that by measuring the rate of diffusion, it can be measured in vitro with a high degree of predictability, reproducibility, reliability, effectiveness and economy. Conveniently, the method of the present invention is suitable for use with standard laboratory robotics platforms.
[0008]
The term passive diffusion as used in the specification and claims is the process of movement of individual molecules of a compound or compound mixture through a semi-permeable membrane, resulting from random molecular movement and related to concentration gradients. Means process. The term passive, which is a modifier, means both the absence of external forces such as high pressure, low pressure, weight, and the absence of active processes such as metabolism, use of transporters.
[0009]
The method of the invention is a simple, high-throughput physicochemistry that uses very small samples, typically less than 0.1 mg, to accurately predict the ability of the sample to penetrate the blood-brain barrier. Method. In actual practice, a solution of a known concentrate of a compound or mixture of compounds in a buffer solution is mixed with a buffer solution impregnated with a buffer solution that does not contain the compound or compound mixture, and a mixture of brain polar lipid extract and dodecane. The filter membrane is separated so that the surface of each buffer solution is in contact with the opposite side of the soaked membrane. After an appropriate time, the concentration of the compound or mixture of compounds is measured for each buffer solution and the diffusion rate is calculated.
[0010]
In one embodiment of the present invention, a 96-well plate (donor) filled with a solution of a known concentration of test sample in a buffer solution is 96-well impregnated with a mixture of brain polar lipid extract and dodecane in a porous filter membrane. The well is filled with a buffer solution (acceptor) that does not contain the test sample so that the surface of each buffer solution is in contact with the opposite side of the soaked filter membrane. After an appropriate period, the donor plate and acceptor plate are separated, the concentration of the sample in each buffer solution is measured, and the permeation rate is calculated.
[0011]
In other embodiments of the invention, high throughput permeation devices such as PSR4p manufactured by pION Inc., Woburn, MA may be used. In this specific example, a parallel artificial membrane assay (PAMPA) is used with a porous filter membrane impregnated with a mixture of brain polar lipid extract and dodecane as the artificial membrane.
[0012]
Buffer solutions suitable for use in the method of the invention include any conventional buffer solution at about pH 6.0-8.0, preferably about 7.2-7.6, and more preferably about 7.4. .
Thus, the method of the present invention has a higher predictive ability for blood-brain barrier permeability than methods currently known in the art, at higher throughput, cheaper, and killing live animals. Not shown.
[0013]
The present invention further provides a membrane composition comprising a porous solid support impregnated with a mixture of brain polar lipid extract and dodecane. A mixture of brain polar lipid extract and dodecane suitable for use in the composition of the invention is about 10% wt / vol to 30% wt / vol, preferably about 15% wt / vol to 25% wt / vol, more preferably May be about 19% wt / vol to 21% wt / vol brain polar lipid extract dodecane solution.
[0014]
Porous solid supports suitable for use in the compositions of the invention include any commonly used porous material such as those used in 96-well filter plates, such as polyvinylidene fluoride or equivalents, preferably poly Vinylidene fluoride is included.
[0015]
Suitable brain polar lipid extracts for use in the compositions of the invention can be found in the literature, or are commercially available, either synthetic or natural brain polar lipid extracts such as pigs, sheep, cows etc. May be a porcine brain polar lipid extract.
[0016]
The composition of the invention, the porous solid support, a mixture of brain polar lipid extract and dodecane, porous solid support area per at least 4 [mu] L / 38mm 2, and soak preferably the level of the mixture of about 4 [mu] L / 38mm 2 May be prepared.
[0017]
In order that the invention may be more clearly understood, the following examples are set forth. These examples are illustrative only and should not be construed as limiting the scope or underlying principles in any way. Indeed, in addition to those shown and described herein, various modifications of the invention will become apparent to those skilled in the art from the following examples and the following description. Such modifications are also intended to fall within the scope of the appended claims.
[0018]
Example 1
Comparative evaluation of the predictive ability of the inventive method for blood-brain barrier permeability using known compounds <br/> In this evaluation, blood-brain barrier permeability is known (P. Crivari, et al, Journal of Medical literature (Journal of Medical Chemistry, 2000, 43, 2204-2216) 30 reference compounds are each dissolved in DMSO at a concentration of 5 mg / mL to obtain a stock solution of each compound. A 100 μL volume of each stock solution is placed in one well of a 96 well plate and the well plate is placed in a PSR4p permeability analyzer manufactured by pION, Inc., Woburn, MA. A 10 μL volume of stock solution is mechanically added to a deep 96-well plate containing 2.0 mL of pH 7.4 buffer solution. The resulting mixture is mechanically stirred to make a donor solution. A 200 μL volume of each donor solution is mechanically added to 3 wells of a 96 well plate to obtain a donor plate. A vial made of Avanti Polar Lipids, Inc. Alabaster, AL containing 20 mg of porcine polar brain lipid extract dissolved in 1 mL of dodecane is placed in the reservoir of the PSR4p device. A 4 μL volume of this brain lipid solution is placed on the filter surface of each well of a 96-well microtiter filter well plate manufactured by Millipore Corp, Bedford, MA (the filter is a porous (0 .45 μm) polyvinylidene fluoride material). The microtiter plate is then placed manually on an orbital shaker for 1 minute to obtain a 96 well microtiter plate with a filter membrane soaked with a 20% wt / vol solution of porcine polar brain lipid extract in dodecane. A 200 μL volume of pH 7.4 buffer was mechanically added to the wells of the microtiter 96 well filter plate thus prepared, and the receptor plate was placed on the donor plate to form a sandwich and placed at room temperature for 18 hours.
[0019]
A UV transmissive 96 well plate (UV plate) is then prepared using a plate washer manufactured by Tecan, Hombrechintikon, Switzerland. The receptor plate is removed from the sandwich and a 150 μL volume of receptor solution is mechanically added to the UV plate and the UV absorption at 190-500 nm of each receptor well is recorded. The UV plate is then returned to the plate washer, washed again, and a 150 μL volume of donor solution is mechanically added to the UV plate and the UV absorption at 190-500 nm of each donor well is recorded. The rate of passive diffusion is measured as the linear rate of permeability (Pe). Pe is calculated for each compound using PSR4p software version V1.4 from pION Inc. Two standards are used for each microtiter plate, verapamil and threophylline. BBB permeability is specified as CNS + for Pe values > 4 × 10 −6 cm / sec and CNS− for < 2 × 10 −6 cm / sec. The data is averaged and the results are shown in Table I.
[0020]
[Table 1]
[0021]
[Table 2]
[0022]
As can be seen by the data in Table I, the inventive method shows 90% accuracy of all 30 test compounds, including compounds involved in the active transport process. For compounds involved in passive diffusion, the method of the present invention shows 100% accuracy.
[0023]
Example 2
Comparative evaluation of predictive ability of the inventive method for blood-brain barrier permeability using experimental compounds Using essentially the same method described in Example 1 and obtained from three separate CNS projects Substituting experimental compounds, Pe values are measured and compared to biological endpoints from blood-brain barrier permeability or in vivo studies as measured by standard rat brain assays. The results are shown in Table II.
[0024]
[Table 3]
[0025]
[Table 4]
[0026]
As can be seen from the data in Table II, the method of the present invention shows 100% accuracy.
