JP2005137201A - ソヤサポゲノールbの製造法 - Google Patents
ソヤサポゲノールbの製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005137201A JP2005137201A JP2001117449A JP2001117449A JP2005137201A JP 2005137201 A JP2005137201 A JP 2005137201A JP 2001117449 A JP2001117449 A JP 2001117449A JP 2001117449 A JP2001117449 A JP 2001117449A JP 2005137201 A JP2005137201 A JP 2005137201A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- soyasapogenol
- sophoradiol
- producing
- plant
- producing soyasapogenol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/06—Hydroxylating
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
- C07H15/256—Polyterpene radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07J—STEROIDS
- C07J63/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by expansion of only one ring by one or two atoms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】医薬品もしくは医薬品の原料として有用なソヤサポゲノールBを、ソフォラジオールから新規に製造する方法の提供。
【解決手段】カンゾウのカルスをナフタレン酢酸及び6−ベンジルアミノプリンを含む培地で培養したものなど、植物培養物に由来の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールとNADPHを原料とし、ソフォラジオールのオレアナン骨格の24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールBの新規な製造法。
【選択図】なし
【解決手段】カンゾウのカルスをナフタレン酢酸及び6−ベンジルアミノプリンを含む培地で培養したものなど、植物培養物に由来の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールとNADPHを原料とし、ソフォラジオールのオレアナン骨格の24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールBの新規な製造法。
【選択図】なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の水酸化酵素を用いた、ソヤサポゲノールB(soyasapogenol B)の新規な製造法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ソヤサポゲノールB(12-oleanane-3,22,24-triol)は大豆種子より単離・構造決定されたオレアナン骨格を有するトリテルペン(Chem. Pharm. Bull. 24,121-129,1976、Chem. Pharm. Bull. 30,2294-2297,1982)であり、その配糖体であるソヤサポニンはマメ科植物に広く分布している。これまでにソヤサポゲノールBに関しては、抗補体活性、血小板凝集抑制作用(特開昭61-37749)、抗腫瘍活性(特開平10-234396)および肝保護作用(Bioorg.Med.Chem. Lett.7,85-88,1997)などが報告されており、医薬品もしくは医薬品原料としての有用性が期待されている。
【0003】
ソヤサポゲノールBの製造法としては、大豆種子に含有されるサポニンの糖鎖を加水分解したのち、ソヤサポゲノールBを精製する方法が知られているが、大豆種子に含有されているサポニンの割合は約0.2%(薬学雑誌104,162-168,1984)と少なく、より効率的な製造法が求められていた。
【0004】
ソヤサポゲノールBと構造的に類似するソフォラジオール(12-oleanene-3,22-diol)は槐花(エンジュ)の成分として報告されている物質(薬学雑誌78,1090-1094,1958)であるが、このソフォラジオールの24位を水酸化すると目的であるソヤサポゲノールBを生産することが可能である。しかしながら、化学合成的な手法で位置選択的に水酸基を導入することは困難である。
従来より、位置選択的に水酸基を導入する方法として微生物による培養変換法が古くから研究されており、ステロイド類では位置選択的に水酸基を導入する微生物が多数発見されている。一方、植物の生合成機能を利用する方法に関する研究も進められており、培養細胞を用いて水酸化や配糖化などが試みられている。
【0005】
これまでにカンゾウの培養細胞がグリシルレチン酸(3-Hydroxy-11-oxo- 12-oleanene-30-oic acid)の24位を水酸化して、24-ハイドロキシグリシルレチン酸を生成することが報告(Phytochemistry 34,1303-1307,1993)されているが、ソフォラジオールを水酸化してソヤサポゲノールBを生産したことは報告されていない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
植物の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールの24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールBの製造法を提供する。
【0007】
【課題を解決するための手段】
カンゾウ(Glycyrrhiza glabra)培養細胞から酵素画分を調製して、ソフォラジオールの24位を水酸化するための条件を検討した。その結果、カンゾウ培養細胞のミクロソーム画分にNADPHとソフォラジオールを添加してインキュベートすることにより、ソヤサポゲノールBを生産することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨とするところは、植物特に好ましくはカンゾウの水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールからソヤサポゲノールBを生産することを特徴とする、ソヤサポゲノールBの製造法である。
【0008】
【発明の実施の形態】
1. 酵素画分の調製法
本発明に用いることができる植物は、ソヤサポゲノールBを生合成する植物であれば、オレアナン骨格の24位を水酸化する機能を有すると考えられることから、カンゾウに限定されるものではなく、ソヤサポゲノールBを含有するマメ科のダイズ、クララ、アルファルファなども利用できる。またその形態としては、種子から発芽して間もない幼植物体、栽培した植物体、あるいはカルスなどの培養細胞のいずれからでも調製することができる。
【0009】
収穫した植物あるいは細胞を適当な方法で破砕し、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを含む緩衝液中で撹拌する。これをろ過や遠心沈降などの方法で処理して不溶物を除去し、酵素を抽出することができる。酵素の比活性を高めるため、超遠心により粗抽出液からミクロソーム画分を調製しても有効である。またゲルろ過やイオン交換樹脂などの常法によってさらに比活性を高めることも可能である。
【0010】
2. ソヤサポゲノールBの生産
適当な緩衝液に懸濁した酵素画分に、NADPHおよびソフォラジオールを加えてインキュベートすることにより、ソヤサポゲノールBを生産することができる。得られたソヤサポゲノールBは、酢酸エチルやクロロホルムなどの有機溶媒で抽出し、シリカゲルやODSを用いて精製することができる。また単にソヤサポゲノールBの生産を確認するだけであれば、有機溶媒での抽出物をTLCあるいはHPLC、GC、GC-MS、LC-MSなどの分析機器により検出、定量することができる。
【0011】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではなく、本発明によって明らかにされた事実に基づいて、酵素学的にソヤサポゲノールBを生産する手法をすべて包括する。
【0012】
【実施例1】
カンゾウ培養細胞は、カンゾウ(Glycyrrhiza glabra)の幼植物より誘導したカルスを100 μMのナフタレン酢酸と1 μMの6-ベンジルアミノプリンを含むLinsmaier-Skoog液体培地で継代培養(Phytochemistry 29,3127-3129,1990)したものを用いた。ソヤサポニン生産培地である1 μMのナフタレン酢酸と10 μMの6-ベンジルアミノプリンを含むLinsmaier-Skoog液体培地に移植後10日目に細胞を収穫し(30g新鮮重)、液体窒素で凍結して乳鉢中で粉砕後、PVPP 3gと、0.25 M ショ糖、2 mM EDTA、20 mM 2-メルカプトエタノールを含む0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 7.5)60 mlを加えてホモジナイズした。これをガーゼでろ過し、10,000 x gで10分間遠心した。遠心上清について、さらに100,000 x gで30分間遠心して得られた沈殿部に、20%グリセロール、2 mM EDTA、20 mM 2メルカプトエタノールを含む0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)6 mlを加えて懸濁し、ミクロソーム画分とした。
ミクロソーム画分1 mlに、NADPH(終濃度2 mM)およびソフォラジオール(終濃度50μM、Bioorg.Med.Chem.Lett.7,85-88,1997記載の方法により合成)をそれぞれ加え、15℃で30分間インキュベートした。反応終了後、これをエ-テル5 mlで2回抽出して、乾固後、200μlのメタノールに溶解した。
抽出液をLC-MS(Hewlett-Packard製、HP1090)で分析し、保持時間並びにマスフラグメントをソヤサポゲノールBの標品(和光純薬製)と比較した結果、ソヤサポゲノールBの生産を確認することができた。LC-MSによる分析条件と検出したマススペクトルを以下に示した。
【0013】
【0014】
【発明の効果】
本発明は医薬品もしくは医薬品の合成原料であるソヤサポゲノールBの製造法として有用である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の水酸化酵素を用いた、ソヤサポゲノールB(soyasapogenol B)の新規な製造法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
ソヤサポゲノールB(12-oleanane-3,22,24-triol)は大豆種子より単離・構造決定されたオレアナン骨格を有するトリテルペン(Chem. Pharm. Bull. 24,121-129,1976、Chem. Pharm. Bull. 30,2294-2297,1982)であり、その配糖体であるソヤサポニンはマメ科植物に広く分布している。これまでにソヤサポゲノールBに関しては、抗補体活性、血小板凝集抑制作用(特開昭61-37749)、抗腫瘍活性(特開平10-234396)および肝保護作用(Bioorg.Med.Chem. Lett.7,85-88,1997)などが報告されており、医薬品もしくは医薬品原料としての有用性が期待されている。
【0003】
ソヤサポゲノールBの製造法としては、大豆種子に含有されるサポニンの糖鎖を加水分解したのち、ソヤサポゲノールBを精製する方法が知られているが、大豆種子に含有されているサポニンの割合は約0.2%(薬学雑誌104,162-168,1984)と少なく、より効率的な製造法が求められていた。
【0004】
ソヤサポゲノールBと構造的に類似するソフォラジオール(12-oleanene-3,22-diol)は槐花(エンジュ)の成分として報告されている物質(薬学雑誌78,1090-1094,1958)であるが、このソフォラジオールの24位を水酸化すると目的であるソヤサポゲノールBを生産することが可能である。しかしながら、化学合成的な手法で位置選択的に水酸基を導入することは困難である。
従来より、位置選択的に水酸基を導入する方法として微生物による培養変換法が古くから研究されており、ステロイド類では位置選択的に水酸基を導入する微生物が多数発見されている。一方、植物の生合成機能を利用する方法に関する研究も進められており、培養細胞を用いて水酸化や配糖化などが試みられている。
【0005】
これまでにカンゾウの培養細胞がグリシルレチン酸(3-Hydroxy-11-oxo- 12-oleanene-30-oic acid)の24位を水酸化して、24-ハイドロキシグリシルレチン酸を生成することが報告(Phytochemistry 34,1303-1307,1993)されているが、ソフォラジオールを水酸化してソヤサポゲノールBを生産したことは報告されていない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
植物の水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールの24位を水酸化することによる、ソヤサポゲノールBの製造法を提供する。
【0007】
【課題を解決するための手段】
カンゾウ(Glycyrrhiza glabra)培養細胞から酵素画分を調製して、ソフォラジオールの24位を水酸化するための条件を検討した。その結果、カンゾウ培養細胞のミクロソーム画分にNADPHとソフォラジオールを添加してインキュベートすることにより、ソヤサポゲノールBを生産することに成功し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨とするところは、植物特に好ましくはカンゾウの水酸化酵素を利用して、ソフォラジオールからソヤサポゲノールBを生産することを特徴とする、ソヤサポゲノールBの製造法である。
【0008】
【発明の実施の形態】
1. 酵素画分の調製法
本発明に用いることができる植物は、ソヤサポゲノールBを生合成する植物であれば、オレアナン骨格の24位を水酸化する機能を有すると考えられることから、カンゾウに限定されるものではなく、ソヤサポゲノールBを含有するマメ科のダイズ、クララ、アルファルファなども利用できる。またその形態としては、種子から発芽して間もない幼植物体、栽培した植物体、あるいはカルスなどの培養細胞のいずれからでも調製することができる。
【0009】
収穫した植物あるいは細胞を適当な方法で破砕し、抗酸化剤、酵素の安定化剤、ポリフェノール吸着剤、金属配位子などを含む緩衝液中で撹拌する。これをろ過や遠心沈降などの方法で処理して不溶物を除去し、酵素を抽出することができる。酵素の比活性を高めるため、超遠心により粗抽出液からミクロソーム画分を調製しても有効である。またゲルろ過やイオン交換樹脂などの常法によってさらに比活性を高めることも可能である。
【0010】
2. ソヤサポゲノールBの生産
適当な緩衝液に懸濁した酵素画分に、NADPHおよびソフォラジオールを加えてインキュベートすることにより、ソヤサポゲノールBを生産することができる。得られたソヤサポゲノールBは、酢酸エチルやクロロホルムなどの有機溶媒で抽出し、シリカゲルやODSを用いて精製することができる。また単にソヤサポゲノールBの生産を確認するだけであれば、有機溶媒での抽出物をTLCあるいはHPLC、GC、GC-MS、LC-MSなどの分析機器により検出、定量することができる。
【0011】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではなく、本発明によって明らかにされた事実に基づいて、酵素学的にソヤサポゲノールBを生産する手法をすべて包括する。
【0012】
【実施例1】
カンゾウ培養細胞は、カンゾウ(Glycyrrhiza glabra)の幼植物より誘導したカルスを100 μMのナフタレン酢酸と1 μMの6-ベンジルアミノプリンを含むLinsmaier-Skoog液体培地で継代培養(Phytochemistry 29,3127-3129,1990)したものを用いた。ソヤサポニン生産培地である1 μMのナフタレン酢酸と10 μMの6-ベンジルアミノプリンを含むLinsmaier-Skoog液体培地に移植後10日目に細胞を収穫し(30g新鮮重)、液体窒素で凍結して乳鉢中で粉砕後、PVPP 3gと、0.25 M ショ糖、2 mM EDTA、20 mM 2-メルカプトエタノールを含む0.1 M トリス塩酸緩衝液(pH 7.5)60 mlを加えてホモジナイズした。これをガーゼでろ過し、10,000 x gで10分間遠心した。遠心上清について、さらに100,000 x gで30分間遠心して得られた沈殿部に、20%グリセロール、2 mM EDTA、20 mM 2メルカプトエタノールを含む0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)6 mlを加えて懸濁し、ミクロソーム画分とした。
ミクロソーム画分1 mlに、NADPH(終濃度2 mM)およびソフォラジオール(終濃度50μM、Bioorg.Med.Chem.Lett.7,85-88,1997記載の方法により合成)をそれぞれ加え、15℃で30分間インキュベートした。反応終了後、これをエ-テル5 mlで2回抽出して、乾固後、200μlのメタノールに溶解した。
抽出液をLC-MS(Hewlett-Packard製、HP1090)で分析し、保持時間並びにマスフラグメントをソヤサポゲノールBの標品(和光純薬製)と比較した結果、ソヤサポゲノールBの生産を確認することができた。LC-MSによる分析条件と検出したマススペクトルを以下に示した。
【0013】
【0014】
【発明の効果】
本発明は医薬品もしくは医薬品の合成原料であるソヤサポゲノールBの製造法として有用である。
Claims (2)
- 植物由来の水酸化酵素を用いて、ソフォラジオールからソヤサポゲノールBを生産することを特徴とするソヤサポゲノールBの製造法
- カンゾウの水酸化酵素を用いて、ソフォラジオールからソヤサポゲノールBを生産することを特徴とする請求項1記載のソヤサポゲノールBの製造法
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001117449A JP2005137201A (ja) | 2001-04-16 | 2001-04-16 | ソヤサポゲノールbの製造法 |
PCT/JP2002/003612 WO2002086142A1 (fr) | 2001-04-16 | 2002-04-11 | Procede de production de soyasapogenol b |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001117449A JP2005137201A (ja) | 2001-04-16 | 2001-04-16 | ソヤサポゲノールbの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005137201A true JP2005137201A (ja) | 2005-06-02 |
Family
ID=18968000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001117449A Pending JP2005137201A (ja) | 2001-04-16 | 2001-04-16 | ソヤサポゲノールbの製造法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2005137201A (ja) |
WO (1) | WO2002086142A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013001890A1 (ja) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | 株式会社J-オイルミルズ | ソーヤサポゲノール組成物 |
WO2014017145A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 株式会社J-オイルミルズ | 組成物 |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE602005025734D1 (de) | 2004-02-25 | 2011-02-17 | Meiji Seika Kaisha | Triterpen-hydroxylase |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS57163331A (en) * | 1981-03-31 | 1982-10-07 | Kikkoman Corp | Preparation of soya sapogenol b |
JP3279574B2 (ja) * | 1995-07-07 | 2002-04-30 | 明治製菓株式会社 | トリテルペン誘導体および肝疾患治療剤 |
-
2001
- 2001-04-16 JP JP2001117449A patent/JP2005137201A/ja active Pending
-
2002
- 2002-04-11 WO PCT/JP2002/003612 patent/WO2002086142A1/ja active Application Filing
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013001890A1 (ja) | 2011-06-28 | 2013-01-03 | 株式会社J-オイルミルズ | ソーヤサポゲノール組成物 |
US9216187B2 (en) | 2011-06-28 | 2015-12-22 | J-Oil Mills, Inc. | Soyasapogenol composition |
WO2014017145A1 (ja) | 2012-07-24 | 2014-01-30 | 株式会社J-オイルミルズ | 組成物 |
US9486398B2 (en) | 2012-07-24 | 2016-11-08 | J-Oil Mills, Inc. | Composition |
US10039704B2 (en) | 2012-07-24 | 2018-08-07 | J-Oil Mills, Inc. | Composition |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002086142A1 (fr) | 2002-10-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Tabata et al. | Glucosylation of phenolic compounds by plant cell cultures | |
Liu et al. | Preparation of minor ginsenosides C-Mc, CY, F2, and CK from American ginseng PPD-ginsenoside using special ginsenosidase type-I from Aspergillus niger g. 848 | |
Beerhues | Benzophenone synthase from cultured cells of Centaurium erythraea | |
Muranaka et al. | Production of podophyllotoxin in Juniperus chinensis callus cultures treated with oligosaccharides and a biogenetic precursor in honour of Professor GH Neil Towers 75th Birthday | |
CN105648021B (zh) | 人参稀有皂苷c-k、f1及四种异构体人参皂苷元的制备方法 | |
KR100377546B1 (ko) | 효소적 방법에 의한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법 | |
Parast et al. | In vitro isolation, elicitation of psoralen in callus cultures of Psoralea corylifolia and cloning of psoralen synthase gene | |
Sabir et al. | Biotransformation of withanolides by cell suspension cultures of Withania somnifera (Dunal) | |
de Pádua et al. | Biotransformation of 21-O-acetyl-deoxycorticosterone by cell suspension cultures of Digitalis lanata (strain W. 1.4) | |
Hirotani et al. | Metabolism of 5β-pregnane-3, 20-dione and 3β-hydroxy-5β-pregnan-20-one by Digitalis suspension cultures | |
van Uden et al. | The accumulation and isolation of coniferin from a high-producing cell suspension of Linum flavum L. | |
Chaturvedi et al. | Enhancement of antioxidant compound in Tylophora indica (Asclepeadaceae) callus | |
JPS6312300A (ja) | ジンセノサイド−Rdの製造法 | |
CN113603744A (zh) | 一种白桦脂酮酸衍生物及其制备方法 | |
Kamel et al. | Glucosylation of butyric acid by cell suspension culture of Nicotiana plumbaginifolia | |
Peng et al. | Production of gastrodin through biotransformation of p-hydroxybenzyl alcohol using hairy root cultures of Datura tatula L. | |
JP4696302B2 (ja) | テアフラビン類の合成方法 | |
Seitz et al. | Enzymes in cardenolide-accumulating shoot cultures of Digitalis purpurea L. | |
JP2005137201A (ja) | ソヤサポゲノールbの製造法 | |
Pfitzner et al. | Properties of vinorine synthase—the Rauwolfia enzyme involved in the formation of the ajmaline skeleton | |
KR100403570B1 (ko) | 효소적 방법에 의한 진세노사이드 f₂의 제조방법 | |
CN111411099B (zh) | 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用 | |
Suzuki et al. | Survey and enzymatic formation of lignans of Anthriscus sylvestris | |
Fisinger et al. | Thebaine synthase: a new enzyme in the morphine pathway in Papaver somniferum | |
Burrows et al. | Metabolism of N, N′-diphenylurea by cytokinin-dependent tobacco callus: identification of the glucoside |