JP2005130758A - 三次元培養による細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、培養液を連続供給することにより当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から生理活性物質を産生させることを特徴とする肝細胞の培養方法および前記肝細胞の樹立細胞株がFLCシリーズ株である肝細胞の培養方法。
【選択図】 図1
Description
ネイチュアー(Nature)424, 870(2003) サイエンス(Science)302, 46(2003)
三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、次いで、培養液を連続して供給することにより、当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から生理活性物質を産生させることを特徴とする肝細胞の培養方法
が提供される。
三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、次いで培養液を連続して供給することにより当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から産生させてなる生理活性物質
が提供される。
2)前記三次元細胞培養装置が、前記三次元細胞培養担体が収容されたラジアルフロー型バイオリアクターである肝細胞の培養方法。
3)前記細胞が肝細胞ばかりでなく、膵細胞等、増殖性を持ち、従来の平面培養では生物活性を発現できない細胞の培養方法。
従って、本発明に係る生体外における培養条件は、肝機能が本来的な能力を発揮できる条件に該当しているものといえる。
同様に、本発明によれば、ヒト由来の肝細胞FLC−5を用いることにより、副腎ホルモン系のプレグナンX受容体(PXR)を平面培養に比較して約22倍産生させることが可能な肝細胞の三次元培養方法を提供する。
また、FLC−5細胞を用いることにより、肝細胞核因子4α(HNF−4α)を平面培養に比較して約1.7倍産生可能な肝細胞の培養方法を提供する。
さらに、本発明によれば、FLC細胞によれば、肝特異性酵素、カルボキシラーゼおよびそのアイソザイムを平面培養に比較して約200倍産生させる肝細胞の培養方法を提供する。
また、本発明によれば、肝細胞における薬物代謝に係るトランスポーター、酵素の産生を平面培養に比較して数10倍以上で行なう肝細胞の三次元培養方法を提供する。
本発明に係る細胞の培養方法に用いられるバイオリアクターとしては、ラジアルフロー型バイオリアクターおよび培地流動型バイオリアクターを挙げることができる。
前記ラジアルフロー型バイオリアクターは、細胞が固定化された担体を培養槽内に充填した固定層型のものであれば、特に限定されるものではなく、従来、提案されている各種形式のものを使用することができる。例えば、一例を挙げると、図5に示すラジアルフロー型バイオリアクター1は、円筒形の本体2内にIKVAV C60 フラーレンを含有する粒状の三次元細胞培養担体3が充填されたものである。
また、ラジアルフロー型バイオリアクターは、複数の酸素補強用パイプ、複数の培養液回収パイプが設けられ、担体の充填位置との関連で栄養分濃度、溶存酸素濃度がリアクター内に均一に分布するように配置される。
さらに、他の形態のラジアルフロー型バイオリアクターとして、WO01/014517号再公表公報の第1図に記載されている三次元的細胞培養担体が充填されたラジアルフロー型バイオリアクターを用いることができる。
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。もっとも本発明は、下記実施例により限定されるものではない。
なお、細胞は、次の方法で培養し、細胞培養装置、細胞培養担体、分析製造等は以下のものを用いた。
培養液調整槽に培養液を装入し、これに酸素、二酸化炭素および苛性アルカリ等を添加し、酸素濃度、二酸化炭素濃度およびpHを所定の範囲に調整し、培養装置(ラジアルフロー型バイオリアクター)に供給した後、別途、培養した肝細胞を培養後に添加し、当該バイオリアクターに供給し、バイオリアクター内の細胞培養担体に担持させた。
次いで、培養担体上の細胞に培養液を供給し、前記培養条件を制御しながら、循環させ、細胞を増殖させ、担体上および培養液上清中の生理活性物質の産生量を測定した。
(2)細胞培養装置
ラジアルフロー型バイオリアクター(以下、「FRB装置」という。)(エイブル社製「RA−15」)および附属装置を使用した。
(3)細胞培養担体
ヒドロキシアパタイト;ペンタックス社製「セルヤード200」
(4)分析装置等
・PCR装置および試薬キット;パーキンエルマー アプライド バイオシステムズ(PerkinElmer Applied Biosystems) 社製「7700型およびMMRキット」
・液体クロマトグラフィー装置等;「シマヅLC’10A」
培養後、培地上清液中のアルブミン量を液体クロマトグラフィーで定量した。
本発明に係るRFB培養によれば、図1に示すように平面培養に比較して約7倍の産生量を得た。
培養した細胞は、0.02%のEDTAを添加したトリプシン(25USP単位/ml、DIFCO製)で処理した。ミクロソーム分画は、1000rpm−5分、10000rpm−10分の遠心処理の後、100000rpm−60分のペレット分画を使用した。CYPの誘発剤としてリンファンピシンを添加した。また、GAPDHのRNA量を用いてmRNA値の補正を行なった。
PXRは、リンファンビシンの誘導により平面培養による産生量と比較したところ、図3に示すように約22倍であった。
肝細胞核因子の産生量は、図4に示すようにリファンピシンの誘導により平面培養に比較して約1.7倍であった。
本発明によれば、従来の二次的・平面的培養では得られなかった形態・量の生理活性物質を得ることができ、動物実験が不必要となる機会を与え、さらに、細胞の正確かつ資質的な性状の明確な評価手段を提供する。
従って、本発明は、今日までの平面培養による蓄積された細胞の知見を根底からくつがえす機会を提供するものであり、新規理論に基づく生化学の確立と新規産業の創成に寄与するところ極めて大きいものである。
2 バイオリアクター本体
3 細胞培養担体
Claims (7)
- 三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液を供給し、当該担体に肝細胞を担持させ、培養液を連続供給することにより当該肝細胞を増殖させ、当該肝細胞から生理活性物質を産生させることを特徴とする肝細胞の培養方法。
- 前記生理活性物質が、
(1)血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、
(2)チトクロームP450 1A2、2A6、2C9、2D6、2E1および3A4、
(3)プレグナンX受容体、
(4)カルボキシラーゼまたは該アイソザイム、
(5)肝細胞核因子4α および
(6)薬物トランスポーター
からなる群より選択される生体成分である請求項1に記載の肝細胞の培養方法。 - 前記肝細胞の樹立細胞株がFLCシリーズ株である請求項1に記載の肝細胞の培養方法。
- 前記三次元細胞培養担体が、シラン(TM)またはヒドロキシアパタイトである請求項1に記載の肝細胞の培養方法。
- 前記三次元細胞培養装置が、ラジアルフロー型バイオリアクターまたは液体培地による培地流動型バイオリアクターである請求項1に記載の肝細胞の培養方法。
- 肝細胞を、三次元細胞培養担体を収容した三次元細胞培養装置に培養液の存在下において供給し増殖させることにより産生させてなる三次元生理活性物質。
- 前記生理活性物質が、
(1)血清アルブミン、α−フェトプロテイン、トロンボポエチン、
(2)チトクロームP450 1A2、2A6、2C9、2D6、2E1および3A4、
(3)プレグナンX受容体、
(4)カルボキシラーゼまたは該アイソザイム、および
(5)肝細胞核因子4α
からなる群より選択される生体成分である請求項6に記載の三次元生理活性物質。
(6)薬物トランスポーター
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