JP2005233920A

JP2005233920A - 誘電泳動による溶液中の物質の捕集・濃縮・分離に用いる制御装置とそれを用いる制御方法。

Info

Publication number: JP2005233920A
Application number: JP2004081447A
Authority: JP
Inventors: Tatsuo Nishina; 辰夫仁科; Masatoshi Endo; 昌敏遠藤; Rei Tsuyoshi; 玲津吉; Tadao Ihara; 忠雄井原
Original assignee: IHARA RIKEN KK
Current assignee: IHARA RIKEN KK
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2005-09-02

Abstract

【課題】クロマトグラフィーに用いられる分配剤微粒子を自在に固定・排出することにより、分離目的に合致した最適カラムを自在に素早く構築することにより、生体試料中の蛋白質あるいは環境ホルモンのような複雑な試料の濃縮・分離・分析を煩雑な前処理操作を必要とせず迅速に行える新規なクロマトグラフィーを提供することである。
【解決手段】ガラス基板に作成したマイクロアレイ電極上に、他のガラス基板に一本の溝を彫ることによって形成した溶液通路を重ね合わせ、該マイクロアレイ電極に高周波電圧を印加し、溶液通路入口から分配剤微粒子溶液を導入すると、微粒子は電極パターンに従って電極上に配列・固定される。ここに分析対象となる試料溶液を導入することにより、分配剤と試料溶液との間の化学的相互作用を利用した濃縮クロマトグラフィー分離を達成することができる。
【選択図】図３

Description

本発明は、液体クロマトグラフィーに関する。さらに詳しくは、誘電泳動による溶液中の物質の捕集・濃縮・分離に用いる新規な制御装置とそれを用いる制御方法に関する。

従来の液体クロマトグラフィーは、ステンレスチューブに数μｍの単一の逆相分配剤（例えばシリカＯＤＳ）やポリマー型吸着剤を高圧充填したカラム（分離管）を用いるため、必ずしも被検物質に最適な分離カラムを構築することは困難であった。すなわち、分離溶出液の組成および水素イオン濃度（ｐＨ）の適正条件の探索など、最適分離条件の設定のために多大な時間と労力を必要とした。また、生体試料のような複雑なマトリックスを有する試料では、前処理による試料の精製を必要とする上、さらに短時間でカラムの劣化が生じるため、生体試料中の蛋白質の迅速測定には不向きであった。

さらに、カラムに充填剤を機械的に充填するため、カラムの性能はその充填方法に大きく依存する。性質が異なる複数の試料を対象とする場合、目的とする試料にあわせてカラムを機械的に交換する必要があり、作業工程が煩雑であった。
また、多様で複雑なマトリックス物質を含む実試料の分離を繰り返して行い、カラムの汚染が生じた場合、その汚染の除去は容易ではなく、カラム全体の交換が必要であった。

一方、電気泳動およびマイクロアレイ電気泳動の従来技術は、分離手段として物質固有の電気泳動速度の違いを応用した技術である。したがって、これらの技術は、分離手段としてのみ有効であり、濃縮・分離を一連の操作として同時に行うことはできないため、環境水に含まれる環境ホルモンのように希薄な試料の濃縮・分離・分析には不向きである。そのため、人的、物的に多額な費用と時間をかけて前処理操作を必要とする。また、物質と物質を相互作用させるために自在に固定したり排出したりすることも不可能であった。

前記のような従来のクロマトグラフィーに対し、クロマトグラフィーに用いられる分配剤微粒子（シリカ、ポリマー型吸着剤等）を自在に固定・排出することにより、分離目的に合致した最適カラムを自在に素早く構築することにより、生体試料中の蛋白質あるいは環境ホルモンのような複雑な試料の濃縮・分離・分析を煩雑な前処理操作を必要とせず迅速に行える新規なクロマトグラフィーを提供することである。

誘電泳動は、交流高周波電界により粒子を電界の強いところへ引き寄せるもので、電荷をもたない粒子の運動を行うことができる。用いる高周波の周波数帯により、粒子を電極上に引き寄せる引力モードと電極から引き離す力が生じる斥力モードとを使い分けることができる。市販されている高速液体クロマトグラフィー用の分配剤は、数μｍの粒径をもつシリカあるいはポリマーの粒子であり、粒径に合わせたパターンを持つマイクロアレイ電極を用いれば、粒子の自在な固定・排出を行うことができることを見い出した。

流路内におかれたマイクロアレイ電極上に高周波電圧を印加しておき、流路入口から分配剤微粒子を導入すると、誘電泳動力により微粒子は電極のパターンに従って電極上に配列・固定される。ここに分析対象となる試料の溶液を導入することにより、分配剤と溶液との間の化学的相互作用を利用した濃縮・クロマトグラフィー分離を達成することができることを見い出した。

本発明によれば、粒子の緻密な配列化によるカラム理論段数が向上するため、この誘電泳動によればＤＮＡや蛋白質のような巨大分子の運動制御が可能であり、これを粗分離・前段濃縮に用いることが可能であると考えられる。

本発明は、ガラスまたはシリコンウェハー等の無機材料基板に作成したマイクロアレイ電極（櫛型電極）上に、ガラス、シリコン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の無機材料基板あるいは有機材料基板に一本の溝を彫ることによって形成した溶液が通過する流路を重ね合わせ、該マイクロアレイ電極に高周波電圧を印加するファンクションジェネレータを備えた誘電泳動による溶液中の物質の捕集・濃縮・分離に用いる制御装置である。

本発明は、前記の制御装置を用いて、水あるいは有機溶媒あるいは水と有機溶媒の混合溶液中に存在する被検物質を捕集・濃縮・分離する誘電泳動による溶液中の物質の捕集・濃縮・分離を行う制御方法である。

本発明によれば、分配剤を自由に選択し、自在に交換することができる新規なクロマトグラフィー技術を実現できる。
本発明の技術によって、溶液中の微量な環境ホルモンを分配剤と溶液間の化学的相互作用を利用した濃縮・クロマトグラフィーで分離・分析することが可能と考えられる。
また、本発明の技術によって、ＤＮＡや蛋白質のような巨大分子を高周波電圧を加減することにより濃縮・分離・分析が可能であると考えられる。

図１は本発明の実施のために用いた液体クロマトグラフィーの全体図である。
図中ＥＭＲカラムは、本発明の請求項１に記載の制御装置である。このＥＭＲカラムには、分配剤粒子を溶媒に分散させた分配剤スラリーと移動相として用いる溶媒が電磁バルブとシリンジポンプで交互に導入される。被検試料はマイクロシリンジでインジェクションバルブを通して導入される。ＥＭＲカラムから出た被検物質は電気化学検出器で検出される。検出のためのイオン溶液は電気化学的に検出するために必要な支持塩であり、最後部に設置されたシリンジポンプにより検出器に導入される。このシリンジポンプはＥＭＲカラムに固定された分配剤粒子の排出にも用いられる。

図２は本発明の制御装置であるＥＭＲカラムの構造図である。
ガラス基板１にエッチング法で一本の溝２を作成し液体の流路とする。この基板とマイクロアレイ電極を形成した基板３とをテフロンテープで貼り付けた。さらに溶液流路の入口と出口に溶液導入用チューブと排出用チューブ５を取り付けた。

マイクロアレイ電極に５０ｋＨｚ程度の高周波電圧を印加しておき、流路入口から分配剤微粒子を適当な溶媒に懸濁させて送り込むと、分配剤微粒子は誘電泳動力により電極上に配列・固定される。マイクロアレイ電極は電極幅、電極間隔共に１０μｍ程度の櫛型アレイ形状とし、その電極間における電界強度は５×１０^５Ｖ／ｍ程度とする。分散剤粒子の固定のされ方は、その大きさ、材質、表面修飾等によって異なるが、電場強度、周波数、溶媒の種類などを適切に選択することで良好な配列・固定を実現できる。
次ぎに、溶媒を送液して流路中の余分な分配剤微粒子を除去した後、試料溶液を導入すれば、目的のイオンや分子を分配剤との化学的相互作用により捕集・濃縮することができる。また、適当な移動相溶液を送液しておいて、微小量の試料溶液を導入すれば、複数の目的のイオンや分子をクロマトグラフィー分離を行うことができる。

フェロシアン化鉄イオンの捕集・濃縮
分配剤にはアニオン交換基を化学修飾した多孔性シリカゲル微粒子を用い、前述した実施条件でフェロシアン化鉄イオンを捕集した。
図３は、流路出口においてフェロシアン化鉄イオンを電気化学検出した際の電流応答を時間に対してプロットしたものである。プロットはイオンの漏れ出しによって立ち上がり、濃度に応じた一定値で飽和する。図から明らかなように、分配剤粒子が無い場合に比べ、本発明による分配剤粒子を固定して用いた場合には、イオン漏れ出しに約２分の時間の遅れが認められ、この時間の遅れの分のフェロシアン化鉄イオンが分配剤粒子上に捕集・濃縮されたことがわかった。

本発明は、新規なクロマトグラフィー技術であり、本技術は、環境ホルモンの環境計測分野、生体試料であるＤＮＡや蛋白質等の組成解析分野等に広い応用が可能と考えられ、産業上の利用価値は極めて高いものである。

本発明の液体クロマトグラフィーの全体図である。本発明の制御装置であるＥＭＲカラムの構造図である。フェロシアン化鉄イオンの電流応答と時間のプロット図である。

符号の説明

１．ガラス基板
２．ガラス基板上にエッチングで作成した一本溝
３．マイクロアレイ電極を形成した基板
４．櫛型状マイクロアレイ電極パターン
５．溶液導入・排出用チューブ

Claims

ガラスまたはシリコンウェハー等の無機材料基板に作成したマイクロアレイ電極（櫛型電極）上に、ガラス、シリコン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル等の無機材料基板あるいは有機材料基板に一本の溝を彫ることによって形成した溶液が通過する流路を重ね合わせ、該マイクロアレイ電極に高周波電圧を印加するファンクションジェネレータを備えたことを特徴とする誘電泳動による溶液中の物質の捕集・濃縮・分離に用いる制御装置。
請求項１に記載の制御装置を用いて、水あるいは有機溶媒あるいは水と有機溶媒の混合溶液中に存在する被検物質を捕集・濃縮・分離することを特徴とする誘電泳動による溶液中の物質の捕集・濃縮・分離を行う制御方法。