JP2005274410A - エンザイムイムノアッセイデバイス及び検出方法 - Google Patents
エンザイムイムノアッセイデバイス及び検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005274410A JP2005274410A JP2004089132A JP2004089132A JP2005274410A JP 2005274410 A JP2005274410 A JP 2005274410A JP 2004089132 A JP2004089132 A JP 2004089132A JP 2004089132 A JP2004089132 A JP 2004089132A JP 2005274410 A JP2005274410 A JP 2005274410A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- sample
- substrate
- detected
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【解決手段】 試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたEIAデバイスであって、ストリップ部の一端に吸収パッド部、ストリップ部の他端上に酵素基質を乾燥状態で含有する基質部、ストリップ部に被検出物と反応する標識抗体又は標識抗原を乾燥状態で含有した標識部、標識部と吸収パッド部間のストリップ部に被検出物と反応する抗体又は抗原を固相化した検出部、標識部と基質部間のメンブラン部に検体試料液を加えるための試料部を設けたEIAデバイス並びにそのデバイスを用いて被検出物を検出する方法であって、試料液を試料部に加えて1回の操作で標識抗体又は標識抗原と基質を試料液のみで溶解して泳動させ、連続した一連の反応で起こる検出部における着色の有無を観察して検出する。
【選択図】 なし
Description
使用時に、検体試料液を標識抗体部10に加え、つづいて基質パッド部9に酵素反応により着色する基質液を加える。
基質液も同方向に泳動し、捕捉された標識抗体の標識酵素が基質と酵素反応するので検出部11が着色する。
図1は、エンザイムイムノアッセイデバイスの好ましい実施態様の模式図である。
すなわち、メンブランストリップ部1の一方の端に吸収パッド部2、もう一方の端のメンブランストリップ部上に酵素の基質が乾燥状態で含有されている基質部3、前記メンブランストリップ部1に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部4、該標識部4と前記吸収パッド部2の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部5、標識部4と基質部3を含むその間のメンブランストリップ部に検体試料液を加えるための試料部6を設けたデバイスである。
メンブランストリップ部の材質は、特に限定されないが、多孔性の吸水性の材質であり、検体試料液や基質液が毛管作用により展開し得る材質である。例えば、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ナイロン、ポリエーテルスルホン、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ガラス繊維、ポリオレフィン、セルロース、これらの混合繊維からなる人工ポリマーが用いられ、好ましくはニトロセルロースメンブランが用いられる。メンブランの厚さは特に限定されないが、好ましくは100〜200μm程度である。また、メンブランは長方形のストリップで用い、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜9mm×40mm〜60mm程度である。
吸収パッド部は、本発明のエンザイムイムノアッセイデバイスの一端に設けられデバイスを展開する液体を吸収することによりメンブレン上の液体の流れを促進する。吸収パッド部は、多量の液を吸収できるよう、吸水性の材質でできており、例えば、ろ紙、ガラス繊維などでできた不織布等が用いられる。また、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜15mm×10mm〜40mm、厚さ0.5mm〜3mm程度である。
検出部は、検出すべき抗原または抗体と抗原抗体反応により特異的に結合して検出すべき抗原または抗体を捕捉するための抗体または抗原がメンブランに固相化されている。抗体または抗原は、例えばライン状に固相化すればよい。固相化は、タンパク質をニトロセルロース膜等の固相に固相化するための公知の方法で行うことができる。抗体は精製したポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が用いられる。抗原は、精製した天然の抗原またはリコンビナント抗原が用いられる。
吸水性の材質、例えばスポンジ及びガラス繊維などでできた不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜10mm×3mm〜10mm、厚さ0.5mm〜3mm程度で、酵素標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている。
吸水性のある材質、例えばスポンジ及びガラス繊維などの不織布等の材質が用いられ、その大きさは、特に限定されないが、通常、3mm〜10mm×8mm〜30mm、厚さ0.5mm〜3mm程度で、酵素の基質が乾燥状態で含有されている。上記吸水性の材質に基質を含浸させ、乾燥させればよい。基質としては、酵素反応時に色素が不溶化となる性質を有する基質を用いることが好ましく、例えば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合には5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸/ニトロテトラゾリウムブルー、β−ガラクトシダーゼーの場合には5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトピラノシド、ペルオキシダーゼの場合には3,3’−ジアミノベンチジン等を用いることができる。
検体試料液を加え標識部と基質部に吸収させるための部位で、検体試料液をメンブランに直接加えることが好ましいが、吸水性のある材質、例えばスポンジ、ガラス繊維などの不織布等のパッドをメンブラン上に設けその部分に加えることもできる。この場合、試料部のパッドと基質部および/または標識部は接触していてもいなくてもよい。試料部は標識部と基質部の間に設けられ、基質部または標識部と同じ位置にあってもよい。
本発明にいう検体試料液は、咽頭あるいは鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、咽頭あるいは鼻腔洗浄液、唾液、血清、便懸濁液、尿、培養液及びそれらを緩衝液で希釈したものを用いることができるがこれらに限定されない。
本発明にいう検出すべき抗原または抗体は、何ら限定されず、検出しようとするいかなる物質であってもよい。たとえば、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、RSウイルス、ノーウォーク様ウイルス等のウイルス抗原、レジオネラ属菌、溶連菌、MRSA等の細菌抗原、ホルモン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
使用時に上記のデバイスを用い、検体試料液を試料部6に加えると検体試料液は標識部4および基質部3に達し、標識部4と基質部3に吸収され、標識抗体または標識抗原および基質が検体試料液に溶解する。メンブラン上の吸収パッド部方向への流れが吸収パッド部に達すると液体は吸収パッド部に吸収され、全体の流れは基質部から吸収パッド部へ向かう。従って、溶解された標識抗体または標識抗原は、吸収パッド部方向へと移動する。
1.抗インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の作製
(1)抗A型インフルエンザウイルスNP抗体
A型インフルエンザウイルス抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合した。得られた融合細胞(ハイブリドーマ)を、37℃インキュベーター中で維持し、A型インフルエンザウイルスNP抗原を固相したプレートを用いたELISAにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化(単クローン化)を行った。取得した該細胞2株をそれぞれプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。
B型インフルエンザウイルス抗原を用い、(1)と同様の方法で、2種類の精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
(1)アルカリフォスファターゼ標識抗A型インフルエンザウイルスNP抗体の作製
精製抗A型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について45mgを0.1Mクエン酸緩衝液(pH3.6)で透析後、ペプシン10mgを添加し、37℃で1時間、Fab’消化処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体F(ab’)2精製画分を得た。前記画分を約10mg/mLまで濃縮後、0.1Mメルカプトエチルアミンと10:1の体積比で混合し、37℃で90分間還元処理を行った。処理液をウルトロゲルAcA34カラムで分画して抗A型インフルエンザウイルスNP抗体Fab’精製画分を得た後、約1mLにまで濃縮した。
精製抗B型インフルエンザウイルスNP抗体のうち1種類について、(1)と同様の方法で、アルカリフォスファターゼ標識抗B型インフルエンザウイルスNP抗体を得た。
(1)A型インフルエンザウイルス用デバイス
ニトロセルロースメンブラン(HiFlow Plus HF06504 ミリポア社製)を20cm×5cmに切り、このニトロセルロースメンブランの吸収パッド部側のメンブラン端から1cmの位置に精製水を用いて至適濃度に希釈した抗A型インフルエンザウイルスNP抗体液(上記と別のクローン)で幅0.5mmの20cmラインを描き、減圧下で乾燥して抗体を固相化し、カッターで5mm×5cmのストリップに細切してメンブランストリップ部を作製した。濾紙(WA1.5 ワットマン社製)を5mm×3cmの大きさに細切し、メンブランストリップ部の端に5mm重ねて吸収パッド部を設けた。
(1)と同様の方法で、B型インフルエンザウイルス用デバイスを作製した。
検出
検体としてA型インフルエンザウイルス抗原液並びにB型インフルエンザウイルス抗原液をそれぞれ用いた。
インフルエンザウイルス抗原液を0.15M塩化ナトリウム、0.1%(W/V)ウシ血清アルブミン、0.5%(W/V)n-オクチル-β-D-グルコシドを含む10mMトリス緩衝液(pH8.0)で10倍階段希釈し検体試料液とした。
検体試料液をデバイスの標識部から3mm離れた試料部に200μL加え、20分後に判定を行った。
A型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた時、A型インフルエンザウイルス抗原は105(pfu/mL)まで陽性で、B型インフルエンザウイルス抗原は陰性となり特異的にA型インフルエンザウイルス抗原を検出できることが確かめられた。
得られた結果を表1及び表2に示す。
A型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた成績
ウイルス濃度(pfu/mL)
106 105 104
A型インフルエンザウイルス抗原 + + −
B型インフルエンザウイルス抗原 − − −
判定基準
+ : 青の着色が見られるもの
− : 青の着色が見られないもの
B型インフルエンザウイルス用デバイスを用いた成績
ウイルス濃度(pfu/mL)
106 105 104
B型インフルエンザウイルス抗原 + + −
A型インフルエンザウイルス抗原 − − −
判定基準
+ : 青の着色が見られるもの
− : 青の着色が見られないもの
2 吸収パッド部
3 基質部
4 標識部
5 検出部
6 試料部
7 メンブランストリップ部
8 吸収パッド部
9 基質パッド部
10 標識抗体部
11 検出部
Claims (2)
- 検体試料液中の被検出物を検出するための、メンブランストリップを用いたエンザイムイムノアッセイデバイスであって、メンブランストリップ部の一方の端に吸収パッド部、もう一方の端のメンブランストリップ部上に酵素の基質が乾燥状態で含有されている基質部、前記メンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原を酵素で標識した標識抗体または標識抗原が乾燥状態で含有されている標識部、該標識部と前記吸収パッド部の間のメンブランストリップ部に検出すべき抗原または抗体と反応する抗体または抗原が固相化された検出部、標識部と基質部を含むその間のメンブラン部に検体試料液を加えるための試料部を設けたエンザイムイムノアッセイデバイス。
- 請求項1記載のエンザイムイムノアッセイデバイスを用いて検体試料液中の被検出物を検出する方法であって、検体試料液を試料部に加えて1回の操作で標識抗体または標識抗原と基質を検体試料液のみで溶解して泳動させ、連続した一連の反応により起こる前記検出部における着色の有無を観察することにより検体試料液中の被検出物を検出する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004089132A JP4477390B2 (ja) | 2004-03-25 | 2004-03-25 | エンザイムイムノアッセイデバイス及び検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2004089132A JP4477390B2 (ja) | 2004-03-25 | 2004-03-25 | エンザイムイムノアッセイデバイス及び検出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005274410A true JP2005274410A (ja) | 2005-10-06 |
JP4477390B2 JP4477390B2 (ja) | 2010-06-09 |
Family
ID=35174235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004089132A Expired - Lifetime JP4477390B2 (ja) | 2004-03-25 | 2004-03-25 | エンザイムイムノアッセイデバイス及び検出方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4477390B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007114049A (ja) * | 2005-10-20 | 2007-05-10 | Denka Seiken Co Ltd | アッセイ用媒体及びアッセイ方法 |
JP2008268043A (ja) * | 2007-04-23 | 2008-11-06 | Denka Seiken Co Ltd | 検査デバイスの検出部の形成方法及びラテラルフロー免疫測定用検査デバイス |
-
2004
- 2004-03-25 JP JP2004089132A patent/JP4477390B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007114049A (ja) * | 2005-10-20 | 2007-05-10 | Denka Seiken Co Ltd | アッセイ用媒体及びアッセイ方法 |
JP2008268043A (ja) * | 2007-04-23 | 2008-11-06 | Denka Seiken Co Ltd | 検査デバイスの検出部の形成方法及びラテラルフロー免疫測定用検査デバイス |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4477390B2 (ja) | 2010-06-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5340575B2 (ja) | イムノクロマトグラフィー用試験具 | |
JP5767362B1 (ja) | 免疫クロマト分析装置、免疫クロマト分析方法及び免疫クロマト分析キット | |
EP2290367A1 (en) | Method for detecting objective substance and kit for detecting objective substance | |
WO2009110577A1 (ja) | 免疫学的測定法、キット及び展開溶媒 | |
TW201839397A (zh) | 可防止非特異性反應、用以萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析試驗片 | |
TW201837465A (zh) | 可控制檢體之展開、用以萃取並測定醣鏈抗原之免疫層析試驗片 | |
WO2006073153A1 (ja) | 複数の被検出物を検出する簡易アッセイ法 | |
JP5010649B2 (ja) | デバイスおよび検出方法 | |
EP2270508B1 (en) | Membrane assay method and kit | |
JP2008275511A (ja) | インフルエンザウイルス抗原の免疫測定法及びそれに用いられる物 | |
JP4544907B2 (ja) | デバイスおよび検出方法 | |
JP5500791B2 (ja) | 新規検査方法及びそれに用いる検査キット | |
JP2016161329A (ja) | イムノクロマト法検査デバイスの試料添加部の形成方法及びイムノクロマト法検査デバイス | |
JP4477390B2 (ja) | エンザイムイムノアッセイデバイス及び検出方法 | |
WO2022024925A1 (ja) | シグナルの低下を改善した検査試薬 | |
KR20240031431A (ko) | 이뮤노 크로마토그래피법 검사 디바이스의 시료 첨가부의 형성 방법 및 이뮤노 크로마토그래피법 검사 디바이스 | |
EP4206181A1 (en) | Test reagent with improved specificity by suppressing false negatives | |
JP2005274385A (ja) | イムノアッセイデバイス及び検出方法 | |
JP2005331471A (ja) | アッセイデバイスおよび検出方法 | |
JP2006118936A (ja) | メンブランエンザイムイムノアッセイ法 | |
EP4206672A1 (en) | Test kit having specificity improved by inhibiting false positives | |
TW202314243A (zh) | 糞便檢體之檢查方法及其免疫層析試驗片 | |
JP2007121320A (ja) | フロースルーアッセイ方法、キット及び装置 | |
JP2003344408A (ja) | フロースルーアッセイ方法、キット及び装置 | |
JP2018036119A (ja) | 非特異反応抑制剤および前処理方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070307 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20081120 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090519 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090721 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100205 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100302 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100311 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4477390 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130319 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130319 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140319 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |