JP2004536824A - Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対するヒト化モノクローナル抗体を作製するためのＤＮＡ分子および組換えＤＮＡ分子 - Google Patents
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Abstract
人間の齲食症は、S. mutansのような齲食原性生物の表面抗原と結合するヒトまたはヒト化マウスモノクローナルIgGおよびIgM抗体の経口摂取により、予防または治療することができる。遺伝子工学的に作製されたモノクローナル抗体は、齲食原性生物と結合すると、ヒト免疫系のエフェクター装置を引き出して、結果的に該生物を破壊する。好ましい実施形態では、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体が、発現の際に所望の抗体をコードするDNA配列により形質転換された食用植物（果実および野菜を含む）により産生される。抗体はその植物を食することによって供給される。
Description
【技術分野】
【０００１】
本出願は、齲食症を治療および予防するための免疫学的方法論に関するものである。本発明は特に、確立された自己管理の原理を応用する能力または動機づけのない患者（例えば、幼児、虚弱な人たち、教育のない人たち）に対して適用される。
【背景技術】
【０００２】
齲食症（虫歯）および歯周疾患はおそらく世界中で最もありふれた慢性疾患である。歯に窩洞が形成されるのは細菌が感染したためである。それゆえ、齲食の発生は、石灰化された歯の組織の局所破壊をもたらす伝染性微生物疾患とみなすのが適切である。
【０００３】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）はヒトの虫歯の主たる原因であると考えられている。S. mutansが歯苔にたくさん存在していて、複合糖を代謝すると、生成する有機酸が歯表面の無機質脱落を引き起こす。その結果は齲食病巣であり、これは一般に窩洞として知られている。乳酸杆菌属（Lactobaccilli）や放線菌属（Actinomyces）のような、その他の生物も齲食病巣の進行および形成に関与していると考えられる。本明細書では、虫歯の原因となるこれらの生物を「齲食原性生物」と呼ぶことにする。
【０００４】
歯の損傷部分を取り除き、充填して修復することは、少なくとも一時的には、齲食原性生物による口腔感染に起因する損傷を食い止めることができる。しかし、「削る・詰める」（drill and fill）の方法は原因となる細菌を排除するものではない。適切な口腔衛生により、歯苔（そこでは齲食原性生物が増殖して、歯の表面を攻撃する）の蓄積をコントロールすることができる。ところが、歯の自己管理には限界があり、特に自分自身の管理ができない人たちの場合や、適切な自己管理のやり方の知識がない場合にそうである。フッ化物イオンの投与は齲食を少なくするものの、その発生を止められないことが分かっている。
【０００５】
齲食の病因に齲食原性生物が関与しているという不可抗的な証拠を考慮すると、伝統的な抗微生物療法を用いて齲食状態を改善するための様々な試みが存在していても驚くことではない。抗微生物剤の難点は、それらが齲食原性生物に選択的でないということである。特異的でない殺菌剤の投与は、予測し得ない結果を伴って、口腔内に常在する生物のバランスを乱し、しかも病原性生物に都合のよい条件を提供する環境を作り出す可能性がある。さらに、抗微生物剤を長期間使用すると、かかる薬剤に耐性を示す生物が選び出されることが知られている。したがって、虫歯を予防するために多くの人たちが抗微生物剤を長期間にわたり使用することは実際的でない。
【０００６】
また、S. mutansや他の齲食原性生物に対する能動免疫応答を引き出すためのヒトへのワクチン接種も現時点では実用的な解決策でない。この方法の一つの欠点は、ワクチン接種が主としてIgGおよびIgM抗体の生産を誘導するものの、それらは唾液中に分泌されないことである。唾液中に存在する抗体は大部分がIgAアイソタイプのもので、これらはリンパ球または補体成分と結合し得るが、リンパ球や補体成分を活性化して細菌を殺すことはできない。したがって、ワクチン接種が免疫系の引き金を引いて、口中の齲食原性生物を死滅させる抗体を産生できる可能性があるとは考えられない。口腔においてワクチン接種により誘導されたIgGまたはIgMアイソタイプの抗体の力価を選択的に増加させる方法はまったく知られていない。
【０００７】
これまでに、動物やヒトの虫歯を予防するため、マウスで誘導されたモノクローナルIgA抗体を用いて患者をS. mutansに対して受動免疫する試みがいくつか報告されている。IgAは多価抗体であるので、1つのIgA分子はいくつかの異なる抗原部位に結合することができ、結果的に細菌の凝集をもたらす。しかしながら、細菌の表面抗原にIgAが結合しても、細菌は死滅しない。むしろ、凝集は細菌が歯の表面に結合する能力を妨げると考えられている。この方法のもう一つの欠点は、マウス（すなわち、異種）抗体のヒトへの反復投与が該抗体に対する免疫応答を惹起する可能性があることである。
【０００８】
IgA抗体と違って、IgGおよびIgMクラスの抗体には殺菌効果がある。IgMまたはIgG抗体が齲食原性生物の表面に存在する抗原と結合すると、細菌細胞は、現在知られている2つの別々のメカニズム、すなわち、補体媒介細胞溶解および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性、のいずれかにより破壊されると考えられる。いずれの場合にも、特定の微生物と選択的に結合する抗体は免疫系による破壊のための細胞だけを標的とする。補体媒介細胞溶解および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性はどちらも、IgGおよびIgMクラスの抗体により媒介される体液性免疫応答の一部である。
【０００９】
抗体結合の所望の細胞傷害効果を引き出すためには、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体がヒト免疫系によって認識されねばならない。ヒト免疫系からの応答を誘発しうる抗体を作製するための技術がいくつか存在する。一つの例はキメラ抗体を作製する方法であり、この方法は異なる供給源からの可変ドメインをコードする配列を含むように改変されたヒト抗体の発現をコードする核酸構築物を使用する。もう一つの方法はファージディスプレイを利用するもので、ファージディスプレイを用いてモノクローナル抗体の実際の結合部位である相補性決定領域（CDR）を決定し、次いで、該CDRをヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域に部位特異的突然変異誘発によりグラフトする。当技術分野で公知の別の方法は、体液性免疫系に関与することができる抗体の生産を可能にするもので、つぎの方法が含まれる：1)ヒト抗体を産生するように遺伝的に改変されたマウスを免疫する；2)単離したヒトＢ細胞をin vitroで免疫し、次に細胞融合法を用いて抗体を分泌するハイブリドーマを作製する；および3)急性感染症のヒトからＢ細胞を単離し、抗体産生ハイブリドーマを作製する。
【００１０】
このような遺伝子工学的に作製されたヒト化またはヒトモノクローナル抗体を製造して、ヒトの齲食を治療するために投与することには問題があり、革新的な解決策が必要となる。モノクローナル抗体を生産するための従来技術の方法は、ハイブリドーマを培地で増殖させた後、所望の抗体を抽出して精製する必要があった。本発明の好ましい実施形態においては、抗体を食用の植物または動物内で発現させることによって、こうしたステップが顕著に簡便化されている。抗体の投与は、植物または動物の産物、例えば、果実、野菜またはミルク（抗体が変性していない）などを経口摂取することで可能である。この投与様式は虫歯を改善する際のコンプライアンスの問題を回避できる可能性がある。
【００１１】
米国特許出願第09/378,247号は、S. mutansに特異的な3種類のマウスモノクローナル抗体、すなわち、SWLA1、SWLA2およびSWLA3を開示している。齲食の治療および予防に有効な免疫学的方法を開発するには、S. mutansに特異的なモノクローナル抗体を発現すると共にヒト免疫系のエフェクター機構に関与するように遺伝子操作されたモノクローナル抗体を作製する必要がある。
【発明の開示】
【００１２】
齲食は、S. mutansのような齲食原性生物の表面抗原と結合するヒトまたはヒト化マウスモノクローナルIgGおよびIgM抗体の経口摂取により、予防または治療することができる。遺伝子工学的に作製されたモノクローナル抗体は、齲食原性生物と結合すると、ヒト免疫系のエフェクター装置(effector apparatus)と結びついて、結果的にそれらを破壊する。好ましい実施形態では、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体が、所望の抗体の発現をコードするDNA配列により形質転換された食用植物（果実および野菜を含む）により産生される。遺伝子工学的に作製されたモノクローナル抗体はその形質転換植物を食することによって供給される。
【００１３】
本発明者らは、このたび、S. mutansに特異的なモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を単離し、配列決定した。発現させると、これらの配列によりコードされたモノクローナル抗体は、S. mutansと特異的に結合する。組換え技術を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に結合させ、それによってS. mutansと特異的に結合するキメラモノクローナル抗体を作製した。このキメラモノクローナル抗体は齲食原性生物の表面抗原に対して特異的であり、標的生物に結合すると、免疫系からエフェクター応答を生じさせる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
1. モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体技術は格別すぐれた特異性を有する抗体の作製を可能にする。特定の分子構造と結合するモノクローナル抗体は、今日では標準的な技法と考えられている方法を使って製造することができる。
【００１５】
本発明において使用できるモノクローナル抗体は、齲食原性生物の表面抗原に対して誘導されたものである。表面抗原とは細胞の表面に展示される物質のことである。このような抗原は体液中に存在する抗体に近づきやすい。本発明に関連して、齲食原性生物の表面抗原は齲食を生じさせる生物の表面に存在する。齲食病変の発生における細菌活性の役割は明確に確定されているが、特定の生物と齲食の発生との間の因果関係を確立することは、完全には成功を収めていない。これまでは、S. mutansのみが齲食と決定的に関係があるとされてきた。しかしながら、乳酸杆菌属（Lactobaccilli）や放線菌属（Actinomyces）の細菌種も関与していると考えられ、特に齲食病変の活発な進行の場合がそうである。齲食病変を生じさせる生物はいずれも、本発明に従って製造および使用されるモノクローナル抗体の潜在的な標的となる。
【００１６】
本発明の実施において使用できるモノクローナル抗体の更なる必要条件は、それらが齲食原性生物に対して選択的であるということである。齲食原性だけでなく非齲食原性の生物にも存在する抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体は、口腔内の細菌叢の構成に非特異的な改変を生じさせる可能性がある。かかる変化の結果は分かっていない。
【００１７】
したがって、好ましいモノクローナル抗体は齲食原性生物の表面抗原と選択的に結合するものである。すなわち、好ましいモノクローナル抗体は齲食を引き起こす生物と特異的に結合するものである。
【００１８】
本発明の範囲はヒトの虫歯予防に限られないことを明確に理解すべきである。本発明に従うモノクローナル抗体は、その他の哺乳動物（例えば、ペットとして飼われている動物）の免疫系のエフェクター応答を引き出すように遺伝子工学的に作製してもよい。
【００１９】
モノクローナル抗体を作製するには、マウスまたは他の哺乳動物宿主を齲食原性生物から単離された細胞壁材料で免疫する。好ましい実施形態では、齲食原性生物はｃタイプのS. mutans (ATCC25175)である。細胞壁中に存在する分子の免疫原性は当技術分野で公知のいろいろな技法により増強することができる。好ましい実施形態では、かかる分子の免疫原性が、単離した細胞材料をホルマリンで変性することにより増強される。細胞壁タンパク質を改変して免疫原性を高めるためのその他の技法も本発明の範囲内である。一般的には、抗体の力価を増加させるために、犠牲にしてクローニングする前に、宿主に単離した細菌細胞断片をさらに１回以上注入する。
【００２０】
宿主から脾細胞を回収する。融合パートナーとしてNSI/Ag4.1マウスミエローマ細胞系
を使用し、5% CO2、37℃でスピナー培養にて増殖し、融合に先立って対数増殖期に維持した。Kohlerら Nature, 256:495-497, (1975)に記載される手法に従ってハイブリドーマを作製した。HAT（100μgヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン）を含む培地中でハイブリッドを選択した。アミノプテリンを抜き取った後、培地中のHT（100μgヒポキサンチン、16μMチミジン）を2週間維持した。ハイブリドーマのクローニングの間、追加の増殖因子としてOPI（1mMオキザロ酢酸、0.45mMピルビン酸、および0.2U/mlウシインスリン）を組織培養物に添加した。ハイブリドーマは、KohlerとMilsteinの先駆的研究以来標準的になった技法を用いて限界希釈によりさらにクローニングした。好ましい実施形態では、生存しているハイブリドーマを、ホルマリン処理した細菌細胞材料をコーティングしたマイクロタイタープレートに対するELISAアッセイにより、齲食原性生物に特異的な抗体についてスクリーニングした。陽性の上清を更なるスクリーニングに供して、齲食原性生物に対する親和性が最も高い抗体を分泌するクローンを同定した。好ましい実施形態では、バックグラウンドより少なくとも3倍高い力価を示したクローンは、S. mutans由来の変性細胞壁材料との免疫沈降を用いて、再度スクリーニングする。好ましい実施形態において、S. mutans株ATCC25175、LM7、OMZ175およびATCC31377とのみ検出可能に結合するクローンが3個同定された。これらのクローンをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託して、受託番号HB 12599 (SWLA1)、HB 12560 (SWLA2)、およびHB 12558 (SWLA3)を受け取った（米国特許出願第09/378,247号）。
【００２１】
齲食原性生物の表面抗原に特異的なヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の発現をコードする核酸配列を取得するための方法はいろいろ存在している：1)齲食原性生物に対するモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを単離し、該抗体の発現をコードするマウス遺伝子をクローニングする；2)精製した齲食原性生物を用いてヒトＢリンパ球から作製したファージディスプレイランダムライブラリーをスクリーニングすることにより、齲食原性生物に特異的な抗体をコードする遺伝子を取得する；3)重度感染患者から回収されたＢリンパ球を用いて、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体を産生するヒトハイブリドーマを単離し、これらの抗体をコードするヒト遺伝子をクローニングする；または4)精製した齲食原性生物を用いてin vitroでヒトＢリンパ球と脾細胞を免疫し、続いて融合によりハイブリドーマを形成させて不死細胞系を作製する。必要とされる技法は当業者に公知であり、ここに記載する方法に限定されるものではない。
【００２２】
2. ヒト免疫系からエフェクター応答を引き出すことができるモノクローナル抗体の作製
齲食予防の免疫学的方法を開発するためのこれまでの努力は異種抗体を利用するものであった。例えば、Lehnerの米国特許第5,352,446号は、マウスにおいて誘導されたS. mutans表面抗原に対するモノクローナル抗体を、これらの細菌のサル体内での増殖を抑制する際に使用することに関する。最近では、Maら、Nature Medicine, 45(5) 601-6 (1998)に、タバコ植物で発現させたS. mutansに対する遺伝子操作型マウス分泌モノクローナル抗体を用いて、ヒトで同様の結果を得たことが報じられている。このアプローチの欠点として以下が挙げられる：1)投与によって有害な生物を凝集させることができるが、非ヒト抗体はヒト免疫応答を効果的に引き出せないので、それらの生物を死滅させない；また、2)かかる抗体を繰り返し投与すると、患者からその抗体に対する免疫応答が惹起されうる。好ましいアプローチは、組換え法を用いて齲食原性生物の表面抗原に特異的なキメラ抗体分子を作製することであり、かかる抗体はまた、標的生物に結合すると、抗体で処置された哺乳動物の免疫系からエフェクター応答を引き出すであろう。これを達成するには、齲食原性生物に特異的なマウスモノクローナル抗体からの可変領域を、処置すべき哺乳動物からのIgGおよび／またはIgMクラスの抗体に挿入する。また、齲食原性生物に特異的なマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）だけを利用した抗体を作製することも可能である。公知の組換え技法により、免疫グロブリンの可変ドメインにCDRを移し変える。
【００２３】
抗体を直接的に生成させる方法も知られている。例えば、1)ヒト抗体を産生するように遺伝的に改変されたマウスを免疫する方法；2)単離したヒトＢリンパ球をin vitroで免疫し、その後細胞融合法を経て抗体を分泌するハイブリドーマを作製する方法；および3)急性感染症のヒトからＢリンパ球を単離し、抗体産生ハイブリドーマを作製する方法である。必要とされる技法は当業者に公知である。それぞれの方法はヒト抗体をもたらすので、該抗体はその特異的抗原に結合した後で体液性免疫エフェクター系を引き出すことができる。
【００２４】
本発明の目下好ましい実施形態においては、S. mutansに特異的なキメラ抗体を作製した。PCRまたはサザンブロット法を用いて、齲食原性生物の細胞表面抗原に特異的な抗体を分泌するマウスハイブリドーマの可変ドメインをコードするDNA断片を単離した。遺伝子クローニング法を用いて、その可変領域をヒト免疫グロブリンの定常領域に結合させた。この遺伝子操作の結果は、齲食原性生物の表面抗原と選択的に結合する可変ドメインを有するが、その定常領域を介してヒト免疫エフェクター系と相互作用するキメラ抗体分子である。
【００２５】
3. モノクローナル抗体の投与
臨床用途のために十分量のモノクローナル抗体を製造するには、免疫グロブリンをコードする配列でトランスフェクトされた所望の細胞系を増やさなければならない。既存の技術によって組織培養でのモノクローナル抗体の大規模生産は可能である。トランスフェクト細胞系はモノクローナル抗体を組織培養培地中に分泌する。分泌されたモノクローナル抗体を回収して、ゲル濾過およびタンパク質化学の関連技法により精製した。
【００２６】
実験的研究において、S. mutansに対するモノクローナル抗体は歯の表面に直接適用されてきた。また、口内洗浄剤の経口摂取による適用やチューインガムによる適用も提案されてきた。目下好ましい代替法は、バナナやブロッコリーのような食用植物において本発明のキメラモノクローナル抗体を発現させることである。本発明に従って形質転換された植物を食べることにより、結果的に、歯の表面や口内のどこかに存在する齲食原性生物に対する抗体が適用されるだろう。その他の生物（植物と動物の両方）を形質転換して、ここに記載のモノクローナル抗体を発現させることもできると考えられ、かくして、この種の抗体を、例えばミルクを飲むことで、摂取してもよい。
【００２７】
以下の実施例において、添付の図１〜８を参照しながら、単なる例示として、本発明を説明することにする。
【実施例】
【００２８】
1. S. mutans に対するマウスモノクローナル抗体の作製
ｃタイプS. mutans株ATCC25175をBHI培地で対数期へと増殖させ、3000xg、5分間の遠心分離によりリン酸緩衝溶液pH7.2（PBS）で2回洗浄した。このペレットを１% ホルマリン／0.9% NaCl中に再懸濁し、室温で30分間混合し、0.9% NaClで2回洗浄した。ホルマリン処理済みのインタクトなS. mutans細菌細胞を約108個含有する抗原100μl（フロイント不完全アジュバント(FIA)で乳化したもの）を腹腔内注入してBALB/cマウス(8〜10週)を免疫した。3〜5週間後、マウスに2回目の抗原量（FIA中の108個のインタクトな細菌細胞）を投与した。犠牲にする3日前に、食塩水中の108個のインタクトな細菌細胞を静脈内に注入してマウスを追加免疫した。
【００２９】
宿主から脾細胞を回収した。用いた組織培養培地は、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび10mM HEPESを補充し、かつ10% ウシ胎児血清と共に100μg/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640 (Gibco)培地であった。NSI/Ag4.1マウスミエローマ細胞系を融合パートナーとして使用し、5% CO2、37℃でスピナー培養にて増殖し、融合に先立って対数増殖期に維持した。Kohlerら, Nature, 256:495-497, (1975)に記載される手法に従ってハイブリドーマを作製した。HAT（100μgヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン）を含む培地中でハイブリッドを選択した。アミノプテリンを抜き取った後、培地中のHT（100μgヒポキサンチン、16μMチミジン）を2週間維持した。ハイブリドーマのクローニングの間、追加の増殖因子としてOPI（1mMオキザロ酢酸、0.45mMピルビン酸、および0.2U/mlウシインスリン）を組織培養物に添加した。ハイブリドーマは、KohlerとMilsteinの先駆的研究以来標準的になった技法を用いて、限界希釈によりさらにクローニングした。
【００３０】
S. mutansに対する種特異的モノクローナル抗体をスクリーニングするために以下のアプローチを使用した。最初のスクリーニングはELISAアッセイを用いて行ったが、これはS. mutansと結合する抗体を含む培養上清を選択するものである。ホルマリン処理済みの細菌をPBSでOD600＝0.5となるまで希釈し、100μlの0.02mg/ml ポリ-L-リシンと共に4時間プレインキュベートした96ウェルPVC ELISAプレートのウェル（100μl）に二重反復で添加した。これらの抗原コーティングプレートを加湿ボックス内で4℃にて一晩インキュベートし、次にPBSで3回洗浄し、PBS中の0.5% ウシ胎児血清によりブロックした後4℃で保存した。100μlの成熟ハイブリドーマ上清を抗原プレートの適切なウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、PBS-0.05% Tween 20で3回洗浄し、さらに結合抗体を検出するために、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた多価ヤギ抗マウスIgG抗体をPBS-1% ウシ胎児血清で1:1000に希釈したものを添加した。基質として炭酸バッファー(15mM Na2CO3, 35mM NaH2CO3, 10mM MgCl2 pH9.6)中の1mg/ml リン酸p-ニトロフェニルを添加して15分後に、EIAリーダーを用いて405nmで発色を測定した。その後、陽性の上清（対照より3倍高い）を免疫沈降アッセイに供して（100μlの細菌を100μlの上清と混合して）、S. mutansとの強い陽性反応を示すものをスクリーニングした。寄託したクローン(ATCC HB 12599、HB 12560およびHB 12558)はこの方法に従って作製された。
【００３１】
2. V 領域をクローニングするためのハイブリドーマ系の作製
A. アイソタイピング
ハイブリドーマ上清をPharmigen Isotyping Kit (BD Pharmigen, San Deigo, CA)によりアイソタイピングした。200μlのアイソタイプ特異的ラット抗マウス抗体を800μlのコーティングバッファーで希釈し、50μlずつの試薬を96ウェルのポリスチレンELISAプレートに添加した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（0.05% Tween 20/PBS）で4回洗浄し、残存する内容物を振って広げ、プレートをペーパータオルで乾燥させてブロットした。各ウェルに200μlのブロッキング溶液（1% BSA/PBS）を添加し、プレートを室温で30分インキュベートした。プレートを再度4回洗浄し、内容物を振って広げた。適切なウェルに50μlのハイブリドーマ上清を添加した。キットからの陽性対照を適切なウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄し、乾燥させてブロットした。１個のホスファターゼ基質錠剤を5.0mlのp-NNP基質希釈液中に溶解した。50μlの基質溶液を各ウェルに添加して、プレートを40分インキュベートした。Dynatech MR 700マイクロプレートリーダーを使って405nmでプレートを読み取った。SWLA1、SWLA2およびSWLA3はすべてがγ2a,κ(IgG)であると決定された。
【００３２】
B. 生合成による標識付け
細胞を、非必須アミノ酸(Grand Island Biological)とグルタミン(29.2μg/ml)を補充したメチオニン不含有ダルベッコ変法イーグル培地(DME, Irvine Scientific)中で2回洗浄した。15μCiの[35S]メチオニン(Amersham, Arlington Heights, IL)を含む1mlのDME中で細胞を標識した。すべての標識は3x106個の細胞を用いて行った。
【００３３】
分泌物の標識のために、35S-メチオニンを15μC/mlまで添加し、細胞を37℃で3時間標識した。細胞を氷上に回収し、遠心分離によりペレット化した。分泌されたIgGを単離するために、放射性培地をクリーンチューブに移した。
【００３４】
細胞質のIgGを測定するために、細胞ペレットを0.5mlのNDET（1% NP40、0.4%デオキシコール酸、66mM EDTAおよびl0mM Tris, pH 7.4）中で溶解し、核を遠心分離によりペレット化し、細胞質溶解物を新しいチューブに移した。分泌されたまたは細胞質のIgGを免疫沈降させるために、ラット抗マウスκセファロース（実験室で調製したもの）を添加した。サンプルを4℃で一晩混合し、NDETで洗浄してからdH20を用いて洗浄した。沈降物をサンプルバッファー（25mM Tris, pH 6.7、2% SDS、10% グリセロール、0.008% ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、沸騰させることによりセファロースから抗体を溶出した。サンプルを5% リン酸ゲルにて非還元条件下でSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。2-メルカプトエタノールで処理したサンプルは12% tris-グリシンゲルを用いて分析した。結果は、3個のクローンすべてが同一サイズの重鎖であるが異なるサイズの軽鎖を製造したことを示した。確実に均一な細胞集団とするために3つのハイブリドーマすべてをサブクローニングした。
【００３５】
C. サブクローニング
ハイブリドーマは軟寒天上でサブクローニングした。60mmのペトリ皿に5mlの増殖培地＋10% J774.2（マウスマクロファージ細胞系）上清＋0.24% アガロース(Sigma)をコーティングした。このアガロースを固化させ、その上面にアガロースと混合したハイブリドーマ細胞の単一細胞懸濁液を重層した。コロニーの大きさが約64個の細胞に達したとき、それらの上に、アガロースと混合したウサギ抗マウスγ2a特異的抗血清を加えた。免疫沈降物が全面に形成され、γ2a,κ抗体を分泌するクローンを部分的に見えなくする。最も多く抗体を産生するコロニーを同定し、取り出して大量培養に付し、そこでもう一度、生合成的に標識した。
【００３６】
3. SWLA 細胞由来の可変領域のクローニング
SWLA細胞由来の可変領域をクローニングするための基本的プロトコルを以下に説明し、続いて特定のSWLAハイブリドーマへのその適用について説明する。
【００３７】
(i) Invitrogenから入手したMicrofast Track Kitを用いて、約5x106個のオリジナルの細胞とサブクローニングした細胞からマウスmRNAを調製する。
【００３８】
(ii) 軽鎖または重鎖の定常領域の5’側にプライムするか、またはmRNAのポリAテイルにプライムするオリゴヌクレオチドを用いて第一鎖cDNAを作製する。
基本的プロトコル：
(a) cDNAの半分を20μlのRNase不含有dH2Oに再懸濁する；
(b) 2μlの0.5mg/mlプライマーを添加する；この混合物を60℃で10分インキュベートする；
(c) サンプルを氷上で冷却する；その後、8μlの5X第一鎖cDNAをバッファー、2μlのRNasin (Promega)、4μlの5mM dNTP、および0.5μlのAMV逆転写酵素を添加する；
(d) このサンプルを42℃で１時間インキュベートする。
【００３９】
(iii) いくつかの軽鎖または重鎖シグナルペプチドプライマーおよび軽鎖または重鎖の定常領域の5’側にハイブリダイズするプライマーを用いてPCR増幅を行う。
PCR 条件：
(a) 変性を94℃で40秒間
(b) アニーリングを60℃で40秒間
(c) 伸長を72℃で40秒間
(d) 増幅を30サイクル
(e) 最終伸長を72℃で10分間
【００４０】
(iv) 得られるPCR産物をTOPO Cloning KitによってInvitrogenのPCR2.1ベクターにクローニングする。
【００４１】
(v) 配列決定のために個々のクローンを外部に送った。得られた結果をオープンリーディングフレーム(ORF)について分析し、既知のデータベースと比較してその配列が可変領域であることを確かめた。
【００４２】
(vi) PCRにより誘導された、その配列のヌクレオチド変異を調べるために、ステップIII〜Vを繰り返したが、それにより、独立したPCR反応からの個々のクローンの配列を比較して、その配列の精度を確実なものとすることができる。さらに、配列データを用いて、使用する必要があるJ領域プライマーの配列を決定する。
【００４３】
(vii) 可変領域を適当な軽鎖（ヒトκ）または重鎖（ヒトIgG1）発現ベクターにクローニングした。
典型的な可変領域連結プロトコル：
(a) 1μgずつのベクターおよびインサートをNheI/EcoRVまたはSa1I/EcoRVのいずれかで切断した；
(b) 次いで、Qiagenのゲル抽出キットを用いて、関係する断片を単離した；
(c) 連結反応には、30μlのベクターサンプルのうち4μlを、そして30μlのインサートサンプルのうち6μlを使用した；
(d) その後、20μlの最終反応用量につき4〜5ユニットのT4 DNAリガーゼを添加した。
【００４４】
典型的な形質転換プロトコル：
(a) HB101化学的コンピテント大腸菌細胞のアリコートを氷上で解凍した；
(b) 次いで、この細胞に全連結反応混合液を添加して氷上で15分インキュベートした；
(c) その後細胞に42℃で1分間、熱ショックを与えた；
(d) この細胞に1mlのLBを添加し、チューブを37℃で1時間振とうした；
(e) チューブを8000 RPMで2分回転させた；
(f) 100μlの上清を除いて全部取り出した；
(g) 細胞を再懸濁し、LB+AMPプレートにまき、37℃で一晩インキュベートした。
【００４５】
B. SWLA1 細胞由来の可変領域のクローニング
軽鎖可変領域(VL)をクローニングしようとして、以下に示すシグナルペプチドプライマー442を定常領域プライマー450と共に用いてPCR産物を見つけ出した。以前の研究から、442は内在性の異常なまたは非生産的なVLであるSWLA1 Aberrant VL（配列番号13）にもプライムすることが分かっている。このことを考慮して、PCR産物をPflMI（異常なVL中の特定の配列を認識する）で制限消化することにより、異常でない転写産物を富化しようとした。最終的に、1つの可変領域配列がORFをもつことが判明した。最終PCR産物であるSWLA1 VL（配列番号１）を、以下に示すプライマー442とJ領域プライマー453を用いて生成させ、適切な発現ベクターに挿入した。SWLA1由来のVLを保持している得られたヒトκ発現ベクターを5936 pAGと命名した。
【００４６】
図１のパネルAを参照されたい。そこにはVLドメインをコードする配列と推定上のアミノ酸配列（配列番号１および２）が示されている。また、異常なVLをコードする配列と推定上のアミノ酸配列（配列番号13および14）を示す図４を参照されたい。
【００４７】
442 (配列番号21) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA T 3’
450 (配列番号22) 5’ GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAA GAT GG 3’
453 (配列番号23) 5’ AGC GTC GAC TTA CGT TTK ATT TCC ARC TTK GTC CC 3’
【００４８】
重鎖可変領域(VH)のクローニングからは、結果的に2つのユニークなVH（両方ともORFをもつ）が見出された。一方のVHでは以下に示すシグナルペプチドプライマー440を使用し、他方ではシグナルペプチドプライマー441を使用した。両反応とも、重鎖定常領域プライマー451を使用した。2つの最終PCRを行なった。1つ目はJ領域プライマー452とプライマー440を使用してSWLA1 VH（配列番号３）を生成させ、2つ目は同じJ領域プライマーとプライマー441を使用してSWLA1 2nd VH（配列番号15）および異常な非生産的VHであるSWLA1 Aberrant VH（配列番号17）を得た。得られた2つの異なるVHを保持するヒトIgG1発現ベクターを5937 pAH (SWLA1 VH) および 5943 pAH (SWLA1 2nd VH)と命名した。しかし、ベクター5937 pAHのみが有効な全長VHを発現することが分かった。
【００４９】
VHドメインをコードするDNAおよび推定上のアミノ酸配列を配列番号３および４として図１のパネルBに示す。効力のない2nd VHのDNAおよびアミノ酸配列（配列番号15および16）については図５を、異常なVHのDNAおよびアミノ酸配列（配列番号17および18）については図６を参照されたい。
【００５０】
440 (配列番号24) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG RAC TTC GGG YTG AGC TKG GTT TT 3’
441 (配列番号25) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T 3’
451 (配列番号26) 5’ AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3’
452 (配列番号27) 5’ TGG GTC GAC WGA TGG GGS TGT TGT GCT AGC TGA GGA GAC 3’
【００５１】
C. SWLA2 細胞由来の可変領域のクローニング
VLをクローニングする際に2つのPCR産物が見出された。1つの産物はプライマー442および450から得られた。もう1つはプライマー443および450から得られた。ORFをもつユニークなVLは443/450反応からクローニングされた。SWLA2 VL（配列番号５）をもたらした最終PCRではJ領域プライマー453とプライマー443を使用した。得られたSWLA2由来のVLを保持するヒトκ発現ベクターは5938 pAGと命名した。
【００５２】
VLドメインをコードする配列および推定上のアミノ酸配列（配列番号５および６）を示す図２のパネルAを参照されたい。
443 (配列番号28) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AG 3’
【００５３】
VHをクローニングする際にも2つのPCR産物が見出された。一方の産物はプライマー439および451から得られた。他方の産物はプライマー440および451から得られた。前者の反応から得られた転写産物は異常なSWLA2 Aberrant VH（配列番号19）であることが分かった。後者の反応から得られた転写産物はその5’配列の一部を欠失していた。この配列をいくつかの類似した既知VHとアラインメントした後で、以下に示すような新しいリーダーシグナルペプチドプライマー843を設計した。最終PCR産物であるSWLA2 VH（配列番号７）はプライマー843とJ領域プライマー452を用いて生成された。得られたSWLA2由来のVHを保持するヒトIgG1発現ベクターは5939 pAHと命名した。
【００５４】
VHドメインをコードするDNAおよび推定上のアミノ酸配列を配列番号７および８として図２のパネルBに示す。異常なVHのDNAおよびアミノ酸配列（配列番号19および20）については図７を参照されたい。
439 (配列番号29) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GRA TGS AGC TGK GTM ATS CTC TT 3’
843 (配列番号30) 5’ GGG ATA TCC ACC ATG GRC AGR CTT ACW TYY TCA TTC CTG 3’
【００５５】
D. SWLA3 細胞由来の可変領域のクローニング
組合せプライマー442および450からはただ1つのVL PCR産物が得られた。もう一度、このPCR産物をPflMIで消化して、異常でない転写産物について富化した。この手法は役に立たなかった。別の酵素Eco0109Iを同様に用いたところ、5’末端を欠失している1つの転写産物が見つかった。この配列を既知のデータベースと比較して、以下に示すシグナルペプチドプライマー826を新たに設計した。このプライマー826を以下に示すJ領域プライマー835と共に用いて最終PCR産物SWLA3 VL（配列番号９）を得た。これをヒトκ発現ベクターにクローニングして、5940 pAGと命名した。
【００５６】
VLドメインをコードする配列および推定上のアミノ酸配列（配列番号９および10）を示す図３のパネルAを参照されたい。
826 (配列番号31) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG ATG AGT CCT GCC CAG TTC C 3’
835 (配列番号32) 5’ GGT CGA CTT AGC TTT CAG CTC CAG CTT GGT 3’
【００５７】
組合せプライマー440および451からはただ1つのVH PCR産物が得られた。最終PCR反応ではプライマー440とJ領域プライマー452を用いてSWLA3 VH（配列番号11）を得た。このVHをヒトIgG1発現ベクターにクローニングして、5941 pAHと命名した。
【００５８】
VHドメインをコードするDNAおよび推定上のアミノ酸配列を配列番号11および12として図３のパネルBに示す。
【００５９】
4. S. mutans に対するヒト化モノクローナル抗体をコードするマウス／ヒトキメラ遺伝子の作製
(i) 正しいV領域を含有する発現ベクターとプラスミドからDNAを調製した。軽鎖および重鎖定常領域を発現するベクターに関する詳細な情報については、Current Protocols in Imunology, Section 2.12.1 (1994)を参照されたい。
(ii) 発現ベクターを適切な制限酵素で消化した。次に、消化物をアガロースゲルで電気泳動にかけ、適切な大きさの断片を単離した。
(iii) さらに、クローン化V領域を含有するプラスミドを消化して、V領域を含む適切なDNA断片をアガロースゲルから単離した。
(iv) 次に、V領域および発現ベクターを一緒に混合し、T4 DNAリガーゼを添加して反応混合物を一晩16℃でインキュベートした。
(v) 連結混合物を用いてコンピテント細胞をトランスフェクトし、正しい連結配列を発現するクローンを選別した。制限マッピングにより正しい構造であることを確認した。
【００６０】
5. 真核細胞のトランスフェクション
各発現ベクター由来の10μgのDNAをBSPC 1 (Stratagene, PvuIアイソシゾマー)消化により線状化し、1×107個のミエローマ細胞(Sp2/0またはNSO/1)をエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。トランスフェクションに先立って、細胞を冷PBSで洗浄し、次に0.9mlの同じ冷バッファー中に再懸濁して、電極間隔が0.4cmのエレクトロポレーション用キュベットに入れた。エレクトロポレーションでは960 microFおよび200 Vを使用した。その後、ショックを与えた細胞を、10% ウシ血清を含むIMDM培地(Gibco, NY)中にて氷上でインキュベートした。
【００６１】
トランスフェクト細胞は96ウェルプレートに104個/ウェルの濃度でまいた。ヒスチジノールまたはミコフェノール酸のような選択用薬物を含む選択培地を用いて、発現ベクターを含有する細胞を選択した。12日後、増殖しているクローンからの上清を抗体産生について試験した。
【００６２】
6. 組換え抗体の分析
ELISAアッセイを用いて、ヒトIgG抗体を分泌するトランスフェクトーマ(transfectomas)を同定した。96ウェルELISAプレートの各ウェルに100μlの5μg/mlヤギ抗ヒトIgGを添加し、一晩インキュベートした。このプレートをPBSで数回洗浄し、3% BSAでブロックした。上記の増殖クローンからの上清をプレートに添加して室温で2時間維持した。次いでプレートを洗浄し、1% BSAで1:1000に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ヒトκ抗体を添加して37℃で1時間維持した。プレートをPBSで洗浄し、ジエタノールアミンバッファー(9.6% ジエタノールアミン, 0.24mM MgCl2, pH9.8)中のp-NPPを添加した。OD405での発色がH2L2を産生する細胞であることを示した。
【００６３】
ヒト化IgG定常領域をもたらす上清について、それらのS. mutansとの反応性をShiら, Hybridoma 17:365-371 (1998)に記載されるように試験した。簡単に説明すると、表１に示す細菌株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにより提案される種々の培地で増殖させた。嫌気性細菌は80% N2、10% CO2、10% H2 の雰囲気にて37℃で増殖させた。種々の口内細菌に対する抗体の特異性をELISAアッセイで調べた。細菌をPBSでOD600=0.5へと希釈し、100μlの0.02mg/mlポリ-L-リシンと共に4時間プレインキュベートした96ウェルPVC ELISAプレートのウェル(100μl)に二重反復して添加した。これらの抗原コーティングプレートを湿潤ボックス内で4℃にて一晩インキュベートし、次にPBSで3回洗浄し、PBS中の0.5% ウシ胎児血清でブロックして4℃で保存した。抗原プレートの適切なウェルに50μg/mlのキメラ抗体を100μl添加し、室温で1時間インキュベートし、PBS-0.05% Tween 20で3回洗浄し、結合抗体を検出するためにPBS-1% ウシ胎児血清で1:1000に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲート多価ヤギ抗ヒトIgG抗体を添加した。基質として炭酸バッファー(15mM Na2CO3, 35mM NaH2CO3, 10mM MgCl2 pH9.6)中の1mg/ml リン酸p-ニトロフェニルを添加した後、15分後の発色を405nmでEIAリーダーにより測定した。「+」はOD405＞1.0を意味し；「-」はOD405＜0.05を意味する。陰性対照は＜0.05である。用いたキメラ抗体はTEDW (SWLA1由来)、TEFE (SWLA2由来)およびTEFC (SWLA3由来)である。結果を表１に示す。
【表１】
【００６４】
図８は、SWLA1から誘導されたキメラTEDW抗体を用いて得られた蛍光顕微鏡像を示す。S. mutans ATCC25175を脳-心臓浸出物培地中、80% N2、10% CO2および10% H2の雰囲気にて37℃で増殖させた。次に細胞を洗浄し、PBSバッファー中に再懸濁し、種々の抗体と混合して光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で検査した。図８を参照すると、左側のキメラ抗体はS. mutans細胞と結合してそれらを凝集させる。中央のキメラ抗体はヤギFITCコンジュゲート抗ヒトIgG（Fc特異的）抗体(Sigma F9512)と相互作用してS. mutansの蛍光画像を提供する。右側のキメラ抗体はヤギFITCコンジュゲート抗マウスIgG（Fc特異的）抗体(Sigma F5387)と反応せず、S. mutansの蛍光画像を与えない。キメラ抗体TEFEおよびTEFCも使用したところ、TEDWキメラ抗体と一致する結果が得られた。
【００６５】
フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の両実験から得られた結果は、それぞれのキメラ抗体(TEDW、TEFEおよびTEFC)が、ヒトIgG定常領域とS. mutansを特異的に認識することができる可変領域をいずれも含んでいたことを示している。
【００６６】
7. 形質転換生物での S. mutans に対するモノクローナル抗体の発現
A. 動物細胞でのヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の生産
ヒトIgG遺伝子の重鎖および軽鎖を動物細胞系（Sp2/0など）にエレクトロポレーションにより別々に導入するか、または同時トランスフェクトした。トランスフェクト細胞をマイクロタイタープレートにまいて、10% ウシ胎児血清を含む培地中37℃で5% C02の雰囲気にてインキュベートした。48時間のインキュベーション後に、ヒスチジノールまたはミコフェノール酸を含有する選択培地中で細胞を増殖させた。薬剤耐性細胞の上清を集め、先に記載したELISAまたは免疫沈降アッセイを用いてS. mutansに対する免疫反応性をスクリーニングした。
【００６７】
B. 食用植物でのヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の生産
トランスジェニック植物は大量の外来タンパク質をきわめて低コストで生産するための非常に有用な系であることが認められている。食用植物（野菜または果実）においてS. mutansに対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を発現させることで、口から植物または植物抽出物を直接摂取して既存の齲食症を治療し、また、将来の細菌感染を予防することが可能となる。好適なトランスジェニック食用植物としては、限定するものではないが、ジャガイモ、トマト、ブロッコリー、トウモロコシ、バナナが挙げられる。
【００６８】
ここでは、トランスジェニックシロイヌナズナ(Arabidopsis)を作製するための手順を示すことにする。シロイヌナズナはキャベツ、カリフラワー、ブロッコリーのようなありふれた野菜を含むアブラナ属の種に近縁の食用植物であるが、この植物が選ばれた理由は、多くの遺伝的および生化学的ツールがシロイヌナズナ用に開発されていることによる。この植物にIgGを発現させるためのストラテジーはいくつか存在する。１つの方法は、最初に、重鎖および軽鎖をコードするヒトIgG遺伝子を2つの別個のトランスジェニック系統に導入することである。2つの遺伝子は遺伝的交雑および選別によって合体させる。その他の方法は連続的形質転換を必要とし、この場合には1つのIgG遺伝子で形質転換されたトランスジェニック系統を2つ目の遺伝子で再形質転換する。あるいはまた、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、同じT-DNA形質転換用ベクターの2つの異なるクローニング部位に2つのプロモーターの制御下でクローニングし、植物への単一の構築物の形質転換によって両遺伝子の発現を達成することができる。技術的には、別々の形質転換法が一番簡単な方法であり、通常は比較的高い抗体収量をもたらす。したがって、本発明者らは、ここではこのストラテジーを採用する。同様の技法を用いて他の植物を形質転換することも可能である。
【００６９】
ヒトIgG遺伝子の重鎖および軽鎖をコードするDNA断片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のTiプラスミドに別個にクローニングする。このプラスミドはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)においてヒトIgGの重鎖および軽鎖を発現させるためのプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス選択用の抗生物質マーカー、およびシロイヌナズナでの形質転換選択のための除草剤耐性遺伝子を含有する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株をこれらのプラスミドで形質転換し、抗生物質選択のもとで後期対数増殖期へと増殖させ、Bethtoldら(C.R. Acad. Sci. Paris Life Sci. 316:1194-1199, 1993)により記載された浸潤用培地中に再懸濁する。
【００７０】
Tiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスによるシロイヌナズナの形質転換は減圧浸潤法により実施する。シロイヌナズナの全植物体を細菌懸濁液中に浸漬する。この方法は減圧チャンバーで実施する。5分減圧（約40 cmHg）を4サイクル行なう。それぞれの減圧後に、減圧を解放して、すぐに再度減圧をかける。浸潤後、植物を生育チャンバー内で水平に24時間維持する。その後植物を成熟するまで育てて、その種子を収穫する。収穫した種子は、最初の一対の本葉が出るまで非選択的生育条件下で発芽させる。この段階で、150 mg/l(水中)の濃度の除草剤バスタ(Basta)を植物に噴霧する。形質転換Tiプラスミドを含有するシロイヌナズナ植物はこの除草剤に耐性を示し、一方非形質転換植物は白化して枯死する。かかる選択を第二世代の植物まで継続する。耐性植物について、全ゲノムDNAを単離し、IgG遺伝子の重鎖および軽鎖をコードするDNA断片でプローブ（探査）する。陽性形質転換体から植物抽出物を調製し、ヒトIgGの定常領域の重鎖および軽鎖に対する抗体を用いてウェスタンブロット法によりヒトIgGタンパク質の発現についてスクリーニングする。
【００７１】
ヒトIgG重鎖を発現する植物と、ヒトIgG軽鎖を発現する植物との雌雄交雑を行い、両方の鎖を発現する子孫を作出する。ウェスタンブロット法を用いて重鎖と軽鎖の両方をスクリーニングする。陽性形質転換体からの抽出物を集めて、先に述べたELISAまたは免疫沈降アッセイによりS. mutansに対する免疫反応性をスクリーニングする。
【００７２】
8. ヒト齲食症を治療および予防するための S. mutans に対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の使用
上記の研究が成功裏に完了したことで、S. mutansに対するヒト化モノクローナル抗体が得られた。植物組織の効力を試験した。
【００７３】
S. mutansに対するモノクローナル抗体を含む植物組織の抽出物を、精製したヒト補体成分または精製したヒト多形核白血球の存在下または不在下で、様々な濃度のS. mutansと混合する。2時間のインキュベーション後、混合物をBHIプレートに播種して抗菌活性を調べる。
【００７４】
Wolinskyら, J. Dent. Res. 75:816-822 (1996)によって開発された人工的なプラーク形成系を用いて、唾液中または人口歯のエナメル質に存在する歯苔中のS. mutansを死滅させる発現モノクローナル抗体の能力を調べるために、該モノクローナル抗体を含有する植物組織抽出物を使用する。同様の技法を用いて、歯苔の形成を防止する能力についても試験する。
【００７５】
動物細胞または植物により産生されたこれらのモノクローナル抗体を用いて、ヒト臨床試験を実施する。これらのS. mutansに対するヒトモノクローナル抗体を用いてまたは用いないでボランティアを治療する。その後、唾液中または歯苔中のS. mutansのレベルを調べる。さらに、モノクローナル抗体による治療との関係において現在の齲食と将来の齲食との間に相関関係があるかについても調べる。
【００７６】
前述の実施例は単なる例示を目的としたものであって、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものでないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】SWLA1細胞から誘導されたS. mutansに特異的なキメラ抗体(TEDW)の可変領域をコードするDNA配列（配列番号１および３）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号２および４）を示す。
【図２】SWLA2細胞から誘導されたS. mutansに特異的なキメラ抗体(TEFE)の可変領域をコードするDNA配列（配列番号５および７）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号６および８）を示す。
【図３】SWLA3細胞から誘導されたS. mutansに特異的なキメラ抗体(TEFC)の可変領域をコードするDNA配列（配列番号９および11）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号10および12）を示す。
【図４】SWLA1細胞から誘導された異常な軽鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号13）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号14）を示す。
【図５】SWLA1細胞から誘導された効力のない重鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号15）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号16）を示す。
【図６】SWLA1細胞から誘導された異常な重鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号17）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号18）を示す。
【図７】SWLA2細胞から誘導された異常な重鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号19）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号20）を示す。
【図８】S. mutansと結合するキメラ抗体TEDWの光学および蛍光顕微鏡像を示す。
【０００１】
本出願は、齲食症を治療および予防するための免疫学的方法論に関するものである。本発明は特に、確立された自己管理の原理を応用する能力または動機づけのない患者（例えば、幼児、虚弱な人たち、教育のない人たち）に対して適用される。
【背景技術】
【０００２】
齲食症（虫歯）および歯周疾患はおそらく世界中で最もありふれた慢性疾患である。歯に窩洞が形成されるのは細菌が感染したためである。それゆえ、齲食の発生は、石灰化された歯の組織の局所破壊をもたらす伝染性微生物疾患とみなすのが適切である。
【０００３】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）はヒトの虫歯の主たる原因であると考えられている。S. mutansが歯苔にたくさん存在していて、複合糖を代謝すると、生成する有機酸が歯表面の無機質脱落を引き起こす。その結果は齲食病巣であり、これは一般に窩洞として知られている。乳酸杆菌属（Lactobaccilli）や放線菌属（Actinomyces）のような、その他の生物も齲食病巣の進行および形成に関与していると考えられる。本明細書では、虫歯の原因となるこれらの生物を「齲食原性生物」と呼ぶことにする。
【０００４】
歯の損傷部分を取り除き、充填して修復することは、少なくとも一時的には、齲食原性生物による口腔感染に起因する損傷を食い止めることができる。しかし、「削る・詰める」（drill and fill）の方法は原因となる細菌を排除するものではない。適切な口腔衛生により、歯苔（そこでは齲食原性生物が増殖して、歯の表面を攻撃する）の蓄積をコントロールすることができる。ところが、歯の自己管理には限界があり、特に自分自身の管理ができない人たちの場合や、適切な自己管理のやり方の知識がない場合にそうである。フッ化物イオンの投与は齲食を少なくするものの、その発生を止められないことが分かっている。
【０００５】
齲食の病因に齲食原性生物が関与しているという不可抗的な証拠を考慮すると、伝統的な抗微生物療法を用いて齲食状態を改善するための様々な試みが存在していても驚くことではない。抗微生物剤の難点は、それらが齲食原性生物に選択的でないということである。特異的でない殺菌剤の投与は、予測し得ない結果を伴って、口腔内に常在する生物のバランスを乱し、しかも病原性生物に都合のよい条件を提供する環境を作り出す可能性がある。さらに、抗微生物剤を長期間使用すると、かかる薬剤に耐性を示す生物が選び出されることが知られている。したがって、虫歯を予防するために多くの人たちが抗微生物剤を長期間にわたり使用することは実際的でない。
【０００６】
また、S. mutansや他の齲食原性生物に対する能動免疫応答を引き出すためのヒトへのワクチン接種も現時点では実用的な解決策でない。この方法の一つの欠点は、ワクチン接種が主としてIgGおよびIgM抗体の生産を誘導するものの、それらは唾液中に分泌されないことである。唾液中に存在する抗体は大部分がIgAアイソタイプのもので、これらはリンパ球または補体成分と結合し得るが、リンパ球や補体成分を活性化して細菌を殺すことはできない。したがって、ワクチン接種が免疫系の引き金を引いて、口中の齲食原性生物を死滅させる抗体を産生できる可能性があるとは考えられない。口腔においてワクチン接種により誘導されたIgGまたはIgMアイソタイプの抗体の力価を選択的に増加させる方法はまったく知られていない。
【０００７】
これまでに、動物やヒトの虫歯を予防するため、マウスで誘導されたモノクローナルIgA抗体を用いて患者をS. mutansに対して受動免疫する試みがいくつか報告されている。IgAは多価抗体であるので、1つのIgA分子はいくつかの異なる抗原部位に結合することができ、結果的に細菌の凝集をもたらす。しかしながら、細菌の表面抗原にIgAが結合しても、細菌は死滅しない。むしろ、凝集は細菌が歯の表面に結合する能力を妨げると考えられている。この方法のもう一つの欠点は、マウス（すなわち、異種）抗体のヒトへの反復投与が該抗体に対する免疫応答を惹起する可能性があることである。
【０００８】
IgA抗体と違って、IgGおよびIgMクラスの抗体には殺菌効果がある。IgMまたはIgG抗体が齲食原性生物の表面に存在する抗原と結合すると、細菌細胞は、現在知られている2つの別々のメカニズム、すなわち、補体媒介細胞溶解および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性、のいずれかにより破壊されると考えられる。いずれの場合にも、特定の微生物と選択的に結合する抗体は免疫系による破壊のための細胞だけを標的とする。補体媒介細胞溶解および抗体依存性細胞媒介細胞傷害性はどちらも、IgGおよびIgMクラスの抗体により媒介される体液性免疫応答の一部である。
【０００９】
抗体結合の所望の細胞傷害効果を引き出すためには、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体がヒト免疫系によって認識されねばならない。ヒト免疫系からの応答を誘発しうる抗体を作製するための技術がいくつか存在する。一つの例はキメラ抗体を作製する方法であり、この方法は異なる供給源からの可変ドメインをコードする配列を含むように改変されたヒト抗体の発現をコードする核酸構築物を使用する。もう一つの方法はファージディスプレイを利用するもので、ファージディスプレイを用いてモノクローナル抗体の実際の結合部位である相補性決定領域（CDR）を決定し、次いで、該CDRをヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域に部位特異的突然変異誘発によりグラフトする。当技術分野で公知の別の方法は、体液性免疫系に関与することができる抗体の生産を可能にするもので、つぎの方法が含まれる：1)ヒト抗体を産生するように遺伝的に改変されたマウスを免疫する；2)単離したヒトＢ細胞をin vitroで免疫し、次に細胞融合法を用いて抗体を分泌するハイブリドーマを作製する；および3)急性感染症のヒトからＢ細胞を単離し、抗体産生ハイブリドーマを作製する。
【００１０】
このような遺伝子工学的に作製されたヒト化またはヒトモノクローナル抗体を製造して、ヒトの齲食を治療するために投与することには問題があり、革新的な解決策が必要となる。モノクローナル抗体を生産するための従来技術の方法は、ハイブリドーマを培地で増殖させた後、所望の抗体を抽出して精製する必要があった。本発明の好ましい実施形態においては、抗体を食用の植物または動物内で発現させることによって、こうしたステップが顕著に簡便化されている。抗体の投与は、植物または動物の産物、例えば、果実、野菜またはミルク（抗体が変性していない）などを経口摂取することで可能である。この投与様式は虫歯を改善する際のコンプライアンスの問題を回避できる可能性がある。
【００１１】
米国特許出願第09/378,247号は、S. mutansに特異的な3種類のマウスモノクローナル抗体、すなわち、SWLA1、SWLA2およびSWLA3を開示している。齲食の治療および予防に有効な免疫学的方法を開発するには、S. mutansに特異的なモノクローナル抗体を発現すると共にヒト免疫系のエフェクター機構に関与するように遺伝子操作されたモノクローナル抗体を作製する必要がある。
【発明の開示】
【００１２】
齲食は、S. mutansのような齲食原性生物の表面抗原と結合するヒトまたはヒト化マウスモノクローナルIgGおよびIgM抗体の経口摂取により、予防または治療することができる。遺伝子工学的に作製されたモノクローナル抗体は、齲食原性生物と結合すると、ヒト免疫系のエフェクター装置(effector apparatus)と結びついて、結果的にそれらを破壊する。好ましい実施形態では、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体が、所望の抗体の発現をコードするDNA配列により形質転換された食用植物（果実および野菜を含む）により産生される。遺伝子工学的に作製されたモノクローナル抗体はその形質転換植物を食することによって供給される。
【００１３】
本発明者らは、このたび、S. mutansに特異的なモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を単離し、配列決定した。発現させると、これらの配列によりコードされたモノクローナル抗体は、S. mutansと特異的に結合する。組換え技術を用いて、モノクローナル抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に結合させ、それによってS. mutansと特異的に結合するキメラモノクローナル抗体を作製した。このキメラモノクローナル抗体は齲食原性生物の表面抗原に対して特異的であり、標的生物に結合すると、免疫系からエフェクター応答を生じさせる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
1. モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体技術は格別すぐれた特異性を有する抗体の作製を可能にする。特定の分子構造と結合するモノクローナル抗体は、今日では標準的な技法と考えられている方法を使って製造することができる。
【００１５】
本発明において使用できるモノクローナル抗体は、齲食原性生物の表面抗原に対して誘導されたものである。表面抗原とは細胞の表面に展示される物質のことである。このような抗原は体液中に存在する抗体に近づきやすい。本発明に関連して、齲食原性生物の表面抗原は齲食を生じさせる生物の表面に存在する。齲食病変の発生における細菌活性の役割は明確に確定されているが、特定の生物と齲食の発生との間の因果関係を確立することは、完全には成功を収めていない。これまでは、S. mutansのみが齲食と決定的に関係があるとされてきた。しかしながら、乳酸杆菌属（Lactobaccilli）や放線菌属（Actinomyces）の細菌種も関与していると考えられ、特に齲食病変の活発な進行の場合がそうである。齲食病変を生じさせる生物はいずれも、本発明に従って製造および使用されるモノクローナル抗体の潜在的な標的となる。
【００１６】
本発明の実施において使用できるモノクローナル抗体の更なる必要条件は、それらが齲食原性生物に対して選択的であるということである。齲食原性だけでなく非齲食原性の生物にも存在する抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体は、口腔内の細菌叢の構成に非特異的な改変を生じさせる可能性がある。かかる変化の結果は分かっていない。
【００１７】
したがって、好ましいモノクローナル抗体は齲食原性生物の表面抗原と選択的に結合するものである。すなわち、好ましいモノクローナル抗体は齲食を引き起こす生物と特異的に結合するものである。
【００１８】
本発明の範囲はヒトの虫歯予防に限られないことを明確に理解すべきである。本発明に従うモノクローナル抗体は、その他の哺乳動物（例えば、ペットとして飼われている動物）の免疫系のエフェクター応答を引き出すように遺伝子工学的に作製してもよい。
【００１９】
モノクローナル抗体を作製するには、マウスまたは他の哺乳動物宿主を齲食原性生物から単離された細胞壁材料で免疫する。好ましい実施形態では、齲食原性生物はｃタイプのS. mutans (ATCC25175)である。細胞壁中に存在する分子の免疫原性は当技術分野で公知のいろいろな技法により増強することができる。好ましい実施形態では、かかる分子の免疫原性が、単離した細胞材料をホルマリンで変性することにより増強される。細胞壁タンパク質を改変して免疫原性を高めるためのその他の技法も本発明の範囲内である。一般的には、抗体の力価を増加させるために、犠牲にしてクローニングする前に、宿主に単離した細菌細胞断片をさらに１回以上注入する。
【００２０】
宿主から脾細胞を回収する。融合パートナーとしてNSI/Ag4.1マウスミエローマ細胞系
を使用し、5% CO2、37℃でスピナー培養にて増殖し、融合に先立って対数増殖期に維持した。Kohlerら Nature, 256:495-497, (1975)に記載される手法に従ってハイブリドーマを作製した。HAT（100μgヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン）を含む培地中でハイブリッドを選択した。アミノプテリンを抜き取った後、培地中のHT（100μgヒポキサンチン、16μMチミジン）を2週間維持した。ハイブリドーマのクローニングの間、追加の増殖因子としてOPI（1mMオキザロ酢酸、0.45mMピルビン酸、および0.2U/mlウシインスリン）を組織培養物に添加した。ハイブリドーマは、KohlerとMilsteinの先駆的研究以来標準的になった技法を用いて限界希釈によりさらにクローニングした。好ましい実施形態では、生存しているハイブリドーマを、ホルマリン処理した細菌細胞材料をコーティングしたマイクロタイタープレートに対するELISAアッセイにより、齲食原性生物に特異的な抗体についてスクリーニングした。陽性の上清を更なるスクリーニングに供して、齲食原性生物に対する親和性が最も高い抗体を分泌するクローンを同定した。好ましい実施形態では、バックグラウンドより少なくとも3倍高い力価を示したクローンは、S. mutans由来の変性細胞壁材料との免疫沈降を用いて、再度スクリーニングする。好ましい実施形態において、S. mutans株ATCC25175、LM7、OMZ175およびATCC31377とのみ検出可能に結合するクローンが3個同定された。これらのクローンをアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託して、受託番号HB 12599 (SWLA1)、HB 12560 (SWLA2)、およびHB 12558 (SWLA3)を受け取った（米国特許出願第09/378,247号）。
【００２１】
齲食原性生物の表面抗原に特異的なヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の発現をコードする核酸配列を取得するための方法はいろいろ存在している：1)齲食原性生物に対するモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを単離し、該抗体の発現をコードするマウス遺伝子をクローニングする；2)精製した齲食原性生物を用いてヒトＢリンパ球から作製したファージディスプレイランダムライブラリーをスクリーニングすることにより、齲食原性生物に特異的な抗体をコードする遺伝子を取得する；3)重度感染患者から回収されたＢリンパ球を用いて、齲食原性生物に対するモノクローナル抗体を産生するヒトハイブリドーマを単離し、これらの抗体をコードするヒト遺伝子をクローニングする；または4)精製した齲食原性生物を用いてin vitroでヒトＢリンパ球と脾細胞を免疫し、続いて融合によりハイブリドーマを形成させて不死細胞系を作製する。必要とされる技法は当業者に公知であり、ここに記載する方法に限定されるものではない。
【００２２】
2. ヒト免疫系からエフェクター応答を引き出すことができるモノクローナル抗体の作製
齲食予防の免疫学的方法を開発するためのこれまでの努力は異種抗体を利用するものであった。例えば、Lehnerの米国特許第5,352,446号は、マウスにおいて誘導されたS. mutans表面抗原に対するモノクローナル抗体を、これらの細菌のサル体内での増殖を抑制する際に使用することに関する。最近では、Maら、Nature Medicine, 45(5) 601-6 (1998)に、タバコ植物で発現させたS. mutansに対する遺伝子操作型マウス分泌モノクローナル抗体を用いて、ヒトで同様の結果を得たことが報じられている。このアプローチの欠点として以下が挙げられる：1)投与によって有害な生物を凝集させることができるが、非ヒト抗体はヒト免疫応答を効果的に引き出せないので、それらの生物を死滅させない；また、2)かかる抗体を繰り返し投与すると、患者からその抗体に対する免疫応答が惹起されうる。好ましいアプローチは、組換え法を用いて齲食原性生物の表面抗原に特異的なキメラ抗体分子を作製することであり、かかる抗体はまた、標的生物に結合すると、抗体で処置された哺乳動物の免疫系からエフェクター応答を引き出すであろう。これを達成するには、齲食原性生物に特異的なマウスモノクローナル抗体からの可変領域を、処置すべき哺乳動物からのIgGおよび／またはIgMクラスの抗体に挿入する。また、齲食原性生物に特異的なマウスモノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）だけを利用した抗体を作製することも可能である。公知の組換え技法により、免疫グロブリンの可変ドメインにCDRを移し変える。
【００２３】
抗体を直接的に生成させる方法も知られている。例えば、1)ヒト抗体を産生するように遺伝的に改変されたマウスを免疫する方法；2)単離したヒトＢリンパ球をin vitroで免疫し、その後細胞融合法を経て抗体を分泌するハイブリドーマを作製する方法；および3)急性感染症のヒトからＢリンパ球を単離し、抗体産生ハイブリドーマを作製する方法である。必要とされる技法は当業者に公知である。それぞれの方法はヒト抗体をもたらすので、該抗体はその特異的抗原に結合した後で体液性免疫エフェクター系を引き出すことができる。
【００２４】
本発明の目下好ましい実施形態においては、S. mutansに特異的なキメラ抗体を作製した。PCRまたはサザンブロット法を用いて、齲食原性生物の細胞表面抗原に特異的な抗体を分泌するマウスハイブリドーマの可変ドメインをコードするDNA断片を単離した。遺伝子クローニング法を用いて、その可変領域をヒト免疫グロブリンの定常領域に結合させた。この遺伝子操作の結果は、齲食原性生物の表面抗原と選択的に結合する可変ドメインを有するが、その定常領域を介してヒト免疫エフェクター系と相互作用するキメラ抗体分子である。
【００２５】
3. モノクローナル抗体の投与
臨床用途のために十分量のモノクローナル抗体を製造するには、免疫グロブリンをコードする配列でトランスフェクトされた所望の細胞系を増やさなければならない。既存の技術によって組織培養でのモノクローナル抗体の大規模生産は可能である。トランスフェクト細胞系はモノクローナル抗体を組織培養培地中に分泌する。分泌されたモノクローナル抗体を回収して、ゲル濾過およびタンパク質化学の関連技法により精製した。
【００２６】
実験的研究において、S. mutansに対するモノクローナル抗体は歯の表面に直接適用されてきた。また、口内洗浄剤の経口摂取による適用やチューインガムによる適用も提案されてきた。目下好ましい代替法は、バナナやブロッコリーのような食用植物において本発明のキメラモノクローナル抗体を発現させることである。本発明に従って形質転換された植物を食べることにより、結果的に、歯の表面や口内のどこかに存在する齲食原性生物に対する抗体が適用されるだろう。その他の生物（植物と動物の両方）を形質転換して、ここに記載のモノクローナル抗体を発現させることもできると考えられ、かくして、この種の抗体を、例えばミルクを飲むことで、摂取してもよい。
【００２７】
以下の実施例において、添付の図１〜８を参照しながら、単なる例示として、本発明を説明することにする。
【実施例】
【００２８】
1. S. mutans に対するマウスモノクローナル抗体の作製
ｃタイプS. mutans株ATCC25175をBHI培地で対数期へと増殖させ、3000xg、5分間の遠心分離によりリン酸緩衝溶液pH7.2（PBS）で2回洗浄した。このペレットを１% ホルマリン／0.9% NaCl中に再懸濁し、室温で30分間混合し、0.9% NaClで2回洗浄した。ホルマリン処理済みのインタクトなS. mutans細菌細胞を約108個含有する抗原100μl（フロイント不完全アジュバント(FIA)で乳化したもの）を腹腔内注入してBALB/cマウス(8〜10週)を免疫した。3〜5週間後、マウスに2回目の抗原量（FIA中の108個のインタクトな細菌細胞）を投与した。犠牲にする3日前に、食塩水中の108個のインタクトな細菌細胞を静脈内に注入してマウスを追加免疫した。
【００２９】
宿主から脾細胞を回収した。用いた組織培養培地は、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウムおよび10mM HEPESを補充し、かつ10% ウシ胎児血清と共に100μg/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するRPMI 1640 (Gibco)培地であった。NSI/Ag4.1マウスミエローマ細胞系を融合パートナーとして使用し、5% CO2、37℃でスピナー培養にて増殖し、融合に先立って対数増殖期に維持した。Kohlerら, Nature, 256:495-497, (1975)に記載される手法に従ってハイブリドーマを作製した。HAT（100μgヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μMチミジン）を含む培地中でハイブリッドを選択した。アミノプテリンを抜き取った後、培地中のHT（100μgヒポキサンチン、16μMチミジン）を2週間維持した。ハイブリドーマのクローニングの間、追加の増殖因子としてOPI（1mMオキザロ酢酸、0.45mMピルビン酸、および0.2U/mlウシインスリン）を組織培養物に添加した。ハイブリドーマは、KohlerとMilsteinの先駆的研究以来標準的になった技法を用いて、限界希釈によりさらにクローニングした。
【００３０】
S. mutansに対する種特異的モノクローナル抗体をスクリーニングするために以下のアプローチを使用した。最初のスクリーニングはELISAアッセイを用いて行ったが、これはS. mutansと結合する抗体を含む培養上清を選択するものである。ホルマリン処理済みの細菌をPBSでOD600＝0.5となるまで希釈し、100μlの0.02mg/ml ポリ-L-リシンと共に4時間プレインキュベートした96ウェルPVC ELISAプレートのウェル（100μl）に二重反復で添加した。これらの抗原コーティングプレートを加湿ボックス内で4℃にて一晩インキュベートし、次にPBSで3回洗浄し、PBS中の0.5% ウシ胎児血清によりブロックした後4℃で保存した。100μlの成熟ハイブリドーマ上清を抗原プレートの適切なウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、PBS-0.05% Tween 20で3回洗浄し、さらに結合抗体を検出するために、アルカリホスファターゼとコンジュゲートさせた多価ヤギ抗マウスIgG抗体をPBS-1% ウシ胎児血清で1:1000に希釈したものを添加した。基質として炭酸バッファー(15mM Na2CO3, 35mM NaH2CO3, 10mM MgCl2 pH9.6)中の1mg/ml リン酸p-ニトロフェニルを添加して15分後に、EIAリーダーを用いて405nmで発色を測定した。その後、陽性の上清（対照より3倍高い）を免疫沈降アッセイに供して（100μlの細菌を100μlの上清と混合して）、S. mutansとの強い陽性反応を示すものをスクリーニングした。寄託したクローン(ATCC HB 12599、HB 12560およびHB 12558)はこの方法に従って作製された。
【００３１】
2. V 領域をクローニングするためのハイブリドーマ系の作製
A. アイソタイピング
ハイブリドーマ上清をPharmigen Isotyping Kit (BD Pharmigen, San Deigo, CA)によりアイソタイピングした。200μlのアイソタイプ特異的ラット抗マウス抗体を800μlのコーティングバッファーで希釈し、50μlずつの試薬を96ウェルのポリスチレンELISAプレートに添加した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（0.05% Tween 20/PBS）で4回洗浄し、残存する内容物を振って広げ、プレートをペーパータオルで乾燥させてブロットした。各ウェルに200μlのブロッキング溶液（1% BSA/PBS）を添加し、プレートを室温で30分インキュベートした。プレートを再度4回洗浄し、内容物を振って広げた。適切なウェルに50μlのハイブリドーマ上清を添加した。キットからの陽性対照を適切なウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで5回洗浄し、乾燥させてブロットした。１個のホスファターゼ基質錠剤を5.0mlのp-NNP基質希釈液中に溶解した。50μlの基質溶液を各ウェルに添加して、プレートを40分インキュベートした。Dynatech MR 700マイクロプレートリーダーを使って405nmでプレートを読み取った。SWLA1、SWLA2およびSWLA3はすべてがγ2a,κ(IgG)であると決定された。
【００３２】
B. 生合成による標識付け
細胞を、非必須アミノ酸(Grand Island Biological)とグルタミン(29.2μg/ml)を補充したメチオニン不含有ダルベッコ変法イーグル培地(DME, Irvine Scientific)中で2回洗浄した。15μCiの[35S]メチオニン(Amersham, Arlington Heights, IL)を含む1mlのDME中で細胞を標識した。すべての標識は3x106個の細胞を用いて行った。
【００３３】
分泌物の標識のために、35S-メチオニンを15μC/mlまで添加し、細胞を37℃で3時間標識した。細胞を氷上に回収し、遠心分離によりペレット化した。分泌されたIgGを単離するために、放射性培地をクリーンチューブに移した。
【００３４】
細胞質のIgGを測定するために、細胞ペレットを0.5mlのNDET（1% NP40、0.4%デオキシコール酸、66mM EDTAおよびl0mM Tris, pH 7.4）中で溶解し、核を遠心分離によりペレット化し、細胞質溶解物を新しいチューブに移した。分泌されたまたは細胞質のIgGを免疫沈降させるために、ラット抗マウスκセファロース（実験室で調製したもの）を添加した。サンプルを4℃で一晩混合し、NDETで洗浄してからdH20を用いて洗浄した。沈降物をサンプルバッファー（25mM Tris, pH 6.7、2% SDS、10% グリセロール、0.008% ブロモフェノールブルー）中に再懸濁し、沸騰させることによりセファロースから抗体を溶出した。サンプルを5% リン酸ゲルにて非還元条件下でSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより分析した。2-メルカプトエタノールで処理したサンプルは12% tris-グリシンゲルを用いて分析した。結果は、3個のクローンすべてが同一サイズの重鎖であるが異なるサイズの軽鎖を製造したことを示した。確実に均一な細胞集団とするために3つのハイブリドーマすべてをサブクローニングした。
【００３５】
C. サブクローニング
ハイブリドーマは軟寒天上でサブクローニングした。60mmのペトリ皿に5mlの増殖培地＋10% J774.2（マウスマクロファージ細胞系）上清＋0.24% アガロース(Sigma)をコーティングした。このアガロースを固化させ、その上面にアガロースと混合したハイブリドーマ細胞の単一細胞懸濁液を重層した。コロニーの大きさが約64個の細胞に達したとき、それらの上に、アガロースと混合したウサギ抗マウスγ2a特異的抗血清を加えた。免疫沈降物が全面に形成され、γ2a,κ抗体を分泌するクローンを部分的に見えなくする。最も多く抗体を産生するコロニーを同定し、取り出して大量培養に付し、そこでもう一度、生合成的に標識した。
【００３６】
3. SWLA 細胞由来の可変領域のクローニング
SWLA細胞由来の可変領域をクローニングするための基本的プロトコルを以下に説明し、続いて特定のSWLAハイブリドーマへのその適用について説明する。
【００３７】
(i) Invitrogenから入手したMicrofast Track Kitを用いて、約5x106個のオリジナルの細胞とサブクローニングした細胞からマウスmRNAを調製する。
【００３８】
(ii) 軽鎖または重鎖の定常領域の5’側にプライムするか、またはmRNAのポリAテイルにプライムするオリゴヌクレオチドを用いて第一鎖cDNAを作製する。
基本的プロトコル：
(a) cDNAの半分を20μlのRNase不含有dH2Oに再懸濁する；
(b) 2μlの0.5mg/mlプライマーを添加する；この混合物を60℃で10分インキュベートする；
(c) サンプルを氷上で冷却する；その後、8μlの5X第一鎖cDNAをバッファー、2μlのRNasin (Promega)、4μlの5mM dNTP、および0.5μlのAMV逆転写酵素を添加する；
(d) このサンプルを42℃で１時間インキュベートする。
【００３９】
(iii) いくつかの軽鎖または重鎖シグナルペプチドプライマーおよび軽鎖または重鎖の定常領域の5’側にハイブリダイズするプライマーを用いてPCR増幅を行う。
PCR 条件：
(a) 変性を94℃で40秒間
(b) アニーリングを60℃で40秒間
(c) 伸長を72℃で40秒間
(d) 増幅を30サイクル
(e) 最終伸長を72℃で10分間
【００４０】
(iv) 得られるPCR産物をTOPO Cloning KitによってInvitrogenのPCR2.1ベクターにクローニングする。
【００４１】
(v) 配列決定のために個々のクローンを外部に送った。得られた結果をオープンリーディングフレーム(ORF)について分析し、既知のデータベースと比較してその配列が可変領域であることを確かめた。
【００４２】
(vi) PCRにより誘導された、その配列のヌクレオチド変異を調べるために、ステップIII〜Vを繰り返したが、それにより、独立したPCR反応からの個々のクローンの配列を比較して、その配列の精度を確実なものとすることができる。さらに、配列データを用いて、使用する必要があるJ領域プライマーの配列を決定する。
【００４３】
(vii) 可変領域を適当な軽鎖（ヒトκ）または重鎖（ヒトIgG1）発現ベクターにクローニングした。
典型的な可変領域連結プロトコル：
(a) 1μgずつのベクターおよびインサートをNheI/EcoRVまたはSa1I/EcoRVのいずれかで切断した；
(b) 次いで、Qiagenのゲル抽出キットを用いて、関係する断片を単離した；
(c) 連結反応には、30μlのベクターサンプルのうち4μlを、そして30μlのインサートサンプルのうち6μlを使用した；
(d) その後、20μlの最終反応用量につき4〜5ユニットのT4 DNAリガーゼを添加した。
【００４４】
典型的な形質転換プロトコル：
(a) HB101化学的コンピテント大腸菌細胞のアリコートを氷上で解凍した；
(b) 次いで、この細胞に全連結反応混合液を添加して氷上で15分インキュベートした；
(c) その後細胞に42℃で1分間、熱ショックを与えた；
(d) この細胞に1mlのLBを添加し、チューブを37℃で1時間振とうした；
(e) チューブを8000 RPMで2分回転させた；
(f) 100μlの上清を除いて全部取り出した；
(g) 細胞を再懸濁し、LB+AMPプレートにまき、37℃で一晩インキュベートした。
【００４５】
B. SWLA1 細胞由来の可変領域のクローニング
軽鎖可変領域(VL)をクローニングしようとして、以下に示すシグナルペプチドプライマー442を定常領域プライマー450と共に用いてPCR産物を見つけ出した。以前の研究から、442は内在性の異常なまたは非生産的なVLであるSWLA1 Aberrant VL（配列番号13）にもプライムすることが分かっている。このことを考慮して、PCR産物をPflMI（異常なVL中の特定の配列を認識する）で制限消化することにより、異常でない転写産物を富化しようとした。最終的に、1つの可変領域配列がORFをもつことが判明した。最終PCR産物であるSWLA1 VL（配列番号１）を、以下に示すプライマー442とJ領域プライマー453を用いて生成させ、適切な発現ベクターに挿入した。SWLA1由来のVLを保持している得られたヒトκ発現ベクターを5936 pAGと命名した。
【００４６】
図１のパネルAを参照されたい。そこにはVLドメインをコードする配列と推定上のアミノ酸配列（配列番号１および２）が示されている。また、異常なVLをコードする配列と推定上のアミノ酸配列（配列番号13および14）を示す図４を参照されたい。
【００４７】
442 (配列番号21) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA T 3’
450 (配列番号22) 5’ GCG TCT AGA ACT GGA TGG TGG GAA GAT GG 3’
453 (配列番号23) 5’ AGC GTC GAC TTA CGT TTK ATT TCC ARC TTK GTC CC 3’
【００４８】
重鎖可変領域(VH)のクローニングからは、結果的に2つのユニークなVH（両方ともORFをもつ）が見出された。一方のVHでは以下に示すシグナルペプチドプライマー440を使用し、他方ではシグナルペプチドプライマー441を使用した。両反応とも、重鎖定常領域プライマー451を使用した。2つの最終PCRを行なった。1つ目はJ領域プライマー452とプライマー440を使用してSWLA1 VH（配列番号３）を生成させ、2つ目は同じJ領域プライマーとプライマー441を使用してSWLA1 2nd VH（配列番号15）および異常な非生産的VHであるSWLA1 Aberrant VH（配列番号17）を得た。得られた2つの異なるVHを保持するヒトIgG1発現ベクターを5937 pAH (SWLA1 VH) および 5943 pAH (SWLA1 2nd VH)と命名した。しかし、ベクター5937 pAHのみが有効な全長VHを発現することが分かった。
【００４９】
VHドメインをコードするDNAおよび推定上のアミノ酸配列を配列番号３および４として図１のパネルBに示す。効力のない2nd VHのDNAおよびアミノ酸配列（配列番号15および16）については図５を、異常なVHのDNAおよびアミノ酸配列（配列番号17および18）については図６を参照されたい。
【００５０】
440 (配列番号24) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG RAC TTC GGG YTG AGC TKG GTT TT 3’
441 (配列番号25) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GCT GTC TTG GGG CTG CTC TTC T 3’
451 (配列番号26) 5’ AGG TCT AGA AYC TCC ACA CAC AGG RRC CAG TGG ATA GAC 3’
452 (配列番号27) 5’ TGG GTC GAC WGA TGG GGS TGT TGT GCT AGC TGA GGA GAC 3’
【００５１】
C. SWLA2 細胞由来の可変領域のクローニング
VLをクローニングする際に2つのPCR産物が見出された。1つの産物はプライマー442および450から得られた。もう1つはプライマー443および450から得られた。ORFをもつユニークなVLは443/450反応からクローニングされた。SWLA2 VL（配列番号５）をもたらした最終PCRではJ領域プライマー453とプライマー443を使用した。得られたSWLA2由来のVLを保持するヒトκ発現ベクターは5938 pAGと命名した。
【００５２】
VLドメインをコードする配列および推定上のアミノ酸配列（配列番号５および６）を示す図２のパネルAを参照されたい。
443 (配列番号28) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AG 3’
【００５３】
VHをクローニングする際にも2つのPCR産物が見出された。一方の産物はプライマー439および451から得られた。他方の産物はプライマー440および451から得られた。前者の反応から得られた転写産物は異常なSWLA2 Aberrant VH（配列番号19）であることが分かった。後者の反応から得られた転写産物はその5’配列の一部を欠失していた。この配列をいくつかの類似した既知VHとアラインメントした後で、以下に示すような新しいリーダーシグナルペプチドプライマー843を設計した。最終PCR産物であるSWLA2 VH（配列番号７）はプライマー843とJ領域プライマー452を用いて生成された。得られたSWLA2由来のVHを保持するヒトIgG1発現ベクターは5939 pAHと命名した。
【００５４】
VHドメインをコードするDNAおよび推定上のアミノ酸配列を配列番号７および８として図２のパネルBに示す。異常なVHのDNAおよびアミノ酸配列（配列番号19および20）については図７を参照されたい。
439 (配列番号29) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG GRA TGS AGC TGK GTM ATS CTC TT 3’
843 (配列番号30) 5’ GGG ATA TCC ACC ATG GRC AGR CTT ACW TYY TCA TTC CTG 3’
【００５５】
D. SWLA3 細胞由来の可変領域のクローニング
組合せプライマー442および450からはただ1つのVL PCR産物が得られた。もう一度、このPCR産物をPflMIで消化して、異常でない転写産物について富化した。この手法は役に立たなかった。別の酵素Eco0109Iを同様に用いたところ、5’末端を欠失している1つの転写産物が見つかった。この配列を既知のデータベースと比較して、以下に示すシグナルペプチドプライマー826を新たに設計した。このプライマー826を以下に示すJ領域プライマー835と共に用いて最終PCR産物SWLA3 VL（配列番号９）を得た。これをヒトκ発現ベクターにクローニングして、5940 pAGと命名した。
【００５６】
VLドメインをコードする配列および推定上のアミノ酸配列（配列番号９および10）を示す図３のパネルAを参照されたい。
826 (配列番号31) 5’ GGG GAT ATC CAC ATG ATG AGT CCT GCC CAG TTC C 3’
835 (配列番号32) 5’ GGT CGA CTT AGC TTT CAG CTC CAG CTT GGT 3’
【００５７】
組合せプライマー440および451からはただ1つのVH PCR産物が得られた。最終PCR反応ではプライマー440とJ領域プライマー452を用いてSWLA3 VH（配列番号11）を得た。このVHをヒトIgG1発現ベクターにクローニングして、5941 pAHと命名した。
【００５８】
VHドメインをコードするDNAおよび推定上のアミノ酸配列を配列番号11および12として図３のパネルBに示す。
【００５９】
4. S. mutans に対するヒト化モノクローナル抗体をコードするマウス／ヒトキメラ遺伝子の作製
(i) 正しいV領域を含有する発現ベクターとプラスミドからDNAを調製した。軽鎖および重鎖定常領域を発現するベクターに関する詳細な情報については、Current Protocols in Imunology, Section 2.12.1 (1994)を参照されたい。
(ii) 発現ベクターを適切な制限酵素で消化した。次に、消化物をアガロースゲルで電気泳動にかけ、適切な大きさの断片を単離した。
(iii) さらに、クローン化V領域を含有するプラスミドを消化して、V領域を含む適切なDNA断片をアガロースゲルから単離した。
(iv) 次に、V領域および発現ベクターを一緒に混合し、T4 DNAリガーゼを添加して反応混合物を一晩16℃でインキュベートした。
(v) 連結混合物を用いてコンピテント細胞をトランスフェクトし、正しい連結配列を発現するクローンを選別した。制限マッピングにより正しい構造であることを確認した。
【００６０】
5. 真核細胞のトランスフェクション
各発現ベクター由来の10μgのDNAをBSPC 1 (Stratagene, PvuIアイソシゾマー)消化により線状化し、1×107個のミエローマ細胞(Sp2/0またはNSO/1)をエレクトロポレーションによって同時トランスフェクトした。トランスフェクションに先立って、細胞を冷PBSで洗浄し、次に0.9mlの同じ冷バッファー中に再懸濁して、電極間隔が0.4cmのエレクトロポレーション用キュベットに入れた。エレクトロポレーションでは960 microFおよび200 Vを使用した。その後、ショックを与えた細胞を、10% ウシ血清を含むIMDM培地(Gibco, NY)中にて氷上でインキュベートした。
【００６１】
トランスフェクト細胞は96ウェルプレートに104個/ウェルの濃度でまいた。ヒスチジノールまたはミコフェノール酸のような選択用薬物を含む選択培地を用いて、発現ベクターを含有する細胞を選択した。12日後、増殖しているクローンからの上清を抗体産生について試験した。
【００６２】
6. 組換え抗体の分析
ELISAアッセイを用いて、ヒトIgG抗体を分泌するトランスフェクトーマ(transfectomas)を同定した。96ウェルELISAプレートの各ウェルに100μlの5μg/mlヤギ抗ヒトIgGを添加し、一晩インキュベートした。このプレートをPBSで数回洗浄し、3% BSAでブロックした。上記の増殖クローンからの上清をプレートに添加して室温で2時間維持した。次いでプレートを洗浄し、1% BSAで1:1000に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ヒトκ抗体を添加して37℃で1時間維持した。プレートをPBSで洗浄し、ジエタノールアミンバッファー(9.6% ジエタノールアミン, 0.24mM MgCl2, pH9.8)中のp-NPPを添加した。OD405での発色がH2L2を産生する細胞であることを示した。
【００６３】
ヒト化IgG定常領域をもたらす上清について、それらのS. mutansとの反応性をShiら, Hybridoma 17:365-371 (1998)に記載されるように試験した。簡単に説明すると、表１に示す細菌株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにより提案される種々の培地で増殖させた。嫌気性細菌は80% N2、10% CO2、10% H2 の雰囲気にて37℃で増殖させた。種々の口内細菌に対する抗体の特異性をELISAアッセイで調べた。細菌をPBSでOD600=0.5へと希釈し、100μlの0.02mg/mlポリ-L-リシンと共に4時間プレインキュベートした96ウェルPVC ELISAプレートのウェル(100μl)に二重反復して添加した。これらの抗原コーティングプレートを湿潤ボックス内で4℃にて一晩インキュベートし、次にPBSで3回洗浄し、PBS中の0.5% ウシ胎児血清でブロックして4℃で保存した。抗原プレートの適切なウェルに50μg/mlのキメラ抗体を100μl添加し、室温で1時間インキュベートし、PBS-0.05% Tween 20で3回洗浄し、結合抗体を検出するためにPBS-1% ウシ胎児血清で1:1000に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲート多価ヤギ抗ヒトIgG抗体を添加した。基質として炭酸バッファー(15mM Na2CO3, 35mM NaH2CO3, 10mM MgCl2 pH9.6)中の1mg/ml リン酸p-ニトロフェニルを添加した後、15分後の発色を405nmでEIAリーダーにより測定した。「+」はOD405＞1.0を意味し；「-」はOD405＜0.05を意味する。陰性対照は＜0.05である。用いたキメラ抗体はTEDW (SWLA1由来)、TEFE (SWLA2由来)およびTEFC (SWLA3由来)である。結果を表１に示す。
【表１】
図８は、SWLA1から誘導されたキメラTEDW抗体を用いて得られた蛍光顕微鏡像を示す。S. mutans ATCC25175を脳-心臓浸出物培地中、80% N2、10% CO2および10% H2の雰囲気にて37℃で増殖させた。次に細胞を洗浄し、PBSバッファー中に再懸濁し、種々の抗体と混合して光学顕微鏡または蛍光顕微鏡で検査した。図８を参照すると、左側のキメラ抗体はS. mutans細胞と結合してそれらを凝集させる。中央のキメラ抗体はヤギFITCコンジュゲート抗ヒトIgG（Fc特異的）抗体(Sigma F9512)と相互作用してS. mutansの蛍光画像を提供する。右側のキメラ抗体はヤギFITCコンジュゲート抗マウスIgG（Fc特異的）抗体(Sigma F5387)と反応せず、S. mutansの蛍光画像を与えない。キメラ抗体TEFEおよびTEFCも使用したところ、TEDWキメラ抗体と一致する結果が得られた。
【００６５】
フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡の両実験から得られた結果は、それぞれのキメラ抗体(TEDW、TEFEおよびTEFC)が、ヒトIgG定常領域とS. mutansを特異的に認識することができる可変領域をいずれも含んでいたことを示している。
【００６６】
7. 形質転換生物での S. mutans に対するモノクローナル抗体の発現
A. 動物細胞でのヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の生産
ヒトIgG遺伝子の重鎖および軽鎖を動物細胞系（Sp2/0など）にエレクトロポレーションにより別々に導入するか、または同時トランスフェクトした。トランスフェクト細胞をマイクロタイタープレートにまいて、10% ウシ胎児血清を含む培地中37℃で5% C02の雰囲気にてインキュベートした。48時間のインキュベーション後に、ヒスチジノールまたはミコフェノール酸を含有する選択培地中で細胞を増殖させた。薬剤耐性細胞の上清を集め、先に記載したELISAまたは免疫沈降アッセイを用いてS. mutansに対する免疫反応性をスクリーニングした。
【００６７】
B. 食用植物でのヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の生産
トランスジェニック植物は大量の外来タンパク質をきわめて低コストで生産するための非常に有用な系であることが認められている。食用植物（野菜または果実）においてS. mutansに対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体を発現させることで、口から植物または植物抽出物を直接摂取して既存の齲食症を治療し、また、将来の細菌感染を予防することが可能となる。好適なトランスジェニック食用植物としては、限定するものではないが、ジャガイモ、トマト、ブロッコリー、トウモロコシ、バナナが挙げられる。
【００６８】
ここでは、トランスジェニックシロイヌナズナ(Arabidopsis)を作製するための手順を示すことにする。シロイヌナズナはキャベツ、カリフラワー、ブロッコリーのようなありふれた野菜を含むアブラナ属の種に近縁の食用植物であるが、この植物が選ばれた理由は、多くの遺伝的および生化学的ツールがシロイヌナズナ用に開発されていることによる。この植物にIgGを発現させるためのストラテジーはいくつか存在する。１つの方法は、最初に、重鎖および軽鎖をコードするヒトIgG遺伝子を2つの別個のトランスジェニック系統に導入することである。2つの遺伝子は遺伝的交雑および選別によって合体させる。その他の方法は連続的形質転換を必要とし、この場合には1つのIgG遺伝子で形質転換されたトランスジェニック系統を2つ目の遺伝子で再形質転換する。あるいはまた、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を、同じT-DNA形質転換用ベクターの2つの異なるクローニング部位に2つのプロモーターの制御下でクローニングし、植物への単一の構築物の形質転換によって両遺伝子の発現を達成することができる。技術的には、別々の形質転換法が一番簡単な方法であり、通常は比較的高い抗体収量をもたらす。したがって、本発明者らは、ここではこのストラテジーを採用する。同様の技法を用いて他の植物を形質転換することも可能である。
【００６９】
ヒトIgG遺伝子の重鎖および軽鎖をコードするDNA断片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)のTiプラスミドに別個にクローニングする。このプラスミドはシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)においてヒトIgGの重鎖および軽鎖を発現させるためのプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス選択用の抗生物質マーカー、およびシロイヌナズナでの形質転換選択のための除草剤耐性遺伝子を含有する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス株をこれらのプラスミドで形質転換し、抗生物質選択のもとで後期対数増殖期へと増殖させ、Bethtoldら(C.R. Acad. Sci. Paris Life Sci. 316:1194-1199, 1993)により記載された浸潤用培地中に再懸濁する。
【００７０】
Tiプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスによるシロイヌナズナの形質転換は減圧浸潤法により実施する。シロイヌナズナの全植物体を細菌懸濁液中に浸漬する。この方法は減圧チャンバーで実施する。5分減圧（約40 cmHg）を4サイクル行なう。それぞれの減圧後に、減圧を解放して、すぐに再度減圧をかける。浸潤後、植物を生育チャンバー内で水平に24時間維持する。その後植物を成熟するまで育てて、その種子を収穫する。収穫した種子は、最初の一対の本葉が出るまで非選択的生育条件下で発芽させる。この段階で、150 mg/l(水中)の濃度の除草剤バスタ(Basta)を植物に噴霧する。形質転換Tiプラスミドを含有するシロイヌナズナ植物はこの除草剤に耐性を示し、一方非形質転換植物は白化して枯死する。かかる選択を第二世代の植物まで継続する。耐性植物について、全ゲノムDNAを単離し、IgG遺伝子の重鎖および軽鎖をコードするDNA断片でプローブ（探査）する。陽性形質転換体から植物抽出物を調製し、ヒトIgGの定常領域の重鎖および軽鎖に対する抗体を用いてウェスタンブロット法によりヒトIgGタンパク質の発現についてスクリーニングする。
【００７１】
ヒトIgG重鎖を発現する植物と、ヒトIgG軽鎖を発現する植物との雌雄交雑を行い、両方の鎖を発現する子孫を作出する。ウェスタンブロット法を用いて重鎖と軽鎖の両方をスクリーニングする。陽性形質転換体からの抽出物を集めて、先に述べたELISAまたは免疫沈降アッセイによりS. mutansに対する免疫反応性をスクリーニングする。
【００７２】
8. ヒト齲食症を治療および予防するための S. mutans に対するヒトまたはヒト化モノクローナル抗体の使用
上記の研究が成功裏に完了したことで、S. mutansに対するヒト化モノクローナル抗体が得られた。植物組織の効力を試験した。
【００７３】
S. mutansに対するモノクローナル抗体を含む植物組織の抽出物を、精製したヒト補体成分または精製したヒト多形核白血球の存在下または不在下で、様々な濃度のS. mutansと混合する。2時間のインキュベーション後、混合物をBHIプレートに播種して抗菌活性を調べる。
【００７４】
Wolinskyら, J. Dent. Res. 75:816-822 (1996)によって開発された人工的なプラーク形成系を用いて、唾液中または人口歯のエナメル質に存在する歯苔中のS. mutansを死滅させる発現モノクローナル抗体の能力を調べるために、該モノクローナル抗体を含有する植物組織抽出物を使用する。同様の技法を用いて、歯苔の形成を防止する能力についても試験する。
【００７５】
動物細胞または植物により産生されたこれらのモノクローナル抗体を用いて、ヒト臨床試験を実施する。これらのS. mutansに対するヒトモノクローナル抗体を用いてまたは用いないでボランティアを治療する。その後、唾液中または歯苔中のS. mutansのレベルを調べる。さらに、モノクローナル抗体による治療との関係において現在の齲食と将来の齲食との間に相関関係があるかについても調べる。
【００７６】
前述の実施例は単なる例示を目的としたものであって、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限するものでないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】SWLA1細胞から誘導されたS. mutansに特異的なキメラ抗体(TEDW)の可変領域をコードするDNA配列（配列番号１および３）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号２および４）を示す。
【図２】SWLA2細胞から誘導されたS. mutansに特異的なキメラ抗体(TEFE)の可変領域をコードするDNA配列（配列番号５および７）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号６および８）を示す。
【図３】SWLA3細胞から誘導されたS. mutansに特異的なキメラ抗体(TEFC)の可変領域をコードするDNA配列（配列番号９および11）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号10および12）を示す。
【図４】SWLA1細胞から誘導された異常な軽鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号13）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号14）を示す。
【図５】SWLA1細胞から誘導された効力のない重鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号15）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号16）を示す。
【図６】SWLA1細胞から誘導された異常な重鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号17）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号18）を示す。
【図７】SWLA2細胞から誘導された異常な重鎖可変領域をコードするDNA配列（配列番号19）ならびに推定アミノ酸配列（配列番号20）を示す。
【図８】S. mutansと結合するキメラ抗体TEDWの光学および蛍光顕微鏡像を示す。
Claims (24)
- 哺乳動物の齲食症を治療および予防するための方法であって、遺伝子工学的に作製された抗体を経口投与することを含んでなり、該抗体の可変領域が齲食原性生物と特異的に結合し、該抗体の定常領域が体液性免疫エフェクター系を引き出すことを特徴とする、上記方法。
- 齲食原性生物がストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)である、請求項１に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 前記抗体の軽鎖の可変領域が配列番号１の核酸配列を含んでなる、請求項２に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 前記抗体の重鎖の可変領域が配列番号３の核酸配列を含んでなる、請求項２に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 前記抗体の軽鎖の可変領域が配列番号５の核酸配列を含んでなる、請求項２に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 前記抗体の重鎖の可変領域が配列番号７の核酸配列を含んでなる、請求項２に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 前記抗体の軽鎖の可変領域が配列番号９の核酸配列を含んでなる、請求項２に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 前記抗体の重鎖の可変領域が配列番号11の核酸配列を含んでなる、請求項２に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 請求項２に記載の抗体の軽鎖の可変領域が配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、齲食症を治療および予防するための方法。
- 請求項２に記載の抗体の重鎖の可変領域が配列番号４のアミノ酸配列を含んでなる、齲食症を治療および予防するための方法。
- 請求項２に記載の抗体の軽鎖の可変領域が配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、齲食症を治療および予防するための方法。
- 請求項２に記載の抗体の重鎖の可変領域が配列番号８のアミノ酸配列を含んでなる、齲食症を治療および予防するための方法。
- 請求項２に記載の抗体の軽鎖の可変領域が配列番号10のアミノ酸配列を含んでなる、齲食症を治療および予防するための方法。
- 請求項２に記載の抗体の重鎖の可変領域が配列番号12のアミノ酸配列を含んでなる、齲食症を治療および予防するための方法。
- 哺乳動物の齲食症を治療および予防するための方法であって、精製された抗体を経口投与することを含んでなり、該抗体の可変領域が齲食原性生物と特異的に結合し、該抗体の定常領域が体液性免疫エフェクター系を引き出すことを特徴とする、上記方法。
- 齲食原性生物がストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)である、請求項15に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項15に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- 精製された抗体が、
a) ヒト抗体を産生するように遺伝的に改変されているマウスを、少なくとも１種の齲食原性生物により免疫し、
b) 少なくとも１種の齲食原性生物に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを作製し、
c) ステップb)の抗体を単離する、
各ステップにより生産される、請求項17に記載の齲食症を治療および予防するための方法。 - 精製された抗体が、
a) 単離されたヒトＢリンパ球を少なくとも１種の齲食原性生物によりin vitroで免疫し、
b) 少なくとも１種の齲食原性生物に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを作製し、
c) ステップb)の抗体を単離する、
各ステップにより生産される、請求項17に記載の齲食症を治療および予防するための方法。 - 精製された抗体が、
a) 少なくとも1種の齲食原性生物の急性感染にかかったヒトからＢリンパ球を単離し、
b) 少なくとも１種の齲食原性生物に特異的な抗体を分泌するハイブリドーマを作製し、
c) ステップb)の抗体を単離する、
各ステップにより生産される、請求項17に記載の齲食症を治療および予防するための方法。 - 精製された抗体が、
a) 前記可変領域の発現をコードする遺伝配列を単離し、
b) 前記可変領域の発現をコードする遺伝配列をクローニングし、
c) 前記可変領域の発現をコードする遺伝配列を、前記定常領域の発現をコードする遺伝配列に連結させ、
d) 連結させた配列を発現させ、
e) ステップd)の発現された抗体を単離する、
各ステップにより生産される、請求項17に記載の齲食症を治療および予防するための方法。 - ステップa)がファージディスプレイランダムライブラリーをスクリーニングすることにより行なわれる、請求項21に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- ステップc)における前記定常領域の発現をコードする遺伝配列がIgGまたはIgM抗体から誘導される、請求項21に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
- ステップd)における前記連結させた配列の発現が動物、ヒト、鶏卵または植物からなる群より選択される発現系において行なわれる、請求項21に記載の齲食症を治療および予防するための方法。
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