【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はきのこの抽出物を含有することを特徴とする神経細胞賦活物質に関し、さらに詳しくは、抽出溶剤として、エタノール、アセトン、ヘキサン、水あるいは含水でｐＨを酸性またはアルカリ性に調整したエタノールを用いたきのこ抽出物を含有することを特徴とする神経細胞賦活物質に関する。また、本発明の神経細胞賦活物質は神経細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用を有する。さらに、本発明の神経細胞賦活物質を有効成分とする医薬組成物や食用組成物を調製することができる。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、アルツハイマー病等の脳疾患の予防法として、クルクミン、コール酸、シムノール用いる技術（例えば特許文献１）、アラキドン酸や中鎖脂肪酸を用いる技術（例えば特許文献２）、ヨモギやクマザサを用いる技術（例えば特許文献３）、テアニンを用いる技術（例えば特許文献４）、Ｌ−カルニチンまたはアルカノイルを用いる技術（例えば特許文献５）、ドコサヘキサエン酸を用いる技術（例えば特許文献６，７）、イソフラボノイドを用いる技術（例えば特許文献８，９）が知られている。
【０００３】
また、きのこを疾患の改善や予防に利用する技術としては、皮膚組成物（例えば特許文献１０）、抗うつ病食品（例えば特許文献１１）、抗炎症用食品（例えば特許文献１２）、排泄促進剤（特許文献１３）が知られている。
【０００４】
【特許文献１】
特開２００３−１１３１１７
【０００５】
【特許文献２】
特開２００３−４８８３１
【０００６】
【特許文献３】
特開平１０−２７６７１９
【０００７】
【特許文献４】
特開平７−１７３０５９
【０００８】
【特許文献５】
特表２００２−５２７３８９
【０００９】
【特許文献６】
特表２００２−５２７３８７
【００１０】
【特許文献７】
特表平８−５１１５３３
【００１１】
【特許文献８】
特表２００１−５１１１１７
【００１２】
【特許文献９】
特表２００１−５００４８０
【００１３】
【特許文献１０】
特開２００３−２８１３
【００１４】
【特許文献１１】
特開２００２−５８４５０
【００１５】
【特許文献１２】
特開平１１−３１８３８７
【００１６】
【特許文献１３】
特開平９−１６９６６２
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、上記のアルツハイマー病等の脳疾患の予防法は効果が不十分で、実用化が遅れいている。また、きのこを、神経細胞賦活物質として利用する先行技術は知られていない。
【００１８】
そこで、本発明は、ＮＧＦと同様な神経細胞賦活作用を有し、神経細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害に対して予防あるいは治癒する作用を持つ素材を提供する。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、きのこから特定の溶媒を用いて得た抽出物が神経細胞を活性化することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は次の［１］〜［７］である。
［１］ きのこの抽出物を含有することを特徴とする神経細胞賦活物質。
［２］きのこがマイタケである［１］記載の神経細胞賦活物質。
［３］抽出溶剤として、エタノール、アセトン、ヘキサン、水を用いた［１］、［２］記載の神経細胞賦活物質。
［４］抽出溶剤として、含水でｐＨを酸性またはアルカリ性に調整したエタノールを用いた［１］、［２］記載の神経細胞賦活物質。
［５］神経細胞賦活が神経細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用である［１］〜［４］に記載の神経細胞賦活物質
［６］［１］〜［４］に記載の神経細胞賦活物質を有効成分として配合してなる医薬用組成物。
［７］［１］〜［４］に記載の神経細胞賦活物質を有効成分として配合してなる食用組成物。
【００２０】
すなわち、本発明は、きのこの抽出物を含有することを特徴とする神経細胞賦活物質である。
【００２１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について詳細に説明する。本発明で用いられるきのことは種種雑多な菌類の作る大型子実体および菌糸体である。属としては、キツネタケ属Ｌａｃｃａｒｉａ ｓｐｐ． 、テングタケ属 Ａｍａｎｉｔａｓｐｐ． 、フウセンタケ属 Ｃｏｒｔｉｎａｒｉｕｓ ｓｐｐ． 、チチタケ属・ベニタケ属Ｌａｃｔａｒｉｕｓ ｓｐｐ．， Ｒｕｓｓｕｌａ ｓｐｐ． 、ヌメリイグチ属・ショウロ属 Ｓｕｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｒｈｉｚｏｐｏｇｏｎ ｓｐｐ． 、セイヨウショウロタケ属 Ｔｕｂｅｒ ｓｐｐ． であり、このうち、マイタケ、松茸、シメジ、ヒラタケ、エノキタケ、なめこ、エリンギ、ツクリタケ等の食用のきのこのうちの１種類または複数を組み合わせて使用する。これらのうち、効果の面でマイタケが最も優れている。使用できる部位は、子実体、菌糸体等食用になるすべての部分である。また、栽培または天然のきのこを適宜組み合わせて用いることができる。
【００２２】
本発明において、神経細胞賦活物質を調製するために、きのこに溶剤を加えて、有効成分を抽出する。このとき使用する有機溶媒としては、アルコール類、クロロフォルム、アセトン、アセトニトリル、ヘキサン、酢酸エチルなどが挙げられる。なかでも食品製造に使用できるグレードのエタノール、ヘキサン、アセトンが好ましく、より好ましくはエタノールを抽出溶媒として用いる。エタノールやアセトンは水分を含んでいても使用することができ、またこれらは互いに溶け合う組成の範囲内であれば、２種類以上を混合して使用することもできる。エタノールやアセトンは水を加えるとともに、ｐＨを酸性またはアルカリ性に調整して抽出効率を上げることができる。本発明において、抽出原料と溶媒の比率は原料１００重量部に対して溶媒を１００から２０００重量部、好ましくは２００から７００重量部である。抽出原料と溶媒の比率が原料１００重量部に対して溶媒が１００重量部未満では、原料全体に溶媒が行きわたらないため、効果的な抽出が行えない。また、抽出原料と溶媒の比率が原料１００重量部に対して溶媒が２０００重量部を越えても抽出物の収量が増えず、溶媒の消費が増える分コストアップ要因となる。
【００２３】
本発明では、きのこ抽出物中の不純物を除去する目的で、弱アルカリ処理、クロマト処理を行うことができる。また、得られた抽出物は、そのまま、あるいは凍結乾燥法、スプレードライなどの方法を用いて、固体化、粉末化して用いることが出来る。
【００２４】
本発明の神経細胞賦活物質は、上記のきのこ抽出物を０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。きのこ抽出物の含有量が０．０１％未満では神経細胞賦活活性が認められない。また。きのこ抽出物含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。
【００２５】
次に、本発明の神経細胞賦活物質を配合してなる医薬用組成物および食用組成物について説明する。本発明の神経細胞賦活物質を配合してなる製剤は、これをそのまま、あるいは慣用の医薬製剤担体とともに医薬用組成物となし、動物およびヒトに投与することができる。医薬用組成物の剤形としては特に制限されるものではなく、必要に応じて適宜に選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤があげられる。
【００２６】
本発明において錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤としての経口剤は、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を用いて常法に従って製造される。これらの製剤中の本発明の神経細胞賦活物質の配合量は０．０１から５０％、好ましくは０．１から３０％、より好ましくは１から１０％含有する。神経細胞賦活物質の含有量が０．０１％未満では神経細胞賦活活性が認められない。また。神経細胞賦活物質の含有量が５０％より多くしても、活性の顕著な増加は認められない。この種の製剤には本発明の神経細胞賦活物質の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を適宜に使用することができる。
【００２７】
上記の神経細胞賦活物質を含有する医薬用組成物は懸濁液、エマルション剤、シロップ剤、エリキシル剤としても投与することができ、これらの各種剤形には、矯味矯臭剤、着色剤を含有させてもよい。
【００２８】
本発明の神経細胞賦活物質は食用組成物としても利用可能である。すなわち、前述のようにして得られるきのこの抽出物を有効成分としてなる脳神経細胞賦活剤は、これをそのまま液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工して健康食品や栄養補助食品等として利用できる。
【００２９】
これらの食品類あるいは食用組成物における本発明の神経細胞賦活剤の配合量は、当該食品や組成物の種類や状態等により一律に規定しがたいが、約０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％である。配合量が０．０１重量％未満では経口摂取による所望の効果が小さく、５０重量％を超えると食品の種類によっては風味を損なったり当該食品を調製できなくなる場合がある。なお、本発明の神経細胞賦活剤は、原料が食品であり、これをそのまま食用に供してもさしつかえない。
【００３０】
本発明の医薬用組成物および食用組成物は、脳神経細胞の障害を予防あるいは治癒をねらいとして利用するものであれば、それを使用する上で何ら制限を受けることなく適用される。
【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
（１）製造方法（ａ）粗抽出物の調製例
マイタケ子実体を市中で購入し、温風乾燥機で６０℃で４８時間乾燥し、乾燥マイタケとした。乾燥マイタケ１ｋｇを攪拌槽に仕込み、そこにエタノール２Ｌと水０．４Ｌを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを１１に調整し、常温で５時間撹拌した。その後、濾過により抽出液と残渣を分離した。抽出液をエバポレーターにより濃縮し、茶褐色の粗抽出物２５０ｇを得た。
【００３３】
（ｂ）神経細胞賦活物質の調製例
上記の粗抽出物１０ｇを、分取用高速液体クロマトグラフィー（ギルソン社製、モデル３０３）で分画した。カラムとしてデベロシル６０−１０ φ５０ｍｍ×５００ｍｍ（野村化学製）を用い、検出波長は２１０ｎｍ、溶媒はクロロホルム、溶媒流量を５０ｍＬ／分とした。分画に際し、５分ごとに溶離液を分取し、分取物に含まれる溶媒をロータリーエバポレーターで乾燥して、乾固した分画物を得た。画分各物の神経細胞活性化効果を上記の方法で測定し、最も活性が高かった分画物を神経細胞賦活物質とした。
【００３４】
【実施例１】
馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）にＰＣ−１２細胞（岐阜薬科大学から分与）を５万個／ｍＬ濃度で培養し、２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換した。さらに２４時間後に本発明の神経細胞賦活物質を１００または５００μｇ／ｍＬ添加し、４日後の神経突起の伸長を倒立顕微鏡下で判定した。陽性対象として、ＮＧＦβ（シグマ製）を２５ｎｇ／ｍＬ添加し同じ操作を行った。結果を表１に示した。同表中の記号は、培養４日後の神経突起形成状態について−：なし、＋：あり、＋＋および＋＋＋：顕著にありを意味する。
【００３５】
【実施例２】
既往の方法で、１８日齢のラット胎児から大脳ニューロンを採取し、馬血清１０容量％、牛胎児血清５容量％を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）で２４時間培養した。２４時間後に無血清のＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間後に本発明の神経細胞賦活物質を１００または５００μｇ／ｍＬ添加した。３０秒後に大脳ニューロンの細胞質のタンパク質をリシスバッファーで採取した。採取したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をナイロンメンブレンにブロットした。ブロッキング後に抗ＥＲＫラビットＩｇＧ抗体で反応後、アビジンービオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックスで処理した。ペルオキシダーゼ活性をジアミノベンジディン−Ｈ２Ｏ２を用いてＥＲＫを可視化することにより、ＭＡＰＫのリン酸を測定した。陽性対象として、ＮＧＦβ（シグマ製）を２５ｎｇ／ｍＬ添加し同じ操作を行った。結果を表２に示した。同表中の記号は、ＭＡＰＫのリン酸化について−：なし、＋：あり、＋＋および＋＋＋：顕著にありを意味する。
【００３６】
【比較例１】
ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）に関して実施例１の方法で神経活性化作用を測定した。結果を表１に示した。
【００３７】
【比較例２】
ヨモギ抽出物（一丸ファルコス（株）製）、テアニン（太陽化学（株）製）、ドコサヘキサエン酸（日本油脂（株）製）に関して実施例２の方法で神経活性化作用を測定した。結果を表２に示した。
【００３８】
【表１】
【００３９】
【表２】
【００４０】
表１、２に示されるように、本発明の神経細胞賦活物質は、従来神経賦活作用があると言われていた、ヨモギ抽出物、テアニン、ドコサヘキサエン酸よりも格段に優れた神経細胞賦活作用が認められる。また、陽性対象としたＮＧＦと同等の神経細胞賦活作用を有していた。
【００４１】
【発明の効果】
本発明によれば、きのこの抽出物を含有することを特徴とする、神経細胞の分化誘導作用、神経細胞の神経突起伸長作用、脳神経細胞の外傷性障害、代謝性要因による障害、β−アミロイド蛋白質による障害または脳虚血性障害を予防あるいは治癒する作用のある神経細胞賦活物質を提供できる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a nerve cell activator characterized in that it contains an extract of mushrooms, and more specifically, ethanol, acetone, hexane, water, or ethanol whose pH is adjusted to acidic or alkaline with water is used as an extraction solvent. The present invention relates to a nerve cell activator characterized by containing a mushroom extract. In addition, the neuronal cell activator of the present invention has a neuronal differentiation inducing action, a neuronal neurite outgrowth action, a traumatic disorder of brain neurons, a disorder due to metabolic factors, a disorder due to β-amyloid protein or a cerebral ischemic disorder. Has the effect of preventing or healing. Furthermore, a pharmaceutical composition or an edible composition containing the nerve cell activator of the present invention as an active ingredient can be prepared.
[0002]
[Prior art]
Until now, as a method for preventing brain diseases such as Alzheimer's disease, a technique using curcumin, cholic acid, or simnole (for example, Patent Document 1), a technique using arachidonic acid or a medium chain fatty acid (for example, Patent Document 2), mugwort or Kumazasa have been used. Technology (for example, Patent Document 3), technology using theanine (for example, Patent Document 4), technology using L-carnitine or alkanoyl (for example, Patent Document 5), technology using docosahexaenoic acid (for example, Patent Documents 6 and 7), isoflavonoid Techniques using this (for example, Patent Documents 8 and 9) are known.
[0003]
In addition, as a technique for using mushrooms for improvement or prevention of diseases, skin compositions (for example, Patent Document 10), antidepressant foods (for example, Patent Document 11), anti-inflammatory foods (for example, Patent Document 12), excretion promotion An agent (Patent Document 13) is known.
[0004]
[Patent Document 1]
JP 2003-113117 A
[0005]
[Patent Document 2]
JP 2003-48831 A
[0006]
[Patent Document 3]
JP-A-10-276719
[0007]
[Patent Document 4]
JP 7-173059 A
[0008]
[Patent Document 5]
Special table 2002-527389
[0009]
[Patent Document 6]
Special table 2002-527387
[0010]
[Patent Document 7]
Special table flat 8-511533
[0011]
[Patent Document 8]
Special table 2001-511117
[0012]
[Patent Document 9]
Special table 2001-500480
[0013]
[Patent Document 10]
JP2003-2813A
[0014]
[Patent Document 11]
JP 2002-58450 A
[0015]
[Patent Document 12]
JP-A-11-318387
[0016]
[Patent Document 13]
JP-A-9-16962
[0017]
[Problems to be solved by the invention]
However, the above-mentioned methods for preventing brain diseases such as Alzheimer's disease are not effective enough and their practical application has been delayed. Moreover, the prior art which utilizes a mushroom as a nerve cell activator is not known.
[0018]
Therefore, the present invention has a nerve cell activation action similar to NGF, a nerve cell differentiation inducing action, a nerve cell neurite outgrowth action, a brain nerve cell traumatic disorder, a disorder due to metabolic factors, a β-amyloid protein A material having an action to prevent or cure the damage caused by cerebral ischemia or cerebral ischemic damage is provided.
[0019]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that an extract obtained from a mushroom using a specific solvent activates nerve cells, and has completed the present invention. That is, the present invention includes the following [1] to [7].
[1] A nerve cell activator comprising a mushroom extract.
[2] The nerve cell activator according to [1], wherein the mushroom is maitake.
[3] The nerve cell activator according to [1] or [2], wherein ethanol, acetone, hexane, or water is used as an extraction solvent.
[4] The nerve cell activator according to [1] or [2], wherein ethanol whose pH is adjusted to acidic or alkaline with water is used as an extraction solvent.
[5] Activation of nerve cells prevents or cures nerve cell differentiation-inducing action, nerve cell neurite outgrowth action, cranial nerve cell traumatic disorder, disorder due to metabolic factors, β-amyloid protein disorder or cerebral ischemic disorder A pharmaceutical composition comprising the nerve cell activator according to [1] to [4], wherein the nerve cell activator according to [6] [1] to [4] is blended as an active ingredient.
[7] An edible composition comprising the nerve cell activator according to [1] to [4] as an active ingredient.
[0020]
That is, the present invention is a nerve cell activator characterized by containing an extract of mushrooms.
[0021]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The mushrooms used in the present invention are large fruit bodies and mycelia produced by various fungi. Examples of the genus include the genus Lacaria spp. , Amanitasppp. , Fucentae Cortinarius spp. , Lentinus genus Lactarius spp. , Russula spp. , Genus Nyuriguchi and Shiro. Suillus spp. Rhizopogon spp. , Amanita Tub spp. Of these, one or more of edible mushrooms such as maitake, matsutake mushrooms, shimeji, oyster mushrooms, enokitake mushrooms, nameko, eringi and tsutake mushrooms are used in combination. Of these, Maitake is the most effective. The parts that can be used are all parts that are edible, such as fruiting bodies and mycelium. Moreover, cultivation or a natural mushroom can be used in combination as appropriate.
[0022]
In the present invention, in order to prepare a nerve cell activator, a solvent is added to mushrooms to extract an active ingredient. Examples of the organic solvent used at this time include alcohols, chloroform, acetone, acetonitrile, hexane, and ethyl acetate. Of these, grades of ethanol, hexane, and acetone that can be used for food production are preferable, and ethanol is more preferably used as an extraction solvent. Ethanol and acetone can be used even if they contain water, and two or more of them can be used in combination as long as they are within the range of compositions that are soluble in each other. Ethanol and acetone can increase the extraction efficiency by adding water and adjusting the pH to acidic or alkaline. In the present invention, the ratio of the extraction raw material to the solvent is 100 to 2000 parts by weight, preferably 200 to 700 parts by weight of the solvent with respect to 100 parts by weight of the raw material. When the ratio of the extraction raw material to the solvent is less than 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the raw material, the solvent does not reach the entire raw material, so that effective extraction cannot be performed. Further, even if the ratio of the extraction raw material to the solvent exceeds 2000 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the raw material, the yield of the extract does not increase and the consumption of the solvent increases, resulting in an increase in cost.
[0023]
In the present invention, weak alkali treatment and chromatographic treatment can be performed for the purpose of removing impurities in the mushroom extract. In addition, the obtained extract can be used as it is or after solidification or powderization using a method such as freeze-drying or spray-drying.
[0024]
The nerve cell activator of the present invention contains 0.01 to 50%, preferably 0.1 to 30%, more preferably 1 to 10% of the above mushroom extract. When the content of the mushroom extract is less than 0.01%, nerve cell activation activity is not observed. Also. Even if the mushroom extract content exceeds 50%, no significant increase in activity is observed.
[0025]
Next, a pharmaceutical composition and an edible composition comprising the nerve cell activator of the present invention will be described. The preparation comprising the nerve cell activator of the present invention can be administered to animals and humans as it is or as a pharmaceutical composition together with a conventional pharmaceutical preparation carrier. The dosage form of the pharmaceutical composition is not particularly limited, and may be appropriately selected according to need. For example, tablets, capsules, granules, fine granules, powders and other oral preparations, injections And parenterals such as suppositories and suppositories.
[0026]
In the present invention, oral preparations such as tablets, capsules, granules, fine granules, and powders are produced according to conventional methods using, for example, starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts, and the like. . The compounding amount of the nerve cell activator of the present invention in these preparations is 0.01 to 50%, preferably 0.1 to 30%, more preferably 1 to 10%. When the content of the nerve cell activation substance is less than 0.01%, nerve cell activation activity is not observed. Also. Even when the content of the nerve cell activator is more than 50%, no significant increase in activity is observed. In addition to the nerve cell activator of the present invention, a binder, a disintegrant, a surfactant, a lubricant, a fluidity promoter, a corrigent, a colorant, a fragrance and the like are appropriately used for this type of preparation. Can do.
[0027]
The above-mentioned pharmaceutical composition containing the nerve cell activator can be administered as a suspension, emulsion, syrup, or elixir, and these various dosage forms contain a flavoring agent and a coloring agent. You may let them.
[0028]
The nerve cell activator of the present invention can also be used as an edible composition. That is, the brain nerve cell activator comprising the mushroom extract obtained as described above as an active ingredient is used as it is in a liquid, gel or solid food such as juice, soft drink, tea, soup, soy milk, salad oil. , Dressing, yogurt, jelly, pudding, sprinkle, infant formula, cake mix, powdered or liquid dairy products, bread, cookies, etc., and if necessary, excipients such as dextrin, lactose, starch It can be processed into pellets, tablets, granules, etc. together with fragrances, pigments, etc., or coated with gelatin and formed into capsules for use as health foods, dietary supplements and the like.
[0029]
The compounding amount of the nerve cell activator of the present invention in these foods or edible compositions is difficult to define uniformly depending on the type or state of the food or composition, but is about 0.01 to 50% by weight, more Preferably it is 0.1 to 30 weight%. If the blending amount is less than 0.01% by weight, the desired effect by oral ingestion is small. In addition, the nerve cell activator of the present invention is a food material, and it can be used for food as it is.
[0030]
The pharmaceutical composition and edible composition of the present invention can be applied without any limitation on the use of the pharmaceutical composition and the edible composition as long as they are used for the purpose of preventing or healing brain nerve cell damage.
[0031]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely using an Example, this invention is not limited to this.
[0032]
(1) Production method (a) Preparation of crude extract Maitake fruit bodies were purchased in the city and dried at 60 ° C. for 48 hours in a hot air dryer to obtain dried maitake. 1 kg of dried maitake was added to a stirring tank, 2 L of ethanol and 0.4 L of water were added thereto, the pH was adjusted to 11 with sodium hydroxide, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. Thereafter, the extract and the residue were separated by filtration. The extract was concentrated by an evaporator to obtain 250 g of a brownish brown crude extract.
[0033]
(B) Preparation example of nerve cell activator 10 g of the above crude extract was fractionated by preparative high performance liquid chromatography (Gilson, model 303). Develosil 60-10 φ50 mm × 500 mm (manufactured by Nomura Chemical) was used as the column, the detection wavelength was 210 nm, the solvent was chloroform, and the solvent flow rate was 50 mL / min. In fractionation, the eluent was collected every 5 minutes, and the solvent contained in the fraction was dried by a rotary evaporator to obtain a solid fraction. The nerve cell activation effect of each fraction was measured by the above method, and the fraction with the highest activity was used as the nerve cell activator.
[0034]
[Example 1]
PC-12 cells (distributed from Gifu Pharmaceutical University) are cultured at a concentration of 50,000 cells / mL in DMEM medium (Nissui Pharmaceutical) containing 10% horse serum and 5% fetal bovine serum, and serum free 24 hours later The DMEM medium was replaced. Further, after 24 hours, 100 or 500 μg / mL of the nerve cell activator of the present invention was added, and neurite outgrowth after 4 days was determined under an inverted microscope. As a positive target, 25 ng / mL of NGFβ (manufactured by Sigma) was added and the same operation was performed. The results are shown in Table 1. The symbols in the table mean-: none, +: yes, ++ and +++: markedly present for the neurite formation state after 4 days of culture.
[0035]
[Example 2]
Cerebral neurons were collected from 18-day-old rat fetuses by a conventional method, and cultured for 24 hours in DMEM medium (Nissui Pharmaceutical) containing 10% horse serum and 5% fetal bovine serum. After 24 hours, the medium was replaced with serum-free DMEM medium, and after 24 hours, 100 or 500 μg / mL of the nerve cell activator of the present invention was added. After 30 seconds, cytoplasmic proteins of cerebral neurons were collected with a lysis buffer. The collected protein was separated by SDS-PAGE, and the protein was blotted onto a nylon membrane. After blocking, the reaction with an anti-ERK rabbit IgG antibody was followed by treatment with an avidin-biotinylated horseradish peroxidase complex. MAPK phosphate was measured by visualizing ERK with diaminobenzidine-H2O2 for peroxidase activity. As a positive target, 25 ng / mL of NGFβ (manufactured by Sigma) was added and the same operation was performed. The results are shown in Table 2. The symbols in the table mean-: none, +: yes, ++ and ++: notably about MAPK phosphorylation.
[0036]
[Comparative Example 1]
The nerve activation action was measured by the method of Example 1 for mugwort extract (Ichimaru Falcos Co., Ltd.), theanine (Taiyo Kagaku Co., Ltd.), and docosahexaenoic acid (Nippon Yushi Co., Ltd.). The results are shown in Table 1.
[0037]
[Comparative Example 2]
The nerve activation action was measured by the method of Example 2 for mugwort extract (Ichimaru Falcos Co., Ltd.), theanine (Taiyo Kagaku Co., Ltd.), and docosahexaenoic acid (Nippon Yushi Co., Ltd.). The results are shown in Table 2.
[0038]
[Table 1]
[Table 2]
As shown in Tables 1 and 2, the nerve cell activator of the present invention has a nerve cell activation action that is far superior to mugwort extract, theanine, and docosahexaenoic acid, which have been conventionally said to have a nerve activation action. Is recognized. Moreover, it had the nerve cell activation effect equivalent to NGF made into the positive object.
[0041]
【The invention's effect】
According to the present invention, a neuronal differentiation inducing action, a neuronal neurite outgrowth action, a neuronal traumatic disorder, a disorder due to metabolic factors, β-amyloid, characterized by containing an extract of mushrooms It is possible to provide a nerve cell activator having an action of preventing or curing a protein-induced disorder or cerebral ischemic disorder.