JP2004535803A - 核酸の分析のための定量的ハイブリダイゼーションアッセイ - Google Patents
核酸の分析のための定量的ハイブリダイゼーションアッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004535803A JP2004535803A JP2003500522A JP2003500522A JP2004535803A JP 2004535803 A JP2004535803 A JP 2004535803A JP 2003500522 A JP2003500522 A JP 2003500522A JP 2003500522 A JP2003500522 A JP 2003500522A JP 2004535803 A JP2004535803 A JP 2004535803A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- target nucleic
- probe
- antisense
- sense
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
Abstract
標的核酸サンプル中のmRNAの分析のための定量的ハイブリダイゼーションアッセイを提供する。この方法は、(i)標的核酸サンプルを、固体支持体上に固定化し、(ii)標識したアンチセンスプローブを、当該標的核酸サンプルの第一部分に接触させ、そして標識したセンスプローブを、当該標的核酸サンプルの第2部分に接触させ、(iii)ハイブリダイズしたアンチセンスプローブおよびハイブリダイズしたセンスプローブから生成するシグナルを検出および定量し、(iv)アンチセンスプローブシグナルとセンスプローブシグナルの差によって表される値を決定することを含む。当該値は、標的核酸サンプル中のmRNAの量に比例的である。
Description
【0001】
技術分野
本発明は、核酸サンプル中のmRNAの分析のための定量的ハイブリダイゼーションに関する。
【0002】
背景技術
特異的RNA発現の誘導は、薬物または化学的化合物の生物学的活性の重要なマーカーである。サンプル中のRNAの定量は、ある剤がRNA発現を誘導するのが可能であるか決定するために必要である。種々のRNA定量方法(RNAハイブリダイゼーションアッセイ)が当分野で既知である。しかし、現在使用される方法は通常、RNAの単離および精製、追加的cDNA合成、特別な装置の使用および/または多数(20またはより多い)種特異的オリゴヌクレオチド(分枝DNAアッセイ)のセットの使用を要する。
【0003】
1より多い動物種からのサンプル中の種々の剤のRNA誘導効果を決定することはしばしば望ましい。標準的方法にしたがって、RNA定量アッセイは、ミクロプレートに移動された細胞または組織スライスのモノレイヤーで実施できる。試験すべき剤を次いで、プレートのウェルに、しばしばピペッティングロボットの使用によって添加する。ミクロプレートリーダを次いで、サンプル中のRNAが標識されたプローブにハイブリダイズしたことを示す、蛍光または発光を検出するために使用する。
【0004】
結果として、標準的ミクロプレート形式と両立可能である、かつ同じプローブを、1より多い動物種からのRNAサンプルへのハイブリダイゼーションのために使用し得る、RNA精製または特別な装置の使用を要しないシンプルで信頼できるRNA定量方法の必要性がある。
【0005】
決定されたRNA発現レベルを中間(internal)標準に対して相関し得ることが特に有用であり、こうして、種々のアッセイで種々の量の出発材料の使用から生じる変異を排除する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】図1は、マウスIGF−I遺伝子から由来するセンスおよびアンチセンスプローブ中にとりこまれたビオチンレベルの検出を示すグラフである(LCPS=秒あたりの発光カウント)。
【図2】図2は、種々の量の成長ホルモン(GH)での刺激後の、マウス肝細胞中のIGF−IB RNAの定量を示すグラフである。コントロール(CTR)細胞は、GHを受容しなかった。
【図3】図3は、種々の量の成長ホルモン(GH)での刺激後の、ラット肝細胞中のIGF−IB RNAの定量を示すグラフである。コントロール(CTR)細胞は、GHを受容しなかった。
【0007】
発明の開示
本発明は、改良された定量的RNAハイブリダイゼーションアッセイを提供する。本発明のハイブリダイゼーションアッセイの有利な特徴は:
(a)実質的に同じ長さおよび特異的活性を有する、アンチセンスおよびセンスプローブの使用であって、サンプル中の興味の持たれるRNA、例えばmRNAの量に比例的な値の容易な決定を可能とし、
(b)RNAを予め精製する必要なく、ハイブリダイゼーションアッセイに直接的に細胞ライセートを使用することが可能であり、そして
(c)ハイブリダイゼーション条件が、ノーザンおよびサザンブロッティングについて使用される標準条件と類似するから、いくつかの動物種からの核酸サンプルの分析のために同じプローブを使用することが可能であること
を含む。
【0008】
より具体的には、本発明は、サンプル中の標的核酸の定量のための方法を提供し、該方法は:(i)標的核酸を含むサンプルを、固体支持体上に固定化し、(ii)ハイブリダイゼーション条件下で、標識されたアンチセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第1部分に接触させ、そして標識されたセンスプローブを該標的核酸を含むサンプルの第2部分に接触させ、ここで該アンチセンスプローブは、該標的核酸のすべてまたは一部と相補的であり、ここで該センスプローブは、該標的核酸の全部または一部と同一であり、かつここで該アンチセンスおよびセンスプローブは、実質的に同じ長さであり、実質的に同じ特異的活性(specific activity)のシグナルを生成でき、(iii)アンチセンスプローブおよびセンスプローブから生成したシグナルを検出および定量し、そして(iv)センスプローブシグナルを引いたアンチセンスプローブシグナルによって表される値を決定し、該値が、サンプル中に存在する標的核酸の量に比例的である、ことを含む。
【0009】
該標的核酸は、RNA、例えばmRNAである。標的核酸を含むサンプルは、細胞または細胞集団のmRNA含量を含むことができる。例えば、サンプルは細胞ライセートを含み得る。サンプルを例えば、細胞培養物からの総細胞ライセートを取得することによって調製できる。
1実施態様では、アンチセンスおよびセンスプローブを、インビトロで転写する。さらなる例では、プローブを、固相合成法によって作成する。プローブはRNAまたはDNAであることができる。
【0010】
1実施態様では、該方法は追加的に、検出工程(iii)に先立ち、ハイブリダイズしてない標識プローブを除去する工程を含む。
1実施態様では、固体支持体はナイロン膜であることができる。
プローブを、例えば、放射活性標識または非放射活性標識、例えばビオチンで標識し得る。
【0011】
さらなる側面では、本発明は、本発明の方法を実施するための試薬を含むキットを含む。例えば、キットはここに記載のようなアンチセンスおよびセンスプローブを含み得る。このキットはまた、固体支持体材料および/または細胞ライセートを生成するためおよび分析のためのサンプルを調製するための材料を含み得る。
本発明は、以下の部でより詳細に定義かつ記載する。
【0012】
プローブ
用語「プローブ」は、特異的塩基配列の一本鎖核酸分子をいい、これを使用し、ハイブリダイゼーションによって相補的塩基配列を検出する。本文脈では、用語「アンチセンスプローブ」は、選択のDNAのアンチセンス(非コーディング)鎖の一部の転写から得られるRNAプローブをいう。アンチセンスプローブは結果的に、当該DNAから転写された翻訳可能mRNAに相補的であり、そして、そのようなmRNAにハイブリダイズし得る。用語「センスプローブ」は、センスDNA鎖の一部の転写から得られるRNAプローブ、すなわち相補的mRNAの合成のため使用されるDNA鎖をいう。こうして、センスプローブは、そのようなmRNAに顕著にはハイブリダイズできないことが理解される。
【0013】
本発明にしたがって、アンセンスおよびセンスプローブは、本質的に同じ長さ、例えば100、50、25、20、15、10、5、4、3、2またはを超えない長さによって異なる長さを有する。プローブの長さは、好適には、近似的に100ないし1000ヌクレオチド長の範囲である。
【0014】
好適なセンスおよびアンチセンスプローブは、標準的方法によって興味の持たれるDNAから調製できる。1つの好適な方法は、このましくは100−1000、たとえば約300の興味のもたれる遺伝子のヌクレオチドを含むcDNAクローンを調製し、その結果プロモーターを該cDNAのいずれかの末端にライゲートし、それを両方の方向からのcDNAをインビトロ転写するのを可能とする。cDNAクローンは、好適な制限酵素で線形化し、その結果プロモーターから制限部位までの距離は、cDNAのいずれかの末端から類似である。RNAプローブ(センスおよびアンチセンス)は、例えば商業的に入手可能な転写キット、例えばMAXIscript(登録商標)、In Bitro Transcription Kit(Ambion Cat. No. 1308-1326)を使用してインビトロ転写によって調製できる。インビトロ転写反応で使用される普通のRNAポリメラーゼは、SP6、T7、およびT3ポリメラーゼであり、これらがクローン化されたバクテリオファージについて名づけられる。
【0015】
標識およびシグナルシステム
用語「標識された(センスまたはアンチセンス)プローブ」は、直接的にまたはシグナル生産システムの1または2以上の追加的メンバーでの相互作用を介して検出可能シグナルを提供することのできる、プローブをいう。直接的に検出可能である標識は、放射活性および蛍光標識を含む。シグナル生産系を介して検出可能である標識は、例えばビオチン、フルオレセイン、および低エネルギー放射活性を含む。ビオチニル化プローブは、Leary et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 4145に記載のようなニトロセルロースフィルター上の標的核酸配列の感受性発色性検出についての当分野、およびLanger-Safer(1982) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4381における標的DNAのインサイチュ検出の分野で既知である。
【0016】
以下に提供する例において、プローブを、製造者の推奨にしたがってBrightStar(登録商標)Psoralen-Biotin(登録商標)(Ambion Cat. No. 1480)を使用する架橋化によって標識した。BrightStar(登録商標)Psoralen-Biotin(登録商標)は、ビオチンに共有結合されている三環式インターカレーティング部分、プロラレンからなる。このプソラレン−ビオチンを核酸内に差し込み、そして次いで、長波長UV光での短い照射によって共有結合する。
【0017】
本発明にしたがって、アンチセンスおよびセンスプローブを、実質的に同じ特異的活性で標識する。語句「同じ特異的活性」は、標的核酸サンプルにハイブリダイズしたプローブの量について、同じ強度のシグナルを生成する、センスおよびアンチセンスプローブの能力をいう。語句「同じ特異的活性」はまた、プローブが本質的に同じ長さおよび塩基組成を有すること、および標識されたヌクレオチドの数が、両方のプローブで同じであることをいう。
【0018】
プローブが同じ特異的活性に標識されていることを確認するのが有用である。標識が放射活性である場合、その取りこみは、精製されたプローブのアリコートのシンチレーションカウンティングによって決定できる。非放射性標識の取りこみは、アンチセンスおよびセンスプローブの一連希釈物を、フィルター上にスポッティングし、次いで蛍光を検出する(もし標識がフルオレセインであるなら)こと、または標識がビオチンなら、検出系例えばBrightStar(登録商標)BioDetect(登録商標)Nonisotopic Detection Kit(Ambion Cat. No. 1930)によって決定できる。アンチセンスおよびセンスプローブ濃度が、例えば260nmでの光学的密度を決定し、または標準的方法で蛍光を決定し、その結果それぞれのプローブの同じ量が、それぞれのハイブリダイゼーション反応で使用されることによって正確に決定されることがまた有用である。
【0019】
標的核酸サンプルの調製および固定化
用語「標的核酸サンプル」は、動物組織または細胞培養物から取得されるサンプルをいい、このサンプルは核酸を含み、ここでmRNAの量を定量するのが望ましい。
【0020】
本発明にしたがって、標的核酸サンプルは好ましくは、細胞カルチャーの総ライセートとして調製する。そのような総細胞ライセートは、既知方法によって調製でき、例えばKaabache, T. et al.,(1995)Direct Solution Hybridization of Guanidine Thiocyanate Solubilized Cells for Quantitation of mRNAs in Hepatocytes. Anal. Biochem/ 232:225-230参照。
【0021】
通常は細胞を、好適な密度に培養し、それから好適な剤、例えばグアニジンチオシアネートの添加によって溶解する。細胞溶解後、アリコートの細胞性ライセートを、好適な固体支持体に移す。好適な固体支持体の例は、ミクロプレート形式ナイロンフィルター、例えば「Nylon Membrane Filtermat」である。Fitermat(Perkin-Elmer; Product No. 1450-423)は、プリントされたパターンを有する96位置ナイロン膜であり、RNA/DNAハイブリダイゼーションアッセイのためのマニホルドとの使用を意図する。典型的には、5−10μlのライセートを、ドライフィルター上にスポットする。8レプリカフィルターを、この態様で調製できる。このライセートを次いで、標準的方法にしたがってUV架橋化によってまたはベイキングによってフィルター上に固定化する。
【0022】
プローブの、固定化標的サンプルへのハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイゼーション条件」は、RNAプローブ(複数もある)と標的核酸サンプルに含まれる相補的核酸間の検出可能なハイブリダイゼーションを生産するのに十分な条件を言う。当業者は、例えば周知実験マニュアルから、好適なハイブリダイゼーション条件を決定できる。
【0023】
以下に与える例では、レプリカフィルターは、商業的に入手可能なULTRAhyb(登録商標)Ultrasensitive hybridization Buffer(Ambion Cat. No. 8670)ローリングボトル中の高ストリンジェンシー条件で、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、ULTRAhyb(登録商標)プロトコルにしたがって高ストリンジェンシーで洗浄した。
【0024】
シグナルの検出および定量
標的核酸サンプルにハイブリダイズしたプローブの量は、標準的方法によって決定できる。固体支持体が、標準的ミクロプレート形式を有する膜またはフィルターであるとき、シグナルは肝便意は、ミクロプレートリーダーを使用することによって検出できる。
【0025】
プローブは、放射活性標識で標識されたならば、フィルターを乾燥し、そしてハイブリダイゼーションを、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージャー分析によって直接的に定量できる。代替的には、シンチレーションメディウム(例えばmeltiLex(登録商標)固体シンチレーター(Perkin-Elmer; Product No. 1450-441-442)またはフォす液体シンチレーションメディウム)を、フィルターに添加し、これをプラスチックバッグ中にシールでき、そしてシンチレーションカウンチングのため装着されたミクロプレートリーダーでカウントできる。
【0026】
もし、以下に例示するように、プローブが非放射性標識、例えばビオチンで標識されたならば、フィルターを、シグナルの発展中にローリングボトル(ハイブリダイゼーション中に使用される)中に保持することができる。シグナルを、例えばBrightStar(登録商標)Nonisotopic Detection Kitを使用して検出できる。発光基質の添加後、フィルターをプラスチック、例えば商業的入手可能のSanple bag(Perkin-Elmer; Product No.1450-432)中にシールし、そしてフィルターホルダーに移動することができる。発光を次いで、シグナルが最大に達したときに、ミクロプレートリーダーで定量する。
【0027】
アンチセンスプローブから生成したシグナルは、ライセートに存在する特異的RNA、並びに総細胞性ライセートへのバックグラウンドハイブリダイゼーション(一部はライセート中に存在するDNAへの特異的ハイブリダイゼーションに由来する)を表す。対照的に、センスプローブから生成したシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションのみを表し、そしてライセート中の細胞性材料の量に比例的である。アンチセンスおよびセンスプローブが同じ長さかつ同じ特異的活性のものであるとき、センスハイブリダイゼーションからのシグナルの量は、アンチセンスシグナルから検出でき、特異的遺伝子のフォールド誘導の真の評価という結果である。さらに、この結果は、細胞溶解工程に先立つ細胞または組織の異なる量のために、出発材料の量の可能な変異についての更正という結果となる。
【0028】
本記載を通して、「標準的プロトコル」および「標準的手法」は、分子生物学的技法の文脈で使用するとき、通常の実験マニュアルで見出されるプロトコルおよび手法として理解されるべきであり、例えばCurrent Protocols in Molecular iology , editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994,またはSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: Alaboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboatory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
【0029】
特に定義しないかぎり、ここで使用される技術的および科学的用語は、この発明の属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載されるものと類似または均等な方法および材料を、本発明の実施化または試験で使用できるが、好適な方法および材料は、以下に記載する。すべての刊行物、特許出願、特許およびここに述べる他の引用は、引用によりここに含める。加えて、記載された材料および方法は、例示目的で限定を意図しない。本発明は、例示目的のみで含まれる、実施例によって記載し、とにかく限定として見られるべきでない。
【0030】
実施例
実施例1:IGF−IB RNAの決定のためのプローブの調製
マウスIGF−IB遺伝子エキソン2からの60ヌクレオチド、並びにエキソン3からの179ヌクレオチドを含むcDNA(GenBank Accession No. X04482;配列番号1および2)を、pGEN(登録商標)−4Z標準クローニングベクター(Promega;Cat.No. P2161)内にクローニングした。EcoRIでプラスミドを線形化して、T7ポリメラーゼ(MAXIscript(登録商標)T7キット;Ambion Cat. No 1308)を使用して約250ヌクレオチド長アンチセンスプローブの転写を可能とする。HindIIIでの線形化して、SPポリメラーゼ(MAXIscript(登録商標)SP6キット;Ambion Cat. No.1312)。転写したIGF−IBフラグメントのcDNA配列(小文字)、並びにフランキングプラスミド配列(大文字)を以下に与える(配列番号3):
【化1】 【0031】
プローブを、NICK−カラム(Amersham Pharmacia Biotech; Cat.No. 17-0855-02)で精製し、そしてそれらの濃度を、260nmの光学的密度によって、並びに標準的方法にしたがって臭化エチジウム可視化によって決定した。同じ量(0.5μg)のアンチセンスおよびセンスプローブを、プソラレン−ビオチンで架橋することによって標識した。一連希釈の2反復サンプルを、フィルター上にスポットし、そして標識の量を製造者指示にしたがってBrightStar(登録商標)BioDetect(登録商標)(Nonisotopic Detection)キット(Ambion Cat. No.1930)を使用して決定した。結果(図1)は、標識の量が、アンチセンスおよびセンスプローブの対応する量に類似であることを示した。
【0032】
実施例2:マウス肝細胞のIGF−I RNAの決定
マウス肝細胞をかん流によって調製し、96ウェルミクロプレートにプレートした。プレートの日後、細胞を終夜の血清飢餓の対象とした。その後培養培地を、新鮮血清フリー培地に交換し、そして細胞を、一連希釈のヒト成長ホルモンで6時間刺激した。培養培地を除去し、そして100μl細胞溶解バッファー(4.0−4.2Mグアニジンチオシアネートおよび0.1M EDTA)を、それぞれのウェルに添加し、これらは、近似的に30000細胞のモノレイヤーを含んだ。
【0033】
プレート融解後、細胞の溶解を、ピペッティングロボットを使用して溶解バッファーを数回挙げ下げすることによって達成した。等量(10μl)のライセートを、同じピペッティングロボットを使用してナイロン膜(Nylon Membrane Filtermat; Perkin-Elmer; Product No. 1450-423)に移動させた。レプリカフィルターを、調製した。溶解物を、UV架橋化によってフィルター上に固定化した。
【0034】
ハイブリダイゼーションをULTRAhyb(登録商標)Ultrasensitive Hybridization Buffer(Ambion Cat. No. 8670)を使用して製造者推奨にしたがって、68℃でローリングボトル中で高ストリンジェンシーで実施した。1時間の前ハイブリダイゼーション後、実施例1にしたがって調製したアンチセンスおよびセンスプローブ(0.5ng/ml)を、それぞれ第1および第2フィルターに添加した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、ULTRAhyb(登録商標)プロトコルにしたがって高ストリンジェンシーで洗浄した。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを、BrightStar(登録商標)BioDetec(登録商標)(Nonisotopic Detection)キット(Ambion Cat. No. 1930)および発光リーダを使用して決定した。
【0035】
結果(図2)は、IGF−IB RNAの成長ホルモン依存性誘導を示し、ラット肝細胞について示されたものと類似であるTollet P. et al.,(1990)Moleculae Endocrinology 4:1934-1942)。同じハイブリダイゼーションは、細胞性モノレイヤーがイーブンであったことを示した。センス−プローブによって取得されたバックグラウンドハイブリダイゼーションレベルは、アンチセンスハイブリダイゼーションから演繹したとき、RNA誘導は、インビボおよびインビトロの可溶性ハイブリダイゼーション研究(Tollet P. et al., 前掲)から報告されたものと類似(5ないし8倍)であると示された。
【0036】
実施例3:ラット肝細胞におけるIGF−I RNAの決定
実施例2に記載の実験をラット肝細胞で反復した。図3に示すように、類似の結果がマウス肝細胞についてのように取得された。このことは、プローブの同じ対を、1より多い動物種からのサンプルでRNA定量のため使用し得る。
技術分野
本発明は、核酸サンプル中のmRNAの分析のための定量的ハイブリダイゼーションに関する。
【0002】
背景技術
特異的RNA発現の誘導は、薬物または化学的化合物の生物学的活性の重要なマーカーである。サンプル中のRNAの定量は、ある剤がRNA発現を誘導するのが可能であるか決定するために必要である。種々のRNA定量方法(RNAハイブリダイゼーションアッセイ)が当分野で既知である。しかし、現在使用される方法は通常、RNAの単離および精製、追加的cDNA合成、特別な装置の使用および/または多数(20またはより多い)種特異的オリゴヌクレオチド(分枝DNAアッセイ)のセットの使用を要する。
【0003】
1より多い動物種からのサンプル中の種々の剤のRNA誘導効果を決定することはしばしば望ましい。標準的方法にしたがって、RNA定量アッセイは、ミクロプレートに移動された細胞または組織スライスのモノレイヤーで実施できる。試験すべき剤を次いで、プレートのウェルに、しばしばピペッティングロボットの使用によって添加する。ミクロプレートリーダを次いで、サンプル中のRNAが標識されたプローブにハイブリダイズしたことを示す、蛍光または発光を検出するために使用する。
【0004】
結果として、標準的ミクロプレート形式と両立可能である、かつ同じプローブを、1より多い動物種からのRNAサンプルへのハイブリダイゼーションのために使用し得る、RNA精製または特別な装置の使用を要しないシンプルで信頼できるRNA定量方法の必要性がある。
【0005】
決定されたRNA発現レベルを中間(internal)標準に対して相関し得ることが特に有用であり、こうして、種々のアッセイで種々の量の出発材料の使用から生じる変異を排除する。
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図1】図1は、マウスIGF−I遺伝子から由来するセンスおよびアンチセンスプローブ中にとりこまれたビオチンレベルの検出を示すグラフである(LCPS=秒あたりの発光カウント)。
【図2】図2は、種々の量の成長ホルモン(GH)での刺激後の、マウス肝細胞中のIGF−IB RNAの定量を示すグラフである。コントロール(CTR)細胞は、GHを受容しなかった。
【図3】図3は、種々の量の成長ホルモン(GH)での刺激後の、ラット肝細胞中のIGF−IB RNAの定量を示すグラフである。コントロール(CTR)細胞は、GHを受容しなかった。
【0007】
発明の開示
本発明は、改良された定量的RNAハイブリダイゼーションアッセイを提供する。本発明のハイブリダイゼーションアッセイの有利な特徴は:
(a)実質的に同じ長さおよび特異的活性を有する、アンチセンスおよびセンスプローブの使用であって、サンプル中の興味の持たれるRNA、例えばmRNAの量に比例的な値の容易な決定を可能とし、
(b)RNAを予め精製する必要なく、ハイブリダイゼーションアッセイに直接的に細胞ライセートを使用することが可能であり、そして
(c)ハイブリダイゼーション条件が、ノーザンおよびサザンブロッティングについて使用される標準条件と類似するから、いくつかの動物種からの核酸サンプルの分析のために同じプローブを使用することが可能であること
を含む。
【0008】
より具体的には、本発明は、サンプル中の標的核酸の定量のための方法を提供し、該方法は:(i)標的核酸を含むサンプルを、固体支持体上に固定化し、(ii)ハイブリダイゼーション条件下で、標識されたアンチセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第1部分に接触させ、そして標識されたセンスプローブを該標的核酸を含むサンプルの第2部分に接触させ、ここで該アンチセンスプローブは、該標的核酸のすべてまたは一部と相補的であり、ここで該センスプローブは、該標的核酸の全部または一部と同一であり、かつここで該アンチセンスおよびセンスプローブは、実質的に同じ長さであり、実質的に同じ特異的活性(specific activity)のシグナルを生成でき、(iii)アンチセンスプローブおよびセンスプローブから生成したシグナルを検出および定量し、そして(iv)センスプローブシグナルを引いたアンチセンスプローブシグナルによって表される値を決定し、該値が、サンプル中に存在する標的核酸の量に比例的である、ことを含む。
【0009】
該標的核酸は、RNA、例えばmRNAである。標的核酸を含むサンプルは、細胞または細胞集団のmRNA含量を含むことができる。例えば、サンプルは細胞ライセートを含み得る。サンプルを例えば、細胞培養物からの総細胞ライセートを取得することによって調製できる。
1実施態様では、アンチセンスおよびセンスプローブを、インビトロで転写する。さらなる例では、プローブを、固相合成法によって作成する。プローブはRNAまたはDNAであることができる。
【0010】
1実施態様では、該方法は追加的に、検出工程(iii)に先立ち、ハイブリダイズしてない標識プローブを除去する工程を含む。
1実施態様では、固体支持体はナイロン膜であることができる。
プローブを、例えば、放射活性標識または非放射活性標識、例えばビオチンで標識し得る。
【0011】
さらなる側面では、本発明は、本発明の方法を実施するための試薬を含むキットを含む。例えば、キットはここに記載のようなアンチセンスおよびセンスプローブを含み得る。このキットはまた、固体支持体材料および/または細胞ライセートを生成するためおよび分析のためのサンプルを調製するための材料を含み得る。
本発明は、以下の部でより詳細に定義かつ記載する。
【0012】
プローブ
用語「プローブ」は、特異的塩基配列の一本鎖核酸分子をいい、これを使用し、ハイブリダイゼーションによって相補的塩基配列を検出する。本文脈では、用語「アンチセンスプローブ」は、選択のDNAのアンチセンス(非コーディング)鎖の一部の転写から得られるRNAプローブをいう。アンチセンスプローブは結果的に、当該DNAから転写された翻訳可能mRNAに相補的であり、そして、そのようなmRNAにハイブリダイズし得る。用語「センスプローブ」は、センスDNA鎖の一部の転写から得られるRNAプローブ、すなわち相補的mRNAの合成のため使用されるDNA鎖をいう。こうして、センスプローブは、そのようなmRNAに顕著にはハイブリダイズできないことが理解される。
【0013】
本発明にしたがって、アンセンスおよびセンスプローブは、本質的に同じ長さ、例えば100、50、25、20、15、10、5、4、3、2またはを超えない長さによって異なる長さを有する。プローブの長さは、好適には、近似的に100ないし1000ヌクレオチド長の範囲である。
【0014】
好適なセンスおよびアンチセンスプローブは、標準的方法によって興味の持たれるDNAから調製できる。1つの好適な方法は、このましくは100−1000、たとえば約300の興味のもたれる遺伝子のヌクレオチドを含むcDNAクローンを調製し、その結果プロモーターを該cDNAのいずれかの末端にライゲートし、それを両方の方向からのcDNAをインビトロ転写するのを可能とする。cDNAクローンは、好適な制限酵素で線形化し、その結果プロモーターから制限部位までの距離は、cDNAのいずれかの末端から類似である。RNAプローブ(センスおよびアンチセンス)は、例えば商業的に入手可能な転写キット、例えばMAXIscript(登録商標)、In Bitro Transcription Kit(Ambion Cat. No. 1308-1326)を使用してインビトロ転写によって調製できる。インビトロ転写反応で使用される普通のRNAポリメラーゼは、SP6、T7、およびT3ポリメラーゼであり、これらがクローン化されたバクテリオファージについて名づけられる。
【0015】
標識およびシグナルシステム
用語「標識された(センスまたはアンチセンス)プローブ」は、直接的にまたはシグナル生産システムの1または2以上の追加的メンバーでの相互作用を介して検出可能シグナルを提供することのできる、プローブをいう。直接的に検出可能である標識は、放射活性および蛍光標識を含む。シグナル生産系を介して検出可能である標識は、例えばビオチン、フルオレセイン、および低エネルギー放射活性を含む。ビオチニル化プローブは、Leary et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80: 4145に記載のようなニトロセルロースフィルター上の標的核酸配列の感受性発色性検出についての当分野、およびLanger-Safer(1982) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:4381における標的DNAのインサイチュ検出の分野で既知である。
【0016】
以下に提供する例において、プローブを、製造者の推奨にしたがってBrightStar(登録商標)Psoralen-Biotin(登録商標)(Ambion Cat. No. 1480)を使用する架橋化によって標識した。BrightStar(登録商標)Psoralen-Biotin(登録商標)は、ビオチンに共有結合されている三環式インターカレーティング部分、プロラレンからなる。このプソラレン−ビオチンを核酸内に差し込み、そして次いで、長波長UV光での短い照射によって共有結合する。
【0017】
本発明にしたがって、アンチセンスおよびセンスプローブを、実質的に同じ特異的活性で標識する。語句「同じ特異的活性」は、標的核酸サンプルにハイブリダイズしたプローブの量について、同じ強度のシグナルを生成する、センスおよびアンチセンスプローブの能力をいう。語句「同じ特異的活性」はまた、プローブが本質的に同じ長さおよび塩基組成を有すること、および標識されたヌクレオチドの数が、両方のプローブで同じであることをいう。
【0018】
プローブが同じ特異的活性に標識されていることを確認するのが有用である。標識が放射活性である場合、その取りこみは、精製されたプローブのアリコートのシンチレーションカウンティングによって決定できる。非放射性標識の取りこみは、アンチセンスおよびセンスプローブの一連希釈物を、フィルター上にスポッティングし、次いで蛍光を検出する(もし標識がフルオレセインであるなら)こと、または標識がビオチンなら、検出系例えばBrightStar(登録商標)BioDetect(登録商標)Nonisotopic Detection Kit(Ambion Cat. No. 1930)によって決定できる。アンチセンスおよびセンスプローブ濃度が、例えば260nmでの光学的密度を決定し、または標準的方法で蛍光を決定し、その結果それぞれのプローブの同じ量が、それぞれのハイブリダイゼーション反応で使用されることによって正確に決定されることがまた有用である。
【0019】
標的核酸サンプルの調製および固定化
用語「標的核酸サンプル」は、動物組織または細胞培養物から取得されるサンプルをいい、このサンプルは核酸を含み、ここでmRNAの量を定量するのが望ましい。
【0020】
本発明にしたがって、標的核酸サンプルは好ましくは、細胞カルチャーの総ライセートとして調製する。そのような総細胞ライセートは、既知方法によって調製でき、例えばKaabache, T. et al.,(1995)Direct Solution Hybridization of Guanidine Thiocyanate Solubilized Cells for Quantitation of mRNAs in Hepatocytes. Anal. Biochem/ 232:225-230参照。
【0021】
通常は細胞を、好適な密度に培養し、それから好適な剤、例えばグアニジンチオシアネートの添加によって溶解する。細胞溶解後、アリコートの細胞性ライセートを、好適な固体支持体に移す。好適な固体支持体の例は、ミクロプレート形式ナイロンフィルター、例えば「Nylon Membrane Filtermat」である。Fitermat(Perkin-Elmer; Product No. 1450-423)は、プリントされたパターンを有する96位置ナイロン膜であり、RNA/DNAハイブリダイゼーションアッセイのためのマニホルドとの使用を意図する。典型的には、5−10μlのライセートを、ドライフィルター上にスポットする。8レプリカフィルターを、この態様で調製できる。このライセートを次いで、標準的方法にしたがってUV架橋化によってまたはベイキングによってフィルター上に固定化する。
【0022】
プローブの、固定化標的サンプルへのハイブリダイゼーション
用語「ハイブリダイゼーション条件」は、RNAプローブ(複数もある)と標的核酸サンプルに含まれる相補的核酸間の検出可能なハイブリダイゼーションを生産するのに十分な条件を言う。当業者は、例えば周知実験マニュアルから、好適なハイブリダイゼーション条件を決定できる。
【0023】
以下に与える例では、レプリカフィルターは、商業的に入手可能なULTRAhyb(登録商標)Ultrasensitive hybridization Buffer(Ambion Cat. No. 8670)ローリングボトル中の高ストリンジェンシー条件で、ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、ULTRAhyb(登録商標)プロトコルにしたがって高ストリンジェンシーで洗浄した。
【0024】
シグナルの検出および定量
標的核酸サンプルにハイブリダイズしたプローブの量は、標準的方法によって決定できる。固体支持体が、標準的ミクロプレート形式を有する膜またはフィルターであるとき、シグナルは肝便意は、ミクロプレートリーダーを使用することによって検出できる。
【0025】
プローブは、放射活性標識で標識されたならば、フィルターを乾燥し、そしてハイブリダイゼーションを、オートラジオグラフィーまたはホスホイメージャー分析によって直接的に定量できる。代替的には、シンチレーションメディウム(例えばmeltiLex(登録商標)固体シンチレーター(Perkin-Elmer; Product No. 1450-441-442)またはフォす液体シンチレーションメディウム)を、フィルターに添加し、これをプラスチックバッグ中にシールでき、そしてシンチレーションカウンチングのため装着されたミクロプレートリーダーでカウントできる。
【0026】
もし、以下に例示するように、プローブが非放射性標識、例えばビオチンで標識されたならば、フィルターを、シグナルの発展中にローリングボトル(ハイブリダイゼーション中に使用される)中に保持することができる。シグナルを、例えばBrightStar(登録商標)Nonisotopic Detection Kitを使用して検出できる。発光基質の添加後、フィルターをプラスチック、例えば商業的入手可能のSanple bag(Perkin-Elmer; Product No.1450-432)中にシールし、そしてフィルターホルダーに移動することができる。発光を次いで、シグナルが最大に達したときに、ミクロプレートリーダーで定量する。
【0027】
アンチセンスプローブから生成したシグナルは、ライセートに存在する特異的RNA、並びに総細胞性ライセートへのバックグラウンドハイブリダイゼーション(一部はライセート中に存在するDNAへの特異的ハイブリダイゼーションに由来する)を表す。対照的に、センスプローブから生成したシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションのみを表し、そしてライセート中の細胞性材料の量に比例的である。アンチセンスおよびセンスプローブが同じ長さかつ同じ特異的活性のものであるとき、センスハイブリダイゼーションからのシグナルの量は、アンチセンスシグナルから検出でき、特異的遺伝子のフォールド誘導の真の評価という結果である。さらに、この結果は、細胞溶解工程に先立つ細胞または組織の異なる量のために、出発材料の量の可能な変異についての更正という結果となる。
【0028】
本記載を通して、「標準的プロトコル」および「標準的手法」は、分子生物学的技法の文脈で使用するとき、通常の実験マニュアルで見出されるプロトコルおよび手法として理解されるべきであり、例えばCurrent Protocols in Molecular iology , editors F. Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc. 1994,またはSambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: Alaboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboatory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.
【0029】
特に定義しないかぎり、ここで使用される技術的および科学的用語は、この発明の属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載されるものと類似または均等な方法および材料を、本発明の実施化または試験で使用できるが、好適な方法および材料は、以下に記載する。すべての刊行物、特許出願、特許およびここに述べる他の引用は、引用によりここに含める。加えて、記載された材料および方法は、例示目的で限定を意図しない。本発明は、例示目的のみで含まれる、実施例によって記載し、とにかく限定として見られるべきでない。
【0030】
実施例
実施例1:IGF−IB RNAの決定のためのプローブの調製
マウスIGF−IB遺伝子エキソン2からの60ヌクレオチド、並びにエキソン3からの179ヌクレオチドを含むcDNA(GenBank Accession No. X04482;配列番号1および2)を、pGEN(登録商標)−4Z標準クローニングベクター(Promega;Cat.No. P2161)内にクローニングした。EcoRIでプラスミドを線形化して、T7ポリメラーゼ(MAXIscript(登録商標)T7キット;Ambion Cat. No 1308)を使用して約250ヌクレオチド長アンチセンスプローブの転写を可能とする。HindIIIでの線形化して、SPポリメラーゼ(MAXIscript(登録商標)SP6キット;Ambion Cat. No.1312)。転写したIGF−IBフラグメントのcDNA配列(小文字)、並びにフランキングプラスミド配列(大文字)を以下に与える(配列番号3):
【化1】 【0031】
プローブを、NICK−カラム(Amersham Pharmacia Biotech; Cat.No. 17-0855-02)で精製し、そしてそれらの濃度を、260nmの光学的密度によって、並びに標準的方法にしたがって臭化エチジウム可視化によって決定した。同じ量(0.5μg)のアンチセンスおよびセンスプローブを、プソラレン−ビオチンで架橋することによって標識した。一連希釈の2反復サンプルを、フィルター上にスポットし、そして標識の量を製造者指示にしたがってBrightStar(登録商標)BioDetect(登録商標)(Nonisotopic Detection)キット(Ambion Cat. No.1930)を使用して決定した。結果(図1)は、標識の量が、アンチセンスおよびセンスプローブの対応する量に類似であることを示した。
【0032】
実施例2:マウス肝細胞のIGF−I RNAの決定
マウス肝細胞をかん流によって調製し、96ウェルミクロプレートにプレートした。プレートの日後、細胞を終夜の血清飢餓の対象とした。その後培養培地を、新鮮血清フリー培地に交換し、そして細胞を、一連希釈のヒト成長ホルモンで6時間刺激した。培養培地を除去し、そして100μl細胞溶解バッファー(4.0−4.2Mグアニジンチオシアネートおよび0.1M EDTA)を、それぞれのウェルに添加し、これらは、近似的に30000細胞のモノレイヤーを含んだ。
【0033】
プレート融解後、細胞の溶解を、ピペッティングロボットを使用して溶解バッファーを数回挙げ下げすることによって達成した。等量(10μl)のライセートを、同じピペッティングロボットを使用してナイロン膜(Nylon Membrane Filtermat; Perkin-Elmer; Product No. 1450-423)に移動させた。レプリカフィルターを、調製した。溶解物を、UV架橋化によってフィルター上に固定化した。
【0034】
ハイブリダイゼーションをULTRAhyb(登録商標)Ultrasensitive Hybridization Buffer(Ambion Cat. No. 8670)を使用して製造者推奨にしたがって、68℃でローリングボトル中で高ストリンジェンシーで実施した。1時間の前ハイブリダイゼーション後、実施例1にしたがって調製したアンチセンスおよびセンスプローブ(0.5ng/ml)を、それぞれ第1および第2フィルターに添加した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、ULTRAhyb(登録商標)プロトコルにしたがって高ストリンジェンシーで洗浄した。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルを、BrightStar(登録商標)BioDetec(登録商標)(Nonisotopic Detection)キット(Ambion Cat. No. 1930)および発光リーダを使用して決定した。
【0035】
結果(図2)は、IGF−IB RNAの成長ホルモン依存性誘導を示し、ラット肝細胞について示されたものと類似であるTollet P. et al.,(1990)Moleculae Endocrinology 4:1934-1942)。同じハイブリダイゼーションは、細胞性モノレイヤーがイーブンであったことを示した。センス−プローブによって取得されたバックグラウンドハイブリダイゼーションレベルは、アンチセンスハイブリダイゼーションから演繹したとき、RNA誘導は、インビボおよびインビトロの可溶性ハイブリダイゼーション研究(Tollet P. et al., 前掲)から報告されたものと類似(5ないし8倍)であると示された。
【0036】
実施例3:ラット肝細胞におけるIGF−I RNAの決定
実施例2に記載の実験をラット肝細胞で反復した。図3に示すように、類似の結果がマウス肝細胞についてのように取得された。このことは、プローブの同じ対を、1より多い動物種からのサンプルでRNA定量のため使用し得る。
Claims (10)
- サンプル中の標的核酸の定量方法であって、
(i)標的核酸を含むサンプルを固体支持体上に固定化する、
(ii)ハイブリダイゼーション条件下、標識したアンチセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第一部分に接触させ、そして標識したセンスプローブを、標的核酸を含むサンプルの第2部分に接触させ、ここで該アンチセンスプローブは、該標的核酸の全部または一部に相補的であり、ここで該センスプローブは該標的核酸の全部または一部に同一であり、かつここで、該アンチセンスおよびセンスプローブは、実質的に同じ長さであり、かつ実質的に同じ特異的活性のシグナルを生成し得る、
(iii)アンチセンスプローブおよびセンスプローブから生成するシグナルを検出および定量する、
(iv)センスプローブシグナルをひいたアンチセンスプローブシグナルによって表される値を決定し、該値は、サンプル中に存在する標的核酸の量に比例的である、
方法。 - 該標的核酸がmRNAである、請求項1の方法。
- 該サンプルが細胞溶解物を含む請求項1の方法。
- 該アンチセンスおよびセンスプローブが、インビトロで転写される、請求項1の方法。
- 検出工程(iii)に先立ちハイブリダイズしない標識されたプローブを除去することをさらに含む、請求項1の方法。
- 標的核酸を含むサンプルが、細胞培養物から総細胞溶解物を取得することによって調製される、請求項1の方法。
- 該固体支持体がナイロン膜である請求項1の方法。
- 該プローブが、非放射活性標識で標識される、請求項1の方法。
- 該非放射活性標識がビオチンである、請求項8の方法。
- 請求項1のアンチセンスおよびセンスプローブおよび使用のための指示を含むキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE0101934A SE0101934D0 (sv) | 2001-06-01 | 2001-06-01 | New methods |
PCT/SE2002/001056 WO2002097390A2 (en) | 2001-06-01 | 2002-05-31 | A quantitative hybridization assay for the analysis of nucleic acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004535803A true JP2004535803A (ja) | 2004-12-02 |
JP2004535803A5 JP2004535803A5 (ja) | 2005-12-22 |
Family
ID=20284323
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003500522A Withdrawn JP2004535803A (ja) | 2001-06-01 | 2002-05-31 | 核酸の分析のための定量的ハイブリダイゼーションアッセイ |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20030077761A1 (ja) |
EP (1) | EP1393038A2 (ja) |
JP (1) | JP2004535803A (ja) |
CA (1) | CA2447463A1 (ja) |
SE (1) | SE0101934D0 (ja) |
WO (1) | WO2002097390A2 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7811829B2 (en) * | 2006-06-08 | 2010-10-12 | Canon Kabushiki Kaisha | Measuring probe and production process thereof |
AR066354A1 (es) * | 2007-05-01 | 2009-08-12 | Genzyme Corp | La terapia sistematica con factor-1 de crecimiento de tipo insulina reduce la neuropatia periferica diabetica y mejora la funcion renal en la nefropatia diabetica |
CN106086013B (zh) * | 2016-06-30 | 2018-10-19 | 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 | 一种用于核酸富集捕获的探针及设计方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4483920A (en) * | 1982-05-17 | 1984-11-20 | Hahnemann University | Immobilization of message RNA directly from cells onto filter material |
US5082830A (en) * | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
US5830645A (en) * | 1994-12-09 | 1998-11-03 | The Regents Of The University Of California | Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays |
WO1997018326A1 (en) * | 1995-11-13 | 1997-05-22 | Institut Pasteur | Ultrahigh resolution comparative nucleic acid hybridization to combed dna fibers |
JP2001509662A (ja) * | 1996-04-19 | 2001-07-24 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | 疾患特異的遺伝子の定量および発見のための高容量in―situ mRNA ハイブリダイゼーション法 |
EP1105539A2 (en) * | 1998-08-21 | 2001-06-13 | Naxcor | Assays using crosslinkable immobilized nucleic acids |
-
2001
- 2001-06-01 SE SE0101934A patent/SE0101934D0/xx unknown
-
2002
- 2002-05-31 EP EP02736383A patent/EP1393038A2/en not_active Withdrawn
- 2002-05-31 CA CA002447463A patent/CA2447463A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-31 US US10/161,088 patent/US20030077761A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-31 JP JP2003500522A patent/JP2004535803A/ja not_active Withdrawn
- 2002-05-31 WO PCT/SE2002/001056 patent/WO2002097390A2/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2002097390A8 (en) | 2004-06-24 |
US20030077761A1 (en) | 2003-04-24 |
WO2002097390A3 (en) | 2003-10-30 |
SE0101934D0 (sv) | 2001-06-01 |
WO2002097390A2 (en) | 2002-12-05 |
CA2447463A1 (en) | 2002-12-05 |
EP1393038A2 (en) | 2004-03-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4050789B2 (ja) | 特異的捕捉および検出が可能なヌクレオチドプローブを用いた核酸検出法 | |
EP0875583B1 (en) | Primers and kits for the detection of Chlamydia trachomatis | |
AU2012255121B2 (en) | Methods and compositions for detecting target nucleic acids | |
EP0183800A1 (en) | Method of detection nucleic acid sequences | |
EP1136570A2 (en) | Carrier for gene detection and it's use for detecting validity of interferon therapy | |
JP3088287B2 (ja) | 核酸の定量的検出法 | |
JP2006514826A (ja) | 核酸を分析するためのラボ・オン・チップシステム | |
JP2003516166A (ja) | ハイブリダイゼーション反応のための標準化コントロール及び二重鎖プローブ | |
US20010039012A1 (en) | Methods for diagnostic screening | |
JP2004535803A (ja) | 核酸の分析のための定量的ハイブリダイゼーションアッセイ | |
WO2006093150A1 (ja) | シグナル増幅方法 | |
WO2005019469A2 (en) | Rna detection and quantitation | |
EP1141402A1 (en) | Method for the detection of specific nucleic acid sequences by polymerase nucleotide incorporation | |
US6136531A (en) | Method of quantitatively detecting nucleic acids | |
EP0175776A1 (en) | HYBRIDIZATION HYSTOCHEMISTRY. | |
Thompson et al. | Current concepts in quantitative molecular hybridization | |
US7659064B2 (en) | PNA chip using zip-codes and fabrication method thereof | |
JP2003524168A (ja) | 核酸検出のための電気化学的方法 | |
CN112239776A (zh) | 一种基于杂交和级联信号放大原理的多重核酸检测方法及试剂盒 | |
AU2002309410A1 (en) | A quantitative hybridization assay for the analysis of nucleic acid | |
WO2005043114A2 (en) | Oligonucleotide probe sets and uses thereof | |
EP1158057A1 (en) | Compositions and methods applicable to genetic analyses | |
WO2000011215A2 (en) | Method for diagnostic screening | |
AU723602B2 (en) | Biotin-labelled DNA by polymerase chain reaction and detection thereof | |
JP2007267650A (ja) | 神経毒性を検出するための方法およびキット |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050315 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050315 |
|
A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20050519 |