JP2005253365A - 細菌芽胞処理チップ及び細菌芽胞処理装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明は、取扱いが容易で安価、かつ細菌芽胞から遺伝子の抽出・分析までが一括して自動化できる細菌芽胞処理チップ、及びそれを備えた小型・可搬の細菌芽胞処理装置を提供する
【解決手段】 芽胞を形成した細菌を含む試料が供給される注入口１０２と、前記注入口に供給された前記試料に導入される発芽促進剤を保管する発芽促進液保管部１１１と、前記試料と前記発芽促進剤とを混合した液に導入される溶解液を保管する溶解液保管部１１２と、前記試料と前記発芽促進剤と前記溶解液とを混合し、前記試料から遺伝子が溶出される遺伝子溶出部１０３と、前記溶出遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部１１３と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部１１４と、前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部１１５と、前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部１０４とを備えている細菌芽胞処理チップ１０１。
【選択図】 図１

Description

本発明は、供給された試料中の細菌芽胞を処理する細菌芽胞処理チップに関する。

従来、細菌を分析するには、培地に細菌を移し、培養して細菌が増殖するかを観察する、培養法が主流であった。しかしながら、培養に２〜３日間を要するため、近年では細菌の遺伝子を増幅し、その遺伝子を検出することで目的細菌の有無を判別する遺伝子検査法も取り入れられている。ここで、炭そ菌やセレウス菌などの細菌は、周囲に水分が少なく、栄養が枯渇した状況になると数時間内で芽胞を形成する。この芽胞は非常に固い殻状の物質で、熱、化学物質、紫外線等に強い抵抗力を持つため、適切な芽胞の処理が必要である。細菌芽胞の殺菌方法は、下記特許文献１に開示されている。特許文献１には、細菌芽胞に発芽誘導物質を加えて芽胞を発芽させた後に、バクテリオシンを含有する乳酸発酵液を加えて殺菌を行う例が示されている。

特開２００２−３３０７４０号公報

しかしながら、前記公知例に記載の細菌芽胞の殺菌方法は、乳酸発酵液の存在下で細菌芽胞の増殖を抑制するものであり、細菌の遺伝子検査を主眼としたものではない。さらに、発芽した炭そ菌やセレウス菌は人体に多大な影響を与えることから、細菌芽胞の遺伝子検査は、密閉系で自動化されたシステムで行われるのが望ましい。また、遺伝子検査では試薬のコストが非常に高いことから、分析システムの小型化も大きな課題となる。

そこで、本願発明は、前記課題の少なくともいずれかを解決する細菌芽胞処理チップを提供するものである。

前記課題を解決するために、以下の形態を有する。これにより、微量の試薬で安全、かつ短時間のうちに、細菌芽胞の処理をチップ上で簡易に行うことができる。

本発明により、細菌芽胞からの遺伝子抽出処理を安全かつ短時間にチップ上で簡易に行うことができる細菌芽胞処理チップ或は細菌芽胞処理装置を提供することができる。

本発明の実施例を以下に説明する。なお、本発明は、本明細書に開示した内容に限定するものではなく、公知技術に基づく変更を制限するものではない。

［実施例１］
本発明の一実施例として、芽胞を形成した細菌から遺伝子を抽出し、ポリメラーゼ連鎖反応により遺伝子を増幅させることで、対象の細菌が存在するか否かを検出する例を説明する。ここで芽胞を形成する細菌とは、バチルス属菌、クロストリディウム属菌等の細菌であることができる。

（分析の原理）
分析工程は大きく分けて、細菌芽胞に発芽促進剤を添加して細菌芽胞を発芽させる工程と、発芽した細菌から遺伝子を抽出する工程、とからなる。ここで、遺伝子の抽出は、一般的に知られる固相抽出法により行う。固相抽出法とは、まず固体表面に遺伝子を特異的に結合させ、次に他物質と区別して遺伝子のみを水溶液に溶離させることで抽出する方法である。以下、固相抽出法をステップ毎に説明する。

ステップ１・・・芽胞の発芽
細菌芽胞に発芽促進剤を加え、一定時間を経過すると細菌芽胞が発芽を開始する。発芽する段階で、細菌は自ら芽胞を壊すので、発芽により細菌の細胞壁がむき出しの状態になる。

ステップ２・・・細胞膜の溶解
試料にカオトロピックイオン（分子の直径が大きい−１価の陰イオン）を含む溶液を混合し、細菌の細胞膜をカオトロピックイオンの働きにより破壊する。またカオトロピックイオンは、同時に試料中に含まれる多くの蛋白質を変性し、ヌクレアーゼ（核酸を分解する酵素）の働きを阻害する。

ステップ３・・・結合
溶解後の混合物にシリカが加わると、カオトロピックイオンの働きにより、遺伝子とシリカが特異的に結合する。一般的には混合物をガラスフィルタに通す方法が用いられる。

ステップ４・・・洗浄
試料に含まれる蛋白質や、カオトロピックイオンが抽出物に混入すると、遺伝子増幅による遺伝子の検出を阻害するので、遺伝子−シリカを洗浄する操作が必要となる。ここでは高濃度のエタノールで洗浄する。遺伝子は高濃度のエタノールに溶解しにくい性質を持っているため、シリカに吸着している遺伝子はこの過程で溶離しない。

ステップ５・・・溶離
洗浄後、水もしくは低塩濃度の溶液を遺伝子−シリカに加え、遺伝子をシリカから溶離する。

ステップ６・・・遺伝子検出
溶離した遺伝子にプライマ（目的とするＤＮＡ領域の両末端の２０塩基ほどと同じ塩基配列をもつ一本鎖ＤＮＡ）、ＤＮＡ合成酵素（ポリメラーゼ）と四種類の基質（ｄＮＴＰ）等を加え、温度サイクル「熱変性−アニーリング−相補鎖の合成」をかけることで遺伝子は増幅する（ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応）。ここで上記試薬に加え、蛍光色素を予め注入しておき、励起光を照射しながら温度サイクルをかけることで、遺伝子の増幅をリアルタイムに検出することができる。

（細菌芽胞処理チップの構成）
細菌芽胞を処理する細菌芽胞処理チップの構成を図１を用いて説明する。図１は、細菌芽胞処理チップ１０１の詳細図である。本実施例では、溶解液保管槽と遺伝子増幅試薬を備える形態について説明する。

細菌芽胞処理チップ１０１は、発芽促進液を保管する発芽促進液保管槽１１１と、細胞膜溶解液を保管する溶解液保管槽１１２と、試料注入口１０２（廃液槽としても使用される場合有）と、発芽した細菌芽胞が溶解液により溶解し細菌遺伝子が溶出する遺伝子溶出槽１０３（廃液槽としても使用される場合有）と、遺伝子結合担体を流路に充填した遺伝子抽出エリア１１３と、洗浄液を保管する洗浄液保管槽１１４と、遺伝子溶離液を保管する溶離液保管槽１１５と、遺伝子の検出を行う反応槽１０４と、それぞれの槽を構成する流路において保管された液が位置するよりも流路の末端側に位置し、外部の流路との接点となるチップポート（１２１〜１２８）から構成される。ここでチップ内外の流体が連通される。流体とは例えば空気などの気体である。場合によっては水などの液体であってもよい。本実施例では、さらに、遺伝子増幅試薬を保管する遺伝子増幅試薬保管槽１１６を備えた例を示している。これらのチップポートでチップ内と外部との間を流体が連通させることができる。これらチップ構成要素の大部分は、マイクロファブリケーション技術によりパターン転写された微細流路である。

ここで細菌芽胞処理チップ１０１の作成方法を述べる。細菌芽胞処理チップ１０１の材料として、加工費用が高くまた割れやすいガラスよりも、廃棄処理性に優れる樹脂のほうが好ましい。樹脂の種類は特に限定されるものではないが、本実施例では以下の優れた特性を有するポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ：ダウコーニングアジア社製、シルポット184）を使用した。本チップには以下の特性を備えることが好ましい。
・生体適合性良好（通常のシリコンゴムは生理的に不活性）
・サブミクロンの精度で型の転写が可能（硬化前は低粘度で流動性に富むため、複雑な形状の細部まで良好に浸透）
・低コストである（従来の汎用マイクロデバイス材料であるパイレックスガラスに比べて、１／１００以下とすることができる）
・焼却により容易に廃棄可能

図２に、樹脂基板（以下には一例としてＰＤＭＳを使用した場合を記載）を使用した細菌芽胞処理チップ１０１作成の流れを示す。細菌芽胞処理チップは、細菌芽胞処理チップの構成要素をかたどるパターンをフォトリソグラフィー技術により作製し、このパターンを樹脂に転写成形して成型することができる。プロセスは大きく分けて、〔１〕ＰＤＭＳに転写するパターンの成形、〔２〕ＰＤＭＳへのパターン転写、〔３〕ＰＤＭＳ同士の接合、からなる。以下、各プロセスを段階を追って説明する。

〔１〕ＰＤＭＳに転写するパターンの成形
パターンの材料として感光性厚膜レジスト２０７（Ｍｉｃｒｏ、Ｃｈｅｍ社製，ＮＡＮＯ ＳＵ−８）をシリコンウェハ２０８に塗布（ステップ２０１）、フォトマスク２０９を感光性厚膜レジスト２０７の上に置いて露光（ステップ２０２）、現像の工程（ステップ２０３）を経てマイクロパターンが成形される。従来のウェットエッチングによるフォトファブリケーションと異なり、短形断面を保持しながら曲線形状を成形できる長所を有する。

〔２〕ＰＤＭＳへのパターン転写
ＰＤＭＳ２１０と硬化剤を重量比１０：１の割合で混合し、パターン上に塗布、１００℃で１時間加熱することによりＰＤＭＳ２１０は硬化する（ステップ２０４）。凸形状のマイクロパターンより、凹形状のＰＤＭＳ２１０が得られる（ステップ２０５）。

〔３〕ＰＤＭＳ同士の接合
パターンが転写されたＰＤＭＳ２１０の表面を酸素プラズマ処理し、２枚のＰＤＭＳ２１０を重ねあわせることで、２枚のＰＤＭＳ２１０は接合する。接合強度は、接合部位を剥がそうとするとＰＤＭＳ２１０が破断するほど充分なものである。なお一方をＰＤＭＳ２１０として、シリコン、ガラスと接合させてもよい。ＰＤＭＳの成形方法は上記の手法に限定されるものではなく、例えば押し出し成形によって加工することができる。

本細菌芽胞処理チップ１０１のより詳細な構造を図１、図３を用いて説明する。図３は細菌芽胞処理チップ１０１の断面図である。細菌芽胞処理チップ１０１は２枚のＰＤＭＳがプラズマ処理により表面改質され、接合したものである。まずＰＤＭＳ第１層１３１には、試料注入口兼廃液槽１０２となる貫通穴が形成されている。試料注入口兼廃液槽１０２の体積は１０〜１００μＬで、大気開放である。ＰＤＭＳ第２層１３２には、様々な試薬槽（１１１〜１１６）となる微小流路１１０がパターン成形されている。微小流路１１０は断面形状が縦０．１ｍｍ、横０．５ｍｍで形成した。断面形状は特に限定されないが、横／縦１０以下が好ましい。横／縦が１０以上となると、ＰＤＭＳ第１層１３１がたわんで微小流路１１０の矩形構造が崩れる恐れがある。

さらにＰＤＭＳ第２層１３２には、微小流路１１０と外部装置の流路とを連通するチップポート１２０と、遺伝子溶出槽１０３及び反応槽１０４となる貫通穴が形成されている。遺伝子溶出槽１０３に導入される、細菌芽胞や発芽促進剤を含む液体の体積は１０〜３０μＬである。また反応槽１０４に導入される遺伝子を含む液体の体積は１０〜４０μＬである。特に、反応槽１０４の体積を１０〜２０μＬとすることで、熱応答性が向上し、反応槽１０４の温度制御が迅速化する。これにより、反応槽１０４の温度を秒単位で変化させながら最適な条件下で反応を進行させることができる。また反応槽１０４の体積を微小化することで、反応槽１０４における溶離液と遺伝子増幅試薬との混合が短時間（例えば約１秒程度）で済むため、混合操作が容易となる。なお、反応槽１０４は、試料の注入口１０２よりも厚さ方向から見た面積が大きい。特許文献１に開示された従来技術では超音波素子等を用いて混合を行っていたが、本実施例によれば、簡素化のためには混合操作を用いないことも考えられる。或は、用いるにしても簡易なものですむ。

なお、遺伝子溶出槽１０３及び反応槽１０４は貫通穴であるから、当然底となる板が必要である。後述するが、細菌芽胞処理チップ１０１の底板１４０は温度制御機構から遺伝子溶出槽１０３及び反応槽１０４に熱を伝える媒体の役割も果たすことから、熱伝導性が良い材料であることが好ましい。さらに、底板１４０の表面が鏡面であれば、反応槽１０４内での蛍光が底板１４０に反射するから、遺伝子の検出感度が高くなる。底板１４０として好ましいのはクロムであり、最も好ましいのはシリコンである。シリコンは熱伝導性が良好であり、かつＰＤＭＳとの接合が酸素プラズマ処理のみで容易に行えるからである。

本細菌芽胞処理チップ１０１には、５つの試薬槽（発芽促進剤保管槽１１１、溶解液保管槽１１２、洗浄液保管槽１１４、溶離液保管槽１１５、遺伝子増幅試薬保管槽１１６）が内蔵されている。いずれの試薬槽も、流路形状が好ましい。試薬槽内の試薬を送液するために、試薬槽の背後から流体（空気や水）を試薬槽に送る。このとき、試薬槽が流路形状でなかった場合、流体の通り抜けやすい部位（液ぬれ性のよい部位）のみ試薬が押し出され、その他の部位の試薬が試薬槽に残るためである。消費する試薬の量を減らすために、試薬槽を流路形状にするのは効果的である。

ここで、発芽促進剤保管槽１１１の体積は１０〜２０μＬ、溶解液保管槽１１２の体積は１０〜２０μＬ、洗浄液保管槽１１４の体積は１０〜３０μＬ、溶離液保管槽１１５の体積は５〜１０μＬ、遺伝子増幅試薬保管槽１１６の体積は５〜１０μＬが好ましい。特に、溶離液（含遺伝子）と遺伝子増幅試薬との和が１０μＬ以下であると、前述のように反応槽１０４における溶離液と遺伝子増幅試薬との混合が迅速化し、かつ反応が均一となるため最適である。このように、試薬槽や反応槽の体積をマイクロ化することで、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。

遺伝子抽出エリア１１３に充填する遺伝子結合担体として、石英ウール、ガラスウール、ガラスファイバー、ガラスビーズが適用可能である。ガラスビーズ適用の際は、接触面積を大きくするためにビーズサイズを２０〜５０μｍとするのが好ましく、２０〜３０μｍが最適である。

また、遺伝子保持担体を堰きとめるために、エリアを構成する流路が１箇所以上狭まっていることが好ましい。

例えば、遺伝子結合担体を遺伝子抽出エリア１１３に保持するために、遺伝子抽出エリア１１３の微小流路中、２箇所の流路幅を１０μｍまで狭めると良い。すなわち、狭められた流路が遺伝子結合担体に対して堰となる。流路を１０μｍ未満にすると流体抵抗が大きく流体制御が困難になる。よって、堰としての流路幅は１０〜２０μｍが好適である。

（細菌芽胞処理装置の構成）
図４に、細菌芽胞処理チップ１０１をセットする装置の断面図を示す。分析装置は大きく分けて、流体系、温調系、そして光学検出系の３つから構成される。細菌芽胞処理チップ１０１をセットする基板１００には、細菌芽胞処理チップ１０１を吸着させるための吸着溝１５０、細菌芽胞処理チップ１０１のポートに連通する装置内流路１６２、遺伝子溶出槽１０３及び反応槽１０４の温度を最適化するための温度制御機構１７０が内蔵されている。装置には各制御を行う制御機構を備える。装置に、ポンプ１６０を制御するポンプ制御機構１６５、バルブ１６１を制御するバルブ制御機構１６６、光源１８０を制御する光源制御機構１８５、光検出器１８１を制御する光検出器制御機構１８６、光検出器の信号を変換する光信号変換機１８７及び変換された光信号を表示するデータ表示画面１８８が搭載される。

細菌芽胞処理チップ１０１を基板１００の上に置き、基板１００の吸着溝１５０を真空引きすることにより、細菌芽胞処理チップ１０１は基板１００に吸着する。このように真空チャックを行うことで、チップポート１２０と装置内流路１６２が確実に接続され、流体の漏れを防止する一方で、細菌芽胞処理チップ１０１は基板１００に対して容易に着脱可能となる。細菌芽胞処理チップ１０１を使い捨てとするには、真空チャックによる細菌芽胞処理チップ１０１の固定方式が極めて実用的である。

温度制御機構１７０としては、様々な発熱体が適用可能であるが、例えば、好ましいのはペルチェである。ペルチェを使用した場合、印加電流の向きを変えるだけで昇温・冷却操作を簡便に行うことができる。

装置内流路１６２は、それぞれバルブ１６１を介してポンプ１６０に接続される。ポンプ１６０は、送風・吸引の切替えが可能なものがより好ましく、また複数個あると好ましい。ある試薬槽の試薬を送液したい場合には、バルブ１６１を切り替えてその試薬槽に連通するポートのみに送風を行う。

このように流体を制御するバルブ１６１を細菌芽胞処理チップ１０１の内部ではなく、分析装置側に設けることが好ましい。これにより、細菌芽胞処理チップ１０１には機械部品がなくなり、小型化・ディスポーザブル化を実現することができる。

光検出系は、反応槽１０４内の遺伝子に励起光を照射する光源１８０と、反応槽１０４内の蛍光を測定する光検出器１８１から構成される。光源１８０は様々な波長領域のものが使用可能であるが、蛍光色素として一般的なエチジウムブロマイドを用いた場合、紫外線ランプや紫外線レーザーを用いるのが好ましい。光検出器１８１は、光検出器１８１受光面が反応槽１０４の真上にくるよう配置する。光検出器１８１としてはＣＣＤカメラ、光電子倍増管、フォトダイオード等を使用できるが、装置を小型化するにはフォトダイオードが好ましい。

本発明では、機械部品を内蔵しない小型の細菌芽胞処理チップを基板上に置いて簡便な光検出器を組み合わせるだけの、小型で可搬の分析装置を提供することが出来る。

（分析の手順）
細菌芽胞処理チップ１０１を用いた分析の手順を、図４、図５、図６を参照しながら説明する。図５は、分析方法の手順を示すフローチャート図である。図６は、実施例１の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。

分析の手順としては、主に以下の手順を有することができる。
まず、試料の細菌芽胞に発芽促進剤を供給し、細菌芽胞を発芽させる。
そして、試料の細胞壁を壊す溶解液を発芽した前記試料と混合する。
次に、前記溶解液と試料の混合液を、遺伝子保持担体が充填された流路に送液する。
そして、試料に含まれる蛋白質等を洗浄する洗浄液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらにその廃液を試料が当初保持されていた槽に送液する。

次に、遺伝子保持担体に吸着された遺伝子を溶離する溶離液を前記遺伝子保持担体が充填された流路に送液し、さらに遺伝子を検出する反応槽へと送液する。
その後、分析対象の遺伝子の有無を検出する。以下に一例を具体的に説明する。

初めに、５種類の試薬、すなわち発芽促進剤、細胞膜溶解液、洗浄液、遺伝子溶離液、遺伝子増幅試薬がそれぞれ発芽促進剤保管槽１１１、溶解液保管槽１１２、洗浄液保管槽１１４と、溶離液保管槽１１５、遺伝子増幅試薬保管槽１１６に内蔵され、凍結保存しておいた細菌芽胞処理チップ１０１を室温で解凍する。細菌芽胞処理チップ１０１に予め１検査分のみの試薬を内蔵してユーザーに提供することで、細菌芽胞処理チップ１０１を１検査の使い切りとしても試薬の無駄がなく、経済性が向上する。またユーザーは試薬を各試薬保存槽に分注する手間を省くことができ、時間が短縮されるだけでなく、汚染を防ぐことも出来る。さらに、この細菌芽胞処理チップ１０１を凍結した状態でユーザーに提供し、ユーザーが０℃で細菌芽胞処理チップ１０１を凍結保存することで、試薬の活性は１ヶ月保たれる。また、−２０℃で凍結保存しておけば、半年以上試薬の活性を保つことが可能である。このように、使い捨て可能な細菌芽胞処理チップ１０１に予め１検査分のみの試薬を内蔵し、細菌芽胞処理チップ１０１を冷蔵あるいは冷凍した状態でユーザーに提供することで、簡便な分析環境を作ることができる（ステップ３１１）。

次に、細菌芽胞処理チップ１０１を基板１００の上に置き、チップポート１２０と装置内流路１６２が連通したのを確認したのち、吸着溝１５０を減圧する。このようにして真空引きし、真空チャックにより細菌芽胞処理チップ１０１を基板１００に固定する（ステップ３１２）。
そして、試料注入口兼廃液槽１０２に試料を１０μＬ分注する。試料とは、芽胞を形成した細菌の粉末、あるいは兼濁液である（ステップ３１３）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えて発芽促進剤ポート１２１にのみポンプ１６０から流体を流す。（ポート１２１：開、他のポート１２２〜１２８：閉）ここで使用する流体は、水、アルコール、あるいは空気など、試薬と接した時に試薬の活性が損なわれないものであればよい。

発芽促進剤保管槽１１１内の発芽促進剤２０μＬは流体によって試料注入口兼廃液槽１０２に注入され、試料注入口兼廃液槽１０２内の試料と混合される。ここで発芽促進剤としては、アラニン、アデノシン、グルコースを含むブイヨンが好ましい。特にＬ−アラニンを１ｍＭ〜１０ｍＭ含有するブイヨンが最適である（ステップ３１４）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２からチップ内部を減圧するようポンプ１６０を吸引作動させる。（ポート１２１、１２２：開、他のポート１２３〜１２８：閉、なお、ポート１２１は閉でも可。）これにより、試料注入口兼廃液槽１０２内の試料と発芽促進剤は遺伝子溶出槽１０３に移動する。そして、試料注入口兼廃液槽１０２内の液体が全て遺伝子溶出槽１０３に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。さらに細菌芽胞処理チップ１０１の下部に設けた温度制御機構１７０を駆動し、底板１４０を介して反応槽１０４の温度が２５〜４０℃になるように制御する。細菌芽胞を発芽させるのにより好ましいのは３５〜４０℃であり、最も好ましいのは３５〜３７℃である。細菌芽胞が発芽を開始するのは１０分後であり、細菌芽胞の全てが発芽するのは６０分後である。このように、細菌芽胞の発芽工程をチップ内の閉じた空間で行うため、一度発芽すると人体に悪影響を及ぼす炭そ菌やセレウス菌の処理には好適である（ステップ３１５）。

次に、溶解液ポート１２３にのみポンプ１６０から流体を流す。（ポート１２１、１２３：開、他のポート１２２、１２４〜１２８：閉、なお、ポート１２１は閉でも可。）溶解液保管槽１１２内の細胞膜溶解液２０μＬは流体によって遺伝子溶出槽１０３に注入され、発芽した細菌と混合される。これにより、細菌の細胞膜が破壊され、細菌の遺伝子が細胞外部に放出される。ここで細胞膜溶解液としては、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩化水素、ヨウ化ナトリウム、臭化カリウムといったカオトロピックイオンを含む溶液が好ましい（ステップ３１６）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＢ１２４からチップ内部を減圧するようポンプ１６０を吸引作動させる。（ポート１２１〜１２４：開、他のポート１２１、１２５〜１２８：閉、なお、ポート１２１は閉でも可。）これにより、遺伝子溶出槽１０３内の遺伝子懸濁液は遺伝子抽出エリア１１３に移動する。そして、遺伝子溶出槽１０３内の遺伝子懸濁液が全て遺伝子抽出エリア１１３に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。これにより、遺伝子抽出エリア１１３内の遺伝子結合担体に遺伝子が捕獲される（ステップ３１７）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてポート１２２〜１２４を閉じ、さらに洗浄液ポート１２５にのみポンプ１６０から流体を流す。（ポート１２１〜１２３、１２５：開、他のポート１２４、１２６〜１２８：閉、なお、溶解液ポート１２１は閉でも可。）洗浄液保管槽１１４内の洗浄液２０μＬは流体によって遺伝子抽出エリア１１３に送液される。ここで洗浄液としては、ＴＲＩＳ塩酸が使用可能であり、５０％以上の高濃度エタノールがより好ましい。この洗浄液により、遺伝子抽出エリア１１３に残留する発芽促進剤や蛋白質やカオトロピックイオンは除去される。そして、遺伝子抽出エリア１１３を経た洗浄液が遺伝子溶出槽１０３さらには試料注入口１０２側に流れるようにする。例えば、遺伝子抽出エリア１１３を洗浄した洗浄液が試料注入口兼廃液槽１０２に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。本実施例のように廃液槽を試料注入口と兼ねさせることで、細菌芽胞処理チップ１０１のサイズを小型化することができ、使い捨ての用途にはより好適である。このとき、試料注入口１０２の他に、又は代わりに、発芽促進剤保管槽１１１或は溶解液保管槽１１２に使用済みの洗浄液を導入するようにすることもできる。これにより、試料注入口１０２を大型化しなくとも廃液を蓄えられる。或は、試料注入口から外部へ廃液が漏れることを効果的に抑制することができる。この際、発芽促進剤保管槽１１１と試料注入口兼廃液槽１０２と遺伝子抽出エリア１１３と溶離液保管槽１１５とが直列に配置されている、又は溶解液保管槽１１２と試料注入口兼廃液槽１０２と遺伝子抽出エリア１１３と溶離液保管槽１１５とが直列に配置されていることで、流体の制御手順が最も簡便で済み、分析時間が最短となる（ステップ３１８）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてポート１２２、１２３、１２５を閉じ、溶離ポート１２６とチップポートＣ１２８を開く。そしてポンプ１６０を駆動し溶離ポート１２６に流体を流す。（ポート１２１、１２６、１２８：開、他のポート１２２〜１２５、１２７：閉、なお、溶解液ポート１２１は閉でも可。）溶離液保管槽１１５内の溶離液５μＬは流体によって遺伝子抽出エリア１１３に送液される。ここで溶離液としては、滅菌蒸留水、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡやＴＲＩＳ−アセテート等のバッファ溶液が使用可能である。この溶離液により、遺伝子抽出エリア１１３の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離する。そして、遺伝子を含む溶離液が遺伝子抽出エリア１１３の末端に達した時に、チップポートＣ１２８から反応槽１０４を減圧するよう別のポンプ１６０を吸引作動させる。これにより、遺伝子を含む溶離液が試料注入口兼廃液槽１０２に送液されることなく、反応槽１０４に導かれる。そして溶離液が反応槽１０４に全て移行した段階で、ポンプ１６０を停止する。これにより、試料の前処理すなわち遺伝子の抽出が完了したことになる（ステップ３１９）。

ここで、抽出された試料について遺伝子検出装置によって検出を行う。
以下は遺伝子の検出手順の一例を示す。分析装置内のバルブ１６１を切り替えて溶離液ポート１２６とチップポートＣ１２８を閉じ、遺伝子増幅試薬ポート１２７にのみポンプ１６０から流体を流す。（遺伝子増幅試薬ポート１２７：開、他のポート１２１〜１２６、１２８：閉。）遺伝子増幅試薬保管槽１１６内の遺伝子増幅試薬５μＬは流体によって反応槽１０４に注入され、反応槽１０４内の遺伝子と混合される。ここで遺伝子増幅試薬は、２．５ｍＭ濃度の4種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、バッファ（１００ｍＭ濃度ＴＲＩＳ塩酸、５００ｍＭ濃度ＫＣｌ、１５ｍＭ濃度ＭｇＣｌ２）、２種類のプライマ、ＤＮＡ合成酵素（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ、サーモシーケナーゼのいずれか）、蛍光色素（エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ製）のいずれか）から構成される（ステップ３２０）。

次に、細菌芽胞処理チップ１０１の下部に設けた温度制御機構１７０を駆動し、底板１４０を介して反応槽１０４の温度が下記の２種類の設定値を往復するように温度サイクルをかける（ステップ３２１）。

温度サイクル例としては、下記の程度を実施する。
「９０〜９５℃、１０〜３０秒 ⇔ ６５〜７０℃、１０〜３０秒」×３０〜４５回
好ましい一例として、以下の温度サイクルを実施する。
「９４℃、３０秒 ⇔ ６８℃、３０秒」×４５回

温度サイクルをかけながら、細菌芽胞処理チップ１０１上部の光源１８０から励起光を反応槽１０４に照射する。遺伝子は、２本鎖の内部にインターカレートした蛍光色素を有すると、吸収した光源１８０光のエネルギーを蛍光色素に渡す（エネルギー転移）。その結果、蛍光色素は励起されて蛍光を発する。すなわち、試料中に目的遺伝子が存在した場合、遺伝子が増幅するに従って発する蛍光量が増加する。よって、温度サイクルの間、光検出器１８１により反応槽１０４内の蛍光量をモニタすることで、図７に示されるように、目的遺伝子の有無がリアルタイムに検出可能となる（ステップ３２２）。

そして基板１００の吸着溝１５０の吸着力を下げた後に基板からチップを取り出す。例えば、分析が完了した時、細菌芽胞処理チップ１０１を分析装置から取り出し、廃棄する（ステップ３２３）。試料や試薬の後処理が必要ない上に、反応検出部の洗浄操作が必要ないため、簡便・迅速な分析を提供することができる。

本発明の細菌芽胞処理チップを使用することで、細菌芽胞から遺伝子を抽出する工程が小型のチップ内で自動化される。細菌芽胞の発芽工程に人手を一切介さないため、誰でも安全に細菌芽胞から遺伝子抽出が可能である。さらに、細菌芽胞処理チップ内にバルブ等の機械部品が含まれず、また廃棄槽が試薬注入口を兼ねるなど省スペースが実現された結果、使い捨て用途に好適な細菌芽胞処理チップが提供できる。また、反応槽や流路を微細加工により作製し容積を微小化した結果、試薬量が削減され低コストとなるだけでなく、温度制御が迅速、混合が迅速、反応が均一といった長所が得られる。さらにディスポーザブルな細菌芽胞処理チップに予め１検査分のみの試薬を内蔵し、細菌芽胞処理チップを冷蔵・冷凍した状態でユーザーに提供することで、極めて簡便・迅速な遺伝子の検出が可能となる。

なお、本実施例で説明したチップの反応槽１０４は大気との間に大気の連通を妨げる壁を備える形態であることができる。一方で、製造上の観点などから、反応槽１０４領域は大気開放となっていることもできる。その際、紫外線を透過する石英ガラス等で反応槽１０４を覆うと反応液の蒸発を防止することができる。

また、反応槽の個数は１個の例を示した。しかし、検査する対象他に応じる等の観点で複数個であってもよい。

また、このように構成することにより、分析チップ内の流体がチップ外部の流体機器（ポンプ、バルブ）により流体や試薬などの流れが制御されているので、チップ内にポンプや多数のバルブを配置することを抑制することができる簡易なチップ構成にすることができる。

これにより、細菌芽胞を含む試料からの遺伝子抽出・分析までが簡便・迅速となり、試薬を予め貯蔵し分析後に試薬と共に処分しうる分析チップ及びそれを備えた分析装置を提供することができる。

また、本実施例では、蛇行流路状の液保管槽や遺伝子抽出エリアの細管の断面積は、これらの保管槽と他のエリア（例えば注入口や反応槽）をつなぐ連絡流路部より大きく形成することにより、試薬等の流体を保管槽などから排出する際の圧力損失を小さくことができる。

一方で、液が保管されている保管槽部の細管の断面積が大きすぎて液の排出時に液残りの発生を抑制する程度の小ささであることが好ましい。例えば、この連絡流路部の細管断面積に対して、１０倍以下程度にすることが考えられる。或いはさらに保管槽等と連絡流路との液流通の際の拡大・縮小損失を小さくする観点で、例えば５倍以下程度にすることが考えられる。

前記は断面積として規定したが、細管の高さは保管槽等の領域と連絡流路との差を同じかあまり変えずに、幅を前述の高さの差より大きく変えることが製造の観点で容易となり好ましい。例えば、前記の断面積として規定した数値を幅として規定することができる。

また、前記保管槽あるいは遺伝子抽出エリアと対応するポートとの間に、前記保管槽あるいは遺伝子抽出エリアの細管断面積よりも狭くなっている領域を有することが、保管している液の漏洩などを抑制する点で好ましい。

［実施例２］
本実施例は、基本的には実施例１で説明した形態を備えることができるが、本実施例では、細菌芽胞処理チップ１０１の試料注入口兼廃液槽１０２は大気開放でなく、少なくとも試料を試料注入口兼廃液槽１０２に分注した後には、試料注入口１０２には大気の連通を妨げる壁などのカバーが形成される。例えば、図８のように樹脂との密着性が良いガラス薄板（例えば顕微鏡用のカバーガラス）等の試料注入口兼廃液槽カバー１０５を試料注入口兼廃液槽１０２に被し、試料注入口兼廃液槽１０２を密閉することも出来る。試料注入口兼廃液槽１０２をカバーする工程は、手動でもよいが、分析装置側に試料注入口兼廃液槽カバー１０５を装着する機構が備わっているとより好ましい。なお、これらのカバーは予め大気の連通を妨げるよう覆われている形態であることが操作上の観点では効率的である。

これに伴って、実施例２における流体ハンドリングのプロファイルの例を図９に示す。実施例１におけるステップ３１１から３１４までは実施例２も同様である。ステップ３１５以降を説明する。分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２を開き、発芽促進剤ポート１２１に引き続きポンプ１６０から流体を流す。（ポート１２１〜１２２：開、他のポート１２３〜１２８：閉。）これにより、試料注入口兼廃液槽１０２内の試料と発芽促進剤は遺伝子溶出槽１０３に移動する。そして、試料注入口兼廃液槽１０２内の液体が全て遺伝子溶出槽１０３に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１５）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＡ１２２を閉じ、発芽促進剤ポート１２１は開いたまま溶解液ポート１２３に流体を流す。（発芽促進液ポート１２１、洗浄液ポート１２３：開、他のポート１２２、１２４〜１２８：閉。）溶解液保管槽１１２内の細胞膜溶解液は流体によって遺伝子溶出槽１０３に注入され、発芽した細菌と混合される（ステップ３１６）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えて溶解液ポート１２３を閉じ、チップポートＢ１２４を開いて発芽促進剤ポート１２１に流体を流す。（ポート１２１、１２４：開、他のポート１２２〜１２３、１２５〜１２８：閉。）これにより、遺伝子溶出槽１０３内の遺伝子懸濁液は遺伝子抽出エリア１１３に移動する。そして、遺伝子溶出槽１０３内の遺伝子懸濁液を遺伝子抽出エリア１１３に移行終了した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１７）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えてチップポートＢ１２４を閉じ、発芽促進剤ポート１２１は開いたまま洗浄液ポート１２５に流体を流す。（ポート１２１、１２５：開、他のポート１２２〜１２４、１２６〜１２８：閉。）洗浄液保管槽１１４内の洗浄液が流体によって遺伝子抽出エリア１１３に送液される。そして、遺伝子抽出エリア１１３を洗浄した洗浄液が全て遺伝子溶出槽１０３さらには試料注入口１０２側に移行した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１８）。

次に、分析装置内のバルブ１６１を切り替えて発芽促進剤ポート１２１と洗浄液ポート１２５を閉じ、溶離液ポート１２６とチップポートＣ１２８を開く。（ポート１２６、１２８：開、他のポート１２１〜１２５、１２７：閉。）そしてポンプ１６０を駆動し溶離ポート１２６に流体を流す。溶離液保管槽１１５内の溶離液は流体によって遺伝子抽出エリア１１３に送液される。この溶離液により、遺伝子抽出エリア１１３の遺伝子結合担体に捕獲されていた遺伝子が溶離し、チップポートＣ１２８が開いている反応槽１０４へと導かれる。そして溶離液が反応槽１０４に全て移行した段階で、ポンプ１６０を停止する（ステップ３１９）。

このように、試料注入口兼廃液槽１０２を密閉することで、ポンプによる流体（ここでは例えば空気）の流入操作で処理を効果的に行うことができる。実施例１のような吸引操作を不要とすることも考えられる。さらに、試料注入口兼廃液槽１０２が大気開放ゆえ起こりうる大気からの汚染や、試薬類の漏れを防止することができる。

［実施例３］
本実施例は基本的には実施例１で説明した形態を用いることができるが、本実施例では温度を一定に保ったまま遺伝子の増幅を行う。

試料から遺伝子を抽出するまでの工程は実施例１と同じである。この場合、遺伝子増幅試薬の成分が異なる。すなわち遺伝子増幅試薬は１０ｍＭ濃度の４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、バッファ（２ｍＭ濃度ＭｇＳＯ４）、４種類のプライマ、１００ｍＭ濃度のＭｇＳＯ_４、４Ｍ濃度のＢＥＴＡＩＮＥ、ＤＮＡ合成酵素（４Ｕｎｉｔ／μＬのＢｓｔポリメラーゼ）、蛍光色素（エチジウムブロマイド、SYBR GREEN（Molecular Probe製）のいずれか）の混合物とする。また温度制御機構１７０による反応槽１０４の温度調整は６０〜６５℃の範囲とする。そして目的遺伝子が存在した場合、温度制御開始１時間ほどで蛍光量が増加する。また、蛍光検出を行うのではなく、副生成物のピロリン酸マグネシウムによる白濁を吸光光度計により測定してもよい。

４種類のプライマの設計がやや困難であるが、温度のサイクルが必要ないのでペルチェより簡便なヒーターで温度調節が可能である。分析装置の構成要素を簡素化できる長所を有する。

［実施例４］
本実施例は、基本的には実施例１で説明した形態を用いることができるが、分析チップ１０１の底板１４０として、水晶振動子や表面弾性波素子などの圧電素子を適用する。圧電素子は、その電極上に付着した重さを発振周波数の変化に定量的に変換することから、微量な質量変化を反応雰囲気下で連続的に測定する手法として広く利用されている。そこで、所定の予め塩基配列が既知の様々なヌクレオチドをチップ底板１４０としての圧電素子に固定しておく。固定方法は下記の如くが好ましい。まず圧電素子の電極上にスパッタリング、蒸着などの方法でガラス薄膜を形成する。ガラスとしては、電極素材であるクロムやチタンと最も接着性のよいＳｉＯ_２を主成分としたものが好ましい。このガラス薄膜にアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）を添加し、１２０〜１６０℃程度でベークすると、ガラス薄膜の表面にアミノ基が固定される。ここで、電極とガラス薄膜の厚みがそれぞれ０.１〜１μｍであることが好ましい。双方の厚みが１μｍを超えると、圧電素子の周波数応答が悪くなるためである。さらに、アミノ基がコーティングされたガラス薄膜にヌクレオチドを塗布し、恒温恒湿槽内で３７℃、湿度９０％で１時間保温する。その後、ＵＶクロスリンカーを用いて６０ｍＪ/ｃｍ^２の紫外線を圧電素子に照射することで、ヌクレオチドは圧電素子に強固に固定される。

試料から遺伝子を抽出するまでの工程は実施例１と同じである。そして反応槽１０４に送液された遺伝子を温度制御機構１７０により９４℃付近まで昇温すると、遺伝子は熱変性して一本鎖となる。この一本鎖遺伝子と底板１４０上に固定されたヌクレオチドが結合したとき、圧電素子の発振周波数が変化する。よって、この周波数変化を測定することにより、固定したヌクレオチドと相補的な遺伝子の配列を読み取りが可能となる。

液中で圧電素子を使用した場合、液温が１℃変化すると周波数は１５〜３０Ｈｚ変化するため液温の正確な制御が必須となるが、本実施例では、遺伝子増幅試薬が不要となり、また温度サイクルが要らないため検出時間が短くなる長所がある。

細菌芽胞処理チップの構成を示す拡大図である。 反細菌芽胞処理チップの作成手順を示すフローチャート図である。 実施例１の細菌芽胞処理チップの断面図である。 細菌芽胞処理装置の構成を示す断面図である。 実施例１の分析手順を示すフローチャート図である。 実施例１の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。 実施例１の実験結果の一例である。 実施例２の細菌芽胞処理チップの断面図である。 実施例２の流体ハンドリングのプロファイルを示す図である。

符号の説明

１００…基板、１０１…細菌芽胞処理チップ、１０２…試料注入口兼廃液槽、１０３…遺伝子溶出槽兼廃液槽、１０４…反応槽、１０５…試料注入口兼廃液槽カバー、１１０…微小流路、１１１…発芽促進剤保管槽、１１２…溶解液保管槽、１１３…遺伝子抽出エリア、１１４…洗浄液保管槽、１１５…溶離液保管槽、１１６…遺伝子増幅試薬保管槽、１２０…チップポート、１２１…発芽促進剤ポート、１２２…チップポートＡ、１２３…溶解液ポート、１２４…チップポートＢ、１２５…洗浄液ポート、１２６…溶離液ポート、１２７…遺伝子増幅試薬ポート、１２８…チップポートＣ、１３１…ＰＤＭＳ第１層、１３２…ＰＤＭＳ第２層、１４０…底板、１５０…吸着溝、１６０…ポンプ、１６１…バルブ、１６２…装置内流路、１６５…ポンプ制御機構、１６６…バルブ制御機構、１７０…温度制御機構、１８０…光源、１８１…光検出器、１８５…光源制御機構、１８６…光検出器制御機構、１８７…光信号変換機、１８８…データ表示画面

Claims (17)

1. 芽胞を形成した細菌を含む試料が供給される注入口と、
   前記注入口に供給された前記試料に導入される発芽促進液を保管する発芽促進液保管部と、
   前記試料と前記発芽促進液とを混合した液に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、
   前記試料と前記発芽促進液と前記溶解液とを混合し、前記試料から遺伝子が溶出される遺伝子溶出部と、
   前記溶出遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、
   前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、
   前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、
   前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部と、を備えていることを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
2. 請求項１において、
   前記遺伝子抽出部の前記試料を含む液が導入される領域より前記遺伝子溶出部乃至前記注入口から離れた領域に、前記洗浄液保管部から前記洗浄液が導入される流路が連絡されていることを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
3. 請求項１において、
   前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部に導入された前記洗浄液は前記遺伝子抽出部を経た後に前記遺伝子溶出部乃至前記注入口側に流れるよう形成された流路を通過することを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
4. 請求項１において、
   遺伝子溶出部乃至前記注入口と前記遺伝子抽出部と前記洗浄液保管部とが流路を介して直列に配置されたことを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
5. 請求項１において、
   前記遺伝子溶出部と前記遺伝子抽出部との間から分岐して前記反応部に連絡する流路を有することを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
6. 請求項１において、
   前記発芽促進液保管部、前記溶解液保管部、前記洗浄液保管部或は溶離液保管部のいずれかの保管部は、幅よりも長手方向の長さが長い流路が曲がり部を介して複数連絡されて形成され、
   前記保管部の他端には前記保管された液体が保管部から排出される際に導入される流体の導入部を備えることを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
7. 請求項６において、
   前記いずれかの保管部を構成する流路は、前記保管部と注入口とを連絡する連絡流路の断面積に対して、１０倍以下の最大断面積を有することを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
8. 請求項６において、
   前記いずれかの保管部を構成する流路の断面構造が横／縦が１０以下であることを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
9. 請求項１において、
   前記発芽促進液保管部の発芽促進液が保管された領域より前記注入口から離れた側に位置し、前記発芽促進液が前記注入口に導入される際に流体が前記発芽促進液保管部に供給される第一の流体導入部と、
   前記遺伝子溶出部より前記注入口から離れた側に位置し、前記試料と前記発芽促進液とが混合した液体が前記注入口から前記遺伝子溶出部へ導入される前に前記遺伝子溶出部内にある流体を前記遺伝子溶出部の外に排出する第一の流体排出部と、
   前記溶解液保管部の前記溶解液が保管された領域より前記遺伝子溶出部から離れた側に位置し、前記溶解液が前記遺伝子溶出部に導入される際に流体が前記溶解液保管部に供給される第二の流体導入部と、
   前記遺伝子抽出部より前記遺伝子溶出部から離れた側に位置し、前記溶出遺伝子が前記遺伝子抽出部に導入される前に前記遺伝子抽出部内にある流体を前記遺伝子抽出部の外に排出する第二の流体排出部と、
   前記洗浄液保管部の前記洗浄液が貯蔵された領域より前記遺伝子抽出部から離れた側に前記洗浄液が前記注入口に導入される際に流体が供給される第三の流体導入部と、
   前記溶離保管部の前記溶離液が貯蔵された領域より前記遺伝子抽出部から離れた側に前記溶離液が前記注入口に導入される際に流体が供給される第四の流体導入部と、
   溶離された前記遺伝子を含む前記液を前記遺伝子抽出部から前記反応部に導入される際に流体が供給される第五の流体導入部と、
   を備えることを特徴とする細菌芽胞処理チップ。
10. 芽胞を形成した細菌を含む試料が供給される注入口と、前記注入口に供給された前記試料に導入される発芽促進液を保管する発芽促進液保管部と、前記試料と前記発芽促進液とを混合した液に導入される溶解液を保管する溶解液保管部と、前記試料と前記発芽促進液と前記溶解液とを混合し、前記試料から遺伝子が溶出される遺伝子溶出部と、前記溶出遺伝子と結合する遺伝子結合担体を備える遺伝子抽出部と、前記遺伝子抽出部に導入される洗浄液を保管する洗浄液保管部と、前記遺伝子抽出部に導入される溶離液を保管する溶離液保管部と、前記溶離液により溶離された前記遺伝子が導入される反応部とを備えた細菌芽胞処理チップが設置されるチップ設置部と、
    前記細菌芽胞処理チップに流体を導入する流体導入機構と、
    溶離した遺伝子を検出する検出機構と、
    を備えることを特徴とする細菌芽胞処理装置。
11. 請求項１０において、
    前記洗浄液保管部から前記遺伝子抽出部に導入された前記洗浄液は前記遺伝子抽出部から遺伝子溶出部乃至前記注入口に流れるよう制御されることを特徴とする細菌芽胞処理装置。
12. 被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体である細菌芽胞から遺伝子を溶出する槽と、遺伝子を精製抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する細菌芽胞処理チップを冷却して冷凍する工程と、
    前記冷凍した遺伝子処理チップを搬送する工程と、
    を有することを特徴とする細菌芽胞処理チップの使用方法。
13. 被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体である細菌芽胞から遺伝子を溶出する槽と、遺伝子を洗浄・精製抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する細菌芽胞処理チップを冷却して冷蔵する工程と、
    前記冷蔵した遺伝子処理チップを搬送する工程と、
    を有することを特徴とする細菌芽胞処理チップの使用方法。
14. 細菌芽胞に発芽促進剤を添加する工程と、
    細菌芽胞が発芽した後に細胞壁を溶解する溶解液を添加し、遺伝子を溶出する工程と、
    溶出した遺伝子をシリカ担体に吸着させた後、洗浄液を添加して洗浄する工程と、
    溶離液の添加により遺伝子をシリカ担体から溶離する工程と、
    溶離した遺伝子を検出する工程と、
    を有することを特徴とする細菌芽胞処理及び遺伝子検出方法。
15. 請求項１４において、
    発芽促進剤が、アラニン、アデノシン、グルコース、を含むブイヨンであることを特徴とする細菌芽胞処理及び遺伝子検出方法。
16. 請求項１４において、
    発芽促進剤を添加したのち、２５℃から３７℃、１０分から６０分で保持することを特徴とする細菌芽胞処理及び遺伝子検出方法。
17. 被検査体を注入する試料注入口と、前記試料注入口に連絡した試薬が貯蔵された試薬槽と、被検査体である細菌芽胞から遺伝子を溶出する槽と、遺伝子を洗浄・精製抽出するための流路と、抽出した遺伝子の検出を行う反応槽と、前記試薬槽と外部流路を結ぶ流路と、を有する細菌芽胞処理チップが、一旦、冷却して冷蔵或は冷凍されて保管された後に供給される工程と、
    前記提供された分析チップを室温に戻す工程と、
    前記試料注入口に遺伝子を含む試料が導入され、前記試薬により遺伝子が抽出される工程と、
    前記遺伝子を検出する工程と、
    を有することを特徴とする細菌芽胞処理及び遺伝子検出方法。
    

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