JP2004537579A - 免疫調節化合物を用いる結核の処置 - Google Patents

Abstract

治療有効量の式Ａの免疫調節剤
【化１】

を投与することによって、動物の結核を処置する。式（Ａ）において、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、かつＸは芳香族もしくは複素環式アミノ酸またはその誘導体である。前記動物はヒトなどの哺乳動物であることができる。

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願の説明
本願は２０００年１２月２０日出願の米国仮特許出願第６０／２５６，４７８号および２００１年８月３日出願の米国仮特許出願第６０／３０９，４７４号の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は概して、ヒトなどの哺乳動物を含む動物の結核を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
結核は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）属に属する結核菌の感染によって起こる慢性の感染性疾患である。この感染は、ある期間、無症候性の場合もあるが、最もよく見られる症候としては、発熱および呼吸器症状をもたらす肺の慢性炎症が挙げられる。処置せずに放置するとかなりの罹患と死が起こりうる。結核はすべての年齢層を襲うが、高齢者および免疫抑制者では特によく見られる。この疾患はヒトならびにウシ、ブタおよび家禽などの家畜を含む動物を侵しうる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヒト型結核菌）はヒト結核の最も一般的な原因菌であるが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（ウシ型結核菌）による例も多い。工業国における動物結核は乳汁の低温殺菌によって抑制されている。結果として、このような措置により、Ｍ．ｂｏｖｉｓによる疾患の発生はウシでもヒトでも劇的に低下する。これに対して、発展途上国では一貫した抑制手段が実行されておらず、低温殺菌が実施されることも稀である。
【０００４】
予防、検出、診断および処置の方法により、この疾患にかかる人口と、この疾患が原因で死亡する人口は、どちらも大きく減少している。当技術分野で知られている治療法には、イソニアジド（イソニコチン酸ヒドラジド）、リファンピシン、ピラジナミド（ＰＺＡ）、カナマイシン、エタンブトール、ストレプトマイシン、カプレオマイシン、アミカシンおよびサイクロセリンなどがある。イソニアジドは現在も結核に対する第一線の治療法であり、近代的な短期化学療法は三剤、すなわちイソニアジド、リファンピシンおよびＰＺＡで開始される。結核は一般に長期抗生物質療法によって抑制することができるが、この処置は通常、結核の蔓延を予防する方法としては不十分である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
結核の処置にはいくつかの化学療法およびワクチンプロトコールが利用できるようになったが、この疾患は、毎年、他のどの感染性疾患よりも多くの命を奪い続けている。当技術分野では、結核の予防および処置に、改善が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明では、治療有効量の式Ａ：
【０００７】
【化１】

【０００８】
の免疫調節剤を投与することによって、哺乳動物（例えばヒト）などの動物の結核を処置する。式Ａにおいて、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、Ｘは芳香族もしくは複素環式アミノ酸またはその誘導体である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましい実施形態の詳細な説明
上述のように本発明は、概して、治療有効量の免疫調節剤を投与することによって、ヒトを含む哺乳動物などの動物の結核を処置する方法に関する。前記免疫調節剤は式Ａで表される。
【００１０】
【化２】

【００１１】
式Ａにおいて、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、Ｘは芳香族もしくは複素環式アミノ酸またはその誘導体であって、好ましくは、Ｘ＝Ｌ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンである。「Ｘ」に適した芳香族または複素環式アミノ酸の誘導体は、アミド、モノ−またはジ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル置換アミド、アリールアミド、および（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルまたはアリールエステルである。「Ｒ」に適したアシルまたはアルキル部分は炭素数１〜約６の分岐または非分岐アルキル基、炭素原子数２〜約１０のアシル基、ならびにカルボベンジルオキシおよびｔ−ブチルオキシカルボニルなどの保護基である。好ましくは、式Ａに示すＣＨ基の炭素は、ｎが２である場合には、Ｘの立体配置とは異なる立体配置を持つ。
【００１２】
好ましい実施形態では、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎ_in−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンおよびβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンなどの化合物を利用する。特に好ましい実施形態では、ＳＣＶ−０７とも呼ばれるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンを利用する。これらの化合物、これらの化合物を製造する方法、これらの化合物の医薬的に許容できる塩、およびその医薬製剤は、参考文献として本明細書の一部を構成する米国特許第５，９１６，８７８号に開示されている。
【００１３】
式Ａの化合物は約０．００１〜１０ｍｇの範囲内の投与量で投与することができる。投薬は１週間に１回またはそれ以上行うことができ、好ましくは毎日、１日に１回またはそれ以上投与する。好ましい実施形態では、投薬を筋肉内注射によって行うが、他の注射および注入形式も利用することができ、他の投与形式、例えば経口もしくは経鼻吸入または経口摂取なども使用することができる。
【００１４】
好ましい実施形態では、式Ａの化合物を約０．０１〜１ｍｇの範囲内の投与量で、より好ましくは約０．１ｍｇの投与量で投与する。
【００１５】
投与量は１キログラムあたりのマイクログラム数で測ることもでき、投与量は１キログラムあたり約０．００１〜１０マイクログラムの範囲内、より好ましくは１キログラムあたり約０．０１〜１マイクログラムの範囲内、最も好ましくは１キログラムあたり約０．１マイクログラムである。
【００１６】
式Ａの免疫調節剤を使って結核を処置する方法は、結核に対して有効な治療有効量の抗菌化合物または静菌化合物の投与を、さらに含んでもよい。適切な結核処置用の抗菌化合物または静菌化合物には、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、カナマイシン、エタンブトール、ストレプトマイシン、カプレオマイシン、アミカシンおよびサイクロセリンなどが包含される。これらの化合物は、約１００〜１０，０００ｍｇの範囲内、好ましくは約２００〜２，０００ｍｇの範囲内、より好ましくは約４００〜１，０００ｍｇの範囲内の投与量で投与することができる。式Ａの化合物は、１種またはそれ以上の結核処置用抗菌化合物または静菌化合物の投与と同時に、および／または逐次的に、例えば投与前に、投与中に、および／または投与後に、投与することができる。
【００１７】
さらに、式Ａの化合物は、結核処置用医薬の製造に使用することもできる。好ましくは、式Ａの化合物は、医薬的に許容できる担体を含む組成物中に含まれる。
【００１８】
限定ではなく例示を目的として以下に実施例を記載する。
【実施例１】
【００１９】
左肺上葉に破壊および播種を伴う浸潤性結核を持つ１９５５年生まれの患者が病院に収容された。この患者は、結核の他にも、十二指腸潰瘍、慢性気管支炎および多価アレルギーを持っていた。血球算定ではリンパ球減少（１８％）およびＥＳＲの上昇（２５ｍｍ／ｈ）がみられた。ＣＤ３＋サブセットの減少も認められ、空洞を伴う浸潤および播種巣が、左肺の腋窩（ａｘｉｌａｒ）区に観察された。静脈内６００ｍｇ／日のイソニアジド、経口１５００ｍｇ／日のピラジナミド、経口４５０ｍｇ／日のリファンピシンを含む積極的抗結核治療を行った。
【００２０】
従来の治療法は不成功に終わったので、ＳＣＶ−０７処置を試みた。毎日０．１ｍｇの用量で５日間にわたる１クールのＳＣＶ−０７治療後に、細菌性中毒は消失し、破壊性空洞は閉じ、喀痰培養検査は陰性だった。ＣＤ３＋リンパ球は増加し、他の薬剤に対する耐性が改善された。循環中の免疫複合体は正常値近くまで低下した（８４Ｕから６９Ｕまで低下。正常レベルは２２〜６６Ｕである）。
【実施例２】
【００２１】
右肺の上葉および第６区ならびに左肺の第４〜５区が破壊期にある浸潤性結核を持つ１９６２年生まれの患者が病院に収容された。ＳＣＶ−０７治療前は、細菌性中毒、呼吸困難および損傷した肺葉にラ音が認められた。断層検査では、左葉の浸潤的背景上に複数の破壊性空洞が観察され、右肺の第６区には肉眼的病巣播種も観察された。病巣周囲炎に取り囲まれた大きな肺破壊巣が、左肺舌葉に見いだされた。さらに、血球算定では白血球増加（１１．４×１０⁹／ｌ）およびＥＳＲの上昇（３６ｍｍ／ｈ）が観察された。免疫応答測定では、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サブセットの減少ならびにＰＨＡおよびＰＰＤによるリンパ球芽球化応答の低下が検出された。
【００２２】
従来の治療法を２ヶ月間続けたところ、患者の状態にわずかな改善がみられた。しかし、Ｘ線像に有意な変化はなく、免疫応答は阻害されたままだった。
【００２３】
従来の抗結核療法（筋肉内６００ｍｇ／日のイソニアジド、経口１５００ｍｇ／日のピラジナミド、経口４５０ｍｇ／日のリファンピシン、筋肉内１０００ｍｇ／日のカナマイシン）を続けながら、ＳＣＶ−０７を筋肉内に０．１ｍｇの用量で１日１回、５日間注射した。臨床的改善は有意だった。喀痰培養検査は陰性になり、空洞は閉じ、浸潤巣は消失した。免疫応答は正常に近くなった。ＣＤ３＋リンパ球は１．０１１×１０⁹／ｌから１．４４１×１０⁹／ｌまでに増加し、ＣＤ８＋数は１２％から２１％まで増加した。正常範囲は約２６〜４０％である。リンパ球の機能的能力も、ＳＣＶ−０７処置後に著しく上昇した。最後に、ＰＨＡによる芽球化応答は２９％から４０％まで増加した。正常レベルは約５０％である。
【実施例３】
【００２４】
今までに処置されたことがないか、または不十分な抗結核治療を受けた後の、破壊性肺結核を持つ患者を処置した。すべての患者に静脈内イソニアジドと４〜５種の他の薬物とからなる抗結核治療を施し、各患者の状態を毎日検査した。主な診断基準には理学的検査、胸部Ｘ線、喀痰の細菌検鏡および培養、気管支肺胞洗浄検査を含めた。また、ＳＣＶ−０７治療前と、その後の毎週１回、全患者で行った血球算定も含めた。血中フィブリノーゲン、β−リポタンパク質、尿素、クレアチニン、Ｃ反応性タンパク質レベル、アラニンおよびアスパラギントランスアミナーゼの活性を含む血液生化学検査を１ヶ月に１回、また必要であればそれ以上の頻度で行った。喀痰培養は治療前、ＳＣＶ−０７治療の１ヶ月後および３ヶ月後に行い、血清学的測定には間接赤血球凝集試験を含めた。
【００２５】
１１人の患者に両肺傷害がみられた。複数区域損傷が１１例に観察された。他の患者は一区域および二区域に肺病巣を持っていた。どの症例でも病理過程は破壊性だった。１〜８ｃｍの空洞が１７枚のＸ線フィルムに観察された。未発達の空洞が３例で診断された。複数の空洞、Ｘ線マーカーおよび滲出性炎がどの患者でも顕著だった。
【００２６】
患者を比較に値する二群、すなわちＳＣＶ−０７で処置する患者２０人と、対照群の１５人とに分割した。実験群では女性がわずかに多かった（５５％）。患者の年齢は２０〜４０歳の範囲だった。患者は全員、毒血症の症状を示し、そのうち４人は症状が重かった。実験群の患者のうち８人は湿性咳を呈した。
【００２７】
典型的に、ＳＣＶ−０７処置前の胸部Ｘ線および断層撮影像は浸潤様陰影を上葉に示した。右肺の第６区は小さい浸潤物で囲まれていた。左肺の軸（ａｘｉａｌ）区および舌区に病巣周囲炎を伴う複数の異なる病巣がみとめられた。２ヶ月間のＳＣＶ−０７治療後に、胸部Ｘ線および断層撮影像は浸潤様陰影の消失を示し、両肺に病巣が検出された。
【００２８】
ヒトにおけるＳＣＶ−０７処置は、実験群での抗結核治療の効力を増大させた。毒血症症状は１ヶ月以内に患者の半分で実質的に消失した。１６人の患者で湿性ラ音が消失し、この場合、すべての症例で体温が低下した。３ヶ月の観察後に実験群の患者の２５％に空洞閉鎖が観察されたのに対して、対照群では１３．３％でしかなかった。喀痰培養検査は、１ヶ月の観察後にＳＣＶ−０７処置患者では３０％、対照群では１３．３％が陰性であり、３ヶ月後にはそれぞれ６５％および３３．３％が陰性だった。
【００２９】
白血球数およびＥＳＲを含む結核活動性の血液学的徴候は実験群ではほとんど減少した。６人の患者では１０×１０⁹／Ｌを超える白血球数が観察され、７人の患者に「左方移動」がみられた。
【００３０】
１０症例で１８％未満のリンパ球レベルが樹立され、４０ｍｍ／ｈより高いＥＳＲが４人の患者にみられた。好酸球および単球レベルはＳＣＶ−０７治療前から正常値に近く、治療中も変化しなかった。血清ビリルビン、クレアチニン、尿素、アラニンおよびアスパラギントランスアミナーゼは安定した。フィブリノゲン、β−リポタンパク質、ＣＲＰなどの血清生化学的炎症マーカーは１ヶ月で減少した。
【００３１】
ＳＣＶ−０７治療前には、細胞免疫パラメータの低下が患者にみとめられた。検査した１４人の患者のうち、ＣＤ３＋リンパ球の減少は９人の患者で、ＣＤ４＋産生量の低下は１人の患者で、またＣＤ８＋産生量の低下は１０人の患者で検出された。
【００３２】
免疫学的試験には、モノクローナル抗体を使ったＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２０＋、ＣＤ２５＋およびＣＤ９５＋などの末梢血リンパ球サブセットのパーセンテージの計数を含めた。ＣＤ４／ＣＤ８係数も計算した。ＳＣＶ−０７治療の直後に、ＣＤ３＋およびＣＤ４＋細胞レベルの上昇が、１４人の患者中７人で見られた。ＣＤ４＋／ＣＤ８＋比も上昇した。これらの変化は、対照群の患者と比較して、ＳＣＶ−０７処置患者では有意に改善された。
【００３３】
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびツベルクリン精製タンパク質（ＰＰＤ）によって誘発される芽球化反応も調べた。治療前の７人の患者に観察されたＰＨＡに対するＴ細胞芽球化応答の阻害（４４．１±２．４％）および調べた症例の８例中６例に見られたＰＰＤに対する極めて低いＴ細胞応答と比較して、Ｔ細胞芽球化応答は、対照群との比較で、実験群では著しく増加した。
【００３４】
ＳＣＶ−０７処置患者では、分裂促進因子ＰＨＡおよびＰＰＤによる刺激後のＩＬ−２産生量が、著しく増加した。
【実施例４】
【００３５】
この実施例では、Ｍ．ｂｏｖｉｓ ８による攻撃に先立って、２００匹のマウス（Ｌａｂ Ａｎｉｍａｌｓ Ｎｕｒｓｅｒｙ，Ｒａｐｐｏｌｏｖｏ，ロシア）をＳＣＶ−０７で免疫処置した場合の効果を説明する。
【００３６】
ＳＣＶ−０７をアンプル１本につき０．１ｍｇずつ、アンプル中で凍結乾燥し、＋４℃で保存した。ＳＣＶ−０７を０．９％食塩水１ｍｌで復元した。感染を誘発するために、マウスの外側尾静脈にＭ．ｂｏｖｉｓ ８懸濁液（生理食塩水０．２ｍｌ中に０．１ｍｇ）を注射した。１２日後に、接種後の肺に亜粟粒病巣を持つ動物を７つの群の一つにランダムに割り当てた。
【００３７】
イソニアジド治療（１０ｍｇ／ｋｇ，皮下）を開始した。複数の亜粟粒病巣を持つ動物で研究を続けた。２０日目に各群の動物にＳＣＶ−０７による処置を開始し、５日間毎日腹腔内（ｉｐ）注射を行った。最初の処置の２日後（２６日目）に、２クール目のＳＣＶ−０７処置を開始して、さらに５日間毎日注射を行った。対照群には、治療なしのマウス（接種対照）とイソニアジド治療のみのマウス（治療対照）とを含めた。
【００３８】
ＳＣＶ−０７治療の４、１０、１７および２４日後に試料を採取した。各群少なくとも５匹のマウスを調べた。
【００３９】
肺損傷は特異性炎症病巣の数および重症度に従って肉眼検査時に計算した。単一亜粟粒病巣を０．５単位（Ｕ）、複数亜粟粒病巣（＜２０）を１．０Ｕ、複数亜粟粒病巣（＞２０）を１．５Ｕ、単一粟粒病巣を１．７５Ｕ、複数集合亜粟粒および単一粟粒病巣を２．０Ｕ、粟粒病巣（＜１０）を２．２５Ｕ、複数集合粟粒病巣を２．７５Ｕ、小乾酪性病巣を３．０Ｕ、播種乾酪性病巣を４．０Ｕ、肺全体への損傷を５．０Ｕと見積もった。漿液による肺浸軟がある場合は、損傷の程度に応じて係数を０．２５〜１．０Ｕ上げた。
【００４０】
重量係数（ＷＩ）の計算は、式：
ＷＩ＝［器官重量（ｇ）／マウス体重（ｇ）］×１００
に従って行った。
【００４１】
予備実験により、このＭ．ｂｏｖｉｓ ８株はビルレンスが低いことがわかった。低ビルレンスの確認にはいくつかの要素、すなわち（１）接種後１１日目まで単一肺亜粟粒病巣が出現せず、接種後１９日目まで複数病巣が出現しないこと、（２）接種後３４日目まで死亡例がないこと、および（３）２８日目の無処置マウスにおける感染の重症度が、２６日目の低進行性結核マウスと同等であること、の検討を含めた。
【００４２】
ＳＣＶ−０７治療の使用は結核の進行に影響を及ぼす。５日間の治療の終了時から４日後（感染２８日目）に測定すると、ＳＣＶ−０７処置はどの用量でも、肺損傷係数を低下させた。第５群、第７群、第８群および第９群（ＳＶＣ−０７用量１、０．１および０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐならびに１μｇ／ｋｇ ＳＣＶ−７ ｐｏ）は、無処置対照（第２群）との比較で有意差を示した。有意差は第７群（０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）と第３群（イソニアジド対照群）との間にもみられた。しかし無処置マウス（第２群）とイソニアジドのみで処置したマウス（第３群）の間には有意差はなかった。
【００４３】
処置終了から１０日後と１７日後ではどちらも、対照群と実験群との間に有意差はなかった。第７群（０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）における肺損傷係数の低下だけが、対照とはかなり異なっていた。
【００４４】
ＳＣＶ−０７治療の最大効果は治療終了時から２４日後に見られた。ここでも第７群（０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）に有利な結果が観察された。この群のマウスは、体重が有意に増加し（イソニアジド対照第３群での２０．７％に対して３０．８％）、肺重量係数（対照第３群における１．０７±２３に対して１．３８±０．０６）および脾重量係数（第３群における１．９４±０．３１に対して１．５９±０．２５）は減少した。この時点で、第７群マウスの脾臓から培養したＭ．ｂｏｖｉｓの成長に有意な減少があった（第３群の２７５±１４．１ ＣＦＵに対して２００±０ ＣＦＵ）。
【００４５】
ＳＣＶ−０７治療による処置で１０回の注射を行うと（第６群）、同じ用量での５回の注射（第５群）よりも、よい応答が得られたようである。脾臓培養物におけるＭ．ｂｏｖｉｓの成長量は、第６群では有意に低下した（対照群での２７５±１４．１ ＣＦＵに対して１９０±２１．５ ＣＦＵ）。しかし処置２４日後の第５群にはこの傾向はなかった。
【００４６】
断頭後に、血液をペトリ皿に収集し、凝血する前に、直ちにスライドを調製した。風乾したスライドを９６％エタノールで１０分間固定し、ギムザ染色によって染色した。各スライドでは、１００〜２００個の細胞を計数し、結果をパーセンテージとして表した。白血球数の場合は、１０μｌの血液を９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ，マサチューセッツ州ケンブリッジ）で１９０μｌの酢酸水溶液と混合し、倍率１００倍の油浸法で行った。Ｇｏｒｉａｅｖ血球計数器で数を決定した。
【００４７】
結核感染は感染対照群である第２群に見られるように総血液リンパ球数の減少および好中性顆粒球数の増加を引き起こす。ＳＣＶ−０７治療はこれらの数の変化を誘発する。処置動物における有意な変化は治療４日後までは観察されなかったが、治療１０日後には、第６群、第７群、第８群および第９群（ＳＶＣ−０７用量１μｇ／ｋｇ ｉｐ；１０回注射；０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ；５回注射および１μｇ／ｋｇ ｐｏ、イソニアジド対照群である第３群との比較）に見られるように、単球レベルの低下が起こった。１７日間のＳＣＶ−０７治療後には、リンパ球数の増加および好中球のパーセンテージの有意な減少が第８群および第９群（０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐおよび１μｇ／ｋｇ ｐｏ）に起こった。２４日後には、群間の相違はそれほど明白ではなかった。
【００４８】
マウスの胸腺を無菌的に収集し、ホモジナイズし、ＲＰＭＩ−１６４０培地に懸濁し、２層の滅菌ガーゼを通して濾過した。細胞懸濁液を、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび８０μｌ／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した後、Ｇｏｒｉａｅｖ血球計数器を使って計数した。
【００４９】
ＳＣＶ−０７処置（第４〜９群）マウスと対照（第１〜３群）マウスとの間で基礎胸腺細胞増殖に有意差はなかった。これに対して、４日間の治療後は、第７群（ＳＣＶ−０７用量０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）におけるＣｏｎＡ刺激胸腺細胞増殖が、第３群（イソニアジド対照）よりも有意に高かった。他の群での相違は明白でなかった。それ以降の時点ではすべての群で増殖は増加したが、ＳＣＶ−０７処置群では増殖が有意に高かった。１７日目までに、第７群および第８群（０．１および０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐ）での増殖応答は、非感染マウスと基本的に同じ応答を示した。２４日目までに、第６群、第７群および第８群（１μｇ／ｋｇ、１０回注射ｉｐならびに０．１および０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐ）での増殖は非感染マウスとの類似性を示し、イソシアニド対照第３群よりも多数だった。
【００５０】
マウスから脾臓を無菌的に収集し、ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏｌｏｔ，ロシア）でホモジナイズし、２層の滅菌ガーゼを通して濾過した。ホモジネートを遠心分離した後、赤血球を０．８３％塩化アンモニウム溶液中で溶解した。２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび８０μｌ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）を含むＲＰＭＩ−１６４０で脾細胞を２回洗浄し、Ｇｏｒｉａｅｖ血球計数器を使って計数した。
【００５１】
ＳＣＶ−０７治療の１７日後に、リンパ球産生量の増加および好中球のパーセンテージの有意な低下が、第８群および第９群（０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐおよび１μｇ／ｋｇ ｐｏ）でみとめられた。２４日間のＳＣＶ−０７治療後は、群間の相違はそれほど明白ではなかった。
【００５２】
脾細胞増殖データを記載する。ＳＣＶ−０７処置動物では、分裂促進因子（ＣｏｎＡおよびＬＰＳ）が誘発する応答の回復が、イソニアジド処置動物よりも早く起こる。２４日間のＳＣＶ−０７治療後は、第６群（１μｇ／ｋｇ，１０回注射ｉｐ）でのＬＰＳによる増殖応答ならびに第６群および第７群（１μｇ／ｋｇ，１０回注射 ｉｐおよび０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）でのＣｏｎＡによる増殖応答は、非感染マウスと差がなかった。一方、イソニアジド対照群である第３群では、増殖応答は低いままだった。
【００５３】
ツベルクリンに対する脾細胞増殖応答は、４日間の治療後はどの群でも低いままだったが、その後、第６群（１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射）の増殖応答は、対照群より有意に高くなった。
【００５４】
脾細胞および胸腺細胞を上述のように単離した。インビトロで、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび４％熱非働化ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）を含むＲＰＭＩ−１６４０で、胸腺細胞を１０⁷／ｍｌに希釈した。脾細胞は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび２０％非働化ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０で、３×１０⁶／ｍｌに希釈した。０．５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ，Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）を使って、胸腺細胞増殖を刺激した。脾細胞増殖には、０．５μｇ／ｍｌ ＣｏｎＡ、１０μｇ／ｍｌリポ多糖（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス）および５０μｇ／ｍｌツベルクリン精製タンパク質（ＰＰＤ）を使用した。測定は９６穴プレートで行い、細胞培養物を湿潤５％ＣＯ₂下に３７℃で７２時間（ツベルクリンを使用する場合は９６時間）インキュベートした後、５μｌ Ｃｉ／ｍｌ ³Ｈ−チミジンを一晩（約１６時間）パルスし、半自動収集装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ（商標），Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ノルウェー）を使ってフィルター上に収集した。フィルターを乾燥し、液体シンチレーションカウンター（ＬＫＢ １２１７ Ｒａｃｋｅｔａ，スウェーデン・ウォーレス）で試料をカウントすることにより、³Ｈ−チミジン取り込み量で増殖量を計算した。データを１分あたりのインパルスとして表した。
【００５５】
食作用を調べるために、腹膜マクロファージをペトリ皿１枚あたり１０⁶細胞の濃度で播種し、マウス血清でオプソニン処理した１０⁷個のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（サッカロミセス・セレビシェ）細胞を含む培地を加えた。結果はマン−ホイットニー検定を使って評価した。食細胞に関与するマクロファージのパーセンテージを決定してから、食細胞活性を計算した。食作用係数は、１細胞あたりの貧食された酵母の平均数を計算することによって決定した。殺細胞活性は、１．５時間のインキュベーション後にマクロファージによって消化された酵母の数によって表した。最後に殺細胞係数は次のように計算した。
【００５６】
ＫＩ＝（１時間後の食作用係数）／（２．５時間後の食作用係数）
結核への感染は、腹膜食細胞活性、食作用係数および食作用による酵母細胞の殺滅を減少させる。感染後、２８日目の食細胞活性は、非感染マウスにおける６４．２％と比較して４．６％だった（ｐ≦０．０１）。食作用による殺細胞は２分の１に減少した。イソニアジド治療はこれらの食細胞活性係数を増加させたが、非感染マウスに見られるレベルには至らなかった。ＳＣＶ−０７治療により、４日間の処置後に、第７群（０．１μｇ／ｋｇ ｉｐのＳＣＶ−０７用量）では、第３群（イソニアジド対照群、ｐ≦０．０５）での１９．４％と比較して、食細胞活性が３８．８％まで著しく上昇した。ＳＣＶ−０７処置により、食作用係数も正常化し、殺細胞も増加した（対照における１９６．４に対して２４４．４、ｐ≦０．０５）。
【００５７】
ＳＣＶ−０７治療の１０日後に観察された薬物の効果は低くなっていた。これはおそらくイソニアジド治療の結果だろう。殺細胞は第５群（１μｇ／ｋｇ，ｉｐ）でのみ対照と比較して有意に増加した。結核の重症度に対して薬物が示す効力がごくわずかであった動物群では、摂取および殺細胞が低下する傾向があった（第８群および第９群，０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐおよび１μｇ／ｋｇ ｐｏ）。
【００５８】
１７日にわたるマウスのＳＣＶ−０７治療後に、第３群（イソニアジド対照）では摂取および殺細胞の低下。第６群（１．０μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射）では、ＳＣＶ−０７処置マウスのすべてが、より顕著な食作用係数の増加を示した。この群における食細胞活性のレベル（第３群における４９．８％に対して６０．４％）および食作用係数（６．８８Ｕ対４．９１Ｕ，ｐ＝０．０５）は非感染マウスと同じままだった。殺細胞および殺細胞係数はどちらも増加し、他のＳＣＶ−０７処置群での食細胞機能が増加する傾向は明白だった。
【００５９】
イソニアジド処置群における食作用は、処置後２４時間で、非感染マウスにみられるレベルまで戻った。しかし、食作用による殺細胞の減少は依然として存在した（非感染マウスにおける１７８．０に対して第３群では６２．０Ｕ，ｐ＝０．０５）。これはマクロファージ殺細胞の低下をもたらすイソニアジドの免疫抑制効果だったと考えられる。ＳＣＶ−０７処置は、第６群および第７群（１．０μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射および０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）では特に、マクロファージ殺細胞を有意に改善した。
【００６０】
１０％ウシ胎仔血清および１０ＩＵ／ｍｌヘパリンを含むイーグル培地（Ｂｉｏｌｏｔ，ロシア）からなる液体を使った腹腔洗浄によってマウス腹膜細胞を収集した。計数した細胞および細胞懸濁液を９６穴プレート（１００μｇ／ウェル）に入れた。プレートを湿潤ＣＯ₂下に３７℃で１時間インキュベートした後、上清を除去し、付着細胞単層を温かい（３７℃）イーグル培地で３回洗浄し、乾燥し、次に固定し、３０％メタノール中の０．０３％クリスタルバイオレット溶液で染色した。プレートリーダーを使ってプレートを５９５ｎｍで読み取れるようにし、結果を吸光係数（試料中の細胞数に関係する）として表した。
【００６１】
イーグル培地中の腹膜細胞懸濁液を１２００ｒｐｍで遠心分離した。培地をデカントし、細胞を０．９％食塩水で洗浄し、ｐＨ７．２の０．１％ＮＢＴ ＨＢＳＳ溶液に再懸濁した。これらの反応は９６穴プレートで行った。計数した細胞を１００μｌの液量でウェルに入れ、湿潤ＣＯ₂下に３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後に、上清をデカントし、プレートを室温で乾燥し、細胞を７０％エタノールで固定した。２Ｍ水酸化カリウムおよび１４０μｌ ＤＭＳＯの溶液に、ジホルマザンを加えた。プレートリーダーを使って、プレートを６４０ｎｍで読み取り、結果を吸光係数（試料中の細胞数に関係する）として表した。
【００６２】
１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび８０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０で脾細胞を１０⁷／ｍｌの濃度に希釈した。１００μｌの細胞懸濁液を９６穴培養プレートの各ウェルに加え、最終濃度２．５μｇ／ｍｌのＣｏｎＡによってサイトカイン産生を誘導した。対照ウェルにはＲＰＭＩ−１６４０を入れた。細胞を５％ＣＯ₂の湿潤雰囲気下に３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後に、１５０μｌの上清を各ウェルから取り出し、−７０℃で保存した。
【００６３】
細胞培養上清中のＩＬ−２濃度を決定するために、ＣＴＬＬ−２ ＩＬ−２依存性細胞株を使用した。ＣＴＬＬ−ＩＬ−２細胞をＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、Ｇｏｒｉａｅｖ血球計数器で計数した。上清を９６穴培養プレートにて１：５、１：１５、１：４５および１：１３５の希釈率で１００μｌの体積に希釈した。ＩＬ−２標準希釈液も調製した。１０％非働化ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、８０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ−１６４０で細胞を２×１０⁵／ｍｌに希釈した。その懸濁液１００μｌを培養プレートの各ウェルに加え、５％ＣＯ_２湿潤雰囲気下に３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベーションを終了する１６時間前に、１０μｌの５μＣｉ／ｍｌ ³Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた。インキュベーション後に、半自動収集装置を使って、細胞をフィルター上に収集し、液体シンチレーションカウンターで試料をカウントした。
【００６４】
結核感染後にはＣｏｎＡ刺激脾細胞におけるＩＬ−２産生量の減少が起こった。これに対し、すべての処置群で、治療後のどの時点においても、ＩＬ−２産生量の増加が観察された。第７群および第８群（ＳＶＣ−０７用量０．１および０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐ）では、第３群と比較して、ＳＣＶ−０７治療の４日後には早くも、ＩＬ−２産生量が著しく増加した（それぞれ４１．６±５．６Ｕ／ｍｌおよび３９．１±２．８Ｕ／ｍｌ対１６．６±２．６Ｕ／ｍｌ）。ＳＣＶ−０７治療の２４日後時点で、第６群（１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射）および第７群（０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）でのＩＬ−２レベルは、非感染マウスと差がなかった。
【００６５】
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（商標）ＥＬＩＺＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネソタ州ミネアポリス）を使用し、キットの説明書に従って、ＣｏｎＡ刺激脾細胞上清のＩＬ−４およびＩＮＦ−γ測定も行った。プレートをＩＬ−４またはＩＦＮ−γに対するモノクローナル抗体でコートし、ブロックした。次に、標品および試料を加えた。細胞を２時間インキュベートし、洗浄した後、比色用基質を加えた。３０分後に反応を停止し、プレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ（商標）３５５０，ＢｉｏＲａｄ，日本）を使って４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【００６６】
ＳＣＶ−０７治療４日後の基礎ＩＦＮ−γ産生量にイソニアジド対照マウス（第３群）との差は認められなかった。しかし、ＳＣＶ−０７治療の１０日後には、第５群、第６群および第７群（ＳＣＶ−０７用量１μｇ／ｋｇ ｉｐ，５回注射；１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射および０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）で、基礎ＩＦＮ−γ産生量の有意な上昇が起こった。ＳＣＶ−０７治療の１７日後には、この増加がすべてのマウスで観察された。実験の終了時には、第６群（１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射）にのみ、このＩＮＦ−γ産生量の増加の維持が見られた。
【００６７】
基礎ＩＬ−４産生量の有意な変化は起こらなかった。ＣｏｎＡはＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生を刺激した。注目すべきことに、ＩＬ−４産生量とＩＦＮ−γ産生量とは反対向きに変化した。ＳＣＶ−０７治療の１０日後に、ＩＮＦ−γ産生は第４群、第５群、第６群および第８群（１０および１μｇ／ｋｇ ｉｐ，５回注射；１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射；ならびに０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐ ｉｐ）で刺激を示し、ＩＬ−４産生は第５群、第６群および第７群（１μｇ／ｋｇ ｉｐ，５回注射；１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射、および０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）で有意に減少した。
【００６８】
血清中のＩＮＦ−γとＩＬ−４の濃度。１０日間のＳＣＶ−０７治療後に、第４群、第５群、第６群および第７群（１０および１μｇ／ｋｇ ｉｐ，５回注射；１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射；ならびに０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）ではＩＦＮ−γレベルが増加し、同時に、同じ群でＩＬ−４レベルは低下した。これらの変化は１７日間のＳＣＶ−０７処置後にも同様にみとめられた。第４群、第５群、第６群、第７群および第８群ではＩＦＮ−γの濃度が増加し（第７群および８群では有意に増加、０．１および０．０１μｇ／ｋｇ ｉｐ）、それと同時に第５群、第６群および第７群（１μｇ／ｋｇ ｉｐ，５回注射；１μｇ／ｋｇ ｉｐ，１０回注射；および０．１μｇ／ｋｇ ｉｐ）ではＩＬ−４が有意に減少した。
【００６９】
マウスでは、イソニアジド結核治療中のＳＣＶ−０７処置は、疾患の重症度および免疫応答の強さに、影響を及ぼす。ＳＣＶ−０７を０．１μｇ／ｋｇの用量で５日間毎日ｉｐ注射すると、肺重量係数および肺損傷係数が有意に減少する。これらのマウスならびに１．０μｇ／ｋｇの用量で１０日間毎日注射を受けたマウスおよび０．０１μｇ／ｋｇの注射を５日間毎日受けたマウスでは、脾臓培養におけるＭ．ｂｏｖｉｓの成長も低下した。
【００７０】
ＣｏｎＡ刺激胸腺細胞増殖の改善はＳＣＶ−０７処置の４日後には早くもみられる。ＳＣＶ−０７治療の１０日後には、ＬＰＳまたはツベルクリンで刺激された増殖に、増大がみられる。ＳＣＶ−０７処置２４日後では、胸腺細胞および脾細胞のどちらについても、増殖応答がほぼ非感染動物の応答まで回復する。
【００７１】
マクロファージ機能のＳＣＶ−０７刺激が起こるが、結核感染およびイソニアジド治療によって低下していた摂取および殺細胞能力の改善が起こる。免疫応答のもう一つの尺度であるサイトカインの産生はＳＣＶ−０７の処置によって増加する。脾細胞によるＩＬ−２の産生量は結核への感染によって低下するが、ＳＣＶ−０７処置の４日後には、特定の群で、低下量が有意に少なくなる。処置の２４日後には、他の群におけるＩＬ−２産生量が非感染動物レベルまで回復する。
【００７２】
最後に、胸腺細胞および脾細胞による基礎および刺激ＩＮＦ−γ産生量はいずれも、ＳＣＶ−０７処置後に増加する。ある時点では、これらと同じマウスで、ＩＬ−４産生量が低下する。特定の群では、ＩＬ−４のＣｏｎＡ刺激産生量が低下し、ＩＬ−４の血清レベルもこの変化を反映する。これらの変化、すなわちＩＮＦ−γの増加およびＩＬ−４産生量の低下から、ＳＣＶ−０７処置はＴヘルパー細胞応答からＴｈ１様免疫応答へのシフトをもたらしていることが示唆される。
【００７３】
明解な理解が得られるように例を挙げて本発明を多少詳しく説明したが、本願特許請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲から逸脱することなく、改変および変更を加えることができる。

Claims (16)

1. 治療有効量の式Ａ：
   

   

   ［式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、Ｘは芳香族もしくは複素環式アミノ酸またはその誘導体である］
   の免疫調節剤を、結核を持つ動物に投与することを含む、動物の結核を処置する方法。
2. Ｒは水素、炭素原子数２〜約１０のアシル、または炭素数１〜約６のアルキルであり、ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンであって、式Ａに示すＣＨ基の炭素は、ｎが２である場合には、Ｘの立体配置とは異なる立体配置を持つ、請求項１に記載の方法。
3. ＸがＬ−トリプトファンである、請求項２に記載の方法。
4. 前記免疫調節剤がγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎ_in−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、およびβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記免疫調節剤がγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン（ＳＣＶ−０７）である、請求項１に記載の方法。
6. 前記免疫調節剤が約０．００１〜１０ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
7. 前記免疫調節剤が約０．０１〜１ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
8. 前記ＳＣＶ−０７が約０．０１〜１ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項５に記載の方法。
9. 前記投与量が約０．１ｍｇである、請求項８に記載の方法。
10. 結核に対して有効な治療有効量の抗菌化合物の投与をさらに含み、前記抗菌化合物がイソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、カナマイシン、エタンブトール、ストレプトマイシン、カプレオマイシン、アミカシンおよびサイクロセリンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
11. 前記治療有効量の抗菌化合物が約１００〜１０，０００ｍｇの範囲内の投与量である、請求項５に記載の方法。
12. 前記治療有効量の抗菌剤が約２００〜２，０００ｍｇの範囲内の投与量である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記治療有効量の抗菌化合物が約４００〜１，０００ｍｇの範囲内の投与量である、請求項１０に記載の方法。
14. 前記動物がヒト患者である、請求項１に記載の方法。
15. 式Ａ：
    

    

    ［式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、Ｘは芳香族もしくは複素環式アミノ酸またはその誘導体である］
    を有する免疫調節剤を含む、結核処置用化合物。
16. 医薬的に許容できる担体と、治療有効量の式Ａ：
    

    

    ［式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキルまたはペプチド断片であり、Ｘは芳香族もしくは複素環式アミノ酸またはその誘導体である］
    の免疫調節剤とを含む、結核処置薬製造用化合物。