JP2005227250A - 生化学分析方法と生化学分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 マイクロチップの微細流路において、高い精度で効率的に生化学分析を行うことができる新しい生化学分析方法および生化学分析装置を提供する。
【解決手段】 マイクロチップ微細流路における担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Ａと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Ｂとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質溶液を送液することにより、検出シグナルをピークとして捉える。
【選択図】 図８

Description

この出願の発明は、マイクロチップの微細流路において、高い精度で効率的に生化学分析を行うことができる、新しい生化学分析方法および生化学分析装置に関するものである。

抗原抗体反応を利用した免疫分析法の場合には、試料中の微量な分析対象物質の存在やその濃度を、酵素標識した抗体により基質を反応させて生成される酵素反応生成物の生成量を吸光光度計、蛍光光度計、熱レンズ顕微鏡法、電気化学法、発光法等を利用して測定することにより知ることができる。

この出願の発明者らは、このような免疫反応による微量物質の検出を、マイクロチップに形成した微細流路（マイクロチャンネル）において行うことを既に提案している（特許文献１）。この方法では、分析対象物質の検出や濃度測定を試料中の分析対象物質に対する抗体等を固相化したビーズ体を、ダム様構造を有する微細流路中で堰き止めて、試料溶液および分析対象物質に対する酵素標識物質を送液し、ついで、酵素の反応基質を送液することで発色、発光、熱レンズ顕微鏡法、もしくは、蛍光性の酵素反応物を蛍光光度計等を利用して測定することによって行っている。

マイクロチャンネルを用いるこの方法には、分析対象物質を含有する微量な試料溶液であっても高い精度での分析が簡便に実現されるという特徴がある。

また、発明者らが展開してきた上記の熱レンズ顕微鏡法では、微小領域をレーザー光で照射することでレーザー光に吸収を持つ物質が存在すると、その微小領域が暖められ、その結果屈折率の変化が生じ、微小凹レンズを形成することにより、焦点距離が変化して、結果として一定面積のディレクターに入射する光量が変化することを利用していることから、超微量分析が可能になる。

このように熱レンズ顕微鏡法では、微小領域の検出ができることから、流路幅１００μｍ以下の微細流路であっても、その中の流体を直接測定することが可能であり、マイクロチップに適用しやすい原理を有している。そこで、一般的には、標識酵素に反応する基質を一定速度でマイクロチップの微細流路に送液しながら、基質の発色反応物を熱レンズ顕微鏡によって、マイクロチップに設けられた堰き止め部の下流で信号強度の変化を検出している。

一方、蛍光による分析法では、蛍光物質を基質として、酵素標識した抗体により基質を反応させることで蛍光性反応生成物の生成量を熱レンズ顕微鏡と同様に堰き止め部の下流を直接蛍光分析することで定量することができる。

このように優れた特徴のあるマイクロチップ微細流路中での免疫反応を利用した生化学分析方法ではあるが、この方法では、通常、送液の下流で反応生成物（酵素反応生成物）の濃度を測定することから、反応基質と酵素と接触する時間が送液の流速に依存し、また、ビーズ体が充填されている微細流路の体積は数ｎｌ以下と極めて小さいことから、反応基質と酵素とを十分に反応させるためには、流速を遅くする必要があり、また、流量の変化は、反応に直接影響を及ぼすことから検出精度の向上のためには、送液のポンプの高い精度での制御が必要とされる。しかも、反応性の低い基質では、十分な反応シグナルを得るためには酵素との接触時間を一定、かつ、長くする必要があり、流速を極めて遅くする必要がある。

しかしながら、流速を遅くすることは、僅かな気泡の混入や僅かな目詰まり等の影響を受けやすいため、一定の流量を得ることによって、安定した反応シグナルを得ることが必ずしも容易ではなかった。
ＷＯ ０３／０６２８２３ Ａ１

そこで、この出願の発明は、以上のとおりの背景から、従来のような流量制御についての特別の配慮を要することなく、簡便な操作によって、マイクロチップを用いて、酵素反応に依存したシグナルを選択的に、しかも鋭い信号強度として得ることのできる、高い精度でも効率的な生化学分析のための新しい生化学分析方法および生化学分析装置を提供することを課題としている。

この出願の発明は、上記の課題を解決する手段として、第１には、マイクロチップ微細流路における担体上で、試料中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Ａと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Ｂとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質溶液を送液することにより、検出シグナルをピークとして捉えることを特徴とする生化学分析方法を提供する。

また、第２には、上記方法において、分析対象物質と特異的に結合する反応物質Ａを支持させたビーズ担体をもって、分析対象物質含有の試料液を反応物質Ａを支持させたビーズ担体充填の微細流路に送液し、これと同時に、もしくは次いで反応物質Ｂを送液し、その後、前記反応物質Ｂの酵素と反応する基質溶液を一定時間の送液停止と引き続いての一定速度での送液により微細流路内に供給することを特徴とする生化学分析方法を提供する。

第３には、送液の停止と送液とをバルブ制御手段によるバルブの切り換えにより行うことを特徴とする生化学分析方法を、第４には、送液の停止と送液とをポンプ制御手段によるポンプの停止と運動の切り換えにより行うことを特徴とする生化学分析方法を、第５には、微細流路には、ビーズ担体の流れ堰き止め部を設けることを特徴とする生化学分析方法を提供する。

第６には、分析対象物質は抗原であり、反応物質Ａは抗体であり、また反応物質Ｂは抗体であることを特徴とする生化学分析方法を、第７には、分析対象物質は抗体であり、反応物質Ａは抗抗体であり、また反応物質Ｂは抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物であることを特徴とする生化学分析方法を、第８には、分析対象物質は抗体であり、反応物質Ａは抗原であり、また反応物質Ｂは抗抗体であることを特徴とする生化学分析方法を提供し、さらに、第９には、酵素との反応によりシグナルを、吸光度、蛍光および熱レンズ信号の少なくとも１つをもって検出することを特徴とする生化学分析方法を提供する。

さらに、この出願の発明は、第１０には、マイクロチップ微細流路における担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Ａと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Ｂとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析装置において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質液を送液する送液手段および検出シグナルを捉える検出手段とを備えていることを特徴とする生化学分析装置を提供し、第１１には、反応物質Ａを支持させたビーズ担体が微細流路内に充填されていることを特徴とする生化学分析装置を提供する。

また、第１２には、送液手段は、バルブ切り換え制御装置を備えていることを特徴とする生化学分析装置を、第１３には、送液手段は、ポンプ切り換え制御装置を備えていることを特徴とする生化学分析装置を提供し、第１４には、微細流路には、ビーズ担体の流れ堰き止め部を備えていることを特徴とする生化学分析装置を提供する。

さらにまた、第１５には、分析対象物質が抗原であり、反応物質Ａが抗体であり、また反応物質Ｂが抗体であることを特徴とする生化学分析装置を、第１６には、分析対象物質が抗体であり、反応物質Ａが抗抗体であり、また反応物質Ｂが抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物であることを特徴とする生化学分析装置を、第１７には、分析対象物質が抗体であり、反応物質Ａが抗原であり、また反応物質Ｂが抗抗体であることを特徴とする生化学分析装置を提供する。

そして、この出願の発明は、第１８には、検出手段として、吸光光度計、蛍光測定装置および熱レンズ顕微鏡の少なくとも１つを備えている生化学分析装置を提供する。

上記第１の発明の生化学分析方法によれば、基質溶液を常に新鮮な状態で送液することで、酵素反応に依存したシグナルを取得し、しかも、基質送液を一定時間停止した後、再度送液することで、流速や流量変化による信号強度への影響を抑え、酵素反応を送液停止時間に比例した鋭いシグナル（信号）として得ることができる。すなわち、酵素反応は送液停止時間に比例した鋭いシグナル（信号）として得られ、停止時間を制御することで酵素反応生成物の濃度を自由に制御することが可能になり、高い精度で効率的な生化学分析を行うことができる。

第２の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明と同様の効果が得られ、分析対象物質と反応物質Ａとの反応が確実にすることができ、より明瞭で、鋭いピークが検出することができ、高い精度で効率的な生化学分析を行うことができる。

第３の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明および第２の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。

第４の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明および第２の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。

第５の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明から第４の発明と同様の効果が得られるとともに、反応生成物はほとんど拡散することなく、半値幅数秒の鋭いピークとして検出することが可能になる。

第６の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明から第５の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。

第７の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明から第５の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。

第８の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明から第５の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。

第９の発明の生化学分析方法によれば、上記第１の発明から第８の発明と同様の効果が得られ、しかも、より高精度なシグナルの検出が可能となる。

第１０の発明の生化学分析装置によれば、基質送液を一定時間停止、また再び一定速度で送液することが安定簡単にでき、酵素反応を送液停止時間に比例した鋭いシグナル（信号）として得ることができるため、停止時間を制御することで酵素反応生成物の濃度を自由に制御することができ、明瞭で鋭いピーク高さを検出、測定することができる。

第１１の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０の発明と同様の効果が得られ、また、分析対象物質と反応物質Ａとの反応が確実にすることができ、しかも、操作の簡便性、再使用性、分析精度の向上を実現することができる。

第１２の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０の発明および第１１の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。

第１３の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０の発明および第１１の発明と同様の効果が得られるとともに、送液の停止および送液の制御が、安定、かつ、スムーズに行うことができる。

第１４の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０から第１３の発明と同様の効果が得られるとともに、反応生成物はほとんど拡散することなく、半値幅数秒の鋭いピークとして検出することが可能になる。

第１５の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０から第１４の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。

第１６の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０から第１４の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。

第１７の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０から第１４の発明と同様の効果に加え、さらに、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。

第１８の発明の生化学分析装置によれば、上記第１０の発明と同様の効果が得られ、しかも、より高精度なシグナルの検出が可能となる。

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。

この出願の発明は、マイクロチップの微細流路における担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Ａと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Ｂとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法である。そして、この生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止して、引き続き一定速度で基質溶液を送液（Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗ）することにより、検出シグナルを明暸で鋭いピークとして検出装置等で捉えることができる。この結果、基質溶液を常に新鮮な状態で送液することができ、酵素反応に依存したシグナルを取得することができる。しかも、基質送液を一定時間停止した後、再度送液することで、液量変化による信号強度への影響を抑え、酵素反応を送液停止時間に比例した鋭い信号として得ることができるため、従来よりも高い精度で効率的に生化学分析を実施することができる。

また、この出願の発明の生化学分析方法においては、反応物質Ａを支持させるための担体としては各種のもの、そして各種形状のものであってよく、ビーズ状、ブロック状、板状等の各種の形態のプラスチック、無機物等のものであってよい。微細流路の内壁、あるいは、これを表面修飾した表面であってもよい。

なかでも、操作の簡便性、再使用性、分析精度等の観点からは、ビーズ状のものが好適な例として示される。たとえば、このビーズ担体を用いる場合には、分析対象物質含有の試料液を、反応物質Ａを支持させたビーズ担体充填の微細流路内にチップジョイントから送液して、これと同時に、もしくは、ついで反応物質Ｂを送液し、その後、前記反応物質Ｂの酵素と反応する基質溶液を一定時間の送液停止と引き続いての一定速度での送液により微細流路内に供給することで、より簡便に、分析対象物質の生化学分析方法を行うことができる。

なお、この場合のビーズ担体は、反応物質Ａが固定化されることができるものであればよく、ガラスビーズや高分子ビーズ等が例示することができるが、特に制限されるものではない。また、この出願の発明の生化学分析方法における、送液の「停止状態」とは、たとえば、後述の図１におけるチップジョイント（６）でのキャピラリー（微細流路）内圧力（Ｐ_０）と排出部（９）の（微細流路）での圧力（Ｐ_１）とが略同一、すなわち、相互の圧力はＰ_０≒Ｐ_１の状態にあることを意味している。

送液の停止と送液のための手段、すなわち送液手段としては、たとえば、バルブ制御手段によるバルブの切り換えを可能とするものや、ポンプ制御手段によるポンプの停止と運動の切り換えを可能とするものが好適に考慮される。この出願の発明の生化学分析方法における送液の停止および送液を安定、かつ、スムーズに行うためには、上記のようなバルブ制御手段、または、ポンプ制御手段を利用することが好ましい。

この出願の発明の生化学分析方法に用いることのできるマイクロチップの微細流路内にビーズ担体の流れ堰き止め部を設けて、検出位置をその下流位置とすることも好適に考慮される。この場合には、反応生成物はほとんど拡散することなく、半値幅数秒の鋭いピークとして検出することが可能になる。

また、この出願の発明の生化学分析方法では、分析対象物質、反応物質Ａおよび反応物質Ｂとの反応において、免疫反応を利用することで、より簡便で高精度な生化学分析を行うことができる。たとえば、分析対象物質が抗原である場合、反応物質Ａは分析対象物質と特異的に結合する抗体、また反応物質Ｂについても抗体であることが好ましい。

さらに、分析対象物質が抗体である場合は、反応物質Ａは分析対象物質と特異的に結合する抗抗体であり、また反応物質Ｂはこれら抗原や抗抗体または抗原と抗体との結合物であることが好ましい。なお、分析対象物質が抗体である場合、反応物質Ａが抗体である分析対象物質の抗原、また反応物質Ｂが抗抗体であってもよい。

この出願の発明において分析対象となりうる物質は、たとえば、蛋白質、核酸、化学物質等、より具体的には、たとえば、生理活性物質や食品等に含まれる内分泌攪乱物質等が挙げられ、特に制限されるものではない。このため、この出願の発明は、医学、薬学、生物学、化学、食品学等の諸分野において利用することができ、分析対象物質の測定やスクリーニング等に利用することができる。また、使用できる反応物質Ａも特に制限されるものではなく、分析対象物質と特異的に結合するものであればよい。さらに、反応物質Ｂについても、分析対象物質および／または反応物質Ａと特異的に結合するものであればよく、さらに、反応物質Ｂに標識される酵素の種類等も特に制限されるものではない。

たとえば、分析対象物質が、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）である場合には、反応物質Ａは抗ＩｇＥ抗体であることが好ましく、反応物質Ｂは、酵素が標識された抗１ｇＥ抗体であることが好ましい例として示される。また、反応物質Ｂに標識されている酵素についても、β−ガラクトシターゼ（β−Ｇａｌ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）やペルオキシターゼ（ＰＯＤ）、ホースラディッシュパーオキシターゼ（ＨＲＰ）等のいずれかが標識されていることが好適な例として考慮される。そして、これら酵素と反応することのできる各種の基質溶液を導入することで、基質溶液中の基質物質が酵素と反応して、蛍光性物質、あるいは、吸光性物質等に変換されてシグナルを発することとなる。

具体例としても各種の場合が考慮されてよい。たとえば、イボニシ等の海産巻き貝に含まれる、内分泌攪乱物質の一種とされる性ホルモン１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌを分析対象物質とすることもできる。この場合には、反応物質Ａは抗１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ抗体を用い、反応物質Ｂは、ＨＲＰ標識された抗１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ抗体を用い、そして、ＨＲＰと反応する基質溶液を導入することにより、酵素反応に依存したシグナルを取得することができるため、１７β−ｅｓｔｒａｄｉｏｌを高精度に分析することができる。

そして、上記のとおりの生化学分析において、得られた酵素との反応によるシグナルを、たとえば、吸光度、蛍光および熱レンズ信号の内、少なくともいずれか１つのシグナルをもって検出装置等による検出手段で検出することができる。

図１は、上記のような生化学分析を行うためのシステム構成（装置）を例示したものであって、マイクロチップ（１）の微細流路（１Ａ）において、抗原抗体免疫反応を行うための自動化された送液制御部（２）と、これにより制御されている試薬を選択し送液するための送液ポンプ（３）とともに、バルブ（４）、そして、検出時に一定時間の停止（ストップ）および引き続いての一定速度の送液（フロー）を行うバルブ（５）を備えている。また、このマイクロチップ（１）には、分析対象物質含有の試料液（８）や各種試薬類を送液、装入するためのチップジョイント（６）と廃液（９１）を排出するための排出部（９）とを備えている。

チップジョイント（６）の微細流路内圧力（Ｐ_０）と、排出部（９）での圧力（Ｐ_１）とがＰ_０≒Ｐ_１となるように送液を「停止」するこの出願の発明においては、上記のバルブ（４）（５）等による送液上流側での制御手段だけでなく、排出部（９）における下流側の流れ（圧力）制御のためのバルブ等の手段を用いてもよいもちろん、上流下流で、これら流れ（圧力）制御手段を併用してもよい。

この検出時における基質溶液の送液の一定時間の停止および引き続き一定速度の送液（Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗ）の制御には、バルブの切り換えによる制御を行うことのできるバルブ切り換え制御装置やポンプの運動および停止による制御を行うことのできるポンプ切り換え制御装置を備えることによって、安定、かつ、スムーズに送液の停止および送液をすることができる。

なお、この出願の発明における「一定時間の停止」の「時間」については、分析対象物質の検出系によって得られる好適なシグナルのピーク高さ等を考慮して、適宜に設定、変更することができる。

前記送液ポンプ（３）には、たとえば、試薬を送液するための複数のマイクロシリンジ（図示せず）が備えられている。また、たとえば、試薬は分析対象物質に特異的に結合する酵素標識抗体（反応物質Ｂ）と、検体（分析対象物質）を含む試料液（８）中の夾雑物および余分な酵素標識抗体（反応物質Ｂ）を洗浄するための洗浄液、そして、酵素反応により蛍光性物質、あるいは、吸光性物質に変換される基質からなっている。

上記の微細流路（１Ａ）（マイクロチャンネル）については、およそ幅５００μｍ以下、深さ３００μｍ以下が目安となる。このような微細流路（１Ａ）は、ガラス、プラスチック、シリコン、その他各種のセラミックスや無機質材、あるいは金属等の適宜な素材のマイクロチップ（１）基板に微細加工技術によって形成したもの、あるいは、さらに、その表面を修飾したものとしたもの等とすることができる。

そして、この微細流路（１Ａ）の平面流路パターンは、分析の目的等に応じて様々な合流部や分岐部を持つものであってよい。その断面形状を適宜に様々なパターンとすることができる。

なお、反応・分析時には、微細流路（１Ａ）（マイクロチャンネル）やビーズ担体のチップジョイント（６）に気泡が混入すると分析上好ましくない場合があることから、たとえば、マイクロチャンネル上部のマイクロチップ（１）表面に配置する透明カバー体やマイクロチップ（１）（基板）に微小孔や微小排気路を設けることや、図２の平面Ｙ字型のマイクロチャンネル流路の一方に試料や試薬を供給する際に、他方のマイクロチャンネル流路にまでこれらが流れ込むように気泡の混入を抑えること等のことが、そして、そのための流路設計が考慮されることになる。

また、定量分析のために一定量のビーズ担体（１Ｂ）を導入することが必要な場合には、ビーズ担体（１Ｂ）の個数を数えるのではなく、流路設計により体積、すなわち流路長さにより判定できるようにすることも考慮されている。

もちろん図１、図２は、システムの構成例を説明したものであって、これに限定されることはない。たとえば一枚の基板（マイクロチップ（１））上に、複数の反応流路部と複数の検出流路部が配設されていてもよいし、さらには、たとえば図２に例示したように、検出点を一点にし、一つの検出流路部に、並列配置した複数の流路部の各々が連通されるようにしてもよい。この場合には、同時に他種類の分析を行うことを目的とし、まず初めに各々の流路部のチャンネルに反応に必要な試薬溶液などを同時に導入して一斉に反応させた後、酵素反応基質溶液を各チャンネルごとに順次導入して、反応生成物を合流部より下流で検出することができる。

この検出する際には、図２に例示したように、ビーズ担体（１Ｂ）の流れを堰き止める堰き止め部（１Ｃ）を設けたマイクロチップ（１）を使用することによって、検出位置をその下流位置とし、反応生成物をほとんど拡散させることなく、半値幅数秒の鋭いピークとして検出することが可能になり、好ましい。

また、各チャンネルの分析結果を一カ所の検出点で測ることができ、検出装置（７）を複数準備したり、検出装置（７）もしくはマイクロチップ（１）を移動させたりする必要がないため、簡便で迅速な分析が可能となる。この検出については、非接触で、たとえば光学的に行うことなどが可能である。たとえば、吸光光度計、蛍光測定装置、熱レンズ顕微鏡等の検出装置を使用することができ、これら検出装置を複数組み合わせて使用してもよい。また、特に熱レンズ顕微鏡については、この出願の発明者らが開発してきた熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）システムを有効に用いることができる。

以上のようなシステム構成（装置）を利用することによって、試薬送液の流速および流量を安定に制御することができ、高い精度で効率的に生化学分析を行うことができることとなる。

そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によってこの出願の発明が限定されることはない。

実施例１：生化学分析
分析対象物質をＩｇＥとし、反応物質Ａとしては抗ＩｇＥ抗体を、また反応物質Ｂとしてはホースラディッシュパーオキシターゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）標識された抗ＩｇＥ抗体を用いた。また、基質溶液としては、ＨＲＰと反応するＡｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（モルキュラープローブ社製）を用いた。また、マイクロチップとしてはパイレックス（登録商標）ガラス製で、幅２５０μｍ、深さ１００μｍの微細流路および中央部のみビーズ担体を堰き止めるために深さを１０μｍにした堰き止め部を有するものを用いた。ビーズ担体としては、直径１５−５０μｍ程度のポリスチレンビーズを用いた。

図１および図２に概要を説明したシステム構成（装置）において、抗ＩｇＥ抗体が吸着保持されたポリスチレンビーズ（１０μｇ／ｍｌ）をマイクロチップの微細流路内に導入して、各種濃度（０ｎｇ／ｍｌ、１５．６ｎｇ／ｍｌ、３１．３ｎｇ／ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ）の分析対象物質であるＩｇＥをそれぞれ送液した。つぎに、ＨＲＰ−抗ＩｇＥ抗体（１０μｇ／ｍｌ）を送液し、洗浄した。そして、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄを４分間マイクロチップの微細流路内に送液して、その後３０秒間隔で送液の停止および送液とを繰り返すことにより、Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄの蛍光性反応生成物をピークとして蛍光検出した。

結果は、図３および図４それぞれに示したとおりであって、検出されるピークの高さはＩｇＥ濃度に依存しており、図４の検量線で示したように良好な直線性を示すことが確認された。
実施例２：生化学分析２
実施例１と同様にして、基質溶液には、ＨＲＰと反応するテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用い、熱レンズ顕微鏡で検出される熱レンズ信号を検出し、検量線を作成評価した。

結果は、図５に示したとおりであった。ＴＭＢを用いた場合でも、ＩｇＥの濃度依存的に検出されるピークが高くなっていることが確認された。
実施例３：Ｓｔｏｐ／ＦｌｏｗによるシグナルとＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗによるシグナルの比較
実施例２において、この出願の発明のＳｔｏｐ／Ｆｌｏｗによるシグナルと従来のＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗによるシグナルとの比較した。図６に示したとおり、Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗ（上段）では、シグナル強度が鋭く、かつ、明確なシグナルが検出された。一方、従来のＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ（下段）では、シグナル強度がポンプの脈流により凸凹のあるシグナルを示した。
実施例４：流速の変動によるシグナル強度の変動
非酵素的シグナルとして、熱レンズ信号を得ることのできる熱レンズ標準色素溶液であるサンセットイエロー（Ｓｕｎｓｅｔ Ｙｅｌｌｏｗ、ＳＹ）を濃度１×１０^−４Ｍで流速１−３μ／ｍｉｎの間で変動させた。図７上段に示したように、流速に依存せずにほぼ同じ程度の信号を確認することができた（左側）。

これに対して、実施例３にて行った従来のＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗにおいては、流速に逆比例したシグナル強度が得られた（右側）。

これをこの出願の発明のＳｔｏｐ／Ｆｌｏｗで検出するとき、流速を２μ／ｍｉｎと５μ／ｍｉｎとの間で変動させた場合では、図７下段に示したように、流速が２．５倍の差があるにも関わらず、流速の変動には影響されず、ピーク高さに大きな差は認められなかった。
実施例５：停止時間の変動によるシグナル強度
実施例２において、Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗにおける停止時間（Ｓｔｏｐ）を３０秒、２０秒、１０秒と変動させ、この停止時間に合わせて送液時間（Ｆｌｏｗ）を３０秒、４０秒、５０秒と変動させた場合のシグナル強度を検討した。

結果は、図８に示したとおり、停止時間に比例して、ピーク高さを得ることができた。このことから、停止時間を制御することで、シグナル強度を簡単に加減できることが確認された。
実施例６：ＩｇＥ濃度の変動におけるシグナル強度
実施例２において、分析対象物質であるＩｇＥの濃度を２５０ｎｇ／ｍｌと１２５ｎｇ／ｍｌの２つの濃度条件で比較検討した。

実施例３で示したように、本来、ベースラインのシグナル（信号）強度もＩｇＥ濃度に依存すると考えられるが、結果としては、図９に示したとおり、２５０ｎｇ／ｍｌのベースライン（Ｌ１）よりも１２５ｎｇ／ｍｌのベースライン（Ｌ２）の方が高くなっている。このことは、基質溶液は、時間経過とともに一部分解（光分解）して着色される性質を有していることから、２５０ｎｇ／ｍｌの測定後に１２５ｎｇ／ｍｌの測定を行う場合には、その間に基質物質が上記のとおり一部分解したことに起因している。しかしながら、このような影響にも関わらず、Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗで得られるピーク高さは、ＩｇＥ濃度に比例したピーク高さを示していることから、この出願の発明では、Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗにより明瞭で鋭いピークとしてシグナル（信号）を得ることができる特長を示している。

この出願の発明のためのシステム構成（装置）を例示した模式図である。 図１の部分断面図である。 この出願の発明の生化学分析をＩｇＥの濃度変動におけるシグナル検出を比較した結果を示した図であり、ＩｇＥの濃度ごとにおけるシグナルのピーク高さを示している。 図３の結果を検量線として示している図である。 この出願の発明の生化学分析をＩｇＥの濃度変動におけるシグナル検出を比較した結果を示した図であり、ＴＭＢを基質溶液として用い、またシグナル検出には熱レンズ顕微鏡を用いた結果を検量線として示している。 ＩｇＥ濃度の変動とともにＳｔｏｐ／ＦｌｏｗとＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗとの比較検討した結果を示した図であり、上段がＳｔｏｐ／Ｆｌｏｗの結果を、下段がＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗの結果を示している。 図６において、流速を変動させた場合の結果を示した図であり、上段はＣｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗの結果を、下段はＳｔｏｐ／Ｆｌｏｗの結果を示している。 Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗにおいて、停止時間の変動によるシグナル（信号）強度の変動を検討した結果を示した図である。 Ｓｔｏｐ／Ｆｌｏｗにおいて、低濃度ＩｇＥと高濃度ＩｇＥ間におけるベースラインのシグナルが逆転している場合における、シグナル強度のＩｇＥの濃度依存性を検討した結果を示した図である。

符号の説明

１ マイクロチップ
１Ａ 微細流路
１Ｂ ビーズ担体
１Ｃ 堰き止め部
２ 送液制御部
３ 送液ポンプ
４、５ バルブ
６ チップジョイント
７ 検出装置
８ 試料液
９ 排出部
９１ 廃液
Ｌ１、Ｌ２ ベースライン

Claims (18)

1. マイクロチップ微細流路における担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Ａと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Ｂとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析方法において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質溶液を送液することにより、検出シグナルをピークとして捉えることを特徴とする生化学分析方法。
2. 分析対象物質と特異的に結合する反応物質Ａを支持させたビーズ担体をもっての請求項１の生化学分析方法であって、分析対象物質含有の試料液を、反応物質Ａを支持させたビーズ担体充填の微細流路内に送液し、これと同時に、もしくは次いで反応物質Ｂを送液し、その後、前記反応物質Ｂの酵素と反応する基質溶液を一定時間の送液停止と引き続いての一定速度での送液により微細流路内に供給することを特徴とする生化学分析方法。
3. 送液の停止と送液とをバルブ制御手段によるバルブの切り換えにより行うことを特徴とする請求項１または２の生化学分析方法。
4. 送液の停止と送液とをポンプ制御手段によるポンプの停止と運動の切り換えにより行うことを特徴とする請求項１または２の生化学分析方法。
5. 微細流路には、ビーズ担体の流れ堰き止め部を設けることを特徴とする請求項１ないし４のいずれかの生化学分析方法。
6. 分析対象物質は抗原であり、反応物質Ａは抗体であり、また反応物質Ｂは抗体であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかの生化学分析方法。
7. 分析対象物質は抗体であり、反応物質Ａは抗抗体であり、また反応物質Ｂは抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかの生化学分析方法。
8. 分析対象物質は抗体であり、反応物質Ａは抗原であり、また反応物質Ｂは抗抗体であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれかの生化学分析方法。
9. 酵素との反応によるシグナルを、吸光度、蛍光および熱レンズ信号の少なくとも１つをもって検出することを特徴とする請求項１ないし８いずれかの生化学分析方法。
10. マイクロチップ微細流路における担体上で、試料液中の分析対象物質が特異的に結合する反応物質Ａと、前記分析対象物質並びにこの分析対象物質と特異的に結合する酵素が標識された反応物質Ｂとによる複合体が、前記酵素の基質が反応するときに生じる酵素量に依存したシグナルから分析対象物質の濃度を測定する生化学分析装置において、微細流路中への基質溶液の送液を一定時間停止し、引き続き一定速度で基質液を送液する送液手段および検出シグナルを捉える検出手段とを備えていることを特徴とする生化学分析装置。
11. 反応物質Ａを支持させたビーズ担体が微細流路内に充填されていることを特徴とする請求項１０の生化学分析装置。
12. 送液手段は、バルブ切り換え制御装置を備えていることを特徴とする請求項１０または１１の生化学分析装置。
13. 送液手段は、ポンプ切り換え制御装置を備えていることを特徴とする請求項１０または１１の生化学分析装置。
14. 微細流路には、ビーズ担体の流れ堰き止め部を備えていることを特徴とする請求項１０ないし１３のいずれかの生化学分析装置。
15. 分析対象物質が抗原であり、反応物質Ａが抗体であり、また反応物質Ｂが抗体であることを特徴とする請求項１０ないし１４のいずれかの生化学分析装置。
16. 分析対象物質が抗体であり、反応物質Ａが抗抗体であり、また反応物質Ｂが抗原、抗抗体または抗原と抗体との結合物であることを特徴とする請求項１０ないし１４のいずれかの生化学分析装置。
17. 分析対象物質が抗体であり、反応物質Ａが抗原であり、また反応物質Ｂが抗抗体であることを特徴とする請求項１０ないし１４のいずれかの生化学分析装置。
18. 検出手段として、吸光光度計、蛍光測定装置および熱レンズ顕微鏡の少なくとも１つを備えていることを特徴とする請求項１０ないし１７いずれかの生化学分析装置。

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