JP2005290008A - 実質的に純粋なゾヌリン（ｚｏｎｕｌｉｎ）、哺乳動物密着結合の生理学的な調節因子 - Google Patents

Abstract

【課題】哺乳動物密着結合の生理学的な調節因子である、実質的に純粋な哺乳動物タンパク質、ゾヌリン、ならびにこれを使用するための方法を提供する。
【解決手段】閉鎖帯毒素に免疫学的におよび機能的に関連し、かつ哺乳動物密着結合の生理学的な調節因子として機能する、哺乳動物タンパク質を同定し、精製し、そして特徴付けし、この哺乳動物タンパク質を哺乳動物密着結合を横切る治療剤の送達のエンハンサーとしてか、治療剤の腸送達のエンハンサーとしてか、治療剤の鼻送達エンハンサーとしてか、または血液脳関門を横切る治療剤の送達のためのエンハンサーとして使用する。
【選択図】なし

Description

本発明の開発は、Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ大学によって支援されている。本明細書中に記載される発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ １−ＲＯ１−ＤＫ ４８３７３−０１Ａ２）からの資金供給によって支持された。政府は、一定の権利を有する。

（発明の分野）
本発明は、哺乳動物密着結合の生理学的な調節因子である、実質的に純粋な哺乳動物タンパク質、本明細書中以後「ゾヌリン」、ならびにこれを使用するための方法に関する。

（発明の背景）
Ｉ．腸密着結合の機能および調節
ｔｊまたは閉鎖帯（本明細書中以後、「ＺＯ」）は、吸収性または分泌性の上皮の顕著な特徴の１つである（Ｍａｄａｒａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８３：１０８９−１０９４（１９８９）；およびＭａｄａｒａ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｌｅｂｅｎｔｈａｌら編、第１１章、１２５−１３８頁（１９９０））。先端区画と基底外側区画との間の関門として、上皮は、傍細胞経路を介するイオンおよび水溶性溶質の受動拡散を選択的に調節する。（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２５３（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２２）：Ｃ７４９−Ｃ７５８（１９８７））。この関門は、経細胞経路と関連する経路の活性によって発生した任意の勾配を維持する（Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ、２０：１０−１８（１９７７））。

経上皮伝導性の変化は、通常、腸細胞原形質膜の抵抗性が、比較的高いので（Ｍａｄａｒａ、前出）、傍細胞経路の透過性の変化に貢献し得る。ＺＯは、この特定の経路において主要な関門を示し、および上皮細胞組織の電気抵抗性は、フリーズフラクチャー電子顕微鏡によって観察されるように、ＺＯ中の膜貫通タンパク質鎖の数、およびそれらの複雑さに依存するようである（Ｍａｄａｒａら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０１：２１２４−２１３３（１９８５））。

ＺＯは、かつて静的な構造として認識されたが、実際は動的であり、および多様な発生的環境（Ｍａｇｎｕｓｏｎら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、６７：２１４−２２４（１９７８）；Ｒｅｖｅｌら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ．、４０：４４３−４５５（１９７６）；およびＳｃｈｎｅｅｂｅｒｇｅｒら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．、３２：３０７−３２４（１９７８））、生理学的環境（Ｇｉｌｕｌａら、Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．、５０：１４２−１６８（１９７６）；Ｍａｄａｒａら、Ｊ． Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．、１００：１４９−１６４（１９８７）；Ｍａｚａｒｉｅｇｏｓら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９８：１８６５−１８７７（１９８４）；およびＳａｒｄｅｔら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、８０：９６−１１７（１９７９））、ならびに病理的環境（Ｍｉｌｋｓら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０３：２７２９−２７３８（１９８６）；Ｎａｓｈら、Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．、５９：５３１−５３７（１９８８）；およびＳｈａｓｂｙら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２５５（Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２４）：Ｃ７８１−Ｃ７８８（１９８８））に容易に適合され得るという豊富な証拠がある。この適合の基礎にある調節機構は、未だ完全には理解されていない。しかし、Ｃａ^２＋の存在下で、ＺＯのアセンブリは、ＺＯエレメントの組織化されたネットワークの形成および調節を最終的に導く生化学的事象の複雑なカスケードを誘発する細胞性相互作用の結果であることが明らかであり、その組成が、わずかに部分的に特徴付けられた（Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ、２０：１０−１８（１９７７））。膜貫通タンパク質鎖、閉鎖についての候補は、最近、同定された（Ｆｕｒｕｓｅら、Ｊ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ．、８７：１４１−１５０（１９８５））。

６つのタンパク質が、膜接触の基礎を成す細胞質の亜膜斑において同定された（Ｄｉａｍｏｎｄ、前出）が、ＺＯ−１およびＺＯ−２は、特徴付けられていない１３０ｋＤタンパク質（ＺＯ−３）との界面活性剤安定性の複合体において、ヘテロ二量体として存在する（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８：３４６０−３４６４（１９９１））。大部分の免疫電子顕微鏡の研究によって、ＺＯ−１が、膜接触の真下に正確に局在化された（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８３：１２９−１４５（１９８８））。２つの他のタンパク質のシンギュリン（ｃｉｎｇｕｌｉｎ）（Ｃｉｔｉら、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３３：２７２−２７５（１９８８）および７Ｈ６抗原（Ｚｈｏｎｇら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２０：４７７−４８３（１９９３））は、膜からさらに遠位に局在化され、そして未だクローン化されていない。Ｒａｂ１３、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質はまた、最近、接合領域に局在化された（Ｚａｈａｒａｏｕｉら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２４：１０１−１１５（１９９４））。他の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、皮質細胞骨格を調節することが公知であり、すなわち、ｒｈｏは、病巣接着におけるアクチン−膜付着を調節し（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、７０：３８９−３９９（１９９２））、およびｒａｃは、増殖因子誘導性の膜波状化を調節する（Ｒｉｄｌｅｙら、Ｃｅｌｌ、７０：４０１−４１０（１９９２））。より良好に特徴付けられた細胞接合、病巣接触（Ｇｕａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５８：６９０−６９２（１９９２））、および密着結合（Ｔｓｕｋｉｔａら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２３：１０４９−１０５３（１９９３））における、斑タンパク質の公知の機能との類似性に基づいて、ｔｊ関連性の斑タンパク質は、細胞膜を横切る両方向にシグナルを伝達することにおいて、および皮質のアクチン細胞骨格への連結を調節することにおいて、関与するという仮説がたてられた。

上皮が受ける多くの多様な生理学的および病理学的攻撃に接するために、ＺＯは、複雑な調節系の存在を必要とする迅速なおよび共同して応答を行い得なければならない。ＺＯのアセンブリおよび調節に関与する機構の正確な特徴づけは、現在の盛んに調査が行われている分野の１つである。

現在、ｔｊの構造的および機能的結合が、アクチン細胞骨格と、吸収細胞のｔｊ複合体との間に存在するという一連の証拠がある（Ｇｕｍｂｉｎｅｒら、前出；Ｍａｄａｒａら、前出；およびＤｒｅｎｃｈａｈｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０７：１０３７−１０４８（１９８８））。アクチン細胞骨格は、微少線維の複雑化された網から構成され、その正確な幾何学は、大きなアクチン結合タンパク質の構造によって調節される。アクチン結合タンパク質のリン酸化の状態が、細胞骨格の細胞原形質膜への連結をどのように調節し得るのかの例は、ミリストイル化されたアラニン豊富なＣキナーゼ基質（本明細書中以後「ＭＡＲＣＫＳ」）である。ＭＡＲＣＫＳは、原形質膜の細胞質表面と会合する特異的なプロテインキナーゼＣ（本明細書中以後「ＰＫＣ」）基質である（Ａｄｅｒｅｍ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ． Ｐｕｂ． （ＵＫ）、４３８−４４３頁（１９９２））。そのリン酸化されていない形態において、ＭＡＲＣＫＳは、膜アクチンと架橋する。従って、ＭＡＲＣＫＳを介して膜と会合するアクチン網目構造は、比較的、堅いようである。（Ｈａｒｔｗｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：６１８−６２２（１９２２））。活性化されたＰＫＣは、ＭＡＲＣＫＳをリン酸化し、これは、膜から放出される（Ｒｏｓｅｎら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７２：１２１１−１２１５（１９９０）；およびＴｈｅｌｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５１：３２０−３２２（１９９１））。ＭＡＲＣＫＳに連結されたアクチンは、膜から空間的に分離され、そしてより可塑性であるようである。ＭＡＲＫＳが、脱リン酸化される場合、これは膜にもどり、アクチンを再度架橋する（Ｈａｒｔｗｉｇら、前出；およびＴｈｅｌｅｎら、前出）。これらのデータは、Ｆ−アクチン網が、アクチン結合タンパク質（ＭＡＲＣＫＳは、それらのうちの１つである）の関与するＰＫＣ依存性のリン酸化プロセスによって再配置され得ることを示唆する。

多様な細胞内媒介因子が、ｔｊ機能および／または構造を変化することが示された。両生類の胆嚢の（Ｄｕｆｆｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２０４：４５１−４５２（１９８１））、ならびにキンギョ（Ｂａｋｋｅｒら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２４６：Ｇ２１３−Ｇ２１７（１９８４））およびヒラメ（Ｋｒａｓｎｅｙら、Ｆｅｄ． Ｐｒｏｃ．、４２：１１００（１９８３））の両方の腸の、密着結合は、細胞内ｃＡＭＰが上昇されるにつれて、受動的なイオン流動に対する増強された耐性を示す。また、両生類の胆嚢のＣａ^２＋イオノフォアへの曝露は、ｔｊ耐性を増強するようであり、およびｔｊ構造の変化を誘導するようである（Ｐａｌａｎｔら、Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２４５：Ｃ２０３−Ｃ２１２（１９８３））。さらに、ホルボールエステルによるＰＣＫの活性化は、傍細胞性の透過性を、腎臓（Ｅｌｌｉｓら、Ｃ． Ａｍ． Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６３（Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３２）：Ｆ２９３−Ｆ３３０（１９９２））、および腸（Ｓｔｅｎｓｏｎら、Ｃ． Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６５（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２８）：Ｇ９５５−Ｇ９６２（１９９３））の両方の上皮細胞株において、増加した。

ＩＩ．閉鎖帯毒素
コレラ毒素（ＣＴ）をコードするｃｔｘＡ遺伝子を欠失することによって構築される、大部分のＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅワクチン候補は、高い抗体応答を誘発することが可能であるが、２分の１を超えるワクチンはなお、軽度の下痢を発症する（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、５６（１）：１６１−１６７（１９８８））。ＣＴの不在下で誘導される下痢の程度を考慮して、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、ｃｔｘＡ配列の欠失された系統においてなお存在する、他の腸内毒素原性因子を生成することが仮説された。結果として、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって生成される、そして残余の下痢に寄与する第２の毒素の閉鎖帯毒素（本明細書中以後「ＺＯＴ」）が、発見された（Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８：５２４２−５２４６（１９９１））。ｚｏｔ遺伝子は、ｃｔｘ遺伝子のすぐ近傍に位置される。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株間でのｚｏｔ遺伝子とｃｔｘ遺伝子との高いパーセントの同時発生（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂ．、３１／３：７３２−７３３（１９９３）；およびＫａｒａｓａｗａら、ＦＥＢＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１０６：１４３−１４６（１９９３））は、コレラに代表的な急性の脱水性の下痢の原因におけるＺＯＴの潜在的な相乗作用的な役割を示唆する。近年、ｚｏｔ遺伝子はまた、他の腸病原体において同定された（Ｔｓｃｈａｐｅ、第２回 Ａｓｉａｎ−Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｙｐｈｏｉｄ ｆｅｖｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｓａｌｏｍｅｌｌｏｓｉｓ ４７（要訳）（１９９４））。

ウサギ回腸粘膜に対して試験される場合、ＺＯＴは、細胞間ｔｊの構造を調節することによって、腸透過性を増加することが、以前に見出された（Ｆａｓａｎｏら、前出）。傍細胞経路の改変の結果として、腸粘膜が、より透過性になることが見出された。ＺＯＴは、Ｎａ^＋−グルコース結合化活性輸送に影響せず、細胞傷害性でなく、および経上皮耐性を完全には破壊し得ないことがまた、見出された（Ｆａｓａｎｏら、前出）。

より最近に、ＺＯＴは、腸粘膜において可逆的にｔｊを開き得ることが見出され、従って、ＺＯＴは、治療学的薬剤とともに同時投与される場合、腸薬物送達のための経口投薬組成物において用いられる場合、治療薬剤の腸送達を達成し得る（ＷＯ ９６／３７１９６；１９９５年５月２４日に出願された米国特許出願第０８／４４３，８６４号；および１９９６年２月９日に出願された米国特許出願第０８／５９８，８５２号；およびＦａｓａｎｏら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、９９：１１５８−１１６４（１９９７）；これらのそれぞれは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。ＺＯＴは、鼻粘膜においてｔｊを可逆的に開き得ることがまた見出され、従って、ＺＯＴは、治療学的薬剤とともに同時投与される場合、治療学的薬剤の鼻吸収を増強し得る（１９９７年１月９日に出願された、米国特許出願第０８／７８１，０５７号；これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）。

１９９７年２月２０日に出願された米国特許出願第０８／８０３，３６４号（これは、その全体が、本明細書中に参考として援用される）において、ＺＯＴレセプターが、腸細胞株から同定および精製されている。ＺＯＴレセプターは、腸および鼻の透過性の調節に関与する傍細胞経路の第１の工程を示す。

ＩＩＩ．血液脳関門
血液脳関門（ＢＢＢ）は、溶質の自由な拡散に非常に耐性であり、そして血液と脳とを分離する極度に薄い膜の関門である。分子の次元において、この膜を介する薬物または溶質の移動は、化合物が、ＢＢＢ膜内に包埋されるいくつかの特殊化された酵素様輸送機構のうちの１つに接近しない限り、本質的にない。ＢＢＢは、上皮細胞の単層からではなく、複数の細胞から構成される。ＢＢＢを構成する４つの異なるタイプの細胞（内皮細胞、周皮細胞（ｐｅｒｙｃｉｔｅ）、星状細胞、ニューロン）のうちの、毛細管の上皮細胞成分は、ＢＢＢの透過性についての制限因子を示す。脊椎動物脳および脊髄における毛細管内皮は、周辺組織における微少血管の内皮関門に通常存在する内皮間孔を閉鎖する、ｔｊを有する。最終的に、内皮ｔｊは、ＢＢＢの制限された透過性を担う。

これまで、ＢＢＢを介して化合物を効率的に送達するために利用可能な効率的な系は、それらが以下のカテゴリーのうちの１つに属しない限り、存在しなかった：
（１）６００ダルトン未満の分子量を有する脂溶性薬物（例えば、プロゲステロン、アルドステロン、もしくはコルチゾール）；
（２）原形質タンパク質に結合する薬物（例えば、プロパノールオール（ｐｒｏｐａｎｏｌｏｌ）、ブピバカイン、イミプラミン、ジアゼパム、もしくシクロスポリン）；
（３）ＢＢＢの内腔膜および抗内腔膜の両方において包埋される特別なキャリア媒介性の輸送系に結合する栄養素（例えば、グルコース、グルタミン、もしくはフェニルアラニン）；または
（４）ＢＢＢを介するペプチドの経細胞輸送を媒介する特異的なレセプターに結合する、ペプチド（例えば、インシュリンおよびトランスフェリン）。

本発明において、ＺＯＴに免疫学的におよび機能的に関連し、ならびに哺乳動物密着結合の生理学的な調節因子として機能する哺乳動物タンパク質が、同定され、そして精製された。これらの哺乳動物タンパク質は、「ゾヌリン」と言及され、腸粘膜および鼻粘膜のｔｊを介する、ならびにＢＢＢのｔｊを介する治療学的薬剤の増強された吸収のために有用である。

（発明の要旨）
項目１．実質的に純粋なゾヌリンであって、そのゾヌリンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、これは、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、ならびに哺乳動物密着結合を可逆的に開き得る、実質的に純粋なゾヌリン。
項目２．項目１に記載の実質的に純粋なゾヌリンであって、そのゾヌリンは、以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を有する、実質的に純粋なゾヌリン。
項目３．治療剤の送達のための薬学的組成物であって、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリンであって、ここで、そのゾヌリンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、そして哺乳動物密着結合を可逆的に開き得る、薬学的組成物。
項目４．項目３に記載の薬学的組成物であって、上記ゾヌリンは、以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を有する、薬学的組成物。
項目５．項目３に記載の薬学的組成物であって、上記治療剤は、薬物化合物、生物学的に活性なペプチド、およびワクチンからなる群より選択される、薬学的組成物。
項目６．項目５に記載の薬学的組成物であって、上記薬物化合物は、心血管系に対して作用する薬物、中枢神経系に対して作用する薬物、抗新生物薬物、および抗生物質からなる群より選択される、薬学的組成物。
項目７．項目６に記載の薬学的組成物であって、上記心血管系に対して作用する薬物は、リドカイン、アデノシン、ドブタミン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびフェントラミンからなる群より選択される、薬学的組成物。
項目８．項目６に記載の薬学的組成物であって、上記中枢神経系に対して作用する薬物は、ドキサプラム、アルフェンタニル、デゾシン（ｄｅｚｏｃｉｎ）、ナルブフェン、ブプレノルフィン、ナロキソン、ケトロラク、ミダゾラム、プロポフォール、メタクリン（ｍｅｔａｃｕｒｉｎｅ）、ミバクリウム、およびスクシニルコリンからなる群より選択される、薬学的組成物。
項目９．項目６に記載の薬学的組成物であって、上記抗新生物薬物は、シタラビン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群より選択される、薬学的組成物。
項目１０．項目６に記載の薬学的組成物であって、上記抗生物質は、メチシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セトキシチン（ｃｅｔｏｘｉｔｉｎ）、セフォニシド、セフメタゾール、およびアズトレナムからなる群より選択される、薬学的組成物。
項目１１．項目５に記載の薬学的組成物であって、上記生物学的に活性なペプチドは、ホルモン、リンホカイン、グロブリン、およびアルブミンからなる群より選択される、薬学的組成物。
項目１２．項目１１に記載の薬学的組成物であって、上記ホルモンは、テストステロン、ナンドロレン（ｎａｎｄｒｏｌｅｎｅ）、メノトロピン、プロゲステロン、インスリン、および尿性卵胞性刺激ホルモン（ｕｒｏｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ）からなる群より選択される、薬学的組成物。
項目１３．項目１１に記載の薬学的組成物であって、上記リンホカインは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、およびインターロイキン−８からなる群より選択される、薬学的組成物。
項目１４．項目１１に記載の薬学的組成物であって、上記グロブリンは、多価ＩｇＧ、および特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭからなる群より選択される免疫グロブリンである、薬学的組成物。
項目１５．項目３に記載の薬学的組成物であって、治療剤対ゾヌリンの比が、約１：１０〜３：１の範囲にある、薬学的組成物。
項目１６．項目１５に記載の薬学的組成物であって、治療剤対ゾヌリンの比が、約１：５〜２：１の範囲にある、薬学的組成物。
項目１７．項目３に記載の薬学的組成物であって、ゾヌリンが、約４０ｎｇ〜１０００ｎｇの量で該組成物中に存在する、薬学的組成物。
項目１８．項目１７に記載の薬学的組成物であって、ゾヌリンが、約４００ｎｇ〜８００ｎｇの量で該組成物中に存在する、薬学的組成物。
項目１９．項目３に記載の薬学的組成物であって、その組成物が、上記治療剤の腸送達のための経口投薬組成物である、薬学的組成物。
項目２０．項目３に記載の薬学的組成物であって、その組成物が、上記治療剤の鼻送達のための鼻投薬組成物である、薬学的組成物。
項目２１．項目３に記載の薬学的組成物であって、その組成物が、血液脳関門を通過して送達するための静脈内投薬組成物である、薬学的組成物。
項目２２．治療剤の送達のための方法であって、その方法は、その治療剤を必要とする被験体に薬学的組成物を投与する工程を包含し、その薬学的組成物は、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリンであって、ここで、そのゾヌリンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、そして哺乳動物密着結合を可逆的に開き得る、薬学的組成物である、方法。
項目２３．項目２２に記載の方法であって、上記ゾヌリンは、以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を有する、方法。
項目２４．項目２２に記載の方法であって、上記治療剤は、薬物化合物、生物学的に活性なペプチド、およびワクチンからなる群より選択される、方法。
項目２５．項目２４に記載の方法であって、上記薬物化合物は、心血管系に対して作用する薬物、中枢神経系に対して作用する薬物、抗新生物薬物、および抗生物質からなる群より選択される、方法。
項目２６．項目２５に記載の方法であって、上記心血管系に対して作用する薬物は、リドカイン、アデノシン、ドブタミン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびフェントラミンからなる群より選択される、方法。
項目２７．項目２５に記載の方法であって、上記中枢神経系に対して作用する薬物は、ドキサプラム、アルフェンタニル、デゾシン、ナルブフェン、ブプレノルフィン、ナロキソン、ケトロラク、ミダゾラム、プロポフォール、メタクリン、ミバクリウム、およびスクシニルコリンからなる群より選択される、方法。
項目２８．項目２５に記載の方法であって、上記抗新生物薬物は、シタラビン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンからなる群より選択される、方法。
項目２９．項目２５に記載の方法であって、上記抗生物質は、メチシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セトキシチン（ｃｅｔｏｘｉｔｉｎ）、セフォニシド、セフメタゾール、およびアズトレナムからなる群より選択される、方法。
項目３０．項目２４に記載の方法であって、上記生物学的に活性なペプチドは、ホルモン、リンホカイン、グロブリン、およびアルブミンからなる群より選択される、方法。
項目３１．項目３０に記載の方法であって、上記ホルモンは、テストステロン、ナンドロレン、メノトロピン、プロゲステロン、インスリン、および尿性卵胞性刺激ホルモンからなる群より選択される、方法。
項目３２．項目３０に記載の方法であって、上記リンホカインは、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、およびインターロイキン−８からなる群より選択される、方法。
項目３３．項目３０に記載の方法であって、上記グロブリンは、多価ＩｇＧ、および特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭからなる群より選択される免疫グロブリンである、方法。
項目３４．項目２２に記載の方法であって、治療剤対ゾヌリンの比が、約１：１０〜３：１の範囲にある、方法。
項目３５．項目３４に記載の方法であって、治療剤対ゾヌリンの比が、約１：５〜２：１の範囲にある、方法。
項目３６．項目２２に記載の方法であって、上記ゾヌリンが、約４０ｎｇ〜１０００ｎｇの量で上記組成物中に存在する、方法。
項目３７．項目３６に記載の方法であって、上記ゾヌリンが、約４００ｎｇ〜８００ｎｇの量で該組成物中に存在する、方法。
項目３８．項目２２に記載の方法であって、上記ゾヌリンが、最終濃度が約１０^−５Ｍ〜１０^−１４Ｍの範囲であるような量で投与される、方法。
項目３９．項目３８に記載の方法であって、上記ゾヌリンが、最終濃度が約１０^−６Ｍ〜５．０×１０^−８Ｍの範囲であるような量で投与される、方法。
項目４０．項目２２に記載の方法であって、上記組成物が、上記治療剤の腸送達のための経口投薬組成物であり、上記投与する工程が、経口投与による、方法。
項目４１．項目２２に記載の方法であって、上記組成物が、上記治療剤の鼻送達のための鼻投薬組成物であり、上記投与する工程が、鼻投与による、方法。
項目４２．項目２２に記載の方法であって、上記組成物が、血液脳関門を通過して上記治療剤を送達するための静脈内投薬組成物であり、上記投与する工程が、静脈内投与による、方法。

本発明の目的は、ＺＯＴに免疫学的におよび機能的に関連し、ならびに哺乳動物密着結合の生理学的な調節因子として機能する、哺乳動物タンパク質を同定することである。

本発明の別の目的は、この哺乳動物タンパク質を精製および特徴付けすることである。

本発明のさらに別の目的は、哺乳動物密着結合を横切る治療剤の送達のエンハンサーとして、この哺乳動物タンパク質を使用することである。

本発明のなお別の目的は、治療剤の腸送達のエンハンサーとして、この哺乳動物タンパク質を使用することである。

本発明のさらなる目的は、治療剤の鼻送達エンハンサーとして、この哺乳動物タンパク質を使用することである。

本発明のさらに別の目的は、血液脳関門を横切る治療剤の送達のためのエンハンサーとして、この哺乳動物タンパク質を使用することである。

本発明のさらなる目的は、治療剤の送達のために有効な薬学的組成物を提供することである。

本発明のこれらのおよび他の目的は、本明細書中以後に提供される発明の詳細な説明から明らかであり、１つの実施態様において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有する実質的に純粋なゾヌリンによって満たされており、これは、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、ならびに哺乳動物密着結合を可逆的に開き得る。

好ましい実施態様において、本発明の上記の目的は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、そして以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または
以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を有する、実質的に純粋なゾヌリンによって満たされている。

別の実施態様において、本発明の上記の目的は、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリンであって、ここで、このゾヌリンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、ならびに哺乳動物密着結合を可逆的に開き得、そして好ましくは、以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または
以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を含有する、治療剤の送達のための薬学的組成物によって満たされる。

さらに別の実施態様において、本発明の上記の局面は、治療剤の送達のための方法であって、その必要性がある患者に、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリンであって、ここで、このゾヌリンは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、ならびに哺乳動物密着結合を可逆的に開き、そして好ましくは、以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または
以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を含有する薬学的組成物を投与する工程を包含する方法によって満たされる。

（発明の詳細な説明）
上述で考察されるように、１つの実施態様において、本発明の上記の目的は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、ならびに哺乳動物密着結合を可逆的に開き得、そして、そして好ましくは、以下：

からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列、または
以下：

からなる群より選択される内部アミノ酸配列を有する、実質的に純粋なゾヌリンによって満たされる。

ゾヌリンは、種々の哺乳動物細胞および組識（例えば、ウサギまたはヒトの細胞／組織）によって生成されるか、またはこれらにおいて見出される。ゾヌリンが由来する特定の哺乳動物の細胞／組織型は、本発明に重要ではない。このような哺乳動物の組織型の例としては、心臓、肺、腸、肝臓、脳、腎臓、脾臓、および膵臓が挙げられる。

ゾヌリンは、以下の実施例３において記載されるように、例えば、抗ＺＯＴ抗体を使用するアフィニティー精製クロマトグラフィーによって、獲得および精製され得る。

本明細書中で使用されるように、「ゾヌリンの生物学的活性」とは、細胞間ｔｊの構造を調節することによって、透過性を可逆的に増加する能力を意味する。

従って、別の実施態様において、本発明の上記の目的は、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリン、
を含有する、治療剤の送達のための薬学的組成物によって満たされている。

薬学的組成物は、好ましくは、腸送達のための経口投薬組成物、鼻送達のための鼻投薬組成物、または血液脳関門を通過して送達するための静脈内投薬組成物である。

治療剤の腸送達のための経口投薬組成物は、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）腸吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリン、
を含有する。

小腸送達（例えば、小腸送達）のための経口投薬組成物は、当該分野において周知である。このような経口投薬組成物は、一般に、胃耐性の錠剤またはカプセルを含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、第８９章（１９８０）；Ｄｉｇｅｎｉｓら、Ｊ． Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８３：９１５−９２１（１９９４）；Ｖａｎｔｉｎｉら、Ｃｌｉｎｉｃａ Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃａ、１４５：４４５−４５１（１９９３）；Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、４０：１９０２−１９０５（１９９２）；Ｔｈｏｍａら、Ｐｈａｒｍａｚｉｅ、４６：３３１−３３６（１９９１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、７：３０９−３１９（１９９１）；およびＬｉｎら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．、８：９１９−９２４（１９９１）；これらのそれぞれは、本明細書中に、その全体が参考として援用される。）
錠剤は、例えば、セルロースアセテートフタレートまたはセルロースアセテートテレフタレートのいずれかの添加によって、胃耐性に作製される。

カプセルは、治療剤が硬性または軟性のいずれかの可溶性の容器またはゼラチンの剤皮中に含まれる、固形投薬形態である。カプセルの製造において使用されるゼラチンは、加水分解によってコラーゲン材料から得られる。２つのタイプのゼラチンがある。タイプＡは、酸プロセシングによってブタ皮膚から得られ、およびタイプＢは、アルカリプロセシングによって骨および動物皮膚から得られる。硬性ゼラチンカプセルの使用は、個々の被験体について最も良好であると考えられる正確な投薬レベルで、単一の治療剤またはその組合わせを処方する際における選択を許容する。硬性ゼラチンカプセルは、一方を他方にはめ込む２つの部分からなり、従って、治療剤を完全に囲む。これらのカプセルは、治療剤、または治療剤を含有する胃耐性ビーズを、カプセルのより長い側に導入し、次いで、キャップをはめ込むことによって、充填される。硬性ゼラチンカプセルは、主にゼラチン、ＦＤ＆Ｃ着色料、およびときどき、不透明化剤（例えば、チタニウムジオキシド）から作製される。ＵＳＰは、ゼラチンが、この目的のために、製造の間の分解を防ぐために、０．１５％（ｗ／ｖ）二酸化硫黄を含むことを許容する。

本発明の情況において、小腸送達のための経口投薬組成物はまた、治療剤およびゾヌリンが、胃中の胃液によって実質的に不活性化されることを防ぎ、それによって治療剤およびゾヌリンを活性な形態において小腸に到達することを可能にする、水性緩衝化剤を含有する、液体組成物を含む。本発明において用いられ得るこのような水性緩衝化剤の例としては、重炭酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．７、好ましくは、約ｐＨ７．４）が挙げられる。

経口投薬組成物が、液体組成物である場合、安定性の問題を最小にするように、組成物は投与の直前に調製されることが好ましい。この場合において、液体組成物は、水性の緩衝化剤中に、凍結乾燥された治療剤およびゾヌリンを溶解することによって調製され得る。

治療剤の鼻送達のための鼻投薬組成物は、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）鼻吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリン、
を含有する。

鼻送達のための鼻投薬組成物は、当該分野において周知である。このような鼻送達投薬組成物は、一般に、薬学的投薬形態を調製するために広範に使用されてきた水溶性のポリマー（Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第３版、５９２−６３８頁（１９８３））を含み、これは、鼻投与のためのペプチドについてのキャリアとして作用し得る（Ｄａｖｉｓ、Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｒｕｇｓ、１２５：１−２１（１９８６））。ポリマーマトリクス中に包埋されるペプチドの鼻吸収は、鼻粘膜繊毛のクリアランスの遅延を介して増強されることが示されている（Ｉｌｌｕｍら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．、４６：２６１−２６５（１９８８））。他の潜在的な増強機構としては、ペプチド吸収についての増加される濃度勾配または減少される分散経路が挙げられる（Ｔｉｎｇら、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．、９：１３３０−１３３５（１９９２））。しかし、粘膜繊毛クリアランス速度の減少は、鼻から投与された全身性薬物の再現可能な生物学的利用能の達成に対する良好なアプローチであることが予測されている（Ｇｏｎｄａら、Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ．、７：６９−７５（１９９０））。約５０μｍの直径を有する微粒子は、鼻腔中に沈着することが期待されるが（Ｂｊｏｒｋら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．、６２：１８７−１９２（１９９０）；およびＩｌｌｕｍら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ．、３９：１８９−１９９（１９８７））、１０μｍ以下の直径を有する微粒子は、鼻の濾過系を逃れ、より下位の気道に沈着され得る。２００μｍよりも大きな直径の微粒子は、鼻投与後に鼻中に保持されない（Ｌｅｗｉｓら、Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ． Ｂｉｏａｃｔ． Ｍａｔｅｒ．， １７：２８０−２９０（１９９０））。

用いられる特定の水溶性ポリマーは、本発明に重要ではなく、そして鼻投薬形態について用いられる任意の周知の水溶性ポリマーから選択され得る。鼻送達のために有用な水溶性ポリマーの代表的な例は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）である。この物質は、その物理学的特性が、分子量、加水分解の程度、架橋密度、および結晶化度に依存する膨張可能な（ｓｗｅｌｌａｂｌｅ）親水性ポリマーである（Ｐｅｐｐａｓら、Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ、３：１０９−１３１（１９８７））。ＰＶＡは、相分離、噴霧−乾燥化、噴霧−包埋化、および噴霧−高密化（ｄｅｎｓａｔｉｏｎ）を介する、分散された物質のコート化において使用され得る（Ｔｉｎｇら、前出）。

血液脳関門を通過する、治療剤の送達のための静脈内投薬組成物は、以下：
（Ａ）治療剤；および
（Ｂ）血液脳関門吸収を増強する、有効量の精製されたゾヌリン、
を含有する。

脳への送達のための静脈内投薬組成物は、当該分野において周知である。このような静脈内投薬組成物は、一般に、生理学的希釈剤（例えば、滅菌水、または０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）を含む。

「鼻」送達組成物と、「腸」送達組成物とは、後者が、胃における活性な薬剤（例えば、ゾヌリンおよび治療剤）の酸分解を防ぐための胃耐性特性を有さなくてはならないのに対し、前者が、粘膜繊毛クリアランスを減少するために、および鼻から投与された薬剤の再現可能な生物学的利用能を達成するために、一般に、約５０μｍの直径を有する水溶性のポリマーを含む点で異なる。「静脈内」送達組成物は、「静脈内」送達組成物中に胃耐性または水溶性のポリマーを必要としない点で、「鼻」および「腸」送達組成物の両方とは異なる。

なお別の実施態様において、本発明の上記の目的は、治療剤の送達のための方法であって、その必要性がある被験体に、上記薬学的組成物を投与する工程を包含する方法によって満たされている。

投与の様式は、本発明に重要ではない。しかし、投与の様式は、腸送達組成物について、経口；鼻送達組成物について、鼻内；および血液脳関門を通過する送達について、静脈内であることが好ましい。

用いられる特定の治療剤は、本発明に重要ではなく、例えば、任意の薬物化合物、生物学的に活性なペプチド、ワクチン、またはそうでなければ、大きさまたは電荷にもかかわらず、経細胞経路を介して吸収されない任意の他の部分であり得る。

本発明において用いられ得る薬物化合物の例としては、心血管系に対して作用する薬物、中枢神経系に対して作用する薬物、抗新生物薬物、および抗生物質が挙げられる。

本発明において用いられ得る心血管系に対して作用する薬物の例としては、リドカイン、アデノシン、ドブタミン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリン、およびフェントラミンが挙げられる。

本発明において用いられ得る中枢神経系に対して作用する薬物の例としては、ドキサプラム、アルフェンタニル、デゾシン（ｄｅｚｏｃｉｎ）、ナルブフェン、ブプレノルフィン、ナロキソン、ケトロラク、ミダゾラム、プロポフォール、メタクリン（ｍｅｔａｃｕｒｉｎｅ）、ミバクリウム、およびスクシニルコリンが挙げられる。

本発明において用いられ得る抗新生物薬物の例としては、シタラビン、マイトマイシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびビンブラスチンが挙げられる。

本発明において用いられ得る抗生物質の例としては、メチシリン、メズロシリン、ピペラシリン、セトキシチン（ｃｅｔｏｘｉｔｉｎ）、セフォニシド、セフメタゾール、およびアズトレナムが挙げられる。

本発明において用いられ得る生物学的に活性なペプチドの例としては、ホルモン、リンホカイン、グロブリン、およびアルブミンが挙げられる。

本発明において用いられ得るホルモンの例としては、テストステロン、ナンドロレン（ｎａｎｄｒｏｌｅｎｅ）、メノトロピン、プロゲステロン、インスリン、および尿性卵胞性刺激ホルモン（ｕｒｏｆｏｌｌｔｒｏｐｉｎ）が挙げられる。

本発明において用いられ得るリンホカインの例としては、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、およびインターロイキン−８が挙げられる。

本発明において用いられ得るグロブリンの例としては、α−グロブリン、β−グロブリン、およびγ−グロブリン（免疫グロブリン）が挙げられる。

本発明において用いられ得る免疫グロブリンの例としては、多価ＩｇＧ、または特異的ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭ（例えば、抗破傷風抗体）が挙げられる。

本発明において用いられ得るアルブミンの例としては、ヒト血清アルブミンおよびオボアルブミンが挙げられる。

本発明において用いられ得るワクチンの例としては、ペプチド抗原、および弱毒化された微生物およびウイルスが挙げられる。

本発明において用いられ得るペプチド抗原の例としては、腸毒素性Ｅ．ｃｏｌｉの非耐熱性腸毒素のＢサブユニット、コレラ毒素のＢサブユニット、腸内病原体の莢膜抗原、腸内病原体の線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）または線毛（ｐｉｌｉ）、ＨＩＶ表面抗原、塵埃アレルゲンおよびダニアレルゲンが挙げられる。

本発明において用いられ得る弱毒化された微生物およびウイルスの例としては、腸毒素性のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、腸病原性のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ およびロタウイルスといった微生物およびウイルスが挙げられる（Ｆａｓａｎｏら、Ｌｅ Ｖａｃｃｉｎａｚｉｏｎｉ ｉｎ Ｐｅｄｉａｔｒｉａ、Ｖｉｅｒｕｃｃｉら編、ＣＳＨ、Ｍｉｌａｎ、１０９−１２１頁（１９９１）；Ｇｕａｎｄａｌｉｎｉら、Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ Ｉｎｆａｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ、Ｅｌｓｅｖｉｏｒ編、Ｂｕｔｚら、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、第２５章（１９９３）；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｓｅｍ． Ｐｅｄ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、５：２４３−２５０（１９９４）；Ｋａｐｅｒら、Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、８：４８−８６（１９９５）；およびＭａｃＡｒｔｈｕｒら、ＪＡＭＡ、２７３：７２９−７３４（１９９５）、これらのそれぞれは本明細書中にその全体が参考として援用される）。

治療剤がインスリンである場合、本発明の薬学的組成物は、糖尿病の処置のために有用である。

用いられる治療剤の量は、本発明に重要ではなく、そして選択される特定の薬剤、処置される疾患または状態、ならびに処置される被験体の年齢、体重および性別に依存して変化する。

用いられるゾヌリンの量はまた、本発明に重要ではなく、そして処置される被験体の年齢、体重、および性別に依存して変化する。一般的に、治療剤の吸収を増強するために本発明において用いられるゾヌリンの最終濃度は、約１０^−５Ｍ〜１０^−１４Ｍ、好ましくは約１０^−６Ｍ〜５．０×１０^−８Ｍの範囲にある。例えば、腸、鼻、または血液においてこのような最終濃度を達成するために、本発明の単一の薬学的組成物におけるゾヌリンの量は、一般的に、約４０ｎｇ〜１０００ｎｇ、好ましくは約４００ｎｇ〜８００ｎｇである。

用いられる治療剤対ゾヌリンの比は、本発明に重要ではなく、そして選択される期間内に送達されるべき治療剤の量に依存して変化する。一般的に、本発明において用いられる治療剤対ゾヌリンの重量比は、約１：１０〜３：１、好ましくは約１：５〜２：１の範囲にある。

ゾヌリンはまた、当該分野において周知の技術（Ａｂｒａｍｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１：１０７−１１９（１９８６））を使用して、ゾヌリンについての結合特異性を有する、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかの抗体を得るための免疫原として使用され得る。これらの抗体は、次いで、体組織もしくは体液中のゾヌリンについてアッセイするために、またはゾヌリンのアフィニティー精製において使用され得る。

以下の実施例は、例示の目的のためのみに提供され、本発明の範囲を制限することを決して意図しない。

（実施例１）
（ＺＯＴの精製）
プラスミドｐＺ１４で形質転換された、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅＣＶＤ１１０株（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、Ｇ１：４４６２−４４６８（１９９３））を培養した後に得られた、５０００ｍｌの上清画分を、１０ｋＤａのＭＷカットオフを有する層流（ｌａｍｉｎａ ｆｌｏｗ）フィルターを使用して、１０００倍に濃縮した。Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ ｚｏｔ遺伝子を含むｐＺ１４の構築は、とりわけ、ＷＯ９６／３７１９６において詳細に記載される。次いで、得られた上清を、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質バンドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色によって検出した。プラスミドｐＴＴＱ１８１（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で形質転換され、そして同じ様式において処置されたＣＶＤ１１０株からのコントロール上清と比較した場合、ＺＯＴに対応するタンパク質バンドは検出できなかった。従って、ｚｏｔ遺伝子がｐＺ１４において高度に誘導性のおよび強力なｔａｃプロモーターの後ろに配置された場合であっても、１０００倍に濃縮されたｐＺ１４の上清におけるタンパク質レベルは、なお、クマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって検出可能ではなかった。

従って、生成されるＺＯＴの量を増加するために、ｚｏｔ遺伝子を、マルトース結合タンパク質（本明細書中以後、「ＭＢＰ」）遺伝子と、インフレームで融合して、ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質を作製した。

ＭＢＰベクターｐＭＡＬ−ｃ２（Ｂｉｏｌａｂ）を使用して、ｚｏｔ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉのｍａｌＥ遺伝子に融合することによって、ＺＯＴを発現、そして精製した。この構築物は、強力な、誘導性のｔａｃプロモーター、およびｍａｌＥ翻訳開始シグナルを使用し、クローン化されたｚｏｔ遺伝子の高レベルの発現を生じる。ベクターｐＭＡＬ−ｃ２は、融合タンパク質の細胞質発現を導くｍａｌＥシグナル配列の正確な欠失を有する。ＭＢＰについてのアフィニティークロマトグラフィー精製を使用して、融合タンパク質の単離を容易にした（Ｂｉｏｌａｂ）。

より詳細には、ベクターｐＭＡＬ−ｃ２を、ＥｃｏＲＩ（これは、ｍａｌＥ遺伝子の３’末端で切断する）で線状化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで充填し、そしてＸｂａＩ（これは、ｐＭＡＬ−ｃ２ポリリンカーにおける単一の部位を有する）で消化した。ＺＯＴをコードするｏｒｆを、プラスミドｐＢＢ２４１（Ｂａｕｄｒｙら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、６０：４２８−４３４（１９９２））からサブクローン化した。プラスミドｐＢＢ２４１を、ＢｓｓＨＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで充填し、そしてＸｂａＩで消化した。次いで、平滑−ＸｂａＩフラグメントを、ｐＭＡＬ−ｃ２にサブクローン化して、プラスミドｐＬＣ１０−ｃを与えた。インサートおよびベクターの両方が平滑末端および付着末端を有したので、正確な配向が、インサートの５’末端で融合されたｍａｌＥの３’末端を伴って得られた。次いで、ｐＬＣ１０−ｃをＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α株にエレクトロポレーションした。ｐＢＢ２４１において、ＢｓｓＨＩＩ制限部位は、ｚｏｔ ｏｒｆ内にある。従って、ＺＯＴのアミノ酸１〜８は、ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質において欠損している。

ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質を精製するために、０．２％（ｗ／ｖ）グルコースおよび１００μｌ／ｍｌアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスを、ｐＬＣ−１０−ｃを含む単一のコロニーとともに接種し、そして振とうしながら、３７℃で一晩、インキュベートした。培養物を、新鮮な１．０ｍｌの同じ培地中に１：１００に希釈し、そして、約１．０×１０^８細胞／ｍｌまで、振とうしながら、３７℃で増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、ＭＢＰ−ＺＰＴ発現を誘導し、そして培養物を、さらに３時間、３７℃でインキュベートした。次いで細菌を、ペレット化し、そして２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２−ＭＥ、１．０ｍＭ ＮａＮ_３を含有する２０ｍｌの氷冷「カラム緩衝液」中に再懸濁した。細菌懸濁液を、フレンチプレス（ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓ）処理によって溶解し、そして３０分間、１３，０００×ｇで、４℃にて、スピンした。上清を回収し、カラム緩衝液で１：５に希釈し、そしてカラム緩衝液で予め平衡化したアミロース樹脂の１×１０カラム（Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＢＰ−融合体精製系）にロードした。５容量のカラム緩衝液でカラムを洗浄した後、ＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質を、１０ｍｌのカラム緩衝液中の１０ｍＭマルトースをロードすることによって溶出した。１．０ｍｌの培養物からの典型的な収量は、２〜３ｍｇタンパク質であった。

次いで、精製したＭＢＰ−ＺＯＴ融合タンパク質のＭＢＰ融合パートナーを、２０μｇのＭＢＰ−ＺＯＴ当たり１．０μｇの第Ｘａ因子プロテアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、切断した。第Ｘａ因子プロテアーゼは、ＺＯＴのアミノ末端の直前を切断する。そのように得られたＺＯＴタンパク質を、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、そして電気分離チャンバー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を使用して、ゲルから電気溶出した。

Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて試験した場合、得られる精製されたＺＯＴは、Ｒｔの用量依存性の減少を誘導し、７．５×１０^−８ＭのＥＤ_５０であった。

（実施例２）
（アフィニティー精製された抗ＺＯＴ抗体の生成）
特異的な抗血清を得るために、キメラグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＺＯＴタンパク質を発現し、そして精製した。

より詳細には、オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＢＢ２４１（Ｂａｕｄｒｙら、前出）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってｚｏｔ ｏｒｆを増幅した。正方向プライマー（ＴＣＡＴＣＡＣＧＧＣ ＧＣＧＣＣＡＧＧ、配列番号５）は、ｚｏｔ ｏｒｆのヌクレオチド１５〜３２に対応し、および逆方向プライマー（ＧＧＡＧＧＴＣＴＡＧ ＡＡＴＣＴＧＣＣＣＧ ＡＴ、配列番号６）は、ｃｔｘＡ ｏｒｆの５’末端に対応した。従って、ＺＯＴのアミノ酸１〜５は、得られる融合タンパク質において欠損している。増幅産物を、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）におけるＧＳＴ遺伝子の末端に位置するポリリンカー（ＳｍａＩ部位）に挿入した。ｐＧＥＸ−２Ｔは、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍのＧＳＴとの融合タンパク質として、クローン化された遺伝子を発現する、融合タンパク質発現ベクターである。融合遺伝子は、ｔａｃプロモーターの制御下にある。ＩＰＴＧでの誘導の際、抑制解除が生じ、そしてＧＳＴ融合タンパク質は、発現される。

得られた組換えプラスミド（ｐＬＣ１１と命名する）を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αにエレクトロポレーションした。ＧＳＴ−ＺＯＴ融合タンパク質を精製するために、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉブロスを、ｐＬＣ１１を含有する単一のコロニーとともに接種し、そして振とうしながら、３７℃で、一晩、インキュベートした。培養物を、１．０ｍｌの同じ新鮮な培地中に１：１００に希釈し、そして約１．０×１０^８細胞／ｍｌに、振とうしながら、３７℃で増殖させた。次いで、０．２ｍＭ ＩＰＴＧを添加して、ＧＳＴ−ＺＯＴの発現を誘導し、そして培養物を、さらに３時間、３７℃でインキュベートした。次いで細菌をペレット化し、２０ｍｌの氷冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、そしてフレンチプレス法によって溶解した。ＧＳＴ−ＺＯＴ融合タンパク質は、細菌ペレット画分とともに沈降したので、これらの条件下で可溶性ではなかった。従って、ペレットを、０．００６２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ６．８）、０．２Ｍ ２−ＭＥ、２．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．０２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するＬａｅｍｌｉ溶解緩衝液中に再懸濁し、そして８．０％（ｗ／ｖ）ＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルにおける電気泳動に供し、そしてクマシーブリリアントブルーで染色した。融合タンパク質に対応する約７０ｋＤａのバンド（２６ｋＤａのＧＳＴ＋４４ｋＤＡのＺＯＴ）を、電気分離チャンバー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）を使用して、ゲルから電気溶出した。

得られる溶出されたタンパク質（１０〜２０μｇ）のうちの１０μｇを、等容量のＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントとともに混合し、ウサギに注射した。４および８週間後、２回の追加免疫用量を、Ｆｒｅｕｎｄ不完全アジュバントとともに投与した。１ヶ月後、ウサギを採血した。

特異的な抗体の生成を決定するために、１０^−１０ＭのＺＯＴを、２つの融合タンパク質ＭＢＰ−ＺＯＴおよびＧＳＴ−ＺＯＴとともに、ナイロンメンブレン上にトランスファーし、そして、１：５０００希釈のウサギ抗血清とともに、一晩、４℃で、中程度に振とうしながら、インキュベートした。次いで、フィルターを０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ（本明細書中以後「ＰＢＳ−Ｔ」）で、１５分間、４回、洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：３０，０００希釈）とともに室温にて２時間インキュベートした。フィルターを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳで、１５分間、４回、再度洗浄し、そして免疫反応性のバンドを、増強された化学発光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出した。

イムノブロットの際、ウサギ抗血清は、ＺＯＴ、ならびにＭＢＰ−ＺＯＴおよびＧＳＴ−ＺＯＴ融合タンパク質を認識するが、ＭＢＰネガティブコントロールは認識しないことが見出された。

さらに、適切な抗ＺＯＴ抗体の生成を確認するために、中和実験を、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて行った。３７℃で、６０分間、ｐＺ１４上清とともに予めインキュベートされる場合、ＺＯＴ特異的抗血清（１：１００希釈）は、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにのせられたウサギ回腸において、ＺＯＴによって誘導されるＲｔの減少を、完全に中和し得た。

次に、抗ＺＯＴ抗体を、ＭＢＴ−ＺＯＴアフィニティーカラムを使用して、アフィニティー精製した。より詳細には、ＭＢＰ−ＺＯＴアフィニティーカラムを、上述の実施例１に記載されるようにして得られた、１．０ｍｇの精製されたＭＢＰ−ＺＯＴを、一晩、室温で、予め活性化されたゲル（Ａｍｉｎｏｌｉｎｋ、Ｐｉｅｒｃｅ）に固定することによって調製した。カラムを、ＰＢＳで洗浄し、次いで、２．０ｍｌの抗ＺＯＴウサギ抗血清を用いてロードした。室温での、９０分間のインキュベーション後、カラムを、１４ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして特異的な抗ＺＯＴ抗体を、５０ｍＭグリシン（ｐＨ２．５）、１５０ｍｌ ＮａＣｌ、および０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｒｏｎ Ｘ−１００を含有する４．０ｍｌの溶液を用いて、カラムから溶出した。１．０ｍｌの溶出された画分のｐＨを、すぐに１．０Ｎ ＮａＯＨで中和した。

（実施例３）
（ゾヌリンの精製）
ＺＯＴは、特異的な上皮表面レセプターと相互作用し、ｔｊ透過性を調節する事象の複雑な細胞間カスケードのその後の活性化を伴った、１９９７年２月２０日に出願された米国特許出願第０８／８０３，３６４号における観察に基づいて、本発明において、ＺＯＴは、哺乳動物ｔｊの生理学的な調節因子の効果を模倣し得ることを想定した。本発明において、ＺＯＴおよびその生理学的なアナログ（ゾヌリン）は、機能的におよび免疫学的に関連することを想定した。それゆえ、アフィニティー精製した抗ＺＯＴ抗体およびＵｓｓｉｎｇチャンバーアッセイを、組合わせて、種々のウサギおよびヒトの組織におけるゾヌリンを探索するために使用した。

Ａ．ウサギ組織
最初に、ゾヌリンを、ウサギ腸から精製した。組織を、ＰＢＳ中でのホモジナイズによって破壊した。次いで、得られる細胞調製物を、４０，０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離し、そして上清を回収し、そして凍結乾燥した。得られる凍結乾燥された産物を、続いて、ＰＢＳ中で再構成し（１０：１（ｖ／ｖ））、０．４５ｍｍメンブレンフィルターを通して濾過し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０クロマトグラフィーカラム上にロードし、ＰＢＳで溶出した。次いで、カラムから得られた２．０ｍｌ画分を、上述の実施例２において記載されるように得られたアフィニティー精製された抗ＺＯＴ抗体を使用する、標準的なウェスタンイムノブロッティングに供した。

ポジティブな画分（すなわち、抗ＺＯＴ抗体が結合する画分）を合わせ、凍結乾燥し、ＰＢＳ中で再構成し（（１：１（ｖ／ｖ））、そしてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通して塩勾配クロマトグラフィーに供した。塩勾配は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中の０〜１００％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌであった。５つの２０ｍｌ画分を回収し、そして上述の実施例２において記載されるように得られたアフィニティー精製された抗ＺＯＴ抗体を使用する標準的なウエスタンイムノブロッティングに供した。画分１（２０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）は、ウェスタンイムノブロットアッセイにおいてポジティブであることが見出された唯一の画分であった。

次いで、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られた画分を、ＵｓｓｉｎｇチャンバーにおけるＣａＣｏ２単層、およびウサギ小腸の両方に対する、それらの組織耐性効果について試験した。

より具体的には、ＣａＣｏ２細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、４０μｇ／ｌペニシリン、および９０μｇ／ｌストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中で、３７℃にて、９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２の加湿化雰囲気下で、細胞培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で増殖した。細胞を、それらが７０〜８０％コンフルエンスに達した場合、５日毎に、トリプシン処理後に１：５の表面比率で、継代培養した。この研究において使用した細胞の継代数は、１５と３０との間で変化した。

ＣａＣｏ２単層を、ポリスチレン環（直径６．４ｍｍ、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ Ｃｏｓｔａｒ）に堅固に付着された組織培養処理されたポリカーボネートフィルター上でコンフルエンス（１：２．５表面比率で播種した後１２〜１４日）になるまで増殖した。フィルターを、改変されたＵｓｓｉｎｇチャンバーの漿膜区画と粘膜区画とを分離するぴったりとフィットするインサート中に置き、そして実験を、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおけるウサギ腸について、Ｆａｓａｎｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８：５２４２−５２４６（１９９１）によって記載されるように行った。結果を図１において示す。

図１において示されるように、ゾヌリンを含有する画分は、ゾヌリンネガティブな画分に比較して、ＣａＣｏ２単層の耐性の有意な減少を誘導した。

次いで、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーアッセイを、頸部脱臼によって屠殺した、２〜３ｋｇの成体雄性ニュージーランドホワイトウサギからの回腸を使用して行った。回腸の２０ｃｍセグメントを取り出し、腸内容物のないようにリンスし、腸間膜境界に沿って切開し、そして筋肉および漿膜層を剥いだ。次いで、そのように調製された８枚の粘膜をルーサイトＵｓｓｉｎｇチャンバー（１．１２ｃｍ^２開口部）において装備し、電位固定装置（ＥＶＣ ４０００ ＷＰＩ、Ｓａｒａｔｏｓａ、ＦＬ）に連結し、そして５３ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＫＣｌ、３０．５ｍＭ マンニトール、１．６９ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．３ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を含有する、新鮮に調製したＲｉｎｇｅｒ溶液で水浴した。水浴溶液を、定温循環ポンプに連結しおよび９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２でガスを供給した、ウォーター・ジャケット貯蔵器で、３７℃にて維持した
ウサギ腸から精製されたゾヌリンの１００μｌを、粘膜側に添加した。電位差（ＰＤ）を、１０分毎に測定し、そして短絡電流（Ｉｓｃ）および組織耐性（Ｒｔ）を、Ｆａｓａｎｏら、前出に記載されるように算定した。組織の多様性のために、データは、△Ｒｔ（ｘ時間でのＲｔ）−（０時間でのＲｔ）として算定した。結果は、図２において示す。

図２において示されるように、ゾヌリンを含有する画分は、ゾヌリンネガティブな画分に比較して、ウサギ小腸耐性の有意な減少を誘導した。この効果は、いったんゾヌリンが貯蔵器から回収されると、完全に可逆性であった。

ゾヌリンポジティブな画分をまた、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで抗ＺＯＴ抗体を使用するウェスタンイムノブロッティングに供した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質バンドを、１００ｍｌの（３−［シクロヘキシルアミノ］−１プロパンスルホン酸）１０×、１００ｍｌのメタノール、８００ｍｌの蒸留水を含有するＣＡＰＳ緩衝液を使用して、ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にトランスファーした。ウェスタンイムノブロッティングによって検出された単一のバンドに並んだタンパク質は、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有した。このバンドを、ＰＶＤＦフィルターから切り出し、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｍｏｄｅｌ ４９４を使用して、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｈｉｂｌｅｙ編、第１１〜１２章、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、３１５〜３３４頁（１９８５）によって記載されるように、Ｎ末端配列決定に供した。ウサギ腸から精製されたゾヌリンのＮ末端配列を、配列番号１において示す。

ウサギゾヌリンのＮ末端配列を、ＢＬＡＳＴサーチ解析によって、他のタンパク質配列と比較した。この解析の結果は、ウサギゾヌリンのＮ末端配列は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓからのｔａｕタンパク質のＮ末端配列に、８５％同一であり、そして１００％類似であることを示した。

結果として、ウサギゾヌリンおよびｔａｕが、同じ部分であるのか否かを決定するために、交差中和化実験を、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて行った。より具体的には、１０μｌ／ｍｌのウサギゾヌリンを、未処理の、または抗ｔａｕ抗体（１：１０希釈）（Ｓｉｇｍａ）とともに３７℃にて６０分間、予めインキュベートしたいずれかのウサギ回腸の粘膜側に添加した。抗ＺＯＴ抗体（１：１０希釈）（実施例２）とともに予めインキュベートした１０μｌ／ｍｌのウサギゾヌリン；および０．４μｇ／ｍｌの精製したｔａｕ（Ｓｉｇｍａ）の両方を、コントロールとして使用した。結果を、図３において示す。

図３において示されるように、ウサギゾヌリンは、組織耐性の代表的な減少を誘導し、これは、いったんタンパク質がＵｓｓｉｎｇチャンバーから回収されると、容易に可逆的であった。この活性は、抗ＺＯＴ抗体での前処理によって完全に中和化されたが、抗ｔａｕ抗体での前処理によって中和化されなかった。他方、ｔａｕタンパク質に曝露された組織において、組織耐性に対する有意な効果は何もなかった。

ウサギゾヌリンはまた、種々の他のウサギ組織（すなわち、ウサギの心臓、脳、筋肉、胃、脾臓、肺、腎臓）ならびにウサギ腸の種々の部分（すなわち、遠位の空腸、近位の空腸、回腸、盲腸、および結腸）において検出された。すなわち、これらのウサギ組織を、上述で考察したウサギ腸と同じ様式において処理し、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで上述の実施例２において記載されるように得られたアフィニティー精製された抗ＺＯＴ抗体を使用するウエスタンイムノブロッティングに供した場合、約４７ｋＤａのサイズの単一のバンドが、試験した組織の全てにおいて検出された。

Ｂ．ヒト組織
ゾヌリンをまた、腸、心臓、および脳を含むいくつかのヒト組織から精製した。胎児および成人組織の両方を使用した。組織を、ＰＢＳ中でのホモジネートによって破壊した。次いで、得られる細胞調製物を、４０，０００ｒｐｍで、３０分間、遠心分離し、上清を回収し、そして凍結乾燥した。続いて、得られた凍結乾燥産物を、ＰＢＳ中に再構成し（１０：１（ｖ／ｖ））、０．４５ｍｍメンブレンフィルターを通して濾過し、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０クロマトグラフィーカラム上にロードし、そしてＰＢＳで溶出した。次いで、カラムから得られた２．０ｍｌ画分を、上述の実施例２において記載されるように得られた、アフィニティー精製された抗ＺＯＴ抗体を使用する、標準的なウェスタンイムノブロッティングに供した。

ポジティブな画分（すなわち、抗ＺＯＴ抗体が結合する画分）を合わせ、凍結乾燥し、ＰＢＳ中で再構成し（１：１（ｖ／ｖ））、そしてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを通して塩勾配クロマトグラフィーに供した。塩勾配は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）中の０〜１００％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌであった。５つの２０ｍｌ画分を回収し、そして上述の実施例２において記載されるように得られたアフィニティー精製された抗ＺＯＴ抗体を使用する標準的なウエスタンイムノブロッティングに供した。画分１（２０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）は、ウェスタンイムノブロットアッセイにおいて４７ｋＤａのサイズの単一のバンドを示した。画分２（４０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）は、ウェスタンイムノブロットアッセイにおいて３５ｋＤａおよび１５ｋＤａのサイズの２つのさらなるバンドを示した。画分３（６０％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）および画分４（８０％（ｗ／ｖ））は、３５ｋＤａおよび１５ｋＤａのサイズのバンドのみを示した。これらの結果は、ゾヌリンは、使用したヒト組織におそらく存在するプロテアーゼによる分解に供され得ること、および分解された産物は、ホロタンパク質に比較してより高い塩濃度でカラムから溶出されること、を示唆する。

次いで、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムから得られた画分１（ヒトの心臓および脳の組織の両方から）および画分４（心臓組織から）を、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいてウサギ腸およびアカゲザル腸の両方に対する、それらの組織耐性効果について試験した。

Ｕｓｓｉｎｇチャンバーアッセイを、腸の異なる管（２〜３ｋｇの成体雄性ニュージーランド白ウサギ、または５〜６ｋｇの成体雄性アカゲザルのいずれかからの空腸、回腸、または結腸を含む）を使用して行った。動物を屠殺した後、腸の異なるセグメント（空腸、回腸、および結腸を含む）を取り出し、腸内容物のないようにリンスし、腸間膜境界に沿って切開し、そして筋肉および漿膜層を剥いだ。次いで、そのように調製された８枚の粘膜（３つの空腸、３つの回腸、および２つの結腸）を、ルーサイトＵｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備し（１．１２ｃｍ^２開口部）、電位固定装置（ＥＶＣ ４０００ ＷＰＩ、Ｓａｒａｔｏｓａ、ＦＬ）に連結し、そして５３ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＫＣｌ、３０．５ｍＭ マンニトール、１．６９ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．３ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を含有する、新鮮に調製したＲｉｎｇｅｒ溶液で水浴した。水浴溶液を、定温循環ポンプに連結しそして９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２でガスを供給した、ウォーター・ジャケット貯蔵器で、３７℃にて維持した。

ヒト心臓から精製されたゾヌリンの画分１もしくはヒト脳から精製されたゾヌリンの画分１、またはヒト心臓から精製された画分４の、１００μｌを、粘膜側に添加した。電位差（ＰＤ）を、１０分毎に測定し、そして短絡電流（Ｉｓｃ）および組織抵抗（Ｒｔ）を、Ｆａｓａｎｏら、前出によって記載されるように算定した。組織の多様性のために、データは、△Ｒｔ（ｘ時間でのＲｔ）−（０時間でのＲｔ）として算定した。結果は、図４Ａおよび図４Ｂ（サル腸）、ならびに図５Ａおよび５Ｂ（ウサギ腸）において示す。

図４Ａおよび４Ｂにおいて示されるように、ヒト心臓から精製されたゾヌリン（画分１）は、ＰＢＳネガティブコントロールと比較されるように、サル腸管耐性（空腸（図４Ａ）および回腸（図４Ｂ）の両方）の有意な減少を誘導した。ヒト心臓から精製されたゾヌリンを結腸において試験した場合、有意な変化は何も観察されなかった。図４Ａおよび４Ｂもまた、ヒト脳から精製されたゾヌリン（画分１）を試験した場合、サル空腸（図４Ａ）およびサル回腸（図４Ｂ）の両方に対する有意な効果は何も観察されなかったことを示す。ヒト心臓から精製されたゾヌリンの画分４もまた、サル小腸組織耐性の有意な減少を誘導した。

図５Ａおよび５Ｂにおいて示されるように、類似の結果が、ウサギ腸を使用した場合に得られた。すなわち、ヒト心臓から精製されたゾヌリン（画分１）は、ウサギ空腸（図５Ａ）およびウサギ回腸（図５Ｂ）の両方において、組織耐性に対する有意な効果を示したが、結腸においては示さなかった。図５Ａおよび５Ｂはまた、ヒト脳から精製されたゾヌリン（画分１）を試験した場合、ウサギ空腸（図５Ａ）およびウサギ回腸（図５Ｂ）の両方に対する有意な効果は何も観察されなかったことを示す。

ゾヌリンによってインスリンの経口送達が増加されるか否かを確立するために、ウサギ腸を使用するインビトロモデル実験を行った。簡潔には、成体雄性ニュージーランドホワイトウサギ（２〜３ｋｇ）を、頸部脱臼によって屠殺した。ウサギ小腸のセグメント（空腸または回腸のいずれか）を取り出し、腸内容物を皆無にするようにリンスし、腸間膜の境界に沿って切開し、そして筋肉および漿膜層を剥いだ。次いで、そのように調製された８つの粘膜のシートをルーサイトＵｓｓｉｎｇチャンバーにマウントし（１．１２ｃｍ^２開口部）、電位固定装置（ＥＶＣ ４０００ ＷＰＩ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）に連結し、そして５３ｍＭ ＮａＣｌ、５．０ｍＭ ＫＣｌ、３０．５ｍＭ マンニトール、１．６９ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．３ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１．２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および２５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３を含有する、新鮮に調製した緩衝溶液で水浴した。水浴溶液を、定温循環ポンプに連結し、そしておよび９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２でガスが供給される、ウォータージャケットリザーバーにより、３７℃で維持した。電位差（ＰＤ）を測定し、そして短絡電流（Ｉｓｃ）および組織耐性（Ｒｔ）を算定した。いったん組織が定常状態に達したら、対の組織（それらの耐性に基づいて適合している）を、単独で、または画分１からの１００μｌの心臓ゾヌリンの存在下で、１０^−１１Ｍ ^１２５Ｉ−インスリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ；２．０μＣｉ＝１０^−１２Ｍ）に発光的に曝露した。漿膜側由来の１．０ｍｌのアリコートおよび粘膜側由来の５０μｌのアリコートをすぐに得て、ベースライン値を確立した。次いで、次の１００分間、漿膜側からのサンプルを２０分間隔で回収した。

心臓ゾヌリンは、時間依存性の様式で、インスリンの腸吸収を、空腸において（０．０５８±０．００３ｆｍｏｌ／ｃｍ^２．分 対 ０．１２±０．００５ｆｍｏｌ／ｃｍ^２．分、未処置の組織 対 ゾヌリン処置組織（それぞれ、ｐ＝０．００１））、および回腸において（０．００６±０．０００２ｆｍｏｌ／ｃｍ^２．分 対 ０．０１８±０．００５ｆｍｏｌ／ｃｍ^２．分、未処置の組織 対 ゾヌリン処置した組織、それぞれ、ｐ＝０．０５）の両方で増加したことが見出された。

ヒト心臓から精製されたゾヌリンの画分１およびヒト脳から精製されたゾヌリンの画分１もまた、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで上述の実施例２において記載されるようにして得られた抗ＺＯＴ抗体を使用するウエスタンイムノブロッティングに供した。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質バンドを、１００ｍｌの（３−［シクロヘキシルアミノ］−１プロパンスルホン酸）１０×、１００ｍｌのメタノール、８００ｍｌの蒸留水を含有するＣＡＰＳ緩衝液を使用して、ＰＶＤＦフィルター上に転写した。ウェスタンイムノブロッティングによって検出された単一のバンドに整列したタンパク質は、約４７ｋＤａの見かけの分子量を有した。このバンドを、ＰＤＶＦフィルターから切り出し、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｍｏｄｅｌ ４９４を使用して、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ、Ｓｈｉｂｌｅｙ編、第１１〜１２章、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、３１５〜３３４頁（１９８５）によって記載されるように、Ｎ末端配列決定に供した。成人ヒト心臓から精製されたゾヌリンのＮ末端配列を、配列番号２に示し、そして成人ヒト脳から精製されたゾヌリンのＮ末端配列を、配列番号３に示す。

成人ヒト腸から精製されたゾヌリンのＮ末端配列由来の最初の９アミノ酸（配列番号７）もまた配列決定し、そして配列番号２において示されるヒト心臓から精製されたゾヌリンの最初の９アミノ酸に同一であることが見出された（図６を参照のこと）。ヒト胎児腸から精製されたゾヌリンのＮ末端配列由来の最初の２０アミノ酸もまた配列決定し：Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ（配列番号４）、そして配列番号２において示されるヒト心臓から精製されたゾヌリンのアミノ酸配列とほとんど同一であることが見出された（図６を参照のこと）。

成人ヒト脳から精製されたゾヌリンのＮ末端配列（配列番号３）は、心臓および腸の両方から精製されたゾヌリンのＮ末端（配列番号２）とは完全に異なった（図６参照のこと）。この差異は、上述で実証されるように、組織（例えば、腸）の透過性の決定におけるゾヌリンの組織特異性を説明すると考えられる。

心臓、腸、および脳から精製されたヒトゾヌリンのＮ末端配列は全て、ウサギ腸から精製されたゾヌリンのＮ末端配列と異なる（図６）。これらのタンパク質が、ｔａｕ関連ファミリーのタンパク質の異なるイソ形態を示すか否かを確立するために、ウサギおよびヒトの両方からの組織を、８．０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで抗ＺＯＴ抗体または抗ｔａｕ抗体のいずれかを使用するウエスタンイムノブロッティングに供した。抗ＺＯＴ抗体によって認識されることが見出されたウサギおよびヒトの組織（脳、腸、および心臓を含む）の両方から精製された４７ｋＤａのゾヌリンのバンドはまた、抗ｔａｕ抗体と交差反応することが見出された。塩クロマトグラフィーによって得られたヒト脳から精製されたゾヌリンの異なる画分をまた、抗ＺＯＴ抗体または抗ｔａｕ抗体のいずれかを使用するウェスタンイムノブロッティングに供した。抗ＺＯＴ抗体が、インタクトな４７ｋＤａタンパク質と３５ｋＤａおよび１５ｋＤａの両方の分解されたフラグメントを認識する一方で、抗ｔａｕ抗体は、インタクトな４７ｋＤａタンパク質および３５ｋＤａフラグメントのみを認識し、一方、抗ｔａｕ抗体は、１５ｋＤａフラグメントを認識しなかった。３５ｋＤａフラグメントがゾヌリンのＮ末端またはＣ末端を含むか否かを立証するために、３５ｋＤａバンドのＮ末端配列を得、そして：Ｘａａ Ｘａａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｌｅｕ（配列番号８）であることが見出された。この配列は、インタクトなヒト脳ゾヌリンのＮ末端配列（配列番号３）とは異なる。これらの結果は、１５ｋＤａフラグメントが、ゾヌリンのＮ末端部分を示す一方で、３５ｋＤａフラグメントが、ゾヌリンのＣ末端部分を示すことを示唆する。

合わせると、これらの結果は、抗ｔａｕ抗体によって認識されるゾヌリンドメインは、タンパク質のＣ末端の方であり、ヒトまたはウサギの組織のいずれかからのゾヌリンの異なるイソ形態に共通であり（一方で、Ｎ末端部分は変化し得る）、そして、おそらく、タンパク質の透過効果に関与する（ｔａｕが、その後の細胞骨格の再配置を伴ってβチューブリンに結合するという観察、およびサル小腸組織耐性に対する画分４の効果に基づく）ことを示唆する。

心臓および腸の両方から精製されたヒトゾヌリンのＮ末端配列を、ＢＬＡＳＴサーチ解析によって、他のタンパク質配列と比較した。この解析の結果は、ヒトゾヌリンのＮ末端配列が、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来のＩｇＭの重可変鎖のＮ末端配列に、９５％同一であることを示した。

その結果、心臓から精製されたヒトゾヌリンおよびヒトＩｇＭが、同じ部分であるか否かを決定するために、ヒトゾヌリンの部分消化を行い、内部フラグメントを得、次いで、これを配列決定した。

より具体的には、ヒト心臓から精製されたゾヌリンを含有する、１．０ｍｍのＰＶＤＦフィルターを、０．１％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で予め洗浄し、そしてメタノールでリンスしたプラスチックチューブ中に置いた。１００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．２）、１０％（ｖ／ｖ）ＣＨ_３ＣＮ、および１．０％（ｖ／ｖ）脱水素化Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む７５μｌの緩衝液を添加し、そして３７℃で６０分間、メンブレンとともにインキュベートした。次いで、１５０ｎｇのトリプシンを添加し、そして３７℃でのさらなる２４時間のインキュベーション期間を行った。得られる溶液を、１０分間、超音波処理し、そして上清をデカントした。次いで、７５μｌの０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡを添加し、溶液を、さらに１０分間超音波処理し、そして上清をデカントした。両方のアリコートを、０．５ｍｍ×２５０ｍｍ Ｃ_１８カラム、５．０μｍの粒子サイズ、３００Aの孔サイズにロードした。０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡから４５％ ＣＨ_３ＣＮ水＋０．１％（ｗ／ｖ）ＴＦＡの勾配を２時間１５分で展開した。ピークを最終的に回収し、そして配列決定した。

成人ヒト心臓から精製されたヒトゾヌリンの内部配列は：Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｇｌｙ（配列番号９）であることが見出された。

ヒトゾヌリン内部配列を、ＢＬＡＳＴサーチ解析によって他のタンパク質配列と比較した。この解析結果は、ヒトゾヌリンの内部配列は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ由来のＩｇＭの重可変鎖の任意の内部配列に、０％の同一性を有することを示した。

上述の実施例３における結果は、（１）ゾヌリンは、特定の経路の生理学的な調節因子を示すこと；（２）ウサギゾヌリンのＮ末端配列は、ｔａｕタンパク質のＮ末端配列に高度に相同であること；（３）ゾヌリンおよびｔａｕは、免疫学的に関連するが、機能的に異なる２つの異なる部分であること；（４）心臓および腸から得られたヒトゾヌリンのＮ末端配列は、ＩｇＭの重鎖可変領域のＮ末端配列に高度に相同性であること；（５）ヒトゾヌリンおよびＩｇＭは、構造的に関連するが、機能的に異なる２つの異なる部分であること；ならびに（６）ゾヌリンは、共通の、活性なＣ末端配列、および可変性のＮ末端配列を有するｔａｕ関連タンパク質のファミリーを示すことを実証した。

本発明は詳細に、そしてその特定の実施態様について記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変更および改変が、本発明についてなされ得ることが当業者に明らかである。

図１は、種々のネガティブコントロール（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの、画分２（白菱形）；画分３（黒丸）；画分４（黒三角）；および画分５（白四角））に比較されるように、ウサギ腸から精製されたゾヌリン（黒四角）の、ＣａＣｏ２細胞単層の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図２は、ネガティブコントロール（白四角）に比較される、ウサギ腸から精製されたゾヌリン（黒四角）の、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備されたウサギ回腸の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図３は、ネガティブコントロール（ゾヌリン＋抗ＺＯＴ抗体（白四角）；ゾヌリン＋抗ｔａｕ抗体（△）；およびｔａｕ（黒三角））に比較される、ウサギ腸から精製されたゾヌリン（黒四角）の、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備されたウサギ回腸の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ネガティブコントロール（黒四角）に比較される、ヒト心臓（黒三角）またはヒト脳（白四角）のいずれかから精製されたゾヌリンの、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備されたアカゲザル空腸（図４Ａ）およびアカゲザル回腸（図４Ｂ）の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図４Ａおよび４Ｂは、ネガティブコントロール（黒四角）に比較される、ヒト心臓（黒三角）またはヒト脳（白四角）のいずれかから精製されたゾヌリンの、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備されたアカゲザル空腸（図４Ａ）およびアカゲザル回腸（図４Ｂ）の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ネガティブコントロール（黒四角）に比較される、ヒト心臓（黒三角）またはヒト脳（白四角）のいずれかから精製されたゾヌリンの、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備されたウサギ空腸（図５Ａ）およびウサギ回腸（図５Ｂ）の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図５Ａおよび５Ｂは、ネガティブコントロール（黒四角）に比較される、ヒト心臓（黒三角）またはヒト脳（白四角）のいずれかから精製されたゾヌリンの、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーにおいて装備されたウサギ空腸（図５Ａ）およびウサギ回腸（図５Ｂ）の組織耐性（Ｒｔ）についての効果を示す。 図６は、ウサギおよびヒトの組織から精製されたゾヌリンのＮ末端配列の比較を示す。

（配列表）

Claims (1)

1. 実質的に純粋なゾヌリンであって、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって決定されるように、約４７ｋＤａのみかけの分子量を有し、抗ｔａｕポリクローナル抗体および抗ＺＯＴポリクローナル抗体の両方によって認識され、ならびに哺乳動物密着結合を可逆的に開き得、そして該ゾヌリンは、以下：
   
   からなる群より選択されるＮ末端アミノ酸配列を有する、ゾヌリン。