JP2005229844A - Gene marker connected to gene locus participating on number of spicule steps and its utilization - Google Patents

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和義 武田
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a gene marker existing in the genome DNA of a gramineous plant such as barley and connected to a gene locus participating on the number of spicule steps, and to provide a method for utilizing the gene marker. <P>SOLUTION: The detailed chain map of barley was made, and a QTL analysis was carried out. Thus, two gene markers connected to a gene locus participating on the number of spicule steps and boarded on barley 1H chromosome, two gene markers connected to a gene locus participating on the number of spicule steps and boarded on barley 2H chromosome, two gene markers connected to a gene locus participating on the number of spicule steps and boarded on barley 3H chromosome were found, two gene markers connected to a gene locus participating on the number of spicule steps and boarded on barley 4H chromosome were found, and two gene markers connected to a gene locus participating on the number of spicule steps and boarded on barley 5H chromosome were found. <P>COPYRIGHT: (C)2005,JPO&NCIPI

Description

本発明は、新規遺伝マーカーおよびその利用法に関するものであり、特に、オオムギ等のイネ科植物における小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーと、その利用に関するものである。   The present invention relates to a novel genetic marker and a method for using the same, and more particularly to a genetic marker linked to a locus related to the number of spikelets in a grass family such as barley and the use thereof.

イネ科植物の「小穂段数」とは穂についている粒の数のことである。二条オオムギの収量はm2当たりの穂数×小穂段数×1粒重で表すことができるため、「小穂段数」は収量を推定する際の目安となる。したがって同じ穂数と1粒重を有する場合、小穂段数が多い品種ほど、その収量が高いといえる。よって栽培品種においては小穂段数が多いことが好ましい形質であるといえる。 The number of spikelets in the grass family is the number of grains on the spike. Since the yield of Nijo barley can be expressed by the number of spikes per m 2 × number of spikelets × 1 grain weight, “number of spikelets” is a guideline for estimating the yield. Therefore, when having the same number of spikes and one grain weight, it can be said that the yield is higher as the number of spikelets is larger. Therefore, it can be said that a large number of spikelets is a preferable trait in cultivars.

従来、作物の育種は目標形質を有する栽培品種や野生種等を交配し、多数の個体を実際に栽培して目標形質を有する個体を選抜し、当該目標形質を遺伝的に固定化しなければならず、広大な圃場や多大な人力、相当の年月が必要であった。例えば、小穂段数が多い形質を目標とした場合には、選抜対象集団を栽培し、各個体が出穂した後に小穂段数を実際に測定することにより、選抜すべき個体を特定しなければならなかった。また、目標形質が栽培環境因子に影響を受けやすい形質であれば、選抜個体が発現している目標形質が遺伝子の表現型であるか否かの判定が困難であった。   Conventionally, for breeding crops, it is necessary to cross cultivated varieties or wild varieties with a target trait, actually cultivate many individuals, select individuals with the target trait, and genetically fix the target trait First of all, it required a vast field, a lot of human power, and considerable years. For example, when targeting traits with a large number of spikelets, the individuals to be selected must be identified by cultivating the population to be selected and actually measuring the spikelet number after each individual heads. There wasn't. Further, if the target trait is a trait that is easily affected by the cultivation environment factor, it is difficult to determine whether or not the target trait expressed by the selected individual is a gene phenotype.

そこで、近年は育種期間の短縮、労働力および圃場面積の縮減、有用遺伝子の確実な選抜を図るため、遺伝マーカーを指標とした選抜による育種法が用いられるようになってきた。このような遺伝マーカーによる育種では、マーカーの遺伝子型により幼苗段階で選抜が可能となり、目標形質の有無の確認も容易となる。したがって、遺伝マーカーを利用すれば効率的な育種が実現可能である。そして、遺伝マーカーを利用した育種を実現するためには、目標形質に強く連鎖した遺伝マーカーの開発が必須となる。   Therefore, in recent years, breeding methods by selection using genetic markers as indices have been used in order to shorten the breeding period, reduce labor and field area, and reliably select useful genes. In breeding with such a genetic marker, selection can be made at the seedling stage depending on the genotype of the marker, and the presence or absence of the target trait can be easily confirmed. Therefore, efficient breeding can be realized by using genetic markers. In order to achieve breeding using genetic markers, it is essential to develop genetic markers that are strongly linked to the target trait.

ところで、農業上重要な形質の多くは、雑種後代で連続的な変異を示すものが多い。このような形質は、時間や長さなどの量的な尺度で測定されるので量的形質と呼ばれている。上記小穂段数も量的形質の1つであることが知られている。量的形質は一般に、単一主働遺伝子支配の形質ではなく、複数の遺伝子の作用によって決定されている場合が多い。作物の育種において改良対象とされる形質の多く、例えば収量や品質・食味等はこの量的形質であることが多い。   By the way, many of the traits important in agriculture are many that show continuous mutations in hybrid progeny. Such traits are called quantitative traits because they are measured on a quantitative scale such as time and length. It is known that the number of spikelets is one of quantitative traits. In general, quantitative traits are often determined by the action of multiple genes, rather than a single dominant gene-dominated trait. Many traits that are targeted for improvement in crop breeding, such as yield, quality, and taste, are often quantitative traits.

このような量的形質を司る遺伝子が染色体上に占める遺伝的な位置をQTL(Quantitative Trait Loci、量的形質遺伝子座)と称する。QTLを推定する方法として、QTLの近傍に存在する遺伝マーカーを利用するQTL解析が用いられる。1980年代後半にDNAマーカーが登場すると、DNAマーカー利用による詳細な連鎖地図作成が大きく進み、その地図に基づいて多くの生物でQTL解析が行われるようになった。   A genetic position occupied by such a gene that governs quantitative traits on a chromosome is referred to as QTL (Quantitative Trait Loci). As a method of estimating QTL, QTL analysis using a genetic marker existing in the vicinity of QTL is used. With the advent of DNA markers in the late 1980s, detailed linkage map creation using DNA markers has greatly progressed, and QTL analysis has been performed on many organisms based on the maps.

以上のように、目標形質に連鎖する遺伝マーカーの開発は、染色体全体をカバーできる詳細な連鎖地図に基づいた精度の高いQTL解析により可能となり、得られた遺伝マーカーを利用することにより、効率的な育種が実現できるといえる。   As described above, the development of genetic markers linked to the target trait is enabled by high-accuracy QTL analysis based on a detailed linkage map that can cover the entire chromosome, and by using the obtained genetic markers, it is efficient. It can be said that simple breeding can be realized.

上記遺伝マーカーに関する技術としては、オオムギを例に挙げると、1)オオムギにアルミニウム耐性を付与する遺伝子に連鎖する遺伝マーカーとその利用に関する技術(特許文献1参照)や、2)オオムギ染色体由来の核酸マーカーをコムギの背景で検出するための新規なプライマーセット(特許文献2参照)とその利用に関する技術等が、本発明者らによって提案されている。
特開2002−291474号公報(2002(平成14)年10月8日公開) 特開2003−111593号公報(2003(平成15)年4月15日公開)
Examples of techniques related to the genetic marker include, for example, barley, 1) a genetic marker linked to a gene that confers aluminum resistance to barley and a technique related to its use (see Patent Document 1), and 2) a nucleic acid derived from a barley chromosome. The present inventors have proposed a novel primer set (see Patent Document 2) for detecting a marker in the background of wheat, a technique relating to its use, and the like.
JP 2002-291474 A (published on October 8, 2002) JP 2003-111593 A (published on April 15, 2003)

上述のように、イネ科植物の小穂段数はイネ科植物の収量に関与しているため、小穂段数の改変は重要な育種目標の1つである。しかし、小穂段数は栽培環境因子に影響を受けやすい形質であり、複数の遺伝子座が関与する場合が多いため、実際に小穂段数を調査する選抜方法では小穂段数に関与する遺伝子(遺伝子座)を確実に選抜しているか否かを確認することが困難である。そこで小穂段数を改変した植物の育種には遺伝マーカーを利用することが非常に有効である。小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーが開発され、利用可能となれば、小穂段数改変植物の育種の大幅な効率化を実現することが可能となる。   As mentioned above, since the number of spikelets of the grass family is involved in the yield of the grass family, the modification of the spikelet stage is one of important breeding goals. However, the number of spikelets is a trait that is easily influenced by cultivation environment factors, and there are many cases where multiple loci are involved. Therefore, in the selection method that actually investigates the spikelet number, the gene (gene) It is difficult to confirm whether or not the seat has been selected. Therefore, it is very effective to use genetic markers for breeding plants with modified spikelet stages. If genetic markers linked to the loci involved in the spikelet stage number are developed and made available, it will be possible to achieve significant efficiency in breeding the spikelet stage modified plant.

本発明は、上記課題に鑑みなされたものであって、その目的は、イネ科植物、特にオオムギにおける小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する新規遺伝マーカーと、その代表的な利用法とを提供することにある。   The present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a novel genetic marker linked to a locus related to the number of spikelets in a grass family, particularly barley, and a typical use thereof. It is to provide.

本発明者らは、上記課題を解決すべく、発明者らが有するオオムギEST配列に基づいてプライマーセットを設計し、当該プライマーセットにより増幅されるオオムギゲノム断片の多型の有無により遺伝マーカー(DNAマーカー)を開発した。さらに、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「H602」の交雑F1から作出した倍加半数体(doubled haploid、以下「DH」と略記する。)集団を材料として、上記遺伝マーカー間の連鎖を検出して、当該DH系統の連鎖地図を作成し、この連鎖地図に基づいて小穂段数に関与する遺伝子座のQTL解析を行った。その結果、小穂段数に関与する遺伝子座を1H染色体上,2H染色体上,3H染色体上,4H染色体上,5H染色体上にそれぞれ1つづつ検出した。本発明者等はさらに解析を進め、これら小穂段数に関与する遺伝子座にそれぞれ連鎖する新規遺伝マーカーを見いだした。したがって本発明は、上記新規知見により完成されたものであり、以下の発明を包含する。   In order to solve the above problems, the present inventors designed a primer set based on the barley EST sequence possessed by the inventors, and determined whether or not a genetic marker (DNA Marker) was developed. Furthermore, using a doubled haploid (hereinafter abbreviated as “DH”) population produced from a cross F1 of brewing barley “Haruna Nijo” and wild barley “H602”, the linkage between the above genetic markers is detected. Then, a linkage map of the DH strain was prepared, and QTL analysis of the gene locus involved in the number of spikelets was performed based on this linkage map. As a result, loci involved in the number of spikelets were detected one by one on the 1H chromosome, 2H chromosome, 3H chromosome, 4H chromosome, and 5H chromosome. The present inventors have further analyzed and found novel genetic markers linked to the loci involved in the number of spikelets. Accordingly, the present invention has been completed based on the above-described novel findings and includes the following inventions.

すなわち本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムDNA中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、上記小穂段数に関与する遺伝子座から0ないし8センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴としている。上記遺伝マーカーは、小穂段数に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと小穂段数に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率は低い。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、例えば小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変イネ科植物の生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   That is, the genetic marker according to the present invention is a genetic marker that is present in the genomic DNA of a grass family and is linked to a locus related to the number of spikelets, and is 0 to 8 from the locus related to the number of spikelets. It is characterized by being located at a distance within the range of a centimorgan. Since the above genetic marker is strongly linked to the locus associated with the number of spikelets, the probability of recombination occurring between the genetic marker and the locus associated with the number of spikelets is low. Therefore, by using the genetic marker, for example, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets, to produce (produce) or discriminate a spikelet-modified plant.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記イネ科植物がムギ類であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギ・コムギ等のムギ類において小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変ムギ類の生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is characterized in that the Gramineae plant is a wheat. Therefore, by using the above genetic markers, obtaining DNA fragments containing loci involved in the number of spikelets in wheat, such as barley and wheat, and producing (producing) and discriminating spikelets with modified spikelets Is possible.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ムギ類がオオムギであることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギにおいて小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is characterized in that the wheat is a barley. Therefore, by using the above genetic marker, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets in barley, to produce (produce) and discriminate the spikelet-modified barley.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムDNAが1H染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの1H染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is characterized in that the genomic DNA is a 1H chromosome. Therefore, by using the above genetic marker, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets present on the 1H chromosome of barley, to produce (produce) and discriminate the spikelet-modified barley. It becomes possible.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第一プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is amplified using a first primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the first primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第二プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   The genetic marker according to the present invention is amplified using a second primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the second primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムDNAが2H染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの2H染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   The genetic marker according to the present invention is characterized in that the genomic DNA is a 2H chromosome. Therefore, by using the above genetic marker, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets present on the 2H chromosome of barley, to produce (produce) and discriminate the spikelet-modified barley. It becomes possible.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号5に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号6に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第三プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   The genetic marker according to the present invention is amplified using a third primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the third primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号7に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号8に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第四プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   The genetic marker according to the present invention is amplified using a fourth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the fourth primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムDNAが3H染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの3H染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   The genetic marker according to the present invention is characterized in that the genomic DNA is a 3H chromosome. Therefore, by using the above genetic marker, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets present on the 3H chromosome of barley, to produce (produce) and discriminate the spikelet-modified barley. It becomes possible.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号9に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号10に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第五プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is amplified using a fifth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the fifth primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号11に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号12に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第六プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別が容易に行うことができる。   The genetic marker according to the present invention is amplified using a sixth primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the sixth primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムDNAが4H染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの4H染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   The genetic marker according to the present invention is characterized in that the genomic DNA is a 4H chromosome. Therefore, by using the above genetic marker, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets present on the 4H chromosome of barley, to produce (produce) and discriminate the spikelet-modified barley. It becomes possible.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号13に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号14に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第七プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第七プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is amplified using a seventh primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the seventh primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified rice plant can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号15に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号16に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第八プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別が容易に行うことができる。   The genetic marker according to the present invention is amplified using a sixth primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the eighth primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage number-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、上記ゲノムDNAが5H染色体であることを特徴としている。それゆえ上記遺伝マーカーを用いることによって、オオムギの5H染色体上に存在する小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の取得、小穂段数改変オオムギの生産(作出)・判別等を行うことが可能となる。   The genetic marker according to the present invention is characterized in that the genomic DNA is a 5H chromosome. Therefore, by using the above genetic marker, it is possible to obtain a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets present on the 5H chromosome of barley, to produce (produce) and discriminate the spikelet-modified barley. It becomes possible.

さらに本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号17に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号18に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第九プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第九プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別を容易に行うことができる。   Furthermore, the genetic marker according to the present invention is amplified using a ninth primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 18. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the ninth primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage-modified grass family can be easily identified.

また本発明にかかる遺伝マーカーは、配列番号19に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号20に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第十プライマーセットを用いて増幅されることを特徴としている。上記第十プライマーセットを用いてPCR等の増幅反応を行えば当該遺伝マーカーを容易に増幅・検出することが可能となり、小穂段数改変イネ科植物の判別が容易に行うことができる。   The genetic marker according to the present invention is amplified using a tenth primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 20. It is a feature. When an amplification reaction such as PCR is performed using the tenth primer set, the genetic marker can be easily amplified and detected, and the spikelet stage-modified grass family can be easily identified.

一方、本発明にかかるDNA断片の単離方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを用いて小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することを特徴としている。本発明にかかる遺伝マーカーは小穂段数に関与する遺伝子座に強連鎖するものであり、上記遺伝マーカーを目標にクローニングを行えば、小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を容易に単離することが可能となる。   On the other hand, the method for isolating a DNA fragment according to the present invention is characterized by isolating a DNA fragment containing a gene locus involved in the number of spikelets using the genetic marker according to the present invention. The genetic marker according to the present invention is strongly linked to a locus related to the number of spikelets. Cloning with the above genetic marker as a target makes it easy to singly contain a DNA fragment containing the locus related to the number of spikelets. Can be separated.

また本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物の生産方法は、上記本発明にかかるDNA断片の単離方法により得られた上記小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を、イネ科植物のゲノムDNAに導入することを特徴としている。上記イネ科植物はムギ類であることが好ましく、オオムギであることがより好ましい。当該生産方法により、小穂段数改変イネ科植物を生産することが可能となる。   In addition, the method for producing a spikelet stage-modified gramineous plant according to the present invention includes a DNA fragment containing the locus associated with the spikelet stage number obtained by the above-described DNA fragment isolation method according to the present invention. It is characterized by being introduced into the genomic DNA. The gramineous plant is preferably wheat, and more preferably barley. According to the production method, it is possible to produce a spikelet number-modified grass.

また本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物は、上記本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物の生産方法によって得られることを特徴としている。特に小穂段数が多くなった改変イネ科植物は、該作物の収量を増加させることができる。   The spikelet stage number modified gramineous plant according to the present invention is characterized by being obtained by the method for producing the spikelet stage number modified grass family according to the present invention. In particular, a modified gramineous plant having an increased number of spikelets can increase the yield of the crop.

また本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として、小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法である。上記本発明にかかる遺伝マーカーは、小穂段数に関与する遺伝子座に強連鎖するため、当該遺伝マーカーと小穂段数に関与する遺伝子座間で分離して組み換えが起こる確率が非常に低い。それゆえ上記遺伝マーカーを検出することによって、試験対象植物における小穂段数に関与する遺伝子座の遺伝子型を容易に判別することができ、選抜すべき個体を容易に見出すことが可能となる。   The method for selecting a spikelet stage number-modified grass family according to the present invention is a method for selecting a spikelet stage number-modified grass plant using the genetic marker according to the present invention as an index. Since the genetic marker according to the present invention is strongly linked to the locus related to the number of spikelets, the probability that recombination occurs between the genetic marker and the locus related to the number of spikelets is very low. Therefore, by detecting the genetic marker, the genotype of the locus involved in the number of spikelets in the test target plant can be easily distinguished, and the individual to be selected can be easily found.

本発明にかかる遺伝マーカーは、小穂段数に関与する遺伝子座と連鎖するため、当該遺伝マーカーを指標として小穂段数を改変したイネ科植物の育種を可能とする。したがって、小穂段数改変植物の効率的な育種が実現できるという効果を奏する。より具体的には、幼苗段階で目的個体を選抜できるため、実際に植物個体の小穂段数を観察した後に目的の個体を選抜する必要がなくなり、育種期間を短縮できるという効果を奏する。また、複数の遺伝子座を同時に選抜できるために、観察によって選抜するよりも、確実に目的とする遺伝子型を得ることができる。さらに、労働力および圃場面積を縮減できるという効果を奏する。   Since the genetic marker according to the present invention is linked to a locus related to the number of spikelets, it is possible to breed a grass plant with the spikelet number modified using the genetic marker as an index. Therefore, there is an effect that efficient breeding of the spikelet stage number modified plant can be realized. More specifically, since the target individual can be selected at the seedling stage, there is no need to select the target individual after actually observing the number of spikelets of the plant individual, and the breeding period can be shortened. In addition, since a plurality of gene loci can be selected at the same time, the target genotype can be surely obtained rather than selecting by observation. In addition, the labor force and the field area can be reduced.

また、本発明にかかる遺伝マーカーを指標として選抜育種を行えば、栽培環境因子による表現型への影響を排除することが可能となる。したがって、有用遺伝子(遺伝子座)の確実な選抜ができるという効果を奏する。   Moreover, if selective breeding is performed using the genetic marker according to the present invention as an index, the influence on the phenotype by the cultivation environment factor can be eliminated. Therefore, there is an effect that reliable selection of useful genes (locus) can be achieved.

また、上記遺伝マーカーを指標として選択的に育種された小穂段数改変植物、特に小穂段数が多くなった改変植物は、該作物の収量を増加させることできるという効果を奏する。さらには小穂段数を指標として種や品種の識別が容易となり、異種または異品種の混入を排除できるという効果を奏する。   In addition, a spikelet stage modified plant that has been selectively bred using the genetic marker as an indicator, particularly a modified plant with an increased spikelet stage number, can increase the yield of the crop. Furthermore, the identification of species and varieties is facilitated using the number of spikelets as an index, and there is an effect that mixing of different types or different varieties can be eliminated.

本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。   An embodiment of the present invention will be described as follows. Note that the present invention is not limited to this.

本発明は、イネ科植物における小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーとその利用の一例とに関するものである。以下、本発明にかかる遺伝マーカー、本発明の有用性、並びに本発明の利用の一例について説明する。   The present invention relates to a genetic marker linked to a locus related to the number of spikelets in a gramineous plant and an example of its use. Hereinafter, genetic markers according to the present invention, usefulness of the present invention, and examples of use of the present invention will be described.

(1)本発明にかかる遺伝マーカー
本発明にかかる遺伝マーカーは、イネ科植物のゲノムDNA中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖しているものであればよい。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。イネ科植物とは、オオムギ属、コムギ属、イネ等の植物であればよく、特に限定されるものではない。また、ムギ類とは、例えばオオムギ、コムギ、ライムギ、ライコムギ、エンバク等を意味する。
(1) Genetic marker according to the present invention The genetic marker according to the present invention may be any genetic marker as long as it is present in the genomic DNA of a grass family and is linked to a locus related to the number of spikelets. As the gramineous plant, wheat is preferable, and barley is particularly preferable. The grass family plant is not particularly limited as long as it is a plant such as barley, wheat, and rice. The wheat refers to, for example, barley, wheat, rye, triticale, oat and the like.

「小穂段数」とは、イネ科植物の「小穂段数」とは穂についている粒の数のことである。二条オオムギの収量はm2当たりの穂数×小穂段数×1粒重で表すことができるため、「小穂段数」は収量を推定する際の目安となる。したがって同じ穂数と1粒重を有する場合、小穂段数が多い品種ほど、その収量が高いといえる。よって栽培品種においては小穂段数が多いことが好ましい形質であるといえる。したがって優良形質を有する品種を育種する際には、なるべく小穂段数の多いものを選抜する必要がある。 “The number of spikelets” is the number of spikelets in the gramineous plant. Since the yield of Nijo barley can be expressed by the number of spikes per m 2 × number of spikelets × 1 grain weight, “number of spikelets” is a guideline for estimating the yield. Therefore, when having the same number of spikes and one grain weight, it can be said that the yield is higher as the number of spikelets is larger. Therefore, it can be said that a large number of spikelets is a preferable trait in cultivars. Therefore, when breeding varieties having excellent traits, it is necessary to select those having as many spikelets as possible.

またイネ科植物において小穂段数は種や品種によってその長さが異なることが知られている。したがって、他の品種と異なる小穂段数を有する品種を育成すれば、異品種等の混入を容易に識別することもできる。よって小穂段数の改変は重要な育種目標の1つであるといえる。   Moreover, it is known that the number of spikelets in grasses varies depending on the species and variety. Therefore, if a variety having a different spikelet number from other varieties is grown, contamination of different varieties can be easily identified. Therefore, it can be said that the modification of the number of spikelets is one of the important breeding goals.

小穂段数は量的形質であり、複数の遺伝子座により決定される形質である。量的形質はQTL解析により当該量的形質に関与している遺伝子座の染色体上の位置を推定することができる。以下、本発明者らがオオムギにおいて開発した小穂段数に関与する遺伝子座と連鎖する遺伝マーカーについて詳細に説明する。なお、本発明に係る遺伝マーカーはこれらに限定されるものではない。   The number of spikelets is a quantitative trait that is determined by multiple loci. With respect to quantitative traits, the position of the gene locus involved in the quantitative trait on the chromosome can be estimated by QTL analysis. Hereinafter, genetic markers linked to loci involved in the number of spikelets developed by the present inventors in barley will be described in detail. The genetic markers according to the present invention are not limited to these.

本発明者らは、醸造用オオムギ「はるな二条」と野生オオムギ「H602」との交雑F1から作出した倍加半数体(DH)集団を用いて、高密度連鎖地図を作成した。すなわち、本発明者らが有するオオムギEST(expressed sequence tag)配列に基づいて設計されたプライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを増幅し、「はるな二条」と「H602」との間に増幅断片長の多型を有するものや、増幅断片長の制限酵素による消化のパターンが異なる多型を有するものを特定し、これらのDNAマーカーを含む約500遺伝子座からなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図および本発明者らが測定した上記DH集団93個体についての小穂段数のデータに基づいて、小穂段数に関与する遺伝子座のQTL解析を行った。その結果、小穂段数に関与する遺伝子座を1H染色体上、2H染色体上、3H染色体上、4H染色体上、5H染色体上にそれぞれ1つづつ検出した。本発明にかかる遺伝マーカーは、1H染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する2つの遺伝マーカーと、2H染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する2つの遺伝マーカーと、3H染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する2つの遺伝マーカーと、4H染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する2つの遺伝マーカーと、5H染色体上に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座を挟み、最も近傍に位置する2つの遺伝マーカーである。発明者らは1H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「k03582」および「k00591」、2H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「k07732」および「k07430」、3H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「k06937」および「k02538」、4H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「k03289」および「k01301」、5H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーを「k02321」および「k00835」と命名した。   The present inventors created a high-density linkage map using a doubled haploid (DH) population produced from a cross F1 of brewing barley “Haruna Nijo” and wild barley “H602”. That is, barley genomic DNA was amplified using a primer set designed based on the barley EST (expressed sequence tag) sequence possessed by the present inventors, and the length of the amplified fragment was determined between “Haruna Nijo” and “H602”. Those having polymorphisms and those having polymorphisms that differ in the digestion pattern of the amplified fragment length by restriction enzymes were identified, and a linkage map comprising about 500 loci including these DNA markers was constructed. Based on this linkage map and data on the number of spikelets for the 93 individuals of the DH population measured by the present inventors, QTL analysis of loci involved in the number of spikelets was performed. As a result, loci involved in the number of spikelets were detected one by one on the 1H chromosome, 2H chromosome, 3H chromosome, 4H chromosome, and 5H chromosome. The genetic marker according to the present invention is related to the two genetic markers located closest to each other and the number of spikelets to be seated on the 2H chromosome across the locus associated with the number of spikelets to be seated on the 1H chromosome. Two genetic markers located closest to each other across the gene locus and two genetic markers related to the number of spikelets located on the 3H chromosome, and two genetic markers located closest to each other and located on the 4H chromosome Two genetic markers located closest to each other with two genetic markers located closest to the number of spikelet steps on the 5H chromosome and two genetic markers located closest to each other located on the 5H chromosome. It is a marker. The inventors linked genetic markers linked to loci associated with the number of spikelets detected on the 1H chromosome to “k03582” and “k00591”, loci associated with the number of spikelets detected on the 2H chromosome. The genetic markers linked to the loci involved in the number of spikelets detected on the “k07732” and “k07430” and 3H chromosomes are the genetic markers “k06937” and “k02538” and the spikelets detected on the 4H chromosome. Genetic markers linked to loci involved in the number of stages are named “k03289” and “k01301”, and genetic markers linked to loci related to the number of spikelets detected on the 5H chromosome are designated “k02321” and “k00835”. did.

k03582は、
CGTCGCAGGACTGTACTGAA(配列番号1)に示される塩基配列を有するプライマー、およびAGGAAGCGACATGGAAGATG(配列番号2)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅されるDNAマーカーであり、上記1H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約0センチモルガン(以下cMと表示する)の位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:bah13o05、配列番号21)に基づいて設計されている。図1に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号1)および上記プライマー配列(配列番号2)の相補配列である。
k03582 is
Amplified using barley genomic DNA as a template using a first primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown by CGTCGCAGGACTGTTACGAA (SEQ ID NO: 1) and a primer having the base sequence shown by AGGAAGCGACATGAGAATG (SEQ ID NO: 2) A DNA marker that sits at a position of about 0 centmorgan (hereinafter referred to as cM) on the short arm side from the locus related to the number of spikelets detected on the 1H chromosome. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences uniquely developed by the inventors (EST clone name: bah13o05, SEQ ID NO: 21). FIG. 1 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 1) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 2).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間には、SNP(single nucleotide polymorphisms;一塩基多型)がある。図2に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号22)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号23)である。□(四角)で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素XhoIの認識配列(CTCGAG)を示す。図2から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素XhoIの認識配列(CTCGAG)を有しているためXhoIで切断されるが、H602の増幅産物は上記認識配列部分のCがTに変異しているため(CTTGAG)制限酵素XhoIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk03582は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第一プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素XhoI切断により、対象個体が当該1H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is SNP (single nucleotide polymorphisms) between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 2 shows the base sequence of the portion containing the SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 22), and the bottom is Haruna Nijo base sequence (SEQ ID NO: 23). A base surrounded by a square (square) is a SNP. The underlined portion indicates the recognition sequence (CTCGAG) of the restriction enzyme XhoI. As can be seen from FIG. 2, the Haruna Nijo amplification product has a restriction enzyme XhoI recognition sequence (CTCGAG) and is cleaved with XhoI. Since it is mutated (CTTGAG), it is not cleaved by the restriction enzyme XhoI. That is, the present genetic marker k03582 is a CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 1H chromosome by amplification with the first primer set and restriction enzyme XhoI cleavage of the amplified product. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

ここで、栽培品種である「はるな2条」は小穂段数が少ない形質(以下適宜「少小穂段数型」と称する)を有し、野生品種である「H602」は小穂段数が多い形質(以下適宜「多小穂段数型」と称する)を有する。よって第一プライマーセットを用いて得られる増幅産物が、制限酵素XhoIによって切断されれば、当該試験対象植物はるな二条型、すなわち少小穂段数型であると判別でき、逆に当該制限酵素によって切断されなければH602型、すなわち多小穂段数型であると判断できる。   Here, the cultivar “Haruna 2” has a trait with a small number of spikelets (hereinafter referred to as “small spikelet number type” as appropriate), and the wild cultivar “H602” has a trait with a large number of spikelets. (Hereinafter referred to as “multiple spike stage type” as appropriate). Therefore, if the amplification product obtained using the first primer set is cleaved by the restriction enzyme XhoI, the plant to be tested can be identified as the Haruna Nijo type, that is, the small spikelet type, and conversely cleaved by the restriction enzyme. If not, it can be determined that the type is H602, that is, the type of multiple spikelets.

上記制限酵素による切断の有無の確認は、特に限定されるものではないが、例えば上記制限酵素XhoIで消化したものと、未消化のものを電気泳動にかけ、そのときにみられるDNA断片バンドの数が未消化のものに比して増加していれば上記XhoIで切断されたと判断でき、変化がなければ上記XhoIで切断されないと判断できる。なお以下に示す他のプライマーセットを用いたその他の遺伝マーカーの検出・判別においても同様に行なえばよい。   Confirmation of the presence or absence of cleavage by the restriction enzyme is not particularly limited, but, for example, the number of DNA fragment bands observed at that time after electrophoresis of the restriction enzyme XhoI digested and the undigested one. Can be determined to be cleaved with the XhoI if it is increased compared to that of undigested, and it can be determined that it is not cleaved with the XhoI if there is no change. The same may be done for the detection and discrimination of other genetic markers using other primer sets described below.

またk00591は、
CGAGAAGAAACGGAGACGAC(配列番号3)に示される塩基配列を有するプライマー、および
GATCATCAACGAGAGCGTGA(配列番号4)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記1H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約0cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:baak36b12、配列番号24)に基づいて設計されている。図3に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号3)および上記プライマー配列(配列番号4)の相補配列である。
K00591 is
Barley genomic DNA was amplified using a second primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown by CGAGAAGAAAACGGAGACGAC (SEQ ID NO: 3) and a primer having the base sequence shown by GATCATCAACGAGACGGTGA (SEQ ID NO: 4) as a template. This genetic marker is located at a position about 0 cM away from the gene locus related to the number of spikelets detected on the 1H chromosome on the long arm side. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: baak36b12, SEQ ID NO: 24). FIG. 3 shows the entire base sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 3) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 4).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図4に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号25)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号26)である。□で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素BcnIの認識配列(CC[GまたはC]GG)を示す。図4から明らかなように、H602の増幅産物は制限酵素BcnIの認識配列(CCGGG)を有しているためBcnIで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のGがAに変異しているため(CCGGA)制限酵素BcnIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk00591は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第二プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素BcnI切断により、対象個体が当該1H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 4 shows the base sequence of the portion containing the above SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 25), and the bottom is the base sequence of Haruna Nijo (SEQ ID NO: 26). The base surrounded by □ is SNP. The underlined part shows the recognition sequence (CC [G or C] GG) of the restriction enzyme BcnI. As is apparent from FIG. 4, the amplification product of H602 has a restriction enzyme BcnI recognition sequence (CCGGGG), so that it is cleaved by BcnI. Since it is mutated (CCCGGA), it is not cleaved by the restriction enzyme BcnI. That is, this genetic marker k00591 is a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker, and the number of spikelets on which the target individual sits on the 1H chromosome by amplification with the second primer set and cleavage of the amplified product BcnI. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk07732は、
CTTGCAAAGAATGGCCTAGC(配列番号5)に示される塩基配列を有するプライマー、および
GAAAACATGCCAGGAAGGAC(配列番号6)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記2H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約3.5cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:BaGS20M01、配列番号27)に基づいて設計されている。図5に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号5)および上記プライマー配列(配列番号6)の相補配列である。
K07732 is
Amplified using barley genomic DNA as a template using a third primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown in CTTGCAAAGAATGGCCTAGC (SEQ ID NO: 5) and a primer having the base sequence shown in GAAAAACATGCCCAGGAAGGAC (SEQ ID NO: 6) This genetic marker is located at a position about 3.5 cM on the short arm side from the locus associated with the number of spikelets detected on the 2H chromosome. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: BaGS20M01, SEQ ID NO: 27). FIG. 5 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 5) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 6).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図6に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号28)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号29)である。□(四角)で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素EcoRVの認識配列(GATATC)を示す。図6から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素EcoRVの認識配列(GATATC)を有しているためEcoRVで切断されるが、H602の増幅産物は上記認識配列部分のCがGに変異しているため(GATATG)制限酵素EcoRVで切断されない。
すなわち、本遺伝マーカーk07732は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第三プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素EcoRV切断により、対象個体が当該2H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。
There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 6 shows the base sequence of the portion containing the above SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 28), and the bottom is Haruna Nijo base sequence (SEQ ID NO: 29). A base surrounded by a square (square) is a SNP. The underlined part shows the recognition sequence (GATATC) of the restriction enzyme EcoRV. As is clear from FIG. 6, since the amplification product of Haruna Nijo has the recognition sequence (GATATC) of the restriction enzyme EcoRV, it is cleaved by EcoRV. Since it is mutated (GATATG), it is not cleaved by the restriction enzyme EcoRV.
That is, this genetic marker k07732 is a CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 2H chromosome by amplification with the third primer set and restriction enzyme EcoRV cleavage of the amplified product. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk07430は、
TGGCTGCTATGCTACGTTTG(配列番号7)に示される塩基配列を有するプライマー、およびAATTTGGAGGAGCTGTTGGA(配列番号8)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記2H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約0cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:baet18F0911、配列番号30)に基づいて設計されている。図7に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号7)および上記プライマー配列(配列番号8)の相補配列である。
K07430 is
Barley genomic DNA was amplified using a fourth primer set, which is a combination of a primer having the base sequence shown in TGGCTGCTATGCTACGTTTG (SEQ ID NO: 7) and a primer having the base sequence shown in AATTTTGAGGAGCTGTTGGA (SEQ ID NO: 8). This genetic marker is located at a position about 0 cM on the long arm side from the gene locus related to the number of spikelets detected on the 2H chromosome. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences uniquely developed by the inventors (EST clone name: baet18F0911, SEQ ID NO: 30). FIG. 7 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined part is the primer sequence (SEQ ID NO: 7) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 8).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図8に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号31)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号32)である。□(四角)で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素HaeIIIの認識配列(GGCC)を示す。図8から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素HaeIIIの認識配列(GGCC)を有しているためHaeIIIで切断されるが、H602の増幅産物は上記認識配列部分のGがAに変異しているため(GACC)、制限酵素HaeIIIで切断されない。
すなわち、本遺伝マーカーk07430は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第四プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素HaeIII切断により、対象個体が当該2H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。
There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 8 shows the base sequence of the portion containing the SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 31), and the bottom is Haruna Nijo base sequence (SEQ ID NO: 32). A base surrounded by a square (square) is a SNP. The underlined part indicates the restriction enzyme HaeIII recognition sequence (GGCC). As is clear from FIG. 8, the Haruna Nijo amplification product has a restriction enzyme HaeIII recognition sequence (GGCC) and is cleaved by HaeIII. Since it is mutated (GACC), it is not cleaved by the restriction enzyme HaeIII.
That is, the present genetic marker k07430 is a CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 2H chromosome by amplification with the fourth primer set and restriction enzyme HaeIII cleavage of the amplified product. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk06937は、
ATCTCGTTCTTGGAGCCGTA(配列番号9)に示される塩基配列を有するプライマー、および
ACCACAAGCATTGGAGAAGG(配列番号10)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記3H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約3.4cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:BaAL7B16、配列番号33)に基づいて設計されている。図9に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号9)および上記プライマー配列(配列番号10)の相補配列である。
K06937 is
Amplified using barley genomic DNA as a template using a fifth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown by ATCTCGTTCTTGGAGCCGTA (SEQ ID NO: 9) and a primer having the base sequence shown by ACCACAAGCATTGGAGAAGG (SEQ ID NO: 10) This genetic marker is located at a position about 3.4 cM away from the gene locus related to the number of spikelets detected on the 3H chromosome to the short arm side. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: BaAL7B16, SEQ ID NO: 33). FIG. 9 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 9) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 10).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図10に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号34)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号35)である。□で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素FokIの認識配列(CATCC)を示す。図10から明らかなように、H602の増幅産物は制限酵素FokIの認識配列(CATCC)を有しているためFokIで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のCがAに変異しているため(CATAC)制限酵素FokIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk06937は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第五プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素FokI切断により、対象個体が当該3H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 10 shows the base sequence of the portion containing the SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 34), and the bottom is Haruna Nijo base sequence (SEQ ID NO: 35). The base surrounded by □ is SNP. The underlined portion indicates the recognition sequence (CATCC) of the restriction enzyme FokI. As is apparent from FIG. 10, the amplification product of H602 has a restriction enzyme FokI recognition sequence (CATCC) and is thus cleaved with FokI. Since it is mutated (CATAC), it is not cleaved by the restriction enzyme FokI. That is, this genetic marker k06937 is a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 3H chromosome by amplification with the fifth primer set and cleavage of the amplification product FokI. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk02538は、
GAGGCAAGCAGCAATACACA(配列番号11)に示される塩基配列を有するプライマー、および
TTTGTGACGGCTTACACCAC(配列番号12)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記3H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約3cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:bags22g10、配列番号36)に基づいて設計されている。図11に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号11)および上記プライマー配列(配列番号12)の相補配列である。
K02538 is
Amplified with barley genomic DNA as a template using a sixth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown by GAGGCAAGCAGCCAATACACA (SEQ ID NO: 11) and a primer having the base sequence shown by TTTGTGACGGCTTACACCAC (SEQ ID NO: 12) This genetic marker is located at a position about 3 cM away from the gene locus related to the number of spikelets detected on the 3H chromosome on the long arm side. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: bags22g10, SEQ ID NO: 36). FIG. 11 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined part is the primer sequence (SEQ ID NO: 11) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 12).

はるな二条の増幅パターンとH602の増幅パターンとの間に多型があり、はるな二条のゲノムDNAを鋳型として約450bpの断片が増幅されてくるのに対して、H602のゲノムDNAを鋳型としては該DNA断片は増幅されてこない。図12に第六プライマーセットを用いてPCRにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図12(a)左端から順に、はるな二条、H602、はるな二条とH602の交雑F1、DH集団の1〜21の増幅断片である。図12(b)は、左端から順に、DH集団の22〜45の増幅断片である。図12(c)は、左端から順に、DH集団の46〜69の増幅断片である。図12(d)は、左端から順に、DH集団の70〜93の増幅断片である。図12から明らかなように、約450bpの増幅産物を確認することにより、対象個体が当該3H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a polymorphism between the Haruna Nijo amplification pattern and the H602 amplification pattern, and a fragment of about 450 bp is amplified using the Haruna Nijo genomic DNA as a template, whereas the H602 genomic DNA is used as the template. DNA fragments are not amplified. FIG. 12 shows an electrophoresis image of a fragment amplified by PCR using the sixth primer set. FIG. 12A shows, from the left end, Haruna Nijo, H602, Haruna Nijo and H602 cross F1, and amplified fragments 1 to 21 of the DH population. FIG. 12 (b) shows 22 to 45 amplified fragments of the DH population in order from the left end. FIG. 12 (c) shows 46 to 69 amplified fragments of the DH population in order from the left end. FIG. 12 (d) shows 70 to 93 amplified fragments of the DH population in order from the left end. As is clear from FIG. 12, by confirming an amplification product of about 450 bp, the allele of the locus involved in the number of spikelets that the subject individual sits on the 3H chromosome has a Haruna Nijo type genotype. Or having an H602 genotype.

またk03289は、
TGCTCTGCATTTCATTCAGC(配列番号13)に示される塩基配列を有するプライマー、およびCAGCGTTACAGGCATTCTCA(配列番号14)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第七プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記4H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約2.5cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:bags3h19、配列番号37)に基づいて設計されている。図13に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号13)および上記プライマー配列(配列番号14)の相補配列である。
K03289 is
Barley genomic DNA was amplified as a template using a seventh primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in TGCTCTGCATTTCATTCAGC (SEQ ID NO: 13) and a primer having the base sequence shown in CAGCGTTACAGGCATTCTCA (SEQ ID NO: 14) The genetic marker is located at a position about 2.5 cM on the short arm side from the locus related to the number of spikelets detected on the 4H chromosome. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: bags3h19, SEQ ID NO: 37). FIG. 13 shows the entire base sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 13) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 14).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図14に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号38)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号39)である。□(四角)で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素SacIIの認識配列(CCGCGG)を示す。図14から明らかなように、はるな二条の増幅産物は制限酵素SacIIの認識配列(CCGCGG)を有しているためSacIIで切断されるが、H602の増幅産物は上記認識配列部分のCがTに変異しているため(CCGTGG)、制限酵素SacIIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk03289は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第七プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素SacII切断により、対象個体が当該4H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 14 shows the base sequence of the portion containing the above SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 38), and the bottom is the base sequence of Haruna Nijo (SEQ ID NO: 39). A base surrounded by a square (square) is a SNP. The underlined part shows the recognition sequence (CCGCGG) of the restriction enzyme SacII. As is apparent from FIG. 14, the Haruna Nijo amplification product has a recognition sequence (CCGCCGG) of the restriction enzyme SacII and is cleaved by SacII. Since it is mutated (CCGTGG), it is not cleaved by the restriction enzyme SacII. That is, this genetic marker k03289 is a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 4H chromosome by amplification with the seventh primer set and restriction enzyme SacII cleavage of the amplified product. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk01301は、
ATCAACTATGCACGCAACCA(配列番号15)に示される塩基配列を有するプライマー、およびAAGGTTTCAGCGGTCAGAGA(配列番号16)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第八プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記4H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約4.6cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:baal39f20、配列番号40)に基づいて設計されている。図15に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号15)および上記プライマー配列(配列番号16)の相補配列である。
K01301 is
Amplified with barley genomic DNA as a template using an eighth primer set that is a combination of a primer having the base sequence shown by ATCAACTATGCACGCAACCA (SEQ ID NO: 15) and a primer having the base sequence shown by AAGGTTTCAGCGTCAGAGA (SEQ ID NO: 16) This genetic marker is located at a position about 4.6 cM away from the gene locus related to the number of spikelets detected on the 4H chromosome on the long arm side. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences uniquely developed by the inventors (EST clone name: baal39f20, SEQ ID NO: 40). FIG. 15 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 15) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 16).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図16に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号41)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号42)である。□(四角)で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素NcoIの認識配列(CCATGG)を示す。図16から明らかなように、H602の増幅産物は制限酵素NcoIの認識配列(CCATGG)を有しているためSacIIで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のTがCに変異しているため(CCACGG)、制限酵素NcoIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk01301は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第八プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素NcoI切断により、対象個体が当該4H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 16 shows the base sequence of the portion containing the SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 41), and the bottom is Haruna Nijo's base sequence (SEQ ID NO: 42). A base surrounded by a square (square) is a SNP. The underlined part shows the recognition sequence (CCATGG) of the restriction enzyme NcoI. As is clear from FIG. 16, the amplification product of H602 has a restriction enzyme NcoI recognition sequence (CCATGG), so it is cleaved with SacII. Since it is mutated (CCACGG), it is not cleaved by the restriction enzyme NcoI. That is, this genetic marker k01301 is a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 4H chromosome by amplification with the eighth primer set and restriction enzyme NcoI cleavage of the amplified product. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk02321は、
CCAGACTGACGATTTGGGAT(配列番号17)に示される塩基配列を有するプライマー、およびGTGAAGCAATTCATGCAAGC(配列番号18)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第九プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記5H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から短腕側に約7.6cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:bags19i06、配列番号43)に基づいて設計されている。図17に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号17)および上記プライマー配列(配列番号18)の相補配列である。
K02321 is
Barley genomic DNA was amplified using a ninth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in CCAGACTGACGATTTGGGAT (SEQ ID NO: 17) and a primer having the base sequence shown in GTGAAGCAATTCATGCAAGC (SEQ ID NO: 18). This genetic marker is located at a position about 7.6 cM away on the short arm side from the locus related to the number of spikelets detected on the 5H chromosome. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: bags19i06, SEQ ID NO: 43). FIG. 17 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 17) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 18).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間にはSNPがある。図18に両者の増幅産物の塩基配列のうち、上記SNPを含む部分の塩基配列を示した。上がH602の塩基配列(配列番号44)であり、下がはるな二条の塩基配列(配列番号45)である。□(四角)で囲んだ塩基がSNPである。下線部が制限酵素AfaIの認識配列(GTAC)を示す。図18から明らかなように、H602の増幅産物は制限酵素AfaIの認識配列(GTAC)を有しているためAfaIで切断されるが、はるな二条の増幅産物は上記認識配列部分のCがTに変異しているため(GTAT)、制限酵素AfaIで切断されない。すなわち、本遺伝マーカーk02321は、CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーであり、上記第九プライマーセットによる増幅と、増幅産物の制限酵素AfaI切断により、対象個体が当該5H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a SNP between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product. FIG. 18 shows the base sequence of the portion containing the above SNP in the base sequences of both amplification products. The top is the base sequence of H602 (SEQ ID NO: 44), and the bottom is Haruna Nijo's base sequence (SEQ ID NO: 45). A base surrounded by a square (square) is a SNP. The underlined portion indicates the recognition sequence (GTAC) of the restriction enzyme AfaI. As is clear from FIG. 18, since the amplification product of H602 has a recognition sequence (GTAC) of the restriction enzyme AfaI, it is cleaved by AfaI. Since it is mutated (GTAT), it is not cleaved by the restriction enzyme AfaI. That is, this genetic marker k02321 is a cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) marker, and the number of spikelets on which the subject individual sits on the 5H chromosome by amplification with the ninth primer set and restriction enzyme AfaI cleavage of the amplified product. It is possible to discriminate whether the alleles at the gene locus involved in have a Haruna Nijo type genotype or an H602 type genotype.

またk00835は、
TCCATGTTCCCAGCTACACA(配列番号19)に示される塩基配列を有するプライマー、および
AGGAACACATTGGTTCTGGC(配列番号20)に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第十プライマーセットを用いてオオムギゲノムDNAを鋳型として増幅される遺伝マーカーであり、上記5H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座から長腕側に約3.9cM離れた位置に座乗している。上記プライマー配列は、発明者らが独自に開発したオオムギEST配列の1つ(ESTクローン名:baak46e06、配列番号46)に基づいて設計されている。図19に上記ESTの全塩基配列を示す。下線を付した部分が上記プライマー配列(配列番号19)および上記プライマー配列(配列番号20)の相補配列である。
K00835 is
Amplified using barley genomic DNA as a template using a tenth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in TCCATGTTCCCAGCTACCA (SEQ ID NO: 19) and a primer having the base sequence shown in AGGAACACATTGGTTCTGGC (SEQ ID NO: 20) This genetic marker is located at a position about 3.9 cM away from the gene locus involved in the number of spikelets detected on the 5H chromosome on the long arm side. The primer sequence is designed based on one of the barley EST sequences independently developed by the inventors (EST clone name: baak46e06, SEQ ID NO: 46). FIG. 19 shows the entire nucleotide sequence of the EST. The underlined portion is the primer sequence (SEQ ID NO: 19) and the complementary sequence of the primer sequence (SEQ ID NO: 20).

はるな二条の増幅産物とH602の増幅産物との間に断片長多型があり、はるな二条のゲノムDNAを鋳型として増幅される断片のサイズは約890bp、H602のゲノムDNAを鋳型として増幅される断片のサイズは約870bpと異なる。図20に第十プライマーセットを用いてPCRにより増幅した断片の電気泳動像を示した。図20(a)及び(b)の両端は分子量マーカーである。図20(a)は、左端(分子量マーカーを除く)から順に、はるな二条、H602、はるな二条とH602の交雑F1、DH集団の1〜45の増幅断片である。図20(b)は、左端(分子量マーカーを除く)から順に、DH集団の46〜93の増幅断片である。図20から明らかなように、増幅産物のサイズを確認することにより、対象個体が当該5H染色体に座乗する小穂段数に関与する遺伝子座の対立遺伝子について、はるな二条型の遺伝子型を有するか、H602型の遺伝子型を有するかを判別できる。   There is a fragment length polymorphism between the Haruna Nijo amplification product and the H602 amplification product, the size of the fragment amplified using the Haruna Nijo genomic DNA as a template is about 890 bp, and the fragment amplified using the H602 genomic DNA as a template The size of is different from about 870 bp. FIG. 20 shows an electrophoresis image of a fragment amplified by PCR using the tenth primer set. Both ends of FIGS. 20A and 20B are molecular weight markers. FIG. 20A shows, in order from the left end (excluding molecular weight markers), Haruna Nijo, H602, Haruna Nijo and H602 cross F1, and 1 to 45 amplified fragments of the DH population. FIG. 20B shows 46 to 93 amplified fragments of the DH population in order from the left end (excluding molecular weight markers). As is clear from FIG. 20, by confirming the size of the amplification product, the allele of the locus involved in the number of spikelets that sits on the 5H chromosome of the target individual has a Haruna Nijo type genotype. , H602 type genotype can be discriminated.

ここで、1センチモルガン(1cM)とは、2つの遺伝子座の間に1%の頻度で交叉が起きるときの、両遺伝子座間の距離を表す単位である。   Here, 1 centmorgan (1 cM) is a unit representing the distance between two loci when crossover occurs at a frequency of 1% between the two loci.

ところで、増幅に際して鋳型として用いられるゲノムDNAは、植物体より従来公知の方法で抽出可能である。具体的には、植物体からゲノムDNAを抽出するための一般法(Murray,M.G. and W.F.Thompson(1980) Nucleic Acids Res.8:4321-4325. など参照)が好適な例として挙げられる。また、上記のゲノムDNAは、根、茎、葉、生殖器官など、オオムギの植物体を構成するいずれの組織を用いても抽出可能である。また、場合によってはオオムギのカルスから抽出してもよい。なお、上記生殖器官には、花器官(雄性・雌性生殖器官を含む)や種子も含まれる。ゲノムDNAの抽出は、例えば、オオムギの幼苗期の葉を用いて行われる。この理由としては、組織の摩砕が比較的容易であり、多糖類などの不純物の混合割合が比較的少なく、また、種子から短期間で育成可能である点が挙げられる。さらに、幼苗段階で個体の選抜が可能となり、育種期間を大幅に短縮できる点が挙げられる。   By the way, genomic DNA used as a template in amplification can be extracted from a plant body by a conventionally known method. Specifically, a general method for extracting genomic DNA from a plant body (see, for example, Murray, M.G. and W.F.Thompson (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4321-4325.) Is a suitable example. The genomic DNA can be extracted using any tissue that constitutes a barley plant such as roots, stems, leaves, and reproductive organs. In some cases, it may be extracted from barley callus. The reproductive organs include flower organs (including male and female reproductive organs) and seeds. Extraction of genomic DNA is performed, for example, using the leaves of the barley seedling stage. This is because the tissue is relatively easy to grind, the mixing ratio of impurities such as polysaccharides is relatively small, and can be grown from seeds in a short period of time. Furthermore, it is possible to select individuals at the seedling stage, and the breeding period can be greatly shortened.

またオオムギのゲノムDNAを鋳型とし、上記プライマーの組み合わせを用いて増幅する方法は、従来公知のDNA増幅法を採用することができる。一般には、PCR法(ポリメラ−ゼ連鎖反応法)や、その改変法が用いられる。PCR法や、その改変法を用いる際の反応条件は特に限定されるものではなく、通常と同様の条件下で増幅することができる。   A conventionally known DNA amplification method can be employed as a method for amplification using barley genomic DNA as a template and the combination of the above primers. In general, a PCR method (polymerase chain reaction method) or a modified method thereof is used. The reaction conditions when using the PCR method or its modification method are not particularly limited, and amplification can be performed under the same conditions as usual.

(2)本発明の利用
〔小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の単離方法〕
上述のとおり本発明にかかる遺伝マーカー(k03582、k00591)は、オオムギ1H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー(k07732、k07430)は、オオムギ2H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー(k06937、k02538)は、オオムギ3H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー(k03289、k01301)は、オオムギ4H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものであり、本発明にかかる遺伝マーカー(k02321、k00835)は、オオムギ5H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖するものである。
(2) Use of the present invention [Method for isolating a DNA fragment containing a locus involved in the number of spikelets]
As described above, the genetic marker (k03582, k00591) according to the present invention is linked to the locus associated with the number of spikelets detected on the barley 1H chromosome, and the genetic marker according to the present invention (k07732, k07430). Are linked to loci associated with the number of spikelets detected on the barley 2H chromosome, and the genetic markers (k06937, k02538) according to the present invention are linked to the number of spikelets detected on the barley 3H chromosome. The genetic marker (k03289, k01301) according to the present invention is linked to a genetic locus related to the number of spikelets detected on the barley 4H chromosome. Such genetic markers (k02321, k00835) are small molecules detected on the barley 5H chromosome. It is those linked to gene locus involved in the number of stages.

よって、k03582、k00591の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ1H染色体上に検出された一方の小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することができ、k07732、k07430の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ2H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することができ、k06937、k02538の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ3H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することができ、k03289、k01301の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ4H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することができ、k02321、k00835の遺伝マーカーを用いることによってオオムギ5H染色体上に検出された小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することができる。   Therefore, by using the genetic markers k03582 and k00591, it is possible to isolate a DNA fragment containing the locus associated with one spikelet number detected on the barley 1H chromosome, and use the genetic markers k07732 and k07430. Thus, a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets detected on the barley 2H chromosome can be isolated, and spikelets detected on the barley 3H chromosome by using genetic markers k06937 and k02538 A DNA fragment containing a locus related to the number of stages can be isolated, and a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets detected on the barley 4H chromosome by using the genetic markers k03289 and k01301 can be isolated. Of k02321, k00835 The DNA fragment containing the gene locus involved in spikelet number detected on barley 5H chromosome by using a heat transfer markers can be isolated.

単離とは、目的のDNA断片、すなわち小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片をクローニングすることを意味することはいうまでもないが、広義には交雑F1集団から戻し交配等により、両親のうち一方の小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を有する個体を選抜し、その遺伝子座領域のみを目的品種に導入する同質遺伝子系統の作製も単離に含まれる。   The isolation means that cloning of the target DNA fragment, that is, a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets, is broadly defined by backcrossing from the hybrid F1 population, Isolation includes selection of an individual having a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets in one of the parents, and introducing only the locus region into the target variety.

本発明にかかる遺伝マーカーを用いて小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離する方法としては特に限定されるものではないが、例えば次のような方法を挙げることができる。   A method for isolating a DNA fragment containing a gene locus involved in the number of spikelets using the genetic marker according to the present invention is not particularly limited, and examples thereof include the following method.

オオムギでは本発明者らが開発を進めている「はるな二条」を含めて、ゲノムDNAのBACライブラリーが2種類作成されており、現在複数のBACライブラリーが開発中である。そこで、このようなBACライブラリーを用いて、従来公知のマップベースクローニングの手法にしたがって、小穂段数に関与する遺伝子座と当該遺伝子座に連鎖する本発明の遺伝マーカーとで当該マーカーを含むBACクローンを同定し、そこからBACのコンティグを作成して塩基配列を確定することにより、最終的に小穂段数に関与する遺伝子座に到達することができる。   In barley, two types of BAC libraries of genomic DNA have been created, including “Haruna Nijo”, which is being developed by the present inventors, and a plurality of BAC libraries are currently under development. Therefore, using such a BAC library, according to a conventionally known map-based cloning technique, a BAC containing the marker at a locus involved in the number of spikelets and the genetic marker of the present invention linked to the locus. By identifying a clone, creating a BAC contig from the clone, and determining the base sequence, it is possible to finally reach a locus related to the number of spikelets.

また、上述のように、交雑F1に一方の親を戻し交配することにより、他方の親の小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を目的品種に導入して(広義の)単離をすることができる。   In addition, as described above, one parent is backcrossed to the cross F1 to introduce a DNA fragment containing a gene locus involved in the number of spikelets of the other parent into the target variety (in a broad sense). can do.

なお、上記方法をはじめとする小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離する際には、目的とする小穂段数に関与する遺伝子座に対してなるべく近傍に座乗する遺伝マーカーを選択して用いることが好ましい。目的とする小穂段数に関与する遺伝子座と遺伝マーカーの間で組み換えが起こる確率がより低くなり、より確実に小穂段数に関与する遺伝子座を含む断片を単離することができるからである。   When isolating a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets including the above method, a genetic marker that sits as close as possible to the locus related to the target spikelet number It is preferable to select and use. This is because the probability of recombination between the locus associated with the target spikelet number and the genetic marker is lower, and the fragment containing the locus associated with the spikelet number can be isolated more reliably. .

〔小穂段数改変植物の生産方法、および当該生産方法によって得られた小穂段数改変植物〕
上記本発明にかかる小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の単離方法によって得られた小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片をイネ科植物のゲノムDNAに導入することによって、小穂段数改変イネ科植物を生産することが可能である。イネ科植物としてはムギ類であることが好ましく、オオムギであることが特に好ましい。また、例えば、オオムギから単離された小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片をオオムギ以外のイネ科植物に導入することも可能であり、同一属間のみでの単離、導入に限定されるものではない。
[Method of producing spikelet stage number modified plant and spikelet stage number modified plant obtained by the production method]
By introducing the DNA fragment containing the locus related to the spikelet number obtained by the method for isolating the DNA fragment containing the locus related to the spikelet number according to the present invention into the genomic DNA of the grass family plant, It is possible to produce a rice plant with modified spikelet number. As the gramineous plant, wheat is preferable, and barley is particularly preferable. In addition, for example, a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets isolated from barley can be introduced into a grass family other than barley, and is limited to isolation and introduction only between the same genera. Is not to be done.

上記DNA断片を導入する方法は特に限定されるものではなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。より具体的には、例えばアグロバクテリウムまたはパーティクルガンを用いてイネ科植物のゲノムDNAに導入することによって生産すればよく、これにより、小穂段数改変品種が得られることとなる。例えば、雑誌The Plant Journal(1997) 11(6),1369-1376 には、Sonia Tingay等により、Agrobacterium tumefaciens を用いてオオムギを形質転換する方法が開示されており、この方法を利用して形質転換オオムギを生産可能である。   The method for introducing the DNA fragment is not particularly limited, and a known method can be appropriately selected and used. More specifically, for example, it may be produced by introducing it into the genomic DNA of a gramineous plant using, for example, Agrobacterium or particle gun, thereby obtaining a spikelet-modified variety. For example, the journal The Plant Journal (1997) 11 (6), 1369-1376 discloses a method for transforming barley using Agrobacterium tumefaciens by Sonia Tingay et al. Can produce barley.

また、目的とする小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を有する植物個体と、当該DNA断片を導入しようとする植物個体との交雑により、小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を、植物に導入することも可能である。この方法では、交雑が可能である限りにおいて、他の種や属の植物が有する小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片の導入が可能である。   In addition, a DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets by crossing a plant individual having a DNA fragment containing a locus related to the target number of spikelets with a plant individual into which the DNA fragment is to be introduced. Can also be introduced into plants. In this method, as long as crossing is possible, it is possible to introduce a DNA fragment containing a gene locus involved in the number of spikelets of plants of other species or genera.

本発明にかかる小穂段数改変植物は、上記本発明にかかる生産方法により得られるものである。当該小穂段数改変植物は、小穂段数を多くする表現型(多小穂段数型)を有する遺伝子座を含むDNA断片を導入した場合には、元の品種の小穂段数より多い小穂段数を有する品種となり、小穂段数を少なくする表現型(少小穂段数型)を有する遺伝子座を含むDNA断片を導入した場合には、元の品種の小穂段数より少ない小穂段数を有する品種となる。ただし、上述のごとく収量の観点から栽培品種としては、前者の多小穂段数型の品種が好ましい。   The spikelet stage number modified plant according to the present invention is obtained by the production method according to the present invention. When the spikelet stage-modified plant is introduced with a DNA fragment containing a locus having a phenotype that increases the spikelet stage number (multi spikelet stage type), the spikelet stage number is higher than the spikelet stage number of the original variety. When a DNA fragment containing a gene locus having a phenotype (small spikelet number type) that reduces the number of spikelets is introduced, a variety having a spikelet number that is less than the spikelet number of the original variety It becomes. However, as described above, from the viewpoint of yield, the former cultivar of the multiple spikelets type is preferable.

〔小穂段数イネ科植物の選抜方法〕
本発明にかかる小穂段数改変イネ科植物の選抜方法は、上記本発明にかかる遺伝マーカーを指標として小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法であればよく、その他の工程、条件、材料等は特に限定されるものではない。例えば、従来公知の作物育種法を利用することができる。
[Selection method for the number of small spike stages Gramineae]
The method for selecting the spikelet stage number modified gramineous plant according to the present invention may be any method as long as it is a method for selecting the spikelet stage number modified gramineous plant using the genetic marker according to the present invention as an index, and other steps, conditions, materials, etc. Is not particularly limited. For example, a conventionally known crop breeding method can be used.

より具体的には、例えば、交配等により作出した植物のゲノムDNAを抽出し、本発明に係る遺伝マーカーの遺伝子型を指標として植物を選抜する方法が挙げられる。遺伝マーカーを検出する手段としては、例えば、対象とする植物から抽出したゲノムDNAを鋳型として上記第一ないし第十プライマーセットのいずれかを用いて増幅したDNA断片について、断片長または断片の制限酵素消化パターンの観察を挙げることができる。   More specifically, for example, a method of extracting a plant genomic DNA produced by crossing or the like and selecting a plant using the genotype of the genetic marker according to the present invention as an index can be mentioned. Examples of means for detecting a genetic marker include, for example, a fragment length or a fragment restriction enzyme for a DNA fragment amplified using any one of the first to tenth primer sets using genomic DNA extracted from a target plant as a template. The observation of digestion patterns can be mentioned.

なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。   The present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the embodiments can be obtained by appropriately combining technical means disclosed in different embodiments. The form is also included in the technical scope of the present invention.

〔使用植物〕
醸造用オオムギ「はるな二条」(Hordeum vulgare ssp. vulgare variety Harunanijo)と野生オオムギ「H602」(Hordeum vulgare ssp. spontaneum H602)との交配から得られたF1の花粉を培養して半数体(haploid)を育成し、自然倍加した倍加半数体(doubled haploid)93個体からなる集団を使用した。
[Used plant]
H1 haploid obtained by cultivating F1 pollen obtained from crossing brewing barley “Hardeum vulgare ssp. Vulgare variety Harunanijo” and wild barley “H602” (Hordeum vulgare ssp. Spontaneum H602) A population consisting of 93 doubled haploids that were grown and naturally doubled was used.

〔連鎖地図の作成〕
本発明者らが有するオオムギEST配列約12万をphredによって再度ベースコールした後、quality score 20でトリミングし、ベクターマスキングを行って3’端約6万配列を得た。これらの配列からphrapによってcontig 8,753、 singlet 6,686からなるUnigeneを作成した。プライマー作成ソフトPrimer3によって、400bpを中心として150-500bpのcDNA配列を増幅するプライマーセット約11,000を作成した。このうち約5,100のプライマーセットについて、はるな二条とH602との間に増幅されるゲノム断片の多型の有無を検出するために、それぞれのゲノムDNAをPCR増幅し、アガロースゲル電気泳動によってバンドの有無、バンド数、バンドサイズを調査し、マーカーとなり得るものを選択した。さらに、バンドサイズに多型のない場合は、増幅断片をダイレクトシークエンスすることにより塩基配列の差異を検出し、39種類の制限酵素に対してCAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)化が可能なものをマーカーとして選択した。
[Create a chain map]
About 120,000 barley EST sequences possessed by the present inventors were base-called again with phred, then trimmed with a quality score of 20, and vector masking was performed to obtain about 60,000 sequences at the 3 ′ end. Unigene consisting of contig 8,753 and singlet 6,686 was prepared from these sequences by phrap. About 11,000 primer sets for amplifying a 150-500 bp cDNA sequence centered on 400 bp were created by the primer creation software Primer3. Among these, about 5,100 primer sets, in order to detect the presence or absence of polymorphism of genomic fragments amplified between Haruna Nijo and H602, each genomic DNA was amplified by PCR and the presence or absence of a band was detected by agarose gel electrophoresis. The number of bands and the band size were investigated, and those that could serve as markers were selected. In addition, when there is no polymorphism in the band size, the nucleotide sequence difference is detected by direct sequencing of the amplified fragment, and markers that can be converted into CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) for 39 types of restriction enzymes are markers. Selected as.

以上により、上記はるな二条とH602との交雑F1由来のDH集団について、合計499遺伝子座のマーカーからなる連鎖地図を構築した。この連鎖地図の平均マーカー密度は3.0cM/locus、全長は1,470cMである。   As described above, a linkage map composed of markers of a total of 499 loci was constructed for the DH population derived from the hybrid F1 of Haruna Nijo and H602. This linkage map has an average marker density of 3.0 cM / locus and a total length of 1,470 cM.

〔遺伝子型の判定〕
DH集団各個体の遺伝子型の判定は、上記DH集団の連鎖地図にマッピングされたマーカーを用いて行った。すなわち、各個体の新鮮な葉の組織から分離したDNAを鋳型として、EST配列に基づいて設計したプライマーセットを用いてPCRを行った。断片長多型マーカーについてはPCR産物の電気泳動により遺伝子型を判定した。CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)マーカーについては、PCR産物を制限酵素で消化し、電気泳動により遺伝子型を判定した。
[Determination of genotype]
The genotype of each individual in the DH population was determined using the markers mapped to the linkage map of the DH population. That is, PCR was performed using a primer set designed based on the EST sequence using DNA isolated from fresh leaf tissue of each individual as a template. For the fragment length polymorphism marker, the genotype was determined by electrophoresis of PCR products. For the CAPS (cleaved amplified polymorphic sequence) marker, the PCR product was digested with a restriction enzyme and the genotype was determined by electrophoresis.

〔小穂段数の測定〕
DH集団の各個体について、登熟後小穂段数を数えて記録した。小穂段数の分布を図21に示した。また、白矢印ははるな二条、黒矢印はH602の小穂段数を示している。図21において、縦軸は個体数を横軸は小穂段数を示す。本DH集団の小穂段数は18〜36段の間に分布した。
[Measurement of the number of spikelets]
For each individual in the DH population, the number of spikelets after ripening was counted and recorded. The distribution of the number of spikelets is shown in FIG. Further, the white arrow indicates Haruna Nijo, and the black arrow indicates the number of spikelets in H602. In FIG. 21, the vertical axis represents the number of individuals and the horizontal axis represents the number of spikelets. The number of spikelets in this DH population was distributed between 18 and 36.

〔QTL解析〕
QTL解析のアルゴリズムには、シンプルインターバルマッピング(simple interval mapping、以下「SIM」と略記する。)とコンポジットインターバルマッピング(composite interval mapping以下「CIM」と略記する。)を用い、解析ソフトウエアにはそれぞれ、MAPMAKER/QTLとQTL Cartographerを用いた。LODスコアの閾値を2に設定し、LODスコアが2を超えた場合に当該2つのマーカー区間内の最もLODの大きな位置にQTLの存在を推定した。
[QTL analysis]
The QTL analysis algorithm uses simple interval mapping (hereinafter abbreviated as “SIM”) and composite interval mapping (hereinafter abbreviated as “CIM”). MAPMAKER / QTL and QTL Cartographer were used. The threshold of the LOD score was set to 2, and when the LOD score exceeded 2, the presence of QTL was estimated at the position with the largest LOD in the two marker sections.

〔結果〕
結果を表1に示した。
〔result〕
The results are shown in Table 1.

Figure 2005229844
Figure 2005229844

表1から明らかなように、SIMおよびCIMにより小穂段数に関与する5つのQTLが検出された。1H染色体上に存在するQTLは、k03582およびk00591によって挟まれる位置に座乗し、k03582から長腕側に約0cM、k00591から短腕側に約0cMの距離に位置していた。LODスコアは2.3である。このQTLで表現型の分散の11.6%を説明できる。また、このQTLの存在で小穂段数が2.7段増加する。   As is clear from Table 1, five QTLs related to the number of spikelets were detected by SIM and CIM. The QTL present on the 1H chromosome sits at a position between k03582 and k00591, and is located at a distance of about 0 cM from the k03582 to the long arm side and from the k00591 to the short arm side at a distance of about 0 cM. The LOD score is 2.3. This QTL can explain 11.6% of the phenotypic variance. In addition, the presence of this QTL increases the number of spikelets by 2.7.

また2H染色体上に存在するQTLは、k07732およびk07430によって挟まれる位置に座乗し、k07732から長腕側に約3.5cM、k07430から短腕側に約0cMの距離に位置していた。LODスコアは2.2である。このQTLで表現型の分散の11.4%を説明できる。また、このQTLの存在で小穂段数が2.9段増加する。   The QTL present on the 2H chromosome sits at a position sandwiched by k07732 and k07430, and is located at a distance of about 3.5 cM from the k07732 to the long arm side and from the k07430 to the short arm side at a distance of about 0 cM. The LOD score is 2.2. This QTL can explain 11.4% of the phenotypic variance. In addition, the presence of this QTL increases the number of spikelets by 2.9.

また3H染色体上に存在するQTLは、k06937およびk02538によって挟まれる位置に座乗し、k06937から長腕側に約3.4cM、k02538から短腕側に約3.0cMの距離に位置していた。LODスコアは3.0である。このQTLで表現型の分散の42.0%を説明できる。また、このQTLの存在で小穂段数が7.3段減少する。   The QTL present on the 3H chromosome sits at a position sandwiched by k06937 and k02538, and is located at a distance of about 3.4 cM from k06937 to the long arm side and from the k02538 to the short arm side at a distance of about 3.0 cM. . The LOD score is 3.0. This QTL can explain 42.0% of the phenotypic variance. In addition, the presence of this QTL reduces the number of spikelets by 7.3.

また4H染色体上に存在するQTLは、k03289およびk01301によって挟まれる位置に座乗し、k03289から長腕側に約2.5cM、k01301から短腕側に約4.6cMの距離に位置していた。LODスコアは2.7である。このQTLで表現型の分散の13.5%を説明できる。また、このQTLの存在で小穂段数が3.6段増加する。   The QTL present on the 4H chromosome sits at a position between k03289 and k01301, and is located at a distance of about 2.5 cM from the k03289 to the long arm side and from the k01301 to the short arm side at a distance of about 4.6 cM. . The LOD score is 2.7. This QTL can explain 13.5% of the phenotypic variance. In addition, the presence of this QTL increases the number of spikelets by 3.6 stages.

また5H染色体上に存在するQTLは、k02321およびk00835によって挟まれる位置に座乗し、k02321から長腕側に約7.6cM、k00835から短腕側に約3.9cMの距離に位置していた。LODスコアは8.3である。このQTLで表現型の分散の39.1%を説明できる。また、このQTLの存在で小穂段数が5.0段減少する。   The QTL present on the 5H chromosome sits at a position between k02321 and k00835, and is located at a distance of about 7.6 cM from the k02321 to the long arm side and from the k00835 to the short arm side at a distance of about 3.9 cM. . The LOD score is 8.3. This QTL can explain 39.1% of the phenotypic variance. In addition, the presence of this QTL reduces the number of spikelets by 5.0.

本発明にかかる遺伝マーカーは、小穂段数改変植物の育種、小穂段数に関与する遺伝子の単離等に用いることができ、育種の効率化に大きく貢献することが期待される。したがって、広く農業全般に利用可能であり、さらには、オオムギ等を原料とする食品産業においても有効である。また、生物分野の基礎研究、特に植物ゲノム研究等にも利用可能である。   The genetic marker according to the present invention can be used for breeding of spikelet stage-modified plants, isolation of genes involved in the spikelet stage number, and the like, and is expected to greatly contribute to the efficiency of breeding. Therefore, it can be widely used for agriculture in general and is also effective in the food industry using barley and the like as a raw material. It can also be used for basic research in the biological field, particularly plant genome research.

オオムギESTクローン:bah13o05の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the primer sequence designed based on the base sequence of barley EST clone: bah13o05 and the said sequence. 遺伝マーカーk03582における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k03582. オオムギESTクローン:baak36b12の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the base sequence of the barley EST clone: baak36b12 and the primer sequence designed based on the said sequence. 遺伝マーカーk00591における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k00591. オオムギESTクローン:BaGS20M01の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the primer sequence designed based on the base sequence of barley EST clone: BaGS20M01 and the said sequence | arrangement. 遺伝マーカーk07732における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k07732. オオムギESTクローン:baet18F0911の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the primer sequence designed based on the base sequence of the barley EST clone: baet18F0911 and the said sequence. 遺伝マーカーk07430における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in the genetic marker k07430. オオムギESTクローン:BaAL7B16の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the base sequence of the barley EST clone: BaAL7B16 and the primer sequence designed based on the said sequence. 遺伝マーカーk06937における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k06937. オオムギESTクローン:bags22g10の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the base sequence of barley EST clone: bags22g10 and the primer sequence designed based on the said sequence. 図12(a)は遺伝マーカーk02538における、はるな二条、H602、はるな二条とH602の交雑F1、DH集団(1〜21)間の断片長多型を示す電気泳動画像であり、図12(b)は遺伝マーカーk02538における、DH集団(22〜45)間の断片長多型を示す電気泳動画像であり、図12(c)は遺伝マーカーk02538における、DH集団(46〜69)間の断片長多型を示す電気泳動画像であり、図12(d)は遺伝マーカーk02538における、DH集団(70〜93)間の断片長多型を示す電気泳動画像である。FIG. 12A is an electrophoretic image showing the fragment length polymorphism between Haruna Nijo, H602, Haruna Nijo and H602 hybrid F1, DH population (1 to 21) in genetic marker k02538, FIG. 12 (b) Is an electrophoretic image showing the fragment length polymorphism between DH populations (22-45) in genetic marker k02538, and FIG. 12 (c) is the fragment length polymorphism between DH populations (46-69) in genetic marker k02538. FIG. 12D is an electrophoresis image showing a fragment length polymorphism between DH populations (70 to 93) in the genetic marker k02538. オオムギESTクローン:bags3h19の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the base sequence of barley EST clone: bags3h19, and the primer sequence designed based on the said sequence | arrangement. 遺伝マーカーk03289における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k03289. オオムギESTクローン:baal39f20の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the base sequence of the barley EST clone: baal39f20, and the primer sequence designed based on the said sequence. 遺伝マーカーk01301における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k01301. オオムギESTクローン:bags19i06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the primer sequence designed based on the base sequence of barley EST clone: bags19i06, and the said sequence. 遺伝マーカーk02321における、H602とはるな二条との間のSNPおよびSNP周囲の塩基配列を示す図である。It is a figure which shows the base sequence around SNP and SNP between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k02321. オオムギESTクローン:baak46e06の塩基配列、および当該配列に基づいて設計されたプライマー配列の位置を示す図である。It is a figure which shows the position of the primer sequence designed based on the base sequence of the barley EST clone: baak46e06. 図20(a)は遺伝マーカーk00835における、H602とはるな二条との間の断片長多型を示す電気泳動画像(前半)であり、図20(b)は遺伝マーカーk00835における、H602とはるな二条との間の断片長多型を示す電気泳動画像(後半)でありる。FIG. 20 (a) is an electrophoretic image (first half) showing the fragment length polymorphism between H602 and Haruna Nijo in genetic marker k00835, and FIG. 20 (b) is that of H602 and Haruna Nijo in genetic marker k00835. It is the electrophoresis image (latter half) which shows the fragment length polymorphism between. DH集団各個体の小穂段数の分布を示すグラフである。It is a graph which shows distribution of the number of spikelets of each individual of DH group.

Claims (24)

イネ科植物のゲノムDNA中に存在し、小穂段数に関与する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーであって、
上記小穂段数に関与する遺伝子座から0ないし8センチモルガンの範囲内の距離に位置することを特徴とする遺伝マーカー。
A genetic marker present in the genomic DNA of a grass family and linked to a locus related to the number of spikelets;
A genetic marker, wherein the genetic marker is located at a distance within a range of 0 to 8 centimorgans from a locus related to the number of spikelets.
上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項1に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 1, wherein the gramineous plant is wheat. 上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項2に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 2, wherein the wheat is barley. 上記ゲノムDNAが1H染色体であることを特徴とする請求項3に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 3, wherein the genomic DNA is a 1H chromosome. 配列番号1に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号2に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項に記載の遺伝マーカー。   5. The amplification according to claim 1, wherein the amplification is performed using a first primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. The genetic marker according to any one of claims. 配列番号3に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号4に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1ないし4のいずれか1項に記載の遺伝マーカー。   5. The amplification according to claim 1, wherein the amplification is performed using a second primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. The genetic marker according to any one of claims. 上記ゲノムDNAが2H染色体であることを特徴とする請求項3に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 3, wherein the genomic DNA is 2H chromosome. 配列番号5に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号6に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または7に記載の遺伝マーカー。   Amplification using a third primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 6 or The genetic marker according to 3 or 7. 配列番号7に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号8に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または7に記載の遺伝マーカー。   Amplified using a fourth primer set, which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 8, or The genetic marker according to 3 or 7. 上記ゲノムDNAが3H染色体であることを特徴とする請求項3に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 3, wherein the genomic DNA is a 3H chromosome. 配列番号9に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号10に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または10に記載の遺伝マーカー。   Amplification using a fifth primer set, which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 9 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, or The genetic marker according to 3 or 10. 配列番号11に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号12に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または10に記載の遺伝マーカー。   Amplified using a sixth primer set, which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 12, or The genetic marker according to 3 or 10. 上記ゲノムDNAが4H染色体であることを特徴とする請求項3に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 3, wherein the genomic DNA is a 4H chromosome. 配列番号13に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号14に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第七プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または13に記載の遺伝マーカー。   Amplified by using a seventh primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 14, or The genetic marker according to 3 or 13. 配列番号15に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号16に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第八プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または13に記載の遺伝マーカー。   Amplified by using an eighth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or The genetic marker according to 3 or 13. 上記ゲノムDNAが5H染色体であることを特徴とする請求項3に記載の遺伝マーカー。   The genetic marker according to claim 3, wherein the genomic DNA is a 5H chromosome. 配列番号17に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号18に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第九プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または16に記載の遺伝マーカー。   Amplified using a ninth primer set, which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 18, or The genetic marker according to 3 or 16. 配列番号19に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号20に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第十プライマーセットを用いて増幅されることを特徴とする請求項1または2または3または16に記載の遺伝マーカー。   Amplified using a tenth primer set which is a combination of a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19 and a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 20, or The genetic marker according to 3 or 16. 請求項1ないし18のいずれか1項に記載の遺伝マーカーを用いて小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を単離することを特徴とするDNA断片の単離方法。   A method for isolating a DNA fragment, comprising isolating a DNA fragment containing a locus involved in the number of spikelets using the genetic marker according to any one of claims 1 to 18. 請求項19に記載の単離方法により得られた上記小穂段数に関与する遺伝子座を含むDNA断片を、イネ科植物のゲノムDNAに導入することを特徴とする小穂段数改変イネ科植物の生産方法。   A DNA fragment containing a locus related to the number of spikelets obtained by the isolation method according to claim 19 is introduced into the genomic DNA of a grass family plant. Production method. 上記イネ科植物がムギ類であることを特徴とする請求項20に記載の小穂段数改変イネ科植物の生産方法。   21. The method for producing a spikelet stage-modified gramineous plant according to claim 20, wherein the gramineous plant is a wheat. 上記ムギ類がオオムギであることを特徴とする請求項21に記載の小穂段数改変イネ科植物の生産方法。   The method according to claim 21, wherein the wheat is a barley. 請求項20ないし22のいずれか1項に記載の小穂段数改変イネ科植物の生産方法によって得られた小穂段数改変イネ科植物。   23. A spikelet stage number modified gramineous plant obtained by the method for producing a spikelet stage number modified gramineous plant according to any one of claims 20 to 22. 請求項1ないし18のいずれか1項に記載の遺伝マーカーを指標として、小穂段数改変イネ科植物を選抜する方法。   A method for selecting a spikelet number-modified gramineous plant using the genetic marker according to any one of claims 1 to 18 as an index.
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