JP2005278565A - 無菌培養方法及び無菌培養装置 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 上記作業室２及び密封移送容器５を接続手段４によって連通させ、この状態で滅菌装置６からの滅菌ガスを充満させてこれら作業室及び密封移送容器を滅菌する。その後人体より採取された組織を滅菌庫９を介して作業室に搬入し、培養準備作業を行って被培養物を得る。
被培養物が得られたら、当該被培養物を密封移送容器に移送して作業室から密封移送容器を分離し、今度は当該密封移送容器を複数設けられた培養器３のうちの所要の培養器３に接続して、被培養物をハンドリング室１４を介して培養室１２内に供給することで、被培養物の培養を行う。
【効果】 複数の被培養物を交差汚染を防止して同時期に培養することが可能となる。
【選択図】 図１

Description

本発明は無菌培養方法及び無菌培養装置に関し、詳しくは作業室内で培養準備作業を行ってから被培養物を培養器内で培養する無菌培養方法及び無菌培養装置に関する。

今日、再生医療や癌免疫療法を目的として、人体の組織より採取した組織から所要の細胞だけを取り出し、当該細胞を培養することが行われており、これら細胞等の被培養物を培養するためには、予め採取した組織から培養する必要のない組織を取り除く培養準備作業を行う必要がある。
そして上記培養準備作業を行うための作業室と、被培養物を培養するための培養器を備えた無菌培養装置として、以下のものが知られている。
最初に、無菌箱若しくは無菌操作箱を無菌状態を保ったまま直列的に複数台接続した無菌培養装置が知られており（特許文献１）、この特許文献１ではこれらの無菌操作箱若しくは無菌箱をそれぞれ上記作業室や培養器として使用することができるようになっている。
そして無菌操作箱で培養準備作業した被培養物を無菌状態を保ったまま無菌箱に移送することで、被培養物が外部の雰囲気によって汚染されることなく無菌箱内で培養することができるようになっている。
また無菌状態を維持された作業室内に培養器を設けた無菌培養装置が知られており（特許文献２）、作業室内で培養準備作業を行った被培養物をそのまま培養器内に収容することにより、被培養物を外部の雰囲気に触れさせずに無菌箱内で培養することができるようになっている。
実開昭５６−４７７４１号公報 特開昭６１−１２２７９号公報

しかしながら、上述したような再生医療に利用する細胞を被培養物として培養する際、上記作業室内等で他人同士の細胞を同時に扱うと、一方の細胞によって他方の細胞が汚染されるいわゆる交差汚染が生じてしまう。
この交差汚染を防止するためには、他人同士の細胞を作業室内で同時に扱わないことや、他人同士の細胞を同一の培養器内で培養しないことが必要であるが、上記特許文献１では、ひとつの被培養物を無菌箱に移送してしまうと、無菌操作箱と無菌箱とが連通しているため、無菌操作箱で他人の被培養物の培養準備作業を行うと、無菌箱内の被培養物が交差汚染されてしまう。
また特許文献２では、作業室内に１台の培養器しか設けられていないため、１つの被培養物を培養器内に移送してしまうと、当該培養器内で交差汚染のおそれが生じることから、当該被培養物の培養が終了するまで他人の被培養物を培養器内に移送することができなかった。
以上のことから、上記特許文献１及び特許文献２では、同時に複数の異なる被培養物を培養することができず、ひとつの被培養物を培養している間、他人の被培養物については培養準備作業ができないような事態となっていた。
このような問題に鑑み、交差汚染が発生するおそれなく、複数の被培養物を培養することの可能な無菌培養方法及び無菌培養装置を提供するものである。

すなわち、請求項１における無菌培養方法は、被培養物を培養するための培養準備作業を滅菌された作業室内で行い、この培養準備作業を施した被培養物を滅菌された培養器内で培養するようにした無菌培養方法において、
上記作業室と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な密封移送容器を設けるとともに、それぞれ上記密封移送容器と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な培養器を複数設け、
上記作業室、密封移送容器及び培養器の内部を滅菌し、滅菌された作業室内で被培養物の培養準備作業を行なったら、この被培養物を作業室に接続した密封移送容器に移送し、次に作業室より密封移送容器を分離したら、この密封移送容器をいずれかの培養器に接続して、密封移送容器内の被培養物を培養器に移送して培養することを特徴としている。

また請求項４に記載の無菌培養装置は、被培養物を培養するための培養準備作業を滅菌された作業室内で行い、この培養準備作業を施した被培養物を滅菌された培養器内で培養するようにした無菌培養装置において、
上記作業室と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な密封移送容器を設けるとともに、それぞれ上記密封移送容器と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な培養器を複数設けたことを特徴としている。

上記無菌培養方法及び無菌培養装置によれば、培養器が作業室とは分離されて複数設けられているため、異なる複数の被培養物を交差汚染を防止しながら同時期に並行して培養することが可能となる。

以下図示実施例について説明すると、図１は本発明にかかる無菌培養方法に使用する無菌培養装置１を示し、この無菌培養装置１は被培養物についての培養準備作業を行うための作業室２と、当該作業室２とは離隔した位置に設けられるとともに、その内部で被培養物の培養を行う複数の培養器３と、これら作業室２及び培養器３に接続手段４を介して接離する密封移送容器５とを備えている。
上記作業室２および各培養器３にはそれぞれ過酸化水素蒸気などの滅菌ガスを発生させる滅菌装置６が導管６ａを介して接続されており、当該滅菌装置６から供給される滅菌ガスを作業室２や培養器３の内部に充満させることで、これらの内部を滅菌して無菌状態とすることができる。
ここで、本実施例で培養される上記被培養物とは人体から採取した所定の細胞であり、この被培養物を培養することで、当該被培養物を再生医療や癌免疫療法に利用することができるようになっている。
また培養準備作業とは、人体から採取した組織や体液から必要な細胞だけを取り出す作業であって、採取した組織から不必要な組織を除去するための一連の作業をいう。

上記作業室２はその内部が外部の雰囲気より隔離され、図示しない無菌エア供給装置から供給される滅菌された空気によって所定の陽圧に保たれている。そしてこの作業室２の内部には培養準備作業に使用する遠心分離機や顕微鏡等の機器７が備えられている。
また作業室２の側面には作業者が装着して培養準備作業を行うための２組のグローブ８と、作業室２内に搬入される人体の組織を入れた採取容器Ａの外面を滅菌するための滅菌庫９と、上記密封移送容器５と接続するための接続手段４を構成する接続ポート２１とが設けられている。
上記グローブ８の設けられている面は透明なアクリル製となっており、グローブ８を装着した作業者は、作業室２内部の様子を観察しながら培養準備作業等を行うことができるようになっている。
また上記滅菌庫９は上記作業室２との間に開閉可能に設けられた第１開閉扉１０と、外部空間との間で開閉可能に設けられた第２開閉扉１１とを備え、この滅菌庫９にも上記滅菌装置６からの導管６ａが接続され、滅菌ガスによって内部の滅菌が行われるようになっている。
そして人体より採取された組織は上記採取容器Ａ内に密閉され、その状態で滅菌庫９内に搬入されるようになっており、この採取容器Ａは滅菌庫９内で滅菌された後、作業室２内に搬入されるようになっている。
さらに培養準備作業によって得られる被培養物はシャーレなどの培養容器Ｂ内に入れられ、上記接続手段４によって接続された密封移送容器５に収容されて、培養器３へ移送されるようになっている。

次に、上記培養器３は、その内部で被培養物を培養する培養室１２と、開閉扉１３を介して培養室１２に連通するハンドリング室１４とから構成され、上記ハンドリング室１４には、グローブ１５と上記接続手段４を構成するとともに上記作業室２の接続ポート２１と同形の接続ポート２１とが設けられている。
上記培養室１２は図示しない調節手段により、その内部が一定の温度、湿度、炭酸ガス濃度で保たれており、被培養物の培養に適した環境に維持されている。
またハンドリング室１４は上記作業室２と同様、その内部が外部の雰囲気より隔離されており、図示しない無菌エア供給装置から供給される滅菌された空気によって所定の陽圧に保たれている。
さらにこのハンドリング室１４には上記滅菌装置６からの導管６ａが接続されており、滅菌装置６からの滅菌ガスによってこのハンドリング室１４内部を滅菌することが可能であり、上記開閉扉１３を開いた状態で滅菌ガスを流入させることで、培養室１２内の滅菌も行えるようになっている。

そして上記密封移送容器５は培養容器Ｂを収容する本体部１６と、上記作業室２及び培養器３の接続ポート２１に接続する接続手段４を構成する接続ポート２２とを備えており、作業者がかかえて、または、図示しない移動台車によって作業室２と各培養器３との間を移動可能となっている。
図２は上記接続手段４について説明した図であり、上記作業室２の接続ポート２１と密封移送容器５の接続ポート２２とが分離した状態と接続した状態をそれぞれ示した図となっている。なお、上記作業室２の接続ポート２１と培養器３の接続ポート２１とは同一の構成を有しているので、培養器３の接続ポート２１についてはその説明を省略する。
最初に、各接続ポート２１、２２はそれぞれ被培養物の入った培養容器Ｂが通過可能な接続口２１ａ、２２ａと、これら接続口２１ａ、２２ａに開閉可能に設けられた隔壁２１ｂ、２２ｂとを備えており、図２（ａ）のように作業室２と密封移送容器５とを分離したときに、作業室２及び密封移送容器５の内部を外部の雰囲気から隔離するようになっている。
そして作業室２側の接続口２１ａには、上記隔壁２１ａを軸支するヒンジ２３と、図示左方側には隔壁２１ａを閉鎖する閉鎖部材２４が設けられており、この閉鎖部材２４をグローブ８を装着した作業者が操作することで、隔壁２１ａの閉鎖状態が解除されるようになっている。
さらに隔壁２１ａにおける作業室２側の中央には隔壁２１を開閉するための取手２５が設けられており、この取手２５を作業者が把持することで、隔壁２１ａの開閉可能となっている。

そして図２（ｂ）に示すように両接続ポート２１、２２は相互に連結されるようになっており、上記接続口２１ａ、２２ａが連結すると、隔壁２１ｂ、２２ｂが開放されても作業室２及び密封移送容器５内に外部の雰囲気が流入しないようになっている。
また接続口２１ａ、２２ａが連結されると同時に上記隔壁２１ｂ、２２ｂも連結されるようになっており、隔壁２２ｂは隔壁２１ｂと一体となって上記ヒンジ２３を中心に作業室２内に向けて開くようになっている。
そして上記接続ポート２１，２２における、作業室２及び密封移送容器５を連結させる以前に外部に露出していた部分は、連結することによって作業室２内の滅菌された空間に露出することがないので、作業室２が汚染されることはない。
なお、上記接続手段４の構成は従来公知であり、特許第３４４５８１３号公報に記載される構成と略同一の構成を有しているので、これ以上の詳細な説明を省略する。

以上の構成を有する無菌培養装置１を用いた無菌培養方法を以下に説明すると、最初に、上記接続手段４によって作業室２と密封移送容器５とを連結し、作業者がグローブ８を装着して閉鎖部材２４及び取手２５を操作して隔壁２１ｂ、２２ｂを開放し、作業室２と密封移送容器５とを連通させる。
一方各培養器３では、作業者がハンドリング室１４のグローブ１５を装着して開閉扉１３を開き、培養室１２とハンドリング室１４とを連通させておく。
この状態から滅菌装置６を作動させて、導管６ａを介して作業室２及び密封移送容器５内部と、ハンドリング室１４及び培養室１２内部とに滅菌ガスを充満させ、これら作業室２、密封移送容器５、培養室１２の内部を滅菌する。
このように、作業室２と密封移送容器５とを連通した状態で滅菌を行っているので、導管６ａを接続することなく密封移送容器５の滅菌をすることができる。
また培養室１２も同様、ハンドリング室１４と連通した状態で滅菌が行われているので、導管６ａを接続することなく培養室１２の滅菌をすることができる。

作業室２及び密封移送容器５の滅菌が終了したら、滅菌庫９の第２開閉扉１１を開放して、人体より採取した組織の入れられた採取容器Ａや、培養準備作業に使用する用具を当該滅菌庫９内部に搬入し、第２開閉扉１１を閉鎖する。
その後滅菌装置６から滅菌庫９に滅菌ガスを供給して滅菌庫９内を滅菌し、あわせて上記採取容器Ａの外面や用具の滅菌を行う。
採取容器Ａ等の滅菌が終了したら、作業者は作業室２のグローブ８を装着して作業室２と滅菌庫９との間に設けられた第１開閉扉１０を開放し、採取容器Ａ及び用具を滅菌庫９から作業室２へと移動する。
第１開閉扉１０を閉鎖したら、作業者は採取容器Ａ内の組織について培養準備作業を開始し、上記機器７や上記用具を用いて採取された組織から培養する被培養物を取り出して、当該被培養物を培養容器Ｂへと収容する。

その後作業者によって隔壁２１ｂ、２２ｂの開放されている接続ポート２１，２２を介して培養容器Ｂを密封移送容器５へと移動し、上記取手２５及び閉鎖部材２４を操作して隔壁２１ｂ、２２ｂを閉鎖する。
これにより作業室２と密封移送容器５とが互いに隔離され、その後接続ポート２１，２２を分離させて作業室２から密封移送容器５を離脱させた後、密封移送容器５をいずれかの培養器３まで移動させる。
そして密封移送容器５を培養器３にまで移動させたら、接続手段４によってハンドリング室１４の接続ポート２１に密封移送容器５の接続ポート２２を連結する。
さらに、作業者がハンドリング室１４のグローブ１５を装着して、閉鎖部材２４及び取手２５を操作して隔壁２１ｂ、２２ｂを開放し、ハンドリング室１４と密封移送容器５とを連通させる。
ハンドリング室１４と密封移送容器５とが連通したら、接続口２１ａ、２２ａを介して密封移送容器５内の培養容器Ｂをハンドリング室１４内に移動させ、隔壁２１ｂ、２２ｂを閉鎖することで、ハンドリング室１４と密封移送容器５とを隔離し、密封移送容器５を培養器３から分離する。
続いて、作業者は開閉扉１３を開いて培養室１２とハンドリング室１４とを連通させ、培養容器Ｂを培養室１２内に収容して開閉扉１３を閉鎖する。その後所定期間培養容器Ｂを培養室１２内に収容して被培養物を培養し、培養された被培養物は上述した再生医療等に使用される。

上記培養器３で被培養物を培養している間に、当該培養器３から分離した密封移送容器５を作業室２まで移動させて、接続手段４により作業室２と密封移送容器５とを再び接続する。
そして作業者によって隔壁２１ｂ、２２ｂを開放したら、上記滅菌装置６を作動させて作業室２及び密封移送容器５の内部に滅菌ガスを充満させ、現在培養中の被培養物とは異なる検体の被培養物についての培養準備作業及び培養に備えて、これらの内部を滅菌する。
作業室２及び密封移送容器５の内部が滅菌されたら、複数のうちのいずれかの培養器３で被培養物が培養されている間に、この被培養物とは異なる被培養物に対し、改めて滅菌された作業室２内で培養準備作業を行い、接続されている密封移送容器５を用いて、現在培養中の培養器３とは異なる、事前に滅菌された培養器３に被培養物を移送して培養を行う。

このように、新たな採取容器Ａを作業室２内に搬入する前に改めて作業室２及び密封移送容器５の内部を滅菌することで、先の培養準備作業により付着した組織や細胞を死滅させ、次に培養準備作業を行う被培養物が交差汚染されることを防いでいる。
しかも本実施例では作業室２と分離して培養器３を複数設けるとともに、被培養物を密封移送容器５及び接続手段４によって無菌状態を保ったまま移送するので、複数の被培養物を交差汚染を防止して同時期に培養することが可能である。

なお、上記実施例では培養器３にハンドリング室１４を設けていたが、密封移送容器５を移動可能なトランスファアイソレータとして内部にグローブ８を設ければ、上記培養器３からハンドリング室１４を省略することができる。
具体的に説明すると、上記培養室１２の開閉扉１３の代わりに、上記接続手段４の接続ポート２１を設け、上記実施例とは逆に上記ヒンジ２３、閉鎖部材２４、取手２５をそれぞれ密封移送容器５側の接続ポート２２に設ける。またこの培養器に設けた接続ポート２１に合わせ、作業室２の接続ポート２１も同様の構成とする。
このようにすることで、密封移送容器５に設けたグローブにより、隔壁２１ｂ、２２ｂを開放して培養容器Ｂを作業室２から密封移送容器５へと移動させることができ、また密封移送容器５内の被培養物を直接培養室１２へと移動させることができる。
また、上記実施例の作業室２およびハンドリング室１４にはグローブ８、１５が設けられているが、それに代えて作業者の上半身を覆うハーフスーツや作業ロボットを設けることも可能である。
さらに、上記密封移送容器５を自動的に移動させるようにすれば、被培養物の移送を自動的に行うことができ、人が介在することによる被培養物の汚染を防止することができる。

本実施例にかかる無菌培養装置１を示す概略図。 接続手段についての拡大図を示し、（ａ）は作業室と密封移送容器とが分離した状態を示し、（ｂ）は作業室と密封移送容器とが連結した状態を示している。

符号の説明

１ 無菌培養装置 ２ 作業室
３ 培養器 ４ 接続手段
５ 密封移送容器

Claims (5)

1. 被培養物を培養するための培養準備作業を滅菌された作業室内で行い、この培養準備作業を施した被培養物を滅菌された培養器内で培養するようにした無菌培養方法において、
   上記作業室と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な密封移送容器を設けるとともに、それぞれ上記密封移送容器と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な培養器を複数設け、
   上記作業室、密封移送容器及び培養器の内部を滅菌し、滅菌された作業室内で被培養物の培養準備作業を行なったら、この被培養物を作業室に接続した密封移送容器に移送し、次に作業室より密封移送容器を分離したら、この密封移送容器をいずれかの培養器に接続して、密封移送容器内の被培養物を培養器に移送して培養することを特徴とする無菌培養方法。
2. 上記被培養物をいずれかの培養器で培養している間に、該被培養物と異なる被培養物を培養する場合には、改めて滅菌した作業室内で培養準備作業を行ない、この被培養物を上記被培養物を培養している培養器とは異なる培養器に移送して培養することを特徴とする請求項１に記載の無菌培養方法。
3. 上記作業室と密封移送容器とは相互に接続された状態で同時に滅菌されることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の無菌培養方法。
4. 被培養物を培養するための培養準備作業を滅菌された作業室内で行い、この培養準備作業を施した被培養物を滅菌された培養器内で培養するようにした無菌培養装置において、
   上記作業室と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な密封移送容器を設けるとともに、それぞれ上記密封移送容器と接続手段を介して無菌状態を保ったまま接離可能な培養器を複数設けたことを特徴とする無菌培養装置。
5. 上記培養器は、被培養物を培養する培養室と、この培養室に開閉扉を介して連通するハンドリング室を備え、このハンドリング室に上記接続手段が設けられていることを特徴とする請求項５に記載の無菌培養装置。

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