JP2004534559A - 移植用の生体材料及び生合成材料を創成する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、特に、これのみに応用するものではないが、哺乳類由来の自己、同種又は異種の材料の処理への応用における、損傷した、疾病にかかった又は欠損した組織、構造又は器官を、置換又は増強するための、微細構造を維持し、且つインビボ(in vivo)での石灰化、組織の内部への伸展及び経壁性血管形成を阻害する、移植に適した生体材料及び生合成材料を創成する方法に関する。最終用途によって決定される一つの実施態様においては、移植された生細胞は、インビボ条件下で接着及び維持することができる。
【背景技術】
【0002】
(関連技術の記載)
ヒトへの移植のために、組織に強度を与え、抗原部位を中和し、或いは生合成組織及び生体組織を滅菌して組織を安定化及び固定化する目的で、例えば、グルタルアルデヒドを使用することは、既に記載されている。米国特許第4,319,363号、第4,466,139号及び第4,681,588号(Ketharanathan)は、強度及び耐久性を与え、抗原部位を中和し、或いは材料を滅菌するために、静的な液体環境中、一定のグルタルアルデヒド濃度かつ一定のpHで、生合成及び生体材料を処理することを開示している。米国特許第3,966,401号(Hancock and Fogarty)は、例えば心臓の弁のような組織を、グルタルアルデヒドのようななめし液を用いて生理的範囲内で組織を加圧し、次いで天然の組織が柔軟性を保持するように圧力を解放する方法を記載している。一方、米国特許第4,798,611号(Freeman)は、異種材料を、2乃至8メガラドでガンマ線照射し、その後、グルタルアルデヒドのような架橋剤で処理することによって、滅菌し、弾性を与え、抗原性を減少する方法を開示している。
【0003】
生体内石灰化は、体内移植されたグルタルアルデヒド処理を施した生体組織人工器官、特に心臓弁人工器官において報告されている。石灰化が原因で材料がうまくいかなくなるということはなかったものの、米国特許第4,466,139号の材料の壁において、イヌにおける血管導管として使用されたとき、生体内微小石灰化が実証された。移植前に50%アルコールに保存することにより、石灰化の程度は減少したが完全に解消はしなかった。石灰化を減少又は解消するための努力として多くの方法が研究されている。米国特許第4,648,881号(Carpentierら)は、リン酸塩欠損溶液を使用して生体組織における石灰化を阻害する方法を記載している。そして米国特許第5,931,969号(Carpentierら)は、加熱された処理溶液中で少なくとも部分的に固定化された組織を処理し、15乃至60日の間、溶液中の組織の運動(tissue/solution movement)を誘発することを開示している。米国特許第5,843,181号(Jaffe及びHancock)には、生体組織を固定化する前に、pH5乃至8の範囲の少なくとも一つのバッファ溶液に曝すことによって、実質的に無細胞にする方法が開示されている。米国特許第5,746,775号(Levy及びHirsch)は、組織を抗石灰化剤を含有する60乃至80%低級脂肪族アルコール水溶液で少なくとも20分間処理し、次いでグルタルアルデヒドで前処理を行うことによる、生体内石灰化の阻害を開示している。
【0004】
合成材料の表面に生きた移植細胞の増殖、接着及び保持を行うことを促進するために、タンパク質表面をまねた細胞外マトリックスをもった基材の前処理の種々の方法が報告されている。例えば、少なくとも50%の集密度である合成血管移植片表面に内皮細胞を接着するために、ヒト血漿及びフィブリンゲルで、ポリエステル移植材料を被覆することが、米国特許第4,820,626号に開示されている(Williams及びJarrell)。米国特許第5,632,778号(Goldstein)は、間質性コラーゲン中の生存細胞を殺傷し、潜在的な免疫活性可溶性分子を除去し、次いで無細胞組織を細胞外物質で処理し、そして移植片材料の体内移植の前に同種又は自己の細胞を移植する方法を記載している。
【0005】
組織内部への伸展による修復又は生体化を促進する目的で移植される合成材料や、更に最近では、内皮細胞化を促進する貫壁性血管形成のための合成材料においては、その孔サイズを適切なものとすることに、相当な注意が払われてきた。好ましくない点として、特に内径6mm以下の血管導管においては、組織内部への伸展が制御不能であるという性質があり、そのような内径の血管導管は、その後の移植片の破壊とともに、管腔の狭小、血栓及び閉塞を引き起こしていた。
【発明の開示】
【0006】
(発明の概要)
本発明は、哺乳動物の自己、同種又は異種の組織から移植材料を創成する方法であって、
該組織が、20重量%乃至80重量%、及び好ましくは40重量%のコラーゲンを含み、
該方法が、該組織を架橋剤で30分乃至6時間処理し、該処理時間の間、該架橋剤濃度を、0%〜0.25%(重量/体積)の初期濃度から、0.5%〜5%(重量/体積)の最終濃度まで変化させ、更に、該処理時間の間、pHを、1〜3の初期pHから5〜8の最終pHまで変化させる、
ことを包含する方法を提供する。
【0007】
本発明の方法は、好ましくは、およそ2.5時間の間、該組織を該架橋剤で処理することを包含する。
【0008】
本発明の方法は、好ましくは、該処理時間の間、該架橋剤の濃度及び該pHが次第に増加することを包含する。
【0009】
該初期濃度は、およそ0%であることが好ましく、該最終濃度は、およそ2.5%(重量/体積)であることが好ましくい。
【0010】
該初期pHは、およそ1.5であることが好ましく、該最終pHは、およそ7.4であることが好ましい。
【0011】
組織は、例えば、ヒト、ヒツジ、ウシ及びブタ由来の、自己、同種又は異種の材料であってよい。組織は、組織工学処理した生体材料、或いは、代理動物における、又は実験室での組織培養系による、耐久性又は崩壊性の骨格について組織工学処理した材料であってよい。組織は、天然に存在する生体材料、例えば、尿管、胸膜及び血管であってよい。組織は、管状、シート状又は三次元構造を含むいずれの形状でもよい。
【0012】
架橋剤は、グルタルアルデヒドが好ましい。
【0013】
材料は、循環液槽又は回転ドラム中で処理されることが好ましいく、循環液槽において、管状材料は、液体が各管の管腔を通して1分間当たり200乃至400ml、好ましくは1分間当たり300mlの速度で流れるような流体系に置かれる。本発明の方法は、好ましくは更に、該処理時間後、該組織を、0.5%から5%(好ましくは、2.5%)(重量/体積)の濃度の架橋剤(好ましくは、新鮮な架橋剤)で、且つ5から8のpH(好ましくは、7.4)で、20℃から27℃(好ましくは、25℃)の温度で、更に1時間から5日間(好ましくは、48時間)処理することを包含する。
【0014】
組織及び架橋剤溶液は、20℃から27℃の温度であることが好ましく、およそ25℃の温度で保持されることがより好ましい。
【0015】
該組織の形状は、圧縮可能な型によって処理される間保持されることが好ましく、組織は、その材料が動き得るように、該型上に固定されていないか又は一端のみが固定されていることが好ましい。
【0016】
このようにして、組織の微細構造上の配列が組織の損傷なしに保持される。
【0017】
本発明の方法は、好ましくは該組織が架橋された後、好ましくは該組織を化学的又はガンマ線照射のいずれかで、好ましくは15乃至30キログレイ(kgys)、より好ましくは25キログレイで滅菌することを包含する。
【0018】
本発明の方法は、所望により、組織を滅菌する前に、2%(重量/体積)の過酸化水素に30分乃至1.5時間、好ましくは1時間の間液浸することを包含する。
【0019】
本発明の方法は、所望により、組織をガンマ線照射で滅菌する前に、2乃至24時間、好ましくは12時間、5%(重量/体積)のグリシンでインキュベートすることを包含する。
【0020】
該方法は、好ましくは、該材料を体内移植する前に最底限3週間、好ましくは3ヶ月間、50%(体積/体積)のエチルアルコール(即ち、エタノール)中に保存することを包含する。
【0021】
かくして、このような組織の処理によって、生体内石灰化、組織内部への伸展及び経壁性血管形成を阻害する、完全な微小構造と細胞性の内層とを持つ材料を提供するとともに、移植した生細胞が接着するための微小環境を提供する、ことを見出された。加えて、プロセスを実用に応じた範囲で変更すれば、血液適合性、伸展性及び柔軟性を、所望する最終用途に合わせて変化させることができる。
【0022】
本発明は、又、上記した方法により創成される移植材料を提供する。
【0023】
(発明の詳細な説明)
本発明は、自己、同種又は異種の、組織工学処理した生合成材料及び生体材料、又は天然に存在する生体材料を、動的液体環境と共同して、グルタルアルデヒドのような架橋剤の濃度を徐々に上昇させ、且つpHを酸からアルカリへと徐々に変化させて処理することにより、好ましくは、処理後に50%(体積/体積)エタノール中において少なくとも3週間貯蔵することで、組織内部への伸展や血管新生に対して非浸透性で、生体内石灰化を阻害し、且つ移植生細胞の付着及び保持に適する完全な微小構造を有する非多孔性バイオマトリックスが提供されるという、驚くべき知見に基づいている。更に、柔軟性及び弾性は、処理工程中、圧縮性の型に固定されていないか又は一端が固定されているのみである生合成材料又は生体材料へ、架橋剤を段階的に浸透させることによって制御することができる。
【0024】
耐久性の生物学的微小構造と、組織工学処理した材料上の繊維芽細胞や哺乳類の尿管内面を覆う尿路上皮細胞といった、安定化した細胞で覆われた内面とを有する合成材料は、移植された生細胞に対する親和性や、必要な生物学的条件で細胞を保持する能力を有している。移植された生細胞は、内皮細胞の接着を促進するためにポリエステルやポリテトラフルオロエチレンの材料を被覆するのに使用される単一の細胞外マトリックス(ECM)又はECM誘導体よりも、それぞれ一以上のタンパク質リガンドを有する多くの細胞結合部位によって、各合成材料の細胞性の内層に本来的に存在するECMタンパク質と、より強く相互作用するようである。ECM結合部位は、バイオマトリックスがグルタルアルデヒドで架橋されてしまっても、移植された細胞によって認識され細胞接着に利用される。生合成材料の場合には、組織工学処理した生物学的な界面が生体環境に提示され、合成した構成部分は、内部骨格構造のみであり、それは、生体構造物とは接触しない。
【0025】
当該材料の特性は、実用に応じた範囲で、処理時間、グルタルアルデヒド濃度及びpHのパラメーターを変更することによって、特定の用途又は特定の材料に応じた変更が可能である。例えば、実験室で創成された自己組織の場合には、グルタルアルデヒドは、最適の濃度で、組織の増殖を阻止するのに利用されるが、非自己組織においては、グルタルアルデヒドは、材料を非免疫性にする。柔軟性、弾性及び耐久性の程度は、動的プロセスの程度及び強度によって変えることができる。
【0026】
かくして、本発明の好適な実施態様による、自己、同種又は異種の組織(例えば、外科手術用の管状、平らなシート及び三次元構造における、組織工学処理した生合成材料及び生体材料及び天然に存在する生体材料)によって体内移植材料を創成する方法においては、最初に、過剰の組織が、組織の外面から除去される。
【0027】
次いで、組織は、型上で組織の動きが制限されないような、圧縮性の型につなぎ止められる。管状組織の場合には、組織は、固定されずに圧縮可能なマンドレルに搭載される。
【0028】
搭載された組織は、10から20rpmの間で、好ましくは12rpmで回転するドラム中に、又はおよそ25℃の循環槽中に置かれる。循環槽中に置かれる場合は、管状組織は、例えば液体が1分当たりおよそ300mlで管腔を通過して流れるような、流系に置かれる。
【0029】
グルタルアルデヒドの形態の架橋剤は、ドラム又は槽に加えられ、その濃度は0%から予め決められた最大2.5%(重量/体積)まで徐々に増加され、溶液のpHは1.5から7.4まで、2.5時間にわたって徐々に増加される。
【0030】
グルタルアルデヒド溶液が予め決められた最終濃度及びpHに達すると、組織は回転ドラムから除かれ、2.5%(重量/体積)の濃度、pH7.4及び温度25℃に保たれた、グルタルアルデヒドの新鮮溶液の回転槽に置かれる。これに代え、組織が循環槽に既にある場合は、溶液を上記のように新しくし、組織が流系に置かれている場合は、流系を除去して、溶液を上記のように置き換える。組織は循環槽におよそ48時間保持される。組織は、次いで、2%(重量/体積)の過酸化水素に1時間浸漬される。
【0031】
次いで、組織(又は、ここでは、移植材料)は、1%(重量/体積)グルタルアルデヒド溶液及び50%(体積/体積)エタノール中で18時間未満の時間で化学的に滅菌される。代わりに、15乃至30キログレイ、好ましくは25キログレイのガンマ線照射により滅菌することもできる。
【0032】
所望により、組織は、滅菌前に5%(重量/体積)のグリシンで、2乃至24時間、好ましくは12時間インキュベートされる。
【0033】
最後に、組織は、50%(体積/体積)のエタノール中で最低3週間、好ましくは3ヶ月間貯蔵される。
【実施例】
【0034】
本発明をより明白に確認するために、好ましい実施態様について、付属する図面を参照しながら実施例により説明する。
【0035】
(実施例1)
本発明の実施態様による組織を処理する方法を、以下のようにして、血管の人工器官として使用するためのウシ尿管に応用した。
【0036】
ウシ尿管は、衛生的条件下で採取され、実験室に4℃で搬送された。生理食塩水を尿管の骨盤端を経由して送った。遠位又は膀胱端は、一時的に閉塞され、管腔内の生理食塩水の圧を115mmHgに増加した。中間点での尿管の直径を記録した。尿管より少し小さい直径を有する、先端を丸くしたスチール製導入器に搭載された圧縮可能なシリコーン製マンドレルを、加圧した尿管に非外傷的に挿入した。尿管は、一端をシリコーンに固定され、シリコーンに沿って多少動けるようにした。装着された尿管は、12rpm、21℃の温度の回転ドラム内に置かれた。グルタルアルデヒドの濃度を、0から予め決められた濃度の2.5%(重量/体積)に徐々に増加し、溶液のpHを、3時間にわたってリン酸バッファを添加して1.5から5.9に上昇した。グルタルアルデヒド溶液が予め決められた濃度及びpHに達したら、尿管を回転ドラムから取り出し、2.5%(重量/体積)のグルタルアルデヒドの循環槽に、pH7.4で24時間置いた。
【0037】
材料をグルタルアルデヒドから取り出し、緩衝食塩水で軽く洗い流し、50%(体積/体積)のエタノール中に置いた。圧縮可能なマンドレルを取り除き、材料に欠損がないことを圧力試験で確認した。
【0038】
得られた材料を、1%グルタルアルデヒドの50%(体積/体積)エタノール溶液中で、18時間以上浸すことにより化学的に滅菌し、その材料を50%(体積/体積)エタノールの滅菌溶液で洗い流し、最低3週間50%(体積/体積)エタノール中に貯蔵した。
【0039】
(実施例2)
石灰化のインビボ阻害を、グレーハウンド犬で以下のように評価した。
上記した当該実施態様によって、ウシ尿管から調製した内径6mmで長さ10cm以上の移植片を、結紮された基部の吻合部に対して遠位の大動脈で大動脈腸骨動脈の位置に移植した。
内径4mmで、長さ6cm以上の移植片を、大腿中間部移植片として移植した。
【0040】
抗凝固療法又は抗血小板療法は、使用しなかった。
【0041】
開存性を実証し、動脈瘤、拡張又は狭窄を検出するために、定期的な血管造影を予め決められた間隔で行った。動物を、予め決められた間隔で、或いは移植片の閉鎖又は動物の苦痛時に殺処分した。最後に、外植片の肉眼的及び顕微鏡的検査を行った。
【0042】
本発明により処理した移植材料の開存性、壁の完全さ及び管腔の完全さを米国特許第4,466,139号のそれらと比較したところ、何れも欠陥は認められなかった。しかしながら、顕微鏡的に検査すると、本実施態様の方法によって処理され、1乃至18ヶ月において外植した13の人工器官では、石灰化は認められなかった。図1は、本発明の好ましい実施態様の方法により処置し、ネコモデルに、代用血管として127日間体内移植した、ウシ尿管のヘマトキシリン−エオシン染色(H&E)の顕微鏡写真である。移植片の壁には、外植片では微小石灰化が認められない。示した図では、流動表面FSは右側である。
【0043】
比較として、同じ時間の期間に、米国特許第4,466,139号の方法により処理した25の人工器官では、11例(即ち、44%)人工器官が、吻合部位に初発的に壁内に微小石灰化の領域を有していた。図2は、米国特許第4,466,139号に従って処理したウシ尿管で、代用血管としてネコモデルにおいて90日間体内移植したもののヘマトキシリン−エオシン染色の顕微鏡写真である。外移植片で、微小石灰化(Ca)の領域は、遠位吻合において壁に実証されている。移植片は、外植片において開存していた。示した図では、流動表面(FS)は右側である。
【0044】
(実施例3)
処理したウシ尿管の表面に移植したヒト伏在静脈内皮細胞の付着と接着を以下のように評価した。
【0045】
ヒト伏在静脈内皮細胞を、文献記載の又は改良した技術を用いて単離し、育種し、播種した。ヒト伏在静脈内皮細胞は、手術室から得た反転静脈瘤ヒト伏在静脈から単離し、アンピシリン(100μg/ml)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、アンホテリシンB(2.5μg/ml)、L−グルタミン(2.5mM)及び重炭酸ナトリウム(0.23%)を含有する冷却ハンクス均衝塩溶液(HBSS、Sigma Australia社)に入れて、実験室に輸送された。静脈の端は外科用絹糸で結紮した。改良酵素育種技術を利用し、静脈を2mg/mlコラゲナーゼ(WorthingtonタイプIV、Sigma社)10mlに、10分間、37℃にて浸漬し、次いで自動速度で1分間、10秒間隔でボルテックス処理した。集めた細胞懸濁液は、800gで、5分間、4℃で遠心分離し、得られた細胞ペレットを、加熱不活化ウシ胎仔血清又はウシ血清(FCS、CSL Australia社)、ヘパリン(50μg/ml、Sigma Australia社)及び内皮細胞補助剤(Sigma Australia社)を含有するM199(Sigma Australia社)に再懸濁した。次いで、細胞をゼラチンで被覆した直径10cmのペトリ皿に播種し、5%CO2、95%空気加湿インキュベーター(NuAire社、U.S.A.)内で37℃にてインキュベートした。細胞は、集密するまで増殖させ3回継代した。
【0046】
内皮細胞は、0.25%トリプシン/0.2%EDTA(Sigma Australia社)含有トリプシンを用いて1分間、組織培養皿から分離した。トリプシンの活性を20%FCS及びM199で不活化し、細胞懸濁液を4℃、800gで、5分遠心分離した。細胞ペレットは、細胞濃度1×106細胞/mlまで培地に再懸濁した。
【0047】
内径4mm、長さ10cm以上の導管を、細胞溶液で満たし、37℃のインキュベーターで1時間回転した(16回転/時間)。播種後、導管を5%CO2下、37℃でインキュベートした。導管試料(1cm)は、細胞被覆率及び細胞密度を評価するために、インキュベーション0、24、48及び72時間後に取り出した。
【0048】
ヒト伏在静脈内皮細胞を播種された導管は、72時間インキュベーション後、50%を超える融合性被覆を有していた。導管は、480ml/分の流速で、媒体のインビトロ流に付与され、平行した流出ラインに接続した3つの播種された導管に、1時間の間、血液モニターポンプ(GambroBMM10−1/3)からなるインビトロ流系によって、剪断応力11.4ダイン/cm2が加えられた。
【0049】
流動前及び後の内皮細胞の被覆は、抗CD31抗体(PECAM)で細胞を標識した後に定量された。標識細胞は、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸−ニトロブルーテトラゾリウム(BCIP/NBT)色素体(Dako Australia社)を用いた、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン/ビオチン系で検出した。
【0050】
(結果)
内皮細胞の集密単層は、尿路上皮細胞からなるバイオマトリックス表面に緊密に接着しており、11.4ダイン/cm2のインビトロ剪断応力で接着したままであった。図3は、BCIP/NBTクロマゲンを用いた、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン/ビオチン系で検出した抗CD31標識細胞の顕微鏡写真である。図3は、11.4ダイン/cm2のインビトロ剪断応力をかけて1時間後の、本発明の実施態様に従って処理したウシ尿管の流通表面に付着した、ヒト伏在静脈内皮細胞(EC)の単層を示す。この図では、粘膜固有層はLPで、尿路表皮はUROで表示されている。
【0051】
このように、本実施態様の方法は、損傷した、疾病にかかった、又は欠損した組織、構造又は器官を置換又は増強するために、ヒト又は哺乳動物用の体内移植材料を創成するための、自己、同種又は異種の組織に応用することができる。本方法は、特定用途の移植片用の生体組織又は生合成組織に必要とされる特性を与えるために、調節することができる。得られる材料は、心臓血管環境、例えば、小血管環状又は末梢バイパス移植、人工組織心臓弁又は組織の内方伸展、即ちインステント狭窄を防止するための、ステントバイオバリアーに内部移植することができる。処理した材料の非多孔性及び組織不透過性の性状は、小直径の合成バイパス移植片における障害の主要原因の一つである、壁を通して組織の内部への伸展及び血管新生を阻害する。材料は、例えば、人工皮膚、ヘルニア修復パッチ又は人工靱帯のような非心臓血管環境にも体内移植することができる。材料の機能は、体内移植の前に、生細胞を加えることによって、更に増強することができる。例えば、小血管置換の流通表面に内皮細胞を添加すると、血液凝固を防止する抗凝固機能を付与することができる。
【0052】
当業者には明らかなように、本発明に対して改良を加えることができる。これら及びその他の改良は、本発明の範囲、及び上記の記載及び図面から明らかにされるであろう性質から離れることなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1】図1は、本発明の好ましい実施態様の方法により処理したウシ尿管であり、代用血管としてネコモデルにおいて127日体内移植したものの、ヘマトキシリン−エオシン染色(H&E)の顕微鏡写真である。
【図2】図2は、米国特許第4,466,139号の方法により処理したウシ尿管であり、代用血管としてネコモデルにおいて90日体内移植したものの、ヘマトキシリン−エオシン染色の顕微鏡写真である。
【図3】図3は、好ましい実施態様の方法により処理したウシ尿管の、流動面に接した単層抗CD31標識ヒト伏在静脈内皮細胞の顕微鏡写真である。
Claims (36)
- 哺乳動物の自己、同種又は異種の組織から、移植材料を創成する方法であって、
該組織が、20重量%乃至80重量%の間のコラーゲンを含み;
該方法が、該組織を架橋剤で30分乃至6時間の間処理し;該処理時間の間、該架橋剤濃度を、0%〜0.25%(重量/体積)の初期濃度から0.5%〜5%(重量/体積)の最終濃度まで変化させ;更に、該処理時間の間、pHを、1〜3の初期pHから5〜8の最終pHまで変化させる;
ことを包含する方法。 - 該組織が、およそ40重量%のコラーゲンを含むものである請求項1に記載の方法。
- 該処理時間が、およそ2.5時間である請求項1又は2のいずれかに記載の方法。
- 該架橋剤濃度及び該pHを、該処理時間の間、次第に増加させることを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該初期濃度が、およそ0%である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該最終濃度が、およそ2.5%(重量/体積)である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該初期pHが、およそ1.5である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該最終pHが、およそ7.4である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織が、自己、同種又は異種の材料である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織が、ヒト、ヒツジ、ウシ及びブタの何れかの由来である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織が、組織工学処理した生体材料、代理動物における耐久性又は分解性の骨格(scaffold)について組織工学処理された材料、又は実験室で組織培養系によって組織工学処理された材料である、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織が、天然に存在する生体材料である、請求項1乃至10のいずれか一つに記載の方法。
- 該架橋剤が、グルタルアルデヒドである、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該材料を、循環液槽又は回転ドラム中で処理することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該材料が、尿細管状であり;
該方法が、該材料を循環液体槽又は回転ドラム中で処理し、該材料を、液体が該材料の管腔を1分間当たり200〜400mlの速度で流れるような流系に付与する;
ことを包含する、請求項1乃至13のいずれか一つに記載の方法。 - 液体が、該材料の管腔を1分間当たりおよそ300mlの速度で流れる、請求項15に記載の方法。
- 該処理時間の後に、更に、該組織を架橋剤で、0.5%〜5%(重量/体積)の濃度及び5〜8のpHで、20℃〜27℃の温度で、1時間〜5日間処理することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該処理時間の後に、およそ2.5%(重量/体積)の濃度で、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項17に記載の方法。
- 該処理時間の後に、およそ7.4のpHで、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項17又は18に記載の方法。
- 該処理時間の後に、およそ25℃の温度で、該組織を架橋剤で処理することを包含する、請求項17乃至19に記載の方法。
- 該更なる処理時間が、およそ48時間である、請求項17乃至20に記載の方法。
- 該組織及び架橋剤溶液を、20℃から27℃の温度で保持することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織及び架橋剤溶液を、およそ25℃の温度で保持することを包含する、請求項26に記載の方法。
- 該組織の形状を、圧縮可能な型によって処理する間保持することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該材料が動き得るように、該組織が該型上に固定されていないか、又は一端のみが固定されている、請求項24に記載の方法。
- 該組織が架橋された後、該組織を滅菌することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織を、滅菌する前に、およそ2%(重量/体積)の過酸化水素で30分乃至1.5時間の間液浸することを包含する、請求項26に記載の方法。
- 該組織を、滅菌する前に、およそ2%(重量/体積)の過酸化水素中に、およそ1時間浸すことを包含する、請求項27に記載の方法。
- 該組織を、化学的に滅菌することを包含する、請求項26乃至28のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織を、15乃至30キログレイのガンマ線照射によって滅菌することを包含する、請求項26乃至28のいずれか一つに記載の方法。
- 該組織を、25キログレイのガンマ線照射によって滅菌することを包含する、請求項30に記載の方法。
- 該組織を、ガンマ線照射によって滅菌する前に、2乃至24時間、5%(重量/体積)のグリシンでインキュベートすることを包含する、請求項30又は31のいずれかに記載の方法。
- 該組織を、ガンマ線照射によって滅菌する前に、およそ12時間、5%(重量/体積)のグリシンでインキュベートすることを包含する、請求項32に記載の方法。
- 該材料を、移植する前に、最低限3週間、50%(体積/体積)のエタノール中に保存することを包含する、前記請求項のいずれか一つに記載の方法。
- 該材料を、移植する前に、少なくとも3ヶ月間、50%(体積/体積)のエタノール中に保存することを包含する、請求項34に記載の方法。
- 請求項1乃至35のいずれか一つの方法によって創成される移植材料。
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