JP2005130815A - ゴムノキの培養系を利用した形質転換体及びその評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本件発明者らは、ゴムノキの葯、未熟種子又は形成層などから誘導したカルスに標的遺伝子を導入し、その後カルスから不定根を効率よく再生する条件を見出した。そこで、遺伝子改変されたゴムノキの不定根を培養することにより、導入遺伝子の植物内での機能を不定根の段階で評価検定するを可能とした。
【選択図】 なし
Description
材料として、好適には、葯、未熟種子又は形成層を用いる。カルスを誘導するには、培地にサイトカイニン系植物ホルモン及び/又はオーキシン系植物ホルモンを、低濃度で加える。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、SH培地(SchenkとHildebrandtの培地)、MS培地(MurashigeとSkoogの培地)、LS培地(LinsmaierとSkoogの培地)、Gamborg、B5、MB培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えた又はMS改変培地が好適である。
好ましくは、外果皮が硬化する前の段階の未熟な緑色の果実を利用する。未熟果実の表面を、周知の滅菌剤、例えば、エタノール、塩酸ベンザコルニウム、次亜塩素酸ナトリウム好適には、エタノールで滅菌する。滅菌した後、果実の内部の種子をとりだす。未熟種子の胚に成長する部分を摘出する。
III-1 標的遺伝子組み換えベクターの調製
ゴムノキに導入する標的遺伝子としては、例えば、ゴムの生合成機構やポリイソプレン鎖延長反応に関与し、ラテックスの産生量や分子量に対して機能する遺伝子、並びに、ラテックス中に含まれる、タンパク質、イノシトール、ケブラキトールなどの糖類、ビタミンEの一種であり天然の老化防止剤としても効果のあるトコトリエノールの生合成に関与し、その生産量に対して影響を与える遺伝子、さらには、これらのタンパク質、糖類、トコトリエノールの変異体を生ずる遺伝子などを挙がることができるが、これらに限定されず、任意の遺伝子を導入することができる。上記標的遺伝子は、ゴムノキで機能するプロモーターに連結してベクターに載せられる。ゴムノキで機能するプロモーターとしては、ゴムノキ由来のプロモーターであっても、異種以来のものであっても、ゴムノキにおいて機能する限り使用することができる、異種プロモーターとしては、例えば、CaMV35、NOS promoter等を使用することができる。
標的遺伝子組み換えベクターは、周知の手段、例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等により、カルス又は未熟胚に導入される。
上記III-1で調製した標的遺伝子組み換え中間ベクターをアグロバクテリウムツメファシエンス中のTiプラスミドと相同組み換えされるか、又は標的遺伝子バイナリーベクターを、アグロバクテリウムツメファシエンスに導入する。
形質転換されたアグロバクテリウムを、カルスに感染させることにより、標的遺伝子をカルスに導入することができる。
III-1で調製したカルスより、プロトプラストを調製する。調製したプロトプラストをIII-1で調製した標的遺伝子組み換えベクターの共存下、溶液中で、高圧電場を掛け、標的遺伝子をプロトプラストに導入する。
遺伝子導入されたカルス又はプロトプラストは、培地中で増殖させる。
増殖させたカルスから、不定根を誘導する。不定根誘導には、好適には、MS基本培地にIBA(インドール酪酸)を3〜10ppm添加した培地を用いる。更に好適には、スクロースを6〜7wt%添加する。IAA,NAA等のオーキシン類は添加しても、添加しなくても良い。
遺伝子導入された未熟胚は、培地で成長させる。培地としては、Whiteの培地、Hellerの培地、SH培地、MS培地、LS培地等があるが、MS培地又はその組成に変更を加えたMS改変培地が好適である。
上記1.又は2.で誘導された不定根又は無菌根を、適宜の大きさ、好適には、2〜3cm角の小片に切り分ける。適宜の培地、例えば、Whiteの培地、Hellerの培地、SH培地、MS培地、LS培地又はMB培地を用いることができ、好適には、MS培地を用い、培地中にIBA3〜10ppmを加えて、培養することにより、根の増殖を行うことができる。培地は固体でも液体でも良い。固体培地で行う場合は、適当な大きさに根が成長すると、根の一部を切断し、更に移植して、増殖する。好適には、液体培地を用いて、振トウ培養を、ジャーファーメンター等を用いて行う。液体培養することで、いっそう効率のよい増殖が可能で、移植操作も容易となる。
大量培養して、増殖させた根培養物から、標的遺伝子産物を抽出する。
(1)葯・未熟種子・形成層からカルスを経由して不定根を得る方法
外植体として用いる雄花の葯は蕾の状態のものをパラゴムノキから採取し、希釈した次亜鉛素酸ソーダ溶液で消毒後、蕾を開いて取り出した。未熟種子は外皮が緑色の軟らかい果実から採取した。形成層は若い枝を採取し、表面をエタノールで洗浄後、サンプリングした。
増殖されたカルスはホルモン組成のみ3〜10ppmに変えた、カルス誘導と同一組成の培地に移植した。IAA、NAAなどのオーキシンは加えても加えなくてもよい。IBAを加え、16時間光照射した27〜28℃の環境で1〜数ヶ月培養することにより不定根を誘導することができた。形成した発根を図1に示す。
比較的成長した未熟胚を種子からサンプリングし、MS基本培地に6〜7%のスクロースを加えた培地で培養することにより、ホルモン種にはあまり影響されることなしに、無菌根を誘導することができた。
上記(1)、(2)の培養で得た根を2〜3cm以上の小片に切り分け、IBA 3〜10ppmを加えた培地で根を増殖させた。培地は個体でも液体でも良い結果を得た。(図2参照。)
増殖が進んだ根の培養物においては、移植操作時の切断により、ラテックスの浸出が黙示で確認できた。さらにその組成を分析するために、培養根を有機溶媒(クロロホルムなど)でソクスレー抽出を行い、抽出部分を熱分解GC/MS,FT-IR,NMRなどの手法で分析した。
例えば、NMRでCDC13を溶媒として測定したところ、135.24ppm、125.08ppm、32.25ppm、26.44ppm、及び23.44ppmの位置に高いピークが見られ、これ以外に、128.0ppm、120.4ppm、29.7ppm、22.7ppm及び14.1ppmの位置に低いピークが見られた。
(1)カルスへ導入するプラスミドの調製
ここではβ-glucuronidase(通称:GUS)をレポータータンパク質として用いる。GUSは、D-グルクロン酸のβ型配糖体に作用してそのグルクロニド結合を加水分解する酵素であり、ゴムノキには存在しない。そこで、GUS遺伝子と、コローニー選抜用の抗生物質抵抗性遺伝子を有するプラスミドを次のように設計した。
遺伝子導入にはパーティクルガン(BIORAD PDS 1000/He)を用いる。ラプチャーディスクは1100psi(7.58Mpa)を用いる。マイクロキャリーからストッピングスクリーンまでの距離は、1.0cm、ストッピングスクリーンから打ち込み対象のカルス試料までの距離は9.5cmとする。撃ち込みには上記のpCU19−GUSプラスミドをコーティングした1.6μmの金粒子を用いる。
カルスは遺伝子導入2日後にハイグロマイシンを含む選抜培地に移し、培養し、生長してきたカルスを1次選抜する。
遺伝子導入されたカルス又はプロトプラストは、培地中で増殖させる。
増殖させたカルスから、不定根を誘導する。不定根誘導には、好適には、MS基本培地にIBA(インドール酪酸)を3〜10ppm添加した培地を用いる。更に好適には、スクロースを6〜7wt%添加する。
上記(4)で誘導された不定根を、約1cm角の小片に切り分ける。MS培地培地中にIBA3〜10ppmを加えて、ジャーファーメンターを用いて、培養することにより、根の増殖を行うことができる。
大量増殖された根の組織(0.1g)を採取し、GUS抽出バッファー(50mM リン酸ナトリウムバッファー,10mM EDTA,0.1% Triton X-100,0.1%サルコシル,10mM 2-ME)を0.5ml加えてよくホモジナイズし、全量をエッペンドルフチューブに移し、5分間遠心する。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、ここから、10μlを採取し、別のエッペンドフルチューブに移し、これをGUS含有サンプルとする。次に、上記GUS含有サンプルにGUS基質溶液(1mM 4-MUG(4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide、50mM リン酸ナトリウムバッファー,10mM EDTA,0.1% Triton X-100,0.1%サルコシル,10mM 2-ME)90μlを加え、37℃で1時間保温後、900μlの反応停止液(0.2% Na2CO3)を加え、反応を停止する。蛍光分光光度計(励起365nm、蛍光455nm)により蛍光強度を定量的に測定する。
これにより、遺伝子導入された、根をスクリーニングすることができる。
Claims (14)
- ゴムノキの組織培養物に標的遺伝子を導入し、該組織培養物から不定根を再分化させ、不定根を培養することにより得ることができるゴムノキの形質転換不定根。
- 標的遺伝子を導入する組織培養物として、ゴムノキの葯、未熟種子又は形成層から誘導したカルスを用いる請求項1記載の形質転換不定根。
- 標的遺伝子を導入する組織培養物として、ゴムノキの未熟胚の組織培養物を用いる請求項1記載の形質転換不定根。
- 不定根の誘導にIBA(インドール酪酸)を用いる請求項1〜3いずれか1項記載の形質転換不定根。
- IBA(インドール酪酸)の添加濃度が3〜10ppmである請求項4項記載の形質転換不定根。
- 不定根の誘導にスクロースを用いる請求項1〜3いずれか1項記載の形質転換不定根。
- スクロースの添加濃度が、6〜7wt%である請求項6記載の形質転換不定根。
- ゴムノキが、パラゴムノキである請求項1〜7いずれか1項記載の形質転換不定根。
- 標的遺伝子が、ゴムの生合成機構又はポリイソプレン鎖延長反応に関与する遺伝子、若しくは、ラテックス中に含まれる、タンパク質、イノシトール、ケブラキトール等の糖類、又はトコトリエノールの生合成に関与しする遺伝子である請求項1〜8いずれか1項記載の形質転換不定根。
- 標的遺伝子が、組み換えベクターとして組織培養物に導入される請求項1〜9いずれか1項記載の形質転換不定根。
- 標的遺伝子が、パーティクルガン法により、組織培養物中に導入される請求項1〜10いずれか1項記載の形質転換不定根。
- 請求項1〜11いずれか1項に記載される形質転換不定根を培養するゴムノキの形質転換不定根を増殖する方法。
- 請求項1〜11いずれか1項に記載される形質転換不定根を中の標的遺伝子の発現を確認することを含む、標的遺伝子で形質転換された植物の評価方法。
- 標的遺伝子の不定根における発現の確認が、不定根からラテックスを分離し、ラテックス中の成分を確認することにより行われる、請求項13項記載の方法。
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