JP2005000052A - Ａｄｒｐ遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチド及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＲＮＡ干渉法を用いてADRP(Adipocyte differentiation-related protein)の発現を阻害するために最適化されたオリゴヌクレオチドを提供する。これにより、従来の脂質エステルの合成と加水分解の過程によらずに、細胞内脂質滴の新規形成を阻害し、既存の細胞内脂質滴を減少又は消滅させることができる。
【解決手段】ヒトＡＤＲＰ遺伝子又はマウスＡＤＲＰ遺伝子の塩基配列の特定の領域において連続する２１〜２３塩基の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡである。
【選択図】図２
【解決手段】ヒトＡＤＲＰ遺伝子又はマウスＡＤＲＰ遺伝子の塩基配列の特定の領域において連続する２１〜２３塩基の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡである。
【選択図】図２
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞内脂質滴の新規形成を阻害し、既存の細胞内脂質滴を減少又ア消滅させるための手段として、Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （以下「ＡＤＲＰ」という。）の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ）により阻害する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症、脂肪肝、肥満症などの疾病は、細胞内脂質滴の過剰形成が原因となっていることが知られている（非特許文献１）。
この脂質滴の内容物である脂質エステルの合成酵素阻害剤については、動物個体に投与した場合に種々の副作用が生じることが明らかになり、実用化の目処が立っていない（非特許文献２）。
一方、脂質エステル加水分解酵素を過剰発現させた場合には、脂質エステル合成が高まり、予期された効果が得られないという実験結果が報告されている（非特許文献３）。
また、ＡＤＲＰは、脂質エステルを貯蔵する機能を有し、脂質滴の構造形成及び維持に必要な分子であることが知られており（非特許文献４）、その発現が脂質滴の形成を促すことも知られている（非特許文献５）。そのため、ヒトＡＤＲＰをコードするオリゴヌクレオチドに対するアンチセンス分子を用いて、ヒトＡＤＲＰの発現を抑制し、その発現が関係する肥満症などの治療を行う方法が開示されている（特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｄ． Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４０： ３２５−４３８， ２００１
【非特許文献２】
Ｋ． Ｋ． Ｂｕｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７６： ４０３６９−４０３７２， ２００１
【非特許文献３】
Ｊ．−Ｌ． Ｅｓｃａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４０： ３９７−４０４， １９９９
【非特許文献４】
Ｄ． Ｌ． Ｂｒａｓａｅｍｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３８： ２２４９−２２６３， １９９７
【非特許文献５】
Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ２８３： Ｅ７７５−Ｅ７８３， ２００２．
【特許文献１】
特表２００１−５０６８５０ （ＷＯ９８／２６０６７）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＡＤＲＰの発現を効果的に阻害する手段を提供する。これにより、従来の脂質エステルの合成と加水分解の過程によらずに、細胞内脂質滴の新規形成を阻害し、既存の細胞内脂質滴を減少又は消滅させることができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＲＮＡｉを用いてＡＤＲＰの発現を阻害するために最適化されたオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３４７〜３９９又は１０９４〜１２７３において連続する２１個の塩基配列を含む２１〜２３個の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡである。
【０００６】
この連続する２１個の塩基配列として、好ましくは配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３４７〜３６７、３７９〜３９９、１０９４〜１１１４、又は１２５３〜１２７３の塩基配列であり、最も好ましくは３７９〜３９９の塩基配列である。
また本発明は、上記のいずれかのオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡを、ヒト又はマウスの細胞へ導入することから成る、該細胞におけるＡＤＲＰ遺伝子の発現を抑制する方法である。
更に本発明は、上記のいずれかのオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡを、ヒト又はマウスの生体細胞へ導入することから成る、動脈硬化症、脂肪肝、肥満症などの脂質滴が過剰に形成され、ＡＤＲＰ遺伝子の過剰発現が見られる疾病の治療又は予防方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ＡＤＲＰ（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、脂肪分化関連タンパク質）は、脂肪細胞の分化時にその発現が認められ、脂質滴に特異的に局在するタンパク質であり（非特許文献４）、その発現が脂質滴の形成を促す（非特許文献５）。
本発明はＲＮＡ干渉法により細胞内におけるＡＤＲＰの発現を抑制しようとするものである。ＲＮＡ干渉法は標的ＲＮＡに特異的な２１〜２３塩基のＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ）を細胞、特に細胞質に導入すると、このＲＮＡ断片がｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられている（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２； ３４７：１３６４）。この標的ＲＮＡは標的遺伝子の転写により生ずるｍＲＮＡである。
このＲＮＡ断片としては、標的ＲＮＡのセンス又はアンチセンスのものでもよいが、これらはＲＮａｓｅで容易に分解され，また効果が劣ると考えられるため、これらから成る２本鎖ＲＮＡが好ましく用いられる。この２本鎖ＲＮＡは通常センスとアンチセンスの２本を別々に合成し，それをハイブリダイズさせて２本鎖にして用いられる。
【０００８】
このＲＮＡ断片の長さは２１〜２３塩基が有効と考えられているが、一般には２１塩基のものが好ましく使われ、後述の実施例においても２１塩基のもので有効に機能している。但し、なぜこの範囲のものが有効であるかはまだ十分には解明されていない。
本発明においては対象とする細胞はヒトとマウスである。
これらのＡＤＲＰ遺伝子の特定の塩基配列に「相当する」オリゴリボヌクレオチドとは、この遺伝子が転写されて生成するｍＲＮＡの、ＡＤＲＰ遺伝子の特定の塩基配列に相当する部分に相補的なＲＮＡという意味であり、具体的にはこのＡＤＲＰ遺伝子の特定のＤＮＡ配列のＴをＵに置き換えたもという意味である。
ＲＮＡ断片を細胞に導入する方法については、特に制限はなく、リポソーム等に基づく市販のトランスフェクション試薬を用いるのが簡便である。この方法以外にも、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション法などの方法を用いてもよい。最近、マウスの尾静脈から単にｓｉＲＮＡだけを注入することによって、肝臓での遺伝子発現が低下したという報告がある（Ｅ． Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ９： ３４７−３５１， ２００３）。
【０００９】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例においては以下の方法を用いた。
１．細胞の調整
ヒトＨｅｐＧ２、マウスＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３、及びマウスＪ７７４．１を用いた。ＨｅｐＧ２は通常の培養条件で脂質滴を有するため、既存の脂質滴に対する効果を調べる目的で用いた。またヒト肝臓由来の細胞であるＨｅｐＧ２は、本発明の応用の対象として想定される脂肪肝に対する効果を培養細胞レベルで確かめるモデル系としても重要である。Ｂａｌｂ／ｃは培養条件により脂質滴をほとんど消滅させることができるため、脂質滴の新規形成を調べるために用いた。Ｊ７７４．１はマクロファージ由来であり、動脈硬化の初期に動脈壁で生ずる泡沫細胞形成のモデルとして用いた。
ＨｅｐＧ２、 Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥ）に１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加した培地で培養した。Ｊ７７４．１はＲＰＭＩ１６４０に１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加した培地で培養した。
【００１０】
２．ｓｉＲＮＡ （ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ） の作製
ヒトＡＤＲＰ（以下「ｈＡＤＲＰ」という。配列番号１）及びマウスＡＤＲＰ（以下「ｍＡＤＲＰ」という。配列番号２）の配列にあわせて設計したカスタムオリゴヌクレオチド（インビトロジェン社製）をテンプレートとし、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）のマニュアルに従ってｓｉＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）を合成した。ｓｉＲＮＡの濃度は吸光度で測定して １０μＭになるように調整し、アクリルアミドゲルに泳動して長さのチェックを行った。
ｈＡＤＲＰについて作製したｓｉＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の対象配列は以下のとおりである。（なお、カッコ内はそれぞれｈＡＤＲＰ（配列番号１）又はｍＡＤＲＰ（配列番号２）の配列中の対応する位置を示す。）
【００１１】
ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０） ＡＡＧＵＣＵＧＵＧＵＧＵＧＡＧＡＵＧＧＣＡ （配列番号３）
ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１） ＡＡＧＣＵＡＧＡＧＣＣＧＣＡＡＡＵＵＧＣＡ （配列番号４）
ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７） ＡＡＧＡＵＧＣＵＧＵＧＡＣＧＡＣＵＡＣＵＧ （配列番号５）
ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ＡＡＧＧＡＵＵＣＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧ （配列番号６）
ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１） ＡＡＧＡＣＣＡＡＧＵＣＵＧＵＧＧＵＣＡＧＵ （配列番号７）
ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７） ＡＡＧＵＣＵＧＵＧＧＵＣＡＧＵＧＧＣＡＧＣ （配列番号８）
ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７） ＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣ （配列番号９）
ｈＡＤＲＰ（７３５−７５５） ＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＵＵＵＣＵＣＡ （配列番号１０）
ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８） ＡＡＧＧＵＧＵＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＡＵＣＣ （配列番号１１）
ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９） ＡＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＵＧＧ （配列番号１２）
ｈＡＤＲＰ（１０９１−１１１１） ＡＡＧＡＡＧＵＧＵＣＵＧＡＣＡＧＣＣＵＣＣ （配列番号１３）
ｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４） ＡＡＧＵＧＵＣＵＧＡＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＡ （配列番号１４）
ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３） ＡＡＧＧＵＧＣＡＧＡＧＡＵＧＧＡＣＡＡＧＡ （配列番号１５）
ｍＡＤＲＰについて作製したｓｉＲＮＡの対象配列は以下のとおりである。
ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ＡＡＧＧＡＵＵＣＵＧＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡ （配列番号１６）
この配列について、ヌクレオチド配列をランダムに並べ替え、データベースに登録された他の遺伝子の配列に一致しないものを用い、対照実験用のｓｉＲＮＡを作製した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ＡＣＣＡＧＣＧＡＵＵＵＣＵＡＡＧＡＧＡＣＧ （配列番号１７）
【００１２】
３．細胞へのｓｉＲＮＡの導入
（ｉ） ＨｅｐＧ２及びＢａｌｂ／ｃについて
導入前日に抗生物質抜きの培地に継代した。導入はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） にて行った。３５ ｍｍ ｄｉｓｈで２ ｍｌの培地中に培養した細胞の場合、２４ μｌ ｓｉＲＮＡ （１０μＭ濃度）と４ μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００をそれぞれ２００ μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） に希釈し、両者を混合したのち培地に添加した。なおｓｉＲＮＡの最適量については、予備実験にて比較を行い、上記の量で最大の効果が得られることを確認した。
（ｉｉ） Ｊ７７４．１について
トリプシン処理でディッシュから剥離し、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０に３ ｘ １０６／ ｍｌの密度になるように浮遊させた。０．４ ｃｍ幅のキュベットに細胞浮遊液 ４００μｌ、ｓｉＲＮＡ ５０μｌを入れ、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ） で９６０μＦ、 ０．２ ｋＶの条件でエレクトロポレーションを行った。室温で１分おいたのち、血清を含む培地を入れたディッシュに播種した。
【００１３】
４．脂質滴形成・消滅を見るための実験スケジュール
（ｉ） ＨｅｐＧ２は通常の培養条件で多数の脂質滴を持つ。ｓｉＲＮＡを導入して２−３日後に検索し、対照ｓｉＲＮＡを導入した細胞との比較を行った。
（ｉｉ） Ｂａｌｂ／ｃは通常の培養条件では小さい脂質滴があるが、１０％ ＦＣＳの替わりに２−５％リポ蛋白質欠如血清（ＬＰＤＳ）を添加した培地で３−４日間培養することにより、脂質滴はほぼ消滅する。これにｓｉＲＮＡを導入し、その２日後に０．４ ｍＭ オレイン酸（ウシ血清アルブミンとの複合体）又は０．５ ｍＭ コレステロール（メチルβシクロデキストリンとの複合体）を添加し、それぞれトリグリセリド又はコレステロールエステルの合成を誘導し、１−２日後に検索した。
（ｉｉｉ） Ｊ７７４．１はｓｉＲＮＡを導入したのち、１０μｇ／ｍｌ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ （ＬＰＳ） と１日培養して活性化させ、さらに１日後に１００μｇ／ｍｌ アセチル化ＬＤＬを添加して泡沫細胞化を誘導した。１−２日後に対照群との差を検索した。
【００１４】
５．細胞標識と蛍光顕微鏡観察
カバーガラス上に培養した細胞を緩衝３％ホルムアルデヒド溶液又は３％ホルムアルデヒドと０．１％ グルタルアルデヒド混合溶液で固定した。脂質滴をオイルレッドＯで染色し、蛍光顕微鏡観察した。Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色では細胞全体が弱く染色され、脂質滴は特に強く光る丸い構造として認められた。結果はＡｘｉｏｐｈｏｔ２顕微鏡 （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察し、ＣＣＤカメラ（ＡｘｉｏＣａｍ； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で記録した。
【００１５】
６．ウエスタンブロッティング
細胞をＳＤＳを含むサンプルバッファーに溶解し、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）で蛋白質量を定量した。等量の蛋白質をアクリルアミドゲルに泳動し、ニトロセルロース膜に転写したのち、マウス抗ＡＤＲＰ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ社、クローンＡＰ１２５）、ついでパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体と浸漬し、化学発光法で反応を検出した。
【００１６】
７．脂質定量
細胞の全脂質をヘキサン・イソプロパノール（３：２）混合液にて抽出し、窒素気流で乾燥させたのち、適量のイソプロパノールに再溶解した。トリグリセリドはネスコートＴＧキット（アズウェル）を用いて定量した。フリーコレステロールと全コレステロールはそれぞれコレステロールとオレイン酸コレステロールを標準試料として用い、Ｈｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｂｏｙｅｔｔの方法（Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５１４， １９７８）により定量した。全コレステロールとフリーコレステロールの差をコレステロールエステル量とした。
【００１７】
実施例１
ＨｅｐＧ２にｓｉＲＮＡ（（１） Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ）， （２） ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０）， （３） ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１）， （４） ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７）， （５） ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）， （６） ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１）， （７） ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７）， （８） ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７）， （９） ｈＡＤＲＰ（７３５−７５５）， （１０） ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８）， （１１） ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９）， （１２） ｈＡＤＲＰ（１０９１−１１１１）， （１３） ｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４），又は（１４） ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３））を導入し、３日後に細胞を固定し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色したサンプルを観察した。部位により染色強度に差異があるため、広い範囲を顕微鏡観察し、代表的な部位の画像を記録した。その画像の一部を図１に示す。細胞全体が赤く染まっているがその中にあって明るく染まっている丸い構造が脂質滴である。
【００１８】
Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較して、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で検出される脂質滴の密度を顕微鏡観察により判定すると、以下の結果となった。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）を用いた場合には、最も顕著に脂質滴が減少した。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３）を用いた場合には、ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）に次いで脂質滴が減少した。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７）又はｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４）を用いた場合には、脂質滴の減少は認められたが、その程度は上記２点に比べかなり劣ると認められた。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０）， ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１）， ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１）， ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７）， ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７）， ｈＡＤＲＰ（７３５−７５５）， ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８）， ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９）， 又はｈＡＤＲＰ（１０９１−１１１１）を用いた場合には、脂質滴の減少は特に認められず、Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡと有意の差がなかった。
【００１９】
実施例２
通常の培養条件で多数の脂質滴を持つＨｅｐＧ２に対するｓｉＲＮＡ導入の効果について検索した。実施例１で脂質滴の減少が確認されたｈＡＤＲＰの翻訳領域の３７９−３９９番目のヌクレオチドを対象とするｓｉＲＮＡ［ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）］を用いて以下の実験を行った。対照群の細胞はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いて同様に処理した。
ｓｉＲＮＡ導入後２日目の細胞について、等量の蛋白質を電気泳動し、ウェスタンブロッティングにより、ｈＡＤＲＰの発現量を検索した。その結果を図２に示す。ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを導入した細胞よりも明らかにｈＡＤＲＰの発現が減弱した。
【００２０】
ｓｉＲＮＡ導入後２、３日目の細胞を固定し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で脂質滴を染色した。その結果を図３に示す。領域による差異があるものの、ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群ではＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群に比較して有意に脂質滴が少ないことが明らかになった。
すなわち両群とも細胞全体が弱く染色されるが、脂質滴を示す明るく丸い蛍光はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群に比較してｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群では顕著に少なかった。ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群でも脂質滴が多く残る領域が存在したが、同様の領域間の差異はＥＧＦＰ発現プラスミドなどのｃＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００で導入し、蛋白質の発現を観察した時にも認められた。このことからｓｉＲＮＡの導入効率を改善すれば更に高度に発現抑制が行えると考えられる。
ｓｉＲＮＡ導入による脂質エステル（トリグリセリド、コレステロールエステル）の量の変動について検索した。その結果を図４に示す。ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群ではトリグリセリド、コレステロールエステルとも有意に減少している。
【００２１】
実施例３
本実施例では、ＬＰＤＳで培養して脂質滴をほぼ消滅させたＢａｌｂ／ｃにｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡを導入した後にオレイン酸又はコレステロールを負荷し、それぞれトリグリセリド、コレステロールエステルを優位に含む脂質滴形成を誘導した。
オレイン酸負荷の結果を図５に、コレステロール負荷の結果を図６に示す。
いずれの場合でも、ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群ではＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群に比較してＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で強い蛍光を発する脂質滴は有意に少なかった。この方法は脂質滴の新規形成を抑制する効果があること、また脂質滴の内容に関わらず効果のあることが明らかになった。
【００２２】
実施例４
本実施例では、マクロファージのモデル細胞であるＪ７７４．１をＬＰＳで活性化し、アセチル化ＬＤＬと培養することにより、泡沫細胞化を誘導した。その後、 ｓｉＲＮＡを導入して脂質滴形成を誘導した。その結果を図７に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群では全ての細胞にＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで強く染まる脂質滴が見られたが、ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群では脂質滴のない細胞集団が認められた。Ｊ７７４．１細胞などマクロファージ系の細胞はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などのトランスフェクション試薬による遺伝子導入の効率が悪く、それらの試薬を用いた場合にはｓｉＲＮＡによる効果も認められなかった。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒによるｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを用いることにより、初めて上記の効果が確認できた。この結果は、ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡが、動脈硬化の最初の段階に生じるマクロファージの泡沫細胞化を抑制するのに有効であることを示す。
【００２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞に各ｓｉＲＮＡを導入した代表的な部位の画像を示す図である。各画像の横幅は１１０μｍである。各番号は、（１） Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ）， （２） ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０）， （３） ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１）， （４） ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７）， （５） ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）， （６） ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１）， （７） ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７）， （８） ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７）， （１０） ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８）， （１１） ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９）， （１３） ｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４）， （１４） ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３）を示す。
【図２】ｓｉＲＮＡ導入後２日目の細胞についてのウェスタンブロッティングを示す図である。右は、ｓｉＲＮＡ［ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図３】ｓｉＲＮＡ導入後２、３日目の細胞を固定し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で脂質滴を染色した結果を示す図である。各画像の横幅は１３８μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図４】ｓｉＲＮＡ導入による脂質エステル（トリグリセリド、コレステロールエステル）の量の変動を示す図である。
【図５】Ｂａｌｂ／ｃにｓｉＲＮＡを導入した後にオレイン酸を負荷し、脂質滴形成を誘導した結果を示す図である。各画像の横幅は２１７μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図６】Ｂａｌｂ／ｃにｓｉＲＮＡを導入した後にコレステロールを負荷し、脂質滴形成を誘導した結果を示す図である。各画像の横幅は２１７μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図７】マクロファージのモデル細胞であるＪ７７４．１にｓｉＲＮＡを導入して脂質滴形成を誘導した結果を示す図である。各画像の横幅は２１７μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞内脂質滴の新規形成を阻害し、既存の細胞内脂質滴を減少又ア消滅させるための手段として、Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ （以下「ＡＤＲＰ」という。）の発現をＲＮＡ干渉（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ）により阻害する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
動脈硬化症、脂肪肝、肥満症などの疾病は、細胞内脂質滴の過剰形成が原因となっていることが知られている（非特許文献１）。
この脂質滴の内容物である脂質エステルの合成酵素阻害剤については、動物個体に投与した場合に種々の副作用が生じることが明らかになり、実用化の目処が立っていない（非特許文献２）。
一方、脂質エステル加水分解酵素を過剰発現させた場合には、脂質エステル合成が高まり、予期された効果が得られないという実験結果が報告されている（非特許文献３）。
また、ＡＤＲＰは、脂質エステルを貯蔵する機能を有し、脂質滴の構造形成及び維持に必要な分子であることが知られており（非特許文献４）、その発現が脂質滴の形成を促すことも知られている（非特許文献５）。そのため、ヒトＡＤＲＰをコードするオリゴヌクレオチドに対するアンチセンス分子を用いて、ヒトＡＤＲＰの発現を抑制し、その発現が関係する肥満症などの治療を行う方法が開示されている（特許文献１）。
【０００３】
【非特許文献１】
Ｄ． Ｊ． Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４０： ３２５−４３８， ２００１
【非特許文献２】
Ｋ． Ｋ． Ｂｕｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７６： ４０３６９−４０３７２， ２００１
【非特許文献３】
Ｊ．−Ｌ． Ｅｓｃａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ４０： ３９７−４０４， １９９９
【非特許文献４】
Ｄ． Ｌ． Ｂｒａｓａｅｍｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３８： ２２４９−２２６３， １９９７
【非特許文献５】
Ｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ２８３： Ｅ７７５−Ｅ７８３， ２００２．
【特許文献１】
特表２００１−５０６８５０ （ＷＯ９８／２６０６７）
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＡＤＲＰの発現を効果的に阻害する手段を提供する。これにより、従来の脂質エステルの合成と加水分解の過程によらずに、細胞内脂質滴の新規形成を阻害し、既存の細胞内脂質滴を減少又は消滅させることができる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ＲＮＡｉを用いてＡＤＲＰの発現を阻害するために最適化されたオリゴヌクレオチドを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３４７〜３９９又は１０９４〜１２７３において連続する２１個の塩基配列を含む２１〜２３個の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡである。
【０００６】
この連続する２１個の塩基配列として、好ましくは配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３４７〜３６７、３７９〜３９９、１０９４〜１１１４、又は１２５３〜１２７３の塩基配列であり、最も好ましくは３７９〜３９９の塩基配列である。
また本発明は、上記のいずれかのオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡを、ヒト又はマウスの細胞へ導入することから成る、該細胞におけるＡＤＲＰ遺伝子の発現を抑制する方法である。
更に本発明は、上記のいずれかのオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡを、ヒト又はマウスの生体細胞へ導入することから成る、動脈硬化症、脂肪肝、肥満症などの脂質滴が過剰に形成され、ＡＤＲＰ遺伝子の過剰発現が見られる疾病の治療又は予防方法である。
【０００７】
【発明の実施の形態】
ＡＤＲＰ（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、脂肪分化関連タンパク質）は、脂肪細胞の分化時にその発現が認められ、脂質滴に特異的に局在するタンパク質であり（非特許文献４）、その発現が脂質滴の形成を促す（非特許文献５）。
本発明はＲＮＡ干渉法により細胞内におけるＡＤＲＰの発現を抑制しようとするものである。ＲＮＡ干渉法は標的ＲＮＡに特異的な２１〜２３塩基のＲＮＡ断片（ｓｉＲＮＡ）を細胞、特に細胞質に導入すると、このＲＮＡ断片がｍＲＮＡに結合してｍＲＮＡの翻訳を阻害すると考えられている（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００２； ３４７：１３６４）。この標的ＲＮＡは標的遺伝子の転写により生ずるｍＲＮＡである。
このＲＮＡ断片としては、標的ＲＮＡのセンス又はアンチセンスのものでもよいが、これらはＲＮａｓｅで容易に分解され，また効果が劣ると考えられるため、これらから成る２本鎖ＲＮＡが好ましく用いられる。この２本鎖ＲＮＡは通常センスとアンチセンスの２本を別々に合成し，それをハイブリダイズさせて２本鎖にして用いられる。
【０００８】
このＲＮＡ断片の長さは２１〜２３塩基が有効と考えられているが、一般には２１塩基のものが好ましく使われ、後述の実施例においても２１塩基のもので有効に機能している。但し、なぜこの範囲のものが有効であるかはまだ十分には解明されていない。
本発明においては対象とする細胞はヒトとマウスである。
これらのＡＤＲＰ遺伝子の特定の塩基配列に「相当する」オリゴリボヌクレオチドとは、この遺伝子が転写されて生成するｍＲＮＡの、ＡＤＲＰ遺伝子の特定の塩基配列に相当する部分に相補的なＲＮＡという意味であり、具体的にはこのＡＤＲＰ遺伝子の特定のＤＮＡ配列のＴをＵに置き換えたもという意味である。
ＲＮＡ断片を細胞に導入する方法については、特に制限はなく、リポソーム等に基づく市販のトランスフェクション試薬を用いるのが簡便である。この方法以外にも、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション法などの方法を用いてもよい。最近、マウスの尾静脈から単にｓｉＲＮＡだけを注入することによって、肝臓での遺伝子発現が低下したという報告がある（Ｅ． Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ９： ３４７−３５１， ２００３）。
【０００９】
【実施例】
以下、実施例にて本発明を例証するが、本発明を限定することを意図するものではない。
本実施例においては以下の方法を用いた。
１．細胞の調整
ヒトＨｅｐＧ２、マウスＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３、及びマウスＪ７７４．１を用いた。ＨｅｐＧ２は通常の培養条件で脂質滴を有するため、既存の脂質滴に対する効果を調べる目的で用いた。またヒト肝臓由来の細胞であるＨｅｐＧ２は、本発明の応用の対象として想定される脂肪肝に対する効果を培養細胞レベルで確かめるモデル系としても重要である。Ｂａｌｂ／ｃは培養条件により脂質滴をほとんど消滅させることができるため、脂質滴の新規形成を調べるために用いた。Ｊ７７４．１はマクロファージ由来であり、動脈硬化の初期に動脈壁で生ずる泡沫細胞形成のモデルとして用いた。
ＨｅｐＧ２、 Ｂａｌｂ／ｃ ３Ｔ３はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥ）に１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）と抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン）を添加した培地で培養した。Ｊ７７４．１はＲＰＭＩ１６４０に１０％ ＦＣＳと抗生物質を添加した培地で培養した。
【００１０】
２．ｓｉＲＮＡ （ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ） の作製
ヒトＡＤＲＰ（以下「ｈＡＤＲＰ」という。配列番号１）及びマウスＡＤＲＰ（以下「ｍＡＤＲＰ」という。配列番号２）の配列にあわせて設計したカスタムオリゴヌクレオチド（インビトロジェン社製）をテンプレートとし、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ｓｉＲＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）のマニュアルに従ってｓｉＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）を合成した。ｓｉＲＮＡの濃度は吸光度で測定して １０μＭになるように調整し、アクリルアミドゲルに泳動して長さのチェックを行った。
ｈＡＤＲＰについて作製したｓｉＲＮＡ（２本鎖ＲＮＡ）の対象配列は以下のとおりである。（なお、カッコ内はそれぞれｈＡＤＲＰ（配列番号１）又はｍＡＤＲＰ（配列番号２）の配列中の対応する位置を示す。）
【００１１】
ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０） ＡＡＧＵＣＵＧＵＧＵＧＵＧＡＧＡＵＧＧＣＡ （配列番号３）
ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１） ＡＡＧＣＵＡＧＡＧＣＣＧＣＡＡＡＵＵＧＣＡ （配列番号４）
ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７） ＡＡＧＡＵＧＣＵＧＵＧＡＣＧＡＣＵＡＣＵＧ （配列番号５）
ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ＡＡＧＧＡＵＵＣＵＧＵＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧ （配列番号６）
ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１） ＡＡＧＡＣＣＡＡＧＵＣＵＧＵＧＧＵＣＡＧＵ （配列番号７）
ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７） ＡＡＧＵＣＵＧＵＧＧＵＣＡＧＵＧＧＣＡＧＣ （配列番号８）
ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７） ＡＡＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣ （配列番号９）
ｈＡＤＲＰ（７３５−７５５） ＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＡＣＣＡＵＵＵＣＵＣＡ （配列番号１０）
ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８） ＡＡＧＧＵＧＵＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＡＵＣＣ （配列番号１１）
ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９） ＡＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＡＡＧＣＡＣＡＵＧＧ （配列番号１２）
ｈＡＤＲＰ（１０９１−１１１１） ＡＡＧＡＡＧＵＧＵＣＵＧＡＣＡＧＣＣＵＣＣ （配列番号１３）
ｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４） ＡＡＧＵＧＵＣＵＧＡＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＡ （配列番号１４）
ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３） ＡＡＧＧＵＧＣＡＧＡＧＡＵＧＧＡＣＡＡＧＡ （配列番号１５）
ｍＡＤＲＰについて作製したｓｉＲＮＡの対象配列は以下のとおりである。
ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ＡＡＧＧＡＵＵＣＵＧＵＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡ （配列番号１６）
この配列について、ヌクレオチド配列をランダムに並べ替え、データベースに登録された他の遺伝子の配列に一致しないものを用い、対照実験用のｓｉＲＮＡを作製した。
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ＡＣＣＡＧＣＧＡＵＵＵＣＵＡＡＧＡＧＡＣＧ （配列番号１７）
【００１２】
３．細胞へのｓｉＲＮＡの導入
（ｉ） ＨｅｐＧ２及びＢａｌｂ／ｃについて
導入前日に抗生物質抜きの培地に継代した。導入はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） にて行った。３５ ｍｍ ｄｉｓｈで２ ｍｌの培地中に培養した細胞の場合、２４ μｌ ｓｉＲＮＡ （１０μＭ濃度）と４ μｌ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００をそれぞれ２００ μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社） に希釈し、両者を混合したのち培地に添加した。なおｓｉＲＮＡの最適量については、予備実験にて比較を行い、上記の量で最大の効果が得られることを確認した。
（ｉｉ） Ｊ７７４．１について
トリプシン処理でディッシュから剥離し、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０に３ ｘ １０６／ ｍｌの密度になるように浮遊させた。０．４ ｃｍ幅のキュベットに細胞浮遊液 ４００μｌ、ｓｉＲＮＡ ５０μｌを入れ、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ） で９６０μＦ、 ０．２ ｋＶの条件でエレクトロポレーションを行った。室温で１分おいたのち、血清を含む培地を入れたディッシュに播種した。
【００１３】
４．脂質滴形成・消滅を見るための実験スケジュール
（ｉ） ＨｅｐＧ２は通常の培養条件で多数の脂質滴を持つ。ｓｉＲＮＡを導入して２−３日後に検索し、対照ｓｉＲＮＡを導入した細胞との比較を行った。
（ｉｉ） Ｂａｌｂ／ｃは通常の培養条件では小さい脂質滴があるが、１０％ ＦＣＳの替わりに２−５％リポ蛋白質欠如血清（ＬＰＤＳ）を添加した培地で３−４日間培養することにより、脂質滴はほぼ消滅する。これにｓｉＲＮＡを導入し、その２日後に０．４ ｍＭ オレイン酸（ウシ血清アルブミンとの複合体）又は０．５ ｍＭ コレステロール（メチルβシクロデキストリンとの複合体）を添加し、それぞれトリグリセリド又はコレステロールエステルの合成を誘導し、１−２日後に検索した。
（ｉｉｉ） Ｊ７７４．１はｓｉＲＮＡを導入したのち、１０μｇ／ｍｌ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ （ＬＰＳ） と１日培養して活性化させ、さらに１日後に１００μｇ／ｍｌ アセチル化ＬＤＬを添加して泡沫細胞化を誘導した。１−２日後に対照群との差を検索した。
【００１４】
５．細胞標識と蛍光顕微鏡観察
カバーガラス上に培養した細胞を緩衝３％ホルムアルデヒド溶液又は３％ホルムアルデヒドと０．１％ グルタルアルデヒド混合溶液で固定した。脂質滴をオイルレッドＯで染色し、蛍光顕微鏡観察した。Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色では細胞全体が弱く染色され、脂質滴は特に強く光る丸い構造として認められた。結果はＡｘｉｏｐｈｏｔ２顕微鏡 （Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で観察し、ＣＣＤカメラ（ＡｘｉｏＣａｍ； Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社）で記録した。
【００１５】
６．ウエスタンブロッティング
細胞をＳＤＳを含むサンプルバッファーに溶解し、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）で蛋白質量を定量した。等量の蛋白質をアクリルアミドゲルに泳動し、ニトロセルロース膜に転写したのち、マウス抗ＡＤＲＰ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ社、クローンＡＰ１２５）、ついでパーオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体と浸漬し、化学発光法で反応を検出した。
【００１６】
７．脂質定量
細胞の全脂質をヘキサン・イソプロパノール（３：２）混合液にて抽出し、窒素気流で乾燥させたのち、適量のイソプロパノールに再溶解した。トリグリセリドはネスコートＴＧキット（アズウェル）を用いて定量した。フリーコレステロールと全コレステロールはそれぞれコレステロールとオレイン酸コレステロールを標準試料として用い、Ｈｅｉｄｅｒ ａｎｄ Ｂｏｙｅｔｔの方法（Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５１４， １９７８）により定量した。全コレステロールとフリーコレステロールの差をコレステロールエステル量とした。
【００１７】
実施例１
ＨｅｐＧ２にｓｉＲＮＡ（（１） Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ）， （２） ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０）， （３） ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１）， （４） ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７）， （５） ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）， （６） ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１）， （７） ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７）， （８） ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７）， （９） ｈＡＤＲＰ（７３５−７５５）， （１０） ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８）， （１１） ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９）， （１２） ｈＡＤＲＰ（１０９１−１１１１）， （１３） ｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４），又は（１４） ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３））を導入し、３日後に細胞を固定し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色したサンプルを観察した。部位により染色強度に差異があるため、広い範囲を顕微鏡観察し、代表的な部位の画像を記録した。その画像の一部を図１に示す。細胞全体が赤く染まっているがその中にあって明るく染まっている丸い構造が脂質滴である。
【００１８】
Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを導入した細胞と比較して、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で検出される脂質滴の密度を顕微鏡観察により判定すると、以下の結果となった。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）を用いた場合には、最も顕著に脂質滴が減少した。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３）を用いた場合には、ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）に次いで脂質滴が減少した。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７）又はｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４）を用いた場合には、脂質滴の減少は認められたが、その程度は上記２点に比べかなり劣ると認められた。
ｓｉＲＮＡとして、ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０）， ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１）， ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１）， ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７）， ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７）， ｈＡＤＲＰ（７３５−７５５）， ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８）， ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９）， 又はｈＡＤＲＰ（１０９１−１１１１）を用いた場合には、脂質滴の減少は特に認められず、Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡと有意の差がなかった。
【００１９】
実施例２
通常の培養条件で多数の脂質滴を持つＨｅｐＧ２に対するｓｉＲＮＡ導入の効果について検索した。実施例１で脂質滴の減少が確認されたｈＡＤＲＰの翻訳領域の３７９−３９９番目のヌクレオチドを対象とするｓｉＲＮＡ［ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）］を用いて以下の実験を行った。対照群の細胞はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いて同様に処理した。
ｓｉＲＮＡ導入後２日目の細胞について、等量の蛋白質を電気泳動し、ウェスタンブロッティングにより、ｈＡＤＲＰの発現量を検索した。その結果を図２に示す。ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡを導入した細胞ではＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを導入した細胞よりも明らかにｈＡＤＲＰの発現が減弱した。
【００２０】
ｓｉＲＮＡ導入後２、３日目の細胞を固定し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で脂質滴を染色した。その結果を図３に示す。領域による差異があるものの、ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群ではＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群に比較して有意に脂質滴が少ないことが明らかになった。
すなわち両群とも細胞全体が弱く染色されるが、脂質滴を示す明るく丸い蛍光はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群に比較してｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群では顕著に少なかった。ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群でも脂質滴が多く残る領域が存在したが、同様の領域間の差異はＥＧＦＰ発現プラスミドなどのｃＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００で導入し、蛋白質の発現を観察した時にも認められた。このことからｓｉＲＮＡの導入効率を改善すれば更に高度に発現抑制が行えると考えられる。
ｓｉＲＮＡ導入による脂質エステル（トリグリセリド、コレステロールエステル）の量の変動について検索した。その結果を図４に示す。ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群ではトリグリセリド、コレステロールエステルとも有意に減少している。
【００２１】
実施例３
本実施例では、ＬＰＤＳで培養して脂質滴をほぼ消滅させたＢａｌｂ／ｃにｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡを導入した後にオレイン酸又はコレステロールを負荷し、それぞれトリグリセリド、コレステロールエステルを優位に含む脂質滴形成を誘導した。
オレイン酸負荷の結果を図５に、コレステロール負荷の結果を図６に示す。
いずれの場合でも、ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群ではＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群に比較してＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で強い蛍光を発する脂質滴は有意に少なかった。この方法は脂質滴の新規形成を抑制する効果があること、また脂質滴の内容に関わらず効果のあることが明らかになった。
【００２２】
実施例４
本実施例では、マクロファージのモデル細胞であるＪ７７４．１をＬＰＳで活性化し、アセチル化ＬＤＬと培養することにより、泡沫細胞化を誘導した。その後、 ｓｉＲＮＡを導入して脂質滴形成を誘導した。その結果を図７に示す。
Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡ群では全ての細胞にＯｉｌ ｒｅｄ Ｏで強く染まる脂質滴が見られたが、ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡ群では脂質滴のない細胞集団が認められた。Ｊ７７４．１細胞などマクロファージ系の細胞はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などのトランスフェクション試薬による遺伝子導入の効率が悪く、それらの試薬を用いた場合にはｓｉＲＮＡによる効果も認められなかった。ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒによるｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎを用いることにより、初めて上記の効果が確認できた。この結果は、ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９） ｓｉＲＮＡが、動脈硬化の最初の段階に生じるマクロファージの泡沫細胞化を抑制するのに有効であることを示す。
【００２３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨｅｐＧ２細胞に各ｓｉＲＮＡを導入した代表的な部位の画像を示す図である。各画像の横幅は１１０μｍである。各番号は、（１） Ｃｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ）， （２） ｈＡＤＲＰ（１３０−１５０）， （３） ｈＡＤＲＰ（２１１−２３１）， （４） ｈＡＤＲＰ（３４７−３６７）， （５） ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）， （６） ｈＡＤＲＰ（４５１−４７１）， （７） ｈＡＤＲＰ（４５７−４７７）， （８） ｈＡＤＲＰ（７２７−７４７）， （１０） ｈＡＤＲＰ（９９８−１０１８）， （１１） ｈＡＤＲＰ（１０１９−１０３９）， （１３） ｈＡＤＲＰ（１０９４−１１１４）， （１４） ｈＡＤＲＰ（１２５３−１２７３）を示す。
【図２】ｓｉＲＮＡ導入後２日目の細胞についてのウェスタンブロッティングを示す図である。右は、ｓｉＲＮＡ［ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図３】ｓｉＲＮＡ導入後２、３日目の細胞を固定し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で脂質滴を染色した結果を示す図である。各画像の横幅は１３８μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｈＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図４】ｓｉＲＮＡ導入による脂質エステル（トリグリセリド、コレステロールエステル）の量の変動を示す図である。
【図５】Ｂａｌｂ／ｃにｓｉＲＮＡを導入した後にオレイン酸を負荷し、脂質滴形成を誘導した結果を示す図である。各画像の横幅は２１７μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図６】Ｂａｌｂ／ｃにｓｉＲＮＡを導入した後にコレステロールを負荷し、脂質滴形成を誘導した結果を示す図である。各画像の横幅は２１７μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
【図７】マクロファージのモデル細胞であるＪ７７４．１にｓｉＲＮＡを導入して脂質滴形成を誘導した結果を示す図である。各画像の横幅は２１７μｍである。右は、ｓｉＲＮＡ［ｍＡＤＲＰ（３７９−３９９）］、左はＣｏｎｔｒｏｌ （ｒａｎｄｏｍ） ｓｉＲＮＡを用いた場合を示す。
Claims (4)
- 配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３４７〜３９９又は１０９４〜１２７３において連続する２１個の塩基配列を含む２１〜２３個の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡ。
- 配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３４７〜３６７、３７９〜３９９、１０９４〜１１１４、又は１２５３〜１２７３の塩基配列を含む２１〜２３個の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡ。
- 配列番号１（ヒトＡＤＲＰ遺伝子）又は配列番号２（マウスＡＤＲＰ遺伝子）の塩基配列の３７９〜３９９の塩基配列に相当するオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡ。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のオリゴリボヌクレオチド、その相補的オリゴリボヌクレオチド、又はこれらから成る２本鎖ＲＮＡを、ヒト又はマウスの細胞へ導入することから成る、該細胞におけるＡＤＲＰ遺伝子の発現を抑制する方法。
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|---|---|---|---|
| JP2003166119A JP2005000052A (ja) | 2003-06-11 | 2003-06-11 | Ａｄｒｐ遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチド及び方法 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003166119A JP2005000052A (ja) | 2003-06-11 | 2003-06-11 | Ａｄｒｐ遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチド及び方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP (1) | JP2005000052A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008100627A3 (en) * | 2007-02-16 | 2008-10-09 | Wyeth Corp | The secreted protein ccdc80 regulates adipocyte differentiation |
-
2003
- 2003-06-11 JP JP2003166119A patent/JP2005000052A/ja not_active Withdrawn
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