KR101813154B1 - 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법 - Google Patents

토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법에 관한 것으로, 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 분해속도 측정부; 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 상관성 연산부; 및 상관성 연산부에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 인자값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 정화능 평가 모듈을 포함한다.
이와 같은 본 발명은, 토양의 유류오염에 대한 위해성 평가기법을 대체하여 현장에서도 효율적으로 사용할 수 있는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법을 제공한다.

Description

토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법{APPARATUS AND METHOD FOR ASSESSING NATURAL PURIFICATION OF OIL POLLUTION}
본 발명은 토양의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 다양성 지표를 이용하여 토양의 유류오염 정화능력을 평가하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법에 관한 것이다.
급격한 산업화 및 도시화, 국민의 생활수준 향상 등으로 우리나라는 1980년대 이후 주유소나 유류저장 탱크 등의 유류저장 시설 및 유류 사용량이 급격히 증가 되었다. 주유소가 1990년 대비 현재 400% 이상 증가 되는 등(Shin et al., 2014), 전국에 유류활용 시설이 널리 퍼져 있으며 이에 따라 누출 등의 원인으로 인한 유류오염이 도로 및 도시 지역 토양의 대표적인 비점오염으로 인식되었다.
토양의 유류오염은 지하수로 오염이 확산 될 수 있고, 매체의 특성상 대기 및 수질오염에 비해 정화하는데 많은 시간 및 막대한 비용이 소요된다. 이에 따라 미국 등 선진국들은 위해성 평가기법을 사용, 유류 오염된 토양의 위해성 및 토양의 정화능력을 평가하여 유류오염 정화의 기술을 상업적 처리기술 또는 자연 저감기법으로 선정하는 등, 비용효율적인 유류오염처리를 위하여 노력하고 있다(Yun et al., 2003).
또한 위해성 평가기법을 통해 토양의 오염정화능력이 평가되면, 토양의 정화능력을 고려한 절/성토 설계 등 새로운 친환경 건설기술 창출에 기여할 것이므로, 토양의 유류오염분해 능력 평가는 미래 건설 분야에서 필요하다.
그러나 광범위한 지역에 오염되는 유류오염의 특성상, 마이크로코즘을 이용해 유류오염토양의 분해능 및 분해속도를 추정하여 위해성을 평가하는 위해성 평가기법은 시간적, 경제적 제약사항이 많다.
이를 해결하기 위한 대체 방안으로 미생물 다양성을 이용한 토양의 정화능력 추정 연구가 떠오르고 있다. Kim et al. (2014)는 저영향 개발기법이 적용된 토양을 분석하여 미생물 다양성을 오염정화능력의 지표로 제시한 바 있고, Johnson et al. (2015)은 하수처리장의 미생물 다양성들을 분석한 결과, 다양성과 오염물질 제거와 같은, 미생물의 기능(Multifuntionality)간에 상관성이 있음을 밝힌 바 있다. 그러나 토양에서의 미생물 다양성과 유류오염 정화능력 간의 상관성 및 정화능력 추정기법에 대한 연구는 부족한 실정이다.
또한, 우리나라의 대표적인 토양 비점오염원으로 알려진 유류오염을 정화하는 토양의 능력은 토양 자원의 기능적 가치 평가에서 매우 유의하므로, 절/성토 설계 등의 친환경 건설기술 측면에서 토양의 유류오염정화능력을 평가하는 것은 중요하다. 그러나 상술한 바와 같이, 위해성 평가기법으로 알려진 기존의 토양 유류오염정화능력 평가 기법은 경제적, 시간적인 제약이 많아 광범위한 지역에 적용하기 어렵다는 문제점이 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-1179673호(2012.08.29) 대한민국 등록특허공보 제10-1198143호 (2012.10.31)
본 발명에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법은 다음과 같은 해결과제를 가진다.
첫째, 본 발명은 토양의 유류오염에 대한 위해성 평가기법을 대체하여 현장에서도 효율적으로 사용할 수 있는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법을 제공하고자 함이다.
둘째, 본 발명은 미생물 다양성 지표를 이용하여 유류오염물질 분해속도 등과 같은 유류오염 정화능력을 추정하고 평가할 수 있는 자연 토양 유류오염의 정화능 평가장치 및 평가방법을 제공하고자 함이다.
본 발명의 해결과제는 이상에서 언급한 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 과제를 해결하고자 하는 본 발명의 제1 특징은, 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치로, 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 분해속도 측정부; 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 상관성 연산부; 및 상관성 연산부에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 인자값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 정화능 평가 모듈을 포함한다.
여기서, 상기 분해속도 측정부는, 마이로코즘 실험에 사용되는 용기의 헤드스페이스 내부에 채워진 기체를 측정하는 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출기(gas chromatography-flame ionization detector:GC-FID)를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 기체는, 톨루엔(C7H8) 가스를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 상관성 분석부는, 상기 분해속도 인자는 1mg 셀 당 톨루엔 분해속도를 나타내는 비분해 속도(Vmax) 데이터와, 미생물 다양성 인자는 1g 토양에 존재하는 16S 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness)과, DI 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness) 데이터 중 적어도 어느 하나의 상관성을 분석하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 상관식은,
Figure 112016060785580-pat00001
(여기서, Xo는 토양의 미생물 농도(mg cell/g soil)이고, Ks는 토양의 반포화계수(half saturation coefficient)(mg/cell)이고, S는 t 시간 후 톨루엔 농도이고, So는 초기 톨루엔 농도이고, Vmax는 분해속도를 세균세포로 나눈 비분해속도(mg-toluene/mg cell/hr)이고, L은 지연시간(lag time)(hr)이다.) 와 같은 식을 만족하는 것이 바람직하다.
더하여, 상기 정화능 평가 모듈은, 시료 토양의 자연정화가 가능한 토양인지 여부를 평가하고, 목표 농도까지 유류오염 물질을 정화하는데 소요되는 시간을 추정하는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명의 제2 특징은, 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법으로, 상술한 자연 정화능 평가장치를 이용하여, (a) 분해속도 측정부가 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 단계; (b) 상관성 연산부가 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 단계; 및 (c) 정화능 평가 모듈이 상관성 연산부에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 단계를 포함한다.
여기서, 상기 (a) 단계는, (a1) 용기에 시료 토양과 유류오염물질이 함유된 미디어를 넣고 배양시키는 단계; (a2) 용기의 헤드스페이스 내부에 채워진 기체를 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출기(gas chromatography-flame ionization detector:GC-FID)로 측정하여 유류오염 분해속도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 미디어는 95 mg/L 내지 125 mg/L의 농도를 갖는 톨루엔(C7H8)을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (b) 단계는, (b1) 시료토양의 분해속도 인자로 비분해속도(specific degradation) 데이터를 산출하고, 미생물 다양성 인자로 1g 토양에 존재하는 16S 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness)과, DI 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness) 데이터 중 적어도 어느 하나를 획득하는 단계; 및 (b2) 산출된 비분해속도 데이터와 다양성 인자 데이터를 통해 피어슨 상관계수 및 유의확률값을 획득하여 상관식을 도출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 상관식은,
Figure 112016060785580-pat00002
(여기서, Xo는 토양의 미생물 농도(mg cell/g soil)이고, Ks는 토양의 반포화계수(half saturation coefficient)(mg/cell)이고, S는 t 시간 후 톨루엔 농도이고, So는 초기 톨루엔 농도이고, Vmax는 분해속도를 세균세포로 나눈 비분해속도(mg-toluene/mg cell/hr)이고, L은 지연시간(lag time)(hr)이다.) 와 같은 식을 만족하는 것이 바람직하다.
더하여, 상기 지연시간(L)을 산출하는 식은,
Figure 112016060785580-pat00003
(x는 "Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수/16S rRNA 유전자수"를 나타내고, α는 상관계수를 나타낸다.) 와 같은 식을 만족하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (d) 단계는, 정화능 평가 모듈이 상기 상관식으로부터 목표 처리시간 내 목표 정화 농도 만족을 위한 기준 토착 미생물 농도(X')를 획득하고, 현장 시료 토양의 미생물 농도(X)가 획득된 기준 토착 미생물 농도(X')보다 높으면 자연정화가 가능한 토양으로 판단하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 (d) 단계는, 정화능 평가 모듈이 상기 상관식의 토양의 미생물 농도(X0)에 현장 시료 토양 미생물 농도(X)를 대입하고 초기 유류오염물질 농도 및 목표 정화 농도를 대입하여, 목표 정화 농도까지 시료 토양이 유류오염물질을 정화하는데 소요되는 시간을 산출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
그리고, 본 발명의 제3 특징은, 하드웨어와 결합되어, 청구항 7의 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법을 실행시키기 위하여 컴퓨터가 판독 가능한 매체에 저장된 컴퓨터프로그램이다.
본 발명에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법은 다음과 같은 효과를 가진다.
첫째, 시간 및 경제성이 효율적인 T-RFLP(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism)을 통해 16S rRNA 유전자 기반의 미생물 다양성을 분석하고 이를 통해 토양의 유류오염 정화능력을 평가할 수 있는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법을 제공한다.
둘째, 본 발명은 미생물 다양성 지표를 이용하여 유류오염물질 분해속도 등과 같은 토양의 유류오염 정화능력을 추정하고 평가할 수 있는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법을 제공한다.
셋째, 본 발명은 미생물 다양성 분석을 통해 넓은 지역 토양의 유류오염 정화능력을 지도화할 수 있을 뿐만 아니라, 유류오염 토양의 정화기법 선정 및 오염정화능력을 이용한 건설 산업의 친환경적 설계 등에 활용되는 등 공학적으로 광범위한 분야에 활용할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치의 블록 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법의 흐름을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명에 있어서, 분해속도(Degradation Rate;DR)을 세균세포 무게로 나눈 비분해속도(specific degradation rate)(V max , mg-toluene/mg cell/hr)은 저영향개발기법을 적용한 토양(시료 1~3번)이 일반 나대지 토양(시료 4~10번)보다 높은 결과를 보이는 것을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 있어서, 미생물 다양성 대표성이 높고 피어슨(Pearson) 상관계수 및 p값(p-value)에서도 상관관계가 더 높은 것으로 나타난 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)를 미생물 다양성인자로 선정하여 V max 와 회귀분석을 진행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명에 있어서, 결과 지연시간(lag time)과 x(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수(ARHD 유전자수)/16S rRNA 유전자수)의 역수간에 상관성이 있어 회귀분석을 한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에 있어서, 토양의 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)와 초기 톨루엔 농도(S 0 )별로 정화에 필요한 토착 미생물 농도 X를 나타낸 값을 그래프화 한 것이다.
본 발명의 추가적인 목적들, 특징들 및 장점들은 다음의 상세한 설명 및 첨부도면으로부터 보다 명료하게 이해될 수 있다.
본 발명의 상세한 설명에 앞서, 본 발명은 다양한 변경을 도모할 수 있고, 여러 가지 실시 예를 가질 수 있는바, 아래에서 설명되고 도면에 도시된 예시들은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "연결되어" 있다거나 "접속되어" 있다고 언급된 때에는, 그 다른 구성요소에 직접적으로 연결되어 있거나 또는 접속되어 있을 수도 있지만, 중간에 다른 구성요소가 존재할 수도 있다고 이해되어야 할 것이다. 반면에, 어떤 구성요소가 다른 구성요소에 "직접 연결되어" 있다거나 "직접 접속되어" 있다고 언급된 때에는, 중간에 다른 구성요소가 존재하지 않는 것으로 이해되어야 할 것이다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도는 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 명세서에 기재된 "...부", "...유닛", "...모듈" 등의 용어는 적어도 하나의 기능이나 동작을 처리하는 단위를 의미할 수 있다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치의 블록 구성을 나타낸 도면이고, 도 2는 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법의 흐름을 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치는, 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 분해속도 측정부(110); 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 상관성 연산부(130); 및 상관성 연산부(130)에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 인자값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 정화능 평가 모듈(150)을 포함하여 구성된다.
그리고, 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법은, 상술한 자연 평가능 평가장치를 이용하여, (a) 분해속도 측정부(110)가 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 단계; (b) 상관성 연산부(130)가 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 단계; 및 (c) 정화능 평가 모듈(150)이 상관성 연산부(130)에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 단계를 포함하여 구성된다.
여기서, 마이크로코즘(Microcosm)은 통제된 실험 조건 하에서 생태계의 일부분을 모사하여 자연 현상을 연구하기 위한 기법으로서, 생태계 내 나노물질의 거동과 통합적인 독성영향 평가 등을 가능하게 하는 기법이다.
이처럼 본 발명의 실시예에서는 유류오염물질로 톨루엔을 선정하여 쉽고 간편하게 측정할 수 있는 토양의 미생물 다양성 지표를 이용하여 토양의 유류오염 정화능력을 평가할 수 있는 시스템 및 방법을 제안한다.
즉, 본 발명의 실시예에서는 다양성 지표 중 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)와 토양의 정화능력 인자인 비분해속도(V max :Specific Degradation Rate)간의 상관성을 분석하고 두 인자 간의 상관식을 도출하고, 이 상관식을 미하엘리스-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetics)에 적용하여 미생물 다양성 인자만으로 토양의 유류오염 정화능력을 평가할 수 있는 시스템 및 방법을 제시한다.
이와 같은 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가 시스템 및 방법을 통해, 경제적 및 시간적 효율성을 높여 토양의 유류오염 정화능력을 평가할 수 있으며, 친환경 건설기술분야와 같은 다양한 공학적 분야에 광범위하게 활용될 수 있다.
이하에서 각 단계별로 본 발명의 실시예에 따른 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법을 상세히 설명하기로 한다.
마이크로코즘 실험을 통한 분해속도 측정단계((a) 단계)
(a) 단계는, 분해속도 측정부(110)가 마이크로코즘을 이용하여 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 단계이다.
본 발명의 실시예에서 적용된 마이크로코즘 실험은 미생물 다양성이 다양한 토양 10가지의 톨루엔 분해 속도를 측정하는 것을 목표로 진행하였다. 실험에 사용된 토양은 충청남도 천안시 신도시개발지역 인근에 파일럿(pilot) 규모로 설치한 저영향개발기법 실험 토양 3종(시료 1~3번), 인근 나대지 토양 2종(시료 4~5번), 인천시 강화도 길상면 갯벌 토양 2종(시료 6, 7번), 서울시 서대문구 신촌로 공사현장 토양(시료 8번), 서울시 연세대학교의 잔디밭(시료 9번), 서울시 서대문구에 위치한 안산 토양(시료 10번)이다.
각 토양을 이용한 마이크로코즘 실험은 160ml 세럼병(serum bottle)에 토양 16g(10ml bulk)과 미디아(media) 50ml를 넣고 공기 100ml의 헤드스페이스(headspace)로 구성하였다. 톨루엔의 완전 호기성 분해에 필요한 산소의 양은 1mol 톨루엔(C7H8) 당 9mol 산소로(C7H8+9O2 → 7CO2+4H2O, (Yu et al.,2001)) 헤드스페이스(headspace)의 공기로 필요 산소를 충당할 수 있음을 알 수 있다.
미디아(media)에는 대책기준 농도(60mg/L,)보다 높은 톨루엔 110±14.1mg/L를 주입하였으며 미량원소(trace element solution)로 (mg/L) NH4Cl (100), KH2PO4 (700), K2HPO4 (1,000), NaCl (10), CaCl2 (5), MgCl2 (10), CuCl22H2O (0.0392), ZnCl2 (0.1363), NiCl2 (0.013), FeCl24H2O (0.7016), AICi3 (0.1106), MnCl24H2O(0.2807), CoCi26H2O (0.0382), Na2MoO42H2O (0.0254), H3BO3 (0.0382), Na2SO4 (0.1420), 비오틴(biotin) (0.02), 엽산(folic acid) (0.02), 피리독신(pyridoxine) HCl (0.1), 리보플라빈(riboflavin) (0.05), 티아민(thiamine) (0.05), 니코틴산(nicotinic acid) (0.05), 판토텐산(pantothenic acid) (0.05), 비타민(vitamin) B12 (0.001), p아미노벤조산(p-aminobenzoic acid) (0.05를 첨가하였다(Alvarez and Vogel, 1991).
배양 조건은 25℃의 온도에서 150rpm으로 교반하였으며 각 실험은 모두 duplicate로 진행하였다. 토양의 정화능력으로 인한 톨루엔 농도 변화는 실험 구성 후 12시간의 교반을 통해 헤드스페이스(headspace) 내 톨루엔의 농도를 평형 상태에 도달하게 한 후 헤드스페이스(headspace)의 기체를 분해속도 측정부(110)의 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출기(gas chromatography-flame ionization detector;GC-FID)로 주기적으로 분석하여 측정하였다.
가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출기(GC-FID)의 검출기(Detector) 온도는 200℃이며 칼럼(column)은 19091P-QO4(30m X 0.320mm X 20.0um)을 사용하였고 캐리어가스(carrier gas)는 질소 가스를 1.7ml/min의 유량(flow rate)으로 사용하였다. 인젝트(Inject)의 온도는 200℃로, 오븐(oven)의 온도는 100℃에서 2분 고정 후 10℃/min의 속도로 225℃까지 올린 후 1분 고정 후 측정하였다.
상관성 도출단계((b) 단계)
(b) 단계는 상관성 연산부(130)가 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양선 인자들 간의 상관성을 분석하고 산관식을 도출하는 단계이다.
미생물 다양성 분석
본 발명의 실시예에서 적용된 각 토양 시료는 FastDNA Spin Kit for Soil(MP Bio 101, CA, USA)를 이용하여 DNA를 추출한 후 미생물의 정량적 분석을 위한 qPCR(quantitative-polymerase chain reation)과 미생물 다양성 분석을 위한 T-RFLP(Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism)을 진행하였다.
qPCR은 사이버 그린(SYBR Green) 방법을 사용하였으며, 프라이머(primer)는 전체 박테리아를 대상으로 한 Bac 1055F(ATGGYTGTCGTCAGCT), Bac 1392R(ACGGGCGGTGTGTAC)을 첨가하였다.
T-RFLP은 16S rRNA 유전자와 다륜성 방향족 탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbon)를 분해하는 유전자인 방향족 2산화효소 유전자(aromatic ring hydroxylating dioxygenase gene: ARHD)(Zhou et al.,2006)를 대상으로 PCR을 수행한 후 진행하였다.
16S rRNA 유전자 분석에 사용된 프라이머(primer)는 형광물질이 부착된 27F-FAM(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)를 사용하였으며, 방향족 2산화효소 유전자(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase gene) 분석에 사용한 프라이머(primer)는 88F(TGCASSTWTCACGGSTG), 300R(CTCGACTCCGAGCTTCCAGTT)이다.
증폭된 PCR산물에 HhaI 제한효소를 반응시킨 제한 효소 반응 실험을 진행하였으며, 이후 군집구조 분석은 Microbial Community Analysis(http://mica.ibest.uidaho.edu)의 database를 통해 분석하였다.
상관성 분석
본 발명의 실시예에서 분해 특성과 미생물 다양성간의 상관관계를 알아보기 위해 분해 특성으로는 톨루엔 분해속도(DR, mg-toluene/g-soil/hr), 1mg cell 당 톨루엔 분해속도를 나타내는 비분해속도(specific degradation rate)(V max , mg-toluene/mg-cell/hr)를 분석하였으며 미생물 다양성 인자로는 1g 토양 당 세균세포 무게(mg cell, mg-cell/g-soil), 16S rRNA 유전자(16S)의 샤논지수(Shannon index), 풍부성(Richness), 균등성(Evenness), 방향족 2산화효소(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase) 유전자(DI)의 샤논지수(Shannon index), 풍부성(Richness), 균등성(Evenness)을 분석하였다.
이후 분해 특성 인자들의 역수 및 로그 값을 포함한 각 인자들 간의 상관성을 SPSS 통계분석 프로그램으로 피어슨(Pearson) 상관계수 및 유의확률(p값(p-value))을 도출하여 분석하였다. 상관성 분석으로 얻은 상관식을 통한 정화능 평가 모듈(150)을 제작하기 앞서, 톨루엔 분해속도 중 지연시간(lag time)을 추론하기 위한 추가 실험을 진행하였다.
앞서 실험한 토양들에 유류오염분해 미생물제재를 다양하게 추가하여 얻은 샘플 총 23가지의 지연시간(lag time)을 분석하여 미생물 다양성 인자들과의 상관관계를 이전과 동일하게 SPSS로 추론하고 상관식을 도출하였다. 이렇게 얻은 인자들을 대표적인 반응속도 모델로 알려진 미하엘리스-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetics)에 대입해 미생물 다양성으로 토양의 유류오염 정화능을 평가하는 정화능 평가 모듈(150)을 제작하였다.
상관식 도출
본 발명의 실시예에서 적용되는 총 10가지의 다양한 토양들의 톨루엔 분해는 모두 약 48시간 정도의 지연시간(lag time)을 가진 후 96시간 이후에는 대부분 99%이상 제거율을 보였다. 톨루엔의 분해속도를 나타내는 DR(mg/L/hr)은 토양의 종류에 상관없이 다양한 결과를 보였으나, 분해속도(Degradation Rate;DR)를 세균세포 무게로 나눈 비분해속도(specific degradation rate)(V max , mg-toluene/mg cell/hr)는 저영향개발 기법을 적용한 토양(시료 1~3번)이 일반 나대지 토양(시료 4~10번)보다 높은 결과를 보였다(도 3 참조).
각 토양 시료의 미생물 다양성들을 분석한 결과는 [표 1]과 같다. V max 가 높은 시료 1~3번의 경우, 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)를 비롯한 모든 미생물 다양성 값들이 시료 4~10번 보다 높은 경향을 보인다. 이는 저영향 개발기법 토양이 토양, 지하수 환경의 조성이 잘되어 있고 오염저감 및 생태기능에 좋다는 결과를 뒷받침 한다(Ahiablame et al.,2012).
Figure 112016060785580-pat00004
분해특성 인자인 V max 가 높은 샘플에서 미생물 다양성 값들이 높아짐에 따라 분해 특성과 미생물 다양성 인자간의 상관성이 있다는 가능성이 제시되며, 이에 따라 피어슨(Pearson) 상관계수와 유의확률(p값(p-value))을 사용한 상관성 분석을 [표 2]와 같이 분석하였다.
먼저 p값(p-value)를 통해 유의성이 있는(p값(p-value)<0.05) 인자들은 16S rRNA 유전자의 샤논지수(Shannon index)와 V max 의 역수, 그리고 16S rRNA 유전자의 균등성(evenness)과 V max 의 역수이다.
톨루엔의 분해에 직접적으로 관여하는 방향족 2산화효소(aromatic ring hydroxylating dioxygenase) 유전자의 다양성과는 상관성이 적은 것으로 나타났는데 이는 톨루엔의 분해에 관여하는 유전자가 다양하기 때문인 것으로 보인다. 톨루엔의 분해에 관여하는 유전자는 방향족 2산화효소(aromatic ring hydroxylating dioxygenase) 유전자 외에 톨루엔(toluene) 1,2-dioxygenase 유전자(Wackett, 1990), cis-톨루엔 디하이드로디올 탈수소효소(tnoluene dihydrodiol dehydrogenase) 유전자(Furkawa et al., 1993), 3-methylcatechol 2,3-dioxygenase 유전자(Kukor and Olsen, 1996) 등이 있다.
이와 같은 이유로 특정 톨루엔 분해 유전자의 다양성보다는 전체 유전자의 다양성을 대변하는 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)나 균등성(Evenness)이 분해 특성과 직접적인 상관성이 있는 것으로 보인다. 두 다양성 인자 중 미생물 다양성 대표성이 높고 피어슨(Pearson) 상관계수 및 p값(p-value)에서도 상관관계가 더 높은 것으로 나타난 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)를 미생물 다양성인자로 선정하여 V max 와 회귀분석을 진행하였으며 그 결과는 도 4와 같다.
Figure 112016060785580-pat00005
16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)가 클수록 토양의 정화능력을 나타내는 V max 는 커지며, 특히 샤논지수(Shannon index)의 값이 3.5 이상인 경우에는 V max 의 값이 급격히 증가하는 양상을 나타낸다.
일반적인 자연 토양의 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)는 보통 4를 넘지 않는 것으로 알려져 있어(Ki, 2008), 본 상관식을 사용하여 V max 를 추론할 경우, 샤논지수(Shannon index)가 4가 넘는 토양에 대해서는 어느 정도 보정이 필요하다.
톨루엔 분해 미생물 순수 균주 및 consortium의 V max 는 2.11~2.44/hr로 알려져 있으며, 일반 자연 조건에서는 0.41~1.45/hr로 알려져 있어([표 3] 참조), 본 상관식의 검증성을 알 수 있다.
본 상관식은 일정 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)까지는 기울기가 미미하다 일정 값 이상이 되면 급격히 증가하여, 일반 자연 토양 샤논지수(Shannon index) 최대값인 4까지 기울기가 커진 선형 관계를 보이는 양상이다.
이는 Johnson et al.,(2015)이 밝힌 하수처리장의 다양성과 기능간 상관관계가 선형이라는 결과와 유사하다. 즉, 토양과 하수처리장에서의 다양성과 분해 특성과 같은 기능간 상관성은, 일정 다양성 값 이상에서는 기능이 일정한 decelerating shape가 아닌 선형에 가까운 Non-decelerating shape이다.
그러나 본 연구 결과 특정 다양성 값을 기준으로 이전과 이후의 Non-decelerating shape의 기울기가 달라지며 저영향 평가기법 토양과 같이 의도적으로 다양성을 자연토양보다 높인 환경에서는 그 기울기가 급격히 커짐을 알 수 있다. 이는 미생물 제재 등을 추가한 토양에서의 분해 특성을 미생물 다양성 값으로 추론할 때 오차가 큼을 나타내며 이를 보정하는 추가 연구가 필요함을 시사한다.
Figure 112016060785580-pat00006
토양의 유류오염정화능력은 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)를 도 2의 상관식에 대입하여 도출한 V max 를 대표적인 반응속도 모델인 미하엘리스-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetics)에 대입하여 평가할 수 있다. 미하엘리스-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetics)로 특정 톨루엔 농도를 목표 시간까지 분해하는데 필요한 미생물 양을 구할 수 있으며, 이를 실제 토양의 미생물양과 비교하여 토양의 자연정화 가능 여부를 평가한다. 미하엘리스-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetics)은 [수학식 1]과 같다.
Figure 112016060785580-pat00007
여기서
Figure 112016060785580-pat00008
는 토양의 오염물질(톨루엔) 분해속도(DR, mg/L/hr)이며, V max 는 specific degradation rate(hr-1), S는 톨루엔의 농도이고, X0는 토양의 미생물 농도(mg cell/g soil), Ks는 토양의 반포화계수(half saturation coefficient)(mg/L)이다. 이 식을 적분하여 토양의 미생물 농도 X0에 대한 식으로 바꾸면 [수학식 2]와 같다.
Figure 112016060785580-pat00009
여기서 S 0 는 토양의 초기 톨루엔 농도(mg/L)이고 S는 t시간 후 톨루엔 농도(mg/L)이며 t는 분해시간(hr)이다.
그리고, 본 발명의 실시예를 적용한 실험결과 토양의 톨루엔 분해에는 지연시간(lag time)을 고려해야 하기 때문에, 위에서 실험한 10가지 자연 토양 외 미생물 제재를 추가로 투여한 실험 총 23종의 톨루엔 분해 지연시간(lag time)과 미생물 생태학적 특성 간 상관관계를 분석한 결과 지연시간(lag time)과 x(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수/16S rRNA 유전자수)의 역수간에 상관성에 의한 회귀분석을 한 결과 도 4와 같은 상관식이 나온다. 이를 보정한 지연시간(lag time)과 x간의 상관식은 [수학식 3]과 같다.
Figure 112016060785580-pat00010
여기서 L은 지연시간(lag time)(hr), α는 상관계수이고 그 값은 0.0631hr이며 x는 "Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수/16S rRNA 유전자수"이다.
지연시간(lag time)을 고려한 최종 식은 [수학식 4]와 같다.
Figure 112016060785580-pat00011
위 식에서 K s 는 토양의 시효효과(aging effect)나 풍화 작용 및 미생물 제재 등에 의해 바뀔 수 있으며 현장토양에 맞는 특정 값을 사용한다.
토양의 유류오염 정화능력 평가((c) 단계)
(c) 단계는 정화능 평가 모듈(150)이 상관성 연산부(130)에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 단계이다.
본 발명의 실시예서는 [표 3]의 문헌조사로 나온 일반적인 자연토양의 값 17.4mg/L를 예시로 사용한다. [수학식 4]는 특정 토양의 톨루엔 자연저감능을 평가하는데 사용할 수 있다. 먼저 토양의 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)를 T-RFLP을 통해 분석한 후 도 4의 상관식을 통해 V max 를 구한다. 이후 qPCR을 통해 토양의 방향족 2산화효소(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase) 유전자 수 및 16S rRNA 유전자 수를 구해 x를 산출하고 [수학식 3]을 통해 지연시간(lag time)(L)을 분석한다. 이렇게 구한 지연시간(L)과 V max 및 토양의 특성에 맞는 K s 를 [수학식 4]에 대입하고, 목표 처리 시간(t)과 초기 톨루엔 농도(S 0 ), 목표 정화 농도(S)를 대입하면, 목표 처리시간 내 목표 정화 농도 만족을 위한 기준 토착 미생물 농도 X'를 추정할 수 있다. 또한, 이렇게 구한 X'을 현장 토양 미생물 농도 X와 비교하여 X가 X'보다 높다면 자연정화가 가능한 토양으로 추정할 수 있다.
다른 활용방안으로는 X 0 에 현장 토양 미생물 농도를 대입하고 초기 톨루엔 농도 및 목표 정화 농도를 대입하여, 목표 농도까지 토양이 톨루엔을 정화하는데 소요되는 시간을 산정할 수 있다.
[표 4]는 활용방안 예시이다. x(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수/16S rRNA 유전자수)값이 일반적인 자연 토양의 값인 0.001이고(L=63.1hr), 목표 처리 시간(t)이 240hours이며, 목표정화 농도(S)가 20mg/L일 때 토양의 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)와 초기 톨루엔 농도(S 0 )별로 정화에 필요한 토착 미생물 농도 X를 나타내었다.
그 값들을 그래프화 시키면 도 6과 같으며, 목표 정화 시간이 짧을수록, 초기 톨루엔 농도가 높을수록, 그리고 토양의 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index) 값이 낮을수록 정화에 필요한 토착 미생물 농도 X가 커짐을 알 수 있다. 이렇게 구한 X의 값을 평균 산정하는 등 보정하여 실제 토양의 토착 미생물 농도와 비교하여 자연저감 가능 여부 등의 자연 정화능을 평가할 수 있게 된다.
Figure 112016060785580-pat00012
이처럼, 본 발명의 실시예는 먼저 토양의 미생물 다양성 인자와 톨루엔 분해 특성 인자간의 상관관계가 있음을 추정하였으며, 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index)와 토양의 비분해속도(specific degradation rate)간의 상관식을 도출하였다.
두 번째로 위 상관식 및 미하엘리스-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetics)을 이용하여 16S rRNA 유전자 샤논지수(Shannon index) 값 및 x(Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수/16S rRNA 유전자수)와 같은 분자 생태학적 인자들 만으로 토양의 오염정화능력을 평가할 수 있는 모듈을 제시하였다.
이와 같은 본 발명의 실시예는 경제적 및 시간적 효율성을 갖는 분자생태학적 분석 기법을 이용해 기존의 위해성 평가기법보다 공학적으로 유리한 토양의 톨루엔 오염정화능력 평가 기법을 제시하였으며, 유류오염 토양의 정화기법 선정 및 오염정화능력을 이용한 건설 산업의 친환경적 설계 등에 활용되는 등 공학적으로 광범위한 분야에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
그리고, 본 발명의 또 다른 실시예로서, 하드웨어와 결합되어 상술한 기후 변화 시나리오에 따른 수력발전소의 투자시기 결정방법을 실행시키기 위하여 컴퓨터가 판독 가능한 매체에 저장된 컴퓨터프로그램일 수 있다.
즉, 본 발명의 실시예에 따른 장치로서, 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체에 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드로서 구현하는 것이 가능하다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 컴퓨터 시스템에 의하여 읽힐 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록장치를 포함한다. 기록매체의 예로는 ROM, RAM, 광학 디스크, 자기 테이프, 플로피 디스크, 하드 디스크, 비휘발성 메모리 등을 포함한다. 또한 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체는 네트워크로 연결된 컴퓨터 시스템에 분산되어 분산방식으로 컴퓨터가 읽을 수 있는 코드가 저장되고 실행될 수 있다.
본 명세서에서 설명되는 실시예와 첨부된 도면은 본 발명에 포함되는 기술적 사상의 일부를 예시적으로 설명하는 것에 불과하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이므로, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아님은 자명하다. 본 발명의 명세서 및 도면에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시 예는 모두 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
100: 자연 정화능 평가장치 110: 분해속도 측정부
130: 상관성 연산부 150: 정화능 평가 모듈

Claims (15)

  1. 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 분해속도 측정부;
    시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 상관성 연산부; 및
    상관성 연산부에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 인자값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 정화능 평가 모듈을 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치로서,
    상기 정화능 평가 모듈은,
    시료 토양의 자연정화가 가능한 토양인지 여부를 평가하고,
    목표 농도까지 유류오염 물질을 정화하는데 소요되는 시간을 추정하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 분해속도 측정부는,
    마이로코즘 실험에 사용되는 용기의 헤드스페이스 내부에 채워진 기체를 측정하는 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출기(gas chromatography-flame ionization detector:GC-FID)를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 기체는,
    톨루엔(C7H8) 가스를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 상관성 연산부는,
    상기 분해속도 인자는 1mg 셀 당 톨루엔 분해속도를 나타내는 비분해 속도(Vmax) 데이터와,
    미생물 다양성 인자는 1g 토양에 존재하는 16S 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness)과, DI 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness) 데이터 중 적어도 어느 하나의 상관성을 분석하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 상관식은,
    Figure 112016060785580-pat00013

    (여기서, Xo는 토양의 미생물 농도(mg cell/g soil)이고, Ks는 토양의 반포화계수(half saturation coefficient)(mg/cell)이고, S는 t 시간 후 톨루엔 농도이고, So는 초기 톨루엔 농도이고, Vmax는 분해속도를 세균세포로 나눈 비분해속도(mg-toluene/mg cell/hr)이고, L은 지연시간(lag time)(hr)이다.)
    와 같은 식을 만족하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치.
  6. 삭제
  7. 청구항 1의 자연 정화능 평가장치를 이용하여,
    (a) 분해속도 측정부가 마이크로코즘을 이용해 시료 토양의 유류오염 분해속도를 측정하는 단계;
    (b) 상관성 연산부가 시료 토양의 분해속도 인자와 미생물 다양성 인자들 간의 상관성을 분석하고 상관식을 도출하는 단계; 및
    (c) 정화능 평가 모듈이 상관성 연산부에서 도출된 상관식으로부터 토양의 미생물 다양성 값에 따른 유류오염 정화능력을 평가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법으로서,
    상기 정화능 평가 모듈은,
    시료 토양의 자연정화가 가능한 토양인지 여부를 평가하고,
    목표 농도까지 유류오염 물질을 정화하는데 소요되는 시간을 추정하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 (a) 단계는,
    (a1) 용기에 시료 토양과 유류오염물질이 함유된 미디어를 넣고 배양시키는 단계; 및
    (a2) 용기의 헤드스페이스 내부에 채워진 기체를 가스 크로마토그래피 불꽃 이온화 검출기(gas chromatography-flame ionization detector:GC-FID)로 측정하여 유류오염 분해속도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 미디어는 95 mg/L 내지 125 mg/L의 농도를 갖는 톨루엔(C7H8)을 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    (b1) 시료토양의 분해속도 인자로 비분해속도(specific degradation) 데이터를 산출하고, 미생물 다양성 인자로 1g 토양에 존재하는 16S 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness)과, DI 유전자의 샤논지수(Shanoon index), 풍부성(Richness) 및 균등성(Evenness) 데이터 중 적어도 어느 하나를 획득하는 단계; 및
    (b2) 산출된 비분해속도 데이터와 다양성 인자 데이터를 통해 피어슨 상관계수 및 유의확률값을 획득하여 상관식을 도출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  11. 청구항 7에 있어서,
    상기 상관식은,

    (여기서, Xo는 토양의 미생물 농도(mg cell/g soil)이고, Ks는 토양의 반포화계수(half saturation coefficient)(mg/cell)이고, S는 t 시간 후 톨루엔 농도이고, So는 초기 톨루엔 농도이고, Vmax는 분해속도를 세균세포로 나눈 비분해속도(mg-toluene/mg cell/hr)이고, L은 지연시간(lag time)(hr)이다.)
    와 같은 식을 만족하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 지연시간(L)을 산출하는 식은,
    Figure 112016060785580-pat00015

    (x는 "Aromatic ring hydroxylating dioxygenase 유전자수/16S rRNA 유전자수"를 나타내고, α는 상관계수를 나타낸다.)
    와 같은 식을 만족하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  13. 청구항 7에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    정화능 평가 모듈이 상기 상관식으로부터 목표 처리시간 내 목표 정화 농도 만족을 위한 기준 토착 미생물 농도(X')를 획득하고,
    현장 시료 토양의 미생물 농도(X)가 획득된 기준 토착 미생물 농도(X')보다 높으면 자연정화가 가능한 토양으로 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  14. 청구항 7에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    정화능 평가 모듈이 상기 상관식의 토양의 미생물 농도(X0)에 현장 시료 토양 미생물 농도(X)를 대입하고 초기 유류오염물질 농도 및 목표 정화 농도를 대입하여, 목표 정화 농도까지 시료 토양이 유류오염물질을 정화하는데 소요되는 시간을 산출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법.
  15. 하드웨어와 결합되어,
    청구항 7의 토양 유류오염의 자연 정화능 평가방법을 실행시키기 위하여 컴퓨터가 판독 가능한 매체에 저장된 컴퓨터프로그램.
KR1020160078575A 2016-05-03 2016-06-23 토양 유류오염의 자연 정화능 평가장치 및 평가방법 KR101813154B1 (ko)

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