JP2005254084A - 修復期間の予測方法および修復プロセスの制御方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明の課題は、環境汚染の生物的修復において、修復期間を予想し、浄化プロセスを制御する簡便な方法を提供することである。
【手段】本発明は、有機塩素化合物による汚染を嫌気的生物処理によって修復するために必要な期間を推定する方法であって、既存試料を用いて、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量値と有機塩素化合物の分解処理試験より求めた修復期間との相関を求める工程、および供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程を含む上記方法である。
【選択図】なし
【手段】本発明は、有機塩素化合物による汚染を嫌気的生物処理によって修復するために必要な期間を推定する方法であって、既存試料を用いて、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量値と有機塩素化合物の分解処理試験より求めた修復期間との相関を求める工程、および供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程を含む上記方法である。
【選択図】なし
Description
本発明は、環境汚染の生物的修復方法に関する。より詳細には、本発明は、有機塩素化合物による土壌汚染または地下水汚染の生物的修復方法において、事前に修復期間を推定し、浄化プロセスを制御する方法に関する。
近年、様々な有害化学物質による環境汚染が問題となっている。特に、有機塩素系化合物や重金属化合物による土壌や地下水などの汚染は深刻な問題につながる可能性があり、汚染された土壌や地下水を修復する技術が必要とされている。
汚染された土壌や地下水の修復法として、現在まで、種々の方法が提案されている。例えば、吸着現象等を利用した物理的・化学的な方法や、微生物を利用した生物的な方法を挙げることができる。これらの方法の中でも、微少量の汚染物質を分解したい場合や環境面で有利なことから、最近では、微生物を利用した生物的な汚染修復方法が注目されている。
微生物による汚染修復方法では、通常、修復現場への適用性を評価するため、室内試験による分解処理試験が実施される。分解処理試験においては、汚染現場の土壌または地下水を採取し、修復工事と同様の条件を室内試験で再現することによって、実際の修復工事に必要な浄化期間の推定および栄養剤投入量の決定を行う。しかし、この分解処理試験には長い期間が必要であり、例えば、有機塩素化合物で汚染された現場に対して微生物による嫌気処理を適用する場合、通常の適用性評価手法では３〜６ヶ月程度の期間が必要である。
有機塩素化合物の生物的処理方法に関しては、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレンを始めとする有機塩素化合物をエチレンまで分解する微生物としてDehalococcoides ethanogenが発見され（非特許文献１参照）、有機塩素化合物の嫌気脱塩素処理が良好に進行する汚染現場では、上記の微生物が特徴的に検出される事例が報告されている（非特許文献２参照）。
Maymo-Gatell他、Science：276：1568‐1571(1997)
Frank E Loffler他：Appl.Environ.Microbiol.66：(4)：1369‐1374(2000)
上記の報告に基づいて、エチレン系の有機塩素化合物汚染サイトに微生物を利用した嫌気的浄化法を採用する際、Dehalococcoides属の微生物の存在を確認することによって、対象となる汚染現場での修復の可能性を短期間で判断する事が可能となった。
しかし、上記の評価手法は修復の可否を判断するための定性的な評価手法であるため、実際の施工にあたって重要な設計要素となる浄化期間の推定および栄養剤投入量の決定を行うには、依然として、従来法である分解処理試験を実施する必要があった。
そこで、修復の可否に加えて、修復期間および栄養剤投入量をも迅速に評価することのできる手法の開発が切望されていた。
このような状況に鑑み、本発明の課題は、有機塩素化合物による土壌汚染または地下水汚染の生物的修復方法において、迅速に修復期間を推定し、栄養剤投入量を始めとする種々のパラメータを適切に決定する方法を提供することである。さらに、本発明の課題は、有機塩素化合物による土壌汚染または地下水汚染の生物的修復方法において、上記の方法によって推定された修復期間やパラメータによって、修復プロセスを適切に制御する方法を提供することである。
本発明者らは、土壌または地下水からDehalococcoides属、Desulfitbacterium属、Desulfuromonas属、Dehalobacter属等の脱塩素反応を触媒する嫌気性細菌を特異的に定量解析する手法を開発した。
また、本発明者らは、一般の嫌気処理において、Dehalococcoides属の脱塩素反応を触媒する嫌気性細菌の定量評価値と、実際の汚染現場における修復期間との間に相関関係がある事を見出した。さらに、本発明者らは、還元剤および微生物を活性化するための栄養剤を併用した土壌還元法（特許第3401191号）による処理において、Dehalococcoides属、Desulfitbacterium属、Desulfuromonas属、Dehalobacter属等の脱塩素反応を触媒する嫌気性細菌の定量評価値と、実際の汚染現場における修復期間との間に相関関係がある事を見出した。
これらの発見に基づき、本発明者らは、汚染現場の土壌または地下水中に存在するDehalococcoides属等の脱塩素反応を触媒する嫌気性細菌の微生物量を定量することによって、修復期間を推定できることを見出した。さらに、本発明者らは、推定された修復期間を、土壌または地下水中の酸化還元電位（ORP）により補正したり、硫酸イオン濃度および第１鉄イオン濃度を測定し、両イオンが嫌気性微生物によって還元されるまでの期間の実測値または予測値で補正することによって、修復期間のより正確な推定が可能となる事を見出した。
本発明によれば、有機塩素化合物による土壌汚染または地下水汚染を生物的に修復するにあたって、迅速に修復期間を推定し、栄養剤投入量を始めとする種々のパラメータを適切に決定することが可能である。
また、本発明により修復期間を特定する事により、処理対象に供給する栄養剤の最適量を決定する事が可能となり、これにより、浄化対象物に添加する浄化微生物量を制御し、任意の浄化期限内に浄化を完了する事が可能となった。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明は、有機塩素化合物による汚染を嫌気的生物処理によって修復するために必要な期間を推定する方法であって、既存試料を用いて、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量値と有機塩素化合物の分解処理試験より求めた浄化期間との相関を求める工程、および供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程を含む上記方法である。
本発明は、有機塩素化合物による汚染を嫌気的生物処理によって修復するために必要な期間を推定する方法であって、既存試料を用いて、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量値と有機塩素化合物の分解処理試験より求めた浄化期間との相関を求める工程、および供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程を含む上記方法である。
用語の説明
本明細書において用いる語句について、以下に説明する。
本明細書において「有機塩素化合物」とは、塩素を含む有機化合物を意味する。したがって、天然のものや合成されたもの、揮発性のものも含まれる。具体的には、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、１，１，１−トリクロロエタン、四塩化炭素を挙げることがことができる。また、いわゆるトリハロメタン類やダイオキシン類も含まれる。環境汚染を引き起こす有機塩素化合物としては、人為的に合成された有機塩素化合物が多いことから、本発明において浄化対象となる有機塩素化合物としては合成された有機塩素化合物が好ましい。
本明細書において用いる語句について、以下に説明する。
本明細書において「有機塩素化合物」とは、塩素を含む有機化合物を意味する。したがって、天然のものや合成されたもの、揮発性のものも含まれる。具体的には、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、１，１，１−トリクロロエタン、四塩化炭素を挙げることがことができる。また、いわゆるトリハロメタン類やダイオキシン類も含まれる。環境汚染を引き起こす有機塩素化合物としては、人為的に合成された有機塩素化合物が多いことから、本発明において浄化対象となる有機塩素化合物としては合成された有機塩素化合物が好ましい。
本明細書において「嫌気的生物処理」とは、分子状酸素が存在しないか、または分子状酸素が十分には存在しない状況下での生物処理を意味する。具体的には、活性汚泥を利用したメタン発酵などを挙げることができる。また、本明細書において「生物処理」とは、微生物等の生物的な作用を利用して、有機塩素化合物等の物質を分解または除去することをいう。具体的には、土壌還元法を挙げることができる。ここで、土壌還元法とは、土壌中の微生物を活性化させ、酸素を急速に消費させることで土壌中に強い還元性雰囲気を作り、生物的および化学的な脱塩素反応を促進させる方法である（特許第３４０１１９１号参照）。
本明細書において「修復」とは、汚染物質により汚染された環境を浄化して、環境中に含まれる汚染物質を目標値以下まで低減させることをいう。この目標値は、目的に応じて自由に定めることができるが、例えば、国や地方公共団体、民間団体等の規定する環境基準値とすることができる。
本明細書において「浄化対象（物）」とは、脱塩素反応に関与する微生物によって、浄化（修復）される対象を意味する。したがって、浄化対象物としては、有機塩素化合物に汚染された土壌や地下水を挙げることができる。
本明細書において「既存試料」とは、汚染現場から採取した浄化対象物のうち、過去に採取した試料を意味する。
本明細書において「供試試料」とは、汚染現場から採取した浄化対象物のうち、現在修復工事を計画するために採取した試料を意味する。
既存試料の分析
本発明は、既存試料を用いて、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量値と有機塩素化合物の分解処理試験より求めた浄化期間との相関を求める工程を含む。
本発明は、既存試料を用いて、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量値と有機塩素化合物の分解処理試験より求めた浄化期間との相関を求める工程を含む。
本明細書において嫌気的脱塩素反応に関与する微生物とは、嫌気性条件下における脱塩素反応に関与するすべての微生物が含まれ、直接的に脱塩素反応を行う微生物や、脱塩素反応の一工程に関係する微生物も含まれる。具体的には、Dehalococcoides属、Desulfitbacterium属、Desulfuromonas属、Dehalobacter属等に属する微生物を挙げることができる。
本発明において、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量は、公知のあらゆる方法により行うことができる。具体的には、ＭＰＮ法（最確数法）、ＰＣＲを利用して定量する方法、ＦＩＳＨ法（fluorescent in situ hybridization）によって、微生物を定量することができる。
本発明において求める微生物の定量値と浄化期間との相関は、公知のあらゆる方法によって求めることができる。例えば、最小２乗法を始めとする回帰分析によって求めることができる。さらに、求められた相関関係も、公知のあらゆる方法によって表わすことができ、例えば、一次関数や高次関数を始めとする関数の形に表現することもできる。
本発明においては、微生物の生育に関係する各種のパラメータを測定してもよい。各種パラメータとしては、具体的に、酸化還元電位、硫酸イオン濃度、第１鉄イオン濃度、硫酸イオン濃度、第２鉄イオン濃度等を挙げることができる。これの測定においては、公知のあらゆる方法を用いることができる。また、本発明において初期値とは、嫌気性生物処理を開始した当初の値をいう。なお、測定範囲は特に限定しないが、当該測定方法における検出限界を測定範囲の上限および下限とすることができる。
本発明においては、測定したパラメータの一定範囲ごとに、微生物の定量値と浄化期間との相関を求めることができる。このように相関を求めることにより、微生物の定量値と浄化期間とのより強い相関関係を得ることができ、この相関関係によって、修復期間を補正し、より正確な修復期間を予測することができる。
例えば、初期酸化還元電位が+100mV以上の場合、-100から+100mVの範囲の場合、および−100mV以下の場合に分けて、微生物の定量値と浄化期間との相関を求め、その相関関係に基づいて修復期間を予測することができる。また、初期硫酸イオン濃度が5mg/L以上の場合、および5mg/L未満の場合に分けて、微生物の定量値と浄化期間との相関を求め、その相関関係に基づいて修復期間を予測することができる。さらに、初期第１鉄イオン濃度が0.1mg/L以上の場合、および0.1mg/L未満の場合に分けて、微生物の定量値と浄化期間との相関を求め、その相関関係に基づいて修復期間を予測することができる。
供試試料の分析
本発明は、供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程を含む。
本発明は、供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程を含む。
供試試料中に存在する前記微生物とは、供試試料中の嫌気的脱塩素反応に関与する微生物をいう。嫌気的脱塩素反応に関与する微生物とは、既に説明したように、嫌気性条件下における脱塩素反応に関与するすべての微生物が含まれ、直接的に脱塩素反応を行う微生物や、脱塩素反応の一工程に関係する微生物も含まれる。具体的には、Dehalococcoides属、Desulfitbacterium属、Desulfuromonas属、Dehalobacter属等に属する微生物を挙げることができる。
また、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量は、既に説明したように、公知のあらゆる方法により行うことができる。具体的には、ＭＰＮ法（最確数法）、ＰＣＲを利用して定量する方法、ＦＩＳＨ法（fluorescent in situ hybridization）によって、微生物を定量することができる。
本発明においては、供試試料について、微生物の生育に関係する各種のパラメータを測定してもよい。各種パラメータとしては、具体的に、酸化還元電位、硫酸イオン濃度、第１鉄イオン濃度、硫酸イオン濃度、第２鉄イオン濃度等を挙げることができる。これらの測定においては、公知のあらゆる方法を用いることができる。また、本発明において初期値とは、嫌気性生物処理を開始した当初の値をいう。
上述のように、測定したパラメータの一定範囲ごとに、微生物の定量値と浄化期間との相関を求めることによって、微生物の定量値と浄化期間とのより強い相関関係を得ることができるため、より正確な修復期間を予測することが期待できる。したがって、本発明においては、微生物の成育に関係する各種のパラメータを測定することが好ましい。
修復期間は、既存試料において求めた「微生物の定量値」と「浄化期間」との関係と、供試試料において求めた「微生物の定量値」とから、予測または推定することができる。微生物の生育に関係する各種のパラメータを測定した場合、一定範囲ごとに求めた「微生物の定量値」と「浄化期間」との強い相関関係と、供試試料において求めた「微生物の定量値」および各種パラメータ値とから、修復期間を予測または推定することができる。
一方、必要となる微生物量を推定することもできる。すなわち、既存試料において求めた「微生物の定量値」と「浄化期間」との関係と、汚染現場を修復する「修復期間」とから、必要な「微生物量」を予測または推定することができる。この際も、微生物の生育に関係する各種のパラメータを測定することで、より正確な予測が可能になる。
また、上記の方法によって得られた推定「微生物量」によって、修復プロセスを制御することができる。すなわち、上記の方法で推定した「微生物量」よりも現場に存在する微生物量が少ない場合は、別途培養した嫌気的脱塩素反応に関与する微生物を添加して推定された「微生物量」を確保することにより、一定期間内に修復を完了させることができる。また、別途培養した微生物を添加する以外にも、修復現場の環境を微生物の生育に好ましい状態にして、環境中に推定された「微生物量」が存在するようにしてもよい。具体的には、微生物の栄養分となるような物質を添加して、微生物に好ましい生育環境を与えることができる。
さらに、別途培養した微生物や栄養分の添加は、公知のあらゆる方法によることができる。例えば、スプレー状や粉末状にして散布することができ、また、そのままの状態あるいは溶液状態あるいは担体に担持させた状態で散布することもできる。微生物や栄養分の保持担体としては、公知のあらゆる担体を使用することができる。例えば、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、寒天などのゲル状担体や、ゼオライト、多孔質ガラス、セラミックス、活性炭、シリカ、シリケートなどの粒子状担体などを挙げることができる。したがって、例えば、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の単離培養物あるいは集積培養物、または嫌気的脱塩素反応に関与する微生物を含んだ土壌、地下水あるいはコンポストを、修復対象物に添加することができる。
また、本発明においては、供試試料の硫酸イオンおよび第２鉄イオンが嫌気性微生物によって還元されるまでの期間の実測値、または供試試料の硫酸イオン濃度および第２鉄イオン濃度の初期実測値から両イオンが嫌気性微生物によって還元されるまでの期間の推定値によって、修復期間を補正してもよい。
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。
［実施例１］
各地より採取した塩素化エチレンによる汚染土壌を供試土壌とし、微生物による還元浄化処理試験と、浄化微生物であるDehalococcoides属の計数を行った。
［実施例１］
各地より採取した塩素化エチレンによる汚染土壌を供試土壌とし、微生物による還元浄化処理試験と、浄化微生物であるDehalococcoides属の計数を行った。
分解処理試験
供試土壌50ｇを130ml容のガラスバイアルに入れ、栄養培地（6g/Lグルコース、4g/L硝酸カリウム、0.5g/L塩化アンモニウム、0.5g/L酵母エキス）40mlおよび還元鉄粉100mgを添加後、窒素パージを施した。テフロン（登録商標）ライナー付きのブチルゴム栓で密封後、マイクロシリンジによりトリクロロエチレン（本明細書において、ＴＣＥと略すことがある）の飽和水を0.1ml注入した。バイアルは28℃の条件で反応させ、ヘッドスペースガス0.1mlを採取しFIDガスクロマトグラフによる分析を行った。分析ではトリクロロエチレンの他、シスジクロロエチレンの定量を行った。
供試土壌50ｇを130ml容のガラスバイアルに入れ、栄養培地（6g/Lグルコース、4g/L硝酸カリウム、0.5g/L塩化アンモニウム、0.5g/L酵母エキス）40mlおよび還元鉄粉100mgを添加後、窒素パージを施した。テフロン（登録商標）ライナー付きのブチルゴム栓で密封後、マイクロシリンジによりトリクロロエチレン（本明細書において、ＴＣＥと略すことがある）の飽和水を0.1ml注入した。バイアルは28℃の条件で反応させ、ヘッドスペースガス0.1mlを採取しFIDガスクロマトグラフによる分析を行った。分析ではトリクロロエチレンの他、シスジクロロエチレンの定量を行った。
浄化微生物の計数
（ＤＮＡの抽出）
氷上にて、2.0ml容マイクロテストチューブに供試土壌0.5 gを入れDNA抽出を行った。100 mMリン酸バッファー（pH8.0）を0.5 ml、直径0.1 mmのzirconia /silica beads（ジルコニア／シリカビーズ）を0.5 g、TNSE buffer（0.5 M Tris-HCl pH 8.0、0.1 M NaCl、10 % SDS、2 mM EDTA）を250μl添加後、3分間のミニビーズビーター（BIOSPEC PRODUCTS）処理を行った。回転数15,000 rpmで3 分間の遠心処理後、上清を新しいチューブに移し、40 ％量の7.5 M酢酸アンモニウムと混合後、4℃にて10 min間放置した。遠心処理後の上清を新しいチューブに回収し、２倍量のイソプロパノールを混合後10 min間放置した。室温にて回転数15,000 rpmで10分間の遠心処理後、上清を取り除き、沈殿物を80 ％エタノールにて2回洗浄した。沈殿物を遠心濃縮機で乾燥後、1 mg/ml濃度のRNaseを添加したTE buffer 50μlに懸濁した試料を40℃にて1時間処理したものを抽出DNAとした。
（ＤＮＡの抽出）
氷上にて、2.0ml容マイクロテストチューブに供試土壌0.5 gを入れDNA抽出を行った。100 mMリン酸バッファー（pH8.0）を0.5 ml、直径0.1 mmのzirconia /silica beads（ジルコニア／シリカビーズ）を0.5 g、TNSE buffer（0.5 M Tris-HCl pH 8.0、0.1 M NaCl、10 % SDS、2 mM EDTA）を250μl添加後、3分間のミニビーズビーター（BIOSPEC PRODUCTS）処理を行った。回転数15,000 rpmで3 分間の遠心処理後、上清を新しいチューブに移し、40 ％量の7.5 M酢酸アンモニウムと混合後、4℃にて10 min間放置した。遠心処理後の上清を新しいチューブに回収し、２倍量のイソプロパノールを混合後10 min間放置した。室温にて回転数15,000 rpmで10分間の遠心処理後、上清を取り除き、沈殿物を80 ％エタノールにて2回洗浄した。沈殿物を遠心濃縮機で乾燥後、1 mg/ml濃度のRNaseを添加したTE buffer 50μlに懸濁した試料を40℃にて1時間処理したものを抽出DNAとした。
（DNAの精製）
アガロース濃度1.2 ％にて抽出DNAの電気泳動を行った。電気泳動槽はMupid（コスモバイオ製）を使用し、抽出DNAの全量を泳動に供した。100 Vにて20 min間の通電後、DNAの蛍光象を観察しながら染色体DNAの先端部分（約4 kbのサイズに相当）にRECOCHIP（タカラ製）を挿入し、再び40 min間の通電を行った。泳動後RECO CHIPを付属のテストチューブに移し、10秒間の遠心処理によりDNAを回収し、滅菌水で50μlに調製した。PCR反応にはこの精製DNA溶液を1／10希釈したものを使用した。
アガロース濃度1.2 ％にて抽出DNAの電気泳動を行った。電気泳動槽はMupid（コスモバイオ製）を使用し、抽出DNAの全量を泳動に供した。100 Vにて20 min間の通電後、DNAの蛍光象を観察しながら染色体DNAの先端部分（約4 kbのサイズに相当）にRECOCHIP（タカラ製）を挿入し、再び40 min間の通電を行った。泳動後RECO CHIPを付属のテストチューブに移し、10秒間の遠心処理によりDNAを回収し、滅菌水で50μlに調製した。PCR反応にはこの精製DNA溶液を1／10希釈したものを使用した。
（PCRによる浄化微生物の定量評価）
PCR反応は酵素キットとしてFastStart DNA Mster SYBR Green I（ロッシュ製）を用い、定量装置としてLightCyclerTM（ロッシュ）を使用した。反応容器のガラスキャピラリーにキット添付のマスターミックス液を２μl、鋳型DNAとして被検DNAを５μl、最終濃度で3.5mMのMgCl2、0.5μMのプライマDhc‐fおよびDhc‐rを添加後キットに付属の滅菌水で20μlの液量に調製し、95℃10分間の熱変性の後、95℃‐15秒、58℃‐10秒、72℃‐20秒、86℃‐0秒からなるサイクルを45回行った。また、上記のPCR条件で、定法（例えば、「Molecular Cloning−A Laboratory Manual (Third Edition)」（Joseph Sambrook and David W. Russell著、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊）に記載の方法を参照）に従ってE.coli MV1184株より抽出・精製した染色体DNAを標準物質としてPCR反応あたり１×１０1、１×１０2、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０６ cell分添加した系を調製し、検量線を作成した。この場合、プライマとしてEcl62fおよびEcl238rを用いた。
PCR反応は酵素キットとしてFastStart DNA Mster SYBR Green I（ロッシュ製）を用い、定量装置としてLightCyclerTM（ロッシュ）を使用した。反応容器のガラスキャピラリーにキット添付のマスターミックス液を２μl、鋳型DNAとして被検DNAを５μl、最終濃度で3.5mMのMgCl2、0.5μMのプライマDhc‐fおよびDhc‐rを添加後キットに付属の滅菌水で20μlの液量に調製し、95℃10分間の熱変性の後、95℃‐15秒、58℃‐10秒、72℃‐20秒、86℃‐0秒からなるサイクルを45回行った。また、上記のPCR条件で、定法（例えば、「Molecular Cloning−A Laboratory Manual (Third Edition)」（Joseph Sambrook and David W. Russell著、Cold Spring Harbor Laboratory Press刊）に記載の方法を参照）に従ってE.coli MV1184株より抽出・精製した染色体DNAを標準物質としてPCR反応あたり１×１０1、１×１０2、１×１０3、１×１０4、１×１０5、１×１０６ cell分添加した系を調製し、検量線を作成した。この場合、プライマとしてEcl62fおよびEcl238rを用いた。
（PCRに用いたプライマ）
PCR反応に以下の配列のプライマを使用した。
Dehalococcoides属検出用プライマ
Dhc‐f（フォワード）：AAGGCGGTTTTCTAGGTTGTCAC（配列番号１）
Dhc‐r（リバース）：CGTTTCGCGGGGCAGTCT（配列番号２）
大腸菌検出用プライマ
Ecl62f（フォワード）：AACAGGAACGAGCTTGCTG（配列番号３）
Ecl238r（リバース）：ATGTGCCCAGATGGGATTAG（配列番号４）
PCR反応に以下の配列のプライマを使用した。
Dehalococcoides属検出用プライマ
Dhc‐f（フォワード）：AAGGCGGTTTTCTAGGTTGTCAC（配列番号１）
Dhc‐r（リバース）：CGTTTCGCGGGGCAGTCT（配列番号２）
大腸菌検出用プライマ
Ecl62f（フォワード）：AACAGGAACGAGCTTGCTG（配列番号３）
Ecl238r（リバース）：ATGTGCCCAGATGGGATTAG（配列番号４）
浄化微生物土壌初期濃度と浄化期間との関係
図１に、浄化微生物の土壌初期濃度と、TCEの分解試験において浄化完了までに要した期間との関係を示す。
図１に、浄化微生物の土壌初期濃度と、TCEの分解試験において浄化完了までに要した期間との関係を示す。
浄化微生物の初期濃度が1×103cell/ｇ‐土壌以上の土壌で、浄化反応が認められた。また、浄化微生物の初期濃度が高い土壌では浄化完了までに要する期間は短く、浄化微生物の初期濃度が低い土壌では浄化完了までに要する期間は長くなった。
本結果から、浄化微生物の初期濃度を分析することによって、浄化に要する期間を推定することができることが明らかになった。
浄化微生物土壌初期濃度および酸化還元電位と浄化期間との関係
上記の実施例において、供試土壌の初期酸化還元電位を測定した。酸化還元電位の測定にはセントラル科学UC‐23を用い、土壌環境分析法に準拠した手順で測定した。
上記の実施例において、供試土壌の初期酸化還元電位を測定した。酸化還元電位の測定にはセントラル科学UC‐23を用い、土壌環境分析法に準拠した手順で測定した。
図２に、浄化微生物の土壌初期濃度と、TCEの分解試験において浄化完了までに要した期間との関係を、供試土壌の初期酸化還元電位ごとにプロットした図を示す。
図２から理解できるように、一定の初期酸化還元電位ごとに分類すると、浄化微生物数と浄化期間との相関がより強くなることが明らかになった。
図２から理解できるように、一定の初期酸化還元電位ごとに分類すると、浄化微生物数と浄化期間との相関がより強くなることが明らかになった。
この結果から、供試土壌の初期酸化還元電位が+100mV以上の場合、−100から+100mVの範囲の場合、および−100mV以下の場合に分けて処理する事で、より相関関係の強い解析が可能となり、より精度の高い浄化期間の推定が可能となることが見出された。
硫酸イオンおよび第１鉄イオン濃度との相関
上記の実施例において、供試土壌の初期硫酸イオンおよび第１鉄イオン濃度を測定した。イオン濃度の測定には共立理化学研究所製、ラムダ8030を使用した。
上記の実施例において、供試土壌の初期硫酸イオンおよび第１鉄イオン濃度を測定した。イオン濃度の測定には共立理化学研究所製、ラムダ8030を使用した。
図３に、浄化微生物の土壌初期濃度と、TCEの分解試験において浄化完了までに要した期間との関係を、供試土壌の初期硫酸イオン濃度ごとにプロットした図を示す。
図３から理解できるように、一定の初期硫酸イオン濃度ごとに分類すると、浄化微生物数と浄化期間との相関がより強いことが明らかになった。
図３から理解できるように、一定の初期硫酸イオン濃度ごとに分類すると、浄化微生物数と浄化期間との相関がより強いことが明らかになった。
この結果から、供試土壌の初期硫酸イオン濃度が5mg/L以上の場合、および5mg/L未満の場合に分けて処理する事で、より相関関係の強い解析が可能となり、精度の高い浄化期間の推定が可能となることが見出された。
また、図４に、浄化微生物の土壌初期濃度と、TCEの分解試験において浄化完了までに要した期間との関係を、供試土壌の初期第１鉄イオン濃度ごとにプロットした図を示す。
図４から理解できるように、一定の初期第１鉄イオン濃度ごとに分類すると、浄化微生物数と浄化期間との相関がより強いことが明らかになった。
図４から理解できるように、一定の初期第１鉄イオン濃度ごとに分類すると、浄化微生物数と浄化期間との相関がより強いことが明らかになった。
この結果から、供試土壌の初期第１鉄イオン濃度が0.1mg/L以上、および0.1mg/L未満の場合に分けて処理する事で、より相関関係の強い解析が可能となり、精度の高い浄化期間の推定が可能となることが見出された。
硫酸イオン消費速度の測定による浄化期間の予測
硫酸イオン溶出濃度が5mg/L未満の土壌試料（0.0、0.0、0.7、3.3mg/L）を用いて、浄化微生物の定量とTCE分解試験とを行った。
硫酸イオン溶出濃度が5mg/L未満の土壌試料（0.0、0.0、0.7、3.3mg/L）を用いて、浄化微生物の定量とTCE分解試験とを行った。
図５に、浄化微生物の定量値（x）とTCE浄化までに要した日数（y）をプロットした図を示す。図５から、浄化微生物数と浄化期間との関係を示す近似式（１）
y = −6.8Ln(x) + 122
が導かれた。
y = −6.8Ln(x) + 122
が導かれた。
硫酸イオン溶出濃度が比較的高い土壌（22、25、39mg/L）を用い、TCE分解試験を行った。分解試験中のバイアルから、経日的に上澄液を0.1mL採取し硫酸イオンの濃度測定を行った。
その結果、硫酸イオン初期濃度が22mg/Lの土壌では試験開始後13日間、硫酸イオン濃度の減少は認められず、その後8日間で検出限界以下となった。硫酸イオン初期濃度が25および39mg/Lの土壌の場合、それぞれ17日および27日間の定常状態の後、7日および13日間で検出限界以下の濃度となった。これより、硫酸イオンの消費が始まるまでの日数を求める近似式（２）、および硫酸イオンの平均消費速度を求めたところ、それぞれy = 0.69x−0.7（x：硫酸イオン初期濃度）、および3.1mg/L/dayだった。
9種類の供試土壌について、浄化微生物の定量およびTCE分解試験を行った。表１に結果を示す。なお、浄化微生物の初期分析値と上記の近似式（１）から浄化期間の予測日数を算出し、推定浄化期間１とした。また、硫酸イオン溶出濃度の初期値、上記近似式（２）、および硫酸イオンの平均消費速度から硫酸イオンの消費期間を算出し、前記の推定浄化期間１に硫酸イオン消費期間を加えた日数を推定浄化期間２とした。
表１において、浄化期間の実測値と推定浄化期間とを比較すると、硫酸イオン溶出濃度が5mg/L未満の土壌試料で求めた近似式による推定浄化期間に、硫酸イオンの消費期間を加算することによって、より正確な浄化期間の推定が可能となることが明らかになった。
浄化期間と栄養剤の投入量の制御
（有機物消費量の確認試験）
供試土壌1.0Lを2L容のステンレス製の容器に入れ、栄養培地（12g/Lグルコース、5g/L硝酸カリウム、1g/L塩化アンモニウム、1g/L酵母エキス）250mlおよびトリクロロエチレンの飽和水を30ml添加後、よく攪拌した。28℃の条件で反応させ経日的に土壌の一部（10g）を採取し、土壌から溶出する有機物量を測定した。有機物量の測定は土壌10gに蒸留水を20mL加え、５分しんとう後、上澄液を0.2μLのメンブレンフィルターでろ過し、全有機物質量分析装置（島津TOC5000）にて分析した。
図６に、処理期間と有機物の消費量との関係を示す。
（有機物消費量の確認試験）
供試土壌1.0Lを2L容のステンレス製の容器に入れ、栄養培地（12g/Lグルコース、5g/L硝酸カリウム、1g/L塩化アンモニウム、1g/L酵母エキス）250mlおよびトリクロロエチレンの飽和水を30ml添加後、よく攪拌した。28℃の条件で反応させ経日的に土壌の一部（10g）を採取し、土壌から溶出する有機物量を測定した。有機物量の測定は土壌10gに蒸留水を20mL加え、５分しんとう後、上澄液を0.2μLのメンブレンフィルターでろ過し、全有機物質量分析装置（島津TOC5000）にて分析した。
図６に、処理期間と有機物の消費量との関係を示す。
（最少有機物必要量の推定）
前記の浄化微生物定量手法により供試土壌の浄化微生物量を分析した結果、7.9×104cells/g土壌だった。また、供試土壌のＯＲＰ（酸化還元電位）は−140mVであった。
前記の浄化微生物定量手法により供試土壌の浄化微生物量を分析した結果、7.9×104cells/g土壌だった。また、供試土壌のＯＲＰ（酸化還元電位）は−140mVであった。
図２に示した浄化微生物数と浄化期間との関係、および上記の測定結果から、該供試土壌における浄化予想期間を推定したところ、約40日だった。さらに、図６に示した処理期間と有機物の消費量との関係、および上記の測定結果から、該供試土壌において浄化に必要となる最少有機物量を推定したところ、0.7kg/m3土壌だった。
（シス‐ジクロロエチレンの分解試験）
供試土壌50ｇを130ml容のガラスバイアルに入れたものを3本準備し、栄養培地（12g/Lグルコース、5g/L硝酸カリウム、1g/L塩化アンモニウム、1g/L酵母エキス）をそれぞれに1.2mL（0.5kg/m3土壌に相当）、1.6mL（0.7kg/m3土壌に相当）および4.7mL（2.0kg/m3土壌に相当）ずつ添加した。窒素パージを施し、テフロン（登録商標）ライナー付きのブチルゴム栓で密封後、マイクロシリンジによりシス‐ジクロロエチレン（本明細書においてｃ−DCEと略されることがある）の飽和水を0.1ml注入した。バイアルは28℃の条件で反応させ、ヘッドスペースガス0.1mlを採取しFIDガスクロマトグラフによる分析を行った。
供試土壌50ｇを130ml容のガラスバイアルに入れたものを3本準備し、栄養培地（12g/Lグルコース、5g/L硝酸カリウム、1g/L塩化アンモニウム、1g/L酵母エキス）をそれぞれに1.2mL（0.5kg/m3土壌に相当）、1.6mL（0.7kg/m3土壌に相当）および4.7mL（2.0kg/m3土壌に相当）ずつ添加した。窒素パージを施し、テフロン（登録商標）ライナー付きのブチルゴム栓で密封後、マイクロシリンジによりシス‐ジクロロエチレン（本明細書においてｃ−DCEと略されることがある）の飽和水を0.1ml注入した。バイアルは28℃の条件で反応させ、ヘッドスペースガス0.1mlを採取しFIDガスクロマトグラフによる分析を行った。
図７に、有機物供給量を変化させた場合の、処理日数とｃ−ＤＣＥ濃度との関係を示す。有機物添加量が0.5kg/m3土壌に相当する条件では、反応開始から約30日でc-DCEの分解は停止し、目標値を達成する事はできなかった。これに対し、最少必要量の有機物添加量と予想された0.7kg/m3土壌に相当する条件では、反応開始後約40日間でc-DCEを目標値まで分解することができた。また、有機物添加量が2.0kg/m3土壌に相当する条件では、0.7kg/m3土壌に相当する条件と同様の挙動を示し、約40日間でc-DCEを目標値まで分解することができた。
以上に説明したように、浄化対象物に含まれる浄化微生物の定量値から修復期間を推定し、また、浄化対象物中における栄養剤の消費速度から浄化対象物に投入する栄養剤の最適量を決定する事ができた。
［実施例２］
集積培養体添加実験
（浄化微生物の集積培養処理）
トリクロロエチレン（TCE）の分解が確認された土壌1.0Lを2L容のステンレス製の容器に入れ、栄養培地（12g/Lピルビン酸ナトリウム、5g/L硝酸カリウム、1g/L塩化アンモニウム、1g/L酵母エキス）500ml、還元鉄粉3gおよびTCEの飽和水を30ml添加後、よく攪拌した。28℃の条件で反応させ、30日後、容器上部の水分を除去し、再び栄養培地500mlおよびTCEの飽和水を30ml添加後、よく攪拌した。30日毎に培地およびTCE飽和水を再添加する操作を5回繰り返すことで、浄化微生物の集積培養体を作成した。
集積培養体添加実験
（浄化微生物の集積培養処理）
トリクロロエチレン（TCE）の分解が確認された土壌1.0Lを2L容のステンレス製の容器に入れ、栄養培地（12g/Lピルビン酸ナトリウム、5g/L硝酸カリウム、1g/L塩化アンモニウム、1g/L酵母エキス）500ml、還元鉄粉3gおよびTCEの飽和水を30ml添加後、よく攪拌した。28℃の条件で反応させ、30日後、容器上部の水分を除去し、再び栄養培地500mlおよびTCEの飽和水を30ml添加後、よく攪拌した。30日毎に培地およびTCE飽和水を再添加する操作を5回繰り返すことで、浄化微生物の集積培養体を作成した。
この集積培養体について、前記の浄化微生物定量手法によって分析した結果、浄化微生物量は9.5×10８cells/g土壌だった。だだし、本実施例ではPCRプライマとしてDfi-fおよびDfi-rを用い、浄化微生物としてDesulfitobacterium dehalogenansの定量を行った。
（PCRプライマ）
Desulfitobacterium dehalogenans検出用プライマ
Dfi‐f（フォワード）：TCTTCAGGGACGAACGGCAG（配列番号５）
Dfi‐r（リバース）：CATGCACCACCTGTCTCAT（配列番号６）
Desulfitobacterium dehalogenans検出用プライマ
Dfi‐f（フォワード）：TCTTCAGGGACGAACGGCAG（配列番号５）
Dfi‐r（リバース）：CATGCACCACCTGTCTCAT（配列番号６）
（浄化期間の設定）
汚染現場Ａより土壌を採取し、供試土壌とした。この供試土壌について、ORP（酸化還元電位）および浄化微生物量を分析した結果、ORPは+120mV、浄化微生物量は検出限界以下（1.5×10２cells/g土壌）だった。
汚染現場Ａより土壌を採取し、供試土壌とした。この供試土壌について、ORP（酸化還元電位）および浄化微生物量を分析した結果、ORPは+120mV、浄化微生物量は検出限界以下（1.5×10２cells/g土壌）だった。
本供試土壌における浄化完了期間を50日および90日に設定し、図２に示した浄化微生物数と浄化期間の関係から、本供試土壌で必要となる浄化微生物の濃度を推定したところ、それぞれ3.0×10６cells/g土壌および2.0×10４cells/g土壌だった。
（シス−ジクロロエチレンの分解試験）
供試土壌50ｇを130ml容のガラスバイアルに入れたものを3本準備し、栄養培地（6g/Lピルビン酸ナトリウム、4g/L硝酸カリウム、0.5g/L塩化アンモニウム、0.5g/L酵母エキス）40mlおよび還元鉄粉100mgを添加後、それぞれのバイアルに前記の集積培養体を160mg添加（3.0×10６cells/g土壌に相当）、7mg添加（2.0×10４cells/g土壌に相当）および無添加のものを調整した。バイアルに窒素パージを施し、テフロン（登録商標）ライナー付きのブチルゴム栓で密封後、マイクロシリンジによりシス−ジクロロエチレンの飽和水を0.1ml注入した。バイアルは28℃の条件で反応させ、ヘッドスペースガス0.1mlを採取しFIDガスクロマトグラフによる分析を行った。
供試土壌50ｇを130ml容のガラスバイアルに入れたものを3本準備し、栄養培地（6g/Lピルビン酸ナトリウム、4g/L硝酸カリウム、0.5g/L塩化アンモニウム、0.5g/L酵母エキス）40mlおよび還元鉄粉100mgを添加後、それぞれのバイアルに前記の集積培養体を160mg添加（3.0×10６cells/g土壌に相当）、7mg添加（2.0×10４cells/g土壌に相当）および無添加のものを調整した。バイアルに窒素パージを施し、テフロン（登録商標）ライナー付きのブチルゴム栓で密封後、マイクロシリンジによりシス−ジクロロエチレンの飽和水を0.1ml注入した。バイアルは28℃の条件で反応させ、ヘッドスペースガス0.1mlを採取しFIDガスクロマトグラフによる分析を行った。
図８に、集積培養体の添加量を変化させた場合の、シス−ジクロロエチレンの分解試験の結果を示す。試験の結果、集積培養体の添加量が3.0×10６cells/g土壌および2.0×10４cells/g土壌に相当する条件において、それぞれ反応開始後約53日および約88日間で目標値までシス−ジクロロエチレンを分解する事ができた。また、集積培養体無添加の条件では分解は殆ど認められなかった。
以上の結果から、浄化対象毎に汚染物質の浄化期限を設定する場合、浄化微生物数と浄化期間の関係から、処理対象物中に必要となる浄化微生物の濃度を推定し、推定した微生物濃度になるよう浄化対象物に浄化微生物を添加する事によって、定められた浄化期間で汚染物質を浄化することが可能であることが確認された。
Claims (10)
- 有機塩素化合物による汚染を嫌気的生物処理によって修復するために必要な期間を推定する方法であって、
既存試料において、嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の定量および有機塩素化合物の分解処理試験を行い、微生物の定量値と修復期間との相関を求める工程、および
供試試料中に存在する前記微生物を定量し、前記の相関を基にして供試試料を修復するために必要な期間を推定する工程、または、設定した修復期間内に修復を完了するために必要な前記微生物量を推定する工程を含む上記方法。 - 前記微生物が、Dehalococcoides属、Desulfitbacterium属、Desulfuromonas属、またはDehalobacter属などの脱塩素反応を触媒する嫌気性細菌である、請求項１に記載の方法。
- 前記嫌気的生物処理が土壌還元法である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記供試試料中に存在する微生物の定量を、1×103cells/ｇ‐土壌以上の範囲で行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 既存試料において、既存試料の初期酸化還元電位が+100mV以上の場合、-100から+100mVの範囲の場合、および−100mV以下の場合に分けて、微生物の定量値と修復期間との相関を求め、
供試試料の初期酸化還元電位をさらに測定し、前記の相関を基にして、修復期間または微生物量を推定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。 - 既存試料において、既存試料の初期硫酸イオン濃度が5mg/L以上の場合、および5mg/L未満の場合に分けて、微生物の定量値と修復期間との相関を求め、
供試試料の初期硫酸イオン濃度をさらに測定し、前記の相関を基にして、修復期間または微生物量を推定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。 - 既存試料において、既存試料の初期第１鉄イオン濃度が0.1mg/L以上の場合、および0.1mg/L未満の場合に分けて、微生物の定量値と修復期間との相関を求め、
供試試料の初期第１鉄イオンの濃度をさらに測定し、前記の相関を基にして、修復期間または微生物量を推定する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 - 供試試料の硫酸イオンおよび第２鉄イオンが嫌気性微生物によって還元されるまでの期間の実測値、または供試試料の硫酸イオン濃度および第２鉄イオン濃度の初期実測値から両イオンが嫌気性微生物によって還元されるまでの期間の推定値によって、前記修復期間を補正する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって、供試試料に含まれる微生物の定量値から修復期間を推定する工程、
微生物による浄化を促進するための栄養剤の消費速度を求める工程、および
前記修復期間の推定値と栄養剤の消費速度から浄化対象物に投入する栄養剤の最適量を決定する工程を含む、修復プロセスの制御方法。 - 請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって、設定した修復期間内に修復するために必要となる嫌気的脱塩素反応に関与する微生物量を決定する工程、および
嫌気的脱塩素反応に関与する微生物の単離培養物あるいは集積培養物、または嫌気的脱塩素反応に関与する微生物を含んだ土壌、地下水あるいはコンポストを、該微生物の濃度決定工程で求めた微生物濃度となるように浄化対象物に添加する工程を含む、修復期間の制御方法。
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