JP2004537717A - 肥満細胞を特異的に枯渇させる化合物同定法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、肥満細胞を枯渇させることが可能な化合物の同定および選択を可能にするスクリーニング法に関し、ここでその化合物は、肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株、例えばSCF依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などに対し重大な毒性を示さない。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定および選択することを可能にするスクリーニング法であり、ここでその化合物は、肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などに重大な毒性を示さない方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満細胞(MC)は、CD34、c-kitおよびCD13抗原を発現している造血幹細胞の特定のサブセットに由来した組織要素である(Kirshenbaumら、Blood、94:2333-2342(1999)；および、Ishizakaら、Curr Opin Immunol.、5:937-43(1993))。未熟なMC前駆細胞は、血流中を循環し、組織において分化する。これらの分化および増殖過程は、サイトカインの影響下にあり、その中で最も重要なものは幹細胞因子(SCF)であり、その受容体はc-kitである。
【０００３】
肥満細胞は、関連する組織の配置および構造のみではなく、機能的および組織化学的レベルでの、それらの不均一性により特徴付けられる(AldenborgおよびEnerback.、Histochem. J.、26:587-96(1994)；Braddingら、J Immunol.、155:297-307(1995)；Iraniら、J. Immunol.、147:247-53(1991)；Millerら、Curr Opin Immunol.、1:637-42(1989)；および、Welleら、J. Leukoc Biol.、61:233-45(1997))。実際、少なくとも3種の異なる肥満細胞亜型がヒトにおいて存在し、これらは、それらの形態学的外観、それらの組織配置、それらの生化学的含有物、および様々な化合物に対するそれらの反応性が異なる。これら3種の異なる肥満細胞亜型は中性プロテアーゼ含量により区別される。トリプターゼ(T)のみを含有する肥満細胞はMCTと称される一方で、トリプターゼおよびキマーゼ(C)を含有するMCはMCTCとして知られている。加えて、少数の肥満細胞は、キマーゼのみを発現し、トリプターゼは発現せず、MCCと称される(Liら、J. Immunol.、156:4839-44(1996))。それらの機能に関して、既にかなり研究された即時型過敏症に関連した細胞としてのそれらの役割に加え、最近の研究は、肥満細胞は抗原提示細胞として、および生物の抗炎症性防御に高度に関連した要素としての、ふたつの主要な生理的特性を有することを示すことができた(AbrahamおよびArock、Semin Immunol.、10:373-381(1998)；ArockおよびAbraham、Infection Immunity、66:6030-4(1998)；Galliら、Curr Opin Immunol.、11:53-59(1999))。
【０００４】
より最近になって、本出願人は、肥満細胞は、これまで考えられていたものよりも遙かに大きく広がる多くの病理に関連していることを発見した。これに関し、本出願人は、米国特許第60/301,408号、第60/601,409号、第60/301,411号、第60/301,407号、第60/301,406号、第60/323,312号、第60/301,410号、第60/323,315号、第60/301,405号、第60/601,409号、および第60/301,404号を出願している。
【０００５】
患者の組織に存在する肥満細胞は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、腫瘍血管新生、炎症疾患、多発性関節炎、炎症性腸疾患(IBD)、および間質性膀胱炎のような疾患の発生に関連またはその原因となっていることが発見された。これらの疾患全てにおいて、肥満細胞が、様々なプロテアーゼおよびメディエーター類(例えばヒスタミン、プロテオグリカン、中性プロテアーゼ)、脂質由来のメディエーター類(プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン)、ならびに様々なサイトカイン類(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF、MIP-1a、MlP-1b、MIP-2、およびIFN-γ)のカクテルの放出により組織破壊に参画していることは自明のことである。
【０００６】
このような理由で、これらの疾患に寄与する肥満細胞を枯渇するためにc-kitを標的とすることが提唱されている。この方法は非常に有望であるが、本出願人は更に特異的に肥満細胞を枯渇することを進め、かつここで提唱している。実際c-kitは、他の造血細胞または非造血細胞においても発現されている。肥満細胞枯渇に関する特異性を増強することは非常に興味深く、前記疾患治療の新規経路を開くことができるであろう。これは例えば、自己免疫疾患の治療について例証することができる。当技術分野において、免疫抑制剤のみが相対的な効能を示しているが、これらは患者の全身の健康を危険に曝し、いくつかの症例においては高い死亡率に関連している大きな副作用がある。
【０００７】
本明細書で以下に定義された方法は、前記疾患の中心にある非常に特異的な免疫系の亜成分である肥満細胞を標的とするが、患者の全身の健康に影響を及ぼすことなく排泄され得るので、当技術分野において提唱されているものと比べてテーラーメード治療を提供することができるであろう。
【発明の開示】
【０００８】
説明
従って本発明は、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定する方法を目的とし、ここでこの化合物は、肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などにとって無毒であり：
a)肥満細胞をインビトロにおいて適当な培養培地内で培養する工程；
b)その培養培地に少なくとも1種の試験される候補化合物を添加し、細胞を延長された期間インキュベーションする工程；
c)化合物が肥満細胞の死または破壊を促進し、肥満細胞増殖を妨害または阻害する程度を測定し、ならびに肥満細胞の枯渇が観察された化合物を選択する工程；
d)肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などから選択された細胞の有意な死を促進することができない、工程c)において選択された化合物のサブセットを同定する工程を含む方法である。
【０００９】
別の表現をすると、本発明は、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定する方法であり、ここでその化合物は肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などにとって無毒であり：
a)肥満細胞の培養物を提供する工程であり、ここで肥満細胞は、野生型肥満細胞およびそれらに由来した細胞株、活性化された突然変異体肥満細胞株、ならびに活性化された野生型肥満細胞およびそれらに由来した細胞株から選択される工程；
b)細胞の培養物を、少なくとも1種の候補化合物と、肥満細胞の増殖および／または生存を許す条件下で接触し、候補化合物存在下での細胞死のレベルを測定し；ならびに、候補化合物存在下での細胞死レベルを、候補化合物非存在下での細胞死レベルと比較し、ここで候補化合物の存在下での細胞死レベルの増加が、候補化合物の肥満細胞枯渇能の指標である工程；
c)肥満細胞以外の少なくとも1種の細胞の培養物を提供する工程であり、ここでその細胞は、肥満細胞ではない造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などから選択される工程；
d)細胞の培養物を、工程b)で同定された少なくとも1種の化合物と、工程c)で説明された細胞の増殖および／または生存を許す条件下で接触し、その化合物存在下での細胞死のレベルを測定し；ならびに、化合物存在下での細胞死レベルを、化合物非存在下での細胞死レベルと比較し、ここでこの化合物存在下での細胞死レベルに有意な増加がないことは、この化合物の少なくとも他の造血細胞に対する肥満細胞枯渇特異性の指標である工程を含む方法に関する。
【００１０】
前記方法の枠内で使用することができる肥満細胞の中でも、本発明者らは以下のものを挙げることができる：
SCF依存性細胞：
a)ヒト臍帯血から得られた血液を起源とする細胞。これに関して、臍帯血由来のヘパリン処理した血液は、Ficoll勾配上で遠心され、他の血液成分から単核細胞が単離される。次にCD34+前駆細胞は、前述の単離された細胞から免疫磁気選択システムMACS(Miltenyi biotech社)を用いて精製される。その後CD34+細胞は、培地MCCM(L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5x10-5Mβ-メルカプトエタノール、20％ウシ胎仔血清、1％ウシ血清アルブミンおよび、100ng/ml組換えヒトSCFを補充したα-MEM)において、濃度105個細胞/ml、37℃、5％CO2大気中で、培養される。培地は、5から7日毎に交換される。この培養物中に存在する肥満細胞の割合は、May-Grunwalギムサまたはトルイジンブルー染色を用い、毎週評価される。抗トリプターゼ抗体も、培養物中の肥満細胞検出に使用することができる。10週間培養した後、純粋な肥満細胞の細胞集団(＞98％)が得られる。
【００１１】
b)a)において得られる細胞由来の細胞株。常法を用い、前述のように確立された細胞株をトランスフェクションするためにc-kitを発現しているベクターを調製することは可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenらの論文に説明されている(EMBO J.、6(II):3341-3351(1987))(同じく配列番号:1参照のこと)。c-kitのコード部分(3000bp)は、下記のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより増幅され、クローニングされる：
これらのPCR産物は、NotIおよびXhoIで消化され、T4リガーゼを用いpFlag-CMVベクター(SIGMA社)へ挿入されるが、このベクターはNotIおよびXhoIにより消化されならびにCIP(Biolabs社)を用いて脱リン酸化されている。このpFlag-CMV-c-kitを用い、細菌クローンXL1-blueが形質転換される。クローンの形質転換は、下記プライマーにより証明される：
当技術分野において公知の慣習的かつ一般的手法により、関連カセットを用いて位置指定突然変異誘発が行われる。
【００１２】
ベクターMigr-1(ABC社)を、成熟肥満細胞のトランスフェクションに使用するためのレトロウイルスベクター構築のための基本として使用することができる。このベクターは、IRESの3'末端にGFPをコードしている配列を含むので都合がよい。これらの特徴は、フルオロサイトメーターによる直接分析を用い、レトロウイルスに感染した細胞の選択を可能にする。前述のように、c-kit cDNAのN-末端は、内因性c-kitから異種を識別するのに有用であるFlag配列を導入するために修飾することができる。
【００１３】
c)肥満細胞株：
野生型または突然変異型c-kitを発現している(傍細胞膜および触媒部位)BaF3マウス細胞は、Kitayamaら(Blood、88:995-1004(1996))およびTsujimuraら(Blood、93:1319-1329(1999))の論文に説明されている。この細胞株は、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン、10％ウシ胎仔血清(FBS)、およびIL-3を補充した、RPMI 1640培地において増殖することができる。
【００１４】
c-kit野生型またはc-kitD814Yのいずれかを発現しているIC-2マウス細胞は、Piaoらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:14665-14669(1996))に示されている。
【００１５】
d)IL-3非依存性細胞株は以下である：
HMC-1は、肥満細胞性白血病患者由来の因子非依存性細胞株であり、構成的キナーゼ活性を有する傍細胞膜突然変異体c-kitポリペプチドを発現している(Furitsu Tら、J. Clin. Invest.、92:1736-1744(1993)；Butterfieldら、「Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia」、Leuk Res.、12:345-355(1988)；および、Nagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、92:10560-10564(1995))。
【００１６】
P815細胞株(814位でc-kit突然変異を天然に発現している肥満細胞腫)は、Tsujimuraらの論文(Blood、83:2619-2626(1994))に説明されている。この細胞株は、ATCCから寄託番号TIB-64で入手可能である。
【００１７】
e)ATCCから入手可能なその他の肥満細胞株：
【００１８】
従って好ましい態様において、本発明は前述の方法に関し、ここで肥満細胞は単離された肥満細胞およびそれら由来の細胞株、BaF3、IC-2マウス細胞、HMC-1、ATCC寄託番号 TIB-64で入手可能なP815、ATCC寄託番号CRL-2034で入手可能な10P2、ATCC寄託番号CRL-2036で入手可能な10P12、ATCC寄託番号CRL-2037で入手可能な11P0-1、ならびにそれら由来の細胞株から選択される。
【００１９】
加えて、本発明の方法に関連して、肥満細胞は、MCC、MCTC、MCTから選択することができる。
【００２０】
別の好ましい態様において、肥満細胞ではない造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株は、下記からなる群から選択することができる：
ヒトTリンパ球Jurkat細胞株(ATCC番号TIB-152およびそれら由来の細胞株)、
ヒトBリンパ球DaudiまたはRaji細胞株(各々、ATCC番号CCL-213およびCCL-86ならびにそれら由来の細胞株)、
ヒト単球U937細胞株(ATCC番号CRL-1593.2)、および
ヒトHL-60細胞株(ATCC番号CCL-240)、それら由来の細胞株(ATCC番号CRL-2258およびCRL-2392)。
【００２１】
先に説明したように、本方法は、これらの造血細胞の1種または数種のいずれかで行うことができる。好ましい化合物は、その他の造血細胞に対する肥満細胞に関して最大の効能および特異性を明らかにする化合物である。
【００２２】
更に別の好ましい態様において、対照細胞は、SCF以外のサイトカインカクテルを含有する培養培地において増殖された正常ヒトCD34+細胞から選択される。好ましい化合物は、これらのSCF非依存性CD34+細胞に対する肥満細胞に関して最大の効能および特異性を明らかにする化合物である。
【００２３】
効能に関して、本発明の化合物は、濃度10μM未満、好ましくは5、4、2または1μM未満で、それらの肥満細胞枯渇能について選択される。
【００２４】
最良の化合物は、先に示した化合物のサブセットであり、これは、濃度範囲1、2、3、4、5μMから10μMでは、肥満細胞以外の造血細胞の生存度には有意に影響しない。本発明は、これらの化合物の中でも濃度範囲10〜15μM、15〜20μM、または20〜40μMで、生存力の喪失がない化合物を特に指定している。
【００２５】
効能／選択性の比は、下記式を用い、前述のデータで説明することができる：
E/S比＝肥満細胞のIC50／肥満細胞以外の造血細胞のIC50
【００２６】
最良の化合物は、最低のE/S比を示す化合物であり、例えばE/S比が1/1000から1/5、1/1000から1/100、1/100から1/50、1/100から1/10、1/50から1/10、1/25から1/10、または1/20から1/5の範囲の化合物である。
【００２７】
細胞死アッセイ法は、細胞増殖アッセイ法、細胞生存度アッセイ法および／またはアポトーシスアッセイ法をさらに含む。
【００２８】
例えば、細胞死の程度は、3Hチミジン取込み、トリパンブルー排除能法、ヨウ化プロピジウムの使用、または51Cr-放出アッセイ法により測定することができる。
【００２９】
あるいは、細胞死の程度は、好ましくは蛍光カルセインおよびエチジウムホモダイマー1を使用し、細胞内エステラーゼ活性試験、および形質膜完全性試験により決定される。これらの試験は、J. Neurosci、15:5389(1995)、J. Cell Sci.、106:685(1993)に説明されている。詳細なプロトコールは、Molecular Probes社カタログ製品番号L-3224(Live/Dead(登録商標)キット)に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。基本的に、カルセインAMは、細胞-透過性エステラーゼ基質であり、これは酵素活性により高度に蛍光性のカルセインに転換されるまでは非蛍光性である。これは、強い緑色蛍光を発している生細胞内に維持され続ける。エチジウムホモダイマー1蛍光は、核酸結合時に増強される。明るい赤色蛍光が放出される。この色素は無傷の形質膜を通過することはできないが、死細胞の中には侵入する。従って生細胞は緑色であるが、死細胞は赤色蛍光を放出する。この技術をCDDカメラおよびプレートリーダーと組合せることで、ハイスループットスクリーニングにつながる。
【００３０】
別の態様において、細胞死の程度は、DiOC18およびヨウ化プロピジウムを用い、生細胞と死細胞の間の識別により決定される。プロトコールは、Molecular Probes社カタログ製品番号L-7010(Live/Dead(登録商標)キット)に詳細に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００３１】
更に別の態様において、細胞死はカスパーゼ活性試験を用い決定することができる。カスパーゼは、アポトーシス活性化において重要な役割を果たす。Molecular probe社キットE-13183(EnzCheckカスパーゼ-3アッセイキット(登録商標)、Molecular Probe社)は、特にJurkat細胞の試験に有用である。ホスファチジル曝露もこれに関して使用することができる。この方法は、Dan Sらの論文「Selctive induction of apoptosis in Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia cells by an inhibitor of BCR-ABL tyrosine kinase CGP 57148」(Cell Death Differ.、5:710-715(1998))において使用されている。
【００３２】
更に別の態様において、細胞死はHL-60細胞の指示薬として有用であることが説明されている、Molecular Probe社のJC-1またはJC-9カチオン性色素を用いる、ミトコンドリア膜脱分極試験を用い決定することができる。
【００３３】
細胞増殖アッセイ法については、MTSテトラゾリウム(Cell Titer96 Aqueous；Promega社、マジソン、WI)を用い行うことができる。この試験は、生細胞数を測定することができる。
【００３４】
前述の全ての細胞死試験において、本発明は、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光マイクロプレートリーダー、および／またはフローサイトメーターを用いる、細胞生存度および細胞毒性の蛍光光度アッセイ法を包含している。
【００３５】
更に本出願人は、先に出願した米国特許第60/301,404号において、c-kitは肥満細胞枯渇に関する関心対象の標的であることを示している。ここでは、この受容体の下流のシグナル伝達経路のインヒビターを試験することがより詳細に提唱されている。実際、シグナル伝達に関連している全てのチロシンキナーゼの中で、それらの1種または数種が、肥満細胞ではない他の造血細胞に対する肥満細胞についてより特異的であるかまたはアップレギュレーションされていることがある。
【００３６】
これに関して、試験される化合物は、チロシンキナーゼのインヒビター、例えばAkt、c-Cbl、CRKL、Doc、p125 Fak、Fyn、Grap、Jak2、Lyn、MAPK、MATK、PI3-K、PLC-γ、Raf1、Ras、SHP-1、SHP2(Syp)、Tec、Vav、およびFlt-3(下記表1参照)から選択することができる。
【００３７】
（表1）ヒトc-kitの細胞内部分と相互作用するかおよび／またはSCFに反応して活性化される分子
【００３８】
関心対象の化合物は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、またはヘテロ環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換されたピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシ化合物、およびベンジルホスホン酸化合物を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明はまた、前述の方法により入手可能な化合物にも関し、ここでその化合物は肥満細胞を枯渇することが可能であり、および他の造血細胞に対する重大な毒性を有さない。好ましくはこのような化合物は、E/S比の範囲が、1/1000〜1/5、1/1000〜1/100、1/100〜1/50、1/100〜1/10、1/50〜1/10、1/25〜1/10、または1/20〜1/5である。
【００４０】
本発明の別の局面は、医薬品製造のための前記化合物の使用に関する。このような医薬品は、経口投与のための薬学的組成物の形状をとることができ、これは、当技術分野において周知の薬学的に許容できる担体を用い、経口投与に適した用量で処方することができる。このような担体は、患者が服用するために、薬学的組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして処方することが可能である。これらの薬学的組成物は、活性成分に加え、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、適当な薬学的に許容できる担体を含有しても良い。処方および投与技術に関する更なる詳細については、「Remington's Pharmaceutical Sciences」最新版(Maack Publishing社、イーストン、Pa)に見ることができる。
【００４１】
このような医薬品は、外用投与のための薬学的組成物または化粧品組成物の形をとることができる。このような本発明の組成物は、ゲル剤、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、水性懸濁剤、水性アルコールもしくは油性の液剤、またはローションもしくは血清型の分散剤、または無水もしくは凍結乾燥したゲル剤、または水相中に脂肪相もしくはその逆の分散により得られたミルク型の液体もしくは半固形のコンシステンシーの乳剤、またはクリームもしくはゲル型の軟質の半固形コンシステンシーの懸濁剤もしくは乳剤、あるいはマイクロエマルション、マイクロカプセル、微粒子、またはイオン性および／もしくは非イオン性型の小胞分散剤の形で存在することができる。これらの組成物は標準的方法に従い調製される。
【００４２】
本発明の組成物は、皮膚科および化粧品において通常使用される任意の成分を含有する。これは、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性物質、保存剤、皮膚軟化剤、増粘性ポリマー、保湿剤、界面活性剤、保存剤、酸化防止剤、溶媒、ならびに充填剤、酸化防止剤、溶媒、香料、充填剤、スクリーニング剤、殺菌剤、消臭剤、および着色物質から選択された少なくとも1種の成分を含有することができる。
【００４３】
本発明において使用することができる油分として、鉱油(流動パラフィン)、植物油(シアバターの液体画分、ヒマワリ油)、動物油、合成油、シリコーン油(シクロメチコーン)、およびフッ素化された油を意味することができる。脂肪族アルコール、脂肪酸(ステアリン酸)、およびワックス(パラフィン、カルナバ、蜜蝋)も、脂肪物質として使用することができる。
【００４４】
本発明において使用することができる乳化剤としては、ステアリン酸グリセロール、ポリソルベート60、およびPEG-6/PEG-32/ステアリン酸グリコール混合物が企図されている。親水性ゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー(カルボマー)、アクリル系コポリマー、例えばアクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、多糖類、例えばヒドロキシプロピルセルロース、クレイ、および天然ゴムを挙げることができ、ならびに親油性ゲル化剤としては、改質クレイ、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、例えばステアリン酸アルミニウム、および疎水性シリカ、あるいはエチルセルロースおよびポリエチレンを挙げることができる。
【００４５】
親水性活性物質としては、タンパク質またはタンパク質の加水分解産物、アミノ酸、ポリオール、尿素、アラントイン、糖質および糖誘導体、ビタミン、デンプンおよび植物抽出物、特にアロエ抽出物、を使用することができる。
【００４６】
親油性活性物質としては、レチノール(ビタミンA)およびその誘導体、トコフェノール(ビタミンE)およびその誘導体、必須脂肪酸、セラミド、ならびに精油を使用することができる。これらの物質は、使用時に余分の湿潤化または皮膚軟化の特徴が追加される。
【００４７】
加えて、肥満細胞枯渇を可能にする化合物、例えばチロシンキナーゼインヒビター、好ましくはc-kitインヒビターのより深部への浸透を提供するために、界面活性剤をこの組成物中に含有することができる。
【００４８】
企図された成分の中で、本発明は、例えば鉱油、水、エタノール、トリアセチン、グリセリン、およびプロピレングリコールからなる群より選択された浸透増強剤；例えばポリイソブチレン、ポリ酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される粘着剤、ならびに増粘剤を包含している。
【００４９】
薬剤の外用吸収を増大する化学的方法は、当技術分野において周知である。例えば、浸透増強特性を持つ化合物は、ラウリル硫酸ナトリウム(Dugard, P. H.およびSheuplein, R. J.、「Effects of Ionic Surfactants on the Permeability of Human Epidermis: An Electrometric Study」、J. Ivest. Dermatol.、60:263-69(1973))、ラウリルアミン酸化物(Johnsonら、米国特許第4,411,893号)、アゾン(Rajadhyaksha、米国特許第4,405,616号および第3,989,816号)、ならびにデシルメチルスルホキシド(Sekura, D. L.およびScala, J.、「The Percutaneous Absorption of Alkylmethyl Sulfides」、Pharmacology of the Skin, Advances In Biolocy of Skin、(Appleton-Century Craft)、12:257-69(1972))を含む。両性分子の頭部の基(head group)の極性の増加は、それらの浸透増強特性を増大するが、それらの皮膚刺激特性の増加が犠牲になっていることは認められている(Cooper, E. R.およびBerner, B.、「Interaction of Surfactants with Epidermal Tissues: Physiochemical Aspects」、Surfactant Science Series、16巻、Reiger, M. M.編集(Marcel Dekker社)、195-210頁、1987年)。
【００５０】
化学増強剤の第二の種類は、一般に補助溶剤と称されている。これらの物質は外用で比較的容易に吸収され、および様々な機構により、このような薬剤の浸透増強を実現する。エタノール(Galeら、米国特許第4,615,699号、ならびにCampbellら、米国特許第4,460,372号および第4,379,454号)、ジメチルスルホキシド(米国特許第3,740,420号および第3,743,727号、ならびに米国特許第4,575,515号)、およびグリセリン誘導体(米国特許第4,322,433号)は、様々な化合物の吸収を増強する能力を示す化合物のほんの数例である。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、患者気道の標的領域へのエアロゾル処方での投与を意図することもできる。薬剤処方のエアロゾルの一吹き(burst)を送達する装置および方法は、米国特許第5,906,202号に開示されている。処方は好ましくは液体であり、例えば水溶液、エタノール溶液、水性／エタノール性溶液、生理食塩水溶液、コロイド状懸濁液、および微晶質懸濁液などである。例えば、好ましくは柔軟な多孔質膜の形であるようなノズルを通して処方を推進する際に形成されるエアロゾル化された粒子は、前述の活性成分および担体(例えば、薬学的活性のある呼吸器系薬剤および担体)を含有する。これらの粒子は、粒子が形成された場合に、患者がこれらの粒子を患者肺へと吸入することができるような十分な時間、空気中に懸濁され続けるのに十分な小さいサイズを有する。
【００５２】
本発明は、米国特許第5,556,611号に開示されている下記システムを包含している：
加圧容器内の液体ガスシステム(液化ガスが、噴射剤ガス(例えば、低沸点FCHCまたはプロパン、ブタン)として使用される
懸濁エアロゾル(活性物質粒子は液体噴射剤相中に固体形で懸濁されている)
加圧ガスシステム(窒素、二酸化炭素、一酸化二窒素、空気などの圧縮されたガスが使用される）
【００５３】
従って本発明において、活性物質が適当な無毒の媒体中に溶解または分散され、この溶液または分散液がエアロゾルに霧状とされている、すなわち担体ガス中に極めて細かく分布されているような薬学的調製物が製造される。これは例えば、特に正確な個別用量が可能であるような、液体噴霧および固形物霧状化のための、それ自身公知のエアロゾル噴射ガスパック、ポンプ式エアロゾル、またはその他の装置の形で技術的に可能である。従って本発明は、先に定義された化合物およびそのような処方を含む、好ましくは用量計量用バルブを備えたエアロゾル装置にも関する。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は鼻腔内投与を意図することもできる。これに関して、鼻粘膜表面への化合物投与のための薬学的に許容できる担体は、当業者には容易に理解されるであろう。このような担体は、単に一例として、「Remington's Pharmaceutical Sciences」16版、1980年、Arthur Osol編集に明らかにされており、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００５５】
適当な担体の選択は、企図される投与の具体的種類に応じて決まる。上気道を介した投与のためには、この組成物は、溶液、例えば水または等張生理食塩水（緩衝したまたはしていないもの）、または懸濁液として、鼻腔内投与のための、液滴または噴霧剤として処方することができる。好ましくは、このような溶液または懸濁液は、鼻分泌物に対して等張、および同じpH範囲、例えば約pH4.0〜約pH7.4、またはpH6.0〜pH7.0である。緩衝液は、生理的に相溶性があり、単に一例としてはリン酸緩衝液である。例えば代表的鼻充血除去剤は、pHが約6.2になるように緩衝されていることが説明されている(Remington's、上記、1445頁)。当然当業者は、鼻および／または上気道投与への無害の水性担体に関し適当な生理食塩水含量およびpHを容易に決定することができる。
【００５６】
一般的な鼻腔内の担体は、粘度が例えば約10〜約3000cps、または約2500〜6500cps、またはそれよりも大きい、鼻用ゲル剤、クリーム剤、パスタ剤、または軟膏剤を含み、鼻粘膜表面とのより持続的な接触を提供するために使用することもできる。このような担体の粘性処方は、単に一例として、高粘性であることが当技術分野において周知である、アルキルセルロースおよび／または他の生体適合性担体を基にすることができる(例えばRemington's、上記、を参照のこと)。好ましいアルキルセルロースは、例えば濃度範囲が担体100mlあたり約5〜約1000mgまたはそれよりも多いメチルセルロースである。より好ましいメチルセルロース濃度は、単に一例として、担体100mlにつき約25〜約mgである。
【００５７】
当技術分野において公知の保存剤、着色剤、滑沢剤または粘性の鉱油もしくは植物油、香料、天然もしくは合成の植物抽出物、例えば香油、ならびに湿潤剤および増粘剤（例えばグリセロールなど）のようなその他の成分も、この処方に更なる粘性、保湿性、ならびに好ましい質感および臭気を提供するために含有することができる。本発明の液剤または懸濁剤の鼻腔内投与については、液滴(drop)、小滴(droplet)、および噴霧剤を作製するために様々な装置を当技術分野において利用することができる。
【００５８】
液滴または噴霧剤として送達するための溶液または懸濁液を含有する点滴器または噴霧装置を含む、予め測定された単位用量の分注装置は、投与される薬剤の1回または複数回用量を含むように調製され、これは本発明の別の目的である。本発明は更に、適量の水を添加することにより液剤または懸濁剤を容易に調製するために、1種または複数の単位用量の脱水された化合物を、いずれか必要な塩および／または緩衝剤、保存剤、着色剤などと共に含有するキットも含む。
【００５９】
更に別の局面において、本発明は先に説明した方法により入手可能な化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類へ投与することを含む、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、骨量減少、腫瘍血管新生、炎症疾患、炎症性腸疾患(IBD)、間質性膀胱炎、肥満細胞症、感染症、およびCNS障害から選択された疾患を治療する方法を目的としている。
【００６０】
更なる局面において、本発明は先に説明した方法により入手可能な化合物を、そのような治療を必要とするヒトへ投与することを含む、毛髪生長および毛髪色の回復を促進する方法を企図している。
【００６１】
更に別の局面において、本発明は、多発性硬化症、乾癬、腸炎症疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチおよび多発性関節炎、限局性および全身性強皮症、全身性エリスマトーデス、円板状エリスマトーデス、皮膚エリスマトーデス、皮膚筋炎、多発性筋炎、シェーグレン症候群、結節性汎動脈炎、自己免疫性腸疾患、増殖性糸球体腎炎、脈管炎、活動性慢性肝炎および慢性疲労症候群を治療するための先に定義した方法を包含している。
【００６２】
更なる別の局面において、本発明は、腎臓、膵臓、肝臓、心臓、および肺を含む任意の臓器移植における、移植片-対-宿主疾患または移植片拒絶反応を治療するための先に定義した方法を包含している。
【００６３】
別の局面において、本発明は、アフタ性潰瘍のような表皮下水疱形成障害、ならびに天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および瘢痕性類天疱瘡などのようないくつかの水疱性疾患を治療するための先に定義された方法を包含している。この方法は更に、好ましくはダプソン、アザチオプリン、エリスロマイシン、プロピオニルエリスロマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、およびメクロサイクリン(mechlocycline)から選択された、少なくとも1種の抗生物質を含有することができる。
【００６４】
本発明は同じく、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシー症候群、じんま疹、血管性水腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性細静脈炎、昆虫の咬傷による皮膚炎症、および吸血寄生生物外寄生を治療するための、先に説明された方法にも関連している。
【００６５】
本発明は、特にイヌおよびネコにおける、皮膚アレルギー性障害、例えば、じんま疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性細静脈炎、昆虫の咬傷による皮膚炎症、および吸血寄生生物外寄生を治療するための、先に説明された方法にも関連している。
【００６６】
従って、この化合物は、患者の気道、鼻腔内の標的部位へエアロゾル処方でまたは局所的処方で投与される。
【００６７】
更に別の局面において、本発明はヒトにおける腫瘍血管新生を治療するため、先に定義された方法を包含している。
【００６８】
本発明は同じく、肥満細胞症、色素性じんま疹を含む顕著な皮膚肥満細胞症、びまん性皮膚肥満細胞症、単発性肥満細胞腫および水疱、紅斑性および末梢血管拡張性肥満細胞症に関連した、ヒトにおける皮膚疾患を治療するために加え、肥満細胞性白血病を含むIV型肥満細胞症を治療するための、先に説明した方法に関する。
【００６９】
特定の態様は、イヌの肥満細胞腫を治療することに関する。
【００７０】
更に別の局面において、本発明は、クローン病、粘膜炎、潰瘍性大腸炎、および壊死性腸炎のような、炎症性腸疾患(IBD)を治療するための、先に説明した方法を包含している。
【００７１】
本発明は更に、ヒトにおける間質性膀胱炎を治療するため、哺乳類、特にヒトにおける細菌感染症を治療するため、好ましくは再発性細菌感染症、細菌性膀胱炎のような無症候期間後に再発する感染症の治療のために、先に説明した方法を企図している。
【００７２】
より詳細に述べると、本発明は大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルケセンス、シトロバクター・フロインディー、およびネズミチフス菌を含む、グラム陰性腸内細菌のような、FimH発現性細菌感染症を治療するために実践することができる。
【００７３】
この細菌感染症を治療する方法においては、バシトラシン、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンのようなマクロライド系抗生物質；フルオロキノロン、アクチノマイシン、スルホンアミド、およびトリメトプリムからから選択された少なくとも1種の抗生物質の投与が対象となる。
【００７４】
本発明はまた、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、および糖質コルチコイドが誘発した骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常症、骨硬化症、骨減少症、骨軟化症、骨線維形成性不全症、およびページェット病のような骨量減少を治療するための、先に説明された方法を企図している。
【００７５】
特定の態様において、本発明は、慢性関節リウマチ、結膜炎、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、多発性関節炎、および他の関節炎的状態のような炎症疾患に加えこれらの炎症疾患に関連した疼痛を治療するための、先に説明された方法に関する。
【００７６】
本発明の有用性は更に、以下の詳細な説明により例証されるであろう。実際c-kit野生型または突然変異されたc-kitの間には、シグナル伝達の差異が認められる。これは、肥満細胞内に特異的に存在するか、活性化されるか、もしくはアップレギュレーションされる特異的二次メッセンジャー、または肥満細胞以外の造血細胞において抑制されるか、存在しないか、もしくは失活される経路の標的化につながることがある。
【００７７】
正常なc-kitの活性化により誘導されたシグナル伝達
SCFは、インビトロ造血を誘導するために、M-CSFを除くほとんど全ての造血増殖因子に相乗作用を及ぼすので、これは造血において必須の増殖因子である(Metcalf, D.、「The cellular basis for enhancement interactions between stem cell factor and the colony stimulating factors」、Stem Cells (Dayt)、11(Suppl 2):1-11(1993))。この因子は、骨髄ストローマ細胞において産生され、その受容体であるc-kitとの相互作用を介して作用する(Ratajczak, M.Zら、「Role of the KIT protooncogene in normal and malignant human hematopoiesis」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:1710-1714(1992))。先に示されたように、c-kit受容体は、145kDaの糖タンパク質であり、III型チロシンキナーゼサブファミリーに属し、その分子の細胞外部分における5個のIg様ドメインの存在、および細胞質内ドメインをアデノシン三リン酸(ATP)結合ドメインとホスホトランスフェラーゼドメインとに分断するインターキナーゼ配列を特徴としている。c-kitは、CFU-GEMM、BFU-Eにより、ならびに肥満細胞株系の前駆細胞および成熟細胞により、強力に発現される(Katayama N.ら、「Stage-specific expression of c-kit protein by murine hematopoietic progenitors」、Blood、82:2353-2360(1993))。
【００７８】
c-kitへのリガンド結合は、触媒機能の活性化を生じ、結果的に細胞質ドメインのチロシン残基の自己リン酸化を生じる。これらのホスホチロシン残基は、SH2ドメインを含む様々な細胞質シグナル伝達分子のドッキング部位となる。c-kitは、PI3キナーゼ、ras、およびJAK2に依存性のものを含む、多くの増殖因子受容体に共通である正準のシグナル伝達経路を活性化する。インビボまたはインビトロにおいてc-kitと会合することが分かっている分子は、PI3-キナーゼのp85サブユニット、複数のSrcファミリーの一員であるLynおよびFyn、Vav、Grb2、SHP-1、SHP-2、PKC、MATK(CHK)、およびSocs1を含むと同時に、PLC-γ、rasのGTPase活性化タンパク質(GAP)およびJAK2に関する多様なデータが存在する。以下の追加の分子は、c-kit活性化に反応して活性化またはリン酸化される：Shc、Tec、Vav GDP/GTP交換因子、raf-1、MAPK、Akt、CRKL、p120 Cbl、およびDoc。様々な細胞系において行われた最近の研究は、c-kitと会合しこれによりリン酸化される基質に関する異なる結果を生じた。これらの矛盾点は、同じリガンド／受容体システムにより媒介された個別のシグナルおよび細胞型特異的な反応の基となる、個々の細胞型の基質発現プロファイルにおける実験法の差異または機能的関係の変動のいずれかにおける差異を反映しているであろう。これらの理由のために、本発明者らは、様々な細胞状況におけるc-kitシグナル伝達に関して得られたデータを説明することを選択した。
【００７９】
シグナル伝達の初発因子は、c-kitのリガンドが誘導した二量体化であり、これは固有のc-kitチロシンキナーゼ活性を誘導し、重要なチロシン残基においてトランスホスホリレーションを生じる。更にc-kitは、リガンド刺激に反応し、PKCによりセリン残基においてリン酸化されるように見え、このことはc-kit自己リン酸化を阻害する(Katayama, Nら、「Stage-specific expression of c-kit protein by murine hematopoietic progenitors」、Blood、82:2353-2360(1993))。
【００８０】
様々な細胞型において観察されたc-kitとの最も効率的会合のひとつは、PI3-キナーゼのp85サブユニットのSH2ドメインによってなされ(Lev, Sら、「Interkinase domain of kit contains the binding site for phosphatidylinositol 3' kinase」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:678-682(1992)、および、Rottapel, R.ら、「The Steel/W transduction pathway: kit autophosphorylation and its association with a unique subset of cytoplasmic signaling proteins is induced by the Steel factor」、Mol. Cell Biol.、11:3043-3051(1991))、リン酸化されたマウスc-kitのチロシン残基719およびヒトc-kitのチロシン721を介する(Serve, Hら、「Tyrosine residue 719 of the c-kit receptor is essential for binding of the P85 subunit of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase and for c-kit-associated PI 3-kinase activity in COS-1 cells」、J. Biol. Chem.、269:6026-6030(1994))。
【００８１】
c-kitシグナル伝達は、ヒト造血細胞、主にMO7eおよびCMKのふたつの巨核球細胞株において研究されている(前記表I)。
【００８２】
これらの細胞において、SCFは、主要なキナーゼ、例えばPI3キナーゼ、Srcキナーゼ(FynおよびLyn)およびJAK2、ならびに様々なアダプター分子、Grb2、Grap、Vav、CRKLの、それらのSH2ドメインを介した、活性化および／または動員を誘導する。これらの事象は、SH2、SH3、またはPHドメインを介した様々な分子会合の形成を生じ、これは次に異なる経路で活性化を開始する。Ras経路は、SCF刺激に反応して活性化されたことが示され、これはRasとRaf-1の間の相互作用につながり、その結果、MAPキナーゼカスケードを開始する(Tauchi, Tら、「The ubiquitously expressed Syp phosphatase interacts with c-kit and Grb2 in hematopoietic cells」、J. Biol. Chem.、269:25206-25211(1994))。
【００８３】
実際アダプター分子であるGrapは、リガンド活性化されたc-kitと、そのSH2ドメインを介して相互作用し、ならびにグアニンヌクレオチド交換因子mSos1とそのSH3ドメインを介して会合され、受容体および細胞質チロシンキナーゼからのシグナルを、rasシグナル伝達経路と結合させる(Feng, G.Sら、「Grap is a novel SH3-SH2-SH3 adaptor protein that couples tyrosine kinases to the Ras pathway」、J. Biol. Chem.、271:12129-12132(1996))。別のアダプター分子は、Grap、Grb2に関連し、そのSH2ドメインを介してc-kitのリン酸化されたチロシン残基と相互作用し、これはc-CblおよびShcを動員することができる(Briizi, M.Fら、「Discrete protein interactions with the Grb2/c-Cb1 complex in SCF- and TPO-mediated myeloid cell proliferation」、Oncogene、13:2067-2076(1996)；ならびに、Wisniewski, D.、Strife, A.、Clarkson, B.、「c-kit ligand stimulates tyrosine phosphorylation of the c-Cb1 protein in human hematopoietic cells」、Leukemia、10:1436-1442(1996))。活性化後、キナーゼは、c-CblおよびCRKLと相互作用するPI3-キナーゼのようなアダプター分子の役割を果たすか(Sattler, M.ら、「Steel factor induces tyrosine phosphorylation of CRKL and binding of CRKL to a complex containing c-kit, phosphatidylinositol 3-kinase, and p120 (CBL)」、J. Biol. Chem.、272:10248-10253(1997))、もしくはAktをリン酸化するPI3-キナーゼのようなキナーゼの役割を果たす(Blume-Jensen, Pら、「The kit receptor promotes cell survival via activation of PI 3-kinase and subsequent Akt-mediated phosphorylation of Bad on Ser136」、Curr. Biol.、8,779-782(1998))ことができる。
【００８４】
いくつかの場合において、相互作用および／または活性化が、周知のシグナル伝達経路のいずれとも結びつけられることなく説明されている。これは、Tecの場合(Tang. Bら、「Tec kinase associates with c-kit and is tyrosine phosphorylated and activated following stem cell factor binding」、Mol. Cell. Biol.、14:8432-8437(1994))、MATKの場合(Jhun, B.H.ら、「The MATK tyrosine kinase interacts in a specific and SH2-dependent manner with c-kit」、J. Biol. Chem.、270:9661-9666(1995))、Vavの場合(Alai, Mら、「Steel factor stimulates the tyrosine phosphorylation of the proto- oncogene product, p95vav, in human hemopoietic cells」、J. Biol. Chem.、267:18021-18025(1992))、およびDocの場合(Carpino, N.ら、「p62(dok)：a constitutively tyrosine-phosphorylated, GAP-associated protein in chronic myelogenous leukemia progenitor cells」、Cell、88:197-204(1997))である。
【００８５】
予想外のことに、c-kit活性化の期間のJAK-STAT経路についてはよく説明されていない。JAK2は、非チロシンキナーゼサイトカイン受容体スーパーファミリーシグナル伝達に必須である細胞質チロシンキナーゼであるが、これはリガンド活性化前に、c-kitとの物理的会合について説明され、SCFに反応してチロシン残基においてリン酸化されるか(Brizzi, M.ら、「Convergence of signaling by interleukin-3, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and mast cell growth factor on JAK2 tyrosine kinase」、 J. Biol. Chem.、269:31680-31684(1994)；Weiler, S.R ら、「JAK2 is associated with the c-kit proto-oncogene product and is phosphorylated in response to stem cell factor」、Blood、87:3688-3693(1996)；および Linnekin, D.ら、「JAK2 is constitutively associated with c-Kit and is phosphorylated in response to stem cell factor」、Acta Haematol.、95:224-228(1996))、または c-kitと会合されない。加えて、SCFは、MO7e細胞株におけるSTAT1のような細胞質転写因子を活性化する(Deberry, C.ら、「Statl associates with c-kit and is activated in response to stem cell factor」、Biochem. J.、327(Pt 1):73-80(1997))。
【００８６】
c-kitシグナル伝達は、様々な非造血系ヒト細胞株においても試験した。Blume-Jensenらは、SCFは、Akt活性化を誘導し、PI3-キナーゼ依存的様式でBadのセリン残基136のリン酸化を媒介したことを明らかにした(Blume-Jensen, P.ら、(1998))。胚性線維芽細胞において行われたインビトロ実験は、PI3キナーゼおよびPLC-γはヒトc-kitのチロシン残基721との会合について、より高い親和性を示すp85/PI3キナーゼと競合することを示している(Herbst, Rら、「Formation of signal transfer complexes between stem cell and platelet-derived growth factor receptors and SH2 domain proteins in vitro」、Biochemistry、34:5911-5979(1995))。H526細胞株(小細胞肺癌、SCLC)において、SCFは、SrcキナーゼのLckの活性化、およびそれのc-kitの傍細胞膜ドメインとのその相互作用を誘導した(Krystal, G.Wら、「Lck associates with and is activated by Kit in a small cell lung cancer cell line: inhibition of SCF-mediated growth by the Src family kinase inhibitor PP1」、Cancer Res.、58:4660-4666(1998))。ヒトメラノーマ細胞株である501 melにおいて、Hemesathらは、SCF刺激は、MAPKの活性化を生じ、次に小眼球症転写因子(Mi)のリン酸化、p300/CBPとの相互作用によるMiトランス活性化のアップレギュレーションを生じることを説明している(Nature、391:298-301(1998))。
【００８７】
興味深いことに、c-kitとインテグリンシグナル伝達経路との間の相互接続が、TF-1細胞株において観察された。SCFは、フィブロネクチン接着性TF-1細胞の広がりを誘導し、SCF非存在下でのpp125 FAKのチロシンリン酸化レベルと比較した場合に、用量依存的方式でpp125 FAKのチロシンリン酸化を増強する。これらの作用は、ウォルトマンニン感受性経路、インテグリン活性化感受性経路に左右される。
【００８８】
c-kit非活性化を考慮すると、ふたつの主要経路が異なる細胞の状況において説明されている。造血細胞において、ひとつの経路はチロシンリン酸化酵素であるSHP-1に関連し、おそらく569位のチロシンリン酸化された残基においてc-kitと相互作用し、これはc-kitのチロシン残基のリン酸化状態をダウンレギュレーションする(Yi. T.、Ihle, J.N.、「Association of hematopoietic cell phosphatase with c-Kit after stimulation with c-Kit ligand」、Mol. Cell. Biol.、13:3350-3358(1993)；Lorenz, U.ら、「Genetic analysis reveals cell type-specific regulation of receptor tyrosine kinase c-Kit by the protein tyrosine phosphatase SHP1」、J. Exp. Med.、184:1111-1126(1996)；Paulson, R.ら、「Signalling by the W/Kit receptor tyrosine kinase is negatively regulated in vivo by the protein tyrosine phosphatase Shp1」、Nat. Genet.、13:309-315(1996)；および Kozlowski, Mら、「SHP-1 binds and negatively modulates the c-Kit receptor by interaction with tyrosine 569 in the c-Kit juxtamembrane domain」、Mol. Cell. Biol.、18:2089-2099(1998))。
【００８９】
リン酸化酵素SHP-2(Syp)の役割は余り分かっていない。MO7e細胞株において活性化したc-kitと会合されたSHP-2は、そのSH2ドメインを介してリン酸化され始め、Grb2と複合体形成することが示されている(Tauchi T.ら、(1994))。このGrb2との結合は、ras/MAPキナーゼ経路活性化および細胞増殖へとつながる。対照的に、c-kitを発現しているBA/F3細胞において、c-kit Y567FへのSHP-2の会合は著しく低下されることが示されている。この場合、SCFに対する過増殖反応が認められ、このことは、SHP-2は、SCFが誘導した増殖をダウンレギュレーションすることを示唆している(Kozlowski, M.ら、(1998))。
【００９０】
ヒトc-kitの活性化および非活性化を、ブタ内皮細胞(PAE)においても研究した。PI3-キナーゼ、PLC-γ、およびRaf/MAPキナーゼカスケードの活性化は、ヒトc-kitでトランスフェクションしたPAE細胞において、SCFに反応することが説明された。これらの細胞において、第一の負のフィードバックループは、PI3-K、PLD、およびPKC経路であり、これはc-kitの741および746位のセリン残基でのリン酸化につながる。第二の非活性化経路は、PI3-キナーゼが誘導したPLD活性化およびホスファチジルコリン(PtdCho)特異的ホスホリパーゼD活性化(PtdCho)PLDであり、これはホスファチジル酸(PtdH)を生成し、PKCのアクチベーターおよびアラキドン酸(D4Ach)前駆体である、ジアシルグリセロール(DAG)へと代謝した(Kozawa, O.ら、「Involvement of phosphatidylinositol 3'-kinase in stem-cell-factor-induced phospholipase D activation and arachidonic acid release」、Eur. J. Biochem.、248:149-155(1997))。これらの執筆者は、SCFは、D4Ach生成の第二の経路である、PLA2活性化を誘導したことも示した。
【００９１】
マウス骨髄由来の肥満細胞(BMMC)において、SCFは、i)PI3-キナーゼ活性化を誘導し、これは次にRac-1およびJnk経路を刺激すること、ならびにii)チロシン567上のSrcキナーゼのFyn(Timokhina, Iら、「Kit signaling through PI 3-kinase and Src kinase pathways: an essential role for Rac1 and JNK activation in mast cell proliferation」、EMBO J.、17:6250-6262(1998))、および、Lyn(Suzuki, T.ら、「Essential roles of Lyn in fibronectin-mediated filamentous actin assembly and cell motility in mast cells」、J. Immunol.、161:3694-3701(1998))への結合およびリン酸化を誘導することが明らかにされた。Koikeらは、腹腔から単離されたラット肥満細胞において、SCFはPLD活性化を誘導し、引き続きタンパク質チロシンキナーゼ経路を介しホスホイノシチド特異的PLC-γ活性化を伴わずに、D4Achを放出したことを示した(Koike, T.ら、「SCF/c-kit receptor-mediated arachidonic acid liberation in rat mast cells. Involvement of PLD activation associated tyrosine phosphorylation」、Biochem. Biophys. Res. Commun.、197:1570-1577(1993)；ならびに、Koike, T.ら、「Stem cell factor-induced signal transduction in rat mast cells. Activation of phospholipase D but not phosphoinositide-specific phospholipase C in c-kit receptor stimulation」、J. Immunol.、151:359-366(1993))。これらの細胞において、Nagaiらは、SCFにおけるPI3-キナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)およびミオシン軽鎖キナーゼの関与は、ヒスタミン放出を誘導することを示した(Nagai, S.ら、「Pharmacological study of stem-cell-factor-induced mast cell histamine release with kinase inhibitors」、Biochem. Biophys. Res. Commun.、208:576-581(1995))。
【００９２】
マウス細胞におけるc-kit非活性化に関してSCFシグナルを減少する別の方法は、c-kit発現のダウンモジュレーションである。YeeらおよびMiyazawaらは、c-kitインターナリゼーションおよびユビキチン化が、c-kitの損なわれていないキナーゼ活性に依存することを示した(Yee, N.ら、「Mechanism of down-regulation of c-kit receptor. Roles of receptor tyrosine kinase, phosphatidylinositol 3'-kinase, and protein kinase C」、J. Biol. Chem.、269:31991-31998(1994)；および Miyazawa, K.ら、「Ligand-dependent polyubiquitination of c-kit gene product: a possible mechanism of receptor down modulation in M07e cells」、Blood、83:137-145(1994))。
【００９３】
BMMCにおいて、c-kitは、PLC-γを活性化し、PI4,5二リン酸のDAGおよびイノシトール-1,4,5三リン酸への加水分解を生じ、これは細胞内Ca++の動員を誘導する。このカルシウム流入は、c-kitインターナリゼーションにとって重要であるように見える。更にPI3-キナーゼ活性化が存在しない場合は、c-kit受容体はインターナリゼーションするが、形質膜内側の近傍に局在化し続ける。注目すべきは、c-kitインターナリゼーションは、PI3キナーゼおよびCa++流入の両方が阻害される場合は、完全に妨害されることである(Gommerman, J.L.ら、「Phosphatidylinositol 3-kinase and Ca2+ influx dependence for ligand- stimulated internalization of the c-Kit receptor」、J. Biol. Chem.、272:30519-30525(1997))。
【００９４】
c-kit依存性有糸分裂のダウンレギュレーションの新規メディエーターは、Socs-1(サイトカインシグナル伝達のサプレッサー)であると考えられる(De Sepulveda, P.ら、「Socsl binds to multiple signalling proteins and suppresses Steel factor- dependent proliferation」、EMBO J.、18:904-915(1999))。SCFは、Socs-1の合成を誘導し、これはそのSH2ドメインを介してc-kitへ結合する。Socs-1活性の機構は、そのGrb2との相互作用およびVavのN末端の負の調節に関連しているように見える(Blechman, J.ら、「Structure-function analyses of the kit receptor for the steel factor」、Stem Cells、(Dayt)、11(Suppl 2):12-21(1993))。
【００９５】
c-kit突然変異に関連した分子機能不全
酵素機能およびc-kit突然変異
SHP-1発現は、IC2/c-kit野生型細胞とIC2/c-kitD814Y細胞では異なり、これは更にマウス肥満細胞の顆粒内に存在するプロテアーゼであり、肥満細胞突然変異の様々な段階において差次的に発現されるMMCP-4およびMMCP-6のような他のタンパク質についても真実である。実際、MMCP-6転写産物は、外因性SCFの存在下IC2/c-kit野生型細胞において低レベルで発現され、このレベルはc-kitD814Y発現の結果として増大した。MMCP-4転写産物は、IC2/c-ki野生型 T細胞におけるRT-PCRでは検出できなかったが、IC2/c-kitD814Y細胞では豊富に発現された。これらの野生型と突然変異体の間で認められた差異は、SCFにより刺激されたc-kit野生型およびc-kitD814Yにより伝達されたシグナルは同等でないことを示唆している：突然変異c-kitD814Yは、肥満細胞の増殖を変更するのみではなく、それらの突然変異の段階も変更する。
【０００１】
本発明は、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定および選択することを可能にするスクリーニング法であり、ここでその化合物は、肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などに重大な毒性を示さない方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満細胞(MC)は、CD34、c-kitおよびCD13抗原を発現している造血幹細胞の特定のサブセットに由来した組織要素である(Kirshenbaumら、Blood、94:2333-2342(1999)；および、Ishizakaら、Curr Opin Immunol.、5:937-43(1993))。未熟なMC前駆細胞は、血流中を循環し、組織において分化する。これらの分化および増殖過程は、サイトカインの影響下にあり、その中で最も重要なものは幹細胞因子(SCF)であり、その受容体はc-kitである。
【０００３】
肥満細胞は、関連する組織の配置および構造のみではなく、機能的および組織化学的レベルでの、それらの不均一性により特徴付けられる(AldenborgおよびEnerback.、Histochem. J.、26:587-96(1994)；Braddingら、J Immunol.、155:297-307(1995)；Iraniら、J. Immunol.、147:247-53(1991)；Millerら、Curr Opin Immunol.、1:637-42(1989)；および、Welleら、J. Leukoc Biol.、61:233-45(1997))。実際、少なくとも3種の異なる肥満細胞亜型がヒトにおいて存在し、これらは、それらの形態学的外観、それらの組織配置、それらの生化学的含有物、および様々な化合物に対するそれらの反応性が異なる。これら3種の異なる肥満細胞亜型は中性プロテアーゼ含量により区別される。トリプターゼ(T)のみを含有する肥満細胞はMCTと称される一方で、トリプターゼおよびキマーゼ(C)を含有するMCはMCTCとして知られている。加えて、少数の肥満細胞は、キマーゼのみを発現し、トリプターゼは発現せず、MCCと称される(Liら、J. Immunol.、156:4839-44(1996))。それらの機能に関して、既にかなり研究された即時型過敏症に関連した細胞としてのそれらの役割に加え、最近の研究は、肥満細胞は抗原提示細胞として、および生物の抗炎症性防御に高度に関連した要素としての、ふたつの主要な生理的特性を有することを示すことができた(AbrahamおよびArock、Semin Immunol.、10:373-381(1998)；ArockおよびAbraham、Infection Immunity、66:6030-4(1998)；Galliら、Curr Opin Immunol.、11:53-59(1999))。
【０００４】
より最近になって、本出願人は、肥満細胞は、これまで考えられていたものよりも遙かに大きく広がる多くの病理に関連していることを発見した。これに関し、本出願人は、米国特許第60/301,408号、第60/601,409号、第60/301,411号、第60/301,407号、第60/301,406号、第60/323,312号、第60/301,410号、第60/323,315号、第60/301,405号、第60/601,409号、および第60/301,404号を出願している。
【０００５】
患者の組織に存在する肥満細胞は、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、腫瘍血管新生、炎症疾患、多発性関節炎、炎症性腸疾患(IBD)、および間質性膀胱炎のような疾患の発生に関連またはその原因となっていることが発見された。これらの疾患全てにおいて、肥満細胞が、様々なプロテアーゼおよびメディエーター類(例えばヒスタミン、プロテオグリカン、中性プロテアーゼ)、脂質由来のメディエーター類(プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン)、ならびに様々なサイトカイン類(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF、MIP-1a、MlP-1b、MIP-2、およびIFN-γ)のカクテルの放出により組織破壊に参画していることは自明のことである。
【０００６】
このような理由で、これらの疾患に寄与する肥満細胞を枯渇するためにc-kitを標的とすることが提唱されている。この方法は非常に有望であるが、本出願人は更に特異的に肥満細胞を枯渇することを進め、かつここで提唱している。実際c-kitは、他の造血細胞または非造血細胞においても発現されている。肥満細胞枯渇に関する特異性を増強することは非常に興味深く、前記疾患治療の新規経路を開くことができるであろう。これは例えば、自己免疫疾患の治療について例証することができる。当技術分野において、免疫抑制剤のみが相対的な効能を示しているが、これらは患者の全身の健康を危険に曝し、いくつかの症例においては高い死亡率に関連している大きな副作用がある。
【０００７】
本明細書で以下に定義された方法は、前記疾患の中心にある非常に特異的な免疫系の亜成分である肥満細胞を標的とするが、患者の全身の健康に影響を及ぼすことなく排泄され得るので、当技術分野において提唱されているものと比べてテーラーメード治療を提供することができるであろう。
【発明の開示】
【０００８】
説明
従って本発明は、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定する方法を目的とし、ここでこの化合物は、肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などにとって無毒であり：
a)肥満細胞をインビトロにおいて適当な培養培地内で培養する工程；
b)その培養培地に少なくとも1種の試験される候補化合物を添加し、細胞を延長された期間インキュベーションする工程；
c)化合物が肥満細胞の死または破壊を促進し、肥満細胞増殖を妨害または阻害する程度を測定し、ならびに肥満細胞の枯渇が観察された化合物を選択する工程；
d)肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などから選択された細胞の有意な死を促進することができない、工程c)において選択された化合物のサブセットを同定する工程を含む方法である。
【０００９】
別の表現をすると、本発明は、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定する方法であり、ここでその化合物は肥満細胞ではない他の造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などにとって無毒であり：
a)肥満細胞の培養物を提供する工程であり、ここで肥満細胞は、野生型肥満細胞およびそれらに由来した細胞株、活性化された突然変異体肥満細胞株、ならびに活性化された野生型肥満細胞およびそれらに由来した細胞株から選択される工程；
b)細胞の培養物を、少なくとも1種の候補化合物と、肥満細胞の増殖および／または生存を許す条件下で接触し、候補化合物存在下での細胞死のレベルを測定し；ならびに、候補化合物存在下での細胞死レベルを、候補化合物非存在下での細胞死レベルと比較し、ここで候補化合物の存在下での細胞死レベルの増加が、候補化合物の肥満細胞枯渇能の指標である工程；
c)肥満細胞以外の少なくとも1種の細胞の培養物を提供する工程であり、ここでその細胞は、肥満細胞ではない造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などから選択される工程；
d)細胞の培養物を、工程b)で同定された少なくとも1種の化合物と、工程c)で説明された細胞の増殖および／または生存を許す条件下で接触し、その化合物存在下での細胞死のレベルを測定し；ならびに、化合物存在下での細胞死レベルを、化合物非存在下での細胞死レベルと比較し、ここでこの化合物存在下での細胞死レベルに有意な増加がないことは、この化合物の少なくとも他の造血細胞に対する肥満細胞枯渇特異性の指標である工程を含む方法に関する。
【００１０】
前記方法の枠内で使用することができる肥満細胞の中でも、本発明者らは以下のものを挙げることができる：
SCF依存性細胞：
a)ヒト臍帯血から得られた血液を起源とする細胞。これに関して、臍帯血由来のヘパリン処理した血液は、Ficoll勾配上で遠心され、他の血液成分から単核細胞が単離される。次にCD34+前駆細胞は、前述の単離された細胞から免疫磁気選択システムMACS(Miltenyi biotech社)を用いて精製される。その後CD34+細胞は、培地MCCM(L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5x10-5Mβ-メルカプトエタノール、20％ウシ胎仔血清、1％ウシ血清アルブミンおよび、100ng/ml組換えヒトSCFを補充したα-MEM)において、濃度105個細胞/ml、37℃、5％CO2大気中で、培養される。培地は、5から7日毎に交換される。この培養物中に存在する肥満細胞の割合は、May-Grunwalギムサまたはトルイジンブルー染色を用い、毎週評価される。抗トリプターゼ抗体も、培養物中の肥満細胞検出に使用することができる。10週間培養した後、純粋な肥満細胞の細胞集団(＞98％)が得られる。
【００１１】
b)a)において得られる細胞由来の細胞株。常法を用い、前述のように確立された細胞株をトランスフェクションするためにc-kitを発現しているベクターを調製することは可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenらの論文に説明されている(EMBO J.、6(II):3341-3351(1987))(同じく配列番号:1参照のこと)。c-kitのコード部分(3000bp)は、下記のオリゴヌクレオチドを用いてPCRにより増幅され、クローニングされる：
【００１２】
ベクターMigr-1(ABC社)を、成熟肥満細胞のトランスフェクションに使用するためのレトロウイルスベクター構築のための基本として使用することができる。このベクターは、IRESの3'末端にGFPをコードしている配列を含むので都合がよい。これらの特徴は、フルオロサイトメーターによる直接分析を用い、レトロウイルスに感染した細胞の選択を可能にする。前述のように、c-kit cDNAのN-末端は、内因性c-kitから異種を識別するのに有用であるFlag配列を導入するために修飾することができる。
【００１３】
c)肥満細胞株：
野生型または突然変異型c-kitを発現している(傍細胞膜および触媒部位)BaF3マウス細胞は、Kitayamaら(Blood、88:995-1004(1996))およびTsujimuraら(Blood、93:1319-1329(1999))の論文に説明されている。この細胞株は、ペニシリン、ストレプトマイシン、L-グルタミン、10％ウシ胎仔血清(FBS)、およびIL-3を補充した、RPMI 1640培地において増殖することができる。
【００１４】
c-kit野生型またはc-kitD814Yのいずれかを発現しているIC-2マウス細胞は、Piaoらの論文(Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93:14665-14669(1996))に示されている。
【００１５】
d)IL-3非依存性細胞株は以下である：
HMC-1は、肥満細胞性白血病患者由来の因子非依存性細胞株であり、構成的キナーゼ活性を有する傍細胞膜突然変異体c-kitポリペプチドを発現している(Furitsu Tら、J. Clin. Invest.、92:1736-1744(1993)；Butterfieldら、「Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia」、Leuk Res.、12:345-355(1988)；および、Nagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、92:10560-10564(1995))。
【００１６】
P815細胞株(814位でc-kit突然変異を天然に発現している肥満細胞腫)は、Tsujimuraらの論文(Blood、83:2619-2626(1994))に説明されている。この細胞株は、ATCCから寄託番号TIB-64で入手可能である。
【００１７】
e)ATCCから入手可能なその他の肥満細胞株：
従って好ましい態様において、本発明は前述の方法に関し、ここで肥満細胞は単離された肥満細胞およびそれら由来の細胞株、BaF3、IC-2マウス細胞、HMC-1、ATCC寄託番号 TIB-64で入手可能なP815、ATCC寄託番号CRL-2034で入手可能な10P2、ATCC寄託番号CRL-2036で入手可能な10P12、ATCC寄託番号CRL-2037で入手可能な11P0-1、ならびにそれら由来の細胞株から選択される。
【００１９】
加えて、本発明の方法に関連して、肥満細胞は、MCC、MCTC、MCTから選択することができる。
【００２０】
別の好ましい態様において、肥満細胞ではない造血細胞または関連した細胞もしくは細胞株は、下記からなる群から選択することができる：
ヒトTリンパ球Jurkat細胞株(ATCC番号TIB-152およびそれら由来の細胞株)、
ヒトBリンパ球DaudiまたはRaji細胞株(各々、ATCC番号CCL-213およびCCL-86ならびにそれら由来の細胞株)、
ヒト単球U937細胞株(ATCC番号CRL-1593.2)、および
ヒトHL-60細胞株(ATCC番号CCL-240)、それら由来の細胞株(ATCC番号CRL-2258およびCRL-2392)。
【００２１】
先に説明したように、本方法は、これらの造血細胞の1種または数種のいずれかで行うことができる。好ましい化合物は、その他の造血細胞に対する肥満細胞に関して最大の効能および特異性を明らかにする化合物である。
【００２２】
更に別の好ましい態様において、対照細胞は、SCF以外のサイトカインカクテルを含有する培養培地において増殖された正常ヒトCD34+細胞から選択される。好ましい化合物は、これらのSCF非依存性CD34+細胞に対する肥満細胞に関して最大の効能および特異性を明らかにする化合物である。
【００２３】
効能に関して、本発明の化合物は、濃度10μM未満、好ましくは5、4、2または1μM未満で、それらの肥満細胞枯渇能について選択される。
【００２４】
最良の化合物は、先に示した化合物のサブセットであり、これは、濃度範囲1、2、3、4、5μMから10μMでは、肥満細胞以外の造血細胞の生存度には有意に影響しない。本発明は、これらの化合物の中でも濃度範囲10〜15μM、15〜20μM、または20〜40μMで、生存力の喪失がない化合物を特に指定している。
【００２５】
効能／選択性の比は、下記式を用い、前述のデータで説明することができる：
E/S比＝肥満細胞のIC50／肥満細胞以外の造血細胞のIC50
【００２６】
最良の化合物は、最低のE/S比を示す化合物であり、例えばE/S比が1/1000から1/5、1/1000から1/100、1/100から1/50、1/100から1/10、1/50から1/10、1/25から1/10、または1/20から1/5の範囲の化合物である。
【００２７】
細胞死アッセイ法は、細胞増殖アッセイ法、細胞生存度アッセイ法および／またはアポトーシスアッセイ法をさらに含む。
【００２８】
例えば、細胞死の程度は、3Hチミジン取込み、トリパンブルー排除能法、ヨウ化プロピジウムの使用、または51Cr-放出アッセイ法により測定することができる。
【００２９】
あるいは、細胞死の程度は、好ましくは蛍光カルセインおよびエチジウムホモダイマー1を使用し、細胞内エステラーゼ活性試験、および形質膜完全性試験により決定される。これらの試験は、J. Neurosci、15:5389(1995)、J. Cell Sci.、106:685(1993)に説明されている。詳細なプロトコールは、Molecular Probes社カタログ製品番号L-3224(Live/Dead(登録商標)キット)に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。基本的に、カルセインAMは、細胞-透過性エステラーゼ基質であり、これは酵素活性により高度に蛍光性のカルセインに転換されるまでは非蛍光性である。これは、強い緑色蛍光を発している生細胞内に維持され続ける。エチジウムホモダイマー1蛍光は、核酸結合時に増強される。明るい赤色蛍光が放出される。この色素は無傷の形質膜を通過することはできないが、死細胞の中には侵入する。従って生細胞は緑色であるが、死細胞は赤色蛍光を放出する。この技術をCDDカメラおよびプレートリーダーと組合せることで、ハイスループットスクリーニングにつながる。
【００３０】
別の態様において、細胞死の程度は、DiOC18およびヨウ化プロピジウムを用い、生細胞と死細胞の間の識別により決定される。プロトコールは、Molecular Probes社カタログ製品番号L-7010(Live/Dead(登録商標)キット)に詳細に説明されており、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００３１】
更に別の態様において、細胞死はカスパーゼ活性試験を用い決定することができる。カスパーゼは、アポトーシス活性化において重要な役割を果たす。Molecular probe社キットE-13183(EnzCheckカスパーゼ-3アッセイキット(登録商標)、Molecular Probe社)は、特にJurkat細胞の試験に有用である。ホスファチジル曝露もこれに関して使用することができる。この方法は、Dan Sらの論文「Selctive induction of apoptosis in Philadelphia chromosome-positive chronic myelogenous leukemia cells by an inhibitor of BCR-ABL tyrosine kinase CGP 57148」(Cell Death Differ.、5:710-715(1998))において使用されている。
【００３２】
更に別の態様において、細胞死はHL-60細胞の指示薬として有用であることが説明されている、Molecular Probe社のJC-1またはJC-9カチオン性色素を用いる、ミトコンドリア膜脱分極試験を用い決定することができる。
【００３３】
細胞増殖アッセイ法については、MTSテトラゾリウム(Cell Titer96 Aqueous；Promega社、マジソン、WI)を用い行うことができる。この試験は、生細胞数を測定することができる。
【００３４】
前述の全ての細胞死試験において、本発明は、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光マイクロプレートリーダー、および／またはフローサイトメーターを用いる、細胞生存度および細胞毒性の蛍光光度アッセイ法を包含している。
【００３５】
更に本出願人は、先に出願した米国特許第60/301,404号において、c-kitは肥満細胞枯渇に関する関心対象の標的であることを示している。ここでは、この受容体の下流のシグナル伝達経路のインヒビターを試験することがより詳細に提唱されている。実際、シグナル伝達に関連している全てのチロシンキナーゼの中で、それらの1種または数種が、肥満細胞ではない他の造血細胞に対する肥満細胞についてより特異的であるかまたはアップレギュレーションされていることがある。
【００３６】
これに関して、試験される化合物は、チロシンキナーゼのインヒビター、例えばAkt、c-Cbl、CRKL、Doc、p125 Fak、Fyn、Grap、Jak2、Lyn、MAPK、MATK、PI3-K、PLC-γ、Raf1、Ras、SHP-1、SHP2(Syp)、Tec、Vav、およびFlt-3(下記表1参照)から選択することができる。
【００３７】
（表1）ヒトc-kitの細胞内部分と相互作用するかおよび／またはSCFに反応して活性化される分子
関心対象の化合物は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、またはヘテロ環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換されたピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシ化合物、およびベンジルホスホン酸化合物を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
本発明はまた、前述の方法により入手可能な化合物にも関し、ここでその化合物は肥満細胞を枯渇することが可能であり、および他の造血細胞に対する重大な毒性を有さない。好ましくはこのような化合物は、E/S比の範囲が、1/1000〜1/5、1/1000〜1/100、1/100〜1/50、1/100〜1/10、1/50〜1/10、1/25〜1/10、または1/20〜1/5である。
【００４０】
本発明の別の局面は、医薬品製造のための前記化合物の使用に関する。このような医薬品は、経口投与のための薬学的組成物の形状をとることができ、これは、当技術分野において周知の薬学的に許容できる担体を用い、経口投与に適した用量で処方することができる。このような担体は、患者が服用するために、薬学的組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして処方することが可能である。これらの薬学的組成物は、活性成分に加え、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および助剤を含む、適当な薬学的に許容できる担体を含有しても良い。処方および投与技術に関する更なる詳細については、「Remington's Pharmaceutical Sciences」最新版(Maack Publishing社、イーストン、Pa)に見ることができる。
【００４１】
このような医薬品は、外用投与のための薬学的組成物または化粧品組成物の形をとることができる。このような本発明の組成物は、ゲル剤、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、水性懸濁剤、水性アルコールもしくは油性の液剤、またはローションもしくは血清型の分散剤、または無水もしくは凍結乾燥したゲル剤、または水相中に脂肪相もしくはその逆の分散により得られたミルク型の液体もしくは半固形のコンシステンシーの乳剤、またはクリームもしくはゲル型の軟質の半固形コンシステンシーの懸濁剤もしくは乳剤、あるいはマイクロエマルション、マイクロカプセル、微粒子、またはイオン性および／もしくは非イオン性型の小胞分散剤の形で存在することができる。これらの組成物は標準的方法に従い調製される。
【００４２】
本発明の組成物は、皮膚科および化粧品において通常使用される任意の成分を含有する。これは、親水性または親油性ゲル化剤、親水性または親油性活性物質、保存剤、皮膚軟化剤、増粘性ポリマー、保湿剤、界面活性剤、保存剤、酸化防止剤、溶媒、ならびに充填剤、酸化防止剤、溶媒、香料、充填剤、スクリーニング剤、殺菌剤、消臭剤、および着色物質から選択された少なくとも1種の成分を含有することができる。
【００４３】
本発明において使用することができる油分として、鉱油(流動パラフィン)、植物油(シアバターの液体画分、ヒマワリ油)、動物油、合成油、シリコーン油(シクロメチコーン)、およびフッ素化された油を意味することができる。脂肪族アルコール、脂肪酸(ステアリン酸)、およびワックス(パラフィン、カルナバ、蜜蝋)も、脂肪物質として使用することができる。
【００４４】
本発明において使用することができる乳化剤としては、ステアリン酸グリセロール、ポリソルベート60、およびPEG-6/PEG-32/ステアリン酸グリコール混合物が企図されている。親水性ゲル化剤としては、カルボキシビニルポリマー(カルボマー)、アクリル系コポリマー、例えばアクリレート／アルキルアクリレートコポリマー、ポリアクリルアミド、多糖類、例えばヒドロキシプロピルセルロース、クレイ、および天然ゴムを挙げることができ、ならびに親油性ゲル化剤としては、改質クレイ、例えばベントン、脂肪酸の金属塩、例えばステアリン酸アルミニウム、および疎水性シリカ、あるいはエチルセルロースおよびポリエチレンを挙げることができる。
【００４５】
親水性活性物質としては、タンパク質またはタンパク質の加水分解産物、アミノ酸、ポリオール、尿素、アラントイン、糖質および糖誘導体、ビタミン、デンプンおよび植物抽出物、特にアロエ抽出物、を使用することができる。
【００４６】
親油性活性物質としては、レチノール(ビタミンA)およびその誘導体、トコフェノール(ビタミンE)およびその誘導体、必須脂肪酸、セラミド、ならびに精油を使用することができる。これらの物質は、使用時に余分の湿潤化または皮膚軟化の特徴が追加される。
【００４７】
加えて、肥満細胞枯渇を可能にする化合物、例えばチロシンキナーゼインヒビター、好ましくはc-kitインヒビターのより深部への浸透を提供するために、界面活性剤をこの組成物中に含有することができる。
【００４８】
企図された成分の中で、本発明は、例えば鉱油、水、エタノール、トリアセチン、グリセリン、およびプロピレングリコールからなる群より選択された浸透増強剤；例えばポリイソブチレン、ポリ酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される粘着剤、ならびに増粘剤を包含している。
【００４９】
薬剤の外用吸収を増大する化学的方法は、当技術分野において周知である。例えば、浸透増強特性を持つ化合物は、ラウリル硫酸ナトリウム(Dugard, P. H.およびSheuplein, R. J.、「Effects of Ionic Surfactants on the Permeability of Human Epidermis: An Electrometric Study」、J. Ivest. Dermatol.、60:263-69(1973))、ラウリルアミン酸化物(Johnsonら、米国特許第4,411,893号)、アゾン(Rajadhyaksha、米国特許第4,405,616号および第3,989,816号)、ならびにデシルメチルスルホキシド(Sekura, D. L.およびScala, J.、「The Percutaneous Absorption of Alkylmethyl Sulfides」、Pharmacology of the Skin, Advances In Biolocy of Skin、(Appleton-Century Craft)、12:257-69(1972))を含む。両性分子の頭部の基(head group)の極性の増加は、それらの浸透増強特性を増大するが、それらの皮膚刺激特性の増加が犠牲になっていることは認められている(Cooper, E. R.およびBerner, B.、「Interaction of Surfactants with Epidermal Tissues: Physiochemical Aspects」、Surfactant Science Series、16巻、Reiger, M. M.編集(Marcel Dekker社)、195-210頁、1987年)。
【００５０】
化学増強剤の第二の種類は、一般に補助溶剤と称されている。これらの物質は外用で比較的容易に吸収され、および様々な機構により、このような薬剤の浸透増強を実現する。エタノール(Galeら、米国特許第4,615,699号、ならびにCampbellら、米国特許第4,460,372号および第4,379,454号)、ジメチルスルホキシド(米国特許第3,740,420号および第3,743,727号、ならびに米国特許第4,575,515号)、およびグリセリン誘導体(米国特許第4,322,433号)は、様々な化合物の吸収を増強する能力を示す化合物のほんの数例である。
【００５１】
本発明の薬学的組成物は、患者気道の標的領域へのエアロゾル処方での投与を意図することもできる。薬剤処方のエアロゾルの一吹き(burst)を送達する装置および方法は、米国特許第5,906,202号に開示されている。処方は好ましくは液体であり、例えば水溶液、エタノール溶液、水性／エタノール性溶液、生理食塩水溶液、コロイド状懸濁液、および微晶質懸濁液などである。例えば、好ましくは柔軟な多孔質膜の形であるようなノズルを通して処方を推進する際に形成されるエアロゾル化された粒子は、前述の活性成分および担体(例えば、薬学的活性のある呼吸器系薬剤および担体)を含有する。これらの粒子は、粒子が形成された場合に、患者がこれらの粒子を患者肺へと吸入することができるような十分な時間、空気中に懸濁され続けるのに十分な小さいサイズを有する。
【００５２】
本発明は、米国特許第5,556,611号に開示されている下記システムを包含している：
加圧容器内の液体ガスシステム(液化ガスが、噴射剤ガス(例えば、低沸点FCHCまたはプロパン、ブタン)として使用される
懸濁エアロゾル(活性物質粒子は液体噴射剤相中に固体形で懸濁されている)
加圧ガスシステム(窒素、二酸化炭素、一酸化二窒素、空気などの圧縮されたガスが使用される）
【００５３】
従って本発明において、活性物質が適当な無毒の媒体中に溶解または分散され、この溶液または分散液がエアロゾルに霧状とされている、すなわち担体ガス中に極めて細かく分布されているような薬学的調製物が製造される。これは例えば、特に正確な個別用量が可能であるような、液体噴霧および固形物霧状化のための、それ自身公知のエアロゾル噴射ガスパック、ポンプ式エアロゾル、またはその他の装置の形で技術的に可能である。従って本発明は、先に定義された化合物およびそのような処方を含む、好ましくは用量計量用バルブを備えたエアロゾル装置にも関する。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は鼻腔内投与を意図することもできる。これに関して、鼻粘膜表面への化合物投与のための薬学的に許容できる担体は、当業者には容易に理解されるであろう。このような担体は、単に一例として、「Remington's Pharmaceutical Sciences」16版、1980年、Arthur Osol編集に明らかにされており、これは本明細書に参照として組入れられている。
【００５５】
適当な担体の選択は、企図される投与の具体的種類に応じて決まる。上気道を介した投与のためには、この組成物は、溶液、例えば水または等張生理食塩水（緩衝したまたはしていないもの）、または懸濁液として、鼻腔内投与のための、液滴または噴霧剤として処方することができる。好ましくは、このような溶液または懸濁液は、鼻分泌物に対して等張、および同じpH範囲、例えば約pH4.0〜約pH7.4、またはpH6.0〜pH7.0である。緩衝液は、生理的に相溶性があり、単に一例としてはリン酸緩衝液である。例えば代表的鼻充血除去剤は、pHが約6.2になるように緩衝されていることが説明されている(Remington's、上記、1445頁)。当然当業者は、鼻および／または上気道投与への無害の水性担体に関し適当な生理食塩水含量およびpHを容易に決定することができる。
【００５６】
一般的な鼻腔内の担体は、粘度が例えば約10〜約3000cps、または約2500〜6500cps、またはそれよりも大きい、鼻用ゲル剤、クリーム剤、パスタ剤、または軟膏剤を含み、鼻粘膜表面とのより持続的な接触を提供するために使用することもできる。このような担体の粘性処方は、単に一例として、高粘性であることが当技術分野において周知である、アルキルセルロースおよび／または他の生体適合性担体を基にすることができる(例えばRemington's、上記、を参照のこと)。好ましいアルキルセルロースは、例えば濃度範囲が担体100mlあたり約5〜約1000mgまたはそれよりも多いメチルセルロースである。より好ましいメチルセルロース濃度は、単に一例として、担体100mlにつき約25〜約mgである。
【００５７】
当技術分野において公知の保存剤、着色剤、滑沢剤または粘性の鉱油もしくは植物油、香料、天然もしくは合成の植物抽出物、例えば香油、ならびに湿潤剤および増粘剤（例えばグリセロールなど）のようなその他の成分も、この処方に更なる粘性、保湿性、ならびに好ましい質感および臭気を提供するために含有することができる。本発明の液剤または懸濁剤の鼻腔内投与については、液滴(drop)、小滴(droplet)、および噴霧剤を作製するために様々な装置を当技術分野において利用することができる。
【００５８】
液滴または噴霧剤として送達するための溶液または懸濁液を含有する点滴器または噴霧装置を含む、予め測定された単位用量の分注装置は、投与される薬剤の1回または複数回用量を含むように調製され、これは本発明の別の目的である。本発明は更に、適量の水を添加することにより液剤または懸濁剤を容易に調製するために、1種または複数の単位用量の脱水された化合物を、いずれか必要な塩および／または緩衝剤、保存剤、着色剤などと共に含有するキットも含む。
【００５９】
更に別の局面において、本発明は先に説明した方法により入手可能な化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類へ投与することを含む、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、骨量減少、腫瘍血管新生、炎症疾患、炎症性腸疾患(IBD)、間質性膀胱炎、肥満細胞症、感染症、およびCNS障害から選択された疾患を治療する方法を目的としている。
【００６０】
更なる局面において、本発明は先に説明した方法により入手可能な化合物を、そのような治療を必要とするヒトへ投与することを含む、毛髪生長および毛髪色の回復を促進する方法を企図している。
【００６１】
更に別の局面において、本発明は、多発性硬化症、乾癬、腸炎症疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチおよび多発性関節炎、限局性および全身性強皮症、全身性エリスマトーデス、円板状エリスマトーデス、皮膚エリスマトーデス、皮膚筋炎、多発性筋炎、シェーグレン症候群、結節性汎動脈炎、自己免疫性腸疾患、増殖性糸球体腎炎、脈管炎、活動性慢性肝炎および慢性疲労症候群を治療するための先に定義した方法を包含している。
【００６２】
更なる別の局面において、本発明は、腎臓、膵臓、肝臓、心臓、および肺を含む任意の臓器移植における、移植片-対-宿主疾患または移植片拒絶反応を治療するための先に定義した方法を包含している。
【００６３】
別の局面において、本発明は、アフタ性潰瘍のような表皮下水疱形成障害、ならびに天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および瘢痕性類天疱瘡などのようないくつかの水疱性疾患を治療するための先に定義された方法を包含している。この方法は更に、好ましくはダプソン、アザチオプリン、エリスロマイシン、プロピオニルエリスロマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、およびメクロサイクリン(mechlocycline)から選択された、少なくとも1種の抗生物質を含有することができる。
【００６４】
本発明は同じく、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシー症候群、じんま疹、血管性水腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性細静脈炎、昆虫の咬傷による皮膚炎症、および吸血寄生生物外寄生を治療するための、先に説明された方法にも関連している。
【００６５】
本発明は、特にイヌおよびネコにおける、皮膚アレルギー性障害、例えば、じんま疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性細静脈炎、昆虫の咬傷による皮膚炎症、および吸血寄生生物外寄生を治療するための、先に説明された方法にも関連している。
【００６６】
従って、この化合物は、患者の気道、鼻腔内の標的部位へエアロゾル処方でまたは局所的処方で投与される。
【００６７】
更に別の局面において、本発明はヒトにおける腫瘍血管新生を治療するため、先に定義された方法を包含している。
【００６８】
本発明は同じく、肥満細胞症、色素性じんま疹を含む顕著な皮膚肥満細胞症、びまん性皮膚肥満細胞症、単発性肥満細胞腫および水疱、紅斑性および末梢血管拡張性肥満細胞症に関連した、ヒトにおける皮膚疾患を治療するために加え、肥満細胞性白血病を含むIV型肥満細胞症を治療するための、先に説明した方法に関する。
【００６９】
特定の態様は、イヌの肥満細胞腫を治療することに関する。
【００７０】
更に別の局面において、本発明は、クローン病、粘膜炎、潰瘍性大腸炎、および壊死性腸炎のような、炎症性腸疾患(IBD)を治療するための、先に説明した方法を包含している。
【００７１】
本発明は更に、ヒトにおける間質性膀胱炎を治療するため、哺乳類、特にヒトにおける細菌感染症を治療するため、好ましくは再発性細菌感染症、細菌性膀胱炎のような無症候期間後に再発する感染症の治療のために、先に説明した方法を企図している。
【００７２】
より詳細に述べると、本発明は大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルケセンス、シトロバクター・フロインディー、およびネズミチフス菌を含む、グラム陰性腸内細菌のような、FimH発現性細菌感染症を治療するために実践することができる。
【００７３】
この細菌感染症を治療する方法においては、バシトラシン、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンのようなマクロライド系抗生物質；フルオロキノロン、アクチノマイシン、スルホンアミド、およびトリメトプリムからから選択された少なくとも1種の抗生物質の投与が対象となる。
【００７４】
本発明はまた、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、および糖質コルチコイドが誘発した骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常症、骨硬化症、骨減少症、骨軟化症、骨線維形成性不全症、およびページェット病のような骨量減少を治療するための、先に説明された方法を企図している。
【００７５】
特定の態様において、本発明は、慢性関節リウマチ、結膜炎、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、多発性関節炎、および他の関節炎的状態のような炎症疾患に加えこれらの炎症疾患に関連した疼痛を治療するための、先に説明された方法に関する。
【００７６】
本発明の有用性は更に、以下の詳細な説明により例証されるであろう。実際c-kit野生型または突然変異されたc-kitの間には、シグナル伝達の差異が認められる。これは、肥満細胞内に特異的に存在するか、活性化されるか、もしくはアップレギュレーションされる特異的二次メッセンジャー、または肥満細胞以外の造血細胞において抑制されるか、存在しないか、もしくは失活される経路の標的化につながることがある。
【００７７】
正常なc-kitの活性化により誘導されたシグナル伝達
SCFは、インビトロ造血を誘導するために、M-CSFを除くほとんど全ての造血増殖因子に相乗作用を及ぼすので、これは造血において必須の増殖因子である(Metcalf, D.、「The cellular basis for enhancement interactions between stem cell factor and the colony stimulating factors」、Stem Cells (Dayt)、11(Suppl 2):1-11(1993))。この因子は、骨髄ストローマ細胞において産生され、その受容体であるc-kitとの相互作用を介して作用する(Ratajczak, M.Zら、「Role of the KIT protooncogene in normal and malignant human hematopoiesis」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:1710-1714(1992))。先に示されたように、c-kit受容体は、145kDaの糖タンパク質であり、III型チロシンキナーゼサブファミリーに属し、その分子の細胞外部分における5個のIg様ドメインの存在、および細胞質内ドメインをアデノシン三リン酸(ATP)結合ドメインとホスホトランスフェラーゼドメインとに分断するインターキナーゼ配列を特徴としている。c-kitは、CFU-GEMM、BFU-Eにより、ならびに肥満細胞株系の前駆細胞および成熟細胞により、強力に発現される(Katayama N.ら、「Stage-specific expression of c-kit protein by murine hematopoietic progenitors」、Blood、82:2353-2360(1993))。
【００７８】
c-kitへのリガンド結合は、触媒機能の活性化を生じ、結果的に細胞質ドメインのチロシン残基の自己リン酸化を生じる。これらのホスホチロシン残基は、SH2ドメインを含む様々な細胞質シグナル伝達分子のドッキング部位となる。c-kitは、PI3キナーゼ、ras、およびJAK2に依存性のものを含む、多くの増殖因子受容体に共通である正準のシグナル伝達経路を活性化する。インビボまたはインビトロにおいてc-kitと会合することが分かっている分子は、PI3-キナーゼのp85サブユニット、複数のSrcファミリーの一員であるLynおよびFyn、Vav、Grb2、SHP-1、SHP-2、PKC、MATK(CHK)、およびSocs1を含むと同時に、PLC-γ、rasのGTPase活性化タンパク質(GAP)およびJAK2に関する多様なデータが存在する。以下の追加の分子は、c-kit活性化に反応して活性化またはリン酸化される：Shc、Tec、Vav GDP/GTP交換因子、raf-1、MAPK、Akt、CRKL、p120 Cbl、およびDoc。様々な細胞系において行われた最近の研究は、c-kitと会合しこれによりリン酸化される基質に関する異なる結果を生じた。これらの矛盾点は、同じリガンド／受容体システムにより媒介された個別のシグナルおよび細胞型特異的な反応の基となる、個々の細胞型の基質発現プロファイルにおける実験法の差異または機能的関係の変動のいずれかにおける差異を反映しているであろう。これらの理由のために、本発明者らは、様々な細胞状況におけるc-kitシグナル伝達に関して得られたデータを説明することを選択した。
【００７９】
シグナル伝達の初発因子は、c-kitのリガンドが誘導した二量体化であり、これは固有のc-kitチロシンキナーゼ活性を誘導し、重要なチロシン残基においてトランスホスホリレーションを生じる。更にc-kitは、リガンド刺激に反応し、PKCによりセリン残基においてリン酸化されるように見え、このことはc-kit自己リン酸化を阻害する(Katayama, Nら、「Stage-specific expression of c-kit protein by murine hematopoietic progenitors」、Blood、82:2353-2360(1993))。
【００８０】
様々な細胞型において観察されたc-kitとの最も効率的会合のひとつは、PI3-キナーゼのp85サブユニットのSH2ドメインによってなされ(Lev, Sら、「Interkinase domain of kit contains the binding site for phosphatidylinositol 3' kinase」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89:678-682(1992)、および、Rottapel, R.ら、「The Steel/W transduction pathway: kit autophosphorylation and its association with a unique subset of cytoplasmic signaling proteins is induced by the Steel factor」、Mol. Cell Biol.、11:3043-3051(1991))、リン酸化されたマウスc-kitのチロシン残基719およびヒトc-kitのチロシン721を介する(Serve, Hら、「Tyrosine residue 719 of the c-kit receptor is essential for binding of the P85 subunit of phosphatidylinositol (PI) 3-kinase and for c-kit-associated PI 3-kinase activity in COS-1 cells」、J. Biol. Chem.、269:6026-6030(1994))。
【００８１】
c-kitシグナル伝達は、ヒト造血細胞、主にMO7eおよびCMKのふたつの巨核球細胞株において研究されている(前記表I)。
【００８２】
これらの細胞において、SCFは、主要なキナーゼ、例えばPI3キナーゼ、Srcキナーゼ(FynおよびLyn)およびJAK2、ならびに様々なアダプター分子、Grb2、Grap、Vav、CRKLの、それらのSH2ドメインを介した、活性化および／または動員を誘導する。これらの事象は、SH2、SH3、またはPHドメインを介した様々な分子会合の形成を生じ、これは次に異なる経路で活性化を開始する。Ras経路は、SCF刺激に反応して活性化されたことが示され、これはRasとRaf-1の間の相互作用につながり、その結果、MAPキナーゼカスケードを開始する(Tauchi, Tら、「The ubiquitously expressed Syp phosphatase interacts with c-kit and Grb2 in hematopoietic cells」、J. Biol. Chem.、269:25206-25211(1994))。
【００８３】
実際アダプター分子であるGrapは、リガンド活性化されたc-kitと、そのSH2ドメインを介して相互作用し、ならびにグアニンヌクレオチド交換因子mSos1とそのSH3ドメインを介して会合され、受容体および細胞質チロシンキナーゼからのシグナルを、rasシグナル伝達経路と結合させる(Feng, G.Sら、「Grap is a novel SH3-SH2-SH3 adaptor protein that couples tyrosine kinases to the Ras pathway」、J. Biol. Chem.、271:12129-12132(1996))。別のアダプター分子は、Grap、Grb2に関連し、そのSH2ドメインを介してc-kitのリン酸化されたチロシン残基と相互作用し、これはc-CblおよびShcを動員することができる(Briizi, M.Fら、「Discrete protein interactions with the Grb2/c-Cb1 complex in SCF- and TPO-mediated myeloid cell proliferation」、Oncogene、13:2067-2076(1996)；ならびに、Wisniewski, D.、Strife, A.、Clarkson, B.、「c-kit ligand stimulates tyrosine phosphorylation of the c-Cb1 protein in human hematopoietic cells」、Leukemia、10:1436-1442(1996))。活性化後、キナーゼは、c-CblおよびCRKLと相互作用するPI3-キナーゼのようなアダプター分子の役割を果たすか(Sattler, M.ら、「Steel factor induces tyrosine phosphorylation of CRKL and binding of CRKL to a complex containing c-kit, phosphatidylinositol 3-kinase, and p120 (CBL)」、J. Biol. Chem.、272:10248-10253(1997))、もしくはAktをリン酸化するPI3-キナーゼのようなキナーゼの役割を果たす(Blume-Jensen, Pら、「The kit receptor promotes cell survival via activation of PI 3-kinase and subsequent Akt-mediated phosphorylation of Bad on Ser136」、Curr. Biol.、8,779-782(1998))ことができる。
【００８４】
いくつかの場合において、相互作用および／または活性化が、周知のシグナル伝達経路のいずれとも結びつけられることなく説明されている。これは、Tecの場合(Tang. Bら、「Tec kinase associates with c-kit and is tyrosine phosphorylated and activated following stem cell factor binding」、Mol. Cell. Biol.、14:8432-8437(1994))、MATKの場合(Jhun, B.H.ら、「The MATK tyrosine kinase interacts in a specific and SH2-dependent manner with c-kit」、J. Biol. Chem.、270:9661-9666(1995))、Vavの場合(Alai, Mら、「Steel factor stimulates the tyrosine phosphorylation of the proto- oncogene product, p95vav, in human hemopoietic cells」、J. Biol. Chem.、267:18021-18025(1992))、およびDocの場合(Carpino, N.ら、「p62(dok)：a constitutively tyrosine-phosphorylated, GAP-associated protein in chronic myelogenous leukemia progenitor cells」、Cell、88:197-204(1997))である。
【００８５】
予想外のことに、c-kit活性化の期間のJAK-STAT経路についてはよく説明されていない。JAK2は、非チロシンキナーゼサイトカイン受容体スーパーファミリーシグナル伝達に必須である細胞質チロシンキナーゼであるが、これはリガンド活性化前に、c-kitとの物理的会合について説明され、SCFに反応してチロシン残基においてリン酸化されるか(Brizzi, M.ら、「Convergence of signaling by interleukin-3, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and mast cell growth factor on JAK2 tyrosine kinase」、 J. Biol. Chem.、269:31680-31684(1994)；Weiler, S.R ら、「JAK2 is associated with the c-kit proto-oncogene product and is phosphorylated in response to stem cell factor」、Blood、87:3688-3693(1996)；および Linnekin, D.ら、「JAK2 is constitutively associated with c-Kit and is phosphorylated in response to stem cell factor」、Acta Haematol.、95:224-228(1996))、または c-kitと会合されない。加えて、SCFは、MO7e細胞株におけるSTAT1のような細胞質転写因子を活性化する(Deberry, C.ら、「Statl associates with c-kit and is activated in response to stem cell factor」、Biochem. J.、327(Pt 1):73-80(1997))。
【００８６】
c-kitシグナル伝達は、様々な非造血系ヒト細胞株においても試験した。Blume-Jensenらは、SCFは、Akt活性化を誘導し、PI3-キナーゼ依存的様式でBadのセリン残基136のリン酸化を媒介したことを明らかにした(Blume-Jensen, P.ら、(1998))。胚性線維芽細胞において行われたインビトロ実験は、PI3キナーゼおよびPLC-γはヒトc-kitのチロシン残基721との会合について、より高い親和性を示すp85/PI3キナーゼと競合することを示している(Herbst, Rら、「Formation of signal transfer complexes between stem cell and platelet-derived growth factor receptors and SH2 domain proteins in vitro」、Biochemistry、34:5911-5979(1995))。H526細胞株(小細胞肺癌、SCLC)において、SCFは、SrcキナーゼのLckの活性化、およびそれのc-kitの傍細胞膜ドメインとのその相互作用を誘導した(Krystal, G.Wら、「Lck associates with and is activated by Kit in a small cell lung cancer cell line: inhibition of SCF-mediated growth by the Src family kinase inhibitor PP1」、Cancer Res.、58:4660-4666(1998))。ヒトメラノーマ細胞株である501 melにおいて、Hemesathらは、SCF刺激は、MAPKの活性化を生じ、次に小眼球症転写因子(Mi)のリン酸化、p300/CBPとの相互作用によるMiトランス活性化のアップレギュレーションを生じることを説明している(Nature、391:298-301(1998))。
【００８７】
興味深いことに、c-kitとインテグリンシグナル伝達経路との間の相互接続が、TF-1細胞株において観察された。SCFは、フィブロネクチン接着性TF-1細胞の広がりを誘導し、SCF非存在下でのpp125 FAKのチロシンリン酸化レベルと比較した場合に、用量依存的方式でpp125 FAKのチロシンリン酸化を増強する。これらの作用は、ウォルトマンニン感受性経路、インテグリン活性化感受性経路に左右される。
【００８８】
c-kit非活性化を考慮すると、ふたつの主要経路が異なる細胞の状況において説明されている。造血細胞において、ひとつの経路はチロシンリン酸化酵素であるSHP-1に関連し、おそらく569位のチロシンリン酸化された残基においてc-kitと相互作用し、これはc-kitのチロシン残基のリン酸化状態をダウンレギュレーションする(Yi. T.、Ihle, J.N.、「Association of hematopoietic cell phosphatase with c-Kit after stimulation with c-Kit ligand」、Mol. Cell. Biol.、13:3350-3358(1993)；Lorenz, U.ら、「Genetic analysis reveals cell type-specific regulation of receptor tyrosine kinase c-Kit by the protein tyrosine phosphatase SHP1」、J. Exp. Med.、184:1111-1126(1996)；Paulson, R.ら、「Signalling by the W/Kit receptor tyrosine kinase is negatively regulated in vivo by the protein tyrosine phosphatase Shp1」、Nat. Genet.、13:309-315(1996)；および Kozlowski, Mら、「SHP-1 binds and negatively modulates the c-Kit receptor by interaction with tyrosine 569 in the c-Kit juxtamembrane domain」、Mol. Cell. Biol.、18:2089-2099(1998))。
【００８９】
リン酸化酵素SHP-2(Syp)の役割は余り分かっていない。MO7e細胞株において活性化したc-kitと会合されたSHP-2は、そのSH2ドメインを介してリン酸化され始め、Grb2と複合体形成することが示されている(Tauchi T.ら、(1994))。このGrb2との結合は、ras/MAPキナーゼ経路活性化および細胞増殖へとつながる。対照的に、c-kitを発現しているBA/F3細胞において、c-kit Y567FへのSHP-2の会合は著しく低下されることが示されている。この場合、SCFに対する過増殖反応が認められ、このことは、SHP-2は、SCFが誘導した増殖をダウンレギュレーションすることを示唆している(Kozlowski, M.ら、(1998))。
【００９０】
ヒトc-kitの活性化および非活性化を、ブタ内皮細胞(PAE)においても研究した。PI3-キナーゼ、PLC-γ、およびRaf/MAPキナーゼカスケードの活性化は、ヒトc-kitでトランスフェクションしたPAE細胞において、SCFに反応することが説明された。これらの細胞において、第一の負のフィードバックループは、PI3-K、PLD、およびPKC経路であり、これはc-kitの741および746位のセリン残基でのリン酸化につながる。第二の非活性化経路は、PI3-キナーゼが誘導したPLD活性化およびホスファチジルコリン(PtdCho)特異的ホスホリパーゼD活性化(PtdCho)PLDであり、これはホスファチジル酸(PtdH)を生成し、PKCのアクチベーターおよびアラキドン酸(D4Ach)前駆体である、ジアシルグリセロール(DAG)へと代謝した(Kozawa, O.ら、「Involvement of phosphatidylinositol 3'-kinase in stem-cell-factor-induced phospholipase D activation and arachidonic acid release」、Eur. J. Biochem.、248:149-155(1997))。これらの執筆者は、SCFは、D4Ach生成の第二の経路である、PLA2活性化を誘導したことも示した。
【００９１】
マウス骨髄由来の肥満細胞(BMMC)において、SCFは、i)PI3-キナーゼ活性化を誘導し、これは次にRac-1およびJnk経路を刺激すること、ならびにii)チロシン567上のSrcキナーゼのFyn(Timokhina, Iら、「Kit signaling through PI 3-kinase and Src kinase pathways: an essential role for Rac1 and JNK activation in mast cell proliferation」、EMBO J.、17:6250-6262(1998))、および、Lyn(Suzuki, T.ら、「Essential roles of Lyn in fibronectin-mediated filamentous actin assembly and cell motility in mast cells」、J. Immunol.、161:3694-3701(1998))への結合およびリン酸化を誘導することが明らかにされた。Koikeらは、腹腔から単離されたラット肥満細胞において、SCFはPLD活性化を誘導し、引き続きタンパク質チロシンキナーゼ経路を介しホスホイノシチド特異的PLC-γ活性化を伴わずに、D4Achを放出したことを示した(Koike, T.ら、「SCF/c-kit receptor-mediated arachidonic acid liberation in rat mast cells. Involvement of PLD activation associated tyrosine phosphorylation」、Biochem. Biophys. Res. Commun.、197:1570-1577(1993)；ならびに、Koike, T.ら、「Stem cell factor-induced signal transduction in rat mast cells. Activation of phospholipase D but not phosphoinositide-specific phospholipase C in c-kit receptor stimulation」、J. Immunol.、151:359-366(1993))。これらの細胞において、Nagaiらは、SCFにおけるPI3-キナーゼ、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)およびミオシン軽鎖キナーゼの関与は、ヒスタミン放出を誘導することを示した(Nagai, S.ら、「Pharmacological study of stem-cell-factor-induced mast cell histamine release with kinase inhibitors」、Biochem. Biophys. Res. Commun.、208:576-581(1995))。
【００９２】
マウス細胞におけるc-kit非活性化に関してSCFシグナルを減少する別の方法は、c-kit発現のダウンモジュレーションである。YeeらおよびMiyazawaらは、c-kitインターナリゼーションおよびユビキチン化が、c-kitの損なわれていないキナーゼ活性に依存することを示した(Yee, N.ら、「Mechanism of down-regulation of c-kit receptor. Roles of receptor tyrosine kinase, phosphatidylinositol 3'-kinase, and protein kinase C」、J. Biol. Chem.、269:31991-31998(1994)；および Miyazawa, K.ら、「Ligand-dependent polyubiquitination of c-kit gene product: a possible mechanism of receptor down modulation in M07e cells」、Blood、83:137-145(1994))。
【００９３】
BMMCにおいて、c-kitは、PLC-γを活性化し、PI4,5二リン酸のDAGおよびイノシトール-1,4,5三リン酸への加水分解を生じ、これは細胞内Ca++の動員を誘導する。このカルシウム流入は、c-kitインターナリゼーションにとって重要であるように見える。更にPI3-キナーゼ活性化が存在しない場合は、c-kit受容体はインターナリゼーションするが、形質膜内側の近傍に局在化し続ける。注目すべきは、c-kitインターナリゼーションは、PI3キナーゼおよびCa++流入の両方が阻害される場合は、完全に妨害されることである(Gommerman, J.L.ら、「Phosphatidylinositol 3-kinase and Ca2+ influx dependence for ligand- stimulated internalization of the c-Kit receptor」、J. Biol. Chem.、272:30519-30525(1997))。
【００９４】
c-kit依存性有糸分裂のダウンレギュレーションの新規メディエーターは、Socs-1(サイトカインシグナル伝達のサプレッサー)であると考えられる(De Sepulveda, P.ら、「Socsl binds to multiple signalling proteins and suppresses Steel factor- dependent proliferation」、EMBO J.、18:904-915(1999))。SCFは、Socs-1の合成を誘導し、これはそのSH2ドメインを介してc-kitへ結合する。Socs-1活性の機構は、そのGrb2との相互作用およびVavのN末端の負の調節に関連しているように見える(Blechman, J.ら、「Structure-function analyses of the kit receptor for the steel factor」、Stem Cells、(Dayt)、11(Suppl 2):12-21(1993))。
【００９５】
c-kit突然変異に関連した分子機能不全
酵素機能およびc-kit突然変異
SHP-1発現は、IC2/c-kit野生型細胞とIC2/c-kitD814Y細胞では異なり、これは更にマウス肥満細胞の顆粒内に存在するプロテアーゼであり、肥満細胞突然変異の様々な段階において差次的に発現されるMMCP-4およびMMCP-6のような他のタンパク質についても真実である。実際、MMCP-6転写産物は、外因性SCFの存在下IC2/c-kit野生型細胞において低レベルで発現され、このレベルはc-kitD814Y発現の結果として増大した。MMCP-4転写産物は、IC2/c-ki野生型 T細胞におけるRT-PCRでは検出できなかったが、IC2/c-kitD814Y細胞では豊富に発現された。これらの野生型と突然変異体の間で認められた差異は、SCFにより刺激されたc-kit野生型およびc-kitD814Yにより伝達されたシグナルは同等でないことを示唆している：突然変異c-kitD814Yは、肥満細胞の増殖を変更するのみではなく、それらの突然変異の段階も変更する。
Claims (36)
- 肥満細胞ではない他の造血細胞、または関連した細胞もしくは細胞株、またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などにとって無毒である化合物であり、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
a)肥満細胞をインビトロにおいて適当な培養培地で培養する工程；
b)該培養培地に、少なくとも1種の試験される候補化合物を添加し、該細胞を延長された期間インキュベーションする工程；
c)該化合物が、肥満細胞の死または破壊を促進し、肥満細胞増殖を妨害または阻害する程度を測定し、肥満細胞の枯渇が観察された化合物を選択する工程；
d)肥満細胞ではない他の造血細胞、または関連した細胞もしくは細胞株、またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などから選択された細胞の、有意な死を促進することができない工程c)において選択された化合物のサブセットを同定する工程。 - 肥満細胞ではない他の造血細胞、または関連した細胞もしくは細胞株、またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などにとって無毒である化合物であり、肥満細胞を枯渇することが可能である化合物を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
a)肥満細胞の培養物を提供する工程であり、ここで肥満細胞は、野生型肥満細胞およびそれらに由来した細胞株、活性化された突然変異体肥満細胞株、ならびに活性化された野生型肥満細胞およびそれらに由来した細胞株から選択される工程；
b)該細胞の培養物を、少なくとも1種の候補化合物と、肥満細胞の増殖および／または生存を許す条件下で接触させ、候補化合物存在下での細胞死のレベルを測定し；ならびに候補化合物存在下での細胞死レベルを、候補化合物非存在下での細胞死レベルと比較する工程であって、候補化合物の存在下での細胞死レベルの増加が、候補化合物の肥満細胞枯渇能の指標である工程；
c)肥満細胞以外の少なくとも1種の細胞の培養物を提供する工程であり、該細胞は肥満細胞ではない造血細胞、または関連した細胞もしくは細胞株、またはそれらに由来した細胞株、例えばSCF非依存性の増殖されたヒト正常CD34+細胞などから選択される工程；
d)該細胞の培養物を、工程b)で同定された少なくとも1種の化合物と、工程c)で説明された細胞の増殖および／または生存を許す条件下で接触し、該化合物存在下での細胞死のレベルを測定し；ならびに化合物存在下での細胞死レベルを、候補化合物非存在下での細胞死レベルと比較する工程であって、該化合物存在下での細胞死レベルの有意な増加がないことは、該化合物の、少なくとも他の造血細胞に対する肥満細胞枯渇特異性の指標である工程。 - 肥満細胞が、単離された肥満細胞およびそれらに由来する細胞株、BaF3、IC-2マウス細胞、HMC-1、ATCC寄託番号TIB-64で入手可能なP815、ATCC寄託番号CRL-2034で入手可能な10P2、ATCC寄託番号CRL-2036で入手可能な10P12、ATCC寄託番号CRL-2037で入手可能な11P0-1、およびそれらに由来する細胞株から選択される、請求項1または2記載の方法。
- 肥満細胞ではない他の造血細胞、または関連した細胞もしくは細胞株が、SCF以外のサイトカインカクテルを含有する培養培地において増殖されたヒトTリンパ球Jurkat細胞株(ATCC番号TIB-152およびそれら由来の細胞株)、ヒトBリンパ球DaudiまたはRaji細胞株(各々、ATCC番号CCL-213およびCCL-86ならびにそれら由来の細胞株)、ヒト単球U937細胞株(ATCC番号CRL-1593.2)およびヒトHL-60細胞株(ATCC番号CCL-240)、それらに由来する細胞株(ATCC番号CRL-2258およびCRL-2392)、ならびに正常ヒトCD34+細胞からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 濃度10μM未満、好ましくは1μM未満で、肥満細胞の特異的な枯渇が可能である化合物が選択される、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- E/S比、1/1000から1/5の範囲を示す化合物が選択される、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 細胞死アッセイ法が、細胞増殖アッセイ法、細胞生存度アッセイ法、および／またはアポトーシスアッセイ法をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 細胞死の程度が、3Hチミジン取込み、トリパンブルー排除能法、ヨウ化プロピジウムの使用、または51Cr放出アッセイ法により測定される、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 細胞死の程度が、好ましくは蛍光カルセインおよびエチジウムホモダイマー1を使用する、細胞内エステラーゼ活性試験、および形質膜完全性試験により決定される、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 細胞死の程度が、DiOC18およびヨウ化プロピジウムを使用する生細胞と死細胞の間の識別により決定される、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
- 細胞死の程度が、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光マイクロプレートリーダー、またはフローサイトメーターを用いる、細胞生存度および細胞毒性の蛍光光度アッセイ法により測定される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- IL-3依存性細胞である肥満細胞が、IL-3を0.5〜10ng/ml、好ましくは1〜5ng/mlを構成する濃度で含有する培養培地において培養される、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
- 試験される化合物が、チロシンキナーゼのインヒビター、例えばAkt、c-Cbl、CRKL、Doc、p125 Fak、Fyn、Grap、Jak2、Lyn、MAPK、MATK、PI3-K、PLC-γ、Raf1、Ras、SHP-1、SHP2(Syp)、Tec、Vav、およびFlt-3からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記化合物が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式またはヘテロ環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換されたピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシ化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項1〜12のいずれか1項記載のスクリーニング法。
- 肥満細胞を枯渇することが可能であり、他の造血細胞に対する重大な毒性を有さず、好ましくはE/S比1/1000〜1/5の範囲を有する、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法により入手可能な化合物。
- 医薬品製造のための、請求項15記載の化合物の使用。
- 請求項1〜14のいずれか1項記載の方法により入手可能な化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類へ投与する工程を含む、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、骨量減少、腫瘍血管新生、炎症疾患、炎症性腸疾患(IBD)、間質性膀胱炎、肥満細胞症、感染症、およびCNS障害から選択された疾患を治療する方法。
- 請求項1〜14のいずれか1項記載の方法により入手可能な化合物を、そのような治療を必要とするヒトへ投与する工程を含む、毛髪生長および毛髪色の回復を促進する方法。
- 多発性硬化症、乾癬、腸炎症疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性関節リウマチおよび多発性関節炎、限局性および全身性強皮症、全身性エリスマトーデス、円板状エリスマトーデス、皮膚エリスマトーデス、皮膚筋炎、多発性筋炎、シェーグレン症候群、結節性汎動脈炎、自己免疫性腸疾患、増殖性糸球体腎炎、脈管炎、活動性慢性肝炎、および慢性疲労症候群を治療する、請求項17記載の方法。
- 腎臓、膵臓、肝臓、心臓、肺、および骨髄を含む、任意の臓器移植における移植片-対-宿主疾患または移植片拒絶反応を治療するための、請求項17記載の方法。
- アフタ性潰瘍のような表皮下水疱形成障害、ならびに天疱瘡、水疱性類天疱瘡、および瘢痕性類天疱瘡などのようないくつかの水疱性疾患を治療するための、請求項17記載の方法。
- 好ましくはダプソン、アザチオプリン、エリスロマイシン、プロピオニルエリスロマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、およびメクロサイクリンから選択された、少なくとも1種の抗生物質をさらに投与する工程を含む、請求項21記載の方法。
- 喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、アナフィラキシー症候群、じんま疹、血管性水腫、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性細静脈炎、昆虫の咬傷による皮膚炎症、および吸血寄生生物外寄生を治療するための、請求項17記載の方法。
- 特にイヌおよびネコにおける、皮膚アレルギー性障害、例えばじんま疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、結節性紅斑、多形性紅斑、皮膚壊死性細静脈炎、昆虫の咬傷による皮膚炎症、および吸血寄生生物外寄生を治療するための、請求項17記載の方法。
- 化合物が、患者の気道、鼻腔内の標的領域へエアロゾル処方でまたは局所的処方で投与される、請求項23または24項記載の方法。
- ヒトにおける腫瘍血管新生を治療するための、請求項17記載の方法。
- 肥満細胞症、色素性じんま疹を含む顕著な皮膚肥満細胞症、びまん性皮膚肥満細胞症、単発性肥満細胞種および水疱、紅斑性および末梢血管拡張性肥満細胞症に関連したヒトにおける皮膚疾患を治療する、請求項17記載の方法。
- 肥満細胞性白血病を含むIV型肥満細胞症を治療するための、請求項17記載の方法。
- イヌの肥満細胞腫を治療するための、請求項17記載の方法。
- クローン病、粘膜炎、潰瘍性大腸炎、および壊死性腸炎のような、炎症性腸疾患(IBD)を治療するための、請求項17記載の方法。
- ヒトにおける間質性膀胱炎を治療するための、請求項17記載の方法。
- 哺乳類、特にヒトにおける細菌感染症を治療するための、好ましくは再発性細菌感染症、細菌性膀胱炎のような無症候期間後に再発する感染症の治療のための、請求項17記載の方法。
- 大腸菌、肺炎桿菌、セラチア・マルチセンス、シトロバクター・フロインディー、およびネズミチフス菌を含む、グラム陰性腸内細菌のような、FimH発現性細菌感染症を治療するための、請求項17記載の方法。
- バシトラシン、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンのようなマクロライド系抗生物質；フルオロキノロン、アクチノマイシン、スルホンアミド、およびトリメトプリムから選択された、少なくとも1種の抗生物質をさらに投与する工程を含む、請求項29または30記載の方法。
- 閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、および糖質コルチコイドが誘発した骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常症、骨硬化症、骨減少症、骨軟化症、骨線維形成性不全症、およびページェット病のような骨量減少を治療するための、請求項17記載の方法。
- 慢性関節リウマチ、結膜炎、リウマチ様脊椎炎、変形性関節症、痛風性関節炎、多発性関節炎、および他の関節炎的状態のような炎症疾患に加え、これらの炎症疾患に関連した疼痛を治療するための、請求項17記載の方法。
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