JP2005087177A - 海洋無脊椎動物幼生の変態促進剤及びその製造方法 - Google Patents
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【解決手段】 紅藻植物門(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae)オゴノリ目(Gracilariales)、スギノリ目(Gigartinales)又はイギス目(Ceramiales)に属する直立着床可能な大型海藻の塩類水溶液抽出画分を有効成分とした無脊椎動物幼生の変態促進剤とする。
【選択図】 なし
Description
また、藍藻植物と紅藻植物はフィコピリン色素を含むが、その中のエキネノンとミクソキサントフィルは藍藻植物に特有であり、紅藻植物にはアミロペクチンに類似の紅藻デンプンを含んでいる。
そして、紅藻植物については、これまでそれに由来する物質の中に海洋無脊椎動物浮遊幼生の着生促進又は変態促進の作用を有するものがあることが報告されている。
本発明で用いる原料としては、天然に生育している海藻でもよいが、単藻培養株が好ましい。
この際用いる塩類を含む水溶液としては、例えば生理食塩水、リン酸塩緩衝液、トリス塩酸緩衝液などが好ましい。
なお、各例における「変態率」とはイシサンゴ幼生が基層に着生し、放射状の骨格形成を行うステージ(シングルポリプステージ)に達した状態のサンプルの数の全体数に対する割合(%)を意味する。
原料としてオゴノリ目(Gracilariales)オゴノリ科(Gracilariaceae)オゴノリ属(Gracilaria)ツルシラモ(Gracilaria chorda)(徳島県吉野川河口域産)を用い、これを0.15M塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物とした。次いで、この乾燥物100gに0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)700mlを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を4℃で6時間放置後、遠心分離し、上澄として粗抽出液を得た。
次いで、この粗抽出液に、最終濃度35質量%飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて1段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムを添加終了後、4℃で1時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度70質量%飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加終了後、4℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)で再溶解し、粗活性成分画分を得た。
次に、このようにして得られた粗活性成分画分を、0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)に対して透析後、遠心分離し不溶性の夾雑タンパク質を除去後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分子量20,000以上90,000以下の画分を分画し、精製品を得た。得られた精製品中の糖質、硫酸基、タンパク質分析の結果、同質量の精製品中で比較した場合、ヘキソース含有量が約6mg(フェノール−硫酸法による)、硫酸基含有量が約1.5mg(rhodizonate法による)、タンパク質含有量は0.2mg(Lowry法による)以下であった。化学分析の結果から、この精製品は、硫酸化多糖成分あるいは硫酸化グリコサミノグリカン成分あるいは硫酸化プロテオグリカン成分と推定された。
次いで、クシハダミドリイシを1群体ごとに個別のろ過滅菌海水の水槽に分けて収容した。ろ過滅菌海水としては、1μmのグラスフィルターで一次ろ過した海水を、0.22μmのミリポアフィルターで精密ろ過したものを用いた。放卵(バンドルの放出)開始後、1群体から放出された配偶子をそれぞれ回収し、ろ過滅菌海水中へ添加した。卵と精子をろ過滅菌海水を入れた容器に移し、他の群体から分別された卵又は精子で他家受精した。得られたクシハダミドリイシの幼生をろ過滅菌海水の入った容器内で25℃で保存した。
原料として高知県横浪半島沖太平洋水深5mないし10mの間で採取した褐藻類アミジグサ目(Dictyotales)アミジグサ科(Dictyotaceae)ハイオオギ属(Lobophora)ハイオオギ(Lobophora variegata)を用い、これをろ過滅菌海水で3回洗浄し、ろ紙上で軽く水分を除いた。このハイオオギ湿質量1gをとり、ろ過滅菌海水10mlを加えて乳鉢と乳棒を用いて4℃で粉砕し、褐藻類懸濁液を調製した。これを用いて実施例1と同様にしてクシハダミドリイシの幼生に対する生理活性を調べた。その結果を表1に示す。
実施例1の(ロ)の粗活性成分画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加による2段階の塩析による分別処理の代わりに、50質量%エチルアルコールによる分別処理[「フィトケミストリー(Phytochemistry)」,1988年,第27巻,p.2063−2067参照]を行った以外は、実施例1と同様にして粗画分を得た。この粗画分をゲルろ過クロマトグラフィーに通し、分子量20,000以上90,000以下の画分を集め、濃縮し、エチルアルコール分別画分を得た。エチルアルコール分別画分について実施例1と同様にイシサンゴ類(scleractinians)ミドリイシ科(Acroporidae)クシハダミドリイシ(Acropora hyacinthus)幼生に対する変態促進活性を測定した。その結果、エチルアルコール分別画分には、イシサンゴ幼生変態を促進する活性が検出されなかった。
標準分子量タンパク質としてアマシャムバイオサイエンス社より購入したチログロブリン(質量平均分子量669,000)、フェリチン(質量平均分子量440,000)、ウシ血清アルブミン(質量平均分子量67,000)、オボアルブミン(質量平均分子量43,000)、及びリボヌクレアーゼA(質量平均分子量13,700)を用い、ゲルろ過クロマトグラフィーの溶出体積と質量平均分子量との関係を求めた。
このようにして得た標準タンパク質とゲルろ過クロマトグラフィーにおける溶出体積については、チログロブリンの溶出体積が6.56ml、フェリチンの溶出体積が6.78ml、ウシ血清アルブミンの溶出体積が7.51ml、オボアルブミンの溶出体積が7.91ml、及びリボヌクレアーゼAの溶出体積が9.05mlであることが分った。
この結果より、質量平均分子量の常用対数Yとゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出体積Xとは次式の関係を有することが分かる。
Y=10.24118407−0.691372064X (I)
なお、この式の相関係数は−0.971であった。
この結果に基づき、ゲルろ過クロマトグラフィーでの溶出体積と各フラクションの糖含有量との関係のグラフを図1に示す。
また、(I)式より、分子量20,000以上90,000以下の成分の溶出体積範囲は7.647ml以上8.592ml以下となり、変態促進活性をもつ海藻由来硫酸化糖質成分のピークの頂点の溶出体積7.90mlは、その範囲に包含されることが分る。
原料としてオゴノリ目(Gracilariales)オゴノリ科(Gracilariaceae)オゴノリ属(Gracilaria)ツルシラモ(Gracilaria chorda)(徳島県吉野川河口域産)を用い、これを0.15M塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、天日乾燥して乾燥物とした。次いで、この乾燥物100gに0.15M塩化ナトリウム含有100mMリン酸緩衝液(pH6.9)700mlを加えてホモゲナイズしたのち、このホモゲナイズした液を4℃で6時間放置後、遠心分離し、上澄として粗抽出液を得た。
次いで、この粗抽出液に、最終濃度35質量%飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを加えて1段目の塩析を行った。硫酸アンモニウムを添加終了後、4℃で1時間放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して除去した。この操作で紫色色素などの夾雑物が沈殿画分として除去された。次に、遠心分離で得た上澄に、最終濃度70質量%飽和溶液になるように硫酸アンモニウムを添加終了後、4℃で一晩放置したのち、生成した沈殿を遠心分離して分別した。分別した沈殿画分を、25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)で再溶解し、粗活性成分画分を得た。
次に、このようにして得た粗活性成分画分を、25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)に対して透析したのち、遠心分離し、不溶性の夾雑物タンパク質を除去した再溶解活性成分画分を調製した。この再溶解活性成分画分120mlを充填剤(東ソー社製,商標名「DEAEトヨパール650S」)を詰めたゲルろ過用カラム(内径2.6cm、ゲル高さ21.0cm、ゲル体積約120ml)を用い、移動相中の塩化ナトリウムの濃度を0から0.21Mまで上昇させてイオン交換クロマトグラフィー処理を行った。この間、イオン交換クロマトグラフィーカラムから10mlずつ溶出画分を捕集し、10mmのセルで可視部540nmの吸光度を測定した。このようにして、可視部540nmの吸光度が0.01以上のフラクションNo174から272までを採取し、精製品を得た。図2にこのフラクションと吸光度との関係を示す。この精製品について吸収スペクトルを測定した結果、480〜570nmの間に可視部の吸収極大を有する成分であることが確認された。図3にフラクションNo220の吸収スペクトルを示す。溶出画分のフラクションNo220の吸収極大データは、480〜570nmまでの可視部領域では、497nm、541nm及び564nmであった。
すなわち、再溶解活性成分画分をイオン交換カラムに添加終了後、カラム体積の約10倍量の25mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)でカラムを洗浄したのち、緩衝液中の塩化ナトリウム濃度を0から0.21Mまで直線的に上昇させてカラムに吸着した赤色活性成分を採取した。この際の塩化ナトリウム濃度を0から0.21Mまで上昇させたときの移動相の合計体積はカラム体積の約13倍であった。
原料として、高知県横浪半島沖太平洋水深5mないし10mの間で採取した褐藻類アミジグサ目(Dictyotales)アミジグサ科(Dictyotaceae)ハイオオギ属(Lobophora)ハイオオギ(Lobophora variegata)を用い、これをろ過滅菌海水で3回洗浄し、ろ紙上で軽く水分を除いた。このハイオオギ湿質量1gをとり、ろ過滅菌海水10mlを加えて乳鉢と乳棒を用いて4℃で粉砕し、褐藻類懸濁液を調製した。これらの試料について実施例6と同様にして変態率を求め、その結果を表2に示す。
実施例6の(ロ)の粗活性成分画分の分別工程において、硫酸アンモニウム添加の2段階の塩析による分別処理の代わりに、50質量%エチルアルコールによる分別処理[「フィトケミストリー(Phytochemistry)」,1988年,第27巻,p.2063−2067参照]を行った以外は、実施例6と同様にして粗画分を得た。この粗画分について実施例6と同様にイシサンゴ類(scleractinians)ミドリイシ科(Acroporidae)クシハダミドリイシ(Acropora hyacinthus)幼生に対する変態促進活性を測定したところ、エチルアルコール分別画分には、イシサンゴ幼生変態を促進する活性が検出されなかった。
原料としてオゴノリ目(Gracilariales)オゴノリ科(Gracilariaceae)オゴノリ属(Gracilaria)ツルシラモ(Gracilaria chorda)(徳島県吉野川河口域産)の代わりに、紅藻綱大型海藻ウシケノリ目(Bangiales)ウシケノリ科(Bangiaceae)アマノリ属海藻(Porphyra sp.)を用いて、実施例6の(イ)、(ロ)工程を行い、粗赤色系色素画分を得た。
Claims (5)
- 紅藻植物門(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae)オゴノリ目(Gracilariales)、スギノリ目(Gigartinales)又はイギス目(Ceramiales)に属する直立着床可能な大型海藻の塩類水溶液抽出画分を有効成分としてなる無脊椎動物幼生の変態促進剤。
- 塩類水溶液抽出画分が分子量20,000以上90,000以下の画分である請求項1記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤。
- 塩類水溶液抽出画分が波長480〜570nmの領域に吸収極大を有する画分である請求項1記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤。
- 紅藻植物門(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae)オゴノリ目(Gracilariales)、スギノリ目(Gigartinales)又はイギス目(Ceramiales)に属する直立着床可能な大型海藻を塩類含有水溶液で抽出し、次いでこの抽出液に、先ず最終濃度30〜40質量%になるまで硫酸アンモニウムを加えて第1段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度70質量%程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第2段目の塩析を行い、沈殿として得られる粗活性成分画分を分取し、次いでゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量20,000以上90,000以下の画分を分画し、無脊椎動物幼生に対する変態促進活性を示す画分を捕集することを特徴とする請求項2記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤の製造方法。
- 紅藻植物門(Rhodophyta)紅藻綱(Rhodophyceae)オゴノリ目(Gracilariales)、スギノリ目(Gigartinales)又はイギス目(Ceramiales)に属する直立着床可能な大型海藻を塩類含有水溶液で抽出し、得られた抽出液に、先ず最終濃度30〜40質量%になるまで硫酸アンモニウムを加えて第1段目の塩析を行い、沈殿した夾雑物を除去したのち、さらにその抽出液に最終濃度70質量%程度になるまで硫酸アンモニウムを加えて第2段目の塩析を行い、沈殿として得られる粗活性成分画分を分取し、次いでこれからクロマトグラフィー処理して波長480〜570nmの領域に吸収極大を有する画分を分画し、無脊椎動物幼生に対する変態活性を示す画分を捕集することを特徴とする請求項3記載の無脊椎動物幼生の変態促進剤の製造方法。
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