JP2004529907A - How to treat restenosis - Google Patents

Abstract

The present invention relates to a method of inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell by contacting the adhesion molecule or the endothelial cell with one or more isoflavone compounds or derivatives thereof. The present invention relates to a method of preventing or reducing the risk of restenosis after angioplasty, and to treating or preventing atherosclerosis, coronary artery disease, other cardiovascular and inflammatory diseases mediated by adhesion molecules On how to do it. The invention further relates to pharmaceutical compositions useful for these methods, and to methods for making such medicaments.

Description

【００４６】
式中、
Ｒ_１、Ｒ_２およびＺは、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ_９、ＯＣ(Ｏ)Ｒ_１０、ＯＳ(Ｏ)Ｒ_１０、ＣＨＯ、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ_２Ｒ_１０、ＣＯＮＲ_３Ｒ_４、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルキルアリール、アルコキシアリール、チオ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロまたはハロであり、あるいは
Ｒ_２は先に定義したとおりであり、かつ、Ｒ_１およびＺはそれらが結合される炭素原子と一緒になって、次の化学式から選択される５員環を形成し、
【００４７】
【化１５】

【００４８】
あるいは、Ｒ_１は先に定義したとおりであり、かつＲ_２およびＺはそれらが結合される炭素原子と一緒になって、次の化学式から選択される５員環を形成し、
【００４９】
【化１６】

【００５０】
かつ、ＷはＲ_１であり、Ａは水素、ヒドロキシ、ＮＲ_３Ｒ_４またはチオであり、そしてＢは次の化学式から選択され、
【００５１】
【化１７】

【００５２】
あるいは、ＷはＲ_１であり、かつＡおよびＢはそれらが結合される炭素原子と一緒になって次の化学式からから選択される６員環を形成し、
【００５３】
【化１８】

【００５４】
あるいは、Ｗ、ＡおよびＢは、それらが会合される基と一緒になって、次の化学式から選択され、
【００５５】
【化１９】

【００５６】
あるいは、ＷおよびＡはそれらが会合される基と一緒になって、次の化学式から選択され、
【００５７】
【化２０】

【００５８】
かつ、Ｂは次の化学式から選択され、
【００５９】
【化２１】

【００６０】
この場合、
Ｒ_３は、水素、アルキル、アリールアルキル、アルケニル、アリール、アミノ酸、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は水素、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアミノ酸である）、またはＣＯ_２Ｒ_１２（ここで、Ｒ_１２は水素、アルキル、ハロアルキル、アリールまたはアリールアルキルである）であり、
Ｒ_４は、水素、アルキルまたはアリールであるか、あるいは
Ｒ_３およびＲ_４はそれらが結合される窒素と一緒になって、ピロリジニルまたはピペリジニルを構成し、
Ｒ_５は、水素、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）またはＣＯ_２Ｒ_１２（ここで、Ｒ_１２は先に定義したとおりである）であり、
Ｒ_６は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アリール、アミノ、チオ、ＮＲ_３Ｒ_４、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）、ＣＯ_２Ｒ_１２（ここで、Ｒ_１２は先に定義したとおりである）またはＣＯＮＲ_３Ｒ_４であり、
Ｒ_７は、水素、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アリール、アリールアルキルまたはＳｉ（Ｒ_１３）_３（ここで、Ｒ_１３は各々独立して、水素、アルキルまたはアリールである）であり、
Ｒ_８は、水素、ヒドロキシ、アルコキシまたはアルキルであり、
Ｒ_９は、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキル、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）またはＳｉ（Ｒ_１３）_３（ここで、Ｒ_１３は先に定義したとおりである）であり、
Ｒ_１０は、水素、アルキル、ハロアルキル、アミノ、アリール、アリールアルキル、アミノ酸、アルキルアミノまたはジアルキルアミノであり、
描画「---（破線と実線の二重線）」は、単結合または二重結合を表し、
Ｔは、独立して水素、アルキルまたはアリールであり、
Ｘは、Ｏ、ＮＲ_４またはＳであり、かつ
Ｙは、次式である
【００６１】
【化２２】

【００６２】
式中、Ｒ_１４、Ｒ_１５およびＲ_１６は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ_９、ＯＣ(Ｏ)Ｒ_１０、ＯＳ(Ｏ)Ｒ_１０、ＣＨＯ、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ_２Ｒ_１０、ＣＯＮＲ_３Ｒ_４、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、チオ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロまたはハロである。
【００６３】
本発明は、特に次の一般式II〜ＶIIIの化合物の使用に関する：
【００６４】
【化２３】

【００６５】
式中、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_１４、Ｒ_１５、ＷおよびＺは上記に定義したとおりであり、
さらに好ましくは
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_１４、Ｒ_１５、ＷおよびＺは、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ_９、ＯＣ(Ｏ)Ｒ_１０、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ_２Ｒ_１０、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキル、アリール、チオ、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロまたはハロであり、
Ｒ_５は、水素、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は水素、アルキル、アリールまたはアミノ酸である）、またはＣＯ_２Ｒ_１２（ここで、Ｒ_１２は水素、アルキルまたはアリールである）であり、
Ｒ_６は、水素、ヒドロキシ、アルキル、アリール、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）、またはＣＯ_２Ｒ_１２（ここで、Ｒ_１２は先に定義したとおりである）であり、
Ｒ_９は、アルキル、ハロアルキル、アリールアルキルまたはＣ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）であり、かつ
Ｒ_１０は、水素、アルキル、アミノ、アリール、アミノ酸、アルキルアミノまたはジアルキルアミノであり、
【００６６】
さらに好ましくは、
Ｒ_１およびＲ_１４は独立して、ヒドロキシ、ＯＲ_９、ＯＣ(Ｏ)Ｒ_１０またはハロであり、
Ｒ_２、Ｒ_１５、ＷおよびＺは独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ_９、ＯＣ(Ｏ)Ｒ_１０、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１０、ＣＯＯＨ、ＣＯ_２Ｒ_１０、アルキル、ハロアルキルまたはハロであり、
Ｒ_５は、水素、Ｃ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は水素またはアルキルである）またはＣＯ_２Ｒ_１２（Ｒ_１２は水素またはアルキルである）であり、
Ｒ_６は、水素またはヒドロキシであり、
Ｒ_９は、アルキル、アリールアルキルまたはＣ(Ｏ)Ｒ_１１（ここで、Ｒ_１１は先に定義したとおりである）であり、かつ
Ｒ_１０は、水素またはアルキルであり、
【００６７】
さらに好ましくは、
Ｒ_１およびＲ_１４は、独立して、ヒドロキシ、メトキシ、ベンジルオキシ、アセチルオキシまたはクロロであり、
Ｒ_２、Ｒ_１５、ＷおよびＺは、独立して、水素、ヒドロキシ、メトキシ、ベンジルオキシ、アセチルオキシ、メチル、トリフルオロメチルまたはクロロであり、
Ｒ_５は、水素またはＣＯ_２Ｒ_１２（ここで、Ｒ_１２は水素またはメチルである）であり、かつ
Ｒ_６は、水素である。
【００６８】
本発明の特に好ましい化合物は次の化学式から選択される：
【００６９】
【化２４】

【００７０】
【化２５】

【００７１】
【化２６】

【００７２】
本発明の好ましい化合物は、それが結合されるイソフラボンまたは誘導体分子からin vivoで切断され得る生理学的に切断可能な離脱基を有するすべての誘導体も包含する。離脱基としては、アシル、ホスフェート、スルフェート、スルホネートが挙げられ、好ましくはモノ-、ジ-およびペル-アシルオキシ置換化合物であり、この場合、１つまたはそれ以上のペンダントヒドロキシ基がアシル基、好ましくはアセチル基により保護される。
典型的には、アシルオキシ置換イソフラボンおよびその誘導体は、対応するヒドロキシ置換化合物に容易に切断可能である。さらに、本発明のイソフラボン化合物および誘導体上の官能基の保護は、例えばT.W. Greene (1981)に記載されているような当該技術分野において十分に確立された方法により実行され得る。
【００７３】
本発明に従って用いるために意図された最も好ましいイソフラボン化合物としては、ホルムオノネチン（formononetin）、ビオカニン（biochanin）、ゲニステイン（genistein）、ダイゼイン（daidzein）およびイーコル（equol）、ならびにその機能的誘導体、等価物または類似体が挙げられる。同様に重要な化合物は、ジヒドロダイゼイン、シスおよびトランステトラヒドロダイゼインおよびデヒドロイーコルならびにそれらの誘導体およびプロドラッグなどのイソフラボン代謝産物である。
【００７４】
特定のイソフラボンの化学的および機能的等価物は、イソフラボンのいずれか１つまたはそれ以上の機能的活性を示す分子と理解されるべきであり、化学的に合成されるかまたは天然生成物スクリーニングのようなスクリーニング方法により同定されるようなあらゆる供給源から得られる。
【００７５】
「アルキル」という用語は、炭素原子1〜10個、好ましくは炭素原子1〜6個の直鎖、分枝鎖および環状（炭素数５またはそれ以上の場合）の飽和アルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、シクロペンチル等を含むと解釈される。アルキル基は、さらに好ましくはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルである。アルキル基は、所望により、１つまたはそれ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルアミノカルボニル、ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルチオ、Ｃ_３〜Ｃ_６−シクロアルキルまたはフェニルにより置換され得る。
【００７６】
「アルケニル」という用語は、炭素原子2〜10個、好ましくは炭素原子2〜6個で、少なくとも１つの二重結合を有する直鎖、分枝鎖および環状（炭素数５またはそれ以上の場合）の炭化水素、例えばエテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、2-メチル-1-プロペニル、2-メチル-2-プロペニル等を含むと解釈される。アルケニル基は、さらに好ましくはエテニル、1-プロペニルまたは2-プロペニルである。アルケニル基は、所望により、１つまたはそれ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルアミノ−カルボニル、ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４のアルキル−カルボニルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルチオ、Ｃ_３〜Ｃ_６−シクロアルキルまたはフェニルにより置換され得る。
【００７７】
「アルキニル」という用語は、炭素原子２〜１０個、好ましくは炭素原子２〜６個で、少なくとも１つの三重結合を有する直鎖および分枝鎖の炭化水素、例えばエチニル、1-プロピニル、2-プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル等を含むと解釈される。アルキニル基は、さらに好ましくはエチニル、1-プロピニルまたは2-プロピニルである。アルキニル基は、所望により、１つまたはそれ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ_１〜_４−アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルアミノ−カルボニル、ジ-（Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルチオ、Ｃ_３〜Ｃ_６−シクロアルキルまたはフェニルにより置換され得る。
【００７８】
「アリール」という用語は、フェニル、ビフェニルおよびナフチルを含むと解釈され、１つまたはそれ以上のＣ_１〜Ｃ_４−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ、カルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルカルボニルオキシまたはハロにより任意に置換され得る。
【００７９】
「ヘテロアリール」という用語は、環中に少なくとも１つの酸素、硫黄または窒素を含む５員および６員環を含むと解釈され、この環は、所望により、フリル、ピリジル、ピリミジル、チエニル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、キノリル、イソキノリル、プリニル、モルホリニル、オキサゾリル、チアゾリル、ピロリル、キサンチニル、プリン、チミン、シトシン、ウラシルおよびイソキサゾリルなどのその他のアリールまたはヘテロアリール環に融合され得るが、これらに限定されない。ヘテロ芳香族基は、所望により、１つまたはそれ以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシカルボニル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルアミノ−カルボニル、ジ−（Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ_１〜Ｃ_４−アルキルチオ、Ｃ_３〜Ｃ_６−シクロアルキルまたはフェニルにより置換され得る。ヘテロ芳香族は、所望により、部分的にまたは完全に水素化することができる。
【００８０】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨード、好ましくはフルオロおよびクロロ、さらに好ましくはフルオロを含むと解釈される。例えば「ハロアルキル」への言及は、モノハロゲン化アルキル基、ジハロゲン化アルキル基および過ハロゲン化アルキル基までを含む。好ましいハロアルキル基は、トリフルオロメチルおよびペンタフルオロエチルである。
【００８１】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、電荷を運搬し、かつ、例えば塩中のカウンターカチオンまたはカウンターアニオンとして薬学的作用物質とともに投与され得る有機または無機部分を指す。薬学的に許容可能なカチオンは当業者に既知であり、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛および第四級アミンが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容可能なアニオンは当業者に既知であり、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩、重炭酸塩および炭酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
「薬学的に許容可能な誘導体」または「プロドラッグ」という用語は、受容者への投与時に、親化合物または代謝産物を直接または間接的に提供することができるか、あるいはそれ自体活性を示す活性化合物の誘導体を指す。
【００８３】
本明細書中で用いる場合、「治療（treatment）」、「予防（prophylaxis）」または「防止（prevention）」、「改善（amelioration）」等という用語は、それらの最も広い文脈で考えられるべきものである。特に「治療」という用語は、動物が完全な回復まで治療される、ということを必ずしも意味しない。したがって「治療」は、特定の疾患の症状または重症度の改善、あるいは特定疾患を発症するリスクの防止またはそうでなければ低減を包含する。
【００８４】
本発明の治療的処置に必要とされる１つまたはそれ以上の式Iの化合物の量は、多くの因子、例えば特定の用途、用いられる個々の化合物の性質、治療される病状、投与方式および患者の状態に依存している。式Iの化合物は、従来実行されるような方法および量で投与することができる。例えば、Goodman and Gilman, et al. (1995)を参照されたい。利用される具体的な投薬量は、治療される病状、被験者の状態、投与経路および上記のようなその他の既知の因子に依存する。一般的に、患者一人あたり１日の用量は、0.1mg〜5g、典型的には0.5mg〜1g、好ましくは50mg〜200mgの範囲であり得る。投与の長さは、治療または軽減されるべき病状の重症度に依存して、１日または２日に１回投与される１回投与から、１週間から、必要な場合には、数ヶ月〜数年までにわたって投与される１日２回または３回投与の範囲であり得る。任意の個々の患者に関して、特定投薬レジメンは、個体の必要性に、および組成物の投与を行なうかまたは管理する人の専門的判断に従って、時間をかけて調整されるべきである、とさらに理解される。活性化合物による比較的短期間の治療は、血管形成術または外科手術のいずれによっても治療することができない冠動脈疾患病変の安定化または縮小させるために用いることができる。より長期間の治療は、リスクの高い患者における進行病変の発症を防止するために採用され得る。
【００８５】
本明細書中に記載された治療適応症（therapeutic indications）の治療のための薬学的組成物の製造は、典型的には、本発明の化合物（便宜上、以後「活性化合物」と呼ぶ）と当該技術分野で既知の１つまたはそれ以上の薬学的にまたは獣医学的に許容可能な担体および／または賦形剤とを混和することにより調製される。
【００８６】
担体は、もちろん、配合物中の任意のその他の成分と相溶性であるという意味で許容可能でなければならず、かつ被験者に有害であってはならない。担体または賦形剤は、固体または液体あるいはその両方であってもよく、好ましくは100重量％までの活性化合物を、好ましくは0.5重量％〜59重量％の活性化合物を含有し得る単位用量、例えば錠剤、として化合物とともに配合される。１つまたはそれ以上の活性化合物は、本発明の配合物中に配合され得るが、これは、本質的には、所望により１つまたはそれ以上の補助成分を含む構成成分を混ぜ合わせることからなる製剤の既知のなんらかの技法により調製され得る。薬剤組成物中の活性化合物の好ましい濃度は、薬剤の吸収、分布、不活性化および排出速度、ならびに当業者に既知のその他の因子によって決まる。
【００８７】
本発明の配合物は、経口、直腸、眼、バッカル（例えば、舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内または静脈内）ならびに経皮投与に適したものを含むが、任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療される病状の性質および重症度、ならびに用いられている特定の活性化合物の性質によって決まる。
【００８８】
経口投与に適した配合物は、粉末または顆粒として、水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油または油中水乳濁液として、それぞれ所定量の活性化合物を含有する、カプセル、小袋（sachets）、ロゼンジまたは錠剤などの不連続単位で提供され得る。このような配合物は、活性化合物および適切な担体（上記のような１つまたはそれ以上の補助成分を含有し得る）を結合させる工程を包含する調剤の任意の適切な方法によって調製され得る。一般的に、本発明の配合物は、活性化合物を液体または微粉砕固体担体またはその両方と均一によく混ぜ合わせ、次に、必要ならば、その結果生じた混合物を単位投薬量を形成するよう成形することにより調製される。例えば、錠剤は、活性化合物を、所望により、１つまたはそれ以上の補助成分とともに含有する粉末または顆粒を圧縮または成形することにより調製され得る。圧縮錠剤は、適切な機械で、所望により結合剤、滑剤、不活性希釈剤、および／または界面活性剤／分散剤（単数または複数）と混合された粉末または顆粒などの易流動性（free-flowing）の化合物を圧縮することにより調製され得る。成形錠剤は、適切な機械で、不活性液体結合剤で湿らせた粉末化合物を成形することにより製造され得る。
【００８９】
バッカル（舌下）投与に適した配合物としては、風味処理基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性化合物を含むロゼンジ、ならびに不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはすクロスおよびアラビアゴム中に化合物を含む香錠（pastilles）が挙げられる。
【００９０】
非経口投与に適した本発明の組成物は、便宜上、活性化合物の滅菌水性製剤を含むが、この製剤は、好ましくは対象とする受容者の血液と等張である。これらの製剤は、好ましくは静脈内に投与されるが、投与は、皮下、筋肉内または皮内注射によっても達成され得る。このような製剤は、便宜上、該化合物を水またはグリセリン緩衝液と混ぜ合わせ、その結果生じる溶液を滅菌して、血液と等張にすることにより調製され得る。本発明の注射用配合物は、一般に、0.1〜60％（w/v）の活性化合物を含有し、0.1ml/分/kgの割合で投与される。
【００９１】
直腸投与に適した配合物は、好ましくは単位用量座薬として提供される。これらは、活性化合物を１つまたはそれ以上の従来型の固体担体、例えばカカオバターと混ぜ合わせ、次にその結果生じた混合物を成形することにより調製され得る。
【００９２】
皮膚への局所投与に適した配合物または組成物は、好ましくは軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたはオイルの形態をとる。用いることができる担体としては、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール類、アルコール類およびそれらの２つまたはそれ以上の組合せが挙げられる。活性化合物は、一般に、0.1〜5％（w/w）、特に0.5〜2％（w/w）の濃度で提供される。このような組成物の例としては、美容用スキンクリームが挙げられる。
【００９３】
経皮投与に適した配合物は、長期間受容者の表皮と緊密に接触したままであるようになっている個々のパッチとして提供され得る。このようなパッチは、活性化合物を、例えば該活性化合物に関して0.1〜0.2M濃度の所望により緩衝された水溶液として適切に含有する。例えば、Brown, L., et al. (1998)を参照されたい。
【００９４】
経皮投与に適した配合物は、
イオン導入療法（例えば、Panchagnula R, et al., 2000を参照）によっても送達することができ、典型的には所望により緩衝された活性化合物の水溶液の形態をとる。適切な配合物は、クエン酸塩またはビス／トリス緩衝液（pH6）またはエタノール／水を含み、0.1〜0.2Mの活性成分を含有する。
【００９５】
吸入に適した配合物は、溶液、懸濁液または乳濁液の形態でスプレー組成物として送達され得る。吸入スプレー組成物は、さらに、二酸化炭素または亜酸化窒素などの薬学的に許容可能な噴射剤を含むことができる。
【００９６】
活性化合物は、食料品の形態で、例えば添加され、混合され、コーティングされ、一体化されている形態で、またはさもなければ食料品に付加された形態で提供され得る。食料品という用語はその考え得る最も広義で用いられ、乳製品を含む飲料などの液体配合物、および健康食品バー、デザート等のその他の食品が挙げられる。本発明の化合物を含有する食品配合物は、標準的な技法に従って容易に調製され得る。
【００９７】
治療方法、用途および組成物は、例えば、コンパニオン・アニマルおよび家庭動物（例えばイヌおよびネコ）ならびに家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタおよびヤギ）、鳥類（例えば、鶏、七面鳥、アヒル）等の哺乳類を含むヒトまたは動物への投与のためであり得る。
【００９８】
活性化合物あるいはその薬学的に許容可能な誘導体プロドラッグまたはそれらの塩はまた、初期の作用を減損しないその他の活性物質、あるいは初期の作用を補足する物質と、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤または抗ウイルス化合物と共投与され得る。活性作用物質は、２つまたはそれ以上のイソフラボンまたはその誘導体を、組合せまたは相乗（synergistic）混合物中に含み得る。活性化合物はまた、例えばプロブコールおよびニコチン酸などの脂質低下剤、アスピリンなどの血小板凝集阻害剤、クマジン（coumadin）などの抗血栓剤、ベラパミル、ジルチアゼムおよびジフェジピンなどのカルシウムチャンネル遮断剤、カプトプリルおよびエナラプリルなどのアンギオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤、ならびに、プロパノロール、テルブタロール（terbutalol）およびラベタロールなどの_”−遮断剤とともに投与され得る。化合物は、非ステロイド系抗炎症剤、例えばイブプロフェン、インドメタシン、アスピリン、フェノプロフェン、メフェナム酸、フルフェナム酸およびスリンダクと組合せても投与され得る。化合物はまた、コルチコステロイドとともに投与され得る。
【００９９】
共投与は、同時であっても、逐次であってもよい。同時投与は、同一または類似時点で投与される同一単位用量中に、または個別および個々の単位用量中に存在する化合物により達成され得る。逐次投与は、必要に応じた如何なる順序であってもよく、典型的には、二番目の、すなわち後の活性作用物質が投与される時に、特に蓄積または相乗的効果が望まれる場合、一番目の、すなわち最初の活性作用物質の進行中の生理学的作用が存続している必要がある。
【０１００】
本発明に用いるためのイソフラボンは、当業者に容易に同定可能な任意数の供給源から誘導される。好ましくは、それらは、植物供給源からの濃縮物または抽出物の形態で得られる。また、当業者は、適切な植物種を容易に同定し得るが、例えば本発明における特定用途の植物としては、マメ科植物が挙げられる。さらに好ましくは、イソフラボン抽出物は、ヒヨコマメ、レンズマメ、エンドウ、ムラサキツメクサまたはサブタレニアンクローバー種等から得られる。
【０１０１】
イソフラボン抽出物は、当該技術分野で既知の任意数の技法により調製され得る。
例えば、適切なイソフラボン抽出物は、植物供給源からの水／有機溶媒抽出により調製され得る。イソフラボン抽出物は、単一種の植物の任意の単一組織、あるいはそれらの２つまたはそれ以上の異なる組織の組合せから調製され得る、と理解される。同様に、抽出物は、植物の２つまたはそれ以上の異なる種からの組織の異種混合物を含有する出発物質から調製され得る。
【０１０２】
一般に、イソフラボン抽出物が、植物物質から調製される場合、該物質はより小さい片に粉砕されるかまたは切り刻まれ、あるいは部分的により小さい片に細砕されるかまたは切り刻まれて、水および有機溶媒、例えば水混和性有機溶媒と接触され得る。あるいは、植物物質は、如何なる前処置もなしに水および有機溶媒と接触される。水対有機溶媒の比は一般に、1：10〜10：1の範囲であり、例えば、同等の比率の水および溶媒または1〜30％（v/v）の有機溶媒からなってもよい。如何なる有機溶媒またはこのような溶媒の混合物も用いることができる。有機溶媒は、好ましくはＣ_２〜Ｃ_１０の、さらに好ましくはＣ_１〜Ｃ_４の有機溶媒（例えば、メタノール、クロロホルム、エタノール、プロパノール、プロピレングリコール、エリトリット、ブタノール、ブタンジオール、アセトニトリル、エチレングリコール、エチルアセテート、グリシドール、グリセロールジヒドロキシアセトンまたはアセトン）であり得る。所望により、水／有機溶媒混合物は、イソフラボングリコシドをアグリコン型（aglycone form）に切断する酵素を含み得る。該混合物は、乳濁液を形成するよう、激しく撹拌され得る。混合温度は、例えば周囲温度から沸騰温度の範囲であり得る。曝露時間は、１時間〜数週間の間であり得る。便宜的な一抽出時間は、90℃で２４時間である。抽出物は、非溶解植物物質から分離することができ、例えば、蒸留、ロータリーエバポレーション、または溶媒除去のためのその他の標準手法により、有機溶媒が除去される。水溶性および非水溶性構成成分を含有するその結果生じた抽出物を乾燥するとイソフラボン含有抽出物を得ることができ、これは、本発明に従って１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または補助剤とともに配合され得る。
【０１０３】
先の段落に示した説明に従って作られる抽出物は、イソフラボンをそれらのアグリコン型（本明細書中ではイソフラボンと呼ぶ）で含む少量の油を含有し得る。このイソフラボン濃縮油は、HPLC処理してイソフラボン比を調整することができ、あるいはそれが所望のイソフラボン比である場合には、例えばシリカの存在下で乾燥され、１つまたはそれ以上の担体、賦形剤および／または補助剤とともに配合されて、イソフラボン含有抽出物を得ることができる。あるいは、上記の少量の油中に含有されるイソフラボンは、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、アセトンまたはこのような溶媒の１つまたはそれ以上の混合物などの非水溶性有機溶媒の油に添加することによりさらに濃縮され得る。一例は、油に関して高溶解性を有するが、イソフラボンに関しては低溶解性を有する80％ヘキサン、20％（w/w）アセトンである。油は有機溶媒中に容易に分配され、濃縮イソフラボン含有抽出物は溶液外に分離する。回収された抽出物は、例えばオーブン中で50℃〜約120℃で乾燥され、そして、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または補助剤とともに配合される。
【０１０４】
本発明は、当該技術分野で既知の確立された合成技法により、適切なイソフラボン、その機能性誘導体、等価体または類似体の生成も意図する、と理解される。例えば、種々のイソフラボンの合成に適した方法を開示するChang et al. (1994)を参照されたい。
【０１０５】
その他の適切な方法は、例えば、国際特許出願公開WO98/08503およびWO00/49009ならびにそこに引用された参考文献に見出すことができる。これらの記載内容は、そのままそっくり参照によりここに援用される。
【０１０６】
以下の非限定的実施例および添付の図面により、本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【０１０７】
抗血管収縮作用および酸化 LDL 損傷からの保護
血管の弾性および血管性応答は、心臓血管性リスクを助長する重要な因子である。正常な生理学的状態は、健常な循環系を示すのに対して、動脈は、ストレスの示差的刺激（differential stimuli）に敏感（responsive）である。コレステロールの蓄積および年齢は、応答が不十分な血管に関与する。したがって血管拡張を生じ、かつ酸化LDL損傷から血管を保護するイソフラボンの能力を検査する実験を実施した。さらにこれらの作用における内皮の重要性を調べた。
【０１０８】
方法
ラット胸大動脈の単離
雄Sprague-Dawleyラット（250±50g）を80％CO_２および20％O_２を用いて死ぬまでガス処理した。胸大動脈を摘出して、199mMのNaCl、4.7mMのHCl、1.17mMのMgSO_４・7H_２O、25mMのNaHCO_３、1.18mMのKH_２PO_４、2.5mMのCaCl_２、11mMのグルコースおよび0.03mMのEDTAからなる氷冷クレブス変法溶液（Krebs modified solution）中に迅速に入れた。次に、脂肪および結合組織を取り除いて、2〜3mm幅の環に切断した。37℃に保持し、95％O_２＋5％CO_２を通気した変法クレブス溶液を含むシングルウォータージャケット付き3mLオーガンバス中の２つの平行なステンレススチールフックに、各環を載せた。下方フックを移動可能な支持足に取り付け、上方フックを等張記録（isometric recordings）のためにFT03フォーストランスデューサー（Grass Scientific Instruments, Mitutoyo, Japan）に取り付けた。力の変化を増幅させ（Quadbridge増幅器、Scientific Concepts Inc., Victoria, Australia）、アップルコンピューター（Apple Computer Inc., Cupertina, CA）に連結したMacLab８Eデータ収集システム（Adinstuments Pty Ltd., NSW, Australia）で記録した。環を2gの初期張力に設定し、30分間平衡させて、その後、各実験プロトコールの開始前に、それらを2g張力に再設定した。
【０１０９】
プロトコール１：ノルアドレナリンに対する収縮曲線に及ぼすイソフラボン代謝産物の作用
β-エストラジオール（1μg/ml）、Cpd.５（0.1および1μg/ml）、Cpd.７（0.1および1μg/ml）、Cpd.８（0.1および1μg/ml）およびCpd.１２（1μg/ml）、ならびにビヒクル等容量DMSOの存在下および非存在下においてノルアドレナリン（0.1nM〜10mM）に対して、全濃度−収縮曲線（ｆull concentration-contractile curves）を得た。いずれか一つの濃度の一化合物のみを、いずれか一つの動物からのいずれか一つの環に関して試験した。
【０１１０】
プロトコール２ａ イソフラボン代謝産物誘導体の血管拡張能力
ノルアドレナリンに対する全濃度応答を得た。これから、約80％の亜最高（submaximal）収縮を生じる濃度を選択した（0.03〜0.3μM）。次に環をこの亜最高値濃度で絞窄して、安定状態にした後、β-エストラジオールおよびCpd.５、７、８および１２、ならびにビヒクルDMSO（等容量で）に対して、全濃度−弛緩曲線を得た。任意の一動物からの任意の一つの環を用いて、一化合物のみを試験した。
【０１１１】
プロトコール２ｂ． イソフラボン代謝産物誘導体の血管拡張能力：作用メカニズム
内皮（粗面に対して管腔を静かに回転させることにより、環から内皮を剥がした）、一酸化窒素シンターゼ阻害剤ニトロ-L-アルギニン（NOLA 10μM；化合物の限定供給のためにCpd.８を除く）、40mMのKCl（内皮由来過分極化因子を阻害するため）、シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（10μM）および可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン-1-オン（ODQ；10μM）の非存在下および存在下においてCpd.５、７、８および１２ならびにβ-エストラジオールに対して、全弛緩曲線を得た。任意の一動物からの任意の一つの環に関して、唯一の治療を有する唯一の化合物を試験した。
【０１１２】
プロトコール３ 酸化低密度リポタンパク質により誘導される内皮損傷に対するイソフラボン代謝産物誘導体の保護作用
フェニレフリンに対する全濃度応答曲線を構築し、これから、約80％の亜最大収縮を示す濃度を選択した（通常0.3μM）。次に組織を選定濃度でフェニレフリンで締め付けて、安定状態にさせた。次にアセチルコリンに対して、全濃度拡張曲線を構築した。この後、予備実験でアセチルコリンに対する応答に影響を及ぼさないことが実証された
0.1％消泡剤B（SIGMA）を、バスに添加した。次に、β-エストラジオール（10pg/ml）、Cpd.５（300ng/ml）、Cpd.７（1μg/ml）、Cpd.８（3μg/ml）またはCpd.１２（3μg/ml）の非存在下および付加的存在下で、酸化低密度リポタンパク質（雄ウシLDL：0.3mgタンパク質/ml）を用いて１時間インキュベートした後、アセチルコリンに対する全濃度応答曲線を反復した。プロトコール２ａで実施した実験からのneg log EC_４５〜EC_５０に基づいて、濃度を選定した。
【０１１３】
低密度リポタンパク質の調製
血液バンクからヒト血漿を得た。Beckman遠心分離機を用いたBeckman垂直ローター（70 Ti）での不連続密度勾配超遠心分離を用いて、個々のリポタンパク質分画を得た。すなわち、0.018gのKBrを１mlの血漿に添加し、これを迅速密封管に移して、65,000rpmで4℃で一晩回転させた。次に上部（VLDL）分画を取り除き、0.064gのKBrを１mlの底部分に添加した。これを迅速密封管（quick-seal tubes）に移して、65,000rpmで4℃で一晩回転させた。上部（LDL）分画を迅速密封管に移して、dl.063溶液でいっぱいにして、回転させた。各回転後に上部LDL分画を回収し、0.05MのNH_４HCO_３pH8.0に対して4日間にわたって、毎日溶液を交換して、透析した。得られた最終LDL分画のタンパク質含量を、Lowryの簡易タンパク質アッセイ法により確定した。5μMのCuSO_４を用いた2時間のインキュベーションにより、LDLを酸化した。
【０１１４】
データ提示および統計分析
収縮応答は、ｇ張力（平均＋平均の標準誤差）で表される。拡張応答は、用いた前絞窄剤（pre-constricting agent）により生じる収縮力のパーセンテージとして表される。ノルアドレナリンおよびアセチルコリン±用いた治療に関する個々の濃度−応答曲線を、次式の論理方程式（logistic equation）に当てはめた：
Ｅ＝ＭＡ^ｐ／(Ａ^ｐＸＫ^ｐ）
式中、Ｅは応答であり、Ｍは最大応答であり、そしてＫは最大応答の50％を引き出す濃度である（すなわち、neg log EC_５０）。
【０１１５】
分散の２方向反復測定解析により結果を分析し、適切な場合には、その後、パラメーター分析を実施する前に正規性に関してデータを本質的に試験するSigmastat統計ソフトウエア（Jandel Scientific, San Rafael, CA）を用い、適切な補正を有するpost-hoc t検定を行った。
【０１１６】
薬剤および溶液
1,3,5[10]-エストラトリエン-3,17β-ジオール（17β-エストラジオール、SIGMA）、Cpd.５、Cpd.７、Cpd.８およびCpd.１２（Novogen Ltd製）をDMSO中に溶解し、クレブス中で所望の濃度に希釈した。Ｎ^ω-ニトロ-L-アルギニン（SIGMA）、インドメタシン（SIGMA）、ノルエピネフリン重酒石酸塩（SIGMA）、アセチルコリンクロリド（SIGMA）および1H-(1，2,4)オキサジアゾロ(4,3-a)キノキサリン-1-オン（SIGMA）を、メーカーの使用説明書に従って溶解した。
【０１１７】
結果
プロトコール１：ノルアドレナリンに対する収縮曲線に及ぼすイソフラボン代謝産物の作用
表１は、β-エストラジオール、合成イソフラボン誘導体（Cpd.５、７、８および１２）および慣例的使用物（the used）の存在下および非存在下でのノルアドレナリンに対して得られる最大力を表示する。
【０１１８】
図１は、1マイクロg/mlで用いた場合の種々の化合物に関するノルアドレナリンに対する応答に及ぼす作用をグラフで示す。図２は、３０分インキュベーション後の非存在下（前化合物：pre-compound）および存在下（後化合物：post-compound）でのノルアドレナリンに対する全濃度−収縮応答を示す。
【０１１９】
試験した活性化合物はすべて、ノルアドレナリン誘導性収縮に及ぼす有意の拮抗作用を有した。試験した化合物の効力の順序の指標を得るために、ノルアドレナリンに対する最大応答の差（化合物の非存在下での最大応答−化合物の存在下での最大応答）を、1μg/mlで各化合物に関して算定した（表１）。これから、Cpd.１２が、ノルアドレナリンに対する収縮応答を相殺する場合にβ-エストラジオールに匹敵することは明らかであったが、Cpd.５、Cpd.７およびCpd.８は活性であるが、β-エストラジオールより低効力であった。
【０１２０】
【表１】

【０１２１】
プロトコール２ａ：イソフラボン代謝産物の血管拡張能力：作用メカニズム
図３は、試験した化合物の濃度−拡張作用を示す。亜最大濃度のノルアドレナリンで前絞窄された（pre-constricted）ラット単離大動脈環を用いた17β-エストラジオールおよびCpd.５、７、８および１２に関して得られた濃度−拡張曲線。値はすべて、平均±平均の標準誤差である。４つの化合物はすべて、それらの血管拡張能力においてβ-エストラジオールと少なくとも同等に強力であった。これらの化合物が拡張作用を発揮するメカニズムをさらに、特定のアンタゴニストを用いて調べた。
【０１２２】
β-エストラジオール：図４は、亜最大濃度のノルアドレナリンで前絞窄した（pre-constricted）ラット単離大動脈環を用いた17β-エストラジオールに関して得られた濃度−拡張曲線を示す。
これらを、
(ａ)無傷内皮、
(ｂ)一酸化窒素シンターゼ阻害剤N“-ニトロ-L-アルギニン（NOLA 10μM）、
(ｃ)４０mMのKCl、
(ｄ)可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン−１−オン（ODQ 10μM）、
(ｅ)シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（10μM）の非存在下および存在下で実施し、
(ｆ)は時間（３０分）コントロールを示す。
ｎ＝実験数。
【０１２３】
β-エストラジオールに対する血管拡張性応答は、内皮の除去（図３ａ）、ニトロ-L-アルギニンを用いたインキュベーション（図４ｂ）、高レベルのKCl（図４ｃ）およびODQ（図４ｄ）により、阻害された。インドメタシンはこのステロイドの拡張作用に影響を及ぼさず（図４ｅ）、時間依存性変化は観察されなかった（図４ｆ）。
【０１２４】
Cpd.５：図５は、亜最大濃度のノルアドレナリンで前絞窄したラット単離大動脈環を用いたCpd.５に関して得られた濃度−拡張曲線を示す。
これらを、
(ａ)無傷内皮、
(ｂ)一酸化窒素シンターゼ阻害剤N”-ニトロ-L-アルギニン（NOLA 10μM）、
(ｃ)４０mMのKCl、
(ｄ)可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン−１−オン（ODQ 10μM）、
(ｅ)シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（10μM）の非存在下および存在下で実施し、
(ｆ)は時間（３０分）コントロールを示す。
ｎ＝実験数。
【０１２５】
Cpd.５に対する血管拡張性応答は、内皮の除去（図５ａ）、ニトロ-L-アルギニンを用いたインキュベーション（図５ｂ）、高レベルのKCl（図５ｃ）およびODQ（図５ｄ）により、阻害された。インドメタシンはこのステロイドの拡張作用に影響を及ぼさず（図５ｅ）、時間依存性変化は観察されなかった（図５ｆ）。
【０１２６】
Cpd.７：図６は、亜最大濃度のノルアドレナリンで前絞窄したラット単離大動脈環を用いたCpd.７に関して得られた濃度−拡張曲線を示す。
これらを、
(ａ)無傷内皮、
(ｂ)一酸化窒素シンターゼ阻害剤N”-ニトロ-L-アルギニン（NOLA 10μM）、
(ｃ)４０mMのKCl、
(ｄ)可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン−１−オン（ODQ 10μM）、
(ｅ)シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（10μM）の非存在下および存在下で実施し、
(ｆ)は時間（３０分）コントロールを示す。
ｎ＝実験数。
【０１２７】
Cpd.７に対する血管拡張性応答は、内皮の除去（図６ａ）、高レベルのKCl（図６ｃ）およびODQ（図６ｃ）により、阻害された。NOLAによるこれらの応答の阻害傾向が認められたが、これは統計学的に有意でなかった。インドメタシンはこのステロイドの拡張作用に影響を及ぼさず（図６ｄ）、時間依存性変化は観察されなかった（図６ｅ）。
【０１２８】
Cpd.８：図７は、亜最大濃度のノルアドレナリンで前絞窄したラットから単離した大動脈環を用いたCpd.８に関して得られた濃度−拡張曲線を示す。
これらを、
(ａ）無傷内皮、
(ｂ)40mMのKCl、
(ｃ)可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン−１−オン（ODQ 10μM）、
(ｄ)シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（10μM）の非存在下および存在下で実施し、
(ｅ)は時間（３０分）コントロールを示す。
ｎ＝実験数。
【０１２９】
Cpd.８に対する血管拡張性応答は、内皮の除去（図７ａ）、高KClレベル（図７ｂ）によって阻害されたが、ODQ（図７ｃ）によっては阻害されなかった。インドメタシンはCpd.８の阻害作用を強化した（図７ｄ）。時間依存性変化は観察されなかった（図７ｅ）。
【０１３０】
Cpd.１２：図８は、亜最大濃度のノルアドレナリンで前絞窄したラットから単離した大動脈環を用いたCpd.１２に関して得られた濃度−拡張曲線を示す。これらを、
(ａ)無傷内皮、
(ｂ)一酸化窒素シンターゼ阻害剤N“-ニトロ−L−アルギニン（NOLA 10μM）、
(ｃ)40mMのKCl、
(ｄ)可溶性グアニル酸シクラーゼ阻害剤1H-[1,2,4]オキサジアゾロ[4,3-a]キノキサリン−１−オン（ODQ 10μM）、
(ｅ)シクロ−オキシゲナーゼ阻害剤インドメタシン（10μM）の非存在下および存在下で実施し、
(ｆ)は時間（３０分）コントロールを示す。ｎ＝実験数。
【０１３１】
Cpd.１２に対する血管拡張性作用は、内皮の除去（図８ａ）および高レベルのKCl（図８ｃ）によって阻害されたが、NOLA（図８ｂ）にもODQ（図８ｄ）にもまたはインドメタシン（図８ｅ）にも阻害されなかった。時間依存性変化は観察されなかった（図８ｅ）。
【０１３２】
プロトコール３：酸化低密度リポタンパク質により誘導される内皮損傷に対するイソフラボン代謝産物の保護作用
図９は、
（ａ）酸化低密度リポタンパク質（雄ウシLDL、0.3mgタンパク質／ml)、
（ｂ）雄ウシLDL＋Cpd.８（3μg/ml）
を用いた３０分インキュベーションを行なった場合と行なわなかった場合での亜最大濃度のフェニレフリンで前絞窄したラットから単離した大動脈環を用いて得られたアセチルコリンに対する全濃度応答曲線を示す。図１０は、雄ウシLDLを用いた単独インキュベーションならびに雄ウシLDL＋17β-エストラジオールまたはCpd.５、７、８または１２の共インキュベーション（co-incubation）を行なった場合と行なわなかった場合での亜最大濃度のフェニレフリンで前絞窄したラット単離大動脈環を用いたアセチルコリンに対して得られた最大拡張を示すヒストグラムを表す。ｎ＝実験数。
【０１３３】
雄ウシLDLを用いたインキュベーションにより、アセチルコリンに対する応答は有意に減じた（図９ａ）。雄ウシLDLのCpd.８との共インキュベーションは、雄ウシLDLの阻害作用を減少した（図９ｂ）。
【０１３４】
さらに、この化合物との共インキュベーションを行なった場合でのアセチルコリンに対して得られる最大応答は、雄ウシLDLを用いた単独インキュベーションの場合より有意に低かった（図１０）。β-エストラジオールおよびその他の化合物との雄ウシLDLの共インキュベーションは、雄ウシLDLインキュベーションの前および後に得られた最大拡張間の有意差がもはや明らかでないよう、雄ウシLDLの作用を減少させた。しかしながら共インキュベーションを行なった場合で得られたアセチルコリンに対する最大拡張は、雄ウシLDLのみの存在下で得られたものと異ならなかった（図１０）。
【０１３５】
考察
これらの試験は、
イソフラボン化合物および誘導体が、
(ａ)ノルアドレナリンに対する血管収縮性応答を阻害し、
(ｂ)血管拡張性であることを、そして
(ｃ)Cpd.８が酸化LDLによる内皮損傷に対して有意に保護するということを実証する。いくつかのこれらの化合物のin vitro血管プロフィールは、卵巣ステロイド17β-エストラジオールに匹敵し、そしてある場合には、それより有効である。これは、これらの化合物が、高イソフラボン食（high isoflavone diets）に帰する心臓保護作用を担うことができるということを示唆するが、さらに重要なことには、特に通常の食事で摂取するイソフラボンから得られるものより多い用量で投与される場合、これらの化合物は、潜在的な心臓保護的治療剤として有用であり得る、ということを示唆する。
【０１３６】
Cpd.５、７、８および１２はすべて、ノルアドレナリンの収縮作用と拮抗し得たが、異なる程度にであった。Cpd.１２は最も効果的で、17β-エストラジオールに匹敵する。Cpd.５およびCpd.７は同等の効力であるが、Cpd.１２より低効力であるように思われた。Cpd.８は、最小の効力であった。Cpd.５、７および８の拮抗作用は、用量依存性であったが、Cpd.１２およびβ-エストラジオールの用量依存性は検査しなかった。等容量では、ビヒクル（DMSO）は、ノルアドレナリンに対する応答の阻害には有効でなかった。
【０１３７】
イソフラボン代謝産物合成誘導体の血管拡張作用は、17β-エストラジオールより強力ではないとしても、少なくとも同等に強力であったが、作用メカニズムは、４つの化合物すべての拡張作用が内皮の除去時に減少したという点で、17β-エストラジオールの作用メカニズムとは異なった。
【０１３８】
インドメタシンによる影響を受けない化合物はなかったが、これは、プロスタサイクリンがそれらの血管拡張能力において実質的役割を果たしそうにない、ということを示唆する。しかしながら、インドメタシンが、血管拡張能力の増大が観察されるようなCpd.８の作用を強化したことは、Cpd.８が、トロンボキサンなどの血管収縮性プロスタノイド（vasoconstrictory prostanoid）の放出を増大し、その除去により拡張増大が観察されたことを示唆する。Cpd.５およびCpd.７の両方の拡張応答は、高レベルのKCl、ODQおよびNOLAにより阻害された。したがって、これらの化合物両方の拡張作用は、内皮由来弛緩因子、おそらくは可溶性グアニル酸シクラーゼ活性を活性化する一酸化窒素の放出と関連し得る。
【０１３９】
KClによる阻害は、内皮由来過分極因子（EDHF）も放出されることを示唆する。EDHF応答を単離するに際してのKClの使用への制限が認められ、アパミンおよびカリブドトキシン（charybdotoxin）などの特異的Ｋ^＋チャンネル阻害剤の使用によるさらなる調査が保証される、と認識される。制限を仮定すると、一般的試験においては、Cpd.５およびCpd.７により放出される過分極因子が一酸化窒素でないことを示唆する証拠はない。
【０１４０】
一方、Cpd.８およびCpd.１２の拡張作用は、EDHFに全体的に寄与し得るが、この場合、これは明らかに一酸化窒素でなく、可溶性グアニル酸シクラーゼにより活性化されない。したがって、これら４つの化合物が血管拡張を引き起こす作用メカニズムが、卵巣ステロイドβ-エストラジオールおよびその親化合物と異なるだけでなく、互いに異なる、ということは明らかである。
【０１４１】
最終シリーズの実験において、酸化LDLにより誘導される内皮損傷に対するこれらの化合物の保護作用を調べた。酸化LDLは、内皮依存性血管拡張剤アセチルコリンの血管拡張能力を阻害した。試験したすべての化合物は、雄ウシLDLに起因するアセチルコリンに対する応答を減少したが、Cpd.８は、雄ウシLDLを用いた単独インキュベーションとの直接比較において、アセチルコリンに対する応答に有意な作用を及ぼすことを実証することができた唯一の化合物であった。その17β-エストラジオールが雄ウシLDLによる内皮損傷に対して保護し得るということは、既に実証されている。現在のデータから、これに関連してCpd.８の保護作用が17β-エストラジオールより少なくとも10倍強力である、ということは明らかである。Cpd.８は、他のプロトコールにおいては、すなわちノルアドレナリンの拮抗において、あるいはその直接血管拡張能力において、最も強力な化合物というわけではないため、この化合物の心臓保護作用のメカニズムは、試験した他のものとは異なるようであり、その酸化防止能力に存在し得る。
【０１４２】
これらの結果は、Cpd.５、７、８、１２が強力な血管調節能力を有する、ということを示す。したがって、イソフラボンおよびその誘導体は、収縮活性を相殺でき（Cpd.１２＞Cpd.５＝Cpd.７＞Cpd.８）、直接血管拡張を相殺し、かつ酸化低密度リポタンパク質による内皮損傷に対して保護する（Cpd.８は、この情況においては、17β-エストラジオールより少なくとも１０倍強力である）ことができる。卵巣ステロイド17β-エストラジオールに匹敵する一方、それらの活性はまた、それらの作用メカニズムにおいて独特であると思われる。したがって、イソフラボンおよび誘導体は、心臓保護的療法としての使用、特に再狭窄の治療およびその他の種類の内皮肥厚加速（accelerated intimal thickening）の治療における使用の可能性を示す。
【実施例２】
【０１４３】
血管平滑筋細胞作用
血管平滑筋細胞増殖は、アテローム性動脈硬化症プロセスにおける重要な工程であり、エストロゲンにより阻害される。イソフラボン化合物および誘導体のアテローム保護（ateroprotective）特性を調べるために、実験を実施して、DNA合成および細胞増殖の簡単なマーカー、すなわち[3H]-チミジン取込みおよび細胞数に及ぼすイソフラボン代謝産物の選定合成誘導体、Cpd.５、７、８および１２の作用を調べた。Cpd.７に関して得られた有望な結果に鑑みて、マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼ（Erk, JUNK, p38）に及ぼすCpd.７の作用を確定することにより、これらの活性を媒介するシグナル経路を調べた。
【０１４４】
方法
細胞調製
雌内胸動脈（IMA）由来の血管平滑筋細胞（VSMC）を10％FBS−DMEM中で培養した。細胞をLG（グルコース5mM）培地中で集密に増殖させ、次にトリプシン処理して、10％FBS−LG培地で約10,000細胞/mlに希釈し、1mlの懸濁液を4つの24ウエルプレート中にアリコート化した。次に細胞を２日間増殖させて、視覚的に集密にした。LG無血清培地を48時間取り換えて、ほとんどの細胞をG_０／G_１に同調させた。
【０１４５】
細胞処理：
無血清培地での24時間後、細胞を化合物（Cpd.５、Cpd.７、Cpd.８またはCpd.１２）で4時間処理し、FBSを一晩（18〜20時間）添加した（最終濃度2.5％）。各処理に４つのウエルを割り当てた：
（１）コントロール：2.5％FBS
（２）FBS＋イソフラボン処理（0.01 mM）
（３）FBS＋イソフラボン処理（0.1 mM）
（４）FBS＋イソフラボン処理（1 mM)
（５）FBS＋イソフラボン処理（10 mM）
（６）FBS＋イソフラボン処理（100 mM）
【０１４６】
種々の増殖因子、例えば血清および血小板由来増殖因子（PDGF)により、細胞増殖を誘導した。
【０１４７】
チミジン取込みアッセイ：
培地をLG無血清DMEMに変えて、細胞を、[^３H]-チミジンで1μCi/ウエルで3時間処理した。細胞を氷冷したダルベッコのPBS（Dulbecco's PBS）で2回洗浄した。次に氷冷した0.2M HClO_４（１ml/ウエル）を添加し、細胞を氷上で30分間インキュベートした。次に細胞を氷冷した0.2M HClO_４（0.5ml/ウエル）で3回洗浄した。培地（0.5ml/ウエルの0.2M NaOH）を交換して、細胞を37℃でインキュベートした。1時間後、細胞を酢酸（6％、0.2ml/ウエル）で処理し、3mlのシンチレーション液（Instagel）を有するシンチレーションバイアルに移して、バイアル当たり2分間計数した。
【０１４８】
結果
予備実験において、０.１mMという低い濃度でのCpd.７が、コントロール（０）（＃細胞損傷）と比較して、IMA由来VSMC細胞の増殖を有意に阻害する（ｎ＝3）（^＊Ｐ＜0.05）、ということが判明した（図１１参照）。面白いことに、その作用は低濃度（１mMまで）で観察されただけで、増殖の相対的増大は、10mMおよび100mMで測定された（図１１）。Cpd.１２は、細胞増殖を阻害するように見えなかったが、高濃度（10mMおよび100mM）で有意の細胞損傷を引き起こした（図１１）。この作用をより詳細に検査し、それがアポトーシスによるものか否かを確定する試験が目下行なわれている。興味深いことに、Cpd.８が、高濃度（10mMおよび100mM）で、増殖において有意の増大を引き起こした、ということを見出した（図１１）。Cpd.５は、比較的不活性であることが判明した。
【０１４９】
Cpd.５およびCpd.７の作用を、血清の代わりにPDGF BBで感作したIMA由来ヒトVSMC中でさらに試験した。また、Cpd.７が、0.1nMという低い濃度で、IMA細胞の増殖を阻害した（（ｎ＝１）（^＊Ｐ＜0.005）対コントロール（０）；＃Ｐ＜0.01対コントロール（０））ということが判明した（図１２）。この作用は、エストラジオールを用いて観察されたのと等価であった。Cpd.５は、細胞増殖に及ぼす作用は全く観察されなかった。
【０１５０】
さらなる実験において、Cpd.７は、血小板由来増殖因子（PDGF）BB誘導性DNA合成を阻害し、用量依存的に[3H]-チミジン取込みにより評価され、１nmol/Lで10％阻害、10および100nmol/Lで17％阻害であった。その阻害は、統計学的に有意であったが、17β-エストラジオールの作用と比較して低かった（1または10nmol/Lで27％、100nmol/Lで33％）。非選択的エストロゲン受容体（ER）アンタゴニスト（100nmol/L）であるICI 182780は、1〜10nmol/LでのCpd.７の阻害作用を完全になくし、100nmol/LでのCpd.７の阻害作用を部分的になくし、ER媒介を示す。チミジン取込みを用いた我々の結果と一致して、細胞数のPDGF BB誘導性増大は、Cpd.７（1〜100nmol/L）により部分的ではあるが有意に低減された。
【０１５１】
VSMCにおけるこのフィトエストロゲンの作用を媒介するシグナル経路をさらに調べるために、マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼ（Erk、JUNK、p38）に及ぼすCpd.７の作用を免疫沈降分析により、そして初期増殖応答遺伝子（Egr-1,Sp-1）に及ぼす作用をウエスタンブロッティングにより測定した。PDGF BBはErkを活性化し、この活性化は、用量依存的にCpd.７により有意に阻害され、JUNKおよびp38の活性は、PDGF BBまたはCpd.７のいずれによっても影響されなかったが、細胞は両タンパク質ならびにErkを強力に発現した。Egr-1又はSp-1タンパク質は、PDGF BBまたはCpd.７のいずれによっても変更されなかった。
【０１５２】
これらの結果は、イソフラボンおよびその誘導体、ならびに特にCpd.７が、ヒト血管平滑筋細胞の細胞増殖を阻害し、かつヒト血管平滑筋細胞におけるPDGF誘導性Erk活性化も阻害することを示す。この活性は、アテローム性動脈硬化性病変の発症および進行を、特に狭窄加速（accelerated stenosis]を防止するイソフラボンおよびその誘導体の可能性を示し、血管保護において潜在的な利点を提供する。
【実施例３】
【０１５３】
酸化防止剤活性
酸化は、多数の主要な疾患過程において一役割を果たすプロセスである。心臓血管性疾患との関連で、アテローム性動脈硬化症の発症に寄与する主なものの１つは、動脈壁中のLDLコレステロールの酸化であり、これが炎症性病変を導く。検査されずに放置されると、炎症プロセスは、その病変が血管閉塞および梗塞を引き起こすまで進行し、そして再狭窄の内膜肥厚加速（accelerated intimal thickening）において特に重要な問題を提示する。酸化防止剤活性の潜在的な心臓血管の利点を考慮すると、本発明の選択されたイソフラボン化合物にアッセイを施して、それらの酸化防止剤活性を確定した。
【０１５４】
LDL 酸化防止試験
LDL酸化防止試験は、フリーラジカルを直接掃去する（scavenge）か、または遷移金属をキレート化する化合物の能力を測定する。したがって、この一連の実験では、イソフラボンおよびそれらの誘導体を、フリーラジカル掃去剤として作用するそれらの能力に関して試験した。
【０１５５】
方法
25歳以下の健常ヒトボランティアからの静脈穿刺により新鮮な全血を採取し、EDTA（91mg/ml）およびBHT（4.4mg/ml）を直ちに添加した。1.02〜1.05g/cm^３の密度勾配内で、段階方式超遠心分離（step-wise ultracentrifugation）により、LDLを調製した。EDTA及びBHTは、単離の全段階を通して存在した。EDTA／BHT含有ストック溶液（15〜30 mgLDL/ml）を、使用するまで、しかし2週間以下の期間、窒素雰囲気中の暗所に保存した。
【０１５６】
酸化実験前に、真空脱気により、その後窒素でパージして無酸素にした100倍容積の0.01Mリン酸塩緩衝液pH7.4、0.16MのNaCl、0.1mg/mlのクロロアンフェニコール中でLDLストック溶液を透析した。緩衝液を４回取り換えた。このEDTAおよびＢＨＴ無含有LDLストック溶液を、すべての酸化試験に用いた。ストック溶液を24時間以下の時間、4℃で保存した。酸化実験を実施するために、EDTA及びBHT無含有LDLストック溶液を酸素飽和0.01Mリン酸塩緩衝液pH7.4、0.16MのNaClで希釈して、新たに調製したCuCl_２水溶液の添加により、酸化を開始した。最終条件は、すべての実験において：室温、0.25mgLDL/mlおよび1.66mMのCuCl_２（Esterbauer et al., 1989参照）であった。
【０１５７】
次の化合物の酸化防止剤活性を試験した：ダイゼイン（10mM）、ゲニステイン（10mM）、グリシテイン（10mM）、ビオカニン（10mM）、ホルムオノネチン（10mM）、プロメンシル（Promensil、登録商標）（Novogen）（2.5mg/ml、5mg/ml）、Cpd.５（10mM）、Cpd.７（10mM）、Cpd.８（10mM）、Cpd.１２（10mM）、Cpd.４（10mM）およびCpd.６（10mM）。各実験において、コントロールを用いてNovogenイソフラボン誘導体の相対効力を、一般的かつ既知の酸化防止剤、例えばアスコルビン酸塩（2.5mM；ビタミンＣ）と比較した。
【０１５８】
結果
試験した濃度（10mM）で、親イソフラボンはフリーラジカルを掃去する能力を全く示さなかった、ということが判明した。他方、プロメンシルは、中等度の掃去剤であり、陽性コントロールと比較した場合、遅れ時間を100％まで（5mg/mlで）増大することを示した（表２参照）。
【０１５９】
【表２】

【０１６０】
イソフラボン誘導体を試験したとき、Cpd.１２（10mM）およびCpd.８（10mM）は、非常に活性な掃去剤であって、陽性コントロールと比較した場合、遅れ時間を600％以上増大することが判明した（表３参照）。Cpd.７は、Cpd.８およびCpd.１２より有意に低活性であるが、依然としてアスコルビン酸塩とほぼ同じ活性であることが判明した。
【０１６１】
【表３】

【０１６２】
トコフェロール媒介性過酸化の防止（抗 TMP 試験）
イソフラボン誘導体が、ビタミンEの存在下でLDL酸化を防止し得るか否かを確定するために、試験を実行した。この試験は、ビタミンE（a-トコフェロール）が血流中にLDLとともに存在するため、およびLDL酸化がアテローム性動脈硬化症の発症の主要因子の１つであると考えられるために、生理学的に重要である。
【０１６３】
方法
抗TMP試験は、Bowry et al. (1995)により詳細に説明されている。当該試験は、軽度の化学的に制御された酸化を受けているヒトLDL中のa-トコフェロールとシナジー作用をする化合物の能力を間接的に評価する。内因性のa-トコフェロールの20％消費に対応する時点におけるコレステロールエステルヒドロペルオキシドの蓄積により、酸化を測定する。
【０１６４】
要するに、アスコルビン酸塩およびユビキノール-10無含有LDL（アポＢ中に１mM）に、試験される化合物のストック溶液のアリコートを添加した。混合物を37℃で10分間インキュベートし、その後、AAPH（4mM）から生成される低フラックスの水溶性ＲＯＯ-を用いて37℃で酸化させた。LDL a-トコフェロールの時間依存性消費ならびにコレステリルリノレートヒドロペルオキシド（cholesteryllinolate hydroperoxide）（Ch18：2-ＯＯＨ）の蓄積を、それぞれ電気化学的およびポストカラム化学発光検出を用いたHPLCによりモニタリングした。抗TMP指数（レドックス指数）として特定される酸化防止剤の効力を、コントロール試料（すなわち、酸化防止剤の非存在下）における内因性a-トコフェロールの20％消費後に測定される、酸化防止剤を添加した場合と添加しない場合とで生成されるCh18：2-ＯＯＨの相対量として規定した。活性化合物は、低レドックス指数を生じる。高レドックス活性は、化合物が、おそらくはa-トコフェロキシルラジカルを還元することにより、LDL中のa-トコフェロールと相互作用できる、ということを示唆する。ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT、10mM）を、陽性コントロールとして用いた。
【０１６５】
結果
Cpd.１２（10mM）は、強力なLDL保護作用（低レドックス指数）を有し、ビタミンEの存在下でLDL酸化を防止する、ということが判明した。さらに、Cpd.７およびCpd.８は、低レベルの活性を示した。結果を表４に要約する。
【０１６６】
【表４】

【０１６７】
さらに、多数の親イソフラボンを試験し、それらが酸化防止作用を有さないことが判明した。プロメンシルは低レベルの活性を示した（表５参照）。
【０１６８】
【表５】

【０１６９】
a- トコフェロールとの相乗作用（ TRAA 試験）
この試験の目的は、セチルトリメチルアンモニウムクロリドcetyltrimethyl ammonium chlorideおよびドデシル硫酸ナトリウムミセル中のa-トコフェロキシルラジカルを減じるイソフラボン誘導体の能力を評価することであった。
【０１７０】
方法
ａ−トコフェロキシルラジカル減衰能力（TRAA）アッセイは、Witting et al. (1997)に詳細に説明されている。すなわち、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（HTAC）およびドデシル硫酸ナトリウム（SDS）のストック溶液100mMを、リン酸塩緩衝液中に調製した。500mMの最終ビタミン濃度でミセル中にa-トコフェロール（0.2M）のエタノール溶液を希釈することにより、a-トコフェロールのミセル分散液を調製した。結果として得たこの溶液を15秒間音波処理すると、その時点で完全に均質になった。
【０１７１】
LDLを、非絶食健常男性ドナー（27歳）から新たに採取したヘパリン処理血漿の超遠心分離により、単離した。LDLを直接吸引によって得て、使用前に4℃で16時間保存した。使用直前に、過剰なKBrおよび残留低分子量水溶性酸化防止剤をLDLからPD-10カラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより除去し、LDLの濃度をLowry et al. (1951)により記載されるように測定した。
【０１７２】
a-トコフェロール含有ミセルのアリコートを、ESRフラットセル（100mL）の頚部に入れて、UV光源として用いた125WのOsram HQL-Mercury蛍光球（fluorescent bulb）から0.5mに配置した。光強度を増大するために、電球のつや消しケーシングを除去した。試料を３分間照射し、その後十分混合した後、ESRキャビティ中の対応する恒温デュワーインサート（temperature-controlled Dewar insert）にフラットセルを移し、ここで試料を37℃に平衡させた。この手法は、10mMのTPDIニトロオキシド標準に対して概算したように、1〜2mMの間のa-トコフェロキシルラジカル（a-TO）をもたらした。Ｘバンドキャビティを装備したBruker ESP 300 ESR分光計を用いて、変調振幅1.0G、マイクロ波電力20nWおよび変調周波数12.5kHzで、9.41GHzでESRスペクトルを得た。
【０１７３】
Ｔ＝０分スペクトルの蓄積後、a-TOを含有するフラットセル配列をESRキャビティから除去し、溶液を正圧下でフラットセルの頚部に静かに導入した。次に選定化合物を添加して、最終濃度を10mMとし、処理試料をキャビティ中に再び入れて、標準条件と平衡させて、サンプリングを再開した。a-TOに関するESRシグナル強度の時間依存性減衰を、20.5秒の清掃時間（sweep time）を用いて、共酸化防止剤（co-antioxidant）（10mM）を添加した場合および添加しない場合の両方で測定し、各時点での３連続清掃からの出力を平均し、３つの別個の実験の結果を平均化した。
【０１７４】
結果
結果は、試験試料の存在下でのa-トコフェロキシルラジカルの減衰の相対速度定数を試験試料の非存在下でのa-トコフェロキシルラジカルの減衰の相対速度定数で割った値として表す。TRAA近似単一体（TRAA approaching unity）は、弱い相乗活性を有するとみなされるが、活性化合物は、それらが混合時に直ちにa-トコフェロキシルラジカルを排除するため、大きい値を示す。アスコルビン酸塩を陽性コントロールとして用いた。
【０１７５】
Cpd.１２は高率の減衰を誘導し、a-トコフェロキシルラジカル排除時に活性である、ということが判明した。結果を表６に要約する。
【０１７６】
【表６】

【０１７７】
しかしながら、トコフェロキシルラジカルにより触媒されるもの以外の酸化反応も、重要であると思われる。したがって、誘導体が付加的酸化防止剤活性を保有するか否かを調べた。
【０１７８】
４．５ ペルオキシルラジカル掃去（ scavenging ）
ペルオキシルラジカル（ビタミンEの非存在下で）により誘導されるリノリエート酸化を阻害するイソフラボン誘導体の効力を試験した。この試験は、誘導体が、ビタミンEと無関係のラジカル掃去活性を有するか否かに関する情報を提供した。
【０１７９】
方法
ペルオキシルラジカルは、多数の酵素、例えばリポキシゲナーゼおよびシクロ−オキシゲナーゼの天然副産物である。ペルオキシルラジカルは、熱不安定性アゾ開始剤（thermo-labile azo-initiator）AAPHにより、生成した。リノリエートのAAPH誘導酸化を、より低いリノリエート濃度を用い、かつSDSを省いた以外は、上記（Pryor et al., 1993）と同様に実施した。リノリエートストック溶液のアリコートを37℃でPBSに添加して、最終濃度を500mMとした。10mMのCpd.７、Cpd.８またはCpd.１２、あるいは500mMのアスコルビン酸塩（陽性コントロール）のいずれかの非存在下および存在下で、AAPH（最終濃度87.5mM）の添加により、酸化を開始した。リノリエートヒドロペルオキシドの生成を、Perkin Elmerの紫外／可視ラムダ40分光光度計（UV/Vis Lambda 40 spectrophotometer）を用いてUV234nmによりモニタリングした。試験を単一分析として２回実施した。適切な濃度のアルコール（エタノールおよびイソプロパノール；0.13〜0.2％（v/v））をそれぞれのコントロール試料中に含入した。
【０１８０】
ダルベッコのPBSは、Sigma, St Louis, MOから購入した。水溶性アゾペルオキシルラジカル発生剤2,2’-アゾビス(2-アミジノプロパン)ジヒドロクロリド（AAPH）は、Polysciences, Warrington, PAから購入した。アスコルビン酸塩（ナトリウム塩）は、Merckから購入した。AAPH（350mM）のストック溶液は、ダルベッコのPBSを用いた連続希釈により調製した。試験化合物（10mM）のストック溶液は、エタノール溶液として調製したが、リノリエート（300mM）のストック溶液は、イソプロパノール中に溶解することにより作った。
【０１８１】
結果
10mMのCpd.１２の含入により、リノール酸のAAPHへの曝露により誘導される234nm吸光度の時間依存性増大を有意に阻害する、ということが判明したが、これは、Cpd.１２がアルキルペルオキシルラジカルの効率的な剤であることを示す。類似の結果を、２つの別個の実験で得た。アスコルビン酸塩（陽性コントロールとして使用）は、リノール酸のAAPH誘導酸化を防止し、これは既存の文献と一致する。
【０１８２】
４．６ リノリエートのペルオキシダーゼ誘導酸化の防止
この試験の目的は、イソフラボン誘導体がヘム触媒酸化反応に影響を及ぼし得るか否かを試験することであった。このような酸化反応は、in vivoに関連すると考えられ、基質（単数または複数）として脂質、タンパク質および／またはDNAを用いて起こり得る。
【０１８３】
方法
当該試験は、ペルオキシルラジカル発生剤の代わりに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）＋過酸化水素（H_２O_２）を用いた以外は、上記の４．５節に記載されたペルオキシル掃去と類似する。
【０１８４】
ヘムレベルの増大は、アテローム性動脈硬化症に関して潜在的リスク因子と考えられ、ヘム含有タンパク質はLDLの酸化的修飾に関与し得る。H_２O_２の存在下では、ヘムタンパク質は、脂質、例えばLDL中の脂質を酸化的に修飾し得る強力な酸化剤（化合物Iと呼ぶ）を生じる。したがって、モデルヘムタンパク質としてホースラディッシュペルオキシダーゼを用いて、このような脂質酸化を阻害するイソフラボンの能力を試験した。リノリエートのHRP/H_２O_２誘導酸化は、LDLをリノリエートに置き換えることにより、主としてWitting et al (1997)により記載されたのと同様であった。リノリエートストックを３７℃でPBSに添加して、最終濃度を300mMとし、10mMのCpd.７、Cpd.８またはCpd.１２あるいは２５mMのBHT（陽性コントロール）のいずれかの非存在下および存在下で、HRP（40U/mL）/H_２O_２（2mM）により酸化した。リノリエートヒドロペルオキシドの生成を、Perkin Elmerの紫外／可視ラムダ４０分光光度計を用いてUV２３４nmによりモニタリングした。上記の試験を１回の分析として２回実施した。適切な濃度のアルコール（エタノールおよびイソプロパノール；0.13〜0.2％（v/v））をそれぞれのコントロール試料中に含入した。
【０１８５】
ダルベッコのPBS、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）および酸無含有リノリエートは、Sigma、St. Louis、MOから購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP；Grad II；100,000U/502.5mg lyop．粉末）は、Boehringer Mannheim（Germany）から購入した。過酸化水素（H_２O_２；30％（w/v））はMerckから購入した。HRP（6000U/mL）のストック溶液およびH_２O_２（１M）のストック溶液は、ダルベッコのPBSを用いた連続希釈により調製した。ＢＨＴ（25mM）および試験化合物（10mM）はエタノール溶液として調製したが、リノリエート（300mM）のストック溶液はイソプロパノール中に溶解することにより作った。
【０１８６】
結果
イソフラボンが強力な酸化化合物Iと反応し得るか否かを調べるために試験を実施した。
したがって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ＋H_２O_２をイソフラボン誘導体（Cpd.７、Cpd.８またはCpd.１２）に曝露した。Cpd.７とCpd.８の両方は、リノール酸酸化を25mMのBHT（陽性コントロールとして使用）と同様に効果的に化合物Iによって阻害し得る、ということが判明した。意外にも、Cpd.７およびCpd.８の阻害活性は、等モル量のCpd.１２よりも大きかったが、これは、それらの作用メカニズムが複雑であり得ることを示唆する。
【０１８７】
４．７ リポキシゲナーゼの阻害
リポキシゲナーゼは、酸化活性化を要する、潜在的に前炎症性の酵素であり、触媒作用時にペルオキシルラジカルを放出する。イソフラボン誘導体を、ダイズおよびウサギ網状赤血球15-リポキシゲナーゼおよび基質としてリノール酸を用いて、in vitroでのリポキシゲナーゼ活性に及ぼすそれらの能力に関して試験した。
【０１８８】
方法
１５−リポキシゲナーゼは、in vivoのLDL酸化の初期段階に関与することが示唆されており、かつアテローム発生の一因となることが示唆されている（Kuhn et al., 1994; Folcik et al., 1995）。ダイズ15-リポキシゲナーゼ（SLO）は、15-リポキシゲナーゼの適切なモデルであり、したがって、この酵素を阻害するCpd.７、Cpd.８およびCpd.１２の能力を評価するために用いた。上記と同様に、リノリエートのSLO誘導性酸化を実施した（Upston et al., 1996）。要するに、PBS中のリノリエート（100mM）を、10mMのCpd.７、Cpd.８またはCpd.１２あるいは100mMのエイコサテトラエン酸（ETYA、陽性コントロール）の非存在下および存在下で、SLO（60U/mL）により酸化した。リノリエートヒドロペルオキシドの生成を、Perkin Elmerの紫外／可視ラムダ40分光光度計を用いてUV234nmによりモニタリングした。上記の試験を１回の分析として２回実施した。適切な濃度のアルコール（エタノールおよびイソプロパノール；0.13〜0.2％（v/v））をそれぞれのコントロール試料中に含入した。
【０１８９】
ダルベッコのPBS、酸無含有リノリエート、ダイズ15-リポキシゲナーゼ（SLO；630,000U/mgタンパク質）は、Sigma（St. Louis, MO）から購入した。アスコルビン酸塩（ナトリウム塩）およびエイコサテトラエン酸（ETYA）はそれぞれ、AldrichおよびCayman Chemicalsから購入した。SLO（12,000U/mL）のストック溶液およびアスコルビン酸塩（100mM）のストック溶液は、ダルベッコのPBSを用いた連続希釈により調製した。ETYA（33.3mM）のストック溶液および試験化合物（10mM）のストック溶液はエタノール溶液として調製したが、リノリエート（300mM）のストック溶液はイソプロパノール中に溶解することにより作った。
【０１９０】
結果
Cpd.１２は、234nm吸光度における増大の強力減衰により示されるように、タイプ１リポキシゲナーゼの有効な阻害剤である。実際、10mMでも、Cpd.１２は、リポキシゲナーゼの十分に確立された阻害剤である100mMのETYAに匹敵する阻害作用を示した。ペルオキシルラジカルの場合と同様に、Cpd.７もCpd.８もSLOを阻害できなかった。
【０１９１】
５．０ 脂質試験
５．１ リポタンパク質亜分画（ lipoprotein subfractions ）中のイソフラボンの分布
ウサギにおける血中コレステロール濃度に及ぼす食用ダイズタンパク質の作用は、MeekerとKestenにより1940年代に最初に報告された（Kristchevskyによる概説、1995を参照）。その後、血中コレステロール濃度に及ぼすイソフラボンの独立した作用に関する証拠は、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類およびヒトなどの種々のモデルにおいて実証されている（Carroll, 1991; Anderson et al., 1995; Potter, 1996; Balmir et al., 1996; Clarkson et al., 1998）。Cassidy et al. (1995)の報告によると、ヒトにおいては、４５ｍｇのイソフラボンは、若年女性における総コレステロール濃度およびLDLコレステロール濃度の有意の低減を生じるが、23mgのイソフラボンは生じない。同様の知見が、Potter et al (1993）およびBakhit et al. (1994)により報告された。対照的に、Nestel et al. (1997)は、5〜10週間の期間にわたって投与された45mgのゲニステイン（Cpd.３）が血中脂質濃度に及ぼす有意の作用を報告していない。
【０１９２】
血中コレステロールの調節におけるイソフラボンの関連性relevance isoflavonesを確証するために、実験を実施して、血清中のLDLおよびHDLに対するイソフラボン誘導体の親和性を調べた。予備試験では、その結果を以下に示すが、一つの化合物、すなわちCpd.１（ダイゼイン）のみを用いた。
【０１９３】
方法
Cpd.１(10mMおよび50mM）を、全血漿とともに0時間、4時間および8時間インキュベートした。次に、異なる亜分画LDL／VLDL、HDLおよびタンパク質（リポタンパク質非含有）を、それらのCpd.１濃度に関して分析した。イソフラボン合成誘導体に最もよく似た極性を有するという理由から、Cpd.１を用いた。
【０１９４】
結果
少量ではあるが有意量のCpd.１（ダイゼイン）がリポタンパク質と会合する、ということが判明した。Cpd.１の２％はLDLと会合し、６％はHDLと会合することが判明し、92％はタンパク質分画と会合した。リポタンパク質と会合される量は時間に伴って増大したが、濃度には伴わなかった。結果を図１３（Cpd.１、10mM）および図１４（Cpd.１、50mM）に示す。
【０１９５】
５．２ LDL 受容体の調節
心臓血管性疾患に関する高リスク因子は、LDLコレステロールレベルの上昇である。過剰量のコレステロールは、酸化損傷の、したがってアテローム性動脈硬化症の機会をより大きくする。エストロゲンは、アテローム性動脈硬化症の発症および心臓血管性事象の結果に多数の潜在的に有益な作用を及ぼす。17β-エストラジオールは、LDL受容体活性を増大することが示されている。植物由来エストロゲン（すなわちイソフラボンなどのフィトエストロゲン）が心臓血管性疾患の発生に対する保護活性を有し得るという証拠もあるが、これに関する根元的メカニズムは依然として不明である。イソフラボンおよびそれらの誘導体とエストロゲンのある特定の部分との構造的類似性を仮定すると、イソフラボンと関連化合物が類似の分子作用を有し得るか否かを試験することは興味深い。いくつかの試験は、イソフラボン（およびエストロゲン）が血中脂質プロフィールを改善するメカニズムは、LDL受容体の量または活性における変化によるものであり得る、ということを示唆した（Baum et al., 1998; Kirk et al., 1998）。LDL受容体活性に影響を及ぼすことにより、イソフラボン誘導体がコレステロールの代謝回転を増大し、かつ血流からのその除去を増大するか否かは、依然として確定されていない。したがって、コントロール細胞対試験化合物で前処理した細胞における標識化LDLの特異的結合を調べることにより、in vitroでのヒト肝細胞においてLDL受容体結合を刺激するCpd.７、Cpd.８およびCpd.１２の能力を検査するために試験を実施した。
【０１９６】
方法
10％ウシ胎仔血清（FBS）を含有する完全DMEM培地中で、試験化合物（最終濃度50nM、500nMおよび10mMのCpd.７、Cpd.８およびCpd.１２）の非存在下または存在下で48時間、集密ヒト肝癌（confluent human hepatoma）（HepG２）細胞をプレインキュベートした。血清奪取（serum deprivation）（すなわち0.5％FBS）を陽性コントロールとして用いて、LDL受容体発現を誘導した。プレインキュベーション後、細胞を洗浄した後、50ｍｇの[¹²⁵I]-LDL（比活性6.5〜29.5cpm/fmol）を添加し、細胞を4℃でさらに4時間、500mgの非標識化LDLの非存在下（総結合のため）および存在下（非特異的結合を評価するため）でインキュベートした。次に細胞を洗浄し、溶解（0.1MのNaOH）して、溶解物の放射能およびタンパク質含量（BCAアッセイ）を確定した。LDL受容体の数は、特異的結合（総結合−非特異的結合）から確定したが、LDL受容体当たり１分子のLDLが結合すると仮定した。３つの独立した実験（各々３回試験）を、異なるバッチの細胞および[¹²⁵I]-LDLを用いて実施した。
【０１９７】
結果
結合飽和に達するのに必要なLDLの濃度を確定するために、集密なHepG２細胞を、過剰（すなわち500mg）の非標識化LDLの存在下で[¹²⁵I]-LDL濃度を漸増させた１２ウエルプレート中でインキュベートした。飽和は、約50mgの[¹²⁵I]-LDLで到達した。この濃度を用いて、４℃で飽和結合に達するのに要する時間は、約４時間であると確定された。これらの確立された最適条件を、その後のすべての結合アッセイに用いた。
【０１９８】
全体的に、
異なる一連の実験で測定された多数のLDL受容体は互いに異なっていた（表７）。
【０１９９】
【表７】

【０２００】
コントロールを上回るLDL受容体発現の増分的増大（incremental increase)として表した結果からわかるように、Cpd.１２は一貫した作用を示さなかったが、Cpd.７およびCpd.８はLDL結合を増大した。Cpd.７（Cpd.８ではなく）の場合、LDL受容体の発現は、濃度依存的に増大したが、この増大の程度は、血清奪取により得られたものと比較した場合、小さかった。Cpd.８は、明白な濃度依存性作用を有さなかった。
【０２０１】
観察された作用は小さかったが、少なくとも血清奪取の場合と比較して、LDL結合の増大は、細胞およびLDLの両方の異なるバッチを用いた別個の組の実験において一貫して観察され、このことは、なされた観察がCpd.７およびCpd.８の真の活性を反映することを示唆している。これらの結果は、アテローム性動脈硬化性悪疫の再狭窄を伴う発症および進行の加速を防止するかまたは遅らせるイソフラボンおよびその誘導体の潜在能力を示す。
【実施例４】
【０２０２】
血管新性活性
血管新性は、内皮細胞の活性化、移動、増殖および再組織化として定義され得る多数の別個の工程を通って起こり、管腔を特徴とする成熟血管を形成する。血管新性、特に内皮細胞増殖および内皮細胞移動に及ぼすイソフラボン誘導体の作用は、in vitroアッセイにより評価される。
【０２０３】
４．１ 内皮細胞増殖に及ぼすイソフラボン誘導体の作用
方法：
細胞調製
通路１と３の間のヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた。20％ウシ胎児血清、25mg/ml内皮細胞増殖サプリメントおよび25mg/mlヘパリンを添加したEarle塩を含有する、培地199中でゼラチン被覆フラスコ中で細胞を増殖させた。2名の異なるドナーからの細胞を用いた。
【０２０４】
増殖アッセイ
100ｍｌ増殖培地中の5×103細胞を、ゼラチン被覆マイクロタイターウエル中にプレーティングした。試験化合物をプレーティング時に添加した。次に細胞を3日間インキュベートし、比色定量アッセイ（CellTiter96 Aqueous assay、Promega）により細胞数を測定した。結果を標準曲線と比較し、各実験で実施した。２つの異なる内皮細胞単離物を用いて、アッセイを２つの異なる日に実施した。ヒト臍帯静脈内皮細胞の増殖に及ぼすイソフラボン誘導体の作用を、ドナーNo.１（図１５）およびドナーNo.２（図１６）に関して示す。
【０２０５】
結果：
図１５および１６は、内皮細胞増殖に及ぼすCpd.５、Cpd.７、Cpd.８およびCpd.１２の作用を示す。Cpd.８（1〜10mg/ml）およびCpd.１２（0.01〜10mg/ml）の両方が細胞増殖を阻害し、毒性を生じなかった。興味深いことに、これらの化合物に対する細胞の応答性においてかなりの系統変動が認められた（図１５ａおよび図１６ａ）。Cpd.５（0.01〜10mg/ml）は、試験した２つの細胞単離物のいずれにおいても、内皮細胞増殖に明白な作用を及ぼさない、ということが判明した（図１５ｂおよび図１６ｂ）。同様に、Cpd.７（0.01〜10mg/ml）は、試験した２つの細胞単離物に及ぼす感知可能な抗増殖作用を全く示さなかった（図１５ｃおよび図１６ｃ）。
【０２０６】
４．２ 内皮細胞の移動に及ぼすイソフラボン誘導体の作用
方法：
細胞調製
通路１と３の間のヒト臍帯静脈内皮細胞を用いた。20％ウシ胎児血清、25mg/ml内皮細胞増殖サプリメントおよび25mg/mlヘパリンを補足したEarle塩を有する、培地199中でゼラチン被覆フラスコ中で細胞を増殖させた。
【０２０７】
移動アッセイ（ Migration Assay ）
増殖培地中の5×105細胞／ウエルを、フィブロネクチン被覆６ウエルトレイ上でプレーティングして、集密に増殖させた。細胞スクレーパー（Costar）の使用により、単層に沿って創傷を生じた。次に細胞を１回洗浄し、試験化合物を含有する新鮮な培地を添加した。創傷に沿った限定点（defined points）に、インクコンデンサー（Olympus microscopes）を用いて印をつけて、次の48時間の間、定点で、細胞の移動を可視化させた。適当な時間に写真を撮って、創傷最前部からの細胞移動の程度を評価した。
【０２０８】
結果：
図１７は、内皮細胞移動に及ぼすCpd.１２の作用を示す。写真は、ベースライン（0時間）（図１７ａ）での創傷および創傷後30時間の細胞移動の量を示す。Cpd.１２（最終濃度1mg/ml）による処置は、30時間後の創傷に向かう内皮細胞移動を顕著に阻害した(図ｃ）。DMSO（溶媒コントロール）は、増殖に作用を及ぼさず、処置の30時間後に、細胞は創傷に向かって移動して、単層を形成した（図１７ｂ）。創傷に沿った種々の点で写真を撮影したが、その点は実験の経過中一定であった。初期創傷最前部に印をつけた。
【０２０９】
この実施例の結果は、Cpd.８およびCpd.１２は内皮細胞増殖を阻害し、Cpd.１２は内皮細胞移動を阻害した、ということを示す。したがって、イソフラボンおよびその誘導体は、心臓保護療法としての、特に血管治療および外科手術後の使用の可能性を示す。
【実施例５】
【０２１０】
細胞接着分子発現の阻害
Eセレクチンの発現を阻害するイソフラボン化合物および誘導体の能力を、Litwin et al. (1997)に記載されたプロトコールにより測定し、これは、参照により本明細書に援用される。
【０２１１】
図１８は、Litwin等の方法に従って実行したEセレクチンの発現を阻害する多数のイソフラボン化合物の能力に関する比較データを提示する。TNF-_”により活性化されたヒト臍帯静脈内皮細胞におけるイソフラボン代謝産物Cpd.８および１２の相互作用を、化合物の濃度に対して測定した。細胞を、TNF刺激の前に、2時間または18時間、プレインキュベートした。DMSOコントロールとの比較に際して、イソフラボンCpd.８は、Eセレクチン発現の非常に良好な、特に10_”g/mlでの、阻害を示した。イソフラボンCpd.１２は、特に1_”g/mlおよび10_”g/mlの濃度で、Eセレクチン発現の優れた阻害を示した。
【０２１２】
本実施例は、特許請求されたイソフラボンおよび誘導体が、再狭窄、炎症性応答および細胞接着分子発現により媒介されるその他の疾患において活性であることが既知の多数のシグナルに応答する血管内皮細胞により発現されるEセレクチンの能力を特異的に遮断する、ということを立証する。
【実施例６】
【０２１３】
再狭窄モデル−細胞移動および増殖
ヒトにおけるアテローム性動脈硬化症の重要な特徴は、動脈中膜（arterial media）から内膜（intima）への血管平滑筋細胞（VSMC)移動と、その後の内膜内での増殖である。この実験に用いたアテローム性動脈硬化症の動物モデルは、内皮への機械的損傷によりVSMC移動および新生内膜増殖（neointimal proliferation）を誘導することを目的とした。プローブをマウスの大腿動脈に導入し、腸骨動脈を通して大動脈分岐に導入した。次にプローブを引き抜いて、大腿動脈を結繋し（ligated）て出血を防止した。側副循環（colateral circulation）は、いかなる四肢関連虚血をも防止する。新生内膜増殖は、その後の４週間にわたって、腸骨動脈で起きた。
【０２１４】
この時間中にマウスにコレステロールを給餌することにより、増殖は強化された（外科手術前１週間に開始）。4週間目に、マウスを屠殺し、両側の腸骨血管を採取した（コントロールとして非手術血管を用いた）。新生内膜増殖を、内膜面積対内膜＋中膜面積の比として表す。
【０２１５】
この技法（主として遺伝子ノックアウトマウスを用いる）は、5〜10匹のマウスというサンプルサイズを用いて、非常に再現性がよいことが判明した。図１９は、正常マウスにおける典型的な増殖のプロファイルを示す。最小増殖は3週目に観察され、増殖の実質的増大は4週目に認められ、その後5週目にさらなる増大が観察された。最小新生内膜増殖は、反対側からのコントロール非手術血管（「非血管」）で生じた。
【０２１６】
新生内膜過形成のマウスモデルにおける「アテローム性動脈硬化性」応答を低減および／または防止するイソフラボン誘導体の能力を調べた。試験した化合物は、Cpd.５およびCpd.１２であった。
【０２１７】
方法
プローブを用いて内皮を機械的に除去することにより、各マウスの大腿動脈にアテローム性動脈硬化症を誘導した。アテローム性動脈硬化性応答を阻害するイソフラボン化合物の能力を、処置群およびプラセボ群を比較することにより評価した。C57/B16マウス（8〜10週齢雄）に麻酔をかけて、解剖顕微鏡を用いて右大腿動脈を脱内皮処理した（de-endothilialized）。これらのマウスには、2％コレステロール餌も給餌して、疾患の進行を強化した。4週目にマウスを屠殺した。それらの処置動脈（右）およびコントロール動脈（左）をともに収集し、組織学的評価のためにホルマリン中に固定した。
【０２１８】
手術前の1週間、正常マウス餌と混合した2％コレステロール餌をマウスに給餌した。処置群に、Cpd.５またはCpd.１２あるいはCpd.５＋１２を含有する餌を与えた。マウスをアベルチンで麻酔し、大腿動脈の血管形成術を実施した。術後、静かな暗所の暖かいマットの上にマウスを移して、回復をしっかり監視した。マウスを、滅菌ベッドを有する滅菌ケージに収容して、感染を防いだ。マウスは、正常マウス餌と混合したコレステロール餌を次の4週間継続した。術後４週間目にマウスを安楽死させた。病理学的検査のために、それらの大腿動脈を収集した。切片を、画像解析により評価して、動脈壁の種々の切片の領域、および各領域中の細胞の数を確認した。評価される主なパラメーターは、内膜面積対内膜＋中膜の面積の比として表される内膜面積の増大であった。区間切片（50_”m毎または10切片毎）を標本にして、H＆Eで染色した。内皮、内膜および中膜の横断面領域を、画像解析を用いて評価した。
【０２１９】
結果
図２０は、術後4週目の腸骨動脈を通る横断切片を示す。図２０ａは、非手術側からの腸骨動脈中の新生内膜増殖の非存在を示し、この場合、内膜は約１細胞の厚みである。図２０ｂは、手術に応答した腸骨動脈中の実質的な新生内膜増殖を示し、血管壁の約50％の厚みを示している。図２０ｃおよび２０ｄは、それぞれCpd.１２およびCpd.５で処置したマウスからの術後腸骨動脈である。新生内膜増殖が各々の場合に観察され得るが、増殖はCpd.５においては有意に低減された。
【０２２０】
図２１は、新生内膜増殖に及ぼす試験化合物の作用を、個別および一緒の両方で、定量する。非処置血管（手術せず）は5±1％内膜厚を示し、一方、外科的処置のみの血管は50±5％内膜厚を示す。Cpd.５、は、単独で、およびCpd.１２との組合せの両方で、新生内膜増殖をそれぞれ30±6％および32±10％に低減したが、Cpd.１２は新生内膜増殖の程度の検出可能な作用を有さなかった（50±29％）。注目すべきことに、これらのデータは、新生内膜増殖を有意に低減するCpd.５と一致するが、感知可能な作用を有さないCpd.１２とは一致しない。
【０２２１】
新生内膜増殖の面積は、画像解析を用いて測定される内膜内の細胞の数とよく対応する、ということは注目される。
【０２２２】
これらの結果は、イソフラボンおよびその誘導体、特にCpd.５が、アテローム性動脈硬化症のマウスモデルの新生内膜におけるVSMCの増殖を有意に阻害する、ということを示す。新生内膜面積は、試験した時点(４週目）で約50％低減された。Cpd.１２は、この時点でのマウスモデルにおける新生内膜増殖に感知可能な作用を及ぼさなかった。Cpd.５とCpd.１２の組合せは、Cpd.５単独で観察された阻害作用を変えるとは思われなかった。これらの結果は、VSMCの移動および進行を調整し、かつアテローム性動脈硬化性プラークの、それゆえ機械的損傷後の再狭窄の発症および進行を防止するかまたは遅らせ、それにより血管保護における利点を提供するイソフラボンおよびその誘導体の潜在能力を示す。
【０２２３】
読者が不当な実験をせずに本発明を実行できるように、ある特定の好ましい実施形態を参照しながら、本明細書中で本発明を説明してきた。しかしながら、多数の構成成分およびパラメーターが、本発明の範囲を逸脱しない程度まで、変更または修正され得る、と
当業者は容易に認識するであろう。さらに、表題、見出し等は、読者の本明細書への理解を強化するために提示されたものであり、本発明の範囲を限定するものであると理解されるべきでない。
【０２２４】
本明細書中に引用したすべての出願、特許および出版物の全開示内容は、もしあれば、参照により本明細書中に含まれる。
【０２２５】
本明細書中に記載した本発明は、具体的に記載されたもの以外の変更および修正がなされてもよい、と当業者は理解するであろう。本発明はこのような変更および修正をすべて包含する、と理解されるべきである。本発明は、個別にまたは集合的に本明細書中で言及されるかまたは示された工程、特徴、組成物および化合物のすべてを、そして、当該工程または特徴の任意の２つまたはそれ以上のいかなるおよびすべての組合せも包含する。
【０２２６】
本明細書中のどのような従来技術に対する言及も、その従来技術が当該研究分野（the field of endeavour）での共通の一般的知識の一部を形成するという認識またはいかなる形態の示唆でもなく、そのように解釈されるべきでない。
【０２２７】
参考文献一覧
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【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】説明なし
【図２】説明なし
【図３】説明なし
【図４】説明なし
【図５】説明なし
【図６】説明なし
【図７】説明なし
【図８】説明なし
【図９】説明なし
【図１０】説明なし
【図１１】説明なし
【図１２】説明なし
【図１３】説明なし
【図１４】説明なし
【図１５】説明なし
【図１６】説明なし
【図１７】説明なし
【図１８】説明なし
【図１９】説明なし
【図２０】説明なし
【図２１】説明なし【Technical field】
[0001]
The present invention relates generally to a method of inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell by contacting the adhesion molecule or the endothelial cell with one or more isoflavone compounds or derivatives thereof. The present invention relates generally to methods of preventing or reducing the risk of restenosis after angioplasty, and atherosclerosis, coronary artery disease and other cardiovascular diseases mediated by adhesion molecules And also methods of treating or preventing inflammatory diseases. The invention further relates generally to pharmaceutical compositions useful in these methods, and to methods for making such medicaments. Further aspects of the present invention will become apparent from the description below.
[Background Art]
[0002]
Note: Bibliographic details of the publications referred to by author in this specification are collected at the end of the description.
[0003]
Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the intima of the arteries characterized by focal accumulation of leukocytes, smooth muscle cells, lipids and extracellular matrix. The deposition of lipids and other blood derivatives, especially in the vessel walls of large arteries, causes plaque formation. Continued attachment of lipids and leukocytes to the vessel wall will result in a concomitant thickening of the vessel wall. Increased plaque size results in stenotic properties, which can cause vascular occlusion due to atheroma, thrombosis or embolism. Severe vascular problems can occur, such as infarction, heart failure, stroke and sudden death.
[0004]
An important predisposition to the development of atherosclerosis is the level of cholesterol in the blood. Atherosclerotic plaques consist primarily of cells that contain cholesterol. As a result, high blood cholesterol levels are associated with an increased risk of atherosclerosis. High absolute levels of cholesterol are an important risk factor, while the risk is more specifically related to the type of lipoprotein present in the blood. According to a broad medical perspective, low-density lipoprotein (LDL) and very low-density lipoprotein (VLDL) are harmful, while high-density lipoprotein (HDL) is at risk for developing atherosclerosis. Has been shown to be a beneficial factor. In short, the ratio of HDL to LDL in the bloodstream is an important factor. The higher the ratio of HDL to LDL, the more patients will be protected against the development of atherosclerosis, even if their total cholesterol levels are slightly elevated. This view has been supported by clinical trials conducted in a number of centers and countries.
[0005]
Numerous clinical and epidemiological studies have shown that high levels of total cholesterol in the blood, especially high levels of low-density cholesterol in the blood, especially high LDL: HDL cholesterol ratios, It was identified as a major risk factor for the development of sclerosis. This has led to a variety of therapeutic strategies intended to reduce this risk. There are two broad strategies that have shown varying degrees of success. The first is the use of drugs that interfere with cholesterol synthesis. A second strategy is to reduce the absorption of cholesterol from the intestine by using a resin, thereby reducing the pool of cholesterol in the body. However, in general, neither of these two strategies is optimal due to the resulting side effects and limited efficacy.
[0006]
The development of atherosclerosis is progressed by the oxidation of LDL cholesterol in the arterial wall, resulting in inflammatory lesions. If left unchecked, the inflammatory process will progress until the lesion causes vascular architecture, occlusion and infarction.
[0007]
Antioxidants are molecules or compounds that can inhibit oxidation (ie, damage) by chemically inactivating free radicals produced during normal physiological function. If the body lacks the supply of antioxidants, some free radicals will still remain active, attack healthy cells, or convert safe compounds to damaging compounds. Antioxidants play many important roles in cardiovascular disease. They are of particular interest as potential inhibitors of atherosclerosis by inhibiting the oxidative modification of low density lipoprotein (LDL). Lipoproteins are the major carriers of cholesterol in the body. Most cholesterol associates with LDL and with LDL which is distributed throughout the body from the liver. High density lipoprotein (HDL) "wipes" excess cholesterol present in the blood and returns it to the liver. Lipoproteins are very susceptible to oxidation and, once oxidized, can accumulate in healthy arterial and vascular walls without being metabolized. Such lipoprotein accumulation greatly increases the risk of atherosclerosis. In particular, the oxidation of LDL in the sub-endothelial space represents an early causative process in atherogenesis (Non-Patent Document 1). Thus, inhibition of oxidized LDL formation by antioxidants is generally thought to slow disease progression. This is another area of protection in cardiovascular diseases where cardioprotective agents are effective, where more and better agents are sought.
[0008]
Another area in the development of vascular disease and plaque formation is the role played by cell adhesion molecules, as outlined in [2]. Cell adhesion molecules are involved in the adhesion of leukocytes and monocytes to tissues including vascular endothelium. Known cell adhesion molecules include intercellular adhesion molecules (ICAM1, 2 and 3), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) and platelet endothelial cell adhesion molecule-1 (PECAM-1). The role of adhesion molecules in the pathogenesis of cardiovascular disease is supported by the observation that cell adhesion molecules are expressed in atherosclerotic lesions. In addition, cell adhesion molecules are up-regulated by several coronary heart disease risk factors, and antibodies to cell adhesion molecules are thought to prevent reperfusion injury in animal models. Thus, modulation of the expression or activity of adhesion molecules associated with endothelial cells may be useful for treating or preventing cardiovascular pathology by limiting the development of atherosclerotic plaque.
[0009]
Other molecules, such as E-selectin, P-selectin and L-selectin, exhibit adhesive functions. In particular, E-selectin is a cell surface protein that is inducibly expressed in cytokine-activated endothelial cells in response to inflammatory factors such as those caused by tissue damage. Expression of E-selectin by endothelial cells can also be induced by inflammatory factors including interleukin-1 (IL-1), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and various endotoxins. E-selectin expression is associated with the binding of endothelial cells and platelets to leukocytes and lipids. Leukocyte binding to endothelial cells is observed early in tissue injury and is associated with various acute and chronic inflammations. Suppression or inhibition of the expression or activity of adhesion molecules associated with endothelial cells limits focal accumulation and adhesion of leukocytes to vascular walls, especially in areas of injury, damage or infection.
[0010]
In the treatment of atherosclerosis, angioplasty has been developed to enable non-surgical intervention of atherosclerotic plaque. During angioplasty treatment, a balloon catheter is used to dilate the vessel beyond its ability to completely recoil, thereby expanding the vessel lumen and thereby increasing blood flow. However, this procedure causes mechanical damage to the arterial wall, after which restenosis usually occurs. In fact, restenosis is a major problem following traumatic injuries caused to blood vessels during vascular surgery and treatment.
[0011]
A variety of other treatments have been proposed to address the development of restenosis, including surgical treatments and drugs and gene therapy. Such therapies include administration of compounds that inhibit cell division and hyperproliferative disorders, necrosis vascular smooth muscle cells, and block the expression of endothelial cell adhesion molecules. Additional compounds useful in addressing restenosis include hyperlipidemia drugs, antiplatelet drugs, antithrombotics, calcium channel blockers, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors and beta-blockers . However, in general, side effects that need to be monitored or counterattacked are often observed because the therapeutic is not selective. In this regard, reference is generally made to drugs in use, such as Ticlid (ticlopidine), Plavix (clopidrogel) and Cardiprin (Aspirin). Typically, gastrointestinal disorders and skin rashes are commonly reported side effects with their use. Other agents, such as heparin, reportedly inhibit smooth muscle cell proliferation in vitro, but when used in vivo have the adverse side effect of inhibiting coagulation.
[0012]
Given that vascular disease is generally the leading cause of death in today's society, and there is a strong need to identify new, improved, better alternatives and pharmaceuticals for its treatment and prevention .
[0013]
Therefore,
It is a preferred object of the present invention to provide a method for the treatment, amelioration or prevention of restenosis associated with vascular and inflammatory diseases, especially vascular treatment. It is a further preferred object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment, amelioration or prevention of vascular and inflammatory diseases, especially cardiovascular diseases. It is yet another preferred object of the present invention to provide methods and compositions that inhibit the expression or activity of adhesion molecules in endothelial cells.
[Non-patent document 1]
Steinberg D, Parthasarathy S, Carew TE, Khoo JC, Witztum JL "Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity". N Engl J Med 1989 Apr 6; 320 (14): 915-24
[Non-patent document 2]
Hillis GS and Flapan AD "Cell adhesion molecules in cardiovascular disease: a clinical perspective". Heart 1998 May; 79 (5): 429-31
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[0014]
Surprisingly, we have found that isoflavone compounds, their metabolites and derivatives, are particularly useful for inhibiting or down-regulating the expression or activity of adhesion molecules in endothelial cells. . Isoflavones and derivatives thereof have also been found to be particularly useful for inhibiting endothelial cell surface adhesion molecules, particularly E-selectin and VCAM-1.
[0015]
We believe that isoflavones and derivatives thereof are useful for angioplasty treatment of vascular treatments, such as atherosclerosis, and the resulting mechanical damage at the site of angioplasty during the treatment of atherosclerotic lesions. It has also been surprisingly found that it finds use in preventing or reducing the risk of restenosis associated with.
[0016]
Isoflavone compounds, metabolites, derivatives and analogs thereof useful in the method of the present invention are represented by general formula I as set forth below.
[0017]
Thus, according to a first aspect of the present invention there is provided a method of inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell, the method comprising inhibiting the expression or activity of the adhesion molecule or the endothelial cell. Contacting with one or more compounds of formula I in an amount sufficient to
[0018]
Preferably, the adhesion molecule is E-selectin or a vascular cell surface adhesion molecule (VCAM-1).
[0019]
According to a second aspect of the present invention there is provided a method of inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell of a subject, the method comprising a therapeutically effective amount of one or more of the formulas Administering the compound of I to the subject.
[0020]
According to a third aspect of the present invention there is provided a method of treating a disease mediated by the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell in a subject, the method comprising: Administering to the subject one or more compounds of Formula I in an amount sufficient to inhibit the expression or activity of
[0021]
Preferably, said disease is a vascular disease such as restenosis, inflammatory disease, coronary artery disease, angina or small vessel disease, more preferably restenosis after angioplasty.
[0022]
According to a fourth aspect of the present invention there is provided a method of treating, ameliorating, preventing or reducing the risk of restenosis in a subject, the method comprising a therapeutically effective amount of one or more of one or more Formula I Administering the compound to the subject.
[0023]
Typically, restenosis is associated with vascular treatment, such as coronary intervention. Preferably, the vascular coronary treatment is a percutaneous transluminal coronary angioplasty, a directional coronary atherectomy or a stent, more preferably an angioplasty.
[0024]
According to a fifth aspect of the present invention there is provided a method of treating procedural vascular trauma in a subject, the method comprising: administering a therapeutically effective amount of one or more compounds of formula I. Administering to a subject.
[0025]
Preferably, the procedural vascular trauma is an angioplasty, vascular surgery, graft or transplant procedure.
[0026]
According to a sixth aspect of the present invention there is provided a method of treating or preventing a vascular disease in a subject, the method comprising administering to the subject a therapeutically effective amount of one or more compounds of formula I. The step of performing
[0027]
Preferably, the vascular disease is restenosis, inflammatory disease, coronary artery disease, angina or small vascular disease, more preferably restenosis after angioplasty.
[0028]
According to a seventh aspect of the present invention there is provided a pharmaceutical composition in a dosage form suitable for use in treating a disease mediated by the expression or activity of an adhesion molecule associated with endothelial cells in a subject. The compositions comprise one or more compounds of Formula I together with a pharmaceutically acceptable carrier.
[0029]
According to an eighth aspect of the present invention there is provided a pharmaceutical composition in a dosage form suitable for use in preventing or reducing the risk of a vascular disease in a subject, said composition comprising a pharmaceutically acceptable composition It comprises one or more compounds of the formula I together with a carrier.
[0030]
According to a ninth aspect of the invention, the use of one or more compounds of formula I in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease mediated by the expression or activity of adhesion molecules associated with endothelial cells is described. Provided.
[0031]
According to a tenth aspect of the present invention there is provided the use of one or more compounds of formula I in the manufacture of a medicament for the treatment of vascular disease and / or procedural vascular trauma.
[0032]
These and other aspects of the invention will become apparent from the following description and claims, taken in conjunction with the accompanying drawings.
[0033]
Throughout this specification and the appended claims, unless stated otherwise, the word "comprise" and its variants "comprises" or "comprising" Includes the described whole or step or group of completes or steps, but excludes any other complete or step or group of completes or steps. It is understood that this does not mean.
[0034]
The accompanying FIGS. 1-21 illustrate, but are not limited to, aspects of the present invention. A description of each of the figures is provided through the following examples.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0035]
The term "stenosis" is to be interpreted in its broadest sense, meaning to reduce or tighten the diameter of a body passage or orifice, particularly a blood vessel or artery, and generally to reduce blood flow. As well as the attendant problem of vascular occlusion. Typically, stenosis occurs as a result of focal accumulation and deposition of lipids and other blood derivatives.
[0036]
The term "restenosis" or restenosis or secondary stenosis is to be interpreted in its broadest sense and refers to the recurrence of stenosis, typically after vascular treatment, injury or surgery, for example after balloon catheter treatment. . Stenosis and restenosis can occur in blood vessels in the body, but of particular medical importance are the life-threatening and often fatal effects of stenosis in coronary arteries.
[0037]
Isoflavones and their derivatives respond to a number of signals known to be active in atherosclerosis, restenosis, inflammatory responses and other diseases mediated by the expression of cell adhesion molecules, leading to endothelial cell surface It has been surprisingly found that it blocks the induced expression of adhesion molecules, especially E-selectin and VCAM-1. The results indicate that isoflavone compounds and their derivatives are useful in the treatment and prevention of restenosis, coronary artery disease, angina and other vascular and cardiovascular diseases, inflammatory diseases mediated by the adhesion molecules E-selectin and VCAM-1 Is shown. The specific molecular mechanisms by which isoflavones and derivatives function in inhibiting cell adhesion molecule expression are not well understood.
[0038]
It has further been shown that isoflavones and derivatives thereof inhibit cell proliferation of human vascular smooth muscle cells and also inhibit PDGF-induced Erk activation in human vascular smooth muscle cells. This activity indicates that isoflavones and their derivatives may prevent the development and progression of atherosclerotic lesions and provide potential benefits in vascular protection.
[0039]
Isoflavones and derivatives thereof have been shown to inhibit endothelial cell proliferation and inhibit endothelial cell migration, and thus can be used as cardioprotective therapies, such as treating, ameliorating or preventing restenosis after vascular treatment Has the property.
[0040]
It has also been shown that isoflavones and their derivatives have potent vasoregulatory capabilities. Thus, isoflavones and derivatives thereof can offset contractile activity, directly offset vasodilation, and protect against endothelial damage by oxidized low density lipoproteins. Their activity is comparable to the ovarian steroid 17β-estradiol, but also appears to be unique to their mechanism of action. Thus, isoflavones and derivatives also show potential for use as cardioprotective therapies, such as treatment, amelioration or prevention of restenosis after vascular treatment.
[0041]
Isoflavone compounds and derivatives are useful in treating patients with small vascular diseases that are not treatable by surgery or angioplasty, or other vascular diseases for which surgery is not an option, and before and after revascularization. It can be administered to stabilize. Active compounds are generally used immediately before and after vascular treatment, such as coronary angioplasty or vascular angioplasty, as a means to reduce or eliminate hyperproliferative and inflammatory responses that result in clinically significant restenosis. Can also be administered. In addition, isoflavones may be used in the treatment of heart transplant rejection and vascular transplants and transplant procedures.
[0042]
The methods of the present invention represent a significant advance in the treatment of vascular conditions and diseases in that they simply go beyond known therapies intended to inhibit disease progression. The experimental data provided herein unexpectedly showed that restenosis following vascular treatment or angioplasty was inhibited or at least significantly reduced in various mammalian models. . Thus, when used properly, the method of the present invention treats restenosis medically, and possibly by preventing the development of new lesions and stabilizing or regressing established lesions, resulting in atherosclerotic changes. Demonstrates the potential of isoflavone compounds and their derivatives to cure sclerosis.
[0043]
Isoflavones comprise a class of phytoestrogens found primarily in legumes that have estrogenic activity associated with their structural similarity to steroidal estrogens. The importance of isoflavones has only recently been recognized due to the reduced risk of developing osteoporosis in mammals, some forms of cancer and its apparent association with its ability to lower cholesterol levels and blood pressure. It was also suggested that many of the biological effects of isoflavones could be explained by their conversion in vivo to a variety of other active metabolites. Given the importance of isoflavone metabolites, synthetic derivatives of isoflavones and metabolites are also considered important therapeutic agents. In addition, isoflavones have been ingested for many years as components of a staple food with very high tolerance to little or no known side effects, unlike many known symptomatic treatments for vascular disease and related surgery .
[0044]
Isoflavone compounds, metabolites, derivatives and analogs thereof useful in the method of the present invention are represented by the following general formula and also include pharmaceutically acceptable salts thereof:
[0045]
Embedded image

[0046]
Where:
R₁, R₂And Z are independently hydrogen, hydroxy, OR₉, OC (O) R₁₀, OS (O) R₁₀, CHO, C (O) R₁₀, COOH, CO₂R₁₀, CONR₃R₄Alkyl, haloalkyl, arylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, alkylaryl, alkoxyaryl, thio, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro or halo, or
R₂Is as defined above, and R₁And Z together with the carbon atom to which they are attached form a 5-membered ring selected from the following formula:
[0047]
Embedded image

[0048]
Alternatively, R₁Is as defined above, and R₂And Z together with the carbon atom to which they are attached form a 5-membered ring selected from the following formula:
[0049]
Embedded image

[0050]
And W is R₁A is hydrogen, hydroxy, NR₃R₄Or thio, and B is selected from the following formula:
[0051]
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[0052]
Alternatively, W is R₁And A and B together with the carbon atom to which they are attached form a 6-membered ring selected from the following formula:
[0053]
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[0054]
Alternatively, W, A and B, together with the group to which they are associated, are selected from the following formula:
[0055]
Embedded image

[0056]
Alternatively, W and A, together with the group to which they are associated, are selected from the following formula:
[0057]
Embedded image

[0058]
And B is selected from the following formula:
[0059]
Embedded image

[0060]
in this case,
R₃Is hydrogen, alkyl, arylalkyl, alkenyl, aryl, amino acid, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is hydrogen, alkyl, aryl, arylalkyl or amino acid), or CO 2₂R₁₂(Where R₁₂Is hydrogen, alkyl, haloalkyl, aryl or arylalkyl)
R₄Is hydrogen, alkyl or aryl; or
R₃And R₄Together with the nitrogen to which they are attached form pyrrolidinyl or piperidinyl,
R₅Is hydrogen, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above) or CO₂R₁₂(Where R₁₂Is as defined above),
R₆Is hydrogen, hydroxy, alkyl, aryl, amino, thio, NR₃R₄, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above), CO₂R₁₂(Where R₁₂Is as defined above) or CONR₃R₄And
R₇Is hydrogen, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above), alkyl, haloalkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl or Si (R_Thirteen)₃(Where R_ThirteenAre each independently hydrogen, alkyl or aryl);
R₈Is hydrogen, hydroxy, alkoxy or alkyl;
R₉Is alkyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above) or Si (R_Thirteen)₃(Where R_ThirteenIs as defined above),
R₁₀Is hydrogen, alkyl, haloalkyl, amino, aryl, arylalkyl, amino acid, alkylamino or dialkylamino;
drawing"---(A double line of a dashed line and a solid line) represents a single bond or a double bond,
T is independently hydrogen, alkyl or aryl;
X is O, NR₄Or S, and
Y is the following equation
[0061]
Embedded image

[0062]
Where R₁₄, R_FifteenAnd R₁₆Is independently hydrogen, hydroxy, OR₉, OC (O) R₁₀, OS (O) R₁₀, CHO, C (O) R₁₀, COOH, CO₂R₁₀, CONR₃R₄, Alkyl, haloalkyl, arylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, thio, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro or halo.
[0063]
The invention particularly relates to the use of compounds of the following general formulas II to VIII:
[0064]
Embedded image

[0065]
Where:
R₁, R₂, R₅, R₆, R₁₄, R_Fifteen, W and Z are as defined above,
More preferably
R₁, R₂, R₁₄, R_Fifteen, W and Z are independently hydrogen, hydroxy, OR₉, OC (O) R₁₀, C (O) R₁₀, COOH, CO₂R₁₀, Alkyl, haloalkyl, arylalkyl, aryl, thio, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro or halo;
R₅Is hydrogen, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is hydrogen, alkyl, aryl or amino acid), or CO₂R₁₂(Where R₁₂Is hydrogen, alkyl or aryl);
R₆Is hydrogen, hydroxy, alkyl, aryl, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above), or CO₂R₁₂(Where R₁₂Is as defined above),
R₉Is alkyl, haloalkyl, arylalkyl or C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above), and
R₁₀Is hydrogen, alkyl, amino, aryl, amino acid, alkylamino or dialkylamino;
[0066]
More preferably,
R₁And R₁₄Is independently hydroxy, OR₉, OC (O) R₁₀Or halo,
R₂, R_Fifteen, W and Z are independently hydrogen, hydroxy, OR₉, OC (O) R₁₀, C (O) R₁₀, COOH, CO₂R₁₀, Alkyl, haloalkyl or halo;
R₅Is hydrogen, C (O) R₁₁(Where R₁₁Is hydrogen or alkyl) or CO₂R₁₂(R₁₂Is hydrogen or alkyl),
R₆Is hydrogen or hydroxy;
R₉Is an alkyl, arylalkyl or C (O) R₁₁(Where R₁₁Is as defined above), and
R₁₀Is hydrogen or alkyl;
[0067]
More preferably,
R₁And R₁₄Is independently hydroxy, methoxy, benzyloxy, acetyloxy or chloro;
R₂, R_Fifteen, W and Z are independently hydrogen, hydroxy, methoxy, benzyloxy, acetyloxy, methyl, trifluoromethyl or chloro;
R₅Is hydrogen or CO₂R₁₂(Where R₁₂Is hydrogen or methyl), and
R₆Is hydrogen.
[0068]
Particularly preferred compounds of the present invention are selected from the following formula:
[0069]
Embedded image

[0070]
Embedded image

[0071]
Embedded image

[0072]
Preferred compounds of the present invention also include all derivatives having a physiologically cleavable leaving group that can be cleaved in vivo from the isoflavone or derivative molecule to which it is attached. Leaving groups include acyl, phosphate, sulfate, sulfonate, preferably mono-, di- and per-acyloxy substituted compounds, wherein one or more pendant hydroxy groups are acyl groups, preferably Protected by acetyl group.
Typically, acyloxy-substituted isoflavones and derivatives thereof are readily cleavable to the corresponding hydroxy-substituted compound. In addition, protection of the functional groups on the isoflavone compounds and derivatives of the present invention may be performed by well-established methods in the art, for example, as described in T.W. Greene (1981).
[0073]
Most preferred isoflavone compounds contemplated for use in accordance with the present invention include formononetin, biochanin, genistein, daidzein and equol, and functional derivatives, equivalents or Analogs. Similarly important compounds are isoflavone metabolites, such as dihydrodaidzein, cis and trans tetrahydrodaidzein and dehydroecol and their derivatives and prodrugs.
[0074]
A chemical and functional equivalent of a particular isoflavone is to be understood as a molecule that exhibits any one or more functional activities of isoflavones and is chemically synthesized or used for natural product screening. Obtained from any source as identified by such screening methods.
[0075]
The term "alkyl" refers to straight, branched and cyclic (if having 5 or more carbon atoms) saturated alkyl groups of 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl , Propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, cyclopentyl and the like. The alkyl group is more preferably methyl, ethyl, propyl or isopropyl. The alkyl group can optionally include one or more of fluorine, chlorine, bromine, iodine, carboxyl, C₁~ C₄-Alkoxycarbonyl, C₁~ C₄-Alkylaminocarbonyl, di- (C₁~ C₄-Alkyl) -amino-carbonyl, hydroxyl, C₁~ C₄-Alkoxy, formyloxy, C₁~ C₄-Alkyl-carbonyloxy, C₁~ C₄-Alkylthio, C₃~ C₆-May be substituted by cycloalkyl or phenyl.
[0076]
The term "alkenyl" refers to straight, branched and cyclic (when having 5 or more carbon atoms) 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 6 carbon atoms and having at least one double bond. , For example, ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 2-methyl-1-propenyl, 2-methyl-2-propenyl and the like. The alkenyl group is more preferably ethenyl, 1-propenyl or 2-propenyl. An alkenyl group optionally includes one or more of fluorine, chlorine, bromine, iodine, carboxyl, C₁~ C₄-Alkoxycarbonyl, C₁~ C₄-Alkylamino-carbonyl, di- (C₁~ C₄-Alkyl) -amino-carbonyl, hydroxyl, C₁~ C₄-Alkoxy, formyloxy, C₁~ C₄Alkyl-carbonyloxy, C₁~ C₄-Alkylthio, C₃~ C₆-May be substituted by cycloalkyl or phenyl.
[0077]
The term "alkynyl" refers to straight and branched chain hydrocarbons having 2 to 10 carbon atoms, preferably 2 to 6 carbon atoms and having at least one triple bond, such as ethynyl, 1-propynyl, 2- It is intended to include propynyl, 1-butynyl, 2-butynyl and the like. The alkynyl group is more preferably ethynyl, 1-propynyl or 2-propynyl. An alkynyl group optionally includes one or more fluorine, chlorine, bromine, iodine, carboxyl, C₁~₄-Alkoxycarbonyl, C₁~ C₄-Alkylamino-carbonyl, di- (C₁~ C₄-Alkyl) -amino-carbonyl, hydroxyl, C₁~ C₄-Alkoxy, formyloxy, C₁~ C₄-Alkyl-carbonyloxy, C₁~ C₄-Alkylthio, C₃~ C₆-May be substituted by cycloalkyl or phenyl.
[0078]
The term "aryl" is taken to include phenyl, biphenyl and naphthyl and is intended to include one or more C₁~ C₄-Alkyl, hydroxy, C₁~ C₄-Alkoxy, carbonyl, C₁~ C₄-Alkoxycarbonyl, C₁~ C₄-May be optionally substituted by alkylcarbonyloxy or halo.
[0079]
The term "heteroaryl" is taken to include 5- and 6-membered rings containing at least one oxygen, sulfur or nitrogen in the ring, which ring is optionally furyl, pyridyl, pyrimidyl, thienyl, imidazolyl, It can be fused to other aryl or heteroaryl rings such as tetrazolyl, pyrazinyl, benzofuranyl, benzothiophenyl, quinolyl, isoquinolyl, purinyl, morpholinyl, oxazolyl, thiazolyl, pyrrolyl, xanthinyl, purine, thymine, cytosine, uracil and isoxazolyl, It is not limited to these. Heteroaromatic groups may optionally include one or more of fluorine, chlorine, bromine, iodine, carboxyl, C₁~ C₄-Alkoxycarbonyl, C₁~ C₄-Alkylamino-carbonyl, di- (C₁~ C₄-Alkyl) -amino-carbonyl, hydroxyl, C₁~ C₄-Alkoxy, formyloxy, C₁~ C₄-Alkyl-carbonyloxy, C₁~ C₄-Alkylthio, C₃~ C₆-May be substituted by cycloalkyl or phenyl. Heteroaromatics can be partially or completely hydrogenated as desired.
[0080]
The term "halo" is taken to include fluoro, chloro, bromo and iodo, preferably fluoro and chloro, more preferably fluoro. For example, reference to "haloalkyl" includes up to monohalogenated, dihalogenated and perhalogenated alkyl groups. Preferred haloalkyl groups are trifluoromethyl and pentafluoroethyl.
[0081]
The term "pharmaceutically acceptable salt" refers to an organic or inorganic moiety that carries a charge and can be administered with a pharmaceutical agent, for example, as a countercation or counteranion in a salt. Pharmaceutically acceptable cations are known to those of skill in the art and include, but are not limited to, sodium, potassium, calcium, zinc and quaternary amines. Pharmaceutically acceptable anions are known to those of skill in the art and include, but are not limited to, chloride, acetate, citrate, bicarbonate and carbonate.
[0082]
The term "pharmaceutically acceptable derivative" or "prodrug" refers to an activity which, upon administration to a recipient, is capable of providing, directly or indirectly, the parent compound or metabolite, or which exhibits its own activity. Refers to a derivative of a compound.
[0083]
As used herein, the terms "treatment", "prophylaxis" or "prevention", "amelioration" and the like are to be considered in their broadest context. It is. In particular, the term "treatment" does not necessarily imply that the animal is treated until complete recovery. Thus, “treatment” includes ameliorating the symptoms or severity of a particular disease, or preventing or otherwise reducing the risk of developing a particular disease.
[0084]
The amount of one or more compounds of Formula I required for therapeutic treatment of the present invention will depend on many factors, including the particular use, the nature of the particular compound used, the condition being treated, the mode of administration and Depends on the patient's condition. The compounds of formula I can be administered in the manner and in amounts conventionally practiced. See, for example, Goodman and Gilman, et al. (1995). The particular dosage employed will depend upon the condition being treated, the condition of the subject, the route of administration and other known factors as described above. In general, the daily dose per patient may range from 0.1 mg to 5 g, typically 0.5 mg to 1 g, preferably 50 mg to 200 mg. The length of administration will depend on the severity of the condition to be treated or alleviated, from a single dose administered once or twice a day to a week, and if necessary several months to It may range from twice or three times daily dosing administered over several years. It is further understood that for any individual patient, the particular dosing regimen should be adjusted over time according to the needs of the individual and the professional judgment of the person administering or administering the composition. Is done. Relatively short-term treatment with active compounds can be used to stabilize or reduce coronary artery disease lesions that cannot be treated by either angioplasty or surgery. Longer term treatment may be employed to prevent the development of advanced lesions in high-risk patients.
[0085]
The manufacture of pharmaceutical compositions for the treatment of therapeutic indications described herein will typically involve the compound of the invention (for convenience hereinafter referred to as the "active compound"). It is prepared by admixing with one or more pharmaceutically or veterinarily acceptable carriers and / or excipients known in the art.
[0086]
The carrier must, of course, be acceptable in the sense of being compatible with any other ingredients in the formulation and must not be harmful to the subject. The carrier or excipient may be a solid or liquid or both, and may preferably contain up to 100% by weight of active compound, preferably from 0.5% to 59% by weight of a unit dose, e.g. Tablets are formulated with the compound as tablets. One or more active compounds can be incorporated into the formulations of the present invention, which consist essentially of mixing together the components, if desired, with one or more accessory ingredients. It can be prepared by any of the known techniques for formulation. The preferred concentration of the active compound in the drug composition depends on the rate of absorption, distribution, inactivation and elimination of the drug, as well as other factors known to those skilled in the art.
[0087]
The formulations of the present invention include those suitable for oral, rectal, ocular, buccal (eg, sublingual), parenteral (eg, subcutaneous, intramuscular, intradermal or intravenous) and transdermal administration, but are optional. The most appropriate route in a given case will depend on the nature and severity of the condition being treated and on the nature of the particular active compound being used.
[0088]
Formulations suitable for oral administration comprise a predetermined amount of the active compound, as a powder or granules, as a solution or suspension in an aqueous or non-aqueous liquid, or as an oil-in-water or water-in-oil emulsion, respectively. It may be provided in discrete units such as capsules, sachets, lozenges or tablets. Such formulations may be prepared by any suitable method of formulating the compound, which comprises the step of bringing into association the active compound with a suitable carrier, which may contain one or more accessory ingredients as described above. In general, the formulations of the present invention are prepared by uniformly and intimately bringing into association the active compound with liquid or finely divided solid carriers or both, and then, if necessary, formulating the resulting mixture into unit dosages. It is prepared by molding. For example, a tablet can be prepared by compressing or molding a powder or granules containing the active compound, optionally with one or more accessory ingredients. The compressed tablets may be made into a free-flowing (eg, powdered or granulated) powder or granules, optionally in a suitable machine, mixed with a binder, lubricant, inert diluent, and / or surfactant / dispersant (s). It can be prepared by compressing a flowing compound. Molded tablets may be made by molding, in a suitable machine, the powdered compound moistened with an inert liquid binder.
[0089]
Suitable formulations for buccal administration include lozenges containing the active compound in flavoring bases, usually sucrose and acacia or tragacanth, and inert bases such as gelatin and glycerin or starch and acacia. Pastilles containing the compound therein.
[0090]
Compositions of the present invention suitable for parenteral administration conveniently comprise a sterile aqueous preparation of the active compound, which is preferably isotonic with the blood of the intended recipient. These formulations are preferably administered intravenously, but administration can also be achieved by subcutaneous, intramuscular or intradermal injection. Such formulations may conveniently be prepared by mixing the compound with water or glycerin buffer and sterilizing the resulting solution to make it isotonic with blood. The injectable formulations according to the invention generally contain between 0.1 and 60% (w / v) of the active compound and are administered at a rate of 0.1 ml / min / kg.
[0091]
Formulations suitable for rectal administration are preferably presented as unit dose suppositories. These can be prepared by mixing the active compound with one or more conventional solid carriers, for example, cocoa butter, and then shaping the resulting mixture.
[0092]
Formulations or compositions suitable for topical administration to the skin preferably take the form of an ointment, cream, lotion, paste, gel, spray, aerosol or oil. Carriers that can be used include petrolatum, lanolin, polyethylene glycols, alcohols and combinations of two or more thereof. The active compounds are generally provided in a concentration of from 0.1 to 5% (w / w), in particular from 0.5 to 2% (w / w). Examples of such compositions include cosmetic skin creams.
[0093]
Formulations suitable for transdermal administration may be provided as individual patches which are intended to remain in intimate contact with the recipient's epidermis for extended periods of time. Such patches suitably contain the active compound as an optionally buffered aqueous solution, for example, at a concentration of 0.1-0.2M for the active compound. See, for example, Brown, L., et al. (1998).
[0094]
Formulations suitable for transdermal administration include:
It can also be delivered by iontophoresis (see, for example, Panchagnula R, et al., 2000), and typically takes the form of an optionally buffered aqueous solution of the active compound. Suitable formulations include citrate or bis / tris buffer (pH 6) or ethanol / water and contain 0.1-0.2M active ingredient.
[0095]
Formulations suitable for inhalation may be delivered as a spray composition in the form of a solution, suspension or emulsion. Inhalation spray compositions can further include a pharmaceutically acceptable propellant, such as carbon dioxide or nitrous oxide.
[0096]
The active compound can be provided in the form of a foodstuff, for example, added, mixed, coated, integrated or otherwise added to the foodstuff. The term food product is used in its broadest possible sense and includes liquid formulations such as beverages containing dairy products and other food products such as health food bars, desserts and the like. Food formulations containing the compounds of the present invention can be readily prepared according to standard techniques.
[0097]
Therapeutic methods, uses and compositions can be used, for example, in mammals such as companion animals and domestic animals (eg, dogs and cats) and livestock animals (eg, cows, sheep, pigs and goats), birds (eg, chickens, turkeys, ducks). For human or animal administration.
[0098]
The active compound or a pharmaceutically acceptable derivative prodrug thereof or a salt thereof may also be used in combination with other active substances which do not impair the initial action, or substances which supplement the initial action, such as antibiotics, antifungals, It may be co-administered with an inflammatory or antiviral compound. The active agent may comprise two or more isoflavones or derivatives thereof in a combination or synergistic mixture. The active compounds are also lipid-lowering agents such as probucol and nicotinic acid, platelet aggregation inhibitors such as aspirin, antithrombotic agents such as coumadin, calcium channel blockers such as verapamil, diltiazem and diphedipine, captopril and enalapril and the like. Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors, as well as propanolol, terbutalol and labetalol_"-Can be administered with a blocking agent. The compounds can also be administered in combination with non-steroidal anti-inflammatory agents such as ibuprofen, indomethacin, aspirin, fenoprofen, mefenamic acid, flufenamic acid and sulindac. The compounds can also be administered with a corticosteroid.
[0099]
Co-administration can be simultaneous or sequential. Simultaneous administration may be achieved by the compounds being in the same unit dose, which is administered at the same or similar time, or in individual and individual unit doses. Sequential administration may be in any order as needed, and typically will be the second, that is, the first when the active agent is administered, especially if a cumulative or synergistic effect is desired. The ongoing physiological effects of the first active agent need to persist.
[0100]
Isoflavones for use in the present invention are derived from any number of sources readily identifiable to those skilled in the art. Preferably, they are obtained in the form of concentrates or extracts from plant sources. In addition, those skilled in the art can easily identify appropriate plant species. For example, plants for specific use in the present invention include legumes. More preferably, the isoflavone extract is obtained from chickpea, lentil, pea, purple clover, or subterranean clover species.
[0101]
The isoflavone extract may be prepared by any number of techniques known in the art.
For example, a suitable isoflavone extract may be prepared by aqueous / organic solvent extraction from a plant source. It is understood that the isoflavone extract can be prepared from any single tissue of a single species of plant, or a combination of two or more different tissues thereof. Similarly, extracts can be prepared from starting materials containing a heterogeneous mixture of tissues from two or more different species of plant.
[0102]
Generally, when the isoflavone extract is prepared from plant material, the material is ground or chopped into smaller pieces, or is partially ground or chopped into smaller pieces to form water and organic It can be contacted with a solvent, such as a water-miscible organic solvent. Alternatively, the plant material is contacted with water and an organic solvent without any pretreatment. The ratio of water to organic solvent generally ranges from 1:10 to 10: 1 and may consist, for example, of an equal ratio of water and solvent or 1 to 30% (v / v) of organic solvent. Any organic solvent or mixture of such solvents can be used. The organic solvent is preferably C₂~ C₁₀And more preferably C₁~ C₄Organic solvents such as methanol, chloroform, ethanol, propanol, propylene glycol, erythrit, butanol, butanediol, acetonitrile, ethylene glycol, ethyl acetate, glycidol, glycerol dihydroxyacetone or acetone. If desired, the water / organic solvent mixture can include an enzyme that cleaves the isoflavone glycosides into aglycone form. The mixture can be stirred vigorously to form an emulsion. Mixing temperatures can range, for example, from ambient to boiling. The exposure time can be between one hour and several weeks. One convenient extraction time is 24 hours at 90 ° C. The extract can be separated from the undissolved plant material, and the organic solvent is removed, for example, by distillation, rotary evaporation, or other standard techniques for solvent removal. Drying the resulting extract containing the water-soluble and water-insoluble components can yield an isoflavone-containing extract, which according to the present invention, comprises one or more pharmaceutically acceptable carriers, It can be formulated with excipients and / or adjuvants.
[0103]
Extracts made in accordance with the description set forth in the preceding paragraph may contain small amounts of oils containing isoflavones in their aglycone form (referred to herein as isoflavones). The isoflavone-enriched oil can be processed by HPLC to adjust the isoflavone ratio, or if it is the desired isoflavone ratio, dried, for example, in the presence of silica, and dried with one or more carriers, Formulated with excipients and / or adjuvants, an isoflavone-containing extract can be obtained. Alternatively, the isoflavones contained in the small amounts of oil described above are further added to the oil in a water-insoluble organic solvent such as hexane, heptane, octane, acetone or a mixture of one or more such solvents. It can be concentrated. One example is 80% hexane, 20% (w / w) acetone, which has high solubility for oils but low solubility for isoflavones. The oil easily partitions into the organic solvent and the concentrated isoflavone-containing extract separates out of solution. The recovered extract is dried, for example, in an oven at 50 ° C. to about 120 ° C. and combined with one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients and / or adjuvants.
[0104]
It is understood that the present invention also contemplates the production of suitable isoflavones, functional derivatives, equivalents or analogs thereof by established synthetic techniques known in the art. See, for example, Chang et al. (1994) which discloses suitable methods for the synthesis of various isoflavones.
[0105]
Other suitable methods can be found, for example, in International Patent Application Publications WO 98/08503 and WO 00/49009 and references cited therein. These descriptions are incorporated herein by reference in their entirety.
[0106]
The invention is further illustrated by the following non-limiting examples and the accompanying drawings.
Embodiment 1
[0107]
Anti-vasoconstrictor action and oxidation LDL Protection from damage
Vascular elasticity and vascular response are important factors that contribute to cardiovascular risk. Normal physiological conditions indicate a healthy circulatory system, whereas arteries are responsive to differential stimuli of stress. Cholesterol accumulation and age contribute to poorly responding blood vessels. Thus, experiments were performed to test the ability of isoflavones to produce vasodilation and protect blood vessels from oxidized LDL damage. In addition, the importance of endothelium in these effects was investigated.
[0108]
Method
Isolation of rat thoracic aorta
Male Sprague-Dawley rats (250 ± 50 g) with 80% CO₂And 20% O₂Was gassed to death. The thoracic aorta was removed and 199 mM NaCl, 4.7 mM HCl, 1.17 mM MgSO.₄・ 7H₂O, 25 mM NaHCO₃, 1.18 mM KH₂PO₄2.5 mM CaCl₂, 11 mM glucose and 0.03 mM EDTA were rapidly placed in an ice-cold Krebs modified solution. The fat and connective tissue were then removed and cut into rings 2-3 mm wide. Hold at 37 ° C, 95% O₂+ 5% CO₂Each ring was placed on two parallel stainless steel hooks in a 3 mL organ bath with a single water jacket containing a modified Krebs solution vented with. The lower hook was attached to a movable support foot and the upper hook was attached to an FT03 force transducer (Grass Scientific Instruments, Mitutoyo, Japan) for isometric recordings. Amplify the change in force (Quadbridge amplifier, Scientific Concepts Inc., Victoria, Australia) and use a MacLab 8E data acquisition system (Adinstuments Pty Ltd., NSW, Australia) connected to an Apple Computer (Apple Computer Inc., Cupertina, CA). Recorded. The rings were set to an initial tension of 2 g and allowed to equilibrate for 30 minutes, after which they were reset to 2 g tension before the start of each experimental protocol.
[0109]
Protocol 1: Effect of Isoflavone Metabolites on Contraction Curves for Noradrenaline
β-estradiol (1 μg / ml), Cpd. 5 (0.1 and 1 μg / ml), Cpd. 7 (0.1 and 1 μg / ml), Cpd. 8 (0.1 and 1 μg / ml) and Cpd. 12 (1 μg / ml) And full concentration-contractile curves for noradrenaline (0.1 nM to 10 mM) in the presence and absence of vehicle equal volume DMSO. Only one compound at any one concentration was tested for any one ring from any one animal.
[0110]
Protocol 2a Vasodilator capacity of isoflavone metabolite derivatives
The total concentration response to noradrenaline was obtained. From this, the concentration that produced a submaximal contraction of about 80% was selected (0.03-0.3 μM). The rings were then constricted to this sub-maximal concentration and allowed to settle, after which the total concentration of β-estradiol and Cpd. 5, 7, 8 and 12 and vehicle DMSO (in equal volumes) was- A relaxation curve was obtained. Only one compound was tested using any one ring from any one animal.
[0111]
Protocol 2b. Vasodilator capacity of isoflavone metabolite derivatives: mechanism of action
Endothelium (the endothelium was detached from the ring by gentle rotation of the lumen against the rough surface), the nitric oxide synthase inhibitor nitro-L-arginine (NOLA 10 μM; Cpd. ), 40 mM KCl (to inhibit endothelium-derived hyperpolarizing factor), cyclo-oxygenase inhibitor indomethacin (10 μM) and soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3 Total relaxation curves were obtained for Cpd. 5, 7, 8 and 12 and β-estradiol in the absence and presence of [-a] quinoxalin-1-one (ODQ; 10 μM). Only one compound with only one treatment was tested for any one ring from any one animal.
[0112]
Protocol 3 Protective effect of isoflavone metabolite derivatives on endothelial damage induced by oxidized low-density lipoprotein
A total concentration response curve to phenylephrine was constructed, from which the concentration showing a submaximal contraction of about 80% was selected (usually 0.3 μM). The tissue was then clamped at a selected concentration with phenylephrine to reach a stable state. Next, a total concentration expansion curve was constructed for acetylcholine. After this, preliminary experiments demonstrated that they did not affect the response to acetylcholine
0.1% antifoam B (SIGMA) was added to the bath. Next, the absence of β-estradiol (10 pg / ml), Cpd. 5 (300 ng / ml), Cpd. 7 (1 μg / ml), Cpd. 8 (3 μg / ml) or Cpd. 12 (3 μg / ml) After incubation for 1 hour with oxidized low density lipoprotein (bull LDL: 0.3 mg protein / ml) in the presence and in the presence, the total concentration response curve to acetylcholine was repeated. Neg log EC from experiments performed in protocol 2a₄₅~ EC₅₀The concentration was selected based on.
[0113]
Preparation of low density lipoprotein
Human plasma was obtained from a blood bank. Individual lipoprotein fractions were obtained using discontinuous density gradient ultracentrifugation on a Beckman vertical rotor (70 Ti) using a Beckman centrifuge. That is, 0.018 g of KBr was added to 1 ml of plasma, which was transferred to a rapidly sealed tube and spun at 65,000 rpm at 4 ° C. overnight. The top (VLDL) fraction was then removed and 0.064 g of KBr was added to the bottom of 1 ml. This was transferred to quick-seal tubes and spun at 65,000 rpm at 4 ° C. overnight. The upper (LDL) fraction was quickly transferred to a sealed tube, filled with dl.063 solution and spun. The upper LDL fraction was collected after each rotation and 0.05M NH₄HCO₃The solution was changed and dialyzed daily for 4 days against pH 8.0. The protein content of the final LDL fraction obtained was determined by Lowry's simplified protein assay. 5 μM CuSO₄LDL was oxidized by incubation with for 2 hours.
[0114]
Data presentation and statistical analysis
The contractile response is expressed in g-tension (mean + standard error of the mean). The diastolic response is expressed as a percentage of the contractile force generated by the pre-constricting agent used. The individual concentration-response curves for treatment with noradrenaline and acetylcholine ± were fitted to the logistic equation:
E = MA^p/ (A^pXK^p)
Where E is the response, M is the maximal response, and K is the concentration that elicits 50% of the maximal response (ie, neg log EC₅₀).
[0115]
Sigmastat statistical software (Jandel Scientific, San Rafael, CA) that analyzes the results by two-way repeated measures analysis of variance and, where appropriate, subsequently tests the data essentially for normality before performing parameter analysis ) Was used to perform a post-hoc test with appropriate correction.
[0116]
Drugs and solutions
1,3,5 [10] -estraditriene-3,17β-diol (17β-estradiol, SIGMA), Cpd.5, Cpd.7, Cpd.8 and Cpd.12 (from Novogen Ltd) dissolved in DMSO And diluted to the desired concentration in Krebs. N^ω-Nitro-L-arginine (SIGMA), indomethacin (SIGMA), norepinephrine bitartrate (SIGMA), acetylcholine chloride (SIGMA) and 1H- (1,2,4) oxadiazolo (4,3-a) quinoxaline-1- On (SIGMA) was dissolved according to the manufacturer's instructions.
[0117]
result
Protocol 1: Effect of Isoflavone Metabolites on Contraction Curves for Noradrenaline
Table 1 shows the maximal power obtained for noradrenaline in the presence and absence of β-estradiol, synthetic isoflavone derivatives (Cpd. 5, 7, 8 and 12) and the used. I do.
[0118]
FIG. 1 graphically illustrates the effect of various compounds on the response to noradrenaline when used at 1 microg / ml. FIG. 2 shows the total concentration-contractile response to noradrenaline in the absence (pre-compound) and presence (post-compound) after a 30 minute incubation.
[0119]
All active compounds tested had significant antagonism on noradrenaline-induced contractions. To give an indication of the order of potency of the tested compounds, the difference in maximal response to noradrenaline (maximum response in the absence of compound-maximal response in the presence of compound) was calculated for each compound at 1 μg / ml. (Table 1). From this it was clear that Cpd. 12 was comparable to β-estradiol in canceling the contractile response to noradrenaline, whereas Cpd. 5, Cpd. 7 and Cpd. 8 were active, but β-estradiol Lower potency.
[0120]
[Table 1]

[0121]
Protocol 2a: Vasodilator capacity of isoflavone metabolites: mechanism of action
FIG. 3 shows the concentration-expanding effect of the compounds tested. Concentration-expansion curves obtained for 17β-estradiol and Cpd. 5, 7, 8 and 12 using rat isolated aortic rings pre-constricted with submaximal concentrations of noradrenaline. All values are means ± standard error of the mean. All four compounds were at least as potent as β-estradiol in their vasodilator capacity. The mechanism by which these compounds exert a dilating effect was further investigated using specific antagonists.
[0122]
β-estradiol: FIG. 4 shows the concentration-expansion curve obtained for 17β-estradiol using isolated rat aortic rings pre-constricted with submaximal concentrations of noradrenaline.
these,
(a) intact endothelium,
(b) nitric oxide synthase inhibitor N "-nitro-L-arginine (NOLA 10 μM),
(c) 40 mM KCl,
(d) soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ 10 μM),
(e) performed in the absence and presence of the cyclo-oxygenase inhibitor indomethacin (10 μM);
(f) shows time (30 minutes) control.
n = number of experiments.
[0123]
The vasodilator response to β-estradiol was inhibited by endothelial removal (FIG. 3a), incubation with nitro-L-arginine (FIG. 4b), high levels of KCl (FIG. 4c) and ODQ (FIG. 4d). Was. Indomethacin did not affect the diastolic action of this steroid (FIG. 4e) and no time-dependent changes were observed (FIG. 4f).
[0124]
Cpd. 5: FIG. 5 shows the concentration-expansion curve obtained for Cpd. 5 using rat isolated aortic rings preconstricted with submaximal concentrations of noradrenaline.
these,
(a) intact endothelium,
(b) nitric oxide synthase inhibitor N ″ -nitro-L-arginine (NOLA 10 μM),
(c) 40 mM KCl,
(d) soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ 10 μM),
(e) performed in the absence and presence of the cyclo-oxygenase inhibitor indomethacin (10 μM);
(f) shows time (30 minutes) control.
n = number of experiments.
[0125]
The vasodilator response to Cpd. 5 was inhibited by endothelial removal (FIG. 5a), incubation with nitro-L-arginine (FIG. 5b), high levels of KCl (FIG. 5c) and ODQ (FIG. 5d). Was. Indomethacin did not affect the steroid's diastolic action (FIG. 5e) and no time-dependent changes were observed (FIG. 5f).
[0126]
Cpd. 7: FIG. 6 shows concentration-expansion curves obtained for Cpd. 7 using rat isolated aortic rings preconstricted with submaximal concentrations of noradrenaline.
these,
(a) intact endothelium,
(b) nitric oxide synthase inhibitor N ″ -nitro-L-arginine (NOLA 10 μM),
(c) 40 mM KCl,
(d) soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ 10 μM),
(e) performed in the absence and presence of the cyclo-oxygenase inhibitor indomethacin (10 μM);
(f) shows time (30 minutes) control.
n = number of experiments.
[0127]
The vasodilator response to Cpd. 7 was inhibited by endothelial removal (FIG. 6a), high levels of KCl (FIG. 6c) and ODQ (FIG. 6c). There was a trend toward inhibition of these responses by NOLA, but this was not statistically significant. Indomethacin did not affect the diastolic action of this steroid (FIG. 6d) and no time-dependent changes were observed (FIG. 6e).
[0128]
Cpd. 8: FIG. 7 shows the concentration-expansion curves obtained for Cpd. 8 using aortic rings isolated from rats pre-constricted with submaximal concentrations of noradrenaline.
these,
(a) intact endothelium,
(b) 40 mM KCl,
(c) soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ 10 μM),
(d) performed in the absence and presence of the cyclo-oxygenase inhibitor indomethacin (10 μM);
(e) shows time (30 minutes) control.
n = number of experiments.
[0129]
The vasodilator response to Cpd. 8 was inhibited by endothelial removal (Figure 7a), high KCl levels (Figure 7b), but not by ODQ (Figure 7c). Indomethacin enhanced the inhibitory effect of Cpd. 8 (FIG. 7d). No time-dependent change was observed (FIG. 7e).
[0130]
Cpd. 12: FIG. 8 shows concentration-expansion curves obtained for Cpd. 12 using aortic rings isolated from rats pre-constricted with submaximal concentrations of noradrenaline. these,
(a) intact endothelium,
(b) nitric oxide synthase inhibitor N "-nitro-L-arginine (NOLA 10 μM),
(c) 40 mM KCl,
(d) soluble guanylate cyclase inhibitor 1H- [1,2,4] oxadiazolo [4,3-a] quinoxalin-1-one (ODQ 10 μM),
(e) performed in the absence and presence of the cyclo-oxygenase inhibitor indomethacin (10 μM);
(f) shows time (30 minutes) control. n = number of experiments.
[0131]
The vasodilatory effect on Cpd.12 was inhibited by endothelial removal (FIG. 8a) and high levels of KCl (FIG. 8c), but not in NOLA (FIG. 8b) or ODQ (FIG. 8d) or indomethacin (FIG. 8d). 8e) was not inhibited. No time-dependent change was observed (FIG. 8e).
[0132]
Protocol 3: Protective effect of isoflavone metabolites on endothelial damage induced by oxidized low density lipoprotein
FIG.
(A) oxidized low density lipoprotein (bull LDL, 0.3 mg protein / ml),
(B) Bull LDL + Cpd. 8 (3 µg / ml)
FIG. 4 shows the total concentration response curves to acetylcholine obtained using aortic rings isolated from rats pre-constricted with submaximal concentrations of phenylephrine with and without 30 minute incubation with. FIG. 10 shows submaximal concentrations with and without co-incubation of bull LDL alone and co-incubation of bull LDL + 17β-estradiol or Cpd. 5, 7, 8 or 12. 2 represents a histogram showing the maximum dilatation obtained for acetylcholine using rat isolated aortic rings preconstricted with phenylephrine. n = number of experiments.
[0133]
Incubation with bull LDL significantly reduced the response to acetylcholine (Figure 9a). Co-incubation of bull LDL with Cpd. 8 reduced the inhibitory effect of bull LDL (FIG. 9b).
[0134]
Furthermore, the maximal response to acetylcholine obtained when co-incubating with this compound was significantly lower than that with bull LDL alone (FIG. 10). Co-incubation of bull LDL with β-estradiol and other compounds reduced the effects of bull LDL such that no significant difference between the maximal expansion obtained before and after bull LDL incubation was apparent. However, the maximal expansion for acetylcholine obtained with co-incubation was not different from that obtained in the presence of bull LDL alone (FIG. 10).
[0135]
Consideration
These tests are
Isoflavone compounds and derivatives,
(a) inhibits the vasoconstrictive response to noradrenaline,
(b) being vasodilatory, and
(c) Demonstrates that Cpd. 8 significantly protects against endothelial damage by oxidized LDL. The in vitro vascular profile of some of these compounds is comparable to, and in some cases more effective than, ovarian steroid 17β-estradiol. This suggests that these compounds may be responsible for cardioprotective effects attributable to high isoflavone diets, but more importantly, especially from isoflavones consumed in the normal diet. When administered in higher doses than those available, it suggests that these compounds may be useful as potential cardioprotective therapeutics.
[0136]
Cpd. 5, 7, 8 and 12 were all able to antagonize the contractile effects of noradrenaline, but to a different extent. Cpd. 12 is the most effective, comparable to 17β-estradiol. Cpd. 5 and Cpd. 7 appeared to be equally potent, but less potent than Cpd. Cpd. 8 was the least potent. Antagonism of Cpd. 5, 7 and 8 was dose-dependent, but dose-dependency of Cpd. 12 and β-estradiol was not examined. At equal volume, vehicle (DMSO) was not effective at inhibiting the response to noradrenaline.
[0137]
Although the vasodilator effect of synthetic derivatives of isoflavone metabolites was at least as potent, if not more potent, than 17β-estradiol, the mechanism of action was that the dilator effect of all four compounds was reduced upon endothelial removal. The mechanism of action was different from that of 17β-estradiol.
[0138]
None of the compounds were unaffected by indomethacin, suggesting that prostacyclins are unlikely to play a substantial role in their vasodilatory capacity. However, indomethacin enhanced the effects of Cpd.8, where increased vasodilatory capacity was observed, indicating that Cpd.8 increased the release of vasoconstrictory prostanoids such as thromboxane. , Suggesting that removal resulted in increased dilation. The expanded response of both Cpd. 5 and Cpd. 7 was inhibited by high levels of KCl, ODQ and NOLA. Thus, the dilating effect of both of these compounds may be associated with the release of endothelium-derived relaxing factor, possibly nitric oxide, which activates soluble guanylate cyclase activity.
[0139]
Inhibition by KCl suggests that endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF) is also released. Restrictions on the use of KCl in isolating EDHF responses have been observed, and specific K such as apamin and charybdotoxin⁺It will be appreciated that further investigation through the use of channel inhibitors is warranted. Assuming limitations, there is no evidence in general testing that the hyperpolarizing factors released by Cpd. 5 and Cpd. 7 are not nitric oxide.
[0140]
On the other hand, the expanding action of Cpd. 8 and Cpd. 12 may contribute globally to EDHF, in which case it is clearly not nitric oxide and is not activated by soluble guanylate cyclase. Thus, it is clear that the mechanism of action of these four compounds to cause vasodilation is not only different from ovarian steroid β-estradiol and its parent compound, but also from each other.
[0141]
In a final series of experiments, the protective effects of these compounds on endothelial damage induced by oxidized LDL were examined. Oxidized LDL inhibited the vasodilating ability of the endothelium-dependent vasodilator acetylcholine. All compounds tested reduced the response to acetylcholine caused by bull LDL, whereas Cpd. 8 had a significant effect on the response to acetylcholine when compared directly to incubation with bull LDL alone. Was the only compound that could be demonstrated. It has already been demonstrated that 17β-estradiol can protect against endothelial damage by bull LDL. From the current data it is clear in this connection that the protective effect of Cpd. 8 is at least 10 times more potent than 17β-estradiol. Since Cpd. 8 is not the most potent compound in other protocols, ie, in antagonizing noradrenaline, or in its direct vasodilatory capacity, the mechanism of cardioprotective action of this compound was And may exist in its antioxidant capacity.
[0142]
These results indicate that Cpd. 5, 7, 8, 12 has potent vasoregulatory capacity. Thus, isoflavones and their derivatives can offset contractile activity (Cpd.12> Cpd.5 = Cpd.7> Cpd.8), directly offset vasodilation, and protect against endothelial damage by oxidized low density lipoproteins. Can be protected (Cpd. 8 is at least 10 times more potent than 17β-estradiol in this context). While comparable to ovarian steroid 17β-estradiol, their activity also appears to be unique in their mechanism of action. Thus, isoflavones and derivatives show potential for use as cardioprotective therapies, particularly in the treatment of restenosis and other types of accelerated intimal thickening.
Embodiment 2
[0143]
Vascular smooth muscle cell action
Vascular smooth muscle cell proliferation is a key step in the atherosclerosis process and is inhibited by estrogen. To investigate the atheroprotective properties of isoflavone compounds and derivatives, experiments were performed to select a simple marker of DNA synthesis and cell proliferation, ie, [3H] -thymidine incorporation and the selection of isoflavone metabolites on cell number. The effects of the derivatives Cpd. 5, 7, 8 and 12 were investigated. In view of the encouraging results obtained for Cpd.7, by determining the effect of Cpd.7 on mitogen-activated protein (MAP) kinase (Erk, JUNK, p38), signaling pathways that mediate these activities Was examined.
[0144]
Method
Cell preparation
Vascular smooth muscle cells (VSMC) from the female internal mammary artery (IMA) were cultured in 10% FBS-DMEM. Cells are grown to confluency in LG (glucose 5 mM) medium, then trypsinized, diluted to about 10,000 cells / ml in 10% FBS-LG medium, and 1 ml of suspension is added to four 24-well plates. Aliquoted in. The cells were then allowed to grow for two days and become visually confluent. Change the serum-free medium for 48 hours to replace most cells with G₀/ G₁Tuned to.
[0145]
Cell processing:
After 24 hours in serum-free medium, cells were treated with compounds (Cpd. 5, Cpd. 7, Cpd. 8, or Cpd. 12) for 4 hours, and FBS was added overnight (18-20 hours) (final concentration). 2.5%). Four wells were assigned to each treatment:
(1) Control: 2.5% FBS
(2) FBS + isoflavone treatment (0.01 mM)
(3) FBS + isoflavone treatment (0.1 mM)
(4) FBS + isoflavone treatment (1 mM)
(5) FBS + isoflavone treatment (10 mM)
(6) FBS + isoflavone treatment (100 mM)
[0146]
Cell growth was induced by various growth factors, such as serum and platelet derived growth factor (PDGF).
[0147]
Thymidine incorporation assay:
Change the medium to LG serum-free DMEM and replace the cells with [³Treated with [H] -thymidine at 1 μCi / well for 3 hours. The cells were washed twice with ice-cold Dulbecco's PBS. Next, ice-cooled 0.2M HClO₄(1 ml / well) was added and the cells were incubated on ice for 30 minutes. The cells are then ice-cooled with 0.2M HClO₄(0.5 ml / well) three times. The medium was changed (0.5 ml / well of 0.2 M NaOH) and the cells were incubated at 37 ° C. After 1 hour, cells were treated with acetic acid (6%, 0.2 ml / well), transferred to scintillation vials with 3 ml of scintillation fluid (Instagel) and counted for 2 minutes per vial.
[0148]
result
In preliminary experiments, Cpd. 7 at a concentration as low as 0.1 mM significantly inhibited the growth of IMA-derived VSMC cells (n = 3) compared to control (0) (# cell damage) (n = 3) (^*P <0.05) (see FIG. 11). Interestingly, the effect was only observed at low concentrations (up to 1 mM), and the relative increase in proliferation was measured at 10 mM and 100 mM (FIG. 11). Cpd.12 did not appear to inhibit cell proliferation, but caused significant cell damage at high concentrations (10 mM and 100 mM) (FIG. 11). Tests are currently underway to examine this effect in more detail and determine if it is due to apoptosis. Interestingly, it was found that Cpd. 8 caused a significant increase in proliferation at high concentrations (10 mM and 100 mM) (FIG. 11). Cpd.5 was found to be relatively inactive.
[0149]
The effect of Cpd.5 and Cpd.7 was further tested in IMA-derived human VSMCs sensitized with PDGF BB instead of serum. 7 inhibited the growth of IMA cells at a concentration as low as 0.1 nM ((n = 1) (^*P <0.005) vs. control (0); #P <0.01 vs. control (0)) (FIG. 12). This effect was equivalent to that observed with estradiol. Cpd. 5 had no effect on cell proliferation.
[0150]
In further experiments, Cpd. 7 inhibited platelet-derived growth factor (PDGF) BB-induced DNA synthesis and was assessed by [3H] -thymidine incorporation in a dose-dependent manner, with 10% inhibition at 1 nmol / L, 10 and 100 nmol. / L resulted in 17% inhibition. The inhibition was statistically significant but lower compared to the effect of 17β-estradiol (27% at 1 or 10 nmol / L, 33% at 100 nmol / L). ICI 182780, a non-selective estrogen receptor (ER) antagonist (100 nmol / L), completely abolishes the inhibitory effect of Cpd.7 at 1-10 nmol / L and inhibits Cpd.7 at 100 nmol / L Is partially eliminated, indicating ER-mediated. Consistent with our results with thymidine incorporation, the PDGF BB-induced increase in cell number was partially but significantly reduced by Cpd. 7 (1-100 nmol / L).
[0151]
To further investigate the signaling pathways that mediate this phytoestrogen action in VSMC, the effect of Cpd.7 on mitogen-activated protein (MAP) kinase (Erk, JUNK, p38) was determined by immunoprecipitation analysis, and the initial proliferative response The effect on the gene (Egr-1, Sp-1) was measured by Western blotting. PDGF BB activated Erk, and this activation was significantly inhibited by Cpd. 7 in a dose-dependent manner, and JUNK and p38 activities were not affected by either PDGF BB or Cpd. Strongly expressed both proteins and Erk. Egr-1 or Sp-1 protein was not altered by either PDGF BB or Cpd.
[0152]
These results indicate that isoflavone and its derivatives, and especially Cpd. 7, inhibit cell proliferation of human vascular smooth muscle cells and also inhibit PDGF-induced Erk activation in human vascular smooth muscle cells. This activity indicates the potential of isoflavones and their derivatives to prevent the onset and progression of atherosclerotic lesions, especially accelerated stenosis, and offers potential benefits in vascular protection.
Embodiment 3
[0153]
Antioxidant activity
Oxidation is a process that plays a role in many major disease processes. In the context of cardiovascular disease, one of the major contributors to the development of atherosclerosis is the oxidation of LDL cholesterol in the arterial wall, which leads to inflammatory lesions. If left unchecked, the inflammatory process progresses until the lesion causes vascular occlusion and infarction, and presents a particularly important problem in accelerated intimal thickening of restenosis. Given the potential cardiovascular benefits of antioxidant activity, selected isoflavone compounds of the invention were assayed to determine their antioxidant activity.
[0154]
LDL Antioxidant test
The LDL antioxidant test measures the ability of a compound to scavenge free radicals directly or to chelate transition metals. Therefore, in this series of experiments, isoflavones and their derivatives were tested for their ability to act as free radical scavengers.
[0155]
Method
Fresh whole blood was collected by venipuncture from healthy human volunteers under 25 years old, and EDTA (91 mg / ml) and BHT (4.4 mg / ml) were immediately added. 1.02 ~ 1.05g / cm³LDL was prepared by step-wise ultracentrifugation in a density gradient of. EDTA and BHT were present throughout all stages of isolation. Stock solutions containing EDTA / BHT (15-30 mg LDL / ml) were stored in the dark under a nitrogen atmosphere until use, but for no more than 2 weeks.
[0156]
Prior to the oxidation experiment, 100 times volume of 0.01 M phosphate buffer pH 7.4, 0.16 M NaCl, 0.1 mg / ml chloroamphenicol by vacuum degassing and then purged with nitrogen to become oxygen-free Dialyzed the LDL stock solution. The buffer was changed four times. This LDL stock solution without EDTA and BHT was used for all oxidation tests. Stock solutions were stored at 4 ° C. for no more than 24 hours. To perform the oxidation experiments, a freshly prepared CuCl was prepared by diluting the LDL stock solution without EDTA and BHT with oxygen-saturated 0.01 M phosphate buffer pH 7.4, 0.16 M NaCl.₂Oxidation was initiated by the addition of the aqueous solution. The final conditions were in all experiments: room temperature, 0.25 mg LDL / ml and 1.66 mM CuCl₂(See Esterbauer et al., 1989).
[0157]
The following compounds were tested for antioxidant activity: daidzein (10 mM), genistein (10 mM), glycitein (10 mM), biochanin (10 mM), formonenetin (10 mM), Promensil (Novogen) (2.5 mg) / ml, 5 mg / ml), Cpd.5 (10 mM), Cpd.7 (10 mM), Cpd.8 (10 mM), Cpd.12 (10 mM), Cpd.4 (10 mM) and Cpd.6 (10 mM). In each experiment, controls were used to compare the relative potency of the Novogen isoflavone derivative with a common and known antioxidant, such as ascorbate (2.5 mM; vitamin C).
[0158]
result
At the concentration tested (10 mM), it was found that the parent isoflavone showed no ability to scavenge free radicals. Promencil, on the other hand, is a moderate scavenger and has been shown to increase the lag time by up to 100% (at 5 mg / ml) when compared to the positive control (see Table 2).
[0159]
[Table 2]

[0160]
When testing isoflavone derivatives, Cpd. 12 (10 mM) and Cpd. 8 (10 mM) are very active scavengers and can increase the lag time by more than 600% when compared to the positive control. (See Table 3). Cpd.7 was found to be significantly less active than Cpd.8 and Cpd.12, but was still nearly as active as ascorbate.
[0161]
[Table 3]

[0162]
Prevent tocopherol-mediated peroxidation (anti- TMP test)
A test was performed to determine if the isoflavone derivatives could prevent LDL oxidation in the presence of vitamin E. This study was performed physiologically because vitamin E (a-tocopherol) was present in the bloodstream along with LDL, and because LDL oxidation was considered to be one of the key factors in the development of atherosclerosis. is important.
[0163]
Method
Anti-TMP tests are described in more detail by Bowry et al. (1995). This test indirectly assesses the ability of compounds to synergize with a-tocopherol in human LDL undergoing mild chemically controlled oxidation. Oxidation is measured by the accumulation of cholesterol ester hydroperoxide at a time point corresponding to 20% consumption of endogenous a-tocopherol.
[0164]
Briefly, an aliquot of a stock solution of the compound to be tested was added to LDL (1 mM in Apo B) without ascorbate and ubiquinol-10. The mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes and then oxidized at 37 ° C. with a low-flux, water-soluble ROO— produced from AAPH (4 mM). The time-dependent consumption of LDL a-tocopherol and the accumulation of cholesterylllinolate hydroperoxide (Ch18: 2-OOH) were monitored by HPLC with electrochemical and post-column chemiluminescence detection, respectively. The efficacy of an antioxidant, specified as the anti-TMP index (redox index), was determined by measuring the antioxidant measured after 20% consumption of endogenous a-tocopherol in a control sample (ie, in the absence of the antioxidant) It was defined as the relative amount of Ch18: 2-OOH formed between when and without addition. The active compound produces a low redox index. High redox activity suggests that the compound can interact with a-tocopherol in LDL, possibly by reducing the a-tocopheroxyl radical. Butylated hydroxytoluene (BHT, 10 mM) was used as a positive control.
[0165]
result
Cpd. 12 (10 mM) was found to have strong LDL protection (low redox index) and prevent LDL oxidation in the presence of vitamin E. In addition, Cpd. 7 and Cpd. 8 showed low levels of activity. The results are summarized in Table 4.
[0166]
[Table 4]

[0167]
In addition, a number of parent isoflavones were tested and found to have no antioxidant action. Promencil showed a low level of activity (see Table 5).
[0168]
[Table 5]

[0169]
a- Synergy with tocopherols ( TRAA test)
The purpose of this test was to evaluate the ability of isoflavone derivatives to reduce a-tocopheroxyl radicals in cetyltrimethyl ammonium chloride and sodium dodecyl sulfate micelles.
[0170]
Method
The a-tocopheroxyl radical decay capacity (TRAA) assay is described in detail in Witting et al. (1997). That is, a 100 mM stock solution of cetyltrimethylammonium chloride (HTAC) and sodium dodecyl sulfate (SDS) was prepared in phosphate buffer. A micellar dispersion of a-tocopherol was prepared by diluting an ethanolic solution of a-tocopherol (0.2 M) in micelles at a final vitamin concentration of 500 mM. The resulting solution was sonicated for 15 seconds, at which point it was completely homogeneous.
[0171]
LDL was isolated by ultracentrifugation of freshly collected heparinized plasma from a non-fasting healthy male donor (27 years old). LDL was obtained by direct aspiration and stored at 4 ° C. for 16 hours before use. Immediately before use, excess KBr and residual low molecular weight water-soluble antioxidants were removed from LDL by gel filtration chromatography using a PD-10 column (Pharmacia, Uppsala, Sweden) to reduce the concentration of LDL by Lowry et al. (1951). ).
[0172]
An aliquot of a-tocopherol-containing micelles was placed in the neck of an ESR flat cell (100 mL) and placed 0.5 m from a 125 W Osram HQL-Mercury fluorescent bulb used as a UV light source. The frosted casing of the bulb was removed to increase light intensity. After irradiating the sample for 3 minutes and then mixing well, the flat cell was transferred to a corresponding temperature-controlled Dewar insert in the ESR cavity where the sample was equilibrated to 37 ° C. This procedure yielded between 1-2 mM a-tocopheroxyl radical (a-TO), as estimated against a 10 mM TPDI nitroxide standard. Using a Bruker ESP 300 ESR spectrometer equipped with an X band cavity, an ESR spectrum was obtained at 9.41 GHz with a modulation amplitude of 1.0 G, a microwave power of 20 nW and a modulation frequency of 12.5 kHz.
[0173]
After accumulation of the T = 0 min spectrum, the flat cell array containing a-TO was removed from the ESR cavity and the solution was gently introduced into the neck of the flat cell under positive pressure. The selected compound was then added to a final concentration of 10 mM, the treated sample was re-entered into the cavity, equilibrated with standard conditions, and sampling resumed. The time-dependent decay of ESR signal intensity for a-TO was determined using a 20.5 second sweep time with and without the addition of a co-antioxidant (10 mM). Measured, the output from three consecutive cleanings at each time point was averaged, and the results of three separate experiments were averaged.
[0174]
result
The results are expressed as the relative rate constant of a-tocopheroxyl radical decay in the presence of the test sample divided by the relative rate constant of a-tocopheroxyl radical decay in the absence of the test sample. The TRAA approaching unity is considered to have a weak synergistic activity, but the active compounds show large values because they eliminate the a-tocopheroxyl radical immediately upon mixing. Ascorbate was used as a positive control.
[0175]
Cpd. 12 was found to induce a high rate of decay and was active upon exclusion of the a-tocopheroxyl radical. The results are summarized in Table 6.
[0176]
[Table 6]

[0177]
However, oxidation reactions other than those catalyzed by tocopheroxyl radicals also appear to be important. Therefore, it was investigated whether the derivative possessed additional antioxidant activity.
[0178]
4.5 Scavenging of peroxyl radicals ( scavenging )
The efficacy of isoflavone derivatives in inhibiting linoleate oxidation induced by peroxyl radicals (in the absence of vitamin E) was tested. This test provided information on whether the derivative had a radical scavenging activity independent of vitamin E.
[0179]
Method
Peroxyl radicals are a natural by-product of many enzymes, such as lipoxygenase and cyclo-oxygenase. The peroxyl radical was generated by a thermolabile azo-initiator AAPH. AAPH-induced oxidation of linoleate was performed as described above (Pryor et al., 1993), except that lower linoleate concentrations were used and SDS was omitted. An aliquot of the linoleate stock solution was added to PBS at 37 ° C. to a final concentration of 500 mM. Initiation of oxidation by the addition of AAPH (87.5 mM final concentration) in the absence and presence of either 10 mM Cpd. 7, Cpd. 8, or Cpd. 12, or 500 mM ascorbate (positive control). did. The production of linoleate hydroperoxide was monitored by UV 234 nm using a Perkin Elmer UV / Vis Lambda 40 spectrophotometer. The test was performed twice as a single analysis. Appropriate concentrations of alcohol (ethanol and isopropanol; 0.13-0.2% (v / v)) were included in each control sample.
[0180]
Dulbecco's PBS was purchased from Sigma, St Louis, MO. Water-soluble azoperoxyl radical generator 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) was purchased from Polysciences, Warrington, PA. Ascorbate (sodium salt) was purchased from Merck. A stock solution of AAPH (350 mM) was prepared by serial dilution with Dulbecco's PBS. Stock solutions of test compound (10 mM) were prepared as ethanol solutions, while stock solutions of linoleate (300 mM) were made by dissolving in isopropanol.
[0181]
result
The inclusion of 10 mM Cpd.12 was found to significantly inhibit the time-dependent increase in 234 nm absorbance induced by exposure of linoleic acid to AAPH, indicating that Cpd. It shows that it is an efficient agent of the radical. Similar results were obtained in two separate experiments. Ascorbate (used as a positive control) prevented AAPH-induced oxidation of linoleic acid, which is consistent with the existing literature.
[0182]
4.6 Prevention of peroxidase-induced oxidation of linoleate
The purpose of this test was to test whether isoflavone derivatives could affect heme-catalyzed oxidation reactions. Such oxidation reactions are believed to be relevant in vivo and can occur using lipids, proteins and / or DNA as substrate (s).
[0183]
Method
In this test, horseradish peroxidase (HRP) + hydrogen peroxide (H₂O₂), But similar to the peroxyl scavenging described in section 4.5 above.
[0184]
Increased heme levels are considered a potential risk factor for atherosclerosis, and heme-containing proteins may be involved in oxidative modification of LDL. H₂O₂In the presence of, the heme protein produces a strong oxidizing agent (referred to as Compound I) that can oxidatively modify lipids, such as lipids in LDL. Therefore, the ability of isoflavones to inhibit such lipid oxidation was tested using horseradish peroxidase as a model heme protein. HRP / H of linoleate₂O₂Induced oxidation was similar to that described by Witting et al (1997), primarily by replacing LDL with linoleate. Linoleate stock was added to PBS at 37 ° C. to a final concentration of 300 mM, in the absence and presence of either 10 mM Cpd. 7, Cpd. 8 or Cpd. 12 or 25 mM BHT (positive control). And HRP (40U / mL) / H₂O₂(2 mM). The production of linoleate hydroperoxide was monitored by UV 234 nm using a Perkin Elmer UV / visible Lambda 40 spectrophotometer. The above test was performed twice as one analysis. Appropriate concentrations of alcohol (ethanol and isopropanol; 0.13-0.2% (v / v)) were included in each control sample.
[0185]
Dulbecco's PBS, butylated hydroxytoluene (BHT) and acid-free linoleate were purchased from Sigma, St. Louis, MO. Horseradish peroxidase (HRP; Grad II; 100,000 U / 502.5 mg lyop. Powder) was purchased from Boehringer Mannheim (Germany). Hydrogen peroxide (H₂O₂; 30% (w / v)) was purchased from Merck. Stock solution of HRP (6000U / mL) and H₂O₂(1M) stock solutions were prepared by serial dilution using Dulbecco's PBS. BHT (25 mM) and test compound (10 mM) were prepared as ethanol solutions, while a stock solution of linoleate (300 mM) was made by dissolving in isopropanol.
[0186]
result
A test was performed to determine whether isoflavones could react with the strong oxidizing compound I.
Therefore, horseradish peroxidase + H₂O₂Was exposed to an isoflavone derivative (Cpd. 7, Cpd. 8, or Cpd. 12). It was found that both Cpd. 7 and Cpd. 8 can inhibit linoleic acid oxidation by Compound I as effectively as 25 mM BHT (used as a positive control). Surprisingly, the inhibitory activity of Cpd. 7 and Cpd. 8 was greater than equimolar amounts of Cpd. 12, suggesting that their mechanism of action may be complex.
[0187]
4.7 Inhibition of lipoxygenase
Lipoxygenases are potentially pro-inflammatory enzymes that require oxidative activation and release peroxyl radicals when catalyzed. The isoflavone derivatives were tested for their ability to exert lipoxygenase activity in vitro using soybean and rabbit reticulocyte 15-lipoxygenase and linoleic acid as a substrate.
[0188]
Method
15-lipoxygenase has been suggested to be involved in the early stages of LDL oxidation in vivo and to contribute to atherogenesis (Kuhn et al., 1994; Folcik et al., 1995). Soy 15-lipoxygenase (SLO) is a suitable model for 15-lipoxygenase and was therefore used to assess the ability of Cpd. 7, Cpd. 8 and Cpd. 12 to inhibit this enzyme. SLO-induced oxidation of linoleate was performed as above (Upston et al., 1996). Briefly, linoleate (100 mM) in PBS was converted to SLO (60 U) in the absence and presence of 10 mM Cpd. 7, Cpd. 8 or Cpd. 12 or 100 mM eicosatetraenoic acid (ETYA, positive control). / mL). The production of linoleate hydroperoxide was monitored by UV 234 nm using a Perkin Elmer UV / visible Lambda 40 spectrophotometer. The above test was performed twice as one analysis. Appropriate concentrations of alcohol (ethanol and isopropanol; 0.13-0.2% (v / v)) were included in each control sample.
[0189]
Dulbecco's PBS, acid-free linoleate, soybean 15-lipoxygenase (SLO; 630,000 U / mg protein) were purchased from Sigma (St. Louis, MO). Ascorbate (sodium salt) and eicosatetraenoic acid (ETYA) were purchased from Aldrich and Cayman Chemicals, respectively. Stock solutions of SLO (12,000 U / mL) and ascorbate (100 mM) were prepared by serial dilution with Dulbecco's PBS. Stock solutions of ETYA (33.3 mM) and test compounds (10 mM) were prepared as ethanol solutions, while stock solutions of linoleate (300 mM) were made by dissolving in isopropanol.
[0190]
result
Cpd. 12 is an effective inhibitor of type 1 lipoxygenase, as indicated by the strong decay of the increase in 234 nm absorbance. In fact, even at 10 mM, Cpd. 12 showed an inhibitory effect comparable to 100 mM ETYA, a well-established inhibitor of lipoxygenase. As in the case of the peroxyl radical, neither Cpd. 7 nor Cpd. 8 was able to inhibit SLO.
[0191]
5.0 Lipid test
5.1 Lipoprotein subfraction ( lipoprotein subfractions Of isoflavones in)
The effect of edible soy protein on blood cholesterol levels in rabbits was first reported by Meeker and Kesten in the 1940s (reviewed by Kristchevsky, 1995). Subsequently, evidence for an independent effect of isoflavones on blood cholesterol levels has been demonstrated in various models such as rats, hamsters, non-human primates and humans (Carroll, 1991; Anderson et al., 1995; Potter). Balmir et al., 1996; Clarkson et al., 1998). According to a report by Cassidy et al. (1995), in humans, 45 mg of isoflavones causes a significant reduction in total and LDL cholesterol levels in young women, but not 23 mg of isoflavones. Similar findings were reported by Potter et al (1993) and Bakhit et al. (1994). In contrast, Nestel et al. (1997) do not report a significant effect of 45 mg genistein (Cpd. 3) administered over a 5-10 week period on blood lipid levels.
[0192]
To confirm relevance isoflavones in the regulation of blood cholesterol, experiments were performed to examine the affinity of isoflavone derivatives for LDL and HDL in serum. In preliminary tests, the results are shown below, but only one compound, Cpd. 1 (daidzein), was used.
[0193]
Method
Cpd. 1 (10 mM and 50 mM) was incubated with whole plasma for 0, 4 and 8 hours. Next, the different subfractions LDL / VLDL, HDL and proteins (without lipoproteins) were analyzed for their Cpd.1 concentration. Cpd.1 was used because it has the polarity most similar to the isoflavone synthetic derivatives.
[0194]
result
It was found that a small but significant amount of Cpd.1 (daidzein) was associated with the lipoprotein. 2% of Cpd. 1 was found to be associated with LDL, 6% was found to be associated with HDL, and 92% was associated with the protein fraction. The amount associated with lipoprotein increased with time, but not with concentration. The results are shown in FIG. 13 (Cpd. 1, 10 mM) and FIG. 14 (Cpd. 1, 50 mM).
[0195]
5.2 LDL Receptor regulation
A high risk factor for cardiovascular disease is elevated LDL cholesterol levels. Excessive cholesterol makes the chances of oxidative damage and thus atherosclerosis greater. Estrogens have a number of potentially beneficial effects on the development of atherosclerosis and the consequences of cardiovascular events. 17β-estradiol has been shown to increase LDL receptor activity. There is also evidence that plant-derived estrogens (ie, phytoestrogens such as isoflavones) may have protective activity against the development of cardiovascular disease, but the underlying mechanism for this remains unknown. Given the structural similarities between isoflavones and their derivatives and certain moieties of estrogens, it is interesting to test whether isoflavones and related compounds can have similar molecular actions. Several studies have suggested that the mechanism by which isoflavones (and estrogens) improve blood lipid profiles may be due to changes in LDL receptor levels or activities (Baum et al., 1998; Kirk et al., 1998). Whether the isoflavone derivatives increase the turnover of cholesterol and increase its removal from the bloodstream by affecting LDL receptor activity remains undetermined. Therefore, by examining the specific binding of labeled LDL in control cells versus cells pre-treated with the test compound, Cpd. 7, Cpd. 8, and Cpd. 8, which stimulate LDL receptor binding in human hepatocytes in vitro. A test was performed to test 12 performances.
[0196]
Method
48 hours in complete DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) in the absence or presence of test compounds (final concentrations of 50 nM, 500 nM and 10 mM Cpd. 7, Cpd. 8 and Cpd. 12) Confluent human hepatoma (HepG2) cells were pre-incubated. LDL receptor expression was induced using serum deprivation (ie, 0.5% FBS) as a positive control. After preincubation, after washing the cells, 50 mg of [¹²⁵I] -LDL (specific activity 6.5-29.5 cpm / fmol) was added and cells were incubated at 4 ° C. for an additional 4 hours in the absence (for total binding) and presence (for non-specific binding) of 500 mg of unlabeled LDL. To assess binding). The cells were then washed and lysed (0.1 M NaOH) to determine the radioactivity and protein content of the lysate (BCA assay). The number of LDL receptors was determined from specific binding (total binding-non-specific binding), assuming one molecule of LDL bound per LDL receptor. Three independent experiments (each performed three times) were performed with different batches of cells and [¹²⁵This was performed using [I] -LDL.
[0197]
result
To determine the concentration of LDL required to reach binding saturation, confluent HepG2 cells were grown in the presence of an excess (ie, 500 mg) of unlabeled LDL [¹²⁵Incubation was carried out in 12-well plates with increasing concentrations of I] -LDL. Saturation is about 50 mg [¹²⁵I] -LDL. Using this concentration, the time required to reach saturation binding at 4 ° C. was determined to be about 4 hours. These established optimal conditions were used for all subsequent binding assays.
[0198]
Overall,
The number of LDL receptors measured in different series of experiments were different from each other (Table 7).
[0199]
[Table 7]

[0200]
Cpd. 12 did not show a consistent effect, whereas Cpd. 7 and Cpd. 8 increased LDL binding, as can be seen from the results, expressed as an incremental increase in LDL receptor expression over control. . In the case of Cpd. 7 (but not Cpd. 8), LDL receptor expression increased in a concentration-dependent manner, but the extent of this increase was small when compared to that obtained by serum deprivation. Cpd. 8 had no apparent concentration dependent effect.
[0201]
Although the effects observed were small, at least compared to serum deprivation, the increase in LDL binding was consistently observed in separate sets of experiments with different batches of both cells and LDL, Suggest that the observations made reflect the true activity of Cpd. 7 and Cpd. These results demonstrate the potential of isoflavones and their derivatives to prevent or delay the accelerated onset and progression of atherosclerotic plague with restenosis.
Embodiment 4
[0202]
Angiogenic activity
Angiogenesis occurs through a number of distinct steps that can be defined as endothelial cell activation, migration, proliferation and reorganization, forming mature blood vessels characterized by lumens. The effects of isoflavone derivatives on angiogenesis, especially endothelial cell proliferation and endothelial cell migration, are assessed by in vitro assays.
[0203]
4.1 Effects of isoflavone derivatives on endothelial cell proliferation
Method:
Cell preparation
Human umbilical vein endothelial cells between passages 1 and 3 were used. Cells were grown in gelatin-coated flasks in medium 199 containing 20% fetal calf serum, 25 mg / ml endothelial cell growth supplement and Earle's salt supplemented with 25 mg / ml heparin. Cells from two different donors were used.
[0204]
Proliferation assay
5 × 10 3 cells in 100 ml growth medium were plated in gelatin-coated microtiter wells. Test compounds were added at the time of plating. Next, the cells were incubated for 3 days, and the number of cells was measured by a colorimetric assay (CellTiter96 Aqueous assay, Promega). The results were compared to a standard curve and performed for each experiment. Assays were performed on two different days using two different endothelial cell isolates. The effect of isoflavone derivatives on proliferation of human umbilical vein endothelial cells is shown for donor No. 1 (FIG. 15) and donor No. 2 (FIG. 16).
[0205]
result:
15 and 16 show the effects of Cpd. 5, Cpd. 7, Cpd. 8 and Cpd. 12 on endothelial cell proliferation. Both Cpd. 8 (1-10 mg / ml) and Cpd. 12 (0.01-10 mg / ml) inhibited cell proliferation and did not cause toxicity. Interestingly, considerable phylogenetic variation was observed in the responsiveness of cells to these compounds (FIGS. 15a and 16a). Cpd. 5 (0.01-10 mg / ml) was found to have no apparent effect on endothelial cell proliferation in either of the two cell isolates tested (FIGS. 15b and 16b). Similarly, Cpd. 7 (0.01-10 mg / ml) did not show any appreciable antiproliferative effects on the two cell isolates tested (FIGS. 15c and 16c).
[0206]
4.2 Effects of isoflavone derivatives on endothelial cell migration
Method:
Cell preparation
Human umbilical vein endothelial cells between passages 1 and 3 were used. Cells were grown in gelatin-coated flasks in medium 199 with Earle's salt supplemented with 20% fetal calf serum, 25 mg / ml endothelial cell growth supplement and 25 mg / ml heparin.
[0207]
Transfer assay ( Migration Assay )
5 × 10 5 cells / well in growth medium were plated on fibronectin-coated 6-well trays and grown to confluence. Wounds were created along the monolayer by use of a cell scraper (Costar). The cells were then washed once and fresh medium containing the test compound was added. Defined points along the wound were marked using ink condensers (Olympus microscopes) to visualize cell migration at fixed points during the next 48 hours. Photographs were taken at appropriate times to assess the extent of cell migration from the front of the wound.
[0208]
result:
FIG. 17 shows the effect of Cpd. 12 on endothelial cell migration. The photographs show the amount of cell migration at baseline (0 hour) (FIG. 17a) and at 30 hours post-wound. Treatment with Cpd. 12 (final concentration 1 mg / ml) significantly inhibited endothelial cell migration towards the wound after 30 hours (FIG. C). DMSO (vehicle control) had no effect on proliferation, and after 30 hours of treatment, cells migrated toward the wound and formed a monolayer (FIG. 17b). Pictures were taken at various points along the wound, which were constant throughout the course of the experiment. The front of the early wound was marked.
[0209]
The results of this example show that Cpd. 8 and Cpd. 12 inhibited endothelial cell proliferation and Cpd. 12 inhibited endothelial cell migration. Thus, isoflavones and their derivatives show potential use as cardioprotective therapies, especially after vascular treatment and surgery.
Embodiment 5
[0210]
Inhibition of cell adhesion molecule expression
The ability of isoflavone compounds and derivatives to inhibit the expression of E-selectin was determined by the protocol described in Litwin et al. (1997), which is incorporated herein by reference.
[0211]
FIG. 18 presents comparative data on the ability of a number of isoflavone compounds to inhibit E-selectin expression performed according to the method of Litwin et al. TNF-_"The interaction of isoflavone metabolites Cpd. 8 and 12 in human umbilical vein endothelial cells activated by was measured against the concentration of compound. Cells were pre-incubated for 2 or 18 hours prior to TNF stimulation. In comparison to the DMSO control, isoflavone Cpd. 8 showed a very good expression of E-selectin, in particular 10_"Inhibition was shown at g / ml. Isoflavone Cpd. 12, especially 1_"g / ml and 10_"At a concentration of g / ml, it showed excellent inhibition of E-selectin expression.
[0212]
This example demonstrates that the claimed isoflavones and derivatives respond to a number of signals known to be active in restenosis, inflammatory responses and other diseases mediated by cell adhesion molecule expression by vascular endothelial cells. Demonstrates that it specifically blocks the ability of E-selectin to be expressed.
Embodiment 6
[0213]
Restenosis model-cell migration and proliferation
An important feature of atherosclerosis in humans is vascular smooth muscle cell (VSMC) migration from the arterial media to the intima, followed by proliferation in the intima. The animal model of atherosclerosis used in this experiment was aimed at inducing VSMC migration and neointimal proliferation by mechanical damage to the endothelium. The probe was introduced into the femoral artery of the mouse and into the aortic bifurcation through the iliac artery. The probe was then withdrawn and the femoral artery was ligated to prevent bleeding. The collateral circulation prevents any limb-related ischemia. Neointimal proliferation occurred in the iliac arteries over the next four weeks.
[0214]
By feeding mice with cholesterol during this time, growth was enhanced (starting one week before surgery). Four weeks later, the mice were sacrificed and bilateral iliac vessels were harvested (non-operative vessels were used as controls). Neointimal proliferation is expressed as the ratio of intimal area to intima + media area.
[0215]
This technique (primarily using gene knockout mice) proved to be very reproducible using a sample size of 5-10 mice. FIG. 19 shows a typical growth profile in normal mice. Minimal growth was observed at 3 weeks, a substantial increase in growth was observed at 4 weeks, and further growth was observed at 5 weeks. Minimal neointimal proliferation occurred in control non-operative vessels ("non-vessels") from the opposite side.
[0216]
The ability of isoflavone derivatives to reduce and / or prevent the "atherosclerotic" response in a mouse model of neointimal hyperplasia was examined. The compounds tested were Cpd. 5 and Cpd.
[0217]
Method
Atherosclerosis was induced in the femoral artery of each mouse by mechanically removing the endothelium using a probe. The ability of the isoflavone compounds to inhibit the atherosclerotic response was evaluated by comparing the treated and placebo groups. C57 / B16 mice (8-10 week old males) were anesthetized, and the right femoral artery was de-endothilialized using a dissecting microscope. These mice were also fed a 2% cholesterol diet to enhance disease progression. Mice were sacrificed at 4 weeks. The treated arteries (right) and control arteries (left) were collected together and fixed in formalin for histological evaluation.
[0218]
One week prior to surgery, mice were fed a 2% cholesterol diet mixed with normal mouse diet. Treatment groups were fed a diet containing Cpd.5 or Cpd.12 or Cpd.5 + 12. Mice were anesthetized with Avertin and femoral artery angioplasty was performed. After surgery, mice were transferred to a warm dark mat in a quiet dark place and monitored for recovery. Mice were housed in sterile cages with sterile beds to prevent infection. Mice continued on a cholesterol diet mixed with normal mouse diet for the next four weeks. Mice were euthanized four weeks after surgery. The femoral arteries were collected for pathological examination. The sections were evaluated by image analysis to identify the areas of the various sections of the arterial wall and the number of cells in each area. The main parameter evaluated was intimal area increase, expressed as the ratio of intimal area to intima + media area. Section intercept (50_"every m or every 10 sections), and stained with H & E. The cross-sectional areas of the endothelium, intima and media were evaluated using image analysis.
[0219]
result
FIG. 20 shows a transverse section through the iliac artery four weeks after surgery. FIG. 20a shows the absence of neointimal proliferation in the iliac arteries from the non-operative side, where the intima is about 1 cell thick. FIG. 20b shows substantial neointimal proliferation in the iliac arteries in response to surgery, showing approximately 50% thickness of the vessel wall. 20c and 20d are post-operative iliac arteries from mice treated with Cpd. 12 and Cpd. 5, respectively. Neointimal proliferation can be observed in each case, but proliferation was significantly reduced in Cpd.
[0220]
FIG. 21 quantifies the effect of test compounds on neointimal proliferation, both individually and together. Untreated vessels (without surgery) exhibit 5 ± 1% intima, while vessels treated only with surgery exhibit 50 ± 5% intima. 5, both alone and in combination with Cpd. 12, reduced neointimal proliferation to 30 ± 6% and 32 ± 10%, respectively, whereas Cpd. 12 reduced the extent of neointimal proliferation. Had no detectable effect (50 ± 29%). Notably, these data are consistent with Cpd. 5, which significantly reduces neointimal proliferation, but not with Cpd. 12, which has no appreciable effect.
[0221]
It is noteworthy that the area of neointimal proliferation corresponds well with the number of cells in the intima as measured using image analysis.
[0222]
These results indicate that isoflavones and their derivatives, particularly Cpd. 5, significantly inhibit VSMC proliferation in neointima in a mouse model of atherosclerosis. Neointimal area was reduced by about 50% at the time of the test (4 weeks). Cpd. 12 had no appreciable effect on neointimal proliferation in a mouse model at this time. The combination of Cpd.5 and Cpd.12 did not appear to alter the inhibitory effect observed with Cpd.5 alone. These results modulate the migration and progression of VSMCs and prevent or slow the onset and progression of atherosclerotic plaque, and therefore restenosis after mechanical injury, thereby reducing benefits in vascular protection. 2 shows the potential of the provided isoflavones and their derivatives.
[0223]
The invention has been described herein with reference to certain preferred embodiments so that the reader can practice the invention without undue experimentation. However, many components and parameters can be changed or modified without departing from the scope of the invention.
Those skilled in the art will readily recognize. In addition, titles, headings, etc., are provided to enhance the reader's understanding of the present specification and should not be construed as limiting the scope of the invention.
[0224]
The entire disclosure of all applications, patents and publications cited herein, if any, is hereby incorporated by reference.
[0225]
Those skilled in the art will appreciate that the invention described herein may be susceptible to changes and modifications other than those specifically described. It is to be understood that the invention encompasses all such changes and modifications. The present invention contemplates all of the steps, features, compositions and compounds referred to or indicated herein individually or collectively, and any two or more of the steps or features. It includes any and all combinations.
[0226]
Reference to any prior art herein is not a recognition or suggestion of any form that that prior art forms part of the common general knowledge in the field of endeavor. It should not be interpreted as such.
[0227]
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[Brief description of the drawings]
[0228]
FIG. 1 No description
FIG. 2 has no description
FIG. 3 No description
FIG. 4 No description
FIG. 5 No description
FIG. 6 No description
FIG. 7: No description
FIG. 8 No description
FIG. 9: No explanation
FIG. 10: No explanation
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FIG. 12: No explanation
FIG. 13 No description
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FIG. 20: No explanation
FIG. 21: No explanation

Claims (27)

A method of inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell, wherein the adhesion molecule or the endothelial cell comprises one or more compounds of Formula I, including a pharmaceutically acceptable salt thereof. ) And contacting the compound in an amount sufficient to inhibit the expression or activity, wherein the formula I is represented by the following:

Wherein R ₁ , R ₂ and Z are independently hydrogen, hydroxy, OR ₉ , OC (O) R ₁₀ , OS (O) R ₁₀ , CHO, C (O) R ₁₀ , COOH, CO ₂ R ₁₀ , CONR ₃ R ₄ , alkyl, haloalkyl, arylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, alkylaryl, alkoxyaryl, thio, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro or halo, or R ₂ Is as defined above, and R ₁ and Z, together with the carbon atom to which they are attached, are:

Or forms a 5-membered ring selected from, or R ₁ is as defined above, and R ₂ and Z together with the carbon atom to which they are attached, are:

And W is R ₁ , A is hydrogen, hydroxy, NR ₃ R ₄ or thio, and B is:

Or W is R ₁ and A and B together with the carbon atom to which they are attached are:

Or form a 6-membered ring, or W, A and B, together with the group to which they are associated,

Or W and A, together with the group to which they are associated, are:

And B is:

Selected from
in this case,
R ₃ is hydrogen, alkyl, arylalkyl, alkenyl, aryl, amino acid, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is hydrogen, alkyl, aryl, arylalkyl or amino acid), or CO ₂ R ₁₂ (here Wherein R ₁₂ is hydrogen, alkyl, haloalkyl, aryl or arylalkyl)
R ₄ is hydrogen, alkyl or aryl, or R ₃ and R ₄ together with the nitrogen to which they are attached, include pyrrolidinyl or piperidinyl;
R ₅ is hydrogen, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is as defined above) or CO ₂ R ₁₂ (where R ₁₂ is as defined above);
R ₆ is hydrogen, hydroxy, alkyl, aryl, amino, thio, NR ₃ R ₄ , C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is as defined above), CO ₂ R ₁₂ (where , R ₁₂ is as defined above) or CONR ₃ R ₄ ;
R ₇ is hydrogen, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is as defined above), alkyl, haloalkyl, alkenyl, aryl, arylalkyl or Si (R ₁₃ ) ₃ (where R 11 is ₁₃ are each independently hydrogen, alkyl or aryl);
R ₈ is hydrogen, hydroxy, alkoxy or alkyl;
R ₉ is alkyl, haloalkyl, aryl, arylalkyl, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is as defined above) or Si (R ₁₃ ) ₃ (where R ₁₃ is As defined),
R ₁₀ is hydrogen, alkyl, haloalkyl, amino, aryl, arylalkyl, amino acid, alkylamino or dialkylamino;
The drawing " --- " represents either a single or double bond,
T is independently hydrogen, alkyl or aryl;
X is O, NR ₄ or S, and Y is represented by the formula:

Wherein R ₁₄ , R ₁₅ and R ₁₆ are independently hydrogen, hydroxy, OR ₉ , OC (O) R ₁₀ , OS (O) R ₁₀ , CHO, C (O) R ₁₀ , COOH, CO ₂ R ₁₀ , CONR ₃ R ₄ , alkyl, haloalkyl, arylalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, thio, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro or halo. The method of claim 1, wherein the compound of formula I is represented by the following formulas II-VIII and comprises a pharmaceutically acceptable salt thereof:

Wherein R ₁ , R ₂ , R ₅ , R ₆ , R ₁₄ , R ₁₅ , W and Z are as defined in claim 1 above. R ₁ , R ₂ , R ₁₄ , R ₁₅ , W and Z independently represent hydrogen, hydroxy, OR ₉ , OC (O) R ₁₀ , C (O) R ₁₀ , COOH, CO ₂ R ₁₀ , alkyl , Haloalkyl, arylalkyl, aryl, thio, alkylthio, amino, alkylamino, dialkylamino, nitro or halo;
R ₅ is hydrogen, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is hydrogen, alkyl, aryl or amino acid) or CO ₂ R ₁₂ (where R ₁₂ is hydrogen, alkyl or aryl) Yes,
R ₆ is hydrogen, hydroxy, alkyl, aryl, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is as defined above), CO ₂ R ₁₂ (where R ₁₂ is as defined above) Is)
R ₉ is alkyl, haloalkyl, arylalkyl or C (O) R _11, wherein R ₁₁ is as defined above, and R ₁₀ is hydrogen, alkyl, amino, aryl, amino acid, Alkylamino or dialkylamino,
3. The method of claim 2, comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof. R ₁ and R ₁₄ are independently hydroxy, OR ₉ , OC (O) R ₁₀ or halo;
R ₂ , R ₁₅ , W and Z are independently hydrogen, hydroxy, OR ₉ , OC (O) R ₁₀ , C (O) R ₁₀ , COOH, CO ₂ R ₁₀ , alkyl, haloalkyl or halo ,
R ₅ is hydrogen, C (O) R ₁₁ (where R ₁₁ is hydrogen or alkyl) or CO ₂ R ₁₂ (where R ₁₂ is hydrogen or alkyl);
R ₆ is hydrogen or hydroxy;
R ₉ is alkyl, arylalkyl or C (O) R _11, wherein R ₁₁ is as defined above, and R ₁₀ is hydrogen or alkyl;
3. The method of claim 2, comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof. R ₁ and R ₁₄ are independently hydroxy, methoxy, benzyloxy, acetyloxy or chloro;
R ₂ , R ₁₅ , W and Z are independently hydrogen, hydroxy, methoxy, benzyloxy, acetyloxy, methyl, trifluoromethyl or chloro;
R ₅ is hydrogen or CO ₂ R _12, wherein R ₁₂ is hydrogen or methyl, and R ₆ is hydrogen;
3. The method of claim 2, comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof. Compounds of formula I have the following general formulas 1 to 30:

2. The method of claim 1 wherein the method comprises a pharmaceutically acceptable salt thereof. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the adhesion molecule is E-selectin or a vascular cell surface adhesion molecule (VCAM-1). A method of inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell of a subject, comprising a therapeutically effective amount of one or more compounds of formula I as defined in any one of claims 1 to 6. Administering to the subject. The method according to claim 8, wherein the adhesion molecule is E-selectin or a vascular cell surface adhesion molecule (VCAM-1). The method according to claim 8 or 9, wherein the subject is a human. In a method of treating a disease mediated by the expression or activity of an adhesion molecule associated with an endothelial cell in a subject, the method claims an amount sufficient to inhibit the expression or activity of the adhesion molecule associated with the endothelial cell. A method comprising administering to said subject one or more compounds of formula I as defined in any of paragraphs 1 to 6. 12. The method according to claim 11, wherein the disease is a vascular disease. 13. The method of claim 12, wherein the vascular disease is selected from restenosis, inflammatory disease, coronary artery disease, angina, and small vascular disease. 14. The method according to claim 13, wherein the vascular disease is restenosis after angioplasty. A method of treating, ameliorating, preventing, or reducing the risk of restenosis in a subject, comprising a therapeutically effective amount of one or more formulas as defined in any of claims 1-6. Administering a compound of I to said subject. 16. The method of claim 15, wherein the restenosis is associated with a vascular treatment selected from percutaneous transluminal coronary angioplasty, directional coronary atherectomy and stenting. A method of treating a vascular trauma in a subject, comprising administering to said subject a therapeutically effective amount of one or more compounds of formula I as defined in any of claims 1-6. Method. 18. The method of claim 17, wherein the procedural vascular trauma is selected from angioplasty, vascular surgery, transplantation, and a transplantation procedure. A method of treating or preventing a vascular disease in a subject, comprising:
A method comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of one or more compounds of formula I as defined in any of claims 1-6. 20. The method of claim 19, wherein said vascular disease is selected from atherosclerosis, restenosis, hypertension, inflammatory disease, coronary artery disease, angina, and small vascular disease. 21. The method of claim 20, wherein the vascular disease is restenosis after angioplasty. A pharmaceutical composition in a dosage form suitable for use in treating a disease mediated by the expression or activity of an adhesion molecule associated with endothelial cells in a subject, wherein said pharmaceutical composition is in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 6. A composition comprising one or more compounds of formula I as defined in any of 6. A pharmaceutical composition in a dosage form suitable for use in preventing a vascular disease or reducing the risk of a vascular disease in a subject, as defined in any one of claims 1 to 6, together with a pharmaceutically acceptable carrier. A composition comprising one or more compounds of formula I wherein Use of one or more compounds of formula I as defined in any of claims 1 to 6 in the manufacture of a medicament for inhibiting the expression or activity of an adhesion molecule associated with endothelial cells of a subject. The use of one or more compounds of formula I as defined in any of claims 1 to 6 in the manufacture of a medicament for the treatment of a disease mediated by the expression or activity of adhesion molecules associated with endothelial cells. use. Use of one or more compounds of formula I as defined in any of claims 1 to 6 in the manufacture of a medicament for the treatment, amelioration, prevention or reduction of the risk of restenosis. Use of one or more compounds of formula I as defined in any of claims 1 to 6 in the manufacture of a medicament for the treatment of a vascular disease and / or procedural vascular trauma.

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