JP2004532405A - 光学的断層撮影法を使用して流動流中の微小対象物を画像化するための装置と方法 - Google Patents
光学的断層撮影法を使用して流動流中の微小対象物を画像化するための装置と方法 Download PDFInfo
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Abstract
フロー・サイトメータ、および少なくとも１つの再構成用シリンダがキャピラリ・チューブ（２）の周りに配置される。対象物もしくは細胞（１）の開始点に関する第１のトリガ・ポイント（２８）、および細胞（１）の終結点に関する第２のトリガ・ポイント（２９）を供給するように、フォトン供給源（２５）およびフォトン・センサ（２６）がパルス波高分析器（２７）と一緒になって作用する。トリガ信号（２８、２９）は再構成用シリンダ（２０）によって受け取られる。再構成用シリンダ（２０）は、選択可能な発光波長を有し、キャピラリ・チューブの軸（９）に対して直角でかつ同軸のシリンダの周囲である幾何学パターンに配置された光学的点光源（２１）を含み、それが流れる細胞（１）の透過され、減衰された投影画像の入手を容易にする。センサ（２３）はまた、核および／または細胞質の構造体または細胞膜に結びついたタグ付き分子プローブから発射される蛍光の投影を収集する。それらの投影はアルゴリズムによって処理されて細胞（１）およびそれらの疾病状態に関する三次元情報を供給する。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、点光源投影幾何学を使用する三次元光学的断層撮影法に関し、より詳細には、光学的断層撮影法を使用して流動流中の微生物細胞を含む微細な対象物を画像化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年３月２８日に出願したＡｌａｎ Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎの「ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＭＡＬＬ ＯＢＪＥＣＴＳ ＩＮ Ａ ＦＬＯＷ ＳＴＲＥＡＭ ＵＳＩＮＧ ＯＰＴＩＣＡＬ ＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹ」というタイトルで番号６０／２７９２４４の同時係属中の仮出願に関連するものであり、この参考資料によって、同時係属仮出願の出願日付で優先権を主張する。
【０００３】
抗体プローブおよび核酸ハイブリッド形成用プローブといった分子プローブの出現により、生物細胞および組織内でこれらの分子プローブをタグとして、その後にそれらの所在部位と濃度を測定することによって新たな疾病に関する疑問点に対処することが可能である。これらのプローブをより正確に局所化および定量化する必要性が生じるにつれて、それに伴って、二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）で顕微鏡によりプローブ密度を測定するための改良された技術が求められている。スライド・グラス上に乗せた細胞を使用する従来の光学顕微鏡法は、焦点面深度、サンプリング角度、および通常は画像面内で細胞のオーバーラップを引き起こす細胞調製に伴う諸問題が理由で、２Ｄおよび３Ｄで近似させることが可能なだけである。光学顕微鏡法の別の欠点は、対物レンズを通して観察することの固有の限界であって、分析のための正確なデータは焦点面内の領域で得られるだけである。
【０００４】
フロー・サイトメトリ法は、概して、流体流中で細胞を１つずつ流すことによって細胞のオーバーラップの問題を克服する。残念なことに、フロー・サイトメトリ・システムが従来の光学顕微鏡法と同じ品質の細胞画像を生成することはなく、かついずれのケースでも画像は三次元的ではない。背景として、Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５年を当業者に推奨する。
【０００５】
コンピュータ支援の断層撮影法の領域では、１９９５年３月２８日にＪｏｈｎｓｏｎらに発行された「Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ」というタイトルの米国特許第５，４０２，４６０は、Ｘ線発生器および標本を通るＸ線ビームの減衰を測定するＸ線検出器を使用して標本の高解像度三次元画像を発生するための微細断層撮影システムを開示している。Ｊｏｈｎｓｏｎらの微細断層撮影システムでは、標本の各景色について、各々が異なるエネルギーのＸ線を使用する２つの投影がなされる。標本のある景色の２つの投影がなされた後、標本は標本ホルダ上で回転され、別のセットの投影がなされる。標本の各景色の投影は集められて分析され、標本を含む材料の相画分の定量的表示が供給される。標本の三次元画像を供給するためにさまざまな景色の投影が組み合わされる。ここでは米国特許第５，４０２，４６０号を参考資料で取り入れている。米国特許第５，４０２，４６０号によって教示されるようなＸ線技術はいくつかの用途には有用であるが、それはフロー・サイトメトリ法にとって有用な最適の解決策を提供するものではない。
【特許文献１】
米国特許第５，４０２，４６０号
【特許文献２】
米国特許第６，２０１，６２８号
【非特許文献１】
Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５年
【非特許文献２】
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６巻、１０５〜１７頁、１９７２年
【非特許文献３】
Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＢＥの「Ｍｏｒｅ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＮＳ−２１巻、７２〜７頁、１９７４年
【非特許文献４】
Ｓｉｎｇｅｒ，ＪＲ、Ｇｒｕｎｂａｕｍ，ＦＡ、Ｋｏｈｎ，Ｐ、およびＺｕｂｅｌｌｉ，ＪＰの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｏｆ Ｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９５８）、９９０〜３頁、１９９０年
【非特許文献５】
Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＫとＹａｇｅ，Ｒの「Ｒａｐｉｄ ３−Ｄ Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ） Ｕｓｉｎｇ ２−Ｄ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｈａｒｄｗａｒｅ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ １９（１２）巻、１２２７〜３７頁、２００１年
【非特許文献６】
Ｂｅｌｌｍａｎ，ＳＨ、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ、およびＲｏｗｅ，ＪＥの「ＡＲＴ ｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｂｅｉｎｇ Ａ Ｄｅｆｅｎｃｅ ｏｆ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２巻、２０５〜１６頁、１９７１年
【非特許文献７】
Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｊａｓｚｃａｋ，ＲＪ、およびＦｌｏｙｄ，ＣＥの「Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４巻（１２）、１９４７〜５７頁、１９８９年、＃１３８２
【非特許文献８】
Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｇａｇｎｅ，ＧＭ、Ｋｒｏｌ Ａ、Ｔｈｏｍａｓ，ＦＤ、およびＮａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒの「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＣＴ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻（７）、１２２５〜４１頁、１９９５年、＃４３８９
【非特許文献９】
Ｂｌａｓｓ，Ｍが編集長を務めた「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ」、第２版、第４巻、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年
【非特許文献１０】
Ｋａｋ，ＡＣとＳｌａｎｅｙ，Ｍの「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ」、ＩＥＥＥ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年
【非特許文献１１】
Ｈｅｒｍａｎ，Ｇの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０年
【非特許文献１２】
Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＪｉａｎｇ，Ｈの「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｆｉｎｉｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２２巻（６９１〜７０１頁）１９９５年
【非特許文献１３】
Ｈａｍｐｅｌ，ＵとＦｒｅｙｅｒ，Ｒの「Ｆａｓｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉａｌｌｙ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（１）、９２〜１０１頁、１９９８年
【非特許文献１４】
Ｊｉａｎｇ，Ｈ，Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＯｓｔｅｒｂｅｒｇ，ＵＬの「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ Ｐｈａｎｔｏｍｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（２）、１８３〜９３頁、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのようなシステムで見受けられる前述の制限その他を克服するために、フロー・サイトメトリ法の１つずつの細胞提供と複数点光源から得られるコンピュータ利用による光学的断層撮影法を組み合わせることで複数の投影から２Ｄおよび３Ｄの細胞の光学密度情報を再構成することが本発明の動機である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、光学的点光源の投影と断層撮影による画像再構成を使用して流動流中の微小対象物を画像化するための装置と方法を提供する。流動性光学断層撮影（ＦＯＴ）システムは、図１に示したようなフロー・サイトメータ、および図４に示したようなキャピラリ・チューブ２の周囲に配置された再構成用シリンダを有する。フォトンの供給源２５とフォトン・センサ２６はパルス波高分析器２７と共に作用することでトリガ装置として動作する。パルス波高分析器２７は、知られている原理に従って、細胞の開始点に関する第１のトリガ・ポイント２８および細胞の終結点に関する第２のトリガ・ポイント２９を供給するように動作する。パルス波高分析器２７は各々の細胞の開始点と終結点に相当するトリガ信号３０を出力し、そのトリガ信号は再構成用シリンダ２０によって受け取られる。再構成用シリンダから得られる信号は直接的に分析されることも可能であり、あるいはコンピュータ利用の断層撮影画像再構成技術を使用して処理されることで細胞の二次元もしくは三次元情報を供給することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ここで生物細胞に関連する特定の範例でもって本発明を説明するが、しかしながらこれらの範例が本発明の原理を具体的に示す目的のためのものであり、本発明がそのように限定されるものでないことは理解されるであろう。ある範例では、微細容積内で点密度と発光強度の三次元分布を作成することが微細容積内のいかなる場所でも密度と蛍光の測定を許容し、対象となる構造、分子もしくは分子プローブの所在を決定する。タグを付けた分子プローブを使用することによって、微細対象物の特異的構造に付着するプローブの量を測定することができる。具体的に示すことを目的とすると、生物細胞のような対象物がタグを付けた少なくとも１つの分子プローブでラベルされ、このプローブの測定量および所在部位が、限定はされないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌および卵巣癌を含む細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらす可能性がある。
【０００９】
フロー・サイトメトリ用に調製され、特異的疾病診断のためにタグを付けた分子プローブで染色されるかもしくはラベルされた生物細胞がシリンダ状の装置を通過して流され、それが投影画像を供給して、かつ細胞の流動ベクトルに対してほぼ直角の光学投影線経路から２Ｄおよび３Ｄの密度情報の再構成を可能にする。軸に沿って流れる細胞の速度を制御することによって、直交する再構成二次元平面が細胞全体の３Ｄ像を作成するように細胞の軸に沿って正確に配置（もしくは積層）されるか、あるいは細胞の３Ｄ画像が２Ｄの光学透過もしくは発光投影から直接的に算出されることが可能となる。
【００１０】
フロー・サイトメトリ法は以下の特徴が理由で画像再構成に高度に適合している。
・細胞のオーバーラップおよび不鮮明化が最小限となるように細胞がキャピラリ・チューブを通って単一縦列で流れ、
・キャピラリ・チューブを通って流れる細胞の速度が直接的に測定可能であり、かつ一定であり、
・キャピラリ・チューブの中心軸を細胞が流れ、構造的に放射形対称となる傾向があり、および、
・細胞の固定化および懸濁調製に応じて、細胞は可塑性を保つこと、およびキャピラリ・チューブ内で速度勾配に応答してｚ軸に沿って長く延びた形状をとることが可能である。
本発明は点光源投影による画像化と断層撮影による画像再構成をシステムに供給するために前述の特徴の恩恵を得る。
【００１１】
ここで図１を参照すると、本発明の実施形態によって考慮されるフロー・サイトメトリ・システムの範例となる具体例が概略で示されている。このシステムはｘ、ｙおよびｚ方向に座標を有する座標系１１に関して配向される。動作では、知られている注入装置４を使用して細胞１が注入チューブ３に注入される。キャピラリ・チューブは注入端部５で広がっており、圧力キャップ６を有する。キャピラリ・チューブ２内で層流を生じさせるためにシース流体７がチューブ８に導入される。溶液中に調製および懸濁された細胞１が、それらが流れの軸と共に細長く延びてかつ破線９で表わしたようにキャピラリ・チューブのほぼ中心軸を下方向移動するようにキャピラリ・チューブ２を通って押し進められ得ることが従来のフロー・サイトメトリ法の特徴である。細胞は、軸対称かつ一定の速度１０でシリンダ状キャピラリ・チューブの中心軸に沿って単一縦列で流れるようにされることが好都合である。
【００１２】
ここで図２を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される単一細胞のための流動ステップの範例となる具体例が概略で示されている。細胞１は速度ベクトル１０で表わされる一定の速度（Ｖ）で、キャピラリ・チューブ２を通って移動する。細胞１は細胞質の壁１２と細胞核の壁１３を有する。キャピラリ・チューブ２を通って流れる過程で、具体的例示の目的で第１、第２および第３の再構成平面１４ａ、１４ｂおよび１４ｃとしてそれぞれ表わされる複数の再構成平面を細胞１が通過する。細胞質の壁を通る第１の平面状スライス１５ａは再構成平面１４ａ内に位置する。同様に、細胞質の壁と細胞核の壁を通る第２の平面状スライス１５ｂは第２の再構成平面１４ｂ内に位置し、第３の平面状スライス１５ｃは第３の再構成平面１４ｃ内に位置する。本発明の中心的な特徴は、波長選択可能ないくつかの光学的点光源がキャピラリ・チューブの周囲および同軸に配置されることである。光学的点光源は反対側にあって光スペクトルの選択可能部分に感受性のある光学センサ・アレイと共に動作し、その結果、細胞を透過する光の投影を捕捉することが可能となる。得られた投影画像は直接的に分析されることも可能であり、あるいは断層撮影画像再構成アルゴリズムを使用して処理されることで細胞内の密度および／または発光強度の分布のマップもしくは画像を供給することも可能である。実用では、再構成平面の数が、システムに供される対象物の必要な画像解像度に応じて数枚から数百枚またはそれ以上まで変えられる可能性があることは理解されるであろう。再構成された平行する平面状スライス画像のグループは、細胞内の密度および発光強度の三次元（３Ｄ）画像を作り出すために、ソフトウェア内で組み合わせもしくは積層されることが可能である。付け加えると、線形（１Ｄ）の代わりに平面（２Ｄ）の光センサ・アレイ、および扇形の代わりに円錐形の照射線パターンを使用することによって、流動細胞を通る複数の隣接する平面状スライスの投影が同時に得られる可能性がある。結果として、細胞容積内の密度と発光強度の分布の三次元（３Ｄ）画像は円錐形ビーム再構成アルゴリズムを使用して二次元（２Ｄ）投影から直接的に算出されることが可能となる。場合によっては、無限の視野深度を有する２Ｄ点光源投影画像が直接的に分析されることも可能である。
【００１３】
生物細胞のケースでは、再構成平面間の距離（ｄ）は数ミクロンもしくはそれ未満であってもよい。細胞１内のある点は各再構成平面で、時間的間隔を置いて合致し、ここで時間的間隔（ｔ）は関係式、
ｔ＝ｄ÷Ｖ （式１）
によって述べることが可能である。
【００１４】
ここで図３Ａと３Ｂを関連させて参照すると、本発明の実施形態によって考慮される再構成の断面１６の範例が概略で示されている。細胞を通る光学投影から細胞内の点密度を再構成するステップは流れる細胞の軸対称性と中心性から恩恵を受ける。付け加えると、投影によってサンプリングされる空間は次の３つの別々の区分、すなわち、
１．細胞の外側の流体１７（すなわちシース流体もしくは細胞懸濁媒質）
２．細胞質１８、および
３．細胞核１９
から構成されるようにモデル化することができる。
【００１５】
これら３つの区分内の光学密度もしくは分子プローブの分布を知ることは細胞生物学および疾病診断の多くの重要な諸問題を解決するのに充分である。付け加えると、もしも細胞質のもしくは細胞の壁１２と核の壁１３を含む２つの境界面にある分子プローブが優先的に結合するならば、それら表面を算出することが有用になる可能性がある。そうでない場合、これらの壁を３つの異なる区分間の遷移表面として特徴付けることで充分である可能性がある。
【００１６】
細胞の再構成スライスを組み合わせることによって、または螺旋状の容積測定方式で再構成することによって、３Ｄ形態と容積の情報を生じることが可能であるが、しかし絶対的（相対的の反対）な容積は細胞の場所の正確な情報によって決まる。細胞の場所は流速の関数である。しかしながら、いくつかの例では、密度もしくは分子プローブの相対的濃度が次の診断上の疑問を解決するのに充分である。すなわち、核に対して細胞質中にどれだけのプローブが存在するか、それに対してバックグラウンド流体中の非結合プローブはどうか。あるいは主にプローブは細胞膜上に存在するのか、または核の膜表面に存在するのか。
【００１７】
キャピラリ・チューブを通過する細胞は構造的に放射対称形になる可能性があるが、少なくとも１つの結合分子プローブの核および細胞質区分内の分布はそのような対称性を帯びない可能性がある。したがって、結合した蛍光発光分子プローブの量を上述の３つの区分の分析を供給するのに必要となるよりもさらに微細な尺度で場所を特定するのに充分な空間的解像度を提供することが画像化システムおよび（特に発光の）再構成アルゴリズムにとって望ましい。さらに、２つの細胞内区分内に非対称に分布したプローブの濃度に関する定量的情報をシステムが供給することも望ましい。プローブの、特定の亜細胞区分、細胞質もしくは核内の構造体もしくは細胞内小器官との連関はミクロン以下の空間的解像度によって容易になる。
【００１８】
さらに特定の範例は、危険な状態の患者で癌を早期発見することに関する。そのようなケースでは、細胞が形質転換するときにある遺伝子がそれらの機能を過剰もしくは過少に発現する可能性がある。診断上、バックグラウンドの懸濁流体中の非結合プローブに関して正規化をする一方で細胞質内の遺伝子産物（しばしばタンパク質）の相対的過剰もしくは過少発現を核との関連で測定することが重要である。もしも遺伝子産物がタンパク質である場合、遺伝子産物のタンパク質の場所の特定および／または定量化によって細胞の疾病状態を評価するのにタグを付けた抗体プローブを使用することが可能である。したがって、これを疾病状態を決定するのに３つの区分の分析は充分である。
【００１９】
ここで図４を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される、流動細胞１を含む流管２を取り巻く再構成用シリンダの範例が概略で示されている。再構成用シリンダ２０は、たとえば、ピッチ角度θで所定の螺旋ピッチで配置された点光源の螺旋２４を有する。各々の点光源２１はフォトンのビーム２２を発生し、ここで通常、フォトン・ビーム２２は円錐形もしくは扇形の形状にされる。図４の範例に描かれた光源の配列は螺旋であるが、部分的には電子装置の速度、細胞の速度およびセンサ部（検出器部）でオーバーラップのない投影信号を確立する幾何学形状に応じて、点光源アレイは広範な種類の幾何学パターンをとる可能性がある。感知素子２３は点光源から光を受けるように配置される。
【００２０】
チューブの円周の周りに装着された対面する検出器群２３と共に、固定型光学点光源２１は細胞１全体を通る多数の投影角度を、それが流れて光源を過ぎるときにサンプリングすることができる。光源、および減衰されて透過および／または散乱および／または発射される光の発光もしくは読み取り、または両方を時間調整することによって、各々の検出信号は、流れる細胞のｚ方向の軸に沿った特定の知られている位置で一致するであろう。この方式で、同期する様式で発光させられるかもしくは検出される光源に直交する判っている軸に沿って判っている速度で流れる細胞１は、細胞を通る投影で光学的に切片化されることが可能であり、それらはｘ−ｙ平面で２Ｄスライスを形成するように再構成されることが可能である。列になったスライスを積層または数学的に組み合わせることによって、細胞の３Ｄ像が浮かび上がるであろう。細胞の動きを流動の軸の周りの光源（もしくは複数光源）の位置決めと組み合わせることで、たとえば細胞の３Ｄ像を作成するための螺旋方式で再構成されることの可能なデータを生じることもやはり可能である。再構成は、扇形ビーム再構成アルゴリズムを使用して線形（１Ｄ）投影から再構成された隣接する平面画像を積層することによるか、または円錐形ビーム再構成アルゴリズムを使用して平面（２Ｄ）から直接的に行うかのいずれかでなされることが可能である。細胞の３Ｄ像は亜細胞構造体の定量的測定値、および診断情報を提供するタグ付き分子プローブの量をもたらすことが可能である。
【００２１】
記述したように、細胞切片を通る複数の投影は切片または容積内で２Ｄまたは３Ｄの密度構造を再構成するように要求される。従来のスライスごとのＸ線コンピュータ利用断層撮影法では、患者を通る多数の投影角度を生じるためにＸ線源とそれに対面する検出器が外周に沿って移動する間、人間の患者を不動に保つことによって多数投影がなされる。類推によって、本発明の流動性光学断層撮影システムはキャピラリ・チューブの外周に沿って異なる角度で配置された多数光源を過ぎて細胞を所定の速度（Ｖ）で移動させ、それにより、細胞が流れて点光源を過ぎるときに細胞を通る多数の投影を生じさせる。これらの点光源は、細胞を通過して光源の反対側のセンサのアレイによって検出されるフォトンを発射する。点光源は、細胞内の各々の点が点光源のアレイを通り過ぎるときに多数の角度からサンプリングされるように、キャピラリ・チューブの円周上で螺旋２４に沿って、あるいは他の適切な幾何学パターンで配置される可能性がある。良好なサンプリング幾何学形状に関すると、これらの点光源が円周の少なくとも１８０度をカバーすることも可能性がある。いくつかの例ではさらに少ない角度カバレージ（すなわちサンプリング下の角度）が実現可能であり、それに対して追加的な半径方向のカバレージはコンピュータ利用の再構成の精度および信号対ノイズ比を改善するであろう。幾何学形状に応じて、円錐形ビームもしくは扇形ビームの画像再構成に従来の解析、反復または統計学的アルゴリズムを適用することが好都合になる可能性がある。（たとえば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６巻、１０５〜１７頁、１９７２年、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＢＥの「Ｍｏｒｅ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＮＳ−２１巻、７２〜７頁、１９７４年、Ｓｉｎｇｅｒ，ＪＲ、Ｇｒｕｎｂａｕｍ，ＦＡ、Ｋｏｈｎ，Ｐ、およびＺｕｂｅｌｌｉ，ＪＰの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｏｆ Ｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９５８）、９９０〜３頁、１９９０年、Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＫとＹａｇｅ，Ｒの「Ｒａｐｉｄ ３−Ｄ Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ）Ｕｓｉｎｇ ２−Ｄ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｈａｒｄｗａｒｅ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ １９巻（１２）、１２２７〜３７頁、２００１年参照」。）限定はされないが関連する方法には、ＡＲＴ（Ｂｅｌｌｍａｎ，ＳＨ、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ、およびＲｏｗｅ，ＪＥの「ＡＲＴ ｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｂｅｉｎｇ Ａ Ｄｅｆｅｎｃｅ ｏｆ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２巻、２０５〜１６頁、１９７１年で検討されているような代数的再構成技術）、ＳＩＲＴ（たとえばＧｉｌｂｅｒｔ、同、＃１４９３によって検討されているような同時反復再構成技術）、ＭＬ−ＥＭ（たとえばＭａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｊａｓｚｃａｋ，ＲＪ、およびＦｌｏｙｄ，ＣＥの「Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４巻（１２）、１９４７〜５７頁、１９８９年、＃１３８２で検討されているような最尤期待値最大化法）、およびＯＳＥＭ（たとえばＭａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｇａｇｎｅ，ＧＭ、Ｋｒｏｌ Ａ、Ｔｈｏｍａｓ，ＦＤ、およびＮａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒの「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＣＴ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻（７）、１２２５〜４１頁、１９９５年、＃４３８９で検討されているような順序部分集合期待値最大化法）が含まれる。
【００２２】
方法：
フロー・サイトメータ
ここで図５を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される流動性光学断層撮影システム（ＦＯＴ）の範例が概略で示されている。流動性光学断層撮影システムは、キャピラリ・チューブ２の周りに配置された再構成用シリンダ２０を備えたフロー・サイトメータを有する。フォトンの供給源２５とフォトン・センサ２６はパルス波高分析器２７と共に一体となって作用し、トリガ装置として動作する。パルス波高分析器２７は細胞の開始点に関する第１のトリガ・ポイント２８、および細胞の終結点に関する第２のトリガ・ポイント２９を供給するために知られている原理に従って動作する。パルス波高分析器２７は各々の細胞の開始点および終結点に相当するトリガ信号３０を出力し、そのトリガ信号は再構成用シリンダ２０によって受け取られる。
【００２３】
コンピュータ４０は信号線４１〜４３によって、送信データ、点光源２１に対する制御信号とタイミング信号、感知素子２３とパルス波高分析器２７に結合される。コンピュータは、知られているコンピュータもしくは複数のコンピュータと、画像収集および画像再構成処理に適したアレイ・プロセッサを有することも可能である。
【００２４】
市販のフロー・サイトメータは３種の基本的な流動用構造、いわばシリンダ状流管、方形流管および空気系内の流動を付随している（Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５年参照）。好ましい構造はシリンダ状流管であり、その理由は流動用ハードウェアに起因するいかなる放射方向依存性をも最小限にするために、再構成アルゴリズムにとって最適なシリンダ状幾何学形状を保つことが重要だからである（図１参照）。さらに、シリンダ状流管はキャピラリ・チューブの断面積に比べて一様に薄い壁を有することも可能である。
【００２５】
付け加えると、トリガ装置は、細胞が最適に入来してその後に再構成用シリンダから出現するときにデータ収集を開始してその後に終結するためのタイミング信号を供給するために、再構成用モジュールから上流に配置されることが可能である。トリガ装置は、レーザ・ダイオード、ＣＣＤ、ＰＭＴ、光検出器の組合せ、ソリッド・ステートの光検出器、および前述の素子の組合せを含むことが好都合となる可能性がある。トリガ装置は流れる細胞の存在を感知し、その結果、下流の再構成用シリンダが対象となるその特定の細胞についてデータ収集を開始するときに判っている細胞速度と共に計算を行うのに使用され得るトリガ信号を発生する。さらに、再構成用シリンダに入出する細胞の入出点に相当する第１と第２のトリガ・ポイントの間の時間的間隔は等しいかもしくは異なる増分に分割されることも可能であり、それらの各々の間に光源（群）２１をストロボ点灯することによるか、もしくはセンサ・アレイ（群）２３を読み取ることによって追加的な投影データが入手されることもあり得る。
【００２６】
流速は正確に制御かつ測定される必要がある。この性能は１メートル／秒から１０メートル／秒の範囲の速度を使用する高性能の市販のシステムで提供される。最善の細胞速度は後に検討するようなデータ収集速度と信号対ノイズの配慮によって決定されるであろう。
【００２７】
再構成用モジュール
ここで図６を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダ２０内の扇形ビーム投影線の範例が概略で示されている。再構成用シリンダの目的は、複数の固定型点光源２１ａ〜２１ｃからシリンダ状キャピラリ・チューブ内へと内周に沿って光を投影する手段を提供することである。点光源から発射されたフォトンは扇形もしくは円錐形といった判っている投影幾何学形状を有し、キャピラリ・チューブを通り抜けることで、このケースではおそらく相当する点光源の反対側で外周に沿って配置された感知素子２３ａ、２３ｂまたは２３ｃのアレイによって検出される。扇形ビームの透照に適した曲線（１Ｄ）センサ・アレイが具体的説明の目的で描かれているが、円錐形ビームの照明に適した直線（１Ｄ）センサ・アレイまたは平面（２Ｄ）も同様に使用され得ることは理解されるべきである。この方式で、投影線のセットが発生される可能性があり、そこでは投影線は点光源と個々の感知素子を結ぶ直線として述べることができる。線３１のような特定の投影線に沿って点光源から出るフォトン数と特定の感知素子で受けられるフォトン数の間の差異は投影線の経路に沿った流管の細胞および他の内容物に起因して損失および減衰するフォトン数に関係する。
【００２８】
しかしながら、光の散乱、フォトン・エネルギーの変位、不完全な幾何学形状および粗悪な視準から厄介な問題が生じる可能性があり、かつ多数の点光源が同時に励起されるとき、異なる光源からフォトンが特定の感知素子に到達する可能性がある。再構成用シリンダの注意深い作製、たとえば、ここで述べたような点光源とそれらの対面する検出器のパターンに関する幾何学形状の慎重な選択、および多数の点光源の活性化とセンサ・アレイの読み取りの適切な時間調整もしくは多重化によって、これらの項目に起因するフォトンの混入は最小限にできるが、しかし除去されるわけではない。
【００２９】
フォトンの混入はシステムの校正によって、たとえば、細胞の不在下で対策されることが可能である。すなわち、各々の点光源が順々に照明されてセンサの各々に対するその影響が測定可能となり、それにより、システムの正規化に使用するためのオフセット・データを供給する。追加的な校正ステップ、たとえば、光学的特性が知られていて、かつ細胞画像化の対象となる密度範囲にかかるラテックス・ポリマー・ビーズまたはその他のミクロスフェアもしくは偏球の画像化が伴う可能性もある。蛍光発光プローブから発射されたフォトンは、後に検討するように検出部でスペクトル帯域通過フィルタの使用によってそれらの光源由来性から差別化されることも可能である。
【００３０】
光源
各々の光源は同じ総合的特性を有する可能性があり、好ましくは、
・それは小円形の点光源に近似する可能性があり、
・それは判っているスペクトル内容で輝度を有する可能性があり、
・光源から発射されたフォトンが円錐形ビームもしくは扇形ビームといった判っている幾何学形状を有する可能性がある。
各々の光源は１つの投影角度についてデータを作り出す。その軸が流管の中心軸である螺旋に沿って配列された複数の光源は、細胞がモジュールを通って流れるときに各々の連続した平面（もしくは再構成スライス）を通る多数の投影角度からデータを作り出す。センサの幾何学形状に応じて、いくつかの点光源は、センサ部で投影がオーバーラップしないように同じ円周上で同一線に並んで配置されることも可能である。良好なサンプリングの幾何学形状は、１８０度の螺旋に沿って光源が等距離で配置されることによって達成されることが可能であるが、いくつかの例ではさらに小さい角度カバレージも許容可能であり、信号対ノイズ比を向上させるためには３６０度が使用される可能性がある。望ましい光源数は各平面再構成（ｘ−ｙ平面）または容積再構成で必要な解像度の関数である。具体的説明のために点光源の螺旋配列が使用されているが、多様な幾何学形状のパターンが点光源アレイに使用され得ることは理解されるべきである。さらに、光源の波長は、さまざまなダイオードもしくはその他のレーザの使用によるか、あるいは白色もしくは他の広帯域光源、たとえば水銀もしくはキセノン・アーク・ランプの通過帯域フィルタ補正によるかのいずれかで選択することが可能である。
【００３１】
ここで図７を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される図６に示した再構成用シリンダの上面の範例が概略で示されている。第１の点光源２１ａとセンサ・アレイ２３ａが、紙面に対して直角方向に流れる核１９を持つある細胞を供えて光源軌道のある投影で示されており、それは二次元で再構成円３２を構成しており、そこではたとえ一時的に振れのある様式で得られることはあってもすべての投影はオーバーラップするように描かれ、すべての細胞が含まれる。第２の点光源２１ｂと第２のセンサ・アレイ２３ｂは螺旋の周囲で約３０°の位置にある。第３の点光源２１ｃと第３のセンサ・アレイ２３ｃは螺旋の周囲で約９０°の位置にある。
【００３２】
データ収集は、細胞の「厚い」平面状軸方向断面内で細胞速度と同期してゲート制限される。所望の平面厚さはｚ方向で必要な解像度の関数である。通常、軸方向（ｚ方向）の解像度は平面状の軸横断方向よりも小さい。最善の再構成円もやはり、頂点に点光源を有して基部に感知用アレイの幅を有する投影扇形のオーバーラップする交差部によって規定される。再構成用シリンダは、流動する細胞の断面が再構成円の中に完全に含まれるのを確実化することが望ましい。
【００３３】
点光源を作製するのに使用可能ないくつかの選択肢があって、すなわち、
・レーザもしくはその他の高輝度フォトン供給源の前方のピンホール、
・微小断面を備えた光ファイバ、
・フォトン供給源前方の短焦点距離レンズ、
・リン表面のある点を照射する電子ビーム（ＣＲＴの形式）、
・以上のさまざまな組合せ、
といったものである。
【００３４】
幾何学形状は、関心事の対象物（細胞）に点光源が近づくにつれて、光源に近づく対象物によって範囲の決まる広い幾何学角度に起因して、倍率が高くなるようにされる。反対に、もしも必要な解像度がシステム設計よりも前に判っている場合、幾何学形状はその特定の解像度に関して最適化されることが可能である。背景に関しては、Ｂｌａｓｓ，Ｍが編集長を務めた「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ」、第２版、第４巻、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年を当業者に推奨する。
【００３５】
ここで図８を参照すると、図８は本発明の実施形態によって考慮される細胞再構成に使用される直線アレイ２３の範例を概略で示している。たとえば、細胞の断面１２と核１９が直径３０ミクロンの再構成円の中に含まれて所望の解像度が０．５ミクロンであるという前提で、ナイキスト・サンプリング（すなわち因数２による過剰サンプリング）は各々の点光源２１について少なくとも１２０の感知素子３３が必要となることを決定付ける。頂点にある点光源２１と基部の線形アレイの長さ３４は、範例の直径３０ミクロンの細胞が可能な限り点光源２１に接近して三角形３５内に嵌まるように三角形３５を形成する。この範例では、もしも（たとえばＣＣＤ）アレイの各素子が幅２０ミクロンであってアレイ長さが２４００ミクロンであるならば、細胞の中心は点光源から約１００ミクロン（キャピラリ・チューブの直径の半分）に位置することが可能であり、そのとき点光源と線形アレイの間の距離は８ミリメートルであって、８０倍の倍率を与える。
【００３６】
第２の範例として、直径３０ミクロンの再構成円および画素の素子サイズが４ミクロンである相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）の感知アレイを考える。このケースでは、アレイは４８０ミクロンの幅について１２０の素子を含むことが可能であり、かつ点光源と細胞の間の距離が１００ミクロンであるときにそれは点光源から１．６ｍｍに位置することが可能であって１６倍の倍率を与える。
【００３７】
感知素子
各々の点光源は、再構成円を通って透過するフォトン線を受けるように点光源の反対側で何らかの直線もしくは曲線の幾何学的配列にあるＣＣＤ群のような感知素子群の相当するアレイを有するであろう。通常では、線形アレイは点光源と流れの中心軸の間の線上に中心を置くその感知素子のアレイを有する可能性があり、流れの軸に対して直角に整列する可能性がある。２Ｄアレイ内の素子の各々の線のうちの部分集合だけが再構成入力のために読み取られる場合には２Ｄアレイを使用することが可能である。２Ｄアレイでは、複数素子の各々の連続した部分集合は、点光源の螺旋配列に沿って各々の異なる点光源と適切に整列させるために適切な数の素子で互い違いにされる可能性がある。
【００３８】
０．５ミクロンの解像度を得るために扇形あたり１２０の感知素子を備えて３０ミクロンの再構成円の範例を使用するスライスごとの扇形ビーム再構成については、２０００×２０００個の２０ミクロンの素子を備えた２Ｄアレイが、１半径度の増分で配列された１３６個の点光源を感知するのに充分であり、そこでは連続する景色間の平均オフセットは３００ミクロンであって、それは１５個の感知素子と同等である。（アレイの中央ではオフセットが１４０ミクロン、または７素子であるが、それに対してアレイのエッジでは１半径度は景色間でかなり大きなオフセットを伴う可能性がある。）もしも１スライスについて投影データを供給するのにセンサ・アレイの１５本の横列のグループが平均化された場合、細胞画像内のｚ解像度は３．７５ミクロンである可能性があり、それに対してもしも各々の投影について２本の横列が平均化された場合、対象物の軸方向解像度は軸横断方向の解像度と同等の０．５ミクロンである可能性がある。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、２Ｄアレイはシリンダの円周に沿って曲がっており、それが再構成用シリンダと同軸であることも可能であり、それによって複数の線経路が長さですべて等しくなる。３０ミクロンの再構成円のケースについては、点光源の螺旋座に対面するのに必要とされるだけの素子を有する曲線の２Ｄアレイは、上述の範例に関すると、高さ（長さ）で１３６素子の数倍であって１２０素子幅の螺旋状の帯片であることが可能である。
【００４０】
平面状のまたは「厚い」扇形照明が上記の具体的説明の目的で述べられているが、真の、視準されていない円錐形ビームの照明が２Ｄの平面状検出器と共に使用され、円錐形ビームのアルゴリズムを使用して３Ｄ再構成されることも可能であることは理解されるべきである。２Ｄの投影画像は、たとえば、細胞の疾病状態または形質転換状態に関する情報を得るために直接的に分析されることが可能である。直接的な容積性の円錐形ビームによる再構成に関すると、点光源群と検出器群の幾何学的配列が与えられるとさまざまな点光源から出る照明の円錐形がセンサ・アレイ上でオーバーラップしないように複数の点光源が多重化される。
【００４１】
さらに、もしも細胞が１メートル／秒（１，０００，０００ミクロン／秒）の速度で流れ、かつ２Ｄアレイの各素子が２０ミクロン幅であったならば、２０マイクロ秒ごとの線読み取りは細胞の０．２５ミクロンのスライス内で容易にデータを捕捉することができる。３．７５ミクロンのスライスについてデータを供給するために１５本のセンサ横列が平均化されるときのケースでは、読み取りは３００マイクロ秒ごとに生じなければならないであろう。さらに大きな２Ｄアレイを使用して再構成画像品質に有意な改善が達成される。
【００４２】
いくつかの透過もしくは発光波長帯域の多スペクトル性の画像化に特に適した本発明の一実施形態は直列に配置された２つ以上の再構成用モジュールを都合よく含むことが可能である。そのような多重の再構成用シリンダはキャピラリ・チューブの介在区画によって分離されることが可能であり、各々のモジュールが、それを通って流れる対象物の完全な再構成画像を生じるのに適した投影データを供給する。いくつかの再構成用モジュールの各々に関する点光源および／またはセンサ・アレイは特定のスペクトル帯域について最適化される可能性がある。たとえば、第１の再構成用モジュールが極めて強い白色光照明とフィルタ補正のない検出を使用して対象物の光学密度、吸収もしくは散乱係数のマップを再構成するために完全な投影データのセットを供給し、それに対して第２の再構成用モジュールが、４９５ｎｍ付近に中心を置く狭いスペクトル帯域でアルゴンイオン・レーザ（４８８ｎｍ）のような照明を使用することで、５２０ｎｍ発光に感受性のあるフィルタ補正されたセンサ・アレイと共に蛍光免疫の研究のための蛍光発光プローブをラベルしたタンパク質を励起して、後に述べるように発光再構成アルゴリズムを使用することによってラベル化タンパク質の濃度分布をマップ化するのに充分な第２の完全な投影データ・セットを供給することも可能である。さらに第３の再構成用モジュールが、化学量論的にＤＮＡに結合されたヨウ化プロピジウムを励起するために５３５および／または３４２ｎｍ付近に中心を置く狭帯域の照明を使用し、倍数性の研究用に赤色（６１７ｎｍ）発光を最適に検出するためのフィルタ補正されたセンサ・アレイを使用することも可能である。前述の範例が具体的説明を目的とするものであり、本方法が、概して、照明と感知のためのいかなる波長の組合せに対しても当てはまることは理解されるであろう。
【００４３】
画像再構成
フィルタ補正逆投影法として知られている最も一般的でかつ容易に実行される再構成アルゴリズムは、円錐形ビームおよび扇形ビームの幾何学形状を使用するコンピュータ利用のＸ線断層撮影法（ＣＴ）の類似したパラダイムから派生している（たとえば以下の参考資料、すなわち、Ｋａｋ，ＡＣとＳｌａｎｅｙ，Ｍの「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ」、ＩＥＥＥ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年、およびＨｅｒｍａｎ，Ｇの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０年参照）。これらの方法は、光源／検出器構造および照射ビームの線経路の特定の幾何学形状を反映する変更を伴うラドン変換の法則に基づいている。しかしながら、臨床Ｘ線ＣＴのケースでは、スライスごとの収集について、所定のスライス内で多数の投影角度からデータを集めるためにＸ線源と検出器アレイが患者周囲の円弧に沿って移動する可能性のある間は人間の被検者は普通では不動に保たれる。その後、人間の被検者はｚ軸に沿って姿勢を取り直され、別のデータ・スライスを収集するなどがなされる。場合によっては、さらに最新の臨床螺旋ＣＴでは患者はｚ方向に連続的に平行移動され、その間に螺旋投影データを供給するために光源−検出器組み立て体が連続的に回転し、その後、それは患者のｚ軸に対して直角の投影を供給するために間隔をつめられる。流動性光学断層撮影法では、被検体（細胞）は静止した光源と検出器アレイに関して一定の速度で移動させられ、そこでは複数の光源／検出器システムが、所定のスライスもしくは容積内で多数の投影角度のデータを発生する様式で、細胞速度ベクトルに沿った特定のゲート時間点と同期してデータを得る。スライスごとの走査については、再構成アルゴリズムが移動の軸に対して直交する平面の２Ｄ画像を計算するであろうし、多数のスライスの順次の積層が被検体の３Ｄ像を発生するであろうし、そこではコントラストはＣＴもしくは流動性光学断層撮影の被検体内のＸ線の減衰係数または光学密度それぞれの関数である。容積性の円錐形ビームの走査については、再構成アルゴリズムが細胞もしくは他の対象物内の容積の３Ｄ像を平面の透過もしくは発光光学投影から直接的に計算し、そこではコントラストは画像化対象物内の光学密度分布および／またはタグ付きプローブ密度分布それぞれの関数である。
【００４４】
フィルタ補正逆投影以外の画像再構成アルゴリズムを使用するために、透過のデータが細胞の光学密度の再構成を生じるか、または発光のデータがラベル化プローブの分布を再構成するか、またはその両方が生じるかのいずれかであることが望まれる可能性がある。いくつかの例では反復性再構成アルゴリズムとして知られている一般的部類がさらに効果的であり、特に、発光の断層撮影法に関して、あるいは、対象物の軸対称性と３区分の性質が判っている現在の発明の例のように、再構成の品質を高めるために再構成アルゴリズムに先行情報を取り入れることが可能なときにそうである（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６巻、１０５〜１７頁、１９７２年、および前に記した他の参考資料参照）。
【００４５】
同様に、ある方法は、都合のよいことに、有限要素モデル化（ＦＥＭ）に基づく統計学的再構成アルゴリズムを使用することが可能である。ＦＥＭアルゴリズムは、フォトンの拡散／移動が素子の結合すべてで解決されることで画像化対象物の吸収、散乱、屈折率および異方性因子の特性の何らかの組合せの二次元もしくは三次元マップを生じるという線形輸送理論から派生している。そのような方法の範例は、Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＪｉａｎｇ，Ｈの「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｆｉｎｉｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２２巻（６９１〜７０１頁）１９９５年、Ｈａｍｐｅｌ，ＵとＦｒｅｙｅｒ，Ｒの「Ｆａｓｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉａｌｌｙ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（１）、９２〜１０１頁、１９９８年、およびＪｉａｎｇ，Ｈ，Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＯｓｔｅｒｂｅｒｇ，ＵＬの「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ Ｐｈａｎｔｏｍｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（２）、１８３〜９３頁、１９９８年に教示されている。
【００４６】
色彩分別
もしも多色点光源（たとえば白色光）が使用されるならば、いくつかの分子プローブおよび所定の細胞内の構造的特長を見分けるのに異なる色彩の染色液（たとえば発色団）を利用することが可能である。ここでは、光源もしくは感知アレイ（または両方）で直列に並んだ複数の帯域通過フィルタが波長データを分離し、個々の染色された分子群の再構成および場所の特定を可能にする。多数のプローブを画像化するためのさらに強力な方法は、極めて強い白色光源およびセンサ・アレイ内の複数フィルタ補正された帯域幅の同時収集を含み、その結果、再構成アルゴリズムが各発色団について空間的画像スライスを計算するのを可能にする。これらが彩色化された画像として表示されることは可能である。
【００４７】
蛍光、燐光、化学発光およびナノ粒子発光
流動性光学断層撮影システムの特別のケースとして、ある分子プローブは、フォトンの一次供給源によって励起されると異なる（長い）波長の光を発する「レポータ」でタグ付けされることが可能である。レポータからの二次発光は、二次発光のフォトンから一次光源のフォトンを分離するために標準的な光学フィルタでフィルタ処理ことが可能である。しかしながら、二次発光フォトンの画像再構成アルゴリズムはさらに複雑であって、なぜならば二次フォトンは必ずしも点光源から直接の線経路で生じるとは限らないからである。もしも二次フォトンが一様な球形パターン内の二次点光源から発するならば、いかなる感知素子に到達する二次フォトンの強度も感知素子までの距離の単純な関数であろう。点光源との関連、および再構成スライス内の二次フォトンの空間的分布のモデルを供給することによって二次光源から出るフォトンの非球形分布に関してさらなる改良が対策されることも可能である。いずれの方法も再構成スライスもしくは容積内の二次光源の場所を計算する手段を供給するであろう。画像化対象物と検出器アレイ（群）の間の視準化が画像再構成を向上させるであろう。
【００４８】
もしも一次フォトン強度と二次フォトン強度が光学的フィルタ補正によって同時に測定されるならば、一次フォトンの強度から得られる高解像度の密度再構成は、場所の特定されたプローブ濃度と共に画像の形態が単一の再構成画像で利用可能となるように、二次光源の再構成に重畳されるかもしくはそれと融合されることが可能である。強度、信号対ノイズ、および光源および／またはセンサ部でフォトンの狭帯域幅をフィルタ抽出もしくは発生する能力に応じて、各々が異なるタグ付き分子プローブに対応する多数の二次光源を利用することが好都合となる可能性がある。
【００４９】
２００１年３月１３日にＢａｓｉｊｉらに公布された「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｃａｎｎｅｒ」というタイトルの米国特許第６，２０１，６２８号は、自動化され、高速かつ高感度の被検体の蛍光、光学密度もしくは燐光を得るように供給された走査装置を開示している。このスキャナは、高速走査用の移動ビームとノイズ低減用の位相感受性検出の組合せを可能にする一定の経路長の光学列を使用し、光源、光源から光を受け、ステアリング・ミラーを横切ってそれを掃引するための走査ミラー、走査ミラーから光を受けてそれを被検体へと反射し、それによって、走査円弧に沿って被検体を横切って掃引されるステアリング・ミラー、および被検体から発光もしくは散乱された光を受けるための光検出器を有し、光源から光検出器までの長さは被検体を横切る掃引を通じて実質的に一定である。光学列は被検体から発射もしくは散乱された光を収集してそれを光検出器へと向けるための導波路もしくはミラーをさらに含むことも可能である。位相感受性の検出に関すると、光源が輝度変調され、検出器が位相感受性の検出用電子装置に接続される。被検体の平行移動を使用するスキャナもやはり供給される。二次元の画像化については、被検体が１つの方向に平行移動され、その間に走査ミラーがビームを第２の方向で走査する。高処理能力スキャナについては、被検体の積み重ねがトレイ・フィーダからコンベヤ・ベルトに搭載される。米国特許第６，２０１，６２８号はここでは参考資料で取り入れられている。
【００５０】
ここでは特許法に準拠してかつ本発明の新規性のある原理を適用し、必要とされるような範例と特化した構成要素を作製および使用するのに必要な情報を当業者に提供するために、本発明をかなり詳細に説明してきた。しかしながら、本発明が特異的に異なる機器、装置および再構成アルゴリズムによって実行される可能性があること、および本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、機器の詳細と操作の手法の両方についてさまざまな改造が達成される可能性があることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の実施形態によって考慮されるフロー・サイトメトリ・システムの範例となる具体例を示す概略図である。
【図２】本発明の実施形態によって考慮される単一細胞の流動ステップの範例となる具体例を示す概略図である。
【図３】この図中Ａは、本発明の実施形態によって考慮される細胞の再構成の範例となる具体例を示し、図Ｂは、本発明の実施形態によって考慮される細胞断面の再構成の範例となる具体例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダの範例を示す概略図である。
【図５】本発明の実施形態によって考慮される流動性光学断層撮影（ＦＯＴ）システムの範例を示す概略図である。
【図６】本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダ内の投影線の範例を示す概略図である。
【図７】本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダの上面の範例を示す概略図である。
【図８】本発明の実施形態によって考慮される、細胞再構成に使用される光源／リニヤ・アレイの幾何学構造の範例を示す概略図である。
【０００１】
本発明は、点光源投影幾何学を使用する三次元光学的断層撮影法に関し、より詳細には、光学的断層撮影法を使用して流動流中の微生物細胞を含む微細な対象物を画像化することに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、２００１年３月２８日に出願したＡｌａｎ Ｃ．Ｎｅｌｓｏｎの「ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＭＡＬＬ ＯＢＪＥＣＴＳ ＩＮ Ａ ＦＬＯＷ ＳＴＲＥＡＭ ＵＳＩＮＧ ＯＰＴＩＣＡＬ ＴＯＭＯＧＲＡＰＨＹ」というタイトルで番号６０／２７９２４４の同時係属中の仮出願に関連するものであり、この参考資料によって、同時係属仮出願の出願日付で優先権を主張する。
【０００３】
抗体プローブおよび核酸ハイブリッド形成用プローブといった分子プローブの出現により、生物細胞および組織内でこれらの分子プローブをタグとして、その後にそれらの所在部位と濃度を測定することによって新たな疾病に関する疑問点に対処することが可能である。これらのプローブをより正確に局所化および定量化する必要性が生じるにつれて、それに伴って、二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）で顕微鏡によりプローブ密度を測定するための改良された技術が求められている。スライド・グラス上に乗せた細胞を使用する従来の光学顕微鏡法は、焦点面深度、サンプリング角度、および通常は画像面内で細胞のオーバーラップを引き起こす細胞調製に伴う諸問題が理由で、２Ｄおよび３Ｄで近似させることが可能なだけである。光学顕微鏡法の別の欠点は、対物レンズを通して観察することの固有の限界であって、分析のための正確なデータは焦点面内の領域で得られるだけである。
【０００４】
フロー・サイトメトリ法は、概して、流体流中で細胞を１つずつ流すことによって細胞のオーバーラップの問題を克服する。残念なことに、フロー・サイトメトリ・システムが従来の光学顕微鏡法と同じ品質の細胞画像を生成することはなく、かついずれのケースでも画像は三次元的ではない。背景として、Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５年を当業者に推奨する。
【０００５】
コンピュータ支援の断層撮影法の領域では、１９９５年３月２８日にＪｏｈｎｓｏｎらに発行された「Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｍｉｃｒｏｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ」というタイトルの米国特許第５，４０２，４６０は、Ｘ線発生器および標本を通るＸ線ビームの減衰を測定するＸ線検出器を使用して標本の高解像度三次元画像を発生するための微細断層撮影システムを開示している。Ｊｏｈｎｓｏｎらの微細断層撮影システムでは、標本の各景色について、各々が異なるエネルギーのＸ線を使用する２つの投影がなされる。標本のある景色の２つの投影がなされた後、標本は標本ホルダ上で回転され、別のセットの投影がなされる。標本の各景色の投影は集められて分析され、標本を含む材料の相画分の定量的表示が供給される。標本の三次元画像を供給するためにさまざまな景色の投影が組み合わされる。ここでは米国特許第５，４０２，４６０号を参考資料で取り入れている。米国特許第５，４０２，４６０号によって教示されるようなＸ線技術はいくつかの用途には有用であるが、それはフロー・サイトメトリ法にとって有用な最適の解決策を提供するものではない。
【特許文献１】
米国特許第５，４０２，４６０号
【特許文献２】
米国特許第６，２０１，６２８号
【非特許文献１】
Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５年
【非特許文献２】
Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６巻、１０５〜１７頁、１９７２年
【非特許文献３】
Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＢＥの「Ｍｏｒｅ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＮＳ−２１巻、７２〜７頁、１９７４年
【非特許文献４】
Ｓｉｎｇｅｒ，ＪＲ、Ｇｒｕｎｂａｕｍ，ＦＡ、Ｋｏｈｎ，Ｐ、およびＺｕｂｅｌｌｉ，ＪＰの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｏｆ Ｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９５８）、９９０〜３頁、１９９０年
【非特許文献５】
Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＫとＹａｇｅ，Ｒの「Ｒａｐｉｄ ３−Ｄ Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ） Ｕｓｉｎｇ ２−Ｄ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｈａｒｄｗａｒｅ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ １９（１２）巻、１２２７〜３７頁、２００１年
【非特許文献６】
Ｂｅｌｌｍａｎ，ＳＨ、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ、およびＲｏｗｅ，ＪＥの「ＡＲＴ ｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｂｅｉｎｇ Ａ Ｄｅｆｅｎｃｅ ｏｆ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２巻、２０５〜１６頁、１９７１年
【非特許文献７】
Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｊａｓｚｃａｋ，ＲＪ、およびＦｌｏｙｄ，ＣＥの「Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４巻（１２）、１９４７〜５７頁、１９８９年、＃１３８２
【非特許文献８】
Ｍａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｇａｇｎｅ，ＧＭ、Ｋｒｏｌ Ａ、Ｔｈｏｍａｓ，ＦＤ、およびＮａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒの「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＣＴ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻（７）、１２２５〜４１頁、１９９５年、＃４３８９
【非特許文献９】
Ｂｌａｓｓ，Ｍが編集長を務めた「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ」、第２版、第４巻、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年
【非特許文献１０】
Ｋａｋ，ＡＣとＳｌａｎｅｙ，Ｍの「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ」、ＩＥＥＥ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年
【非特許文献１１】
Ｈｅｒｍａｎ，Ｇの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０年
【非特許文献１２】
Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＪｉａｎｇ，Ｈの「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｆｉｎｉｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２２巻（６９１〜７０１頁）１９９５年
【非特許文献１３】
Ｈａｍｐｅｌ，ＵとＦｒｅｙｅｒ，Ｒの「Ｆａｓｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉａｌｌｙ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（１）、９２〜１０１頁、１９９８年
【非特許文献１４】
Ｊｉａｎｇ，Ｈ，Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＯｓｔｅｒｂｅｒｇ，ＵＬの「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ Ｐｈａｎｔｏｍｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（２）、１８３〜９３頁、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そのようなシステムで見受けられる前述の制限その他を克服するために、フロー・サイトメトリ法の１つずつの細胞提供と複数点光源から得られるコンピュータ利用による光学的断層撮影法を組み合わせることで複数の投影から２Ｄおよび３Ｄの細胞の光学密度情報を再構成することが本発明の動機である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、光学的点光源の投影と断層撮影による画像再構成を使用して流動流中の微小対象物を画像化するための装置と方法を提供する。流動性光学断層撮影（ＦＯＴ）システムは、図１に示したようなフロー・サイトメータ、および図４に示したようなキャピラリ・チューブ２の周囲に配置された再構成用シリンダを有する。フォトンの供給源２５とフォトン・センサ２６はパルス波高分析器２７と共に作用することでトリガ装置として動作する。パルス波高分析器２７は、知られている原理に従って、細胞の開始点に関する第１のトリガ・ポイント２８および細胞の終結点に関する第２のトリガ・ポイント２９を供給するように動作する。パルス波高分析器２７は各々の細胞の開始点と終結点に相当するトリガ信号３０を出力し、そのトリガ信号は再構成用シリンダ２０によって受け取られる。再構成用シリンダから得られる信号は直接的に分析されることも可能であり、あるいはコンピュータ利用の断層撮影画像再構成技術を使用して処理されることで細胞の二次元もしくは三次元情報を供給することも可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
ここで生物細胞に関連する特定の範例でもって本発明を説明するが、しかしながらこれらの範例が本発明の原理を具体的に示す目的のためのものであり、本発明がそのように限定されるものでないことは理解されるであろう。ある範例では、微細容積内で点密度と発光強度の三次元分布を作成することが微細容積内のいかなる場所でも密度と蛍光の測定を許容し、対象となる構造、分子もしくは分子プローブの所在を決定する。タグを付けた分子プローブを使用することによって、微細対象物の特異的構造に付着するプローブの量を測定することができる。具体的に示すことを目的とすると、生物細胞のような対象物がタグを付けた少なくとも１つの分子プローブでラベルされ、このプローブの測定量および所在部位が、限定はされないが、肺癌、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌および卵巣癌を含む細胞の疾病状態に関する重要な情報をもたらす可能性がある。
【０００９】
フロー・サイトメトリ用に調製され、特異的疾病診断のためにタグを付けた分子プローブで染色されるかもしくはラベルされた生物細胞がシリンダ状の装置を通過して流され、それが投影画像を供給して、かつ細胞の流動ベクトルに対してほぼ直角の光学投影線経路から２Ｄおよび３Ｄの密度情報の再構成を可能にする。軸に沿って流れる細胞の速度を制御することによって、直交する再構成二次元平面が細胞全体の３Ｄ像を作成するように細胞の軸に沿って正確に配置（もしくは積層）されるか、あるいは細胞の３Ｄ画像が２Ｄの光学透過もしくは発光投影から直接的に算出されることが可能となる。
【００１０】
フロー・サイトメトリ法は以下の特徴が理由で画像再構成に高度に適合している。
・細胞のオーバーラップおよび不鮮明化が最小限となるように細胞がキャピラリ・チューブを通って単一縦列で流れ、
・キャピラリ・チューブを通って流れる細胞の速度が直接的に測定可能であり、かつ一定であり、
・キャピラリ・チューブの中心軸を細胞が流れ、構造的に放射形対称となる傾向があり、および、
・細胞の固定化および懸濁調製に応じて、細胞は可塑性を保つこと、およびキャピラリ・チューブ内で速度勾配に応答してｚ軸に沿って長く延びた形状をとることが可能である。
本発明は点光源投影による画像化と断層撮影による画像再構成をシステムに供給するために前述の特徴の恩恵を得る。
【００１１】
ここで図１を参照すると、本発明の実施形態によって考慮されるフロー・サイトメトリ・システムの範例となる具体例が概略で示されている。このシステムはｘ、ｙおよびｚ方向に座標を有する座標系１１に関して配向される。動作では、知られている注入装置４を使用して細胞１が注入チューブ３に注入される。キャピラリ・チューブは注入端部５で広がっており、圧力キャップ６を有する。キャピラリ・チューブ２内で層流を生じさせるためにシース流体７がチューブ８に導入される。溶液中に調製および懸濁された細胞１が、それらが流れの軸と共に細長く延びてかつ破線９で表わしたようにキャピラリ・チューブのほぼ中心軸を下方向移動するようにキャピラリ・チューブ２を通って押し進められ得ることが従来のフロー・サイトメトリ法の特徴である。細胞は、軸対称かつ一定の速度１０でシリンダ状キャピラリ・チューブの中心軸に沿って単一縦列で流れるようにされることが好都合である。
【００１２】
ここで図２を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される単一細胞のための流動ステップの範例となる具体例が概略で示されている。細胞１は速度ベクトル１０で表わされる一定の速度（Ｖ）で、キャピラリ・チューブ２を通って移動する。細胞１は細胞質の壁１２と細胞核の壁１３を有する。キャピラリ・チューブ２を通って流れる過程で、具体的例示の目的で第１、第２および第３の再構成平面１４ａ、１４ｂおよび１４ｃとしてそれぞれ表わされる複数の再構成平面を細胞１が通過する。細胞質の壁を通る第１の平面状スライス１５ａは再構成平面１４ａ内に位置する。同様に、細胞質の壁と細胞核の壁を通る第２の平面状スライス１５ｂは第２の再構成平面１４ｂ内に位置し、第３の平面状スライス１５ｃは第３の再構成平面１４ｃ内に位置する。本発明の中心的な特徴は、波長選択可能ないくつかの光学的点光源がキャピラリ・チューブの周囲および同軸に配置されることである。光学的点光源は反対側にあって光スペクトルの選択可能部分に感受性のある光学センサ・アレイと共に動作し、その結果、細胞を透過する光の投影を捕捉することが可能となる。得られた投影画像は直接的に分析されることも可能であり、あるいは断層撮影画像再構成アルゴリズムを使用して処理されることで細胞内の密度および／または発光強度の分布のマップもしくは画像を供給することも可能である。実用では、再構成平面の数が、システムに供される対象物の必要な画像解像度に応じて数枚から数百枚またはそれ以上まで変えられる可能性があることは理解されるであろう。再構成された平行する平面状スライス画像のグループは、細胞内の密度および発光強度の三次元（３Ｄ）画像を作り出すために、ソフトウェア内で組み合わせもしくは積層されることが可能である。付け加えると、線形（１Ｄ）の代わりに平面（２Ｄ）の光センサ・アレイ、および扇形の代わりに円錐形の照射線パターンを使用することによって、流動細胞を通る複数の隣接する平面状スライスの投影が同時に得られる可能性がある。結果として、細胞容積内の密度と発光強度の分布の三次元（３Ｄ）画像は円錐形ビーム再構成アルゴリズムを使用して二次元（２Ｄ）投影から直接的に算出されることが可能となる。場合によっては、無限の視野深度を有する２Ｄ点光源投影画像が直接的に分析されることも可能である。
【００１３】
生物細胞のケースでは、再構成平面間の距離（ｄ）は数ミクロンもしくはそれ未満であってもよい。細胞１内のある点は各再構成平面で、時間的間隔を置いて合致し、ここで時間的間隔（ｔ）は関係式、
ｔ＝ｄ÷Ｖ （式１）
によって述べることが可能である。
【００１４】
ここで図３Ａと３Ｂを関連させて参照すると、本発明の実施形態によって考慮される再構成の断面１６の範例が概略で示されている。細胞を通る光学投影から細胞内の点密度を再構成するステップは流れる細胞の軸対称性と中心性から恩恵を受ける。付け加えると、投影によってサンプリングされる空間は次の３つの別々の区分、すなわち、
１．細胞の外側の流体１７（すなわちシース流体もしくは細胞懸濁媒質）
２．細胞質１８、および
３．細胞核１９
から構成されるようにモデル化することができる。
【００１５】
これら３つの区分内の光学密度もしくは分子プローブの分布を知ることは細胞生物学および疾病診断の多くの重要な諸問題を解決するのに充分である。付け加えると、もしも細胞質のもしくは細胞の壁１２と核の壁１３を含む２つの境界面にある分子プローブが優先的に結合するならば、それら表面を算出することが有用になる可能性がある。そうでない場合、これらの壁を３つの異なる区分間の遷移表面として特徴付けることで充分である可能性がある。
【００１６】
細胞の再構成スライスを組み合わせることによって、または螺旋状の容積測定方式で再構成することによって、３Ｄ形態と容積の情報を生じることが可能であるが、しかし絶対的（相対的の反対）な容積は細胞の場所の正確な情報によって決まる。細胞の場所は流速の関数である。しかしながら、いくつかの例では、密度もしくは分子プローブの相対的濃度が次の診断上の疑問を解決するのに充分である。すなわち、核に対して細胞質中にどれだけのプローブが存在するか、それに対してバックグラウンド流体中の非結合プローブはどうか。あるいは主にプローブは細胞膜上に存在するのか、または核の膜表面に存在するのか。
【００１７】
キャピラリ・チューブを通過する細胞は構造的に放射対称形になる可能性があるが、少なくとも１つの結合分子プローブの核および細胞質区分内の分布はそのような対称性を帯びない可能性がある。したがって、結合した蛍光発光分子プローブの量を上述の３つの区分の分析を供給するのに必要となるよりもさらに微細な尺度で場所を特定するのに充分な空間的解像度を提供することが画像化システムおよび（特に発光の）再構成アルゴリズムにとって望ましい。さらに、２つの細胞内区分内に非対称に分布したプローブの濃度に関する定量的情報をシステムが供給することも望ましい。プローブの、特定の亜細胞区分、細胞質もしくは核内の構造体もしくは細胞内小器官との連関はミクロン以下の空間的解像度によって容易になる。
【００１８】
さらに特定の範例は、危険な状態の患者で癌を早期発見することに関する。そのようなケースでは、細胞が形質転換するときにある遺伝子がそれらの機能を過剰もしくは過少に発現する可能性がある。診断上、バックグラウンドの懸濁流体中の非結合プローブに関して正規化をする一方で細胞質内の遺伝子産物（しばしばタンパク質）の相対的過剰もしくは過少発現を核との関連で測定することが重要である。もしも遺伝子産物がタンパク質である場合、遺伝子産物のタンパク質の場所の特定および／または定量化によって細胞の疾病状態を評価するのにタグを付けた抗体プローブを使用することが可能である。したがって、これを疾病状態を決定するのに３つの区分の分析は充分である。
【００１９】
ここで図４を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される、流動細胞１を含む流管２を取り巻く再構成用シリンダの範例が概略で示されている。再構成用シリンダ２０は、たとえば、ピッチ角度θで所定の螺旋ピッチで配置された点光源の螺旋２４を有する。各々の点光源２１はフォトンのビーム２２を発生し、ここで通常、フォトン・ビーム２２は円錐形もしくは扇形の形状にされる。図４の範例に描かれた光源の配列は螺旋であるが、部分的には電子装置の速度、細胞の速度およびセンサ部（検出器部）でオーバーラップのない投影信号を確立する幾何学形状に応じて、点光源アレイは広範な種類の幾何学パターンをとる可能性がある。感知素子２３は点光源から光を受けるように配置される。
【００２０】
チューブの円周の周りに装着された対面する検出器群２３と共に、固定型光学点光源２１は細胞１全体を通る多数の投影角度を、それが流れて光源を過ぎるときにサンプリングすることができる。光源、および減衰されて透過および／または散乱および／または発射される光の発光もしくは読み取り、または両方を時間調整することによって、各々の検出信号は、流れる細胞のｚ方向の軸に沿った特定の知られている位置で一致するであろう。この方式で、同期する様式で発光させられるかもしくは検出される光源に直交する判っている軸に沿って判っている速度で流れる細胞１は、細胞を通る投影で光学的に切片化されることが可能であり、それらはｘ−ｙ平面で２Ｄスライスを形成するように再構成されることが可能である。列になったスライスを積層または数学的に組み合わせることによって、細胞の３Ｄ像が浮かび上がるであろう。細胞の動きを流動の軸の周りの光源（もしくは複数光源）の位置決めと組み合わせることで、たとえば細胞の３Ｄ像を作成するための螺旋方式で再構成されることの可能なデータを生じることもやはり可能である。再構成は、扇形ビーム再構成アルゴリズムを使用して線形（１Ｄ）投影から再構成された隣接する平面画像を積層することによるか、または円錐形ビーム再構成アルゴリズムを使用して平面（２Ｄ）から直接的に行うかのいずれかでなされることが可能である。細胞の３Ｄ像は亜細胞構造体の定量的測定値、および診断情報を提供するタグ付き分子プローブの量をもたらすことが可能である。
【００２１】
記述したように、細胞切片を通る複数の投影は切片または容積内で２Ｄまたは３Ｄの密度構造を再構成するように要求される。従来のスライスごとのＸ線コンピュータ利用断層撮影法では、患者を通る多数の投影角度を生じるためにＸ線源とそれに対面する検出器が外周に沿って移動する間、人間の患者を不動に保つことによって多数投影がなされる。類推によって、本発明の流動性光学断層撮影システムはキャピラリ・チューブの外周に沿って異なる角度で配置された多数光源を過ぎて細胞を所定の速度（Ｖ）で移動させ、それにより、細胞が流れて点光源を過ぎるときに細胞を通る多数の投影を生じさせる。これらの点光源は、細胞を通過して光源の反対側のセンサのアレイによって検出されるフォトンを発射する。点光源は、細胞内の各々の点が点光源のアレイを通り過ぎるときに多数の角度からサンプリングされるように、キャピラリ・チューブの円周上で螺旋２４に沿って、あるいは他の適切な幾何学パターンで配置される可能性がある。良好なサンプリング幾何学形状に関すると、これらの点光源が円周の少なくとも１８０度をカバーすることも可能性がある。いくつかの例ではさらに少ない角度カバレージ（すなわちサンプリング下の角度）が実現可能であり、それに対して追加的な半径方向のカバレージはコンピュータ利用の再構成の精度および信号対ノイズ比を改善するであろう。幾何学形状に応じて、円錐形ビームもしくは扇形ビームの画像再構成に従来の解析、反復または統計学的アルゴリズムを適用することが好都合になる可能性がある。（たとえば、Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６巻、１０５〜１７頁、１９７２年、Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，ＢＥの「Ｍｏｒｅ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ ３ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＮＳ−２１巻、７２〜７頁、１９７４年、Ｓｉｎｇｅｒ，ＪＲ、Ｇｒｕｎｂａｕｍ，ＦＡ、Ｋｏｈｎ，Ｐ、およびＺｕｂｅｌｌｉ，ＪＰの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｏｆ Ｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｄｉｆｆｕｓｅ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８（４９５８）、９９０〜３頁、１９９０年、Ｍｕｅｌｌｅｒ，ＫとＹａｇｅ，Ｒの「Ｒａｐｉｄ ３−Ｄ Ｃｏｎｅ−ｂｅａｍ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（ＳＡＲＴ）Ｕｓｉｎｇ ２−Ｄ Ｔｅｘｔｕｒｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｈａｒｄｗａｒｅ」、ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ １９巻（１２）、１２２７〜３７頁、２００１年参照」。）限定はされないが関連する方法には、ＡＲＴ（Ｂｅｌｌｍａｎ，ＳＨ、Ｂｅｎｄｅｒ，Ｒ、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ、およびＲｏｗｅ，ＪＥの「ＡＲＴ ｉｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｂｅｉｎｇ Ａ Ｄｅｆｅｎｃｅ ｏｆ Ａｌｇｅｂｒａｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３２巻、２０５〜１６頁、１９７１年で検討されているような代数的再構成技術）、ＳＩＲＴ（たとえばＧｉｌｂｅｒｔ、同、＃１４９３によって検討されているような同時反復再構成技術）、ＭＬ−ＥＭ（たとえばＭａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｊａｓｚｃａｋ，ＲＪ、およびＦｌｏｙｄ，ＣＥの「Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＳＰＥＣＴ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｔｅｓｔｓ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４巻（１２）、１９４７〜５７頁、１９８９年、＃１３８２で検討されているような最尤期待値最大化法）、およびＯＳＥＭ（たとえばＭａｎｇｌｏｓ，ＳＨ、Ｇａｇｎｅ，ＧＭ、Ｋｒｏｌ Ａ、Ｔｈｏｍａｓ，ＦＤ、およびＮａｒａｙａｎａｓｗａｍｙ，Ｒの「Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｏｒｄｅｒｅｄ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｅ Ｂｅａｍ ＣＴ」、Ｐｈｙｓｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４０巻（７）、１２２５〜４１頁、１９９５年、＃４３８９で検討されているような順序部分集合期待値最大化法）が含まれる。
【００２２】
方法：
フロー・サイトメータ
ここで図５を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される流動性光学断層撮影システム（ＦＯＴ）の範例が概略で示されている。流動性光学断層撮影システムは、キャピラリ・チューブ２の周りに配置された再構成用シリンダ２０を備えたフロー・サイトメータを有する。フォトンの供給源２５とフォトン・センサ２６はパルス波高分析器２７と共に一体となって作用し、トリガ装置として動作する。パルス波高分析器２７は細胞の開始点に関する第１のトリガ・ポイント２８、および細胞の終結点に関する第２のトリガ・ポイント２９を供給するために知られている原理に従って動作する。パルス波高分析器２７は各々の細胞の開始点および終結点に相当するトリガ信号３０を出力し、そのトリガ信号は再構成用シリンダ２０によって受け取られる。
【００２３】
コンピュータ４０は信号線４１〜４３によって、送信データ、点光源２１に対する制御信号とタイミング信号、感知素子２３とパルス波高分析器２７に結合される。コンピュータは、知られているコンピュータもしくは複数のコンピュータと、画像収集および画像再構成処理に適したアレイ・プロセッサを有することも可能である。
【００２４】
市販のフロー・サイトメータは３種の基本的な流動用構造、いわばシリンダ状流管、方形流管および空気系内の流動を付随している（Ｓｈａｐｉｒｏ，ＨＭの「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９５年参照）。好ましい構造はシリンダ状流管であり、その理由は流動用ハードウェアに起因するいかなる放射方向依存性をも最小限にするために、再構成アルゴリズムにとって最適なシリンダ状幾何学形状を保つことが重要だからである（図１参照）。さらに、シリンダ状流管はキャピラリ・チューブの断面積に比べて一様に薄い壁を有することも可能である。
【００２５】
付け加えると、トリガ装置は、細胞が最適に入来してその後に再構成用シリンダから出現するときにデータ収集を開始してその後に終結するためのタイミング信号を供給するために、再構成用モジュールから上流に配置されることが可能である。トリガ装置は、レーザ・ダイオード、ＣＣＤ、ＰＭＴ、光検出器の組合せ、ソリッド・ステートの光検出器、および前述の素子の組合せを含むことが好都合となる可能性がある。トリガ装置は流れる細胞の存在を感知し、その結果、下流の再構成用シリンダが対象となるその特定の細胞についてデータ収集を開始するときに判っている細胞速度と共に計算を行うのに使用され得るトリガ信号を発生する。さらに、再構成用シリンダに入出する細胞の入出点に相当する第１と第２のトリガ・ポイントの間の時間的間隔は等しいかもしくは異なる増分に分割されることも可能であり、それらの各々の間に光源（群）２１をストロボ点灯することによるか、もしくはセンサ・アレイ（群）２３を読み取ることによって追加的な投影データが入手されることもあり得る。
【００２６】
流速は正確に制御かつ測定される必要がある。この性能は１メートル／秒から１０メートル／秒の範囲の速度を使用する高性能の市販のシステムで提供される。最善の細胞速度は後に検討するようなデータ収集速度と信号対ノイズの配慮によって決定されるであろう。
【００２７】
再構成用モジュール
ここで図６を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダ２０内の扇形ビーム投影線の範例が概略で示されている。再構成用シリンダの目的は、複数の固定型点光源２１ａ〜２１ｃからシリンダ状キャピラリ・チューブ内へと内周に沿って光を投影する手段を提供することである。点光源から発射されたフォトンは扇形もしくは円錐形といった判っている投影幾何学形状を有し、キャピラリ・チューブを通り抜けることで、このケースではおそらく相当する点光源の反対側で外周に沿って配置された感知素子２３ａ、２３ｂまたは２３ｃのアレイによって検出される。扇形ビームの透照に適した曲線（１Ｄ）センサ・アレイが具体的説明の目的で描かれているが、円錐形ビームの照明に適した直線（１Ｄ）センサ・アレイまたは平面（２Ｄ）も同様に使用され得ることは理解されるべきである。この方式で、投影線のセットが発生される可能性があり、そこでは投影線は点光源と個々の感知素子を結ぶ直線として述べることができる。線３１のような特定の投影線に沿って点光源から出るフォトン数と特定の感知素子で受けられるフォトン数の間の差異は投影線の経路に沿った流管の細胞および他の内容物に起因して損失および減衰するフォトン数に関係する。
【００２８】
しかしながら、光の散乱、フォトン・エネルギーの変位、不完全な幾何学形状および粗悪な視準から厄介な問題が生じる可能性があり、かつ多数の点光源が同時に励起されるとき、異なる光源からフォトンが特定の感知素子に到達する可能性がある。再構成用シリンダの注意深い作製、たとえば、ここで述べたような点光源とそれらの対面する検出器のパターンに関する幾何学形状の慎重な選択、および多数の点光源の活性化とセンサ・アレイの読み取りの適切な時間調整もしくは多重化によって、これらの項目に起因するフォトンの混入は最小限にできるが、しかし除去されるわけではない。
【００２９】
フォトンの混入はシステムの校正によって、たとえば、細胞の不在下で対策されることが可能である。すなわち、各々の点光源が順々に照明されてセンサの各々に対するその影響が測定可能となり、それにより、システムの正規化に使用するためのオフセット・データを供給する。追加的な校正ステップ、たとえば、光学的特性が知られていて、かつ細胞画像化の対象となる密度範囲にかかるラテックス・ポリマー・ビーズまたはその他のミクロスフェアもしくは偏球の画像化が伴う可能性もある。蛍光発光プローブから発射されたフォトンは、後に検討するように検出部でスペクトル帯域通過フィルタの使用によってそれらの光源由来性から差別化されることも可能である。
【００３０】
光源
各々の光源は同じ総合的特性を有する可能性があり、好ましくは、
・それは小円形の点光源に近似する可能性があり、
・それは判っているスペクトル内容で輝度を有する可能性があり、
・光源から発射されたフォトンが円錐形ビームもしくは扇形ビームといった判っている幾何学形状を有する可能性がある。
各々の光源は１つの投影角度についてデータを作り出す。その軸が流管の中心軸である螺旋に沿って配列された複数の光源は、細胞がモジュールを通って流れるときに各々の連続した平面（もしくは再構成スライス）を通る多数の投影角度からデータを作り出す。センサの幾何学形状に応じて、いくつかの点光源は、センサ部で投影がオーバーラップしないように同じ円周上で同一線に並んで配置されることも可能である。良好なサンプリングの幾何学形状は、１８０度の螺旋に沿って光源が等距離で配置されることによって達成されることが可能であるが、いくつかの例ではさらに小さい角度カバレージも許容可能であり、信号対ノイズ比を向上させるためには３６０度が使用される可能性がある。望ましい光源数は各平面再構成（ｘ−ｙ平面）または容積再構成で必要な解像度の関数である。具体的説明のために点光源の螺旋配列が使用されているが、多様な幾何学形状のパターンが点光源アレイに使用され得ることは理解されるべきである。さらに、光源の波長は、さまざまなダイオードもしくはその他のレーザの使用によるか、あるいは白色もしくは他の広帯域光源、たとえば水銀もしくはキセノン・アーク・ランプの通過帯域フィルタ補正によるかのいずれかで選択することが可能である。
【００３１】
ここで図７を参照すると、本発明の実施形態によって考慮される図６に示した再構成用シリンダの上面の範例が概略で示されている。第１の点光源２１ａとセンサ・アレイ２３ａが、紙面に対して直角方向に流れる核１９を持つある細胞を供えて光源軌道のある投影で示されており、それは二次元で再構成円３２を構成しており、そこではたとえ一時的に振れのある様式で得られることはあってもすべての投影はオーバーラップするように描かれ、すべての細胞が含まれる。第２の点光源２１ｂと第２のセンサ・アレイ２３ｂは螺旋の周囲で約３０°の位置にある。第３の点光源２１ｃと第３のセンサ・アレイ２３ｃは螺旋の周囲で約９０°の位置にある。
【００３２】
データ収集は、細胞の「厚い」平面状軸方向断面内で細胞速度と同期してゲート制限される。所望の平面厚さはｚ方向で必要な解像度の関数である。通常、軸方向（ｚ方向）の解像度は平面状の軸横断方向よりも小さい。最善の再構成円もやはり、頂点に点光源を有して基部に感知用アレイの幅を有する投影扇形のオーバーラップする交差部によって規定される。再構成用シリンダは、流動する細胞の断面が再構成円の中に完全に含まれるのを確実化することが望ましい。
【００３３】
点光源を作製するのに使用可能ないくつかの選択肢があって、すなわち、
・レーザもしくはその他の高輝度フォトン供給源の前方のピンホール、
・微小断面を備えた光ファイバ、
・フォトン供給源前方の短焦点距離レンズ、
・リン表面のある点を照射する電子ビーム（ＣＲＴの形式）、
・以上のさまざまな組合せ、
といったものである。
【００３４】
幾何学形状は、関心事の対象物（細胞）に点光源が近づくにつれて、光源に近づく対象物によって範囲の決まる広い幾何学角度に起因して、倍率が高くなるようにされる。反対に、もしも必要な解像度がシステム設計よりも前に判っている場合、幾何学形状はその特定の解像度に関して最適化されることが可能である。背景に関しては、Ｂｌａｓｓ，Ｍが編集長を務めた「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｐｔｉｃｓ：Ｆｉｂｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｃｓ」、第２版、第４巻、Ｍｃｇｒａｗ−Ｈｉｌｌ、２００１年を当業者に推奨する。
【００３５】
ここで図８を参照すると、図８は本発明の実施形態によって考慮される細胞再構成に使用される直線アレイ２３の範例を概略で示している。たとえば、細胞の断面１２と核１９が直径３０ミクロンの再構成円の中に含まれて所望の解像度が０．５ミクロンであるという前提で、ナイキスト・サンプリング（すなわち因数２による過剰サンプリング）は各々の点光源２１について少なくとも１２０の感知素子３３が必要となることを決定付ける。頂点にある点光源２１と基部の線形アレイの長さ３４は、範例の直径３０ミクロンの細胞が可能な限り点光源２１に接近して三角形３５内に嵌まるように三角形３５を形成する。この範例では、もしも（たとえばＣＣＤ）アレイの各素子が幅２０ミクロンであってアレイ長さが２４００ミクロンであるならば、細胞の中心は点光源から約１００ミクロン（キャピラリ・チューブの直径の半分）に位置することが可能であり、そのとき点光源と線形アレイの間の距離は８ミリメートルであって、８０倍の倍率を与える。
【００３６】
第２の範例として、直径３０ミクロンの再構成円および画素の素子サイズが４ミクロンである相補的金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）の感知アレイを考える。このケースでは、アレイは４８０ミクロンの幅について１２０の素子を含むことが可能であり、かつ点光源と細胞の間の距離が１００ミクロンであるときにそれは点光源から１．６ｍｍに位置することが可能であって１６倍の倍率を与える。
【００３７】
感知素子
各々の点光源は、再構成円を通って透過するフォトン線を受けるように点光源の反対側で何らかの直線もしくは曲線の幾何学的配列にあるＣＣＤ群のような感知素子群の相当するアレイを有するであろう。通常では、線形アレイは点光源と流れの中心軸の間の線上に中心を置くその感知素子のアレイを有する可能性があり、流れの軸に対して直角に整列する可能性がある。２Ｄアレイ内の素子の各々の線のうちの部分集合だけが再構成入力のために読み取られる場合には２Ｄアレイを使用することが可能である。２Ｄアレイでは、複数素子の各々の連続した部分集合は、点光源の螺旋配列に沿って各々の異なる点光源と適切に整列させるために適切な数の素子で互い違いにされる可能性がある。
【００３８】
０．５ミクロンの解像度を得るために扇形あたり１２０の感知素子を備えて３０ミクロンの再構成円の範例を使用するスライスごとの扇形ビーム再構成については、２０００×２０００個の２０ミクロンの素子を備えた２Ｄアレイが、１半径度の増分で配列された１３６個の点光源を感知するのに充分であり、そこでは連続する景色間の平均オフセットは３００ミクロンであって、それは１５個の感知素子と同等である。（アレイの中央ではオフセットが１４０ミクロン、または７素子であるが、それに対してアレイのエッジでは１半径度は景色間でかなり大きなオフセットを伴う可能性がある。）もしも１スライスについて投影データを供給するのにセンサ・アレイの１５本の横列のグループが平均化された場合、細胞画像内のｚ解像度は３．７５ミクロンである可能性があり、それに対してもしも各々の投影について２本の横列が平均化された場合、対象物の軸方向解像度は軸横断方向の解像度と同等の０．５ミクロンである可能性がある。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、２Ｄアレイはシリンダの円周に沿って曲がっており、それが再構成用シリンダと同軸であることも可能であり、それによって複数の線経路が長さですべて等しくなる。３０ミクロンの再構成円のケースについては、点光源の螺旋座に対面するのに必要とされるだけの素子を有する曲線の２Ｄアレイは、上述の範例に関すると、高さ（長さ）で１３６素子の数倍であって１２０素子幅の螺旋状の帯片であることが可能である。
【００４０】
平面状のまたは「厚い」扇形照明が上記の具体的説明の目的で述べられているが、真の、視準されていない円錐形ビームの照明が２Ｄの平面状検出器と共に使用され、円錐形ビームのアルゴリズムを使用して３Ｄ再構成されることも可能であることは理解されるべきである。２Ｄの投影画像は、たとえば、細胞の疾病状態または形質転換状態に関する情報を得るために直接的に分析されることが可能である。直接的な容積性の円錐形ビームによる再構成に関すると、点光源群と検出器群の幾何学的配列が与えられるとさまざまな点光源から出る照明の円錐形がセンサ・アレイ上でオーバーラップしないように複数の点光源が多重化される。
【００４１】
さらに、もしも細胞が１メートル／秒（１，０００，０００ミクロン／秒）の速度で流れ、かつ２Ｄアレイの各素子が２０ミクロン幅であったならば、２０マイクロ秒ごとの線読み取りは細胞の０．２５ミクロンのスライス内で容易にデータを捕捉することができる。３．７５ミクロンのスライスについてデータを供給するために１５本のセンサ横列が平均化されるときのケースでは、読み取りは３００マイクロ秒ごとに生じなければならないであろう。さらに大きな２Ｄアレイを使用して再構成画像品質に有意な改善が達成される。
【００４２】
いくつかの透過もしくは発光波長帯域の多スペクトル性の画像化に特に適した本発明の一実施形態は直列に配置された２つ以上の再構成用モジュールを都合よく含むことが可能である。そのような多重の再構成用シリンダはキャピラリ・チューブの介在区画によって分離されることが可能であり、各々のモジュールが、それを通って流れる対象物の完全な再構成画像を生じるのに適した投影データを供給する。いくつかの再構成用モジュールの各々に関する点光源および／またはセンサ・アレイは特定のスペクトル帯域について最適化される可能性がある。たとえば、第１の再構成用モジュールが極めて強い白色光照明とフィルタ補正のない検出を使用して対象物の光学密度、吸収もしくは散乱係数のマップを再構成するために完全な投影データのセットを供給し、それに対して第２の再構成用モジュールが、４９５ｎｍ付近に中心を置く狭いスペクトル帯域でアルゴンイオン・レーザ（４８８ｎｍ）のような照明を使用することで、５２０ｎｍ発光に感受性のあるフィルタ補正されたセンサ・アレイと共に蛍光免疫の研究のための蛍光発光プローブをラベルしたタンパク質を励起して、後に述べるように発光再構成アルゴリズムを使用することによってラベル化タンパク質の濃度分布をマップ化するのに充分な第２の完全な投影データ・セットを供給することも可能である。さらに第３の再構成用モジュールが、化学量論的にＤＮＡに結合されたヨウ化プロピジウムを励起するために５３５および／または３４２ｎｍ付近に中心を置く狭帯域の照明を使用し、倍数性の研究用に赤色（６１７ｎｍ）発光を最適に検出するためのフィルタ補正されたセンサ・アレイを使用することも可能である。前述の範例が具体的説明を目的とするものであり、本方法が、概して、照明と感知のためのいかなる波長の組合せに対しても当てはまることは理解されるであろう。
【００４３】
画像再構成
フィルタ補正逆投影法として知られている最も一般的でかつ容易に実行される再構成アルゴリズムは、円錐形ビームおよび扇形ビームの幾何学形状を使用するコンピュータ利用のＸ線断層撮影法（ＣＴ）の類似したパラダイムから派生している（たとえば以下の参考資料、すなわち、Ｋａｋ，ＡＣとＳｌａｎｅｙ，Ｍの「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ」、ＩＥＥＥ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８年、およびＨｅｒｍａｎ，Ｇの「Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０年参照）。これらの方法は、光源／検出器構造および照射ビームの線経路の特定の幾何学形状を反映する変更を伴うラドン変換の法則に基づいている。しかしながら、臨床Ｘ線ＣＴのケースでは、スライスごとの収集について、所定のスライス内で多数の投影角度からデータを集めるためにＸ線源と検出器アレイが患者周囲の円弧に沿って移動する可能性のある間は人間の被検者は普通では不動に保たれる。その後、人間の被検者はｚ軸に沿って姿勢を取り直され、別のデータ・スライスを収集するなどがなされる。場合によっては、さらに最新の臨床螺旋ＣＴでは患者はｚ方向に連続的に平行移動され、その間に螺旋投影データを供給するために光源−検出器組み立て体が連続的に回転し、その後、それは患者のｚ軸に対して直角の投影を供給するために間隔をつめられる。流動性光学断層撮影法では、被検体（細胞）は静止した光源と検出器アレイに関して一定の速度で移動させられ、そこでは複数の光源／検出器システムが、所定のスライスもしくは容積内で多数の投影角度のデータを発生する様式で、細胞速度ベクトルに沿った特定のゲート時間点と同期してデータを得る。スライスごとの走査については、再構成アルゴリズムが移動の軸に対して直交する平面の２Ｄ画像を計算するであろうし、多数のスライスの順次の積層が被検体の３Ｄ像を発生するであろうし、そこではコントラストはＣＴもしくは流動性光学断層撮影の被検体内のＸ線の減衰係数または光学密度それぞれの関数である。容積性の円錐形ビームの走査については、再構成アルゴリズムが細胞もしくは他の対象物内の容積の３Ｄ像を平面の透過もしくは発光光学投影から直接的に計算し、そこではコントラストは画像化対象物内の光学密度分布および／またはタグ付きプローブ密度分布それぞれの関数である。
【００４４】
フィルタ補正逆投影以外の画像再構成アルゴリズムを使用するために、透過のデータが細胞の光学密度の再構成を生じるか、または発光のデータがラベル化プローブの分布を再構成するか、またはその両方が生じるかのいずれかであることが望まれる可能性がある。いくつかの例では反復性再構成アルゴリズムとして知られている一般的部類がさらに効果的であり、特に、発光の断層撮影法に関して、あるいは、対象物の軸対称性と３区分の性質が判っている現在の発明の例のように、再構成の品質を高めるために再構成アルゴリズムに先行情報を取り入れることが可能なときにそうである（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐの「Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｏｂｊｅｃｔ ｆｒｏｍ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６巻、１０５〜１７頁、１９７２年、および前に記した他の参考資料参照）。
【００４５】
同様に、ある方法は、都合のよいことに、有限要素モデル化（ＦＥＭ）に基づく統計学的再構成アルゴリズムを使用することが可能である。ＦＥＭアルゴリズムは、フォトンの拡散／移動が素子の結合すべてで解決されることで画像化対象物の吸収、散乱、屈折率および異方性因子の特性の何らかの組合せの二次元もしくは三次元マップを生じるという線形輸送理論から派生している。そのような方法の範例は、Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＪｉａｎｇ，Ｈの「Ｓｐａｔｉａｌｌｙ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｆｉｎｉｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２２巻（６９１〜７０１頁）１９９５年、Ｈａｍｐｅｌ，ＵとＦｒｅｙｅｒ，Ｒの「Ｆａｓｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ Ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ Ｒａｄｉａｌｌｙ Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（１）、９２〜１０１頁、１９９８年、およびＪｉａｎｇ，Ｈ，Ｐａｕｌｓｅｎ，ＫＤとＯｓｔｅｒｂｅｒｇ，ＵＬの「Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ−ｄｏｍａｉｎ Ｎｅａｒ−ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｐｈｏｔｏ Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｉｎｉｔｉａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｔａｒｇｅｔ Ｔｉｓｓｕｅｌｉｋｅ Ｐｈａｎｔｏｍｓ」、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ 第２５巻（２）、１８３〜９３頁、１９９８年に教示されている。
【００４６】
色彩分別
もしも多色点光源（たとえば白色光）が使用されるならば、いくつかの分子プローブおよび所定の細胞内の構造的特長を見分けるのに異なる色彩の染色液（たとえば発色団）を利用することが可能である。ここでは、光源もしくは感知アレイ（または両方）で直列に並んだ複数の帯域通過フィルタが波長データを分離し、個々の染色された分子群の再構成および場所の特定を可能にする。多数のプローブを画像化するためのさらに強力な方法は、極めて強い白色光源およびセンサ・アレイ内の複数フィルタ補正された帯域幅の同時収集を含み、その結果、再構成アルゴリズムが各発色団について空間的画像スライスを計算するのを可能にする。これらが彩色化された画像として表示されることは可能である。
【００４７】
蛍光、燐光、化学発光およびナノ粒子発光
流動性光学断層撮影システムの特別のケースとして、ある分子プローブは、フォトンの一次供給源によって励起されると異なる（長い）波長の光を発する「レポータ」でタグ付けされることが可能である。レポータからの二次発光は、二次発光のフォトンから一次光源のフォトンを分離するために標準的な光学フィルタでフィルタ処理ことが可能である。しかしながら、二次発光フォトンの画像再構成アルゴリズムはさらに複雑であって、なぜならば二次フォトンは必ずしも点光源から直接の線経路で生じるとは限らないからである。もしも二次フォトンが一様な球形パターン内の二次点光源から発するならば、いかなる感知素子に到達する二次フォトンの強度も感知素子までの距離の単純な関数であろう。点光源との関連、および再構成スライス内の二次フォトンの空間的分布のモデルを供給することによって二次光源から出るフォトンの非球形分布に関してさらなる改良が対策されることも可能である。いずれの方法も再構成スライスもしくは容積内の二次光源の場所を計算する手段を供給するであろう。画像化対象物と検出器アレイ（群）の間の視準化が画像再構成を向上させるであろう。
【００４８】
もしも一次フォトン強度と二次フォトン強度が光学的フィルタ補正によって同時に測定されるならば、一次フォトンの強度から得られる高解像度の密度再構成は、場所の特定されたプローブ濃度と共に画像の形態が単一の再構成画像で利用可能となるように、二次光源の再構成に重畳されるかもしくはそれと融合されることが可能である。強度、信号対ノイズ、および光源および／またはセンサ部でフォトンの狭帯域幅をフィルタ抽出もしくは発生する能力に応じて、各々が異なるタグ付き分子プローブに対応する多数の二次光源を利用することが好都合となる可能性がある。
【００４９】
２００１年３月１３日にＢａｓｉｊｉらに公布された「Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｃａｎｎｅｒ」というタイトルの米国特許第６，２０１，６２８号は、自動化され、高速かつ高感度の被検体の蛍光、光学密度もしくは燐光を得るように供給された走査装置を開示している。このスキャナは、高速走査用の移動ビームとノイズ低減用の位相感受性検出の組合せを可能にする一定の経路長の光学列を使用し、光源、光源から光を受け、ステアリング・ミラーを横切ってそれを掃引するための走査ミラー、走査ミラーから光を受けてそれを被検体へと反射し、それによって、走査円弧に沿って被検体を横切って掃引されるステアリング・ミラー、および被検体から発光もしくは散乱された光を受けるための光検出器を有し、光源から光検出器までの長さは被検体を横切る掃引を通じて実質的に一定である。光学列は被検体から発射もしくは散乱された光を収集してそれを光検出器へと向けるための導波路もしくはミラーをさらに含むことも可能である。位相感受性の検出に関すると、光源が輝度変調され、検出器が位相感受性の検出用電子装置に接続される。被検体の平行移動を使用するスキャナもやはり供給される。二次元の画像化については、被検体が１つの方向に平行移動され、その間に走査ミラーがビームを第２の方向で走査する。高処理能力スキャナについては、被検体の積み重ねがトレイ・フィーダからコンベヤ・ベルトに搭載される。米国特許第６，２０１，６２８号はここでは参考資料で取り入れられている。
【００５０】
ここでは特許法に準拠してかつ本発明の新規性のある原理を適用し、必要とされるような範例と特化した構成要素を作製および使用するのに必要な情報を当業者に提供するために、本発明をかなり詳細に説明してきた。しかしながら、本発明が特異的に異なる機器、装置および再構成アルゴリズムによって実行される可能性があること、および本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、機器の詳細と操作の手法の両方についてさまざまな改造が達成される可能性があることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の実施形態によって考慮されるフロー・サイトメトリ・システムの範例となる具体例を示す概略図である。
【図２】本発明の実施形態によって考慮される単一細胞の流動ステップの範例となる具体例を示す概略図である。
【図３】この図中Ａは、本発明の実施形態によって考慮される細胞の再構成の範例となる具体例を示し、図Ｂは、本発明の実施形態によって考慮される細胞断面の再構成の範例となる具体例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダの範例を示す概略図である。
【図５】本発明の実施形態によって考慮される流動性光学断層撮影（ＦＯＴ）システムの範例を示す概略図である。
【図６】本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダ内の投影線の範例を示す概略図である。
【図７】本発明の実施形態によって考慮される再構成用シリンダの上面の範例を示す概略図である。
【図８】本発明の実施形態によって考慮される、細胞再構成に使用される光源／リニヤ・アレイの幾何学構造の範例を示す概略図である。
Claims (66)
- 微細対象物の画像化および分析のための流動性光学断層撮影法であって、
（ａ）注入チューブ（３）に少なくとも１つの対象物を注入するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの対象物が流れの軸に沿って細長く延び、かつキャピラリ・チューブ（２）の中心軸（９）に沿って近接して移動するようにキャピラリ・チューブ（２）を通る少なくとも１つの対象物の流れを制御するステップと、
（ｃ）キャピラリ・チューブ（２）の円周の周りに配置された少なくとも１つの光学的点光源（２１）で、少なくとも１つの対象物内に焦点面が存在しないようにキャピラリ・チューブ（２）からある距離を置かれて少なくとも１つの光学的点光源（２１）の反対側に配置された少なくとも１つの対面する光学的センサ（２３）と共にサンプリングするステップであって、物体が少なくとも１つの光学的点光源（２１）と少なくとも１つの対面する光学的センサ（２３）を過ぎて流れるとき、少なくとも１つの対象物を通る多数の投影角度がサンプリングされるステップと、
（ｄ）各々のタイミング信号（２８、２９）が少なくとも１つの対象物のｚ方向の軸（９）に沿った特定の位置で合致して、それにより少なくとも１つの対象物を通る時間調節された光学的投影のセットを発生するように一連のタイミング信号（２８、２９）を発生するステップとを含む方法。 - 時間調節された光学的投影のセットを再構成することで二次元（２Ｄ）スライスを形成するステップをさらに含む、請求項１の方法。
- 時間調節された光学的投影のセットを再構成することで三次元（３Ｄ）容積を形成するステップをさらに含む、請求項１の方法。
- 少なくとも１つの対象物の三次元（３Ｄ）画像を作り出すために順番に並んだ２Ｄスライスを組み合わせるステップをさらに含む、請求項２の方法。
- 光学的投影が二次元（２Ｄ）の光学的投影を含み、二次元（２Ｄ）の光学的投影から少なくとも１つの対象物の三次元（３Ｄ）の画像を作り出すステップをさらに含む、請求項１の方法。
- 少なくとも１つの対象物が一定の速度（Ｖ）で移動するようにキャピラリ・チューブ（２）内に層流を発生させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
- 少なくとも１つの対象物が細胞（１）である、請求項１の方法。
- 微細構造体の定量的測定値を生じるように３Ｄ画像を使用するステップをさらに含む、請求項５の方法。
- 微細構造体が亜細胞構造体を含む、請求項８の方法。
- 少なくとも１つの対象物が、その中に少なくとも１つのタグ付き分子プローブを有する細胞（１）を含み、少なくとも１つのタグ付き分子プローブの場所と量を決定するために３Ｄ画像を使用するステップをさらに含む、請求項５の方法。
- 少なくとも１つの対象物が、その中に少なくとも１つの分子プローブを有する細胞（１）を含み、そこでは分子プローブが分子プローブの情報を供給し、本方法が、特定の亜細胞構造体と少なくとも１つの分子プローブの間のいかなるつながりも確認するように２Ｄスライスと分子プローブ情報を組み合わせるステップをさらに含む、請求項２の方法。
- 少なくとも１つの対象物が細胞（１）を含み、本方法が、投影によってサンプリングされる空間が少なくとも３つの区分、すなわち
（ａ）細胞（１）の外側の流体、
（ｂ）細胞質（１８）、および
（ｃ）細胞核（１９）
で構成されるとモデル化されるように、細胞の画像化および分析のために再構成円内で動作するステップをさらに含む、請求項１の方法。 - （ａ）少なくとも１つの分子プローブのうちのあるものが細胞の壁（１２）と核の壁（１３）の表面だけに結合する場合に、細胞の壁（１２）と核の壁（１３）を含む境界面を計算するステップ、および
（ｂ）そうでないときに細胞の壁（１２）と核の壁（１３）を３つの異なる区分の間の遷移表面として特徴付けるステップをさらに含む、請求項１２の方法。 - （ａ）細胞質（１８）の核（１９）に対する遺伝子産物の相対的過剰もしくは過少発現を測定するステップ、および
（ｂ）バックグラウンドの懸濁流体中の非結合プローブを正規化するステップをさらに含む、請求項１２の方法。 - 遺伝子産物がタンパク質である場合に、細胞（１）の疾病状態および形質転換状態のうちの少なくとも１つを評価するためにタグ付き抗体プローブを使用するステップをさらに含む、請求項１４の方法。
- 遺伝子産物がタンパク質である場合に、細胞（１）の疾病状態および形質転換状態のうちの少なくとも１つを評価するために核酸プローブを使用するステップをさらに含む、請求項１４の方法。
- 微細対象物の画像化および分析のための流動性光学断層撮影システムであって、
（ａ）キャピラリ・チューブ（２）を有するフロー・サイトメータ、
（ｂ）キャピラリ・チューブ（２）の周囲に位置する少なくとも１つの再構成用シリンダ（２０）、および
（ｃ）少なくとも１つの対象物に関するトリガ信号（２８、２９）を作り出すためにキャピラリ・チューブ（２）を通って流れる少なくとも１つの対象物を視認するように配置されたトリガ装置（２５、２６、２７）を含み、そこではトリガ信号（２８、２９）が少なくとも１つの再構成用シリンダ（２０）によって受けられ、少なくとも１つの再構成用シリンダ（２０）が少なくとも１つの対象物に関する投影画像を表わす信号群を作り出すことによってトリガ信号（２８、２９）に対応し、少なくとも１つの対象物に関する三次元情報を供給するためにその信号群が処理される流動性光学断層撮影システム。 - 少なくとも１つの対象物がキャピラリ・チューブ（２）を通って速度（Ｖ）で移動し、そこでは少なくとも１つの対象物が細胞質の壁と細胞核の壁（１３）を有する細胞（１）を含み、さらに、キャピラリ・チューブ（２）を通って流れる過程で細胞（１）が複数の再構成平面を通過し、細胞核の壁（１３）を通る平面状スライスが各々の再構成平面内にあり、再構成平面間の距離（ｄ）が通常は１０ミクロンよりも小さく、かつ各々の細胞（１）内の点が時間的間隔（ｔ）を置いて各々の再構成平面で一致し、時間的間隔が、
ｔ＝ｄ÷Ｖ
の関係で述べられる、請求項１７の流動性光学断層撮影システム。 - 細胞（１）が疾病診断用の少なくとも１つのタグ付き分子プローブでラベルされる、請求項１８の流動性光学断層撮影システム。
- （ａ）軸に沿って近接して流れる少なくとも１つの対象物の速度（Ｖ）を制御するための手段、
（ｂ）少なくとも１つの対象物の三次元（３Ｄ）画像を作成するために少なくとも１つの対象物の軸（９）に沿って再構成の二次元（２Ｄ）平面を配置するための手段、および
（ｃ）二次元（２Ｄ）の投影データのセットもしくは複数セットから細胞（１）の三次元（３Ｄ）画像を作成するために再構成用シリンダ内で少なくとも１つの対象物の位置を正しく配置するための手段（２７、４０）をさらに含む、請求項１７の流動性光学断層撮影システム。 - 少なくとも１つの再構成用シリンダが、
（ａ）予め決められた螺旋ピッチで配置された複数点光源（２１）の螺旋を含み、そこでは各々の点光源（２１）がフォトンのビーム（２２）を発生し、ビーム（２２）が扇形もしくは円錐形の形状を有し、少なくとも１つの対象物を通る多数の投影をさまざまな角度配向で発生するように少なくとも１つの対象物が複数点光源の螺旋を通過し、
（ｂ）キャピラリ・チューブの軸（９）と同軸の少なくとも１つのシリンダ（２０）の周囲である幾何学パターンに配置された点光源（２１）の座を含み、かつ
（ｃ）そこでは少なくとも１つの対象物を通る放射投影として通過し、かつ点光源（２１）に対面する少なくとも１つのセンサ（２３）によって検出されるフォトンを点光源（２１）が発射する、請求項１７のシステム。 - 複数の再構成用シリンダ（２０）が直列に配置され、そこでは流管を通過する少なくとも１つの対象物を照明する光源（２１）がＸ線から遠赤外線の電磁スペクトルにわたる波長で発光することのできる、請求項２１のシステム。
- 再構成用シリンダ（２０）内および／または間の光源がそれらの発光スペクトルで異なる、請求項２２のシステム。
- 発光スペクトルが、蛍光免疫染料およびタグの最大励起付近に中心を置く狭帯域スペクトルを含む、請求項２３のシステム。
- 複数の再構成用シリンダ（２０）が直列に配置され、そこでは光センサ・アレイ（２３）が、蛍光免疫研究および倍数性研究のうちの少なくとも１つに使用されるフルオロフォアによって発される波長に対する感受性に関してスペクトルの面で帯域通過フィルタ補正される、請求項２２のシステム。
- 複数の再構成用シリンダ（２０）が、介在するキャピラリ・チューブ（２）の区画を備えて直列に配置される、請求項２２のシステム。
- 発光波長の範囲が１０オングストロームから２０００ミクロンの電磁スペクトルにわたる、請求項２２のシステム。
- 複数の点光源（２１）が、少なくとも１つの対象物が点光源（２１）のアレイを通過するときにその中の各々の点が多数の角度からサンプリングされるようにキャピラリ・チューブ（２）上の幾何学パターンに沿って配置される、請求項１７のシステム。
- 幾何学パターンが螺旋パターンを含む、請求項２８のシステム。
- 点光源（２１）が円周のいかなる角度範囲もカバーし、かつ少なくとも１８０度に沿って等角度の増分で間隔を置かれる、請求項２９のシステム。
- キャピラリ・チューブ（２）がキャピラリ流の断面積に関して一様に薄い壁を有する、請求項１７のシステム。
- トリガ装置（２５、２６）が、少なくとも１つの対象物が再構成用シリンダに入ってそれから出て行くときにデータ収集を開始してそれから終結させるためにタイミング信号を供給するように、再構成用モジュールから上流に配置される、請求項１７のシステム。
- トリガ手段が、レーザ・ダイオード、ＣＣＤ、ＰＭＴ、ソリッド・ステート光検出器および前述素子の組合せで構成されるグループから選択される素子を含む、請求項１７のシステム。
- トリガ手段が、下流の再構成用モジュールが関心事の少なくとも１つの対象物についてデータ収集を開始することができるときに、少なくとも１つの対象物の速度（Ｖ）と併せて算出に使用されるトリガ信号を発生する、請求項１７のシステム。
- トリガ手段（２５、２６、２７）が、上流のトリガ信号（２８、２９）のセットに基づいて、そのときの増分で下流の再構成用モジュールが投影のデータの多数セットの入手へと進むのに合わせて、少なくとも１つの対象物の速度（Ｖ）と併せて点を算出するのに使用されるトリガ信号（２８、２９）を発生する、請求項３４のシステム。
- キャピラリ・チューブ（２）が１メートル／秒から１０メートル／秒の範囲の速度を生じるように作製される、請求項１７のシステム。
- 再構成用シリンダ（２０）が複数の固定型点光源（２１）からキャピラリ・チューブ（２）に入る投影線を発生し、点光源から発射されたフォトンが、対象物内に焦点面が存在しないように選択された投影の幾何学形状を有する点光源から発射される、請求項１７のシステム。
- 選択された投影の幾何学形状が円錐形の形状と扇形の形状で構成されるグループから選択される、請求項３７のシステム。
- 投影線が、感知素子の少なくとも１つのアレイによって検出される少なくとも１つの対象物を通り抜ける、請求項３７のシステム。
- （ａ）感知素子の少なくとも１つのアレイ（２３）が対応する点光源（２１）の反対側に配置され、そこではアレイ（２３）がいかなる幾何学パターンにも配置され、
（ｂ）感知素子の少なくとも１つのアレイ（２３）が光学的帯域通過フィルタを有し、そこでは通過するスペクトル帯域が複数の再構成用モジュール（２０）内または間のいずれの感知アレイについても異なる、請求項３９のシステム。 - システムを正規化するためにオフセット・データが供給される、請求項１７のシステム。
- システムが、ｉ）流管中にいかなる少なくとも１つの対象物も存在しないときに画像が入手され、ｉｉ）判っている光学的特性の少なくとも１つの対象物の画像が入手されることによって校正される、請求項４１のシステム。
- 校正データが再構成される、請求項４２のシステム。
- 判っている光学的特性の少なくとも１つの対象物が、ラテックス・ミクロスフェア、ポリマー・ミクロスフェア、および偏球で構成されるグループから選択される、請求項４２のシステム。
- 各々の点光源が円形の点光源を含む、請求項３７のシステム。
- 再構成円が、頂点の点光源と基部の感知アレイの幅からなる投影の扇形を半径方向でオーバーラップさせることによって規定される、請求項３７のシステム。
- 点光源が、
（ａ）レーザの前方のピンホール、
（ｂ）光ファイバ、
（ｃ）フォトン供給源の前方の短焦点距離レンズ、
（ｄ）リン表面上の点を照射する電子ビーム、
（ｅ）高輝度フォトン供給源、および
（ｆ）以上の素子（ａ）から（ｅ）のいずれかの組合せ、
で構成されるグループから選択される点光源装置を含む、請求項３７のシステム。 - 感知素子のアレイが、電荷結合素子（ＣＣＤ）、フォトダイオード、ＣＭＯＳ、ＣｄＺｎＴｅ、ＭｇＩセンサ、ソリッド・ステート・センサ、線形配列を含むあらゆる幾何学配列のフォトン感受性の素子アレイで構成されるグループから選択される素子を含む、請求項３７のシステム。
- 感知素子のアレイが、点光源と流れの中心軸の間の線上に中心を置く、請求項４８のシステム。
- 感知素子のアレイが流れの軸に対して直角に整列する、請求項４９のシステム。
- 点光源（２１）の螺旋配列に沿って各々の異なる点光源と適切に整列するように互い違いになった連続する素子の部分集合を有する複数の固定型点光源をさらに含む、請求項２９のシステム。
- 感知素子のアレイ（２３）が、再構成用シリンダ（２０）と同軸であるシリンダ状の円周に沿って曲がっている、請求項２９のシステム。
- 再構成用シリンダ（２０）が、フィルタ補正逆投影アルゴリズムを使用して再構成される画像信号を供給し、そこではアルゴリズムが移動の軸に対して直角をなすスライスの二次元（２Ｄ）画像を算出し、多数スライスの順次の積層が少なくとも１つの対象物の三次元（３Ｄ）画像を生じ、コントラストが少なくとも１つの対象物内の光学密度の関数である、請求項１７のシステム。
- 所定の細胞（１）内でいくつかの分子プローブおよび構造的特徴を見分けるために発色団が使用される、請求項１７のシステム。
- 波長データを分離し、個々に染色された分子群の再構成および空間的に場所を特定することを可能にするために再構成用シリンダに結合された直列の帯域通過フィルタをさらに含む、請求項１７のシステム。
- 極めて強い白色光源で少なくとも１つの対象物を照明し、かつ多重フィルタ補正された帯域幅を同時に収集するステップをさらに含む、請求項１の方法。
- （ａ）フォトンの一次供給源によって励起されると異なる波長の光を発するレポータで分子プローブをタグ付けするステップ、および
（ｂ）二次発光フォトンから一次光源フォトンを分離するためにレポータから出る二次発光をフィルタ抽出するステップをさらに含む、請求項１の方法。 - 再構成用シリンダ（２０）が微細加工技術によって作製される、請求項１７のシステム。
- 微細対象物の画像化および分析のための流動性光学断層撮影システムであって、その方法がパルス波高分析器（２７）、フォトンの供給源およびフォトン・センサ（２３）を含み、そこではフォトンの供給源およびフォトン・センサ（２３）がパルス波高分析器（２７）と一緒になってトリガ装置として動作し、パルス波高分析器（２７）が少なくとも１つの対象物の開始点に関する第１のトリガ・ポイント（２８）、および少なくとも１つの対象物の終結点に関する第２のトリガ・ポイント（２９）を提供し、対象物の速度（Ｖ）と位置を各々の投影スライスに同期させるために再構成シリンダに送達される対応トリガ信号を発生するシステム。
- 細胞（１）が少なくとも１つの分子プローブを含み、そこでは分子プローブが分子プローブ情報を供給し、方法が、特定の亜細胞構造体と少なくとも１つの分子プローブの間のいかなるつながりも確認するように３Ｄの容積と分子プローブ情報を組み合わせるステップをさらに含む、請求項３の方法。
- 細胞（１）が少なくとも１つの分子プローブを含み、そこでは分子プローブが分子プローブ情報を供給し、方法が、特定の亜細胞構造体と少なくとも１つの分子プローブの間のいかなるつながりも確認するように３Ｄ画像と分子プローブ情報を組み合わせるステップをさらに含む、請求項４の方法。
- 細胞（１）が少なくとも１つの分子プローブを含み、そこでは分子プローブが分子プローブ情報を供給し、方法が、特定の亜細胞構造体と少なくとも１つの分子プローブの間のいかなるつながりも確認するように３Ｄ画像と分子プローブ情報を組み合わせるステップをさらに含む、請求項５の方法。
- 細胞（１）の疾病状態もしくは形質転換状態を評価するために投影画像を直接的に処理および分析するステップをさらに含む、請求項７の方法。
- 細胞（１）の疾病状態もしくは形質転換状態を評価するために投影画像のセットを直接的に処理および分析する手段をさらに含む、請求項２０のシステム。
- 再構成の容積が、頂点の点光源と基部の感知アレイの幅からなる投影の円錐形を半径方向にオーバーラップさせることによって規定される、請求項３７のシステム。
- 再構成用シリンダ（２０）が、フィルタ補正逆投影アルゴリズムを使用して再構成される画像信号を供給し、そこではアルゴリズムが移動の軸に対して直角をなすスライスの二次元（２Ｄ）画像を算出し、多数スライスの順次の積層が少なくとも１つの対象物の三次元（３Ｄ）画像を生じ、コントラストが少なくとも１つの対象物内のプローブ発光密度の変化の関数である、請求項１７のシステム。
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