JP2004528846A - Methods for identifying targets for compounds that inhibit cell proliferation - Google Patents

Methods for identifying targets for compounds that inhibit cell proliferation Download PDF

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JP2004528846A JP2002583612A JP2002583612A JP2004528846A JP 2004528846 A JP2004528846 A JP 2004528846A JP 2002583612 A JP2002583612 A JP 2002583612A JP 2002583612 A JP2002583612 A JP 2002583612A JP 2004528846 A JP2004528846 A JP 2004528846A
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Abstract

本発明は、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株の培養物または収集物に関する。本発明はまた、生物の増殖を阻害する化合物が作用する標的を特定する方法、および株が株の培養物または収集物に存在する程度を特定する方法を包含する。The present invention relates to cultures or collections of strains that over- or under-express gene products required for growth of an organism. The invention also includes a method of identifying a target on which a compound that inhibits the growth of an organism acts, and a method of determining the extent to which a strain is present in a culture or collection of the strain.

Description

【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減する化合物の標的を特定するための試薬および方法を提供する。さらに、本発明は、新規治療用化合物または新規標的に対して作用する化合物を特定するための試薬および方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
多くの重要な治療化合物は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減あるいは排除することで作用する。例えば、ほとんどの抗生物質化合物は、病原体の増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減あるいは排除することで作用する。同様に、癌を治療または回復するのに使用される化合物はまた、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減あるいは阻害する。
【０００３】
現在の薬物発見方法は、有効な治療薬であるか、または有効な治療薬を提供するように最適化され得るものを特定するために、大量の見込みある治療用化合物をスクリーニングすることを包含する。例えば、治療活性に関して評価されるべき化合物は、コンビナトリアルケミストリーにより生成される化合物ライブラリーの成員、または天然産物ライブラリーの成員であってもよい。
【０００４】
不運にも、現在の方法は手間がかかり、かつ時間を消費し、すでに特定されたか、または既存の治療薬によりすでに標的とされている遺伝子産物に対して作用する化合物をもたらし得る。したがって、新規化合物または新規標的に対して作用する化合物をもたらす迅速なスクリーニング技法が必要である。
【０００５】
さらに、抗菌活性を有するが、それらの標的が未知であるという事実に起因して感染を患う個体に投与することができない大量の化合物が特定されている。したがって、抗菌活性を有する化合物が作用する標的の特定を可能にする方法が必要である。
【０００６】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表を含む、「コピー１」、「コピー２」、「コピー３」、および「ＣＲＦ」と表記したＣＤ−ＲＯＭの４つのコピーと一緒に出願される。ＣＤ−ＲＯＭのコピーそれぞれには、３６，２２０，５８７バイトのサイズの、２００２年２月８日に創ったファイル名０２８ｖｐｃ−ｆｉｎａｌ．ｔｘｔが含まれる。これらの複製ＣＤ−ＲＯＭ上の情報は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００７】
定義
本明細書で使用される場合、「増殖に必要な」または「増殖に必要とされる」という専門用語は、遺伝子転写物および／または遺伝子産物の欠如あるいはかなりの減少が細胞成長を完全に排除する場合、ならびに遺伝子転写物および／または遺伝子産物の欠如が単に細胞成長を低減する場合を包含する。
【０００８】
「Ｅ．ｃｏｌｉまたはエシェリヒア・コリ(Escherichia coli)」とは、エシェリヒア・コリまたはシゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・ゾンネ (Shigella sonnei)、シゲラ２Ａ(Shigella 2A)を含むシゲラ属の種としてこれまで分類されてきた任意の生物を意味する。
【０００９】
「相同コード核酸」とは、配列番号８〜３７９５またはそれらの一部からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物をコードする核酸に相同的な核酸を意味する。幾つかの実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４、ならびにそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有し得る。他の実施形態では、相同コード核酸は、配列番号８〜３７９５の１つに相補的なヌクレオチド配列、およびそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有し得る。同一性は、デフォルトパラメータのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０、またはデフォルトパラメータのｔＢＬＡＳＴＸを用いて測定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。あるいは、「相同コード核酸」は、機能的オルソログクラスターに対する所定の遺伝子の一員により特定することができる。このオルソログクラスターの他の成員はすべて、相同であるとみなされる。かかる機能的オルソログクラスターのライブラリーは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COGに見出すことができる。遺伝子は、上記ウェブサイトで利用可能なＣＯＧＮＩＴＯＲプログラムを用いることにより、あるいはＣＯＧの成員に対する所定の遺伝子の直接ＢＬＡＳＴＰ比較およびTatusov, R.L., Galperin, M.Y., Natale, D.A. and Koonin, E.V. (2000) The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution. Nucleic Acids Research v.28 n.1, pp．33-36に記載されるようなこれらの結果の解析により、オルソログ群のクラスター、すなわちＣＯＧに類別することができる。
【００１０】
「相同コード核酸」という用語はまた、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８のうちの１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号８〜３７９５のうちの１つのヌクレオチド配列を含む核酸により発現が阻害されるポリペプチド、またはそれらの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸を含む断片に対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。あるいは、タンパク質同一性または類似性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＸ、デフォルトパラメータのＢＬＡＳＴＮ、またはデフォルトパラメータのｔＢＬＡＳＴＸを用いて特定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【００１１】
「相同コード核酸」という用語はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択される核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするコード核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸を包含する。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃で６×ＳＳＣ中でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、続く約６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回または複数回の洗浄を意味する。他の例示的ストリンジェントな条件は、例えば、使用される特定のプローブに適切なように、３７℃、４８℃、５５℃、および６０℃での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を指してもよい。
【００１２】
「相同コード核酸」という用語はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸を包含する。本明細書で使用する場合、「中程度の条件」とは、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続く約４２〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回、好ましくは３〜５回の洗浄を意味する。
【００１３】
「相同コード核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物をコードする遺伝子により活性が補完され得る遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。幾つかの実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物により活性が補完される遺伝子産物をコードし得る。他の実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８のポリペプチドのうちの１つにより活性が補完される遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００１４】
「相同アンチセンス核酸」という用語は、配列番号８〜３７９５の配列のうちの１つ、およびそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を包含する。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の配列のうちの１つ、およびそれらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％ヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸であってもよい。核酸同一性は、上述のように決定され得る。
【００１５】
「相同アンチセンス核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。
【００１６】
「相同アンチセンス核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に中程度の条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を包含する。
【００１７】
「相同ポリペプチド」とは、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により、あるいは相同アンチセンス核酸により、活性またはレベルが阻害されるポリペプチドに対して相同的なポリペプチドを意味する。「相同ポリペプチド」という用語は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルは阻害されるポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチド、あるいは配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルは阻害されるポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸を含む断片に対するポリペプチドに対して、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチドを包含する。同一性または類似性は、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定され得る。あるいは、タンパク質同一性または類似性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータでのＴＢＬＡＳＴＸ、またはデフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＮを用いて特定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【００１８】
相同ポリペプチドという用語はまた、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸に対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸同一性あるいは類似性を有するポリペプチドを包含する。
【００１９】
サルモネラ属という用語は、エシェリヒア・コリに密接に関連したグラム陰性腸内細菌の大きなグループに関する一般名である。サルモネラ属により引き起こされる疾患は、食料品または給水の汚染に起因する場合が多く、毎年何百人もの人々が罹患している。サルモネラ属分類学の伝統的な方法は、それぞれが血清学的に識別可能な株に、別個の種名を割り当てることに基づいていた(Kauffmann, F 1966 The bacteriology of the Enterobacteriaceae. Munksgaard, Copenhagen)。サルモネラ属の血清学は、表面抗原に基づいている（Ｏ［菌体］およびＨ［べん毛］）。サルモネラ属の２，４００種以上の血清型または血液型亜型が既知である(Popoff, et al. 2000 Res. Microbiol. 151:63-65)。したがって、各血清型は、別個の種であるとみなされ、したがって多くの場合名称が付与された（例えば、ｓ．パラティフィ(S．paratyphi)、ｓ．タフィマリアム(S．typhimurium)、ｓ．・ティフィ(S．typhi)、 ｓ．エンテリディティス(S. enteriditis)等）。
【００２０】
しかしながら、１９７０代および１９８０年代までには、この系が扱いにくいだけでなく、不正確であることが認められた。続いて、多くのサルモネラ種が単一種（すべての血清型および血液型亜型Ｉ、ＩＩおよびＩＶ、ならびにアリゾナ (Arizona)のすべての血清型）にまとめられ、第２の種であるＳ．ボンゴリもまた認識された(Crosa, et al. 1973,
J. Bacteriol. 115:307-315)。種の名称は高可変表面抗原に基づいているが、サルモネラは、主に病原性決定基を除いて、別の状況では非常に類似している。
【００２１】
サルモネラ種に関する正式名に関する議論が幾つか存在する。一般に(Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38:2465-2467)、受け入れられている名称は、サルモネラ・エンテリカである。Ｓ．エンテリカは、６つの亜種（Ｉ：Ｓ．エンテリカ亜種エンテリカ、ＩＩ：Ｓ．エンテリカ亜種サラマエ(salamae)、ＩＩＩａ：Ｓ．エンテリカ亜種アリゾナエ(arizonae)、ＩＩＩｂ：Ｓ．エンテリカ亜種ジアリゾナエ(diarizonae)、ＩＶ：Ｓ．エンテリカ亜種ホウテナエ(houtenae)、およびＶＩ：Ｓ．エンテリカ亜種インディカ(indica)）に分けられる。亜種Ｉ内では、血清型または血液型亜種をそれぞれ識別するために血清型が使用される（例えば、Ｓ．エンテリカ血清型エンテリディティス(Enteriditis)、Ｓ．エンテリカ血清型タフィマリアム(Typhimurium)、Ｓ．エンテリカ血清型チフィ(Typhi)、およびＳ．エンテリカ血清型コレラエスイス(Choleraesuis)等）。従来の取り決めは、最初の使用時にこれ（サルモネラエンテリカ血清型タフィマリアム）を綴り、その略記型（サルモネラ・タフィマリアム、またはＳ．タフィマリアムタフィマリアム）を使用することである。属および種名（サルモネラ・エンテリカ）はイタリック体で記載されるが、血清型／血液型亜種名（タフィマリアム）はイタリック体で記載されないことに留意されたい。分類学委員会は、依然として公式上正確な種名を推奨しなくてはならないため、この後者のシステムはＣＤＣにより使用されるものである(Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38:2465-2467)。分類学的優先および医療上の重要性の両方の関係により、これらの血清型の幾つかは最終的には完全な種名称を受け得る（ｓ．ティフィが最も顕著であろう）。
【００２２】
したがって、本明細書で記載する場合、「サルモネラ・エンテリカ、またＳ．エンテリカ」は、血液型亜種チフィ、タフィマリアム、パラチフィ（Paratyphi）コレラエスイス等を包含する。しかしながら、「公式」名の訴えは処理中であり、分類学的名称は変更し得る（Ｓ．コレラエスイスは、単に優先に基づいてＳ．エンテリカを置き換えることができる種名である）。
【００２３】
「誘導物質」とは、細胞または微生物と接触させて置いた場合に、望ましいプロモーターから、転写、あるいは阻害剤および／または促進剤クリアランス／ファイデリティを増加する作用物質または溶液を意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸を意味する。したがって、「配列番号Ｘの核酸」または「ヌクレオチド配列を含む核酸」という専門用語は、配列番号ＸのＤＮＡ配列、およびＤＮＡ配列中のチミジンをＲＮＡ配列中でウリジンで置換し、かつＤＮＡ配列のデオキシリボース骨格をＲＮＡ配列中でリボース骨格で置換したＲＮＡ配列の両方を包含する。修飾核酸は、天然に存在しないヌクレオチドまたは構造を有する核酸、例えばヌクレオチド間リン酸残基がメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、およびリン酸エステルである核酸である。シロキサン架橋、炭酸架橋、チオエステル架橋のような非リン酸ヌクレオチド間、ならびに当該技術分野で既知の多くの他のもまた、修飾核酸に使用され得る。
【００２５】
修飾核酸はまた、α−アノマーヌクレオチドユニット、ならびに１，２−ジデオキシ−ｄ−リボフラノース、１，２−ジデオキシ−１−フェニルリボフラノース、およびＮ4，Ｎ4−エタノ−５−メチル−シトシンのような修飾ヌクレオチドを含んでもよく、本発明の使用に意図される。修飾核酸はまた、デオキシリボース−リン酸骨格全体を、化学的には完全に異なるが構造的には類似した、２−アミノエチルグリシンユニットを含有するポリアミド（ペプチド）骨格と交換したペプチド核酸であってもよい。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「過剰発現する」という専門用語は、野生型細胞が保有するレベルよりも高い遺伝子産物レベル、または野生型遺伝子産物の親和性よりも低い試験化合物に関する親和性のいずれかを保有する株を指す一方で、「過小発現する」という専門用語は、野生型細胞が保有するレベルよりも低い遺伝子産物レベル、または野生型遺伝子産物の親和性よりも高い試験化合物に関する親和性のいずれかを保有する株を指す。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
［発明の概要］
本発明のいくつかの態様を以下の番号が付けられた段落で説明する。
【００２８】
１．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００２９】
２．前記培養物は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない株を少なくとも１つ含む、段落１に記載の方法。
【００３０】
３．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落１に記載の方法。
【００３１】
４．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落１に記載の方法。
【００３２】
５．前記特定工程は、前記培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、段落１に記載の方法。
【００３３】
６．前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、段落１に記載の方法。
【００３４】
７．前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、段落６に記載の方法。
【００３５】
８．前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、段落１に記載の方法。
【００３６】
９．前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、段落１に記載の方法。
【００３７】
１０．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落１に記載の方法。
【００３８】
１１．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア (Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム (Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス (Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モラクセラ・カタルハリス(Moraxella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ (Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)からなる群から選択される生物の培養物である、段落１に記載の方法。
【００３９】
１２．前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、段落１に記載の方法。
【００４０】
１３．前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、段落１に記載の方法。
【００４１】
１４．前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落１に記載の方法。
【００４２】
１５．前記培養物中でより迅速に増殖した前記株における前記遺伝子産物が、少なくとも１つの他の生物においておいて相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、段落１に記載の方法。
【００４３】
１６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【００４４】
１７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４５】
１８．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４６】
１９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４７】
２０．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４８】
２１．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００４９】
２２．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する、固体成長培地上の株のアレイを得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記株のアレイを接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００５０】
２３．前記アレイ中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、段落２１に記載の方法。
【００５１】
２４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記複数の培養物のそれぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖が阻害される株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００５２】
２５．前記複数の培養物における少なくとも１つの株が、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、段落２３に記載の方法。
【００５３】
２６．化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で段落１に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で段落１に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。
【００５４】
２７．第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、および
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。
【００５５】
２８．前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落２６または２７に記載の方法。
【００５６】
２９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００５７】
３０．前記培養物中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過小発現しない、段落２９に記載の方法。
【００５８】
３１．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸を含む、段落２９に記載の方法。
【００５９】
３２．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部と相補的なアンチセンス核酸を発現し、前記アンチセンス核酸の発現により、前記株における前記遺伝子産物の発現が低下する、段落２９に記載の方法。
【００６０】
３３．前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、段落２９に記載の方法。
【００６１】
３４．前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、段落２９に記載の方法。
【００６２】
３５．前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、段落３４に記載の方法。
【００６３】
３６．前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、段落２９に記載の方法。
【００６４】
３７．前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、段落２９に記載の方法。
【００６５】
３８．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落２９に記載の方法。
【００６６】
３９．前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、段落２９に記載の方法。
【００６７】
４０．前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、段落２９に記載の方法。
【００６８】
４１．前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落２９に記載の方法。
【００６９】
４２．前記培養物中でよりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物が少なくとも１つの他の生物において相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、段落２９に記載の方法。
【００７０】
４３．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７１】
４４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７２】
４５．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７３】
４６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７４】
４７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７５】
４８．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７６】
４９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００７７】
５０．化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で段落２９に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で段落２９に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。
【００７８】
５１．第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。
【００７９】
５２．前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、段落４９または５０に記載の方法。
【００８０】
５３．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物の発現レベルを調節する様々な濃度の調節剤と、前記複数の培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【００８１】
５４．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物。
【００８２】
５５．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落５４に記載の培養物。
【００８３】
５６．前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落５４に記載の培養物。
【００８４】
５７．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落５４に記載の培養物。
【００８５】
５８．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８６】
５９．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８７】
６０．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８８】
６１．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００８９】
６２．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００９０】
６３．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。
【００９１】
６４．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物。
【００９２】
６５．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落６４に記載の培養物。
【００９３】
６６．前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、段落６４に記載の培養物。
【００９４】
６７．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落６４に記載の培養物。
【００９５】
６８．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９６】
６９．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９７】
７０．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９８】
７１．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【００９９】
７２．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【０１００】
７３．前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。
【０１０１】
７４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含み、、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１０２】
７５．過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、段落７４に記載の方法。
【０１０３】
７６．過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、段落７４に記載の方法。
【０１０４】
７７．前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、段落７６に記載の方法。
【０１０５】
７８．前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、段落７４に記載の方法。
【０１０６】
７９．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、段落７５に記載の方法。
【０１０７】
８０．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望の発現レベルで発現されるように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、段落７５に記載の方法。
【０１０８】
８１．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、段落７５に記載の方法。
【０１０９】
８２．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、段落７５に記載の方法。
【０１１０】
８３．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落７４に記載の方法。
【０１１１】
８４．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落７４に記載の方法。
【０１１２】
８５．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１３】
８６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１４】
８７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ることであって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１５】
８８．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１６】
８９．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【０１１７】
９０．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に相当する該特有の産物を検出することにより、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物中で、より迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１８】
９１．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１１９】
９２．過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、段落９１に記載の方法。
【０１２０】
９３．過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、段落９１に記載の方法。
【０１２１】
９４．前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、段落９３に記載の方法。
【０１２２】
９５．前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、段落９１に記載の方法。
【０１２３】
９６．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、段落９２に記載の方法。
【０１２４】
９７．増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望のレベルで発現するように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、段落９２に記載の方法。
【０１２５】
９８．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、段落９２に記載の方法。
【０１２６】
９９．各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、段落９２に記載の方法。
【０１２７】
１００．前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、段落９１に記載の方法。
【０１２８】
１０１．前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、段落９１に記載の方法。
【０１２９】
１０２．前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む、段落９１に記載の方法。
【０１３０】
１０３．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３１】
１０４．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３２】
１０５．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３３】
１０６．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過小発現される株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。
【０１３４】
１０７．生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。
【０１３５】
１０８．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む株の培養物または収集物から核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１３６】
１０９．前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、段落１０８に記載の方法。
【０１３７】
１１０．前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、段落１０８に記載の方法。
【０１３８】
１１１．増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、段落１０９に記載の方法。
【０１３９】
１１２．前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられ、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、段落１０８に記載の方法。
【０１４０】
１１３．それぞれの前記遺伝子に関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、段落１１１に記載の方法。
【０１４１】
１１４．複数の調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、段落１１１に記載の方法。
【０１４２】
１１５．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４３】
１１６．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４４】
１１７．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４５】
１１８．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４６】
１１９．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４７】
１２０．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドによりその活性が相補され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１４８】
１２１．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の培養物または収集物であって、前記化合物と接触させられている第１の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられていない第２の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に対応する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと
を含む方法。
【０１４９】
１２２．前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、段落１２１に記載の方法。
【０１５０】
１２３．前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、段落１２１に記載の方法。
【０１５１】
１２４．前記遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、段落１２１に記載の方法。
【０１５２】
１２５．前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、段落１２１に記載の方法。
【０１５３】
１２６．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１５４】
１２７．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記第２の株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。
【０１５５】
１２８．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同一のプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。
【０１５６】
１２９．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過剰発現される株を含む方法。
【０１５７】
１３０．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物、から核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１５８】
１３１．生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１５９】
１３２．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増殖反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。
【０１６０】
１３３．前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、段落１３２に記載の方法。
【０１６１】
１３４．前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、段落１３２に記載の方法。
【０１６２】
１３５．増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、段落１３４に記載の方法。
【０１６３】
１３６．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６４】
１３７．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６５】
１３８．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６６】
１３９．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６７】
１４０．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応を実施であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６８】
１４１．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１６９】
１４２．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること
を含む方法。
【０１７０】
１４３．前記プライマー対は少なくとも２つの組に分けられ、各プライマー対は識別可能な色素で標識されるプライマーを含み、各プライマー対を標識するのに使用される前記識別可能な色素は、プライマー対の他の組を標識するのに使用される色素と識別可能である、段落１４２に記載の方法。
【０１７１】
１４４．前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、段落１４２に記載の方法。
【０１７２】
１４５．増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、段落１４４に記載の方法。
【０１７３】
１４６．前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対のうちのプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、段落１４２に記載の方法。
【０１７４】
１４７．前記遺伝子それぞれに関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、段落１４６に記載の方法。
【０１７５】
１４８．前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換えられており、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においている、段落１４６に記載の方法。
【０１７６】
１４９．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群からの選択に基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１７７】
１５０．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて増幅反応を実施することであって、前記プライマー対の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計される、実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１０〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１７８】
１５１．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１７９】
１５２．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１８０】
１５３．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、緊縮条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。
【０１８１】
１５４．複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いてた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現される株を含む方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１８２】
本発明は、細胞増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現するか、または細胞増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過小発現する株を含む株の収集物または培養物を利用する（すなわち、培養物中の株の少なくとも幾つかは、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する）。幾つかの実施形態では、本発明は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する株、および細胞増殖に必要とされる同じ遺伝子産物を過小発現する株の両方を含む株の収集物または培養物を使用する。好ましくは、培養物または収集物中の存在する株はそれぞれ、細胞増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する（すなわち、培養物中の株のすべてが、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する）。各株において過剰発現または過小発現される遺伝子産物は、細胞増殖に必要とされる任意の遺伝子産物であってもよい。遺伝子産物は、核酸またはポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用する場合、「培養物」という用語は、液体成長培地の単一アリコット中で成長する複数の株を指し、「収集物」という用語は、それぞれが液体成長培地の別個のアリコット中で、または固体成長培地上の種々の位置上で成長している複数の株を指す。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、細胞増殖に必要とされる複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現し得る。この実施形態では、１つまたは複数の株において過剰発現または過小発現される遺伝子産物は、機能的に関連され得るか、あるいは機能的に非関連であり得る。これは、２つ以上の遺伝子産物が細胞中で類似の機能を共有する場合、あるいは細胞が特定の最終産物をもたらす多数の生化学経路を有する場合、化合物の特定を促進し得る。
【０１８４】
あるいは、過剰発現または過小発現される遺伝子産物が複数の遺伝子を含有するオペロンの一部である遺伝子によりコードされる場合、所望の遺伝子は過剰発現または過小発現され得るが、一方オペロン中の残りの遺伝子は、それらが、細胞の特定の化合物の存在下で成長する能力に影響を与えないレベルで発現される。例えば、所望の遺伝子は、調節可能なプロモーターの制御下に置かれてもよく、転写終結因子は所望の遺伝子の３’に配置されてもよく、プロモーター、好ましくは構成的プロモーターは、転写終結因子の３’およびオペロン中の残りの遺伝子の５’に配置されてもよい。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含み得る。幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも２個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも１０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも２０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも３０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも５０個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも１００個の遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される少なくとも３００個の遺伝子産物、あるいは配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される３００個より多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含んでもよく、ここで株の培養物または収集物中の各株は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される単一遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。あるいは、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸により活性またはレベルが阻害される複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現してもよい。
【０１８６】
他の実施形態では、株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含み得る。幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも２個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも１０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも２０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも３０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも５０個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも１００個の遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる少なくとも３００個の遺伝子産物、あるいは配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる３００個より多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含んでもよく、ここで株の培養物または収集物中の各株は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸によりコードされる単一遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。あるいは、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸によりコードされる複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現してもよい。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む。幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも２個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも２０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも３０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも５０個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１００個の遺伝子産物、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも３００個の遺伝子産物、あるいは配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３００個より多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含んでもよく、ここで株の培養物または収集物中の各株は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択される単一遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。あるいは、望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択される１つより多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現してもよい。
【０１８８】
他の実施形態では、株の培養物または収集物は、上記に定義されるような相同コード核酸によりコードされる少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む。望ましい場合、株の培養物または収集物は、相同コード核酸によりコードされる１つより多い遺伝子産物を過剰発現または過小発現する１つまたは複数の株を含んでもよい。さらなる実施形態では、株の培養物または収集物は、上記に定義される少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い相同ポリペプチドが過剰発現または過小発現される株を含む。望ましい場合、株の培養物または収集物は、１つより多い相同ポリペプチドを過剰発現または過小発現する１つまたは複数の株を含んでもよい。
【０１８９】
例えば、幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される、少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株あるいは株の群を含み、ここで各株は、１つの遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。
【０１９０】
望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現し得る。
【０１９１】
さらなる実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる、少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株あるいは株の群を含み、ここで各株は、１つの遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。
【０１９２】
望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる複数の遺伝子産物を過剰発現または過小発現し得る。
【０１９３】
さらなる実施形態では、株の培養物または収集物は、概して配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む、少なくとも１個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも３００個、または３００個より多い遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株あるいは株の群を含み、ここで各株は、１つの遺伝子産物を過剰発現または過小発現する。
【０１９４】
望ましい場合、株の培養物または収集物中の１つまたは複数の株は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択される複数のポリペプチドを過剰発現または過小発現し得る。
【０１９５】
本発明の方法は、任意の望ましい細胞または生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定するのに使用され得る。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、細菌、真菌、または原生動物の増殖を阻害する化合物の標的を特定するのに使用される。さらなる実施形態では、本発明の方法は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の成長を阻害する化合物の標的を特定するのに用いられる。
【０１９６】
過剰発現は、当業者が精通している各種技法を用いて得てもよい。例えば、過剰発現は、野生型細胞よりも高レベルの、遺伝子産物をコードするか、または遺伝子産物を含むｍＲＮＡを転写するプロモーターに、遺伝子産物をコードする遺伝子を作動可能に連結することにより得てもよい。様々なプロモーターを用いて、遺伝子産物を過剰発現してもよい。遺伝子産物を過剰発現するのに使用されるプロモーターは、比較的強力なプロモーター、中程度のレベルの活性を保有するプロモーター、または比較的弱いプロモーターであってもよく、構成性プロモーターまたは調節可能なプロモーターであってもよい。幾つかの実施形態では、遺伝子産物の過剰発現の度合いを最適化するために、それぞれが異なる程度に遺伝子産物を過剰発現する幾つかの株を使用してもよい。
【０１９７】
幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物それぞれは、様々なレベルで遺伝子産物を発現する幾つかの異なる株を創出するために、様々な強度の幾つか異なるプロモーターの制御下に置かれてもよい。株それぞれの遺伝子産物の発現レベルは、野生型細胞に対して所望のレベルの発現（すなわち、所望のレベルの過剰発現または過小発現）を提供するプロモーターを特定するために、野生型細胞の発現レベルと比較される。続いて、所望の発現レベルを有する株は、以下に記載するように試験化合物と接触させるべき株の培養物または収集物中に含まれる。
【０１９８】
プロモーターは、遺伝子産物が発現される細胞型において活性であるように選択される。例えば、哺乳類細胞における遺伝子産物の過剰発現に関して、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオニンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｔｅｔＰプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、または当業者に既知の他のプロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結され得る。酵母では、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＣＹＣ１、ＡＤＨＩ、ＡＤＨＩＩ、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＰＨＯ５、ＰＧＫ、または当該技術分野で使用される他のプロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結され得る。同様に、細菌では、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＳＰ６、Ｔ３、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、温度調節λプロモーター、バシラスａｐｒＥおよびｎｐｒＥプロモーター（米国特許第５，３８７，５２１号）、バクテリオファージλＰLおよびＰRプロモーター(Renaut, et al., (1981) Gene 15:81)、ｔｒｐプロモーター(Russell, et al., (1982) Gene 20:23)、ｔａｃプロモーター(de Boer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21)、B. サブチリス(B. subtilis)アルカリプロテアーゼプロモーター（Stahl et al, (1984) J. Bacteriol. 158, 411-418)、B. サブチリス (Yang et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 237-249)またはＢ．アミロリクエファシエンス(B. amyloliquefaciens)(Tarkinen, et al, (1983) J. Biol. Chem. 258, 1007-1013)のαアミラーゼプロモーター、B. サブチリス由来の中性プロテアーゼプロモーター(Yang et al, (1984) J. Bacteriol. 160, 15-21)、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター(Studier and Moffatt (1986) J Mol Biol. 189 (1):113-30)、バシラス属において活性なB. サブチリスｘｙｌプロモーターまたは突然変異ｔｅｔＲプロモーター(Geissendorfer & Hillen (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:657-663)、スタフィロコッカスエンテロトキシンＤプロモーター(Zhang and Stewart (2000) J. Bacteriol. 182 (8)2321-5)、スタフィロコッカス・アウレウス由来のｃａｐ８オペロンプロモーター(Ouyang et al., (1999) J. Bacteriol. 181(8):2492-500)、ラクトコッカス(lactococcal)ｎｉｓＡプロモーター(Eichenbaum (1998) Appl Environ Microbiol. 64(8):2763-9)、アコレプラスマ・ライドラウィイ(Acholeplasma laidlawii)由来のプロモーター(Jarhede et al., (1995) Microbiology 141 (Pt 9): 2071-9)、ネイセリア・メニンジチジスのｐｏｒＡプロモーター(Sawaya et al., (1999) Gene 233:49-57)、ネイセリア・ゴナホエアのｆｂｐプロモーター(Forng et al., (1997) J. Bacteriol. 179:3047-3052)、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素遺伝子プロモーター(Schmitt and Holmes (1994) J. Bacteriol. 176(4):1141-9)、Ａ群ストレプトコッカス属(Streptococci)由来のｈａｓＡプロモーター(Alberti et al., (1998) Mol Microbiol 28(2):343-53)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)のｒｐｏＳプロモーター(Kojic and Venturi (2001) J. Bacteriol. 183:3712-3720)、およびｐＬＵＥＸ５ＢＡにおけるＩＰＴＧ誘導プロモーター(Krause et al., J. Mol. Biol. 274:365 (1997)に作動可能に連結され得る。スタフィロコッカス・アウレウスで有用であり得る別の実施形態では、プロモーターは、スタフィロコッカス・アウレウスのｘｙｌＡプロモーター由来のｘｙｌＯオペレータに融合させた改変Ｔ５プロモーターを含む、新規誘導プロモーター系であるＸｙｌＴ５である。このプロモーターは、米国特許出願第１０／０３２，３９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。別の実施形態では、プロモーターは、ｌａｃＯ２成分誘導プロモーター系であってもよく、ここではＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が染色体上に組み込まれ、かつｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節され（Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111:35-41、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７ 遺伝子１０プロモーターがｌａｃＯオペレータと融合される。他の実施形態では、プロモーターは、米国特許出願第１０／０３２，３９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される、Ｅ．フェカリスにおいて機能的なキシロース誘導プロモーターを保有する、プラスミドｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４由来のプロモーターであってもよい。使用してもよい他のプロモーターは、当業者が精通しているものである。真菌では、遺伝子産物をコードする遺伝子は、ＣａＡＣＴ１プロモーター（Morschhauser, Mol. Gen. Genet. 257:412-420 (1998)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるテトラサイクリン調節可能なプロモーター、または２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるプロモーター、あるいは当業者が精通している他のプロモーターに作動可能に連結され得る。生物およびプロモーターの他の組合せも本発明で使用され得ることが理解されよう。
【０１９９】
幾つかの実施形態では、過剰発現は、増殖に必要とされる遺伝子の発現を駆動する天然プロモーターを、調節可能なプロモーターで置き換えるための相同組換えを用いることで達成され得る。例えば、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法は、調節可能なプロモーターの制御下に増殖に必要とされる遺伝子を配置させるのに使用され得る。２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／８１５，２４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／４９２，７０９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７１１，１６４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／７４１，６６９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）は、本発明の方法のいずれかで使用され得る増殖に必要とされる遺伝子および遺伝子産物を開示している。
【０２００】
簡潔に言えば、これらの方法の幾つかの実施形態では、細胞は、細菌細胞のような一倍体細胞であってもよい。天然プロモーターに対して相同性を有するヌクレオチド配列が隣接した調節可能なプロモーターを含む線状プロモーター置き換えカセットは細胞に導入される。幾つかの実施形態では、このカセットはまた、選択マーカーまたは発現が容易に特定されるマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。カセットは、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、二本鎖核酸または一本鎖核酸であってもよい。相同組換え時に、天然プロモーターは調節可能なプロモーターと置き換えられ、増殖に必要とされる遺伝子は調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。増殖に必要とされる遺伝子が、調節可能なプロモーターの制御下にある株を、調節可能なプロモーターが野生型細胞におけるレベル以上の増殖に必要な遺伝子産物レベルを提供する条件下で成長させる。例えば、株は、調節可能なプロモーターから発現を誘導する誘導物質の存在下で、あるいは調節可能なプロモーターに対するレプレッサの作用を減少または排除する条件下で成長させてもよい。
【０２０１】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の自然プロモーターそれぞれを、単一の所望の置き換えプロモーターで置き換えるのではなく、過剰発現または過小発現されるべき遺伝子産物に関して所望の発現レベルを提供する複数の置き換えプロモーターが使用される。この方法は、単一の置き換えプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的な単一標識プライマーを使用するのではなく、複数の置き換えプロモーター中の適切なヌクレオチド配列に相補的な複数の標識プライマーを使用する以外は上記に記載するように実施される。
【０２０２】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物のレベルまたは活性が、かかる遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸を転写することで低減される実施形態では、アンチセンス核酸をコードするヌクレオチド配列の長さが各遺伝子に関して異なるように株を設計してもよい。増幅反応は、その結果各遺伝子に相当する増幅産物が、特有の長さ、または同じ長さの他の増幅産物と識別され得る色素を有するように、アンチセンス核酸をコードする遺伝子の各末端にあるプライマーを用いて上述のように実施される。あるいは、アンチセンス核酸をコードするヌクレオチド配列の長さは、各遺伝子に関して特有でない場合があるが、増幅反応に使用されるプライマーは、各遺伝子に相当する増幅産物の長さが特有であるように選択され得る。
【０２０３】
別の実施形態では、自然プロモーターを、株の培養物または収集物中の株において、他の組換えプロモーターに存在するヌクレオチド配列と異なる特有のヌクレオチド配列を内部にまたは隣接して含むプロモーターで置き換えてもよい。この実施形態では、各プロモーターは、株の培養物または収集物においてより迅速にあるいはよりゆっくりと増殖する株を特定するのに使用され得る特有の「タグ」を、該プロモーターに隣接して含むか、または有する。タグは、上述の各増殖に必要な遺伝子に関して特有の大きさを有する増幅産物を生成する増幅方法を含む、ハイブリダイゼーションベースの方法または増幅ベースの方法を用いて検出され得る。
【０２０４】
あるいは、増幅に必要とされる遺伝子の転写を誘導する自然プロモーターを、調節要素がプロモーターからの転写レベルを調節するように、相同組換えにより細胞の染色体に調節要素を挿入することで調節可能とさせてもよい。調節要素は、レプレッサ（例えば、ｌａｃ、ｔｅｔ、ａｒａＢＡＤレプレッサ）により認識されるオペレータ、または転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列であってもよい。幾つかの実施形態では、調節要素は、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、または上流活性化配列であってもよい。自然プロモーターに対して相同性を有するヌクレオチド配列が隣接した調節要素を含む線状調節要素挿入カセットを細胞に導入してもよい。幾つかの実施形態では、このカセットはまた、選択マーカーまたは発現が容易に特定されるマーカーをコードするヌクレオチド配列を含む。カセットは、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように、二本鎖核酸または一本鎖核酸であってもよい。相同組換え時に、調節要素は染色体に導入され、増殖に必要とされる遺伝子は調節要素の制御下に置かれる。増殖に必要とされる遺伝子が調節要素の制御下にある株を、調節可能なプロモーターが野生型細胞におけるレベル以上の増殖に必要な遺伝子産物レベルを提供する条件下で成長させる。例えば、株は、プロモーターから発現を誘導する誘導物質の存在下で、あるいはプロモーターに対するレプレッサの作用を減少または排除する条件下で成長させてもよい。各増殖に必要な遺伝子に関して特有の大きさを有する増幅産物を生成する増幅方法を用いて、株の培養物または収集物において過剰表現（overrepresent）または過小表現（underrepresent）される株を検出してもよいことは理解されよう。例えば、望ましい場合、調節要素内のヌクレオチド配列に相補的なプライマーを増幅反応に使用してもよい。
【０２０５】
プロモーター置き換えカセットまたは調節要素挿入カセットは、ＰＣＲまたは他の増幅方法により生成されるアンプリコンのような二本鎖核酸、またはオリゴヌクレオチドのような一本鎖核酸であってもよい。例えば、一本鎖核酸は、Ellis et al., PNAS 98:6742-6746, 2001（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて染色体に導入され得る。
【０２０６】
幾つかの実施形態では、プロモーター置き換えカセットまたは調節要素挿入カセットが導入される細胞は、増大した組換え頻度を有する。例えば、細胞は、染色体に挿入されるＤＮＡを通常分解する１つまたは複数のエキソヌクレアーゼを欠如し得るか、またはそのレベルまたは活性が低減され得る。さらなる実施形態では、細胞は、エキソヌクレアーゼを欠如し得るか、またはそのレベルが低減され得て、かつ相同組換えの媒介に関与するタンパク質を発現または過剰発現する。例えば、上記方法がエシェリヒア・コリまたは他の腸内原核生物で実施される場合、直鎖状核酸を分解するＲｅｃＢＣＤ組換え経路のエキソヌクレアーゼＶの活性が低減または排除された細胞（例えば、ｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、またはｒｅｃＤ突然変異体）を使用してもよい。幾つかの実施形態では、細胞は、相同組換えの頻度を高める１つより多いｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、およびｒｅｃＤ遺伝子における突然変異を有する。例えば、細胞は、ｒｅｃＢおよびｒｅｃＣ遺伝子の両方に突然変異を有し得る。
【０２０７】
プロモーター置き換えまたは調節要素挿入方法はまた、ｓｂｃＡ突然変異を保有する細胞のような、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥＴレコンビナーゼ系の活性が活性化されたエシェリヒア・コリ細胞で実施されてもよい。ｒａｃプロファージのＲｅｃＥ遺伝子がＥｘｏＶＩＩＩ ５’−３’エキソヌクレアーゼをコードする一方で、ＲａｃプロファージのＲｅｃＴ遺伝子は、再生およびＤ−ループ形成を促進する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質をコードする。したがって、ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴの遺伝子産物または類似の機能を有するタンパク質は、相同組換えを促進する。ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ遺伝子は同じオペロンに存在するが、通常発現されない。しかしながら、ｓｂｃＡ突然変異体は、ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ遺伝子の発現を活性化する。幾つかの実施形態では、上記方法は、ｒｅｃＢおよびｒｅｃＣ遺伝子における突然変異ならびにｓｂｃＡ突然変異を保有する細胞で実施されてもよい。ＲｅｃＥおよびＲｅｃＴ遺伝子は構成的または条件的に発現され得る。例えば、上記方法は、ｓｂｃＡ２３、ｒｅｃＢ２１、およびｒｅｃＣ２２突然変異を保有するエシェリヒア・コリ株ＪＣ８６７９で実施されてもよい。
【０２０８】
幾つかの実施形態では、上記方法は、ｓｂｃＢ突然変異を保有する細胞のような、ＲｅｃＦ経路を介した組換えが増強されたエシェリヒア・コリ細胞で実施されてもよい。
【０２０９】
ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ遺伝子産物、または類似の機能を有するタンパク質は、エシェリヒア・コリ以外の原核生物で条件的または構成的に発現され得ることが理解されよう。幾つかの実施形態では、これらのタンパク質は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスにおいて条件的にあるいは構成的に発現され得る。例えば、これらの遺伝子産物をコードするプラスミドを生物に導入してもよい。望ましい場合、これらの遺伝子産物をコードするコード配列は、これらの遺伝子産物が発現される生物のコドン選択を反映するように最適化され得る。同様に、幾つかの実施形態では、生物は、相同組換えの頻度を高めるｒｅｃＢ、ｒｅｃＣ、ｒｅｃＤ、ｓｂｃＡ、またはｓｂｃＢ突然変異に類似した突然変異を含有してもよい。
【０２１０】
さらなる実施形態では、プロモーター置き換えまたは調節要素挿入方法は、バクテリオファージラムダ（λ）のＲｅｄ系、または相同組換えの頻度を高めるための他のファージ由来の類似の系を利用する細胞で行ってもよい。Ｒｅｄ系は、３つの遺伝子、すなわちγ、β、およびｅｘｏ（これらの産物は、Ｇａｍ、Ｂｅｔ、およびＥｘｏタンパク質である）を含有する（Ellis et al. PNAS 98:6742-6746, 2001、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。Ｇａｍタンパク質は、ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼＶを阻害し、したがってＢｅｔａおよびＥｘｏが、組み込まれるＤＮＡの末端に接近することが可能となり、相同組換えを促進する。Ｂｅｔａタンパク質は、相補的一本鎖核酸への一本鎖核酸のアニーリングを促進し、かつ鎖交換を媒介する一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。Ｅｘｏタンパク質は、組換えの基質として作用することができる３’オーバーハングを残す二本鎖ＤＮＡ依存性５’−３’エキソヌクレアーゼである。したがって、λｒｅｄタンパク質または類似の機能を有するタンパク質の構成的または条件的発現は相同組換えを促進する。
【０２１１】
λ Ｂｅｔａ、ＧａｍおよびＥｘｏタンパク質、または類似の機能を有するタンパク質は、エシェリヒア・コリ以外の原核生物で構成的または条件的に発現され得ることが理解されよう。幾つかの実施形態では、これらのタンパク質は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスにおいて条件的または構成的に発現され得る。例えば、これらの遺伝子産物をコードするプラスミドを生物に導入してもよい。望ましい場合、これらの遺伝子産物をコードするコード配列は、これらの遺伝子産物が発現される生物のコドン選択を反映するように最適化され得る。
【０２１２】
幾つかの実施形態では、細胞は、１つより多い上述の特性の結果として、相同組換えの増加した頻度を有し得る。幾つかの実施形態では、増大した組換え頻度は、細胞を成長させる培養条件に依存する細胞の条件特性であってもよい。例えば、幾つかの実施形態では、λ Ｒｅｄ Ｇａｍ、Ｅｘｏ、およびＢｅｔａタンパク質、またはｒｅｃＥおよびｒｅｃＴタンパク質の発現は調節され得る。したがって、細胞は、上述の特性の任意の組合せの結果として、相同組換えの増加した頻度を有し得る。例えば、幾つかの実施形態では、細胞は、ｓｂｃＡおよびｒｅｃＢＣ突然変異を保有してもよい。
【０２１３】
幾つかの実施形態では、生物の染色体に挿入されるべき直鎖状二本鎖ＤＮＡは、上述するように、ｒｅｃＥおよびｒｅｃＴ、またはλ Ｂｅｔａ、ＧａｍおよびＥｘｏタンパク質、あるいは類似の機能を有するタンパク質を構成的または条件的に発現する生物に導入される。幾つかの実施形態では、生物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスであり得る。幾つかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、ｒｅｃＢＣおよびｓｂｃＡ突然変異または類似の突然変異を有する生物に導入されてもよい。
【０２１４】
他の実施形態では、生物の染色体に挿入されるべき一本鎖ＤＮＡは、λ Ｂｅｔａタンパク質、または類似の機能を有するタンパク質を発現する生物に導入される。幾つかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、λ Ｂｅｔａタンパク質およびＧａｍタンパク質の両方、または類似の機能を有するタンパク質を発現する生物に導入される。さらなる実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、λ Ｂｅｔａ、ＧａｍおよびＥｘｏタンパク質、または類似の機能を有するタンパク質を発現する生物に導入される。λタンパク質または類似のタンパク質は、構成的または条件的に発現され得る。幾つかの実施形態では、生物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスであり得る。
【０２１５】
幾つかの実施形態では、直鎖状核酸は、相同組換えの増大した頻度を有する第１の生物の染色体に挿入され、続いて本方法を直接適用しにくい第２の生物に移入されてもよい。例えば、直鎖状核酸をエシェリヒア・コリの染色体に挿入し、続いて接合または形質導入により第２の生物に移入してもよい。第２の生物に導入した後、核酸は、相同組換えにより第２の生物の染色体に導入され、それにより第１の生物の染色体から、第２の生物の染色体において相当する位置へ、調節要素を効率的に移入する。
【０２１６】
他の実施形態では、細胞は真菌細胞のような二倍体細胞であってもよい。幾つかの実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子のコピーの１つを崩壊させてもよく、この遺伝子を不活性にする。さらなる実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子のコピーの１つを崩壊させてもよく、また増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の他のコピーを調節可能なプロモーターの制御下に置いてもよい。かかる株は、それぞれの側に崩壊されるべき標的配列に相同的な核酸が隣接した発現可能な優性選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む崩壊カセットを用いて、相同組換えにより増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の第１のコピーを崩壊することで生成され得る。増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子の第２のコピーは、それぞれの側に増殖に必要な遺伝子用の天然プロモーターに相同的な核酸が隣接した調節可能なプロモーターを含むプロモーター組換えカセットを用いて、相同組換えにより調節可能なプロモーターの制御下に置かれ得る。プロモーター組換えカセットはまた、調節可能なプロモーターの５’に位置するが、天然プロモーターに相同的な核酸との間にある選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０２１７】
他の実施形態では、過剰発現は、ベクターにおいて所望のプロモーターに、増殖に必要とされる遺伝子を作動可能に連結することにより達成され得る。ベクターは、染色体外で複製するベクター、または染色体に組み込まれるベクターであってもよい。例えば、ベクターが細菌細胞で使用される場合、ベクターはｐＢＲ３２２ベースのベクターまたはＰ１もしくはλのようなバクテリオファージベースのベクターであってもよい。ベクターがサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)で使用される場合、ベクターは、２ミクロンサークルに基づいたベクター、または酵母染色体の複製起点を組み込んだベクターであってもよい。ベクターが哺乳類細胞で使用される場合、ベクターは、レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ベースのベクター、ウシパピローマウイルスに基づいたベクター、アデノウイルスに基づいたベクター、またはアデノ随伴ウイルスに基づいたベクターであってもよい。ベクターがカンジダ・アルビカンスで使用される場合、ベクターは、ＣａＰＣＫ１、ＭＥＴ２５、ＭＡＬ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、１０、ＳＴＥ２、またはＳＴＥ３プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含むベクターであってもよい。幾つかの実施形態では、以下の刊行物（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるベクターを使用してもよい：ＣＩｐ１０（カンジダ・アルビカンス用の効率的かつ利便性の高い組み込みベクター）(Murad et al., Yeast 16(4):325-7 (2000)；形質転換用ベクターｐＣＰＷ７(Kvaal et al., : Infect Immun 67(12):6652-62 (1999)；形質転換用ベクターｐＣＷＯＰ１６(Kvaal et al., : Infect Immun 65(11):4668-75 (1997)；株ＣＡ９のヒスチジン栄養要求性の補完によりＣａで直接クローニングするのに使用されるべき二重ＡＲＳベクターであるｐＲＭ１(Pla et al., Gene 165(1):115-20 (1995)；カンジダ・アルビカンスの形質転換用に開発されたものであり、ＡＤＥ２遺伝子マーカーおよび自己複製を促進するカンジダ属自己複製配列（ＣＡＲＳ）要素を保有するｐＭＫ１６（Sanglard and Fiechter Yeast 8 (12):1065-75 (1992)；エシェリヒア・コリ、サッカロミセス・セレビシエおよびカンジダ・アルビカンスで自己複製するプラスミドベクター（ｐＲＣ２３１２で示す）が構築された（このプラスミドは、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、およびカンジダ・アルビカンス由来の自己複製配列（ＡＲＳ）を含有する）(Cannon et al., Mol Gen Genet 235 (2-3):453-7 (1992)；対象の遺伝子がＣａＭＡＬ２マルターゼプロモーターの制御下に存在することができ、かつＣａＲＰ１０遺伝子座に安定に組み込まれ得る、カンジダ・アルビカンスで使用するための発現ベクター（ＣＩｐ１０−ＭＬＡ２ｐ）が構築された(Backen et al., Yeast 16 (12) 1121-9 (2000))；（Volker, R. S., A. Sonneborn, C.E. Leuker, and J.F. Ernst. 1997. Efg1p、ヒト病原体カンジダ・アルビカンスの形態形成の必須調節因子は真菌で形態形成プロセスを調節するｂＨＬＨタンパク質の保存種類の成員である(EMBO 16:1982-1991)、およびカンジダ・アルビカンスＵＲＡ３遺伝子、カンジダ属ＡＲＳ配列、および複製起点を含有するサッカロミセス・セレビシエ２ミクロンサークルの一部を含有するカンジダ・アルビカンス形質転換ベクターが構築された(Goshorn et al., Infect Immun 60(3):876-84 (1992)）。上述の生物または本発明が実施される任意の他の生物で使用するのに適した様々な他のベクターは当業者に精通している。
【０２１８】
遺伝子産物の過小発現は様々な方法で得られ得る。例えば、一実施形態では、遺伝子産物の過小発現は、細胞内の遺伝子産物のレベルまたは活性を低減する作用物質を提供することで達成され得る。一実施形態では、作用物質は、遺伝子産物をコードする核酸に相補的であるか、または遺伝子産物をコードする核酸の一部に相補的であるアンチセンス核酸を含み得る。例えば、アンチセンス核酸をコードする核酸は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結させてもよい。転写の誘導物質または転写の抑制を緩和する作用物質を含有する培地のような適切な条件下で成長させると、アンチセンス核酸が細胞で発現され、それにより細胞内の遺伝子産物のレベルまたは活性が低減される。幾つかの実施形態では、転写の誘導物質または転写の抑制を緩和する作用物質の濃度は、最適な結果を提供するように変更させてもよい。かかる方法は、米国特許出願第０９／８１５，２４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／４９２，７０９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７１１，１６４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７４１，６６９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、または２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。前文中に引用した特許出願はそれぞれ、本発明の方法のいずれかで使用され得る増殖に必要とされる遺伝子および遺伝子産物を開示している。
【０２１９】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物の過小発現は、遺伝子産物が過剰発現される方法に関して上述した方法のような方法を用いて遺伝子産物の発現が構成的または調節可能なプロモーターの制御下にある株を構築することにより達成され得る。遺伝子産物を過小発現する細胞を提供するために、遺伝子産物の発現が野生型細胞のレベル未満のレベルで発現される条件下で細胞を成長させる。例えば、レプレッサが調節可能なプロモーターからの転写のレベルを減少させる条件下で細胞を成長させてもよい。
【０２２０】
他の実施形態では、過小発現は、増殖に必要とされる遺伝子産物が過剰発現される実施形態に関して上述したように、ベクターにおいて所望のプロモーターに、増殖に必要とされる遺伝子を作動可能に連結させることにより達成され得る。幾つかの実施形態では、ベクターは、遺伝子の染色体コピー（単数または複数）を崩壊させた細胞中に存在してもよい。
【０２２１】
増殖に必要とされる遺伝子産物は、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／８１５，２４２号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／４９２，７０９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、米国特許出願第０９／７１１，１６４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／７４１，６６９号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を含む様々な方法を用いて特定され得る。前文に列挙した出願に開示される増殖に必要な遺伝子および遺伝子産物はそれぞれ本発明の方法のいずれかに使用され得る。簡潔に述べると、一実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物は、ベクターにおいて調節可能なプロモーターに、ランダムゲノム断片を作動可能に連結することにより特定される。ランダムゲノム断片は、制限酵素による部分的消化、超音波処理および噴霧(nebulization)のような技法を用いた機械的せん断、またはＤＮアーゼＩ消化により生成され得る。適切な作用物質を用いてプロモーターからの転写を誘導すると、発現ベクターは、挿入ゲノム断片に相当するＲＮＡ分子を産生する。挿入ゲノム断片がプロモーターに関してアンチセンス方向にある場合では、産生される転写物は遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、その結果転写物は様々な遺伝子から産生されるセンスｍＲＮＡと相互作用し、それによりセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率またはレベルを減少させ、したがってこれらのセンスｍＲＮＡ分子によりコードされるタンパク質の産生を減少させる。センスｍＲＮＡが増殖に必要とされるタンパク質をコードする場合では、誘導性条件下で成長させた細胞は、成長することができないか、または実質的に減少した速度で成長する。さらに、産生される転写物が非翻訳ＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、非翻訳ＲＮＡが増殖に必要とされる場合では、誘導性条件下で成長させた細胞はまた、成長することができないか、または実質的に減少した速度で成長する。対照的に、非誘導性条件下で成長させた細胞は正常な速度で成長する。続いて、アンチセンス核酸が相補的である遺伝子が特定され、本発明の方法で利用される。
【０２２２】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子は、上述のように、増殖に必要な遺伝子用の天然プロモーターを、調節可能なプロモーターで置き換えることにより特定され得る。プロモーターが活性であるか、または抑制されていない条件下でのかかる株の成長を、プロモーターが不活性であるか、または抑制されている条件下での成長と比較する。株が、プロモーターが不活性であるか、または抑制されている条件下では成長することができないか、または実質的に減少した速度で成長するが、プロモーターが活性であるか、または抑制されていない条件下で正常に成長する場合、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される遺伝子は、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする。例えば、プロモーター置き換えを用いて特定される増殖に必要な遺伝子および遺伝子産物は、米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。前文に列挙した出願に記載される遺伝子および遺伝子産物はそれぞれ、本発明の方法のいずれかで使用され得る。
【０２２３】
本発明は、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法を包含する。この方法は、生物の株の混合物を含む培養物を使用する。培養物中の株の少なくとも幾つかは、生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する。好ましくは、培養物中の株のそれぞれが、生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する（すなわち、培養物中の株はすべて、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する）。かかる株は、上述の方法を用いて得られ得る。培養物は、任意数の株を含んでもよい。例えば、培養物は、少なくとも２個の株、少なくとも１０個の株、少なくとも２０個の株、少なくとも３０個の株、少なくとも５０個の株、少なくとも１００個の株、少なくとも３００個の株、または３００個より多い株を含んでもよい。幾つかの実施形態では、培養物は、概して生物の増殖に必要とされる遺伝子産物のすべてまたはほとんどを過剰発現する株を含んでもよい。
【０２２４】
培養物を、生物の増殖を阻害する化合物と接触させる。化合物は、任意の供給源から得られる候補薬剤化合物であってもよい。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物、天然産物ライブラリーからの化合物、または不純なもしくは不完全な精製化合物（例えば、不完全に精製した天然抽出物中の化合物）であってもよい。培養物を、化合物が作用する遺伝子産物を過剰発現しない培養物中の生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の化合物と接触させて、その結果、化合物が作用する上記遺伝子産物を過剰発現する株は、上記化合物が作用する上記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に培養物中で増殖する。したがって、十分な期間後に、化合物が作用する遺伝子産物を過剰発現する株は、化合物が作用する遺伝子産物を過剰発現しない株よりも培養物中で優勢である。好ましい実施形態では、成長条件およびインキュベーション期間は、唯一の株、すなわち化合物の標的を過剰発現する株が培養物から回収されるように選択される。したがって、一実施形態では、それぞれが種々の増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する複数の株を含有する複数の培養物を、様々な濃度の化合物の存在下で成長させてもよい。化合物濃度を変更させるほかに、増殖に必要な遺伝子産物の発現が調節可能なプロモーターの制御下にある実施形態では、複数の培養物を、プロモーターからの転写に対するレプレッサの影響を低減する誘導物質または作用物質のような、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の様々な濃度で成長させてもよい。培養物は、その標的が特定される化合物の存在下で（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の存在下で）液体培地中で成長させてもよく、あるいは増殖に必要な遺伝子発現を過剰発現する株を含む液体培養物は、その標的が特定される化合物の非存在下で成長させた後、化合物を含有する（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質も含有する）固体培地上に導入してもよいことが理解されよう。
【０２２５】
化合物の標的である過剰発現される遺伝子産物の特定は、様々な方法を用いてなされ得る。例えば、幾つかの実施形態では、化合物と接触させた株の培養物または収集物中に存在する核酸を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物中に存在する核酸と比較して、株の対照培養物または収集物に対して、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物において過剰表現される核酸を特定してもよい。あるいは、幾つかの実施形態では、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物中の存在する核酸を分析して、株の対照培養物または収集物と比較することなく、存在する核酸を特定してもよい。
【０２２６】
本発明の幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物においてより迅速に増殖した株、すなわち株の培養物または収集物における他の株に対して、試験化合物の存在下で増殖する能力が高い株は以下のように特定される。過剰発現される遺伝子それぞれと相関し、互いに識別可能な増幅産物は、試験化合物の存在下で成長させた培養物または収集物から得られる。増幅産物は、特定の増幅産物が株の培養物または収集物において過剰表現されるかどうかを決定するために、互いに識別される。幾つかの実施形態では、遺伝子産物それぞれに相当する増幅産物は、増幅産物が互いに識別され得る長さを有する。別の実施形態では、１つまたは複数の増幅産物は、類似のまたは同一の長さを有するが、増幅産物に結合された色素のような検出可能な作用物質に基づいて互いに識別可能である。幾つかの実施形態では、過剰表現される増幅産物は、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物からの増幅産物を、試験化合物と接触させなかった株の培養物または収集物からの増幅産物と比較することにより特定される。あるいは、過剰表現される増幅産物は、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる増幅産物を単に特定することにより特定されてもよい（例えば、たった１つの株または数個の株が試験化合物の存在下で増殖され得る）。識別可能な増幅産物を生成する上記方法は、試験化合物の存在下でより迅速にまたはよりゆっくりと増殖する株の特定を容易とするために、本明細書中に記載の増幅に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する株を生成する方法のいずれかと併用してもよい。
【０２２７】
例えば、本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの自然プロモーターそれぞれを、単一の所望の置き換えプロモーターで置き換えてもよい。プロモーターが置き換えられた株を含有する株の培養物または収集物を試験化合物の存在下で所望の期間成長させた後、増幅反応は、以下の通りに培養物から得られる核酸で実施される。
【０２２８】
株の培養物または収集物からの核酸を、望ましい場合に少なくとも２分割量に分割してもよい。好ましい実施形態では、株の培養物または収集物からの核酸は、４分割量に分割される。置換えプロモーター内の、増殖に必要な遺伝子内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接した核酸配列内のヌクレオチド配列に相補的な単一プライマーは、少なくとも２つの部分（核酸の各分割量に対して１つの部分）に分割される。プライマーの各部分は、別個の検出可能な色素、例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な６ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ（商標）、およびＰＥＴ（商標）色素で標識される。例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能なＤＳ−３１またはＤＳ−３３色素の組を用いて、プライマーを標識してもよい。あるいは、Amersham Biosciencesから入手可能なＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ、ＪＯＥ、ＴＭＲ、およびＴＥＴ（商標）色素を使用してもよい。したがって、培養物からの核酸が分割量に分割される場合、単一色素で標識した単一プライマーを使用してもよい。培養物からの核酸が分割量に分割される場合、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、または４個より多い、識別可能な色素で標識されたプライマーを使用してもよい。標識プライマーの部分それぞれは、株の培養物または収集物からの核酸の分割量のそれぞれに添加され、その結果核酸の各分割量は、プライマー上に単一の検出可能な色素を有する単一標識プライマーを受け取る。幾つかの実施形態では、プライマーは、３つの部分、４つの部分、または４つより多い部分に分割され、各部分は、その部分上に、他の部分上の色素と識別可能な色素を有する。
【０２２９】
核酸の分割量それぞれはまた、プロモーター内の、置き換えプロモーターの制御下に置かれた増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の１つに特有なヌクレオチド配列内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的である非標識プライマーそれぞれを有する非標識プライマー組を受け取る。分割量はそれぞれ、置き換えプロモーターの制御下に置かれた１／Ｎ増殖に必要な遺伝子に特有なプライマー（ここでＮは分割量の数である）を受け取る（すなわち、株の培養物または収集物が、増殖に必要とされる遺伝子が置き換えプロモーターの制御下に置かれ、４分割量に分割される１００個の株から構成された場合、株の培養物または収集物からの核酸の４分割量それぞれは、２５個の遺伝子に相補的なプライマーを受け取る）。非標識プライマーは、それぞれが、他の非標識プライマーにより産生される増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように選択される。好ましくは、増幅産物は、約１００〜約４００ヌクレオチド長であるが、互いに識別され得る任意の長さを使用してもよい。さらに、実施形態の幾つかでは、増幅産物の幾つかは同一のまたは非常に類似した長さを有し得るが、識別可能な色素による標識におり、互いに識別可能であり得る。
【０２３０】
核酸増幅反応は、核酸分割量それぞれで行われる。次に、増幅産物を長さで分離して、株の培養物または収集物において表現が増加した増幅産物（すなわち、株の培養物または収集物においてより迅速に増殖した細胞に由来する増幅産物）を特定する。次に、増幅産物を相当する遺伝子と相関させて、どの株が株の培養物または収集物においてより迅速に増殖したかを決定する。望ましい場合、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる増幅産物を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物から得られる増幅産物と比較することにより、培養物において表現が増加した増幅産物を特定してもよい。あるいは、望ましい場合、化合物と接触させなかった対照培養物と比較することなく、化合物と接触させた培養物から得られる増幅産物を直接特定してもよい。
【０２３１】
例えば、幾つかの実施形態では、核酸アリコットそれぞれからの増幅産物をプールし、キャピラリー電気泳動にかける。増幅産物は、増幅産物に結合された蛍光色素を検出することで検出され、それらの長さを決定して、株の培養物または収集物において表現が増加または減少した増幅産物を特定する。図１Ａおよび図１Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施された増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。この方法はまた、試験化合物が相当する遺伝子に作用したために、増殖に必要とされる遺伝子を過剰発現する株の培養物または収集物で実施される増幅反応で過剰表現される増幅産物を特定するのにも使用され得ることは理解されよう。
【０２３２】
あるいは、別の実施形態では、第１の増幅反応は、過剰発現される遺伝子のすべての上流または下流に存在するヌクレオチド配列に相補的な第１のプライマー（例えば、過剰発現される遺伝子すべての上流にある置き換えプロモーター中のヌクレオチド配列の相補的なプライマー）、および株それぞれに特有なヌクレオチド配列に相補的なプライマー（例えば、増殖に必要な遺伝子それぞれ内のヌクレオチド配列に相補的なプライマー）組を用いて、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる核酸で実施される。増殖に必要な遺伝子ぞれぞれのための２つの増幅プライマーのうちの１つは、上述のように色素で標識される。好ましくは、過剰発現される遺伝子すべての上流または下流のヌクレオチド配列に相補的な共通プライマーが色素で標識される。増幅反応で使用されるプライマーは、増殖に必要な遺伝子それぞれに相当する増幅産物が、特有の長さ、または同じ長さの他の増幅産物と識別することが可能な色素を有するように設計される。第２の増幅反応は、第１の増幅反応の場合と同じプライマーを用いて、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物で行われる。第１の増幅反応からの増幅産物を第２の増幅反応からの増幅産物と比較して、株の培養物または収集物で過剰表現される１つまたは複数の増幅産物を特定する。例えば、第１の増幅反応からの増幅産物は、第２の増幅反応からの増幅産物とは別個のポリアクリルアミドゲルのレーン、またはそれと別個のキャピラリーに流してもよく、２つのレーンまたはキャピラリーを互いに比較する。望ましい場合、第１の増幅反応からの増幅産物が第２の増幅反応からの増幅産物と異なるレーンまたはキャピラリーに流される実施形態では、同じ色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。あるいは、望ましい場合、異なる色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。望ましい場合、第１の増幅反応からの増幅産物が第２の増幅反応からの増幅産物と異なるレーンまたはキャピラリーに流される実施形態では、同じ色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。あるいは、望ましい場合、異なる色素を用いて、第１の増幅反応および第２の増幅反応におけるプライマーを標識してもよい。
【０２３３】
あるいは、幾つかの実施形態では、第２の増幅反応におけるプライマーは、第１の増幅反応で使用される色素と識別可能である異なる色素で標識される。この実施形態では、増幅反応物をプールして、ポリアクリルアミドゲル上の同じレーンまたは同じキャピラリーに流してもよく、各増幅反応からの産物は、各増幅産物に関して存在する各色素の量を比較することにより比較される。図２Ａおよび図２Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは化合物と接触させた増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施される増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。この方法はまた、試験化合物が相当する遺伝子に作用したために、増殖に必要とされる遺伝子を過剰発現する株の培養物または収集物で実施される増幅反応で過剰表現される増幅産物を特定するのにも使用され得ることは理解されよう。
【０２３４】
望ましい場合、培養物をアリコットに分割するのではなく、個々の増幅反応は、株の培養物または収集物から得られる核酸で実施されてもよい。各増幅反応は、増殖に必要な遺伝子のたった１つに特異的な増幅産物を生じるプライマーを含有する。個々の増幅反応それぞれから生じた増幅産物はプールされ、培養物において表現が増加した増幅産物は、上述のように特定される。
【０２３５】
別の実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物が、これらの遺伝子産物をコードする遺伝子の自然プロモーターを置き換えた調節可能なプロモーターから過剰発現される株の培養物または収集物は、所望数の世代で試験化合物の存在下で成長させることが可能となる。好ましくは、株の培養物または収集物は、少なくとも２０世代で試験化合物の存在下で成長させることが可能となる。核酸が株の培養物または収集物から単離され、置き換えプロモーター（複数可）またはその５'末端に隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的であるプライマー、および増幅に必要な遺伝子またはそれに隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的であるプライマーを用いて増幅反応が実施される。生じた増幅産物（複数可）は、置き換えプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的なプライマーを用いて直接配列決定される。
【０２３６】
本発明の一実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターは、プラスミド調製技法のような方法を用いて、培養物においてより迅速に増殖した株から得られる。続いて、核酸配列決定技法を用いて、過剰発現された遺伝子のヌクレオチド配列を決定する。
【０２３７】
あるいは、化合物の標的である過剰発現される遺伝子産物の独自性は、過剰発現された遺伝子のヌクレオチド配列を特定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような核酸増幅反応を実施することにより決定されてもよい。例えば、培養物から回収される株からの核酸調製物（例えば、精製プラスミド）のアリコットをそれぞれ、種々の増殖に必要な遺伝子を増幅するＰＣＲプライマー対と接触させて、どのプライマー対が増幅産物を生じるかを決定してもよい。
【０２３８】
化合物の標的である遺伝子産物の独自性を決定するさらに別の方法は、培養物中の株において過剰発現された増殖に必要な遺伝子それぞれを含有するＤＮＡチップのような核酸アレイを得ることを包含する。各増殖に必要な遺伝子は、アレイ中の既知の位置を占める。回収された株からの核酸調製物（例えば、プラスミド調製物）は、放射性部分または蛍光部分のような検出可能な作用物質で標識され、標識核酸がアレイ上の相補的核酸にハイブリダイズするのを可能にする条件下で核酸アレイと接触させて配置される。標識核酸がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定して、回収された株で過剰発現された遺伝子を特定する。望ましい場合、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を、化合物と接触させなかった対象培養物からのハイブリダイズした核酸と比較してもよい。あるいは、対照培養物からの核酸と比較することなく、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を直接特定してもよい。
【０２３９】
本発明の幾つかの実施形態では、複数の株が、化合物の存在下でより迅速に増殖し得る。このことは、様々な原因に起因し得る。例えば、化合物の濃度は、１つの遺伝子産物（すなわち、標的遺伝子産物）を過剰発現する細胞にのみ増殖が制限されるのに十分高くない場合がある。標的遺伝子産物を過剰発現する株は培養物において最も優勢な株であると同時に、他の株も増殖する場合がある。かかる場合では、培養物において最も優勢である株における遺伝子産物の独自性は、培養物中の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子それぞれのレベルを定量化することにより特定され得る。これは、定量的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、または上述のアレイ技術を用いて実現され得る。
【０２４０】
他の場合では、多数の株が、共通の機能属性の結果として培養物においてより迅速な増殖を示す。例えば、より迅速に増殖する株はそれぞれ、例えばセリンプロテアーゼ活性のような共通の酵素活性を有する遺伝子産物を過剰発現し得る。あるいは、より迅速に増殖する株はそれぞれ、ｃＡＭＰ結合ドメインのような共通の機能ドメインを有する遺伝子産物を過剰発現し得る。かかる場合では、より迅速に増殖する株の共通属性は、化合物の作用様式または化合物の標的の生化学活性に関する情報を提供し得る。例えば、より迅速に増殖した株において過剰発現される遺伝子のすべてがセリンプロテアーゼである場合、化合物はセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより作用し、標的タンパク質はセリンプロテアーゼである。望ましい場合、化合物は誘導体化されてもよく、より迅速に増殖した株それぞれに対する誘導体化された化合物の有効性は、共通活性または結合部位を共有する広範囲の標的と相互作用することが可能な誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、全ての株の増殖を阻害する能力が大きな誘導体）を特定するために、あるいは所望の標的に対してより大きな特異性を有する誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、株の１つに対する特異性が大きな誘導体）を特定するために、本明細書中に記載されるように評価され得る。例えば、増殖に必要とされる遺伝子産物のほかに、細胞中で発現される非必須遺伝子産物もまた、初期試験化合物に結合し得ることが可能である。かかる場合では、増殖に必要とされる遺伝子産物に特異的な初期試験化合物の誘導体を得ることが望ましい。さらに、増殖に必要な２つの遺伝子産物が、初期試験化合物に結合し得ることが可能であるが、遺伝子産物の１つに対する特異性が望ましい。
【０２４１】
幾つかの実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する多数の株それぞれを含有する単一培養物を用いるのではなく、本発明の方法は、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する個々の株（すなわち、株の収集物）それぞれのアレイを用いて実施され得る。例えば、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する個々の株それぞれは、多重ウェルプレートの異なるウェル中で成長させてもよい。各ウェルを化合物（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質）と接触させる。ウェルそれぞれ中の株の増殖レベルを決定して、より迅速に増殖した株を特定する。より迅速に増殖した株において過剰発現した遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２４２】
別の実施形態では、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過剰発現する個々の株それぞれ（すなわち、株の収集物）を、寒天板のような固体培地上の異なる位置で成長させてもよい。培地は、化合物、および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質を含有する。株それぞれの増殖レベルを決定して、より迅速に増殖した株を特定する。より迅速に増殖した株において過剰発現された遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２４３】
化合物開発に優先順位を付すために、あるいは化合物がすでに特定されているかどうか、または化合物の標的がすでに特定された薬剤の標的であるかどうかを決定するために、上記方法を用いてもよい。特に、産物が天然産物である場合、化合物を開発する際のかなりの努力を注ぐ前に化合物がすでに特定されたかどうかを決定することが好適である。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、部分的精製または精製天然産物、あるいはコンビナトリアルケミストリーにより生産される化合物の標的は、上述の方法を用いて特定され、既知の薬剤の標的と比較される。標的が既知の薬剤の標的と同一である場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２４４】
本発明の幾つかの実施形態では、異なる遺伝子産物を過剰発現する株それぞれ（すなわち、株の収集物）のアレイは、評価されるべき化合物を含有する固体培地上で成長させる。アレイ中の各株の位置、およびその株により過剰発現される遺伝子産物は既知である。化合物の存在下で成長するコロニーパターンを評価し、すでに特定された薬剤の存在下で成長するコロニーパターンと比較する。評価される化合物の存在下で成長するコロニーパターンが、すでに特定された薬剤の存在下で成長するコロニーパターンと同じである場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２４５】
別の実施形態では、上述のアッセイでより迅速に増殖した株における遺伝子産物の配列を、異種生物からの遺伝子産物の配列と比較して、化合物により成長が阻害される種の可能性ある範囲を決定する。遺伝子産物が、異種の種からの遺伝子産物に対して高度の相同性を有する場合、この化合物はまたこれらの異種の種の成長も阻害する可能性が高い。相同性は、当業者が精通している様々な方法のいずれかを用いて決定され得る。例えば、相同性は、ＢＬＡＳＴＰまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて決定され得る。続いて、化合物の、異種の種の成長を阻害する能力は、化合物の存在下および非存在下での、異種の種の細胞の成長と比較することで確認され得る。
【０２４６】
幾つかの実施形態では、本発明は、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する株、および細胞増殖に必要とされる同じ遺伝子産物を過小発現する株の両方を含む株の収集物または培養物を使用する。株の培養物または収集物を化合物と接触させて、株の培養物または収集物中の存在する核酸を分析する。好ましくは、過剰発現する株に由来する核酸は、過小発現する株に由来する核酸と識別することができる。例えば、過剰発現する株は、上述のようにプロモーター置き換えを用いて得られてもよく、一方過小発現する株は、アンチセンス核酸を発現させることにより得られてもよい。したがって、一実施形態では、過剰発現する株または過小発現する株からの核酸を一意的に増幅する増幅プライマーが設計され得る。化合物が、培養物において過剰発現および過小発現される遺伝子産物に作用する場合、遺伝子産物を過剰発現した培養物または収集物中の株から得られる増幅産物はが培養物または収集物において過剰表現される一方で、遺伝子産物を過小発現する株から得られる増幅産物は、培養物または収集物において過小表現される。望ましい場合、化合物と接触させた培養物または収集物からの核酸を、化合物と接触させなかった対象培養物または収集物からの核酸と比較してもよい。あるいは、対照培養物または収集物と比較することなく、化合物と接触させた培養物または収集物からの核酸を直接分析してもよい。
【０２４７】
細胞増殖を阻害する化合物の標的を特定する現在の方法は、手間がかかり、かつ時間を消費する。上記方法を用いて、多数の化合物の標的を迅速に特定することが可能であり得る。かかる方法では、上述の方法は、多数の化合物それぞれに関して同時に実施される。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物ライブラリーの成員、または天然産物ライブラリーの成員であってもよい。かかる方法では、増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する複数の株それぞれを含む複数の培養物それぞれ、あるいは増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現する個々の株それぞれの複数の収集物が得られる。各株の培養物または収集物を、ライブラリー中の種々の化合物と接触させて、化合物の標的を上述のように特定する。
【０２４８】
本発明の別の実施形態では、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物は、生物の増殖に必要とされる異なる遺伝子産物を過小発現する株を含む生物の株の混合物（すなわち、培養物中の株の少なくとも幾つかが、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する）を含む培養物を用いて特定される。好ましくは、培養物中の株それぞれは、生物の増殖に必要とされる異なる遺伝子産物を過小発現される（すなわち、培養物中の株のすべてが、生物の増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する）。かかる株は、上述の方法を用いて得られ得る。培養物は、任意数の株を含んでもよい。例えば、培養物は、少なくとも２個の株、少なくとも１０個の株、少なくとも２０個の株、少なくとも３０個の株、少なくとも５０個の株、少なくとも１００個の株、少なくとも３００個の株、または３００個より多い株を含んでもよい。幾つかの実施形態では、培養物中の株は、概して生物の増殖に必要とされる遺伝子産物のすべてまたはほとんどを過小発現し得る株を含んでもよい。
【０２４９】
培養物を、生物の増殖を阻害する化合物と接触させる。化合物は、任意の供給源から得られる候補薬剤化合物であってもよい。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物、天然産物ライブラリーからの化合物、または不純なもしくは不完全な精製化合物（例えば、不完全に精製した天然抽出物中の化合物）であってもよい。培養物を、化合物が作用する遺伝子産物を過小発現する培養物中の生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の化合物と接触させて、その結果、化合物が作用する遺伝子産物を過過小発現しない株は、上記化合物が作用する上記遺伝子産物を過小発現する株よりも迅速に培養物中で増殖する。したがって、十分な期間後に、化合物が作用する遺伝子産物を過小発現する株は、化合物が作用する遺伝子産物を過小発現しない株よりも培養物中で優勢ではない。一実施形態では、成長条件およびインキュベーション期間は、唯一の株、すなわち化合物の標的を過小発現する株が培養物において減少した速度で増殖するように選択される。別の実施形態では、成長条件は、化合物の標的を過小発現する株が培養物から回収されないように選択される。したがって、一実施形態では、それぞれが種々の増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する複数の株を含有する複数の培養物を、様々な濃度の化合物の存在下で成長させてもよい。化合物濃度を変更させるほかに、増殖に必要な遺伝子産物の発現が調節可能なプロモーターの制御下にある実施形態では、複数の培養物を、誘導物質またはプロモーターからの転写に対するレプレッサの影響を低減する作用物質のような、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の様々な濃度で成長させてもよい。培養物は、その標的が特定される化合物の存在下で（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質の存在下で）液体培地中で成長させてもよく、あるいは増殖に必要な遺伝子発現を過小発現する株を含む液体培養物は、その標的が特定される化合物の非存在下で成長させた後、化合物を含有する（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質も含有する）固体培地上に導入してもよい。
【０２５０】
化合物の標的である過小発現される遺伝子産物の独自性は、様々な方法を用いて決定され得る。例えば、幾つかの実施形態では、化合物と接触させた株の培養物または収集物中に存在する核酸を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物中に存在する核酸と比較して、株の対照培養物または収集物に対して、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物において過小表現される核酸を特定してもよい。あるいは、幾つかの実施形態では、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物中の存在する核酸を分析して、株の対照培養物または収集物と比較することなく、欠如しているかまたは低減されたレベルで存在する核酸を特定してもよい。
【０２５１】
本発明の幾つかの実施形態では、株の培養物または収集物においてよりゆっくりと増殖した株、すなわち試験化合物の存在下で増殖する能力が低いか、または試験化合物の存在下で増殖しない株は以下のように特定される。過小発現される遺伝子それぞれと相関し、互いに識別可能な増幅産物は、試験化合物の存在下で成長させた培養物または収集物から得られる。増幅産物は、特定の増幅産物が株の培養物または収集物において過小表現されるかどうかを決定するために、互いに識別される。幾つかの実施形態では、遺伝子産物それぞれに相当する増幅産物は、増幅産物が互いに識別され得る長さを有する。別の実施形態では、１つまたは複数の増幅産物は、類似のまたは同一の長さを有するが、増幅産物に結合された色素のような検出可能な作用物質に基づいて互いに識別可能である。幾つかの実施形態では、過小表現される増幅産物は、試験化合物と接触させた株の培養物または収集物からの増幅産物を、試験化合物と接触させなかった株の培養物または収集物からの増幅産物と比較することにより特定される。あるいは、株の培養物または収集物中の過小表現される増幅産物は、株の培養物または収集物中で、どの増幅産物が欠如しているか、または低減されたレベルで存在するかどうかを単に決定することにより特定されてもよい。識別可能な増幅産物を生成する上記方法は、試験化合物の存在下でよりゆっくりと増殖する株の特定を容易とするために、本明細書中に記載の増幅に必要とされる遺伝子産物を過小発現する株を生成する方法のいずれかと併用してもよい。
【０２５２】
例えば、本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの自然プロモーターそれぞれを、単一の所望の置き換えプロモーターで置き換えてもよい。プロモーターが置き換えられた株を含有する株の培養物または収集物を試験化合物の存在下で所望の期間成長させた後、増幅反応は、以下の通りに培養物から得られる核酸で実施される。
【０２５３】
株の培養物または収集物からの核酸は、少なくとも２アリコットに分割される。好ましい実施形態では、株の培養物または収集物からの核酸は、４アリコットに分割される。置換えプロモーター内の、増殖に必要な遺伝子内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接した核酸配列内のヌクレオチド配列に相補的な単一プライマーは、４つの群に分割される。各群は、別個の検出可能な色素、例えばApplied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能な６ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ（商標）、およびＰＥＴ（商標）色素で標識される。例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)から入手可能なＤＳ−３１またはＤＳ−３３色素組を用いて、プライマーを標識してもよい。標識プライマーの群それぞれは、株の培養物または収集物からの核酸のアリコットのそれぞれに添加され、その結果核酸の各アリコットは、プライマー上に単一の検出可能な色素を有する単一標識プライマーを受け取る。
【０２５４】
核酸のアリコットそれぞれはまた、プロモーター内の、置き換えプロモーターの制御下に置かれた増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の１つに特有なヌクレオチド配列内の、またはプロモーターもしくは増殖に必要な遺伝子に隣接したヌクレオチド配列内のヌクレオチド配列に相補的であるそれぞれの非標識プライマーを有する非標識プライマー組を受け取る。アリコットはそれぞれ、置き換えプロモーターの制御下に置かれた１／Ｎ増殖に必要な遺伝子に特有なプライマー（ここでＮはアリコットの数である）を受け取る（すなわち、株の培養物または収集物が、増殖に必要とされる遺伝子が置き換えプロモーターの制御下に置かれ、４アリコットに分割される１００個の株から構成された場合、株の培養物または収集物からの核酸の４アリコットそれぞれは、２５個の遺伝子に相補的なプライマーを受け取る）。非標識プライマーは、それぞれが、他の非標識プライマーにより産生される増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように選択される。好ましくは、増幅産物は、約１００〜約４００ヌクレオチド長であるが、互いに識別され得る任意の長さを使用してもよい。さらに、実施形態の幾つかでは、増幅産物の幾つかは同一のまたは非常に類似した長さを有し得るが、識別可能な色素による標識により、互いに識別可能であり得る。
【０２５５】
核酸増幅反応は、核酸アリコットそれぞれで行われる。次に、増幅産物を長さで分離して、株の培養物または収集物において表現が減少したか、もしくは存在しない増幅産物を特定する。次に、増幅産物を相当する遺伝子と相関させて、どの株が株の培養物または収集物においてよりゆっくりと増殖したかを決定する。望ましい場合、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる増幅産物を、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物から得られる増幅産物と比較することにより、培養物において表現が減少した増幅産物を特定してもよい。あるいは、望ましい場合、化合物と接触させなかった対照培養物と比較することなく、化合物と接触させた培養物において欠如しているかまたは低減されたレベルで存在する増幅産物を直接特定してもよい。
【０２５６】
例えば、幾つかの実施形態では、核酸アリコットそれぞれからの増幅産物をプールし、キャピラリー電気泳動にかける。増幅産物は、増幅産物に結合された蛍光色素を検出することで検出され、それらの長さを決定して、株の培養物または収集物において表現が減少した増幅産物を特定する。図１Ａおよび図１Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施された増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。
【０２５７】
あるいは、別の実施形態では、第１の増幅反応は、過剰発現される遺伝子のすべての上流または下流に存在するヌクレオチド配列に相補的な第１のプライマー(例えば、過剰発現される遺伝子すべての上流にある置き換えプロモーター中のヌクレオチド配列の相補的なプライマー）、および株それぞれに特有なヌクレオチド配列に相補的なプライマー（例えば、増殖に必要な遺伝子それぞれ内のヌクレオチド配列に相補的なプライマー）組を用いて、化合物と接触させた株の培養物または収集物から得られる核酸で実施される。増殖に必要な遺伝子ぞれぞれのための２つの増幅プライマーのうちの１つは、上述のように色素で標識される。好ましくは、過剰発現される遺伝子すべての上流または下流のヌクレオチド配列に相補的な共通プライマーが色素で標識される。増幅反応で使用されるプライマーは、各増殖に必要な遺伝子に相当する増幅産物が特有の長さを有するように設計される。第２の増幅反応は、第１の増幅反応の場合と同じプライマーを用いて、化合物と接触させなかった株の対照培養物または収集物で行われる。第１の増幅反応からの増幅産物を第２の増幅反応からの増幅産物と比較して、株の培養物または収集物で過小表現される１つまたは複数の増幅産物を特定する。例えば、第１の増幅反応からの増幅産物は、第２の増幅反応からの増幅産物とは別個のポリアクリルアミドゲルのレーン、またはその増幅産物と別個のキャピラリーに流してもよく、２つのレーンまたはキャピラリーを互いに比較する。
【０２５８】
あるいは、幾つかの実施形態では、第２の増幅反応におけるプライマーは、第１の増幅反応で使用される色素と識別可能である異なる色素で標識される。この実施形態では、増幅反応物をプールして、ポリアクリルアミドゲル上の同じレーンまたは同じキャピラリーに流してもよく、各増幅反応からの産物は、各増幅産物に関して存在する各色素の量を比較することにより比較される。図２Ａおよび図２Ｂはこの方法の一実施形態を示し、ここでは化合物と接触させた増殖に必要とされる遺伝子を過小発現する複数の株を含む培養物で実施される増幅反応からの増幅産物の非存在が、欠如した増幅産物に相当する遺伝子に対して試験化合物が作用することを示す。
【０２５９】
望ましい場合、培養物をアリコットに分割するのではなく、個々の増幅反応は、株の培養物または収集物から得られる核酸で実施されてもよい。各増幅反応は、増殖に必要な遺伝子のたった１つに特異的な増幅産物を生じるプライマーを含有する。個々の増幅反応それぞれから生じた増幅産物はプールされ、培養物において表現が減少した増幅産物は、上述のように特定される。
【０２６０】
一実施形態では、培養物中の各株の表現は、増殖に必要とされる遺伝子またはその一部をコードする核酸を含むアレイに、培養物から得られる増殖に必要とされる遺伝子またはその一部をコードする検出可能に標識した核酸をハイブリダイズすることにより評価され得る。増殖に必要とされる遺伝子産物またはその一部をコードする各核酸は、アレイ上の既知の位置を占める。アレイ上の各位置からのシグナルを定量化して、培養物で過小表現される増殖に必要な遺伝子産物をコードする核酸を特定する。望ましい場合、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を、化合物と接触させなかった対照培養物からのハイブリダイズした核酸と比較してもよい。あるいは、対照培養物からの核酸と比較することなく、化合物と接触させた培養物からのハイブリダイズした核酸を直接特定してもよい。
【０２６１】
あるいは、増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する各株は、特有の核酸配列（本明細書中では「タグ」とも呼ばれる）を含有するように構築され得る。タグは、各株の染色体中に、または染色体外ベクター中に含まれてもよい。例えば、タグは、増殖に必要とされる遺伝子産物またはかかる遺伝子の一部をコードする遺伝子に相補的なアンチセンス核酸をコードするベクターに含まれ得るか、あるいはタグは、アンチセンス核酸自体に含まれてもよい。培養物中の各株の表現は、タグそれぞれに相補的なプライマーを用いて増幅反応を実施して、生じた増幅産物のレベルを定量化して、培養物から過小表現されるか、または存在しないタグを特定することにより評価され得る。各タグは１つの株に相応するため、培養物から過小表現されるか、または存在しない株は特定され得る。望ましい場合、化合物と接触させた培養物中に存在するタグを、化合物と接触させなかった対照培養物中に存在するタグと比較してもよい。あるいは、対照培養物と比較することなく、化合物と接触させた培養物中に存在するタグを分析してもよい。
【０２６２】
望ましい場合、特有のタグはまた、増殖に必要とされる遺伝子産物が過剰発現される実施形態で使用され得ることが理解されよう。かかる実施形態の幾つかの態様では、タグは、遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモーター内にまたはそれ隣接して存在し得る。かかる実施形態では、培養物中でより迅速に増殖する株において過剰発現される遺伝子産物は、培養物中の遺伝子産物に相当する特有のタグの存在またはその量を検出することにより特定され得る。
【０２６３】
本発明の幾つかの実施形態では、複数の株が、化合物の存在下であまり迅速に増殖し得ない。このことは、様々な原因に起因し得る。例えば、化合物の濃度は、１つの遺伝子産物（すなわち、標的遺伝子産物）を過小発現する細胞にのみ増殖を減少するのに十分高くない場合がある。標的遺伝子産物を過小発現する株は培養物においてあまり優勢でないと同時に、他の株もまた過小表現され得る。かかる場合では、培養物において最も優勢でない（または培養物から回収されない）株における遺伝子産物の独自性は、培養物中の増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子それぞれのレベルを定量化することにより特定され得る。これは、定量的ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、または上述のアレイ技術を用いて実現され得る。
【０２６４】
他の場合では、多数の株が、共通の機能属性の結果として培養物においてあまり迅速でない増殖を示す。例えば、あまり迅速に増殖しない株（または培養物から回収されない株）はそれぞれ、例えばセリンプロテアーゼ活性のような共通の酵素活性を有する遺伝子産物を過小発現し得る。あるいは、あまり迅速に増殖しない株（または培養物から回収されない株）はそれぞれ、ｃＡＭＰ結合ドメインのような共通の機能ドメインを有する遺伝子産物を過小発現し得る。かかる場合では、あまり迅速に増殖しない株（または培養物から回収されない株）の共通属性は、化合物の作用様式または化合物の標的の生化学活性に関する情報を提供し得る。例えば、あまり迅速に増殖しない株において過小発現される遺伝子のすべてがセリンプロテアーゼである場合、化合物はセリンプロテアーゼ活性を阻害することにより作用し、標的タンパク質はセリンプロテアーゼである。望ましい場合、化合物は誘導体化されてもよく、より迅速に増殖した株それぞれに対する誘導体化された化合物の有効性は、共通活性または結合部位を共有する広範囲の標的と相互作用することが可能な誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、全ての株の増殖を阻害する能力が大きな誘導体）を特定するために、あるいは所望の標的に対してより大きな特異性を有する誘導体（すなわち、もとの化合物よりも、株の１つに対する特異性が大きな誘導体）を特定するために、本明細書中に記載されるように評価され得る。
【０２６５】
幾つかの実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する多数の株それぞれを含有する単一培養物を用いるのではなく、本発明の方法は、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する個々の株（すなわち、株の収集物）それぞれのアレイを用いて実施され得る。例えば、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する個々の株それぞれは、多重ウェルプレートの異なるウェル中で成長させてもよい。各ウェルを化合物（および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質）と接触させる。ウェルそれぞれ中の株の増殖レベルを決定して、あまり迅速に増殖しなかったか、または全く増殖しなかった株を特定する。あまり迅速に増殖しなかったか、または全く増殖しなかった株において過小発現した遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２６６】
別の実施形態では、異なる増殖に必要な遺伝子産物を過小発現する個々の株それぞれ（すなわち、株の収集物）を、寒天板のような固体培地上の異なる位置で成長させてもよい。培地は、化合物、および適切な場合には、プロモーターからの発現レベルを調節する作用物質を含有する。株それぞれの増殖レベルを決定して、あまり迅速に増殖しなかった株（または培養物から回収されない株）を特定する。あまり迅速に増殖しなかった株（または培養物から回収されない株）株において過小発現される遺伝子産物の独自性は、上述のように決定される。
【０２６７】
化合物開発に優先順位を付すために、あるいは化合物がすでに特定されているかどうか、または化合物の標的がすでに特定された薬剤の標的であるかどうかを決定するために、上記方法を用いてもよい。特に、産物が天然産物である場合、化合物を開発する際のかなりの努力を注ぐ前に化合物がすでに特定されたかどうかを決定することが好適である。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、不完全な精製または精製天然産物、あるいはコンビナトリアルケミストリーにより生産される化合物の標的は、上述の方法を用いて特定され、既知の薬剤の標的と比較される。標的が既知の薬剤の標的と同一である場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２６８】
本発明の幾つかの実施形態では、異なる遺伝子産物を過小発現する株それぞれ（すなわち、株の収集物）のアレイは、評価されるべき化合物を含有する固体培地上で成長させる。アレイ中の各株の位置、およびその株により過小発現される遺伝子産物は既知である。化合物の存在下であまり成長しないか、または成長することができないコロニーパターンを評価し、すでに特定された薬剤の存在下であまり迅速に成長しないか、または成長することができないコロニーパターンと比較する。評価される化合物の存在下であまり成長しないか、または成長することができないコロニーパターンが、すでに特定された薬剤の存在下であまり成長しないか、または成長することができないコロニーパターンと同じである場合、化合物のさらなる開発は中止される。
【０２６９】
別の実施形態では、上述のアッセイであまり迅速に増殖しなかった株（または培養物から回収されなかった株）における遺伝子産物のヌクレオチド配列を、異種生物からの遺伝子産物のヌクレオチド配列と比較して、化合物により成長が阻害される種の可能性ある範囲を決定する。遺伝子産物が、異種の種からの遺伝子産物に対して高度の相同性を有する場合、この化合物はまたこれらの異種の種の成長も阻害する可能性が高い。相同性は、当業者が精通している様々な方法のいずれかを用いて決定され得る。例えば、相同性は、ＢＬＡＳＴＰまたはＦＡＳＴＡのようなコンピュータプログラムを用いて決定され得る。続いて、化合物の、異種の種の成長を阻害する能力は、化合物の存在下および非存在下での、異種の種の細胞の成長と比較することで確認され得る。
【０２７０】
細胞増殖を阻害する化合物の標的を特定する現在の方法は、手間がかかり、かつ時間を消費する。上記方法を用いて、多数の化合物の標的を迅速に特定することが可能であり得る。かかる方法では、上述の方法は、多数の化合物それぞれに関して同時に実施される。例えば、化合物は、コンビナトリアルケミストリーを用いて生成される化合物ライブラリーの成員、または天然産物ライブラリーの成員であってもよい。かかる方法では、増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過小発現する複数の株それぞれを含む複数の培養物それぞれ、あるいは増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過小発現する個々の株それぞれの複数の収集物が得られる。各株の培養物または収集物を、ライブラリー中の種々の化合物と接触させて、化合物の標的を上述のように特定する。
【０２７１】
本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子またはそれらの一部に相補的な核酸（すなわち、増殖に必要な遺伝子産物またはそれらの一部をコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸をコードする核酸）が調節可能なプロモーターに作動可能に連結される株が構築される。各株が異なる増殖に必要とされる遺伝子産物に対するアンチセンス核酸を発現する複数のかかる株を含む培養物を、増殖を阻害する様々なレベルの化合物の存在下で、および調節可能なプロモーターからの転写レベルを調節する様々なレベルの作用物質の存在下で成長させる。核酸試料は、培養物から得られ、検出可能に標識され、増殖に必要な遺伝子産物またはそれらの一部をコードする遺伝子を含有する核酸を含む固体支持体にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションのレベルを、増殖に必要な遺伝子産物それぞれをコードする各核酸に関して定量化して、株それぞれが培養物中で増殖した割合を決定する。培養物中の株により発現されるアンチセンス核酸が、化合物の標的をコードする遺伝子のすべてまたは一部に相補的でない場合（すなわち、非特異的株）、その株に関するハイブリダイゼーション強度は、化合物濃度と相関されない（図３を参照）一方、培養物中の株により発現されるアンチセンス核酸が、化合物の標的をコードする遺伝子のすべてまたは一部に相補的である場合、その株に関するハイブリダイゼーション強度は、化合物濃度と密接に相関される（図４を参照）。この様式では、化合物の標的が特定されてもよい。上述のように、単一培養物中の株を成長させるのではなく、各株を固体培地上の異なる位置で、あるいは多重ウェルプレートの異なるウェル中で成長させてもよいことが理解されよう。
【０２７２】
本明細書中の方法は、これらの化合物の標的を迅速に特定することが可能であるために、増殖を阻害する複数の化合物それぞれに関して同時に実施されてもよい。
【０２７３】
本発明の幾つかの実施形態を、以下の欄に概要する。本発明は任意の生物の培養物に適用されてもよく、生物の増殖に必要とされる任意の遺伝子産物が過剰発現または過小発現されてもよいことが理解されよう。したがって、以下の実施例に記載される生物および遺伝子産物は単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。
【０２７４】
本発明において使用するための細胞増殖に必要とされる遺伝子は文献から特定されてもよく、以下の方法を用いて特定されてもよく、あるいは当業者が精通している他の方法を用いて特定されてもよい。本発明の幾つかの実施形態では、培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む。配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物の特定を以下に記載する。
【実施例１】
【０２７５】
細胞増殖に必要とされる遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡを発現することによる、細胞増殖に必要とされる遺伝子の特定
ランダムゲノム断片を、細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定したい生物から得る。ランダムゲノム断片は、制限酵素による部分的消化、超音波処理および噴霧のような技法を用いた機械的せん断、またはＤＮアーゼＩ消化により得ることができる。ランダムゲノム断片を、ベクターにおいて調節可能プロモーターに作動可能に連結する。挿入ゲノム断片がプロモーターに関してアンチセンス方向にある場合は、産生される転写物は遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、その結果、転写物は様々な遺伝子から産生されるセンスｍＲＮＡと相互作用をし、それによりセンスメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率またはレベルを減少させ、したがってこれらのセンスｍＲＮＡ分子によりコードされるタンパク質の産生を減少させる。センスｍＲＮＡが増殖に必要とされるタンパク質をコードする場合は、誘導性条件下で成長させた細胞は、成長することができないか、または成長速度がかなり低下する。さらに、産生される転写物が非翻訳ＲＮＡの少なくとも一部に相補的であり、非翻訳ＲＮＡが増殖に必要とされる場合は、誘導性条件下で成長させた細胞はまた、成長することができないか、または成長速度がかなり低下する。対照的に、非誘導性条件下で成長させた細胞は正常な速度で成長する。続いて、アンチセンス核酸が相補的である遺伝子が特定され、本発明の方法で利用される。したがって、細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定するために、調節可能プロモーターからの転写を誘導する作用物質の存在下におけるベクターを含有する細胞増殖の程度を、作用物質の非存在下における細胞増殖の程度と比較する。作用物質の非存在下においては十分に成長するが、作用物質の存在下においては増殖がかなり減少する細胞は、細胞増殖に必要とされる遺伝子の少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸をコードするベクターを含む。
【０２７６】
上記方法を用いて、エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスにおける細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定した。エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスにおける細胞増殖に必要とされる遺伝子の特定は、以下の米国特許出願に記載されている（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）：２００１年３月２１日に出願された米国特許出願第０９／８１５，２４２号、２０００年１月２７日に出願された米国特許出願第０９／４９２７０９号、２０００年１１月９日に出願された米国特許出願第０９／７１１１６４号、２０００年１２月１９日に出願された米国特許出願第０９／７４１６６９号、および２００１年３月２１日に出願された米国特許出願第０９／８１５，２４２号。細胞増殖に必要とされるこれらの遺伝子を特定するのに使用される方法を以下に概要する。
【０２７７】
エシェリヒア・コリの増殖に必要とされる遺伝子を特定するために、ランダムゲノム断片を、ＩＰＴＧ誘導発現ベクターｐＬＥＸ５ＢＡ（Krause et al., J. Mol. Biol. 274:365 (1997)：この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、またはｐＬＥＸ５ＢＡの改変型であるｐＬＥＸ５ＢＡ−３’（Ｔ７ターミネーターを含有する合成リンカーが、ｐＬＥＸ５ＢＡのＰｓｔＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に連結されている）にクローニングした。特に、ｐＬＥＸ５ＢＡ−３’を構築するために、以下のオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＬＥＸ５ＢＡのＰｓｔＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した：
５’−ＧＴＣＴＡＧＣＡＴＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＧＴＣＣＴＴＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡ−３’（配列番号１５７７９）本出願全体にわたって挿入される正確な配列番号）
５’−ＡＧＣＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＣＣＣＧＴＴＴＡＧＡＧＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＴＴＡＴＧＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡ−３’（配列番号１５７８０）。
【０２７８】
エシェリヒア・コリのゲノムＤＮＡのランダム断片を、ＤＮアーゼＩ消化または超音波処理により生成して、Ｔ４ポリメラーゼで充填し、ｐＬＥＸ５ＢＡまたはｐＬＥＸ５ＢＡ−３’のＳｍａＩ部位にクローニングした。活性化または誘導時に、プロモーターがランダムゲノム断片を転写した。
【０２７９】
液体培地中で転写誘導の効果を調査するために、１ｍＭ ＩＰＴＧを含む、または含まない新鮮な培地中に１：２００で培養物を逆希釈し、３０分（ｍｉｎ）毎にＯＤ450を測定することで、成長曲線を作成した。固体培地上で転写誘導の効果を調査するために、一晩の培養物の１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、および１０8倍希釈物を調製した。これらの希釈物の０．５〜３μｌのアリコットを、１ｍＭ ＩＰＴＧを含む、または含まない選択寒天プレートにスポット(spot)した。一晩インキュベーションした後、プレートを比較して、ＩＰＴＧに対するクローンの感受性を評価した。
【０２８０】
試験した数多くのクローンのうち、幾つかのクローンが、ＩＰＴＧ誘導後にエシェリヒア・コリの成長を阻害する配列を含むと特定された。したがって、挿入核酸配列が対応する遺伝子、または挿入核酸を含有するオペロン内の遺伝子は、エシェリヒア・コリの増殖に必要とされる。
【０２８１】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、およびクレブシエラ・ニューモニアエの増殖に必要とされる核酸は以下のように特定された。スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、エンテロコッカス・フェカリスのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、誘導プロモーターから転写された。
【０２８２】
スタフィロコッカス・アウレウスの場合は、スタフィロコッカス・アウレウスのｘｙｌＡプロモーター由来のｘｙｌＯオペレーターに融合させた改変Ｔ５プロモーターを含む、新規誘導プロモーター系であるＸｙｌＴ５を使用した。このプロモーターは、米国特許出願第１０／０３２，３９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。このハイブリッドプロモーターからの転写は、キシロースにより誘導することができる。
【０２８３】
サルモネラ・タフィマリアムのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、ｐＬＥＸ５ＢＡにおいてＩＰＴＧ誘導プロモーター(Krause et al., J. Mol. Biol. 274: 365 (1997)）、またはその誘導体から転写された。クレブシエラ・ニューモニアエのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、ｐＬＥＸ５ＢＡ−ＫａｎにおいてＩＰＴＧ誘導プロモーターから発現された。ｐＬＥＸ５ＢＡ−Ｋａｎを構築するために、ｐＬＥＸ５ＢＡをＣｌａＩで完全に消化して、ｂｌａ遺伝子を除去した。次に、プラスミドを部分的ＮｏｔＩ消化処理して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した。次に、３．２ｋｂｐ断片をゲル精製して、ｐＫａｎπ由来の平滑末端化１．３ｋｂｐのｋａｎ遺伝子に連結した。Ｋａｎ耐性形質転換体をＫａｎプレート上で選択した。ｋａｎ遺伝子の配向性をＳｍａＩ消化により調べた。ｂｌａ遺伝子と同じ配向性のｋａｎ遺伝子を有するクローンを用いて、クレブシエラ・ニューモニアエの増殖に必要とされる遺伝子を特定した。
【０２８４】
シュードモナス・エルジノーザのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、２成分誘導プロモーター系から転写された。染色体上に、ｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ（Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111:35-41：この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。別個のプラスミド上で、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７遺伝子１０プロモーターをｌａｃＯオペレーターと、さらに多数のクローニング部位と融合させた。
【０２８５】
スタフィロコッカス・アウレウスの場合は、スタフィロコッカス・アウレウスのゲノム断片のショットガンライブラリーを、ＸｙＩＴ５誘導プロモーターを保有するベクターｐＸｙＩＴ５−Ｐ１５ａにクローニングした。ＸｙＩＴ５プロモーター／オペレーターのすぐ下流にある特有のＢａｍＨＩ部位でベクターを線状化した。線状化ベクターをシュリンプ(shrimp)アルカリホスファターゼで処理して、線状化末端が再封鎖するのを防いだ。スタフィロコッカス・アウレウス株ＲＮ４５０から単離したゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３Ａで完全に消化したか、あるいはＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片をゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、線状化および脱リン酸化したベクターに、０．１対１のモル比で添加して、連結して、ショットガンライブラリーを形成した。
【０２８６】
連結産物を、エレクトロコンピテント エシェリヒア・コリ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’(Stratagene)に形質転換し、カルベニシリンを１００μｇ／ｍｌで補充したＬＢ培地上で平板培養した。総計５×１０5個以上になったコロニーを掻取って合わせて、続いてプラスミド精製した。
【０２８７】
次に、精製ライブラリーをスタフィロコッカス・アウレウスＲＮ４２２０エレクトロコンピテントに形質転換した。平板培養１回当たり５００コロニーの１００〜１５０平板培養物を生成するために、生じた形質転換体を、ＬＢ＋０．２％グルコース（ＬＢＧ培地）＋１５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＬＢＧ＋ＣＭ１５培地）を含有する寒天上で平板培養した。コロニーをロボット採取して、３８４ウェル培養皿のウェル中に配列させた。各ウェルは、ＬＢＧ＋ＣＭ１５液体培地１００μｌを有していた。接種した３８４ウェル皿を、３７℃で１６時間インキュベートし、各ウェルを、２％キシロースを含むまたは含まない固体ＬＢＧ＋ＣＭ１５培地上にロボットにより格子状に並べた(grid)。格子状に並べたプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、続いてキシロースの存在下で成長が鈍った整列コロニーをマニュアルで採点した。
【０２８８】
２％キシロースを含む培地上で成長感受性である整列コロニーは、キシロースを含まない同様の培地上では成長することができ、以下のようにさらに成長感受性分析した。キシロースを含まないプレートからのコロニーを手動で採取して、ＬＢＧ＋ＣＭ１５を有する９６ウェル培養皿の個々のウェルに接種し、３７℃で１６時間インキュベートした。これらの培養物を、新鮮な培地へ１／１００に自動的に希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを３８４ウェルアレイ中で段階希釈して、続いて２％キシロースを含む培地またはキシロースを含まない培地上へ格子状に並べた。３７℃で１６時間成長させた後、２つの培地上で生じたアレイを互いに比較した。両方の培地上のすべての希釈物で同様に成長したクローンを陰性と採点し、それらについてはこれ以上検討しなかった。キシロース培地上で成長したが、非キシロースプレート上の同じ段階希釈では成長することができなかったクローンに、その差に基づいてスコアを与えた。すなわち、キシロースプレート上では１０4以下の段階希釈で成長し、非キシロースプレート上では１０8以下の段階希釈で成長するクローンには、観察される成長のｌｏｇの差を表す「４」のスコアを与えた。
【０２８９】
サルモネラ・タフィマリアムおよびクレブシエラ・ニューモニアエに関して、１ｍＭ ＩＰＴＧを含む新鮮な培地またはＩＰＴＧを含まない培地に１：２００で培養物を逆希釈し、３０分（ｍｉｎ）毎にＯＤ450を測定することで、成長曲線を作成した。固体培地上での転写誘導の効果を調査するために、一晩の培養物の１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、および１０8倍希釈物を調製した。これらの希釈物の０．５〜３μｌのアリコットを、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むまたは含まない選択寒天プレートにスポットした。一晩インキュベーションした後、プレートを比較して、ＩＰＴＧに対するクローンの感受性を評価した。
【０２９０】
シュードモナス・エルジノーザの増殖に関与する核酸を以下のように特定した。シュードモナス・エルジノーザのゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、２成分誘導プロモーター系から転写された。染色体上に、ｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節されるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込んだ(Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111:35-41)。発現プラスミド上に、ｌａｃＯオペレーター、さらに多数のクローニング部位と融合させた、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７遺伝子１０プロモーターが存在した。このハイブリッドプロモーターからの転写は、ＩＰＴＧにより誘導することができる。プロモーターの下流にあるゲノムＤＮＡが、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部を含む場合、プロモーターからの発現の誘導により、検出可能な程度に増殖が阻害される。
【０２９１】
シュードモナス・エルジノーザのゲノム断片のショットガンライブラリーを、ｐＥＰ５、ｐＥＰ５Ｓ、またはＴ７ｌａｃＯ誘導プロモーターを保有する他の同様に構築されたベクターにクローニングした。Ｔ７ｌａｃＯプロモーター／オペレーターのすぐ下流にある特有のＳｍａＩ部位でベクターを線状化した。線状化ベクターをシュリンプアルカリホスファターゼで処理して、線状化末端が再封鎖するのを防いだ。シュードモナス・エルジノーザ株ＰＡＯ１から単離したゲノムＤＮＡを、ＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片をゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、線状化および脱リン酸化したベクターに、２対１のモル比で添加して、連結して、ショットガンライブラリーを作成した。
【０２９２】
連結産物を、エシェリヒア・コリ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’(Stratagene) エレクトロコンピテントに形質転換し、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを有するＬＢ培地上で平板培養した。総計５×１０5個以上になる生じたコロニーを掻取って合わせて、続いてプラスミド精製した。
【０２９３】
次に、精製ライブラリーをエレクトロコンピテントシュードモナス・エルジノーザ株ＰＡＯ１に形質転換した。平板培養１回当たり５００コロニーの１００〜１５０平板培養物を生成するために、生じた形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはストレプトマイシン４０μｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天上で平板培養した。コロニーをロボット採取して、３８４ウェル培養皿のウェル中に配列させた。各ウェルには、ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０液体培地１００μｌを有していた。接種した３８４ウェル皿を、室温で１６時間インキュベートし、各ウェルを、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むまたは含まない固体ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０培地上へロボットにより格子状に並べた。格子状に並べたプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、続いてＩＰＴＧの存在下で成長が鈍った整列コロニーに関してマニュアルで採点した。
【０２９４】
１ｍＭ ＩＰＴＧを含む培地上で成長感受性である整列コロニーは、ＩＰＴＧを含まない同様の培地上では成長することができ、以下のようにさらに成長感受性分析した。ＩＰＴＧを含まないプレートからコロニーを手動で採取して、ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０を有する９６ウェル培養皿の個々のウェルに接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。これらの培養物を、新鮮な培地中へ１／１００に自動的に希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを３８４ウェルアレイ中で段階希釈して、続いて１ｍＭ ＩＰＴＧを含むまたは含まない培地上へ格子状に並べた。３７℃で１６時間成長させた後、得られた段階希釈スポットのアレイを、２つの培地間で比較した。両方の培地上のすべての希釈物で同様に成長したクローンを陰性と採点し、それらについてはこれ以上検討しなかった。ＩＰＴＧ培地上で成長したが、非ＩＰＴＧプレート上の同じ段階希釈で成長することができなかったクローンに、その差に基づいてスコアを与えた。すなわち、ＩＰＴＧプレート上では１０4以下の段階希釈で成長し、非ＩＰＴＧプレート上で１０8以下の段階希釈で成長するクローンには、観察される成長のｌｏｇの差を表す「４」のスコアを与えた。
【０２９５】
誘導時に、シュードモナス・エルジノーザの成長または増殖に負の影響を与えたこれらのベクターを特定した後、それらのベクターに含まれる挿入物または核酸断片を、さらなる特徴付けをするために単離した。所定のベクターを、核酸配列決定した。
【０２９６】
Ｅ．フェカリスの増殖に関与する核酸を以下のように特定した。ゲノムＤＮＡのランダムに生成した断片は、ｘｙｌオペレーター／レプレッサにより調節される、それぞれＣＰ２５またはＰ５９プロモーターを含有するベクターｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４から発現された。プロモーターの下流にあるゲノムＤＮＡが、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部を含有する場合、プロモーターからの発現の誘導により、検出可能な程度に増殖が阻害される。
【０２９７】
Ｅ．フェカリスのゲノム断片のショットガンライブラリーを、キシロース誘導プロモーターを有するベクターｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４にクローニングした。プロモーター／オペレーターのすぐ下流にある特有のＳｍａＩ部位でベクターを線状化した。線状化ベクターをアルカリホスファターゼで処理して、線状化末端が再封鎖するのを防いだ。Ｅ．フェカリス株ＯＧ１ＲＦから単離したゲノムＤＮＡを、ＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片をゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、線状化および脱リン酸化したベクターに、２対１のモル比で添加して、連結して、ショットガンライブラリーを作成した。
【０２９８】
連結産物を、エシェリヒア・コリ株ＴＯＰ１０エレクトロコンピテント細胞(Invitrogen)に形質転換し、１５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｒｍ）を含むＬＢ培地上で平板培養した。総計５×１０5個以上になる生じたコロニーを掻取って合わせて、続いてプラスミド精製した。
【０２９９】
次に、精製ライブラリーをＥ．フェカリス株ＯＧ１ＲＦエレクトロコンピテントに形質転換した。平板培養１回当たり５００コロニーの１００〜１５０平板培養物を生成するために、生じた形質転換体を、１０μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを有するＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ（ＴＨ）寒天上で平板培養した。コロニーをロボット採取して、３８４ウェル培養皿のウェル中に配列させた。各ウェルには、ＴＨＢ＋Ｅｒｍ１０μｇ／ｍｌ １００μｌを有していた。接種した３８４ウェル皿を、室温で１６時間インキュベートし、各ウェルを、５％キシロースを含むまたは含まない固体ＴＨ寒天＋Ｅｒｍ上へロボットにより格子状に並べた。格子状に並べたプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、続いてキシロースの存在下で成長が鈍った整列コロニーをマニュアルで採点した。
【０３００】
５％キシロースを含む培地上で成長感受性である整列コロニーは、キシロースを含まない同様の培地上では成長することができ、さらに成長感受性分析した。キシロースを含まないプレートからコロニーを手動で採取して、ＴＨＢ＋Ｅｒｍ１０を含有する９６ウェル培養皿の個々のウェルに接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。これらの培養物を、新鮮な培地へ１／１００に自動的に希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、５％キシロースを含むプレートまたはキシロースを含まないプレート上で段階希釈した。３７℃で１６時間成長させた後、生じた段階希釈スポットのアレイを、２つの培地間で比較した。両方の培地上で同様に成長したコロニーを陰性と採点し、対応するコロニーについてはこれ以上検討しなかった。非キシロースプレート上の段階希釈と同じ段階希釈で成長することができなかったキシロース培地上のコロニーに、その差に基づいてスコアを与えた。例えば、キシロース培地上のコロニーが−４の段階希釈に対してのみ成長する一方で、非キシロースプレート上では−８の段階希釈に対して成長することが可能である場合、相当する形質転換体コロニーには、観察される成長のｌｏｇの差を表す「４」のスコアを与えた。
【０３０１】
誘導時に、Ｅ．フェカリスの成長または増殖に負の影響を与えたこれらのベクターを特定した後、それらの発現ベクターに含まれる挿入物または核酸断片をさらに特徴付けするために単離した。所定のベクター中の挿入物を、ヌクレオチド配列決定した。
【０３０２】
他の制限酵素および他のエンドヌクレアーゼまたは方法論がランダムゲノム断片を生成するのに用いられうることが理解されよう。さらに、ランダムゲノム断片は、機械的せん断により生成されてもよい。超音波処理および噴霧は、ＤＮＡの機械的せん断に一般に使用される技法である。
【実施例２】
【０３０３】
エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖に対して有害な影響を有する核酸断片を転写する特定クローンのヌクレオチド配列決定
エシェリヒア・コリの成長を阻害する核酸配列のヌクレオチド配列を、ＱＩＡＰＲＥＰ(Qiagen, Valencia, CA)および製造業者により提供される方法を用いて単離したプラスミドＤＮＡを用いて決定した。挿入物を配列決定するのに使用されるプライマーは、５’−ＴＧＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号１５７８１）および５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１５７８２）であった。これらの配列は、ｐＬＥＸ５ＢＡ中のポリリンカーに隣接する。
【０３０４】
スタフィロコッカス・アウレウスの成長を阻害する核酸配列のヌクレオチド配列を以下のように決定した。スタフィロコッカス・アウレウスを標準的な実験室培地（プラスミドを選択するための１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを有するＬＢまたはＴＢ）中で成長させた。培養管または２ｍｌの深いウェルマイクロタイタープレート中、３７℃で一晩成長させた。
【０３０５】
スタフィロコッカス・アウレウスの溶菌は以下のように実施した。培養物（２〜５ｍｌ）を遠心分離し、細胞ペレットを、リソスタフィンの１．５ｍｇ／ｍｌ溶液（もとの培養物の２０μｌ／ｍｌ）中に再懸濁した後、懸濁緩衝液(Qiagen)２５０μｌを添加した。あるいは、細胞ペレットを懸濁緩衝液(Qiagen)２５０μｌに直接再懸濁して、そこに１ｍｇ／ｍｌリソスタフィン溶液５〜２０μｌを添加した。
【０３０６】
製造業者により提供される指示書に従って、ＱｉａｇｅｎｅミニプレップキットまたはＷｉｚａｒｄ(Qiagen)ミニプレップキットを用いてＤＮＡを単離した。
【０３０７】
ゲノムＤＮＡ挿入物を、以下のようにＰＣＲにより精製プラスミドから増幅した。
【０３０８】
Ｑｉａｇｅｎ精製プラスミド１μｌを、総反応容量２５μｌのＱｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲｍｉｘに入れた。スタフィロコッカス・アウレウスに関して、以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
ｐＸｙｌＴ５Ｆ：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１５７８３）
ＬｅｘＬ ＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴ（配列番号１５７８４）
【０３０９】
同じ方法をサルモネラ・タフィマリアムおよびクレブシエラ・ニューモニアエに関して行った。サルモネラ・タフィマリアムおよびクレブシエラ・ニューモニアエに関して、以下のプライマーを使用した：
５’−ＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴ−３’（配列番号１５７８４）、および
５’−ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＴＣ−３’（配列番号１５７８２）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間を用いて、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９５℃１５分
工程２．９４℃４５秒
工程３．５４℃４５秒
工程４．７２℃１分
工程５．工程２に戻って、２９回
工程６．７２℃１０分
工程７．４℃で保持
ＰＣＲ産物を、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１０】
シュードモナス・エルジノーザに関して、「２」以上の希釈平板培養スコアを与えられた形質転換コロニーからのプラスミドを、以下のように単離して、成長阻害を引き起こすゲノムＤＮＡ挿入物を得た。シュードモナス・エルジノーザを、標準的な実験室培地（プラスミドを選択するための１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンまたはストレプトマイシン４０μｇ／ｍｌを有するＬＢ）中で成長させた。マイクロタイタープレート中の１００μｌ培養ウェル中で３０℃で一晩成長させた。挿入ＤＮＡを増幅するために、培養物２μｌを、Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲミックス２５μｌ中に入れた。ＰＣＲ反応は、９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。プラスミドｐＥＰ５Ｓに関して、以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
Ｔ７Ｌ１＋：ＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＣＧ（配列番号１５７８５）
ｐＳｔｒＡ３：ＡＴＡＡＴＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＴＡＴＣＡＴＡＣＧ（配列番号１５７８６）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９５℃１５分
工程２．９４℃４５秒
工程３．５４℃４５秒
工程４．７２℃１分
工程５．工程２に戻って、２９回
工程６．７２℃１０分
工程７．４℃で保持
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１１】
続いて、精製ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲｍｉｘを用いて直接サイクルシークエンス（配列決定）した。以下のプライマーを配列決定反応に使用した：
Ｔ７／Ｌ２：ＡＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＡＧＡＧＧＡＴ（配列番号１５７８７）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９４℃１５分
工程２．９６℃１０秒
工程３．５０℃５秒
工程４．６０℃４分
工程５．工程２に戻って、２４回
工程６．４℃で保持
ＰＣＲ産物を、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１２】
Ｅ．フェカリスに関して、「２」以上の希釈平板培養スコアを与えられた形質転換コロニーからのプラスミドを、以下のように単離して、成長阻害を引き起こすゲノムＤＮＡ挿入物を得た。Ｅ．フェカリスを、マイクロタイタープレート中の１００μｌ培養ウェルにおいて、ＴＨＢ１０μｇ／ｍｌＥｒｍ中で、３０℃にて一晩成長させた。挿入ＤＮＡを増幅するために、培養物２μｌを、Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲｍｉｘ２５μｌ中に入れた。ＰＣＲ反応は、９６ウェルマイクロタイタープレートで行った。以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
ｐＸｙｌＴ５：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１５７８３）、およびｐＥＰ／ｐＡＫ１プライマー。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９５℃１５分
工程２．９４℃４５秒
工程３．５４℃４５秒
工程４．７２℃１分
工程５．工程２に戻って、２９回
工程６．７２℃１０分
工程７．４℃で保持
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１３】
続いて、精製ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＰＣＲｍｉｘを用いて直接サイクルシークエンス（配列決定）した。以下のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
ｐＸｙｌＴ５：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１５７８３）。
ＰＣＲは、以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐで実施した：
工程１．９４℃１５分
工程２．９６℃１０秒
工程３．５０℃５秒
工程４．６０℃４分
工程５．工程２に戻って、２４回
工程６．４℃で保持
【０３１４】
ＰＣＲ産物は、製造業者の指示書に従って、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲプレートを用いて精製した。
【０３１５】
上述の手順それぞれから得られた増幅ゲノムＤＮＡ挿入物を自動配列決定した。エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖を阻害したアンチセンス核酸のヌクレオチド配列は、添付の配列表に、配列番号８〜３７９５として列挙されている。
【実施例３】
【０３１６】
単離核酸と既知の配列との比較
上述のベクターから得られるサブクローニングしたエシェリヒア・コリのゲノム断片の核酸配列を、以下のデフォルトパラメータ：
フィルタリングオフ、ギャップを開放するためのコスト＝５、
ギャップを伸長するためのコスト＝２、
ランのｂｌａｓｔ部分におけるミスマッチに関するペナルティ＝−３、
ランのｂｌａｓｔ部分におけるマッチに関する報酬＝１、
期待値（ｅ）＝１０．０、
ワードサイズ＝１１、
一行表記数＝１００、
表示するアラインメント数（Ｂ）＝１００を用いて、
ＢＬＡＳＴバージョン１．４またはバージョン２．０．６を使用して、GenBankにおける既知のエシェリヒア・コリ配列と比較した。ＢＬＡＳＴは、Altschul, J Mol Biol. 215:403-10(1990)（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。該ベクターは、センス方向およびアンチセンス方向の両方の核酸配列を含むことが見出された。既知の遺伝子、オープンリーディングフレーム、およびリボソーム結合部位の存在を、遺伝情報を有する公的データベース、ならびにＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ ＧｒｏｕｐプログラムＦＲＡＭＥＳおよびＣＯＤＯＮＰＲＥＦＥＲＥＮＣＥのような様々なコンピュータプログラムと比較することにより決定した。産生されたＲＮＡ転写物が染色体遺伝子座由来の発現ｍＲＮＡ（または非翻訳ＲＮＡ）に相補的であるように、クローニングした断片がプロモーターに方向付けられる場合、クローンを「アンチセンス」と称した。クローンが、染色体遺伝子座由来の野生型ｍＲＮＡの一部に同一であるＲＮＡ断片をコードする場合、クローンを「センス」と称した。
【０３１７】
上述の発現ベクターから得られるスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、またはエンテロコッカス・フェカリス由来のサブクローニングした断片のヌクレオチド配列を、以下のように、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、またはエンテロコッカス・フェカリス、および他の微生物由来の既知の配列と比較した。まず、各クローンが染色体上の１の位置から生じ、それがキメラでないことを確認するために、選択クローンのヌクレオチド配列を、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、またはエンテロコッカス・フェカリスのゲノム配列と比較して、染色体上の正確な位置にクローンをアラインした。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＮ ｖ２．０．９プログラムを使用して比較し、TIGRから認可された不完全スタフィロコッカス・アウレウスゲノム配列、ならびにＮＣＢＩ非重複性GenBankデータベースを、ゲノムデータの供給源として使用した。サルモネラ・タフィマリアム配列は、Genome Sequencing Center (http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml)、および Sanger Centre (http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)から入手可能な配列と比較した。シュードモナス・エルジノーザ配列は、私有データベースおよびNCBI GenBankデータベースと比較した。Ｅ．フェカリス配列は、私有データベースと比較した。
【０３１８】
ＢＬＡＳＴＮ解析は、フィルタリングをオフとした以外はデフォルトパラメータを使用して実施した。多重断片の連結から生じた挿入物についてはさらなる解析は実施しなかった。
【０３１９】
一般に、アンチセンス分子およびそれらの相補的遺伝子は以下のように特定される。まず、考え得る完全長オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を利用可能なゲノムデータベースから抽出する。かかるデータベースとしては、GenBank非重複性（ｎｒ）データベース、TIGRから利用可能な未完成ゲノムデータベース、およびIncyte Genomicsにより開発されたＰａｔｈｏＳｅｑデータベースが挙げられる。後者のデータベースは、完全ＯＲＦ解析を含む４０個を超える注釈付きの細菌ゲノムを含む。データベースが所定の細菌ゲノムに関して不完全である場合、ゲノム中のすべてのＯＲＦを抽出する必要は必ずしもなく、所定のクローンに相補的である利用可能なゲノム配列の一部におけるＯＲＦのみを抽出することが必要である。GeneMarkのようなＯＲＦを特定するためのコンピュータアルゴリズムが利用可能であり、当該技術分野で既知である。クローンＤＮＡの、相補的ＯＲＦ（複数可）との比較により、クローンがセンスクローンであるか、またはアンチセンスクローンであるかどうか決定することができる。さらに、データベースから抽出された各ＯＲＦは、GenBank（ｎｒ）タンパク質データベース、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ等を含む十分に注釈が付けられたデータベース中の配列と比較することができる。密接に関連した微生物中の遺伝子または密接に関連した遺伝子の説明は、これらのデータベースから入手可能である場合が多い。同様の方法を用いて、非翻訳ＲＮＡをコードする遺伝子に相当するアンチセンスクローンを特定する。
【０３２０】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖を阻害する上述のクローニングした核酸配列それぞれを用いて、微生物ゲノム配列のＰａｔｈｏＳｅｑ ｖ４．１（２０００年３月公開）データベース中の対応するスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスのＯＲＦを特定した。この目的で、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＮ ２．０．９コンピュータアルゴリズムを使用した。フィルタリングをオフにした以外はデフォルトパラメータを使用した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ解析に関するデフォルトパラメータは以下の通りであった：
期待値（ｅ）＝１０
アラインメントヴューオプション：ペアを成す(pairwise)
フィルタークエリー配列（ＢＬＡＡＴＮを用いた場合ＤＵＳＴ、他のものを用いた場合ＳＥＧ）＝Ｔ
ギャップを開放するためのコスト（ゼロは挙動を誘起する）＝０
ギャップを伸長するためのコスト（ゼロは挙動を誘起する）＝０
ギャップドアラインメントに関するＸ下降値（ビットで）（ゼロは挙動を誘起する）＝０
デフライン中のＧＩの表示＝Ｆ
ヌクレオチドミスマッチに関するペナルティ（ＢＬＡＳＴのみ）＝−３
ヌクレオチドマッチに関する報酬（ＢＬＡＳＴのみ）＝１
一行表記数（Ｖ）＝５００
表示するアラインメント数（Ｂ）＝２５０
ヒットを伸長するための閾値＝デフォルト
ギャップドアラインメントの実施（ＢＬＡＳＴＸを用いた場合は利用可能ではない）＝Ｔ
使用するクエリー遺伝コード＝１
ＤＢ遺伝コード（ＴＢＬＡＳＴ［ｎｘ］のみに関して）＝１
使用するプロセッサー数＝１
ＳｅｑＡｌｉｇｎファイル
クエリーデフラインの信頼＝Ｆ
マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２
ワードサイズ＝デフォルト
データベースの有効長（実サイズに関してはゼロを使用）＝０
保持する領域からの最良ヒット数＝１００
ヒットを判断するのに使用される領域長＝２０
検索スペースの有効長（実サイズに関してはゼロを使用）＝０
データベースに対して検索するクエリー鎖（ＢＬＡＳＴ［ｎｘ］およびＴＢＬＡＳＴＸに関して）、３が両方、１が上部、２が下部＝３
ＨＴＭＬ出力の作成＝Ｆ
【０３２１】
あるいは、公的および私的データ源の調査をすることによりＯＲＦを特定およびリファインした。これらの生物に関する完全長遺伝子タンパク質およびヌクレオチド配列は、様々な供給源から構築された。シュードモナス・エルジノーザに関しては、遺伝子配列は、シュードモナス属(Pseudomonas)ゲノム配列決定プロジェクトから採択された（http://www.pseudomonas.comからダウンロード）。クレブシエラ・ニューモニアエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、およびサルモネラ・ティフィに関しては、ＰａｔｈｏＳｅｑ ｖ４．１（２０００年３月に公開）からのゲノム配列を、GenePro Inc. 451 Bishop St., N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USAから購入した遺伝子発見ソフトウェアＧｅｎｅＭａｒｋ ｖ２．４ａを用いてＯＲＦについて再解析した。
【０３２２】
誘導プロモーターからの転写が、相補的ＯＲＦ、遺伝子間配列または遺伝子内配列に対するＲＮＡアンチセンスの発現をもたらすクローンとして、アンチセンスクローンが特定された。
【０３２３】
ＯＲＦは、ＰａｔｈｏＳｅｑ以外のデータベースを用いても特定され得ることが理解されよう。例えば、ＯＲＦは、２０００年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／１９１，０７８号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて特定され得る。
【０３２４】
エシェリヒア・コリ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリスの増殖を阻害するアンチセンス核酸に対応するＯＲＦは、添付の配列表に、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、および５９１６〜１００１２として列挙される。特定されたＯＲＦによりコードされるポリペプチドは、添付の配列に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、および１００１３〜１４１１０として示される。
【０３２５】
他の実施形態では、培養物は、上記に定義されるような相同コード核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む。さらなる実施形態では、培養物は、上記に定義されるような相同ポリペプチドを過剰発現または過小発現する株を含む。
【０３２６】
相同コード核酸は、以下の実施例４に記載されるように得られ得る。
【実施例４】
【０３２７】
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドの特定
他の病原体からの相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチド（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸に相同的な核酸、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸に相同的な核酸、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のポリペプチドに相同的なポリペプチドを含む）は、以下に記載するような方法を用いて特定され得る。
【０３２８】
例えば、幾つかの実施形態では、本明細書中に記載するスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な核酸、アンチセンス核酸、およびポリペプチド（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸、ならびに配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のポリペプチドを含む）は、原核生物および真核生物において増殖に必要とされる相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドを特定するのに使用され得る。例えば、プラスモディウム(Plasmodium)種のような原生生物、植物、エントアモエーバ(Entamoeba)種およびコントラセクム(Contracaecum)種のような動物、ならびにカンジダ(Candida)種（例えば、カンジダ・アルビカンス）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、およびアスペルギルス・フミガーツスのような真菌の増殖に必要とさえる核酸またはポリペプチドが特定され得る。本発明の一実施形態では、モネラ、具体的にはグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方を含む細菌を精査して、細胞増殖に必要とされる遺伝子を特定する。同様に、相同アンチセンス核酸も特定され得る。
【０３２９】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要とされる遺伝子およびポリペプチド（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸に相補的な配列、ならびに配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のポリペプチドを含む）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびコンピュータデータベース解析のような方法を用いて、これらの生物および他の生物から増殖に必要とされる相同コード核酸または相同ポリペプチドを特定するのに使用することができる。同様に、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィの増殖を阻害するアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸、またはそれらに相補的な配列を含む）もまた、核酸ハイブリダイゼーションまたはコンピュータデータベース解析を用いて、相同アンチセンス核酸を特定するのに使用され得る。
【０３３０】
例えば、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の核酸配列（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、および配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）は、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス、および所定の他の細菌または真菌種から生成されるゲノムライブラリーをスクリーニングするのに使用される。例えば、ゲノムライブラリーは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、またはアナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)を含む他の生物、あるいはブドウ球菌属のコアグラーゼ陰性種を含む上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の生物由来であり得る。幾つかの実施形態では、ゲノムライブラリーは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来であり得る。
【０３３１】
標準的な分子生物学的技法を用いて、様々な細胞または微生物からゲノムライブラリーを作成する。一態様では、ライブラリーを作成し、ニトロセルロース紙に結合する。次に、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４、または配列番号８〜３７９５の核酸、あるいはその一部をプローブとして使用して、相同配列に関してライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０３３２】
例えば、ライブラリーをスクリーニングして、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、ならびにストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を特定してもよい。
【０３３３】
また、ライブラリーをスクリーニングして、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズする核酸配列を含む核酸、中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を特定してもよい。
【０３３４】
続いて、上記のように特定した相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法で使用することができる。幾つかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、複数の微生物の増殖に必要とされる遺伝子を特定するのに使用され得る。かかる遺伝子は、複数の微生物に対して有効な広範囲の抗生物質に関する重要な標的である。
【０３３５】
例えば、上述の方法を用いて、配列番号８〜３７９５の配列のうちの１つ、それらの配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれらの配列に相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸あるいは相同アンチセンス核酸を単離することができる。また、上述の方法を用いて、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のヌクレオチド配列のうちの１つ、それらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれらに相補的な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸あるいは相同アンチセンス核酸を単離することができる。幾つかの実施形態では、上述の方法を用いて、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の配列のうちの１つ、それらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸あるいは相同アンチセンス核酸を単離することができる。相同性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて測定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、相同ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるコード配列のうちの１つの天然に存在する対立遺伝子変異体であるコード配列を含んでもよい。かかる対立遺伝子変異体は、配列番号８〜３７９５、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列と比較した場合に、１つまたは複数のヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失またはヌクレオチド付加を有し得る。
【０３３６】
さらに、上記手順を用いて、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８のうちの１つの配列を含むポリペプチド、あるいは配列番号８〜３７９５のうちの１つの核酸により、またはそれらの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、もしくは１５０個の連続アミノ酸を含む断片により発現が阻害されるポリペプチドに対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸配列相同性あるいは類似性を有するポリペプチドをコードする相同コード核酸を単離し得る。あるいは、タンパク質相同性または類似性は、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＸ、またはデフォルトパラメータでのＴＢＬＡＳＴＮを用いて特定され得る（Altschul, S.F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997)、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０３３７】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、増殖に関与する核酸もしくはポリペプチドに対する所望レベルのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列相同性を有する配列、または微生物増殖に関与する核酸に対するアンチセンス核酸を特定するためのデータベースを検索することで特定され得る。GenBankおよびGenSeqを含む様々なかかるデータベースは、当業者に利用可能である。幾つかの実施形態では、データベースをスクリーニングすることにより、増殖に必要とされる核酸、増殖を阻害するアンチセンス核酸、または増殖に必要とされる核酸の一部、もしくは増殖を阻害するアンチセンス核酸の一部に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を特定する。例えば、相同コード配列は、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相同的な核酸、それらの配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相同的な核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相同的な核酸、それらの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、あるいは上述の核酸のいずれかに相補的な配列に相同的な核酸を特定するためのデータベースを用いることで特定され得る。他の実施形態では、データベースをスクリーニングすることにより、増殖に関与するポリペプチドまたはその一部に対して、少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、または少なくとも２５％アミノ酸配列相同性あるいは類似性を有するポリペプチドを特定する。例えば、データベースをスクリーニングすることにより、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、ならびに１４９４５〜１５７７８のうちの１つを含むポリペプチドに相同的なポリペプチド、配列番号８〜３７９５のうちの１つの核酸により発現が阻害されるポリペプチド、または上述のポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、もしくは１５０個の連続アミノ酸を含む断片に相同的なポリペプチドを特定し得る。幾つかの実施形態では、データベースをスクリーニングすることにより、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドが得られたスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィ種以外の細胞または微生物からの相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを特定し得る。例えば、データベースをスクリーニングすることにより、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、あるいはアナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)などの微生物、あるいはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属を含む、上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の生物由来の相同ポリペプチドを特定し得る。幾つかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である。
【０３３８】
別の実施形態では、核酸アレイおよびマイクロアレイを用いて、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を特定することができる。核酸アレイは、ガラスチップ、ナイロン膜等の上の特定位置に堆積されたＤＮＡ試料の高密度アレイである。この技術は、例えば米国特許第５８０７５２２号（これは、参照により本明細書に援用される）に見出される。かかる実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を特定したい生物からの核酸を含むアレイを、プローブが相同体に特異的にハイブリダイズし得る条件下で、相同体を特定したい核酸またはその一部を含む検出可能なプローブと接触させる。例えば、アレイは、相同核酸を特定したい生物由来のＯＲＦに相当するＰＣＲ産物を含有する１２×２４ｃｍナイロンフィルターから構成され得る。例えば、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、あるいは相同ポリペプチドをコードする核酸は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)において、あるいはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属を含む上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種において特定することができる。
【０３３９】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を、異種細胞において、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィ種由来の増殖に必要な配列あるいはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を転写し、アンチセンス核酸が細胞または微生物の増殖を阻害するかどうかを決定することにより特定することができる。
【０３４０】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を、相同アンチセンス核酸が特定された微生物において、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つに相補的なヌクレオチド配列に相同的なアンチセンス核酸、配列番号８〜３７９５のうちの１つに相同的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、または上述の核酸のいずれかの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸のような相同アンチセンス核酸を転写して、上述のように微生物の増殖が阻害されるかどうかを決定することにより特定することができる。
【０３４１】
別の実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用するための縮重プライマーを生成するために増殖に必要とされるヌクレオチド配列の保存部分を使用することで特定することができる。ＰＣＲ技法は、当該技術分野で既知である。本明細書中で特定されたヌクレオチド配列から生成された縮重プローブを用いてＰＣＲ産物が首尾よく産生されることは、スクリーニングされる種において相同遺伝子配列が存在することを示す。続いて、この相同遺伝子は、本発明で利用される。
【０３４２】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンスの増殖に必要とされる遺伝子、またはそれらに相補的な配列に相同的な核酸は、以下に記載するように、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス以外の細胞または微生物からの相同コード核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸、または相同アンチセンス核酸を特定するのに使用され得る。例えば、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な遺伝子、またはそれらに相補的な配列に相同的な核酸は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、および上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種における相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸を特定するのに使用され得る。本発明の幾つかの実施形態では、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、またはサルモネラ・ティフィ由来の増殖に必要な配列、またはそれらに相補的な配列に相同的な核酸（配列番号８〜３７９５の１つに相同的な核酸を含む）は、エシェリヒア・コリ以外の生物において増殖に必要な配列を特定するのに使用される。
【０３４３】
本発明の別の実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸は、増殖に必要であると特定された配列、またはそれらの一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５の核酸のような、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４のうちの１つ、またはそれらの配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を含む）を、配列が得られた種以外の種において機能することが可能なベクターに転移することにより特定される。例えば、ベクターは、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)において、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種において機能的であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、ベクターは、エシェリヒア・コリ以外の微生物において機能的であり得る。当業者に理解されるように、ベクターは種特異的なある特定の要素を含み得る。これらの要素としては、プロモーター配列、オペレーター配列、レプレッサ遺伝子、複製起点、リボソーム結合配列、終結配列等を挙げることができる。アンチセンス核酸を使用するために、当業者は、培養細菌細胞からの所定の配列を含有するベクターを単離して、これらの配列を単離および精製して、これらの配列をスクリーニングされるべき細菌種において使用するのに適応されるベクターにサブクローニングするための標準的分子生物学的技法を使用することを理解する。
【０３４４】
様々な他の種のためのベクターが当該技術分野で既知である。例えば、エシェリヒア・コリで機能する数多くのベクターが当該技術分野で既知である。また、Pla等は、サルモネラ・タフィマリアム、シュードモナス・プチダ、およびシュードモナス・エルジノーザを含む多数の関連ある宿主において機能する発現ベクターを報告している(J. Bacteriol. 172(8):4448-55 (1990)）。BrunschwigおよびDarzins（Gene (1992) 111:35-4、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）は、シュードモナス・エルジノーザのためのシャトル発現ベクターについて記載した。同様に、様々なグラム陽性微生物にわたって自由に転移可能である発現ベクターの多くの例が存在する。エンテロコッカス・フェカリスのための発現ベクターは、ｐＡＫ８０骨格に適切なプロモーターを組み込むことにより操作され得る（Israelsen, H., S.M. Madsen, A. Vrang, E.B. Hansen and E. Johansen. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61:2540-2547、この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０３４５】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な配列、またはそれらの一部に相補的なアンチセンス核酸を、所定の第２の細胞または微生物（すなわち、特定された核酸が得られた細胞または微生物以外の細胞または微生物）において機能的なベクターにサブクローニングした後に、細菌成長阻害に関して試験するために、アンチセンス核酸を条件的に転写する。転写されると、第２の細胞または微生物の成長を阻害する、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の核酸のヌクレオチド配列を、第２の細胞または微生物の既知のゲノム配列と比較して、第２の生物由来の相同遺伝子を特定する。第２の細胞または微生物由来の相同配列が既知でない場合、相同配列は、上述のように、増殖に必要とされる所定のスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス配列へのハイブリダイゼーションによって、あるいは所定の増殖に必要なヌクレオチド配列に基づいたＰＣＲプライマーを用いた増幅によって特定および単離されてもよい。このようにして、第２の細胞または微生物の増殖に必要とされ得る配列は特定され得る。例えば、第２の微生物は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)であり得るか、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、第２の微生物は、エシェリヒア・コリ以外の生物である。
【０３４６】
次に、上述のようにして特定される第２の細胞または微生物由来の相同核酸配列は、アンチセンス方向で、誘導プロモーターのようなプロモーターに作動可能に連結され、第２の細胞または微生物に導入され得る。したがって、増殖に必要とされるスタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス遺伝子を特定するための本明細書中に記載される技法を用いて、第２の細胞または微生物由来の特定されたヌクレオチド配列が第２の細胞または微生物の増殖を阻害するかどうかを決定し得る。例えば、第２の微生物は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)であり得るか、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種であり得る。本発明の幾つかの実施形態では、第２の微生物は、エシェリヒア・コリ以外の生物であり得る。
【０３４７】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス以外の微生物の増殖に必要とされるアンチセンス核酸、またはそれらに相当する遺伝子を、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンスのＯＲＦ（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６−１００１２、および１４１１１〜１４９４４の核酸を含む）を含有するマイクロアレイにハイブリダイズさせて、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス配列と他の細胞または微生物由来の増殖に必要な核酸との間の相同性を判定してもよい。例えば、増殖が必要な核酸は、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)由来であるか、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の由来でありうる。幾つかの実施形態では、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要なヌクレオチド配列、または相同核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物の増殖に必要な配列を特定するのに使用される。本発明の幾つかの実施形態では、増殖に必要な配列は、エシェリヒア・コリ以外の微生物由来の配列であってもよい。スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス以外の細胞または微生物由来の増殖に必要な核酸を、プローブがマイクロアレイ上のヌクレオチド配列に対して種々のレベルの相同性を有する場合にハイブリダイゼーションが行われ得る様々な条件下でアレイとハイブリダイズさせてもよい。これは、細胞または微生物間の相同性の示唆、ならびにこれらの細胞または微生物における他の考え得る必須遺伝子への手がかりを提供する。
【実施例５】
【０３４８】
他の細菌種におけるエシェリヒア・コリの増殖に必要とされる核酸に対する核酸相同性の特定
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸は以下のように特定され得る。第１の生物において特定されたアンチセンス分子の、第２の生物の増殖を阻害する能力（それにより、第１の生物からの遺伝子に対して相同的な第２の生物中の遺伝子は、第２の生物の増殖に必要とされることを確認する）は、エシェリヒア・コリの成長を阻害するアンチセンス核酸の幾つかを用いることにより実証された。ＩＰＴＧを用いたアンチセンスＲＮＡ発現誘導時にエシェリヒア・コリの成長を阻害する発現ベクターを、エンテロバクター・クロアカエ、クレブシエラ・ニューモニアエ、またはサルモネラ・タフィマリアムに直接形質転換した。次に、上述の方法に従って、形質転換細胞を成長阻害に関してアッセイした。液体培地中での成長後に、細胞を様々な段階希釈で平板培養し、コロニーが観察される希釈度の最大１０倍の希釈度により決定される場合の「誘導対非誘導」アンチセンスＲＮＡ発現に関する成長のｌｏｇ差を算出することによりスコアを決定した。これらの実験の結果を以下の表Ｉに示す。微生物においてアンチセンスＲＮＡ発現の影響が観察されない場合、クローンは表Ｉでマイナス（−）と示される。対照的に、表Ｉ中のプラス（＋）は、用いられる条件下で、その微生物において、非誘導性プレート上のコロニーを観察するのに必要な細胞の数よりも、誘導プレート上のコロニーを観察するのに必要な細胞の数が、少なくとも１０倍より多いことを意味する。
【０３４９】
表Ｉ
エシェリヒア・コリの増殖を阻害するアンチセンス核酸に対する他の微生物の感受性
分子番号 S. typhimurium E. cloacae K. pneumoniae
EcXA001 + + -
EcXA004 + - -
EcXA005 + + +
EcXA006 - - -
EcXA007 - + -
EcXA008 + - +
EcXA009 - - -
EcXA010 + + +
EcXA011 - + -
EcXA012 - + -
EcXA013 + + +
EcXA014 + + -
EcXA015 + + +
EcXA016 + + +
EcXA017 + + +
EcXA018 + + +
EcXA019 + + +
EcXA020 + + +
EcXA021 + + +
EcXA023 + + +
EcXA024 + - +
EcXA025 - - -
EcXA026 + + -
EcXA027 + + -
EcXA028 + - -
EcXA029 - - -
EcXA030 + + +
EcXA031 + - -
EcXA032 + + -
EcXA033 + + +
EcXA034 + + +
EcXA035 - - -
EcXA036 + - +
EcXA037 + + -
EcXA038 + + +
EcXA039 + - -
EcXA041 + + +
EcXA042 - + +
EcXA043 - - -
EcXA044 - - -
EcXA045 + + +
EcXA046 - - -
EcXA047 + + -
EcXA048 - - -
EcXA049 + - -
EcXA050 - - -
EcXA051 + - -
EcXA052 + - -
EcXA053 + + +
EcXA054 - - +
EcXA055 + - -
EcXA056 + - +
EcXA057 + + -
EcXA058 - - -
EcXA059 + + +
EcXA060 - - -
EcXA061 - - -
EcXA062 - - -
EcXA063 + + -
EcXA064 - - -
EcXA065 + + -
EcXA066 - - -
EcXA067 - + -
EcXA068 - - -
EcXA069 - + -
EcXA070 - - -
EcXA071 + - -
EcXA072 + - +
EcXA073 + + +
EcXA074 + + +
EcXA075 + - -
EcXA076 - + -
EcXA077 + + -
EcXA079 + + +
EcXA080 + - -
EcXA082 - + -
EcXA083 - - -
EcXA084 - + -
EcXA086 - - -
EcXA087 - - -
EcXA088 - - -
EcXA089 - - -
EcXA090 - - -
EcXA091 - - -
EcXA092 - - -
EcXA093 - - -
EcXA094 + + +
EcXA095 + + -
EcXA096 - - -
EcXA097 + - -
EcXA098 + - -
EcXA099 - - -
EcXA100 - - -
EcXA101 - - -
EcXA102 - - -
EcXA103 - + -
EcXA104 + + +
EcXA106 + + -
EcXA107 - - -
EcXA108 - - -
EcXA109 - - -
EcXA110 + + -
EcXA111 - - -
EcXA112 - + -
EcXA113 + + +
EcXA114 - + -
EcXA115 - + -
EcXA116 + + -
EcXA117 + - -
EcXA118 - - -
EcXA119 + + -
EcXA120 - - -
EcXA121 - - -
EcXA122 + - +
EcXA123 + - -
EcXA124 - - -
EcXA125 - - -
EcXA126 - - -
EcXA127 + + -
EcXA128 - - -
EcXA129 - + -
EcXA130 + + -
EcXA132 - - -
EcXA133 - - -
EcXA136 - - -
EcXA137 - - -
EcXA138 + - -
EcXA139 - - -
EcXA140 + - -
EcXA141 + - -
EcXA142 - - -
EcXA143 - + -
EcXA144 + + -
EcXA145 - - -
EcXA146 - - -
EcXA147 - - -
EcXA148 - - -
EcXA149 + + +
EcXA150 - - -
EcXA151 + - -
EcXA152 - - -
EcXA153 + + -
EcXA154 - - -
EcXA155 - - ND
EcXA156 - + -
EcXA157 - - -
EcXA158 - - -
EcXA159 + - -
EcXA160 + - -
EcXA162 - - -
EcXA163 - - -
EcXA164 - - -
EcXA165 - - -
EcXA166 - - -
EcXA167 - - -
EcXA168 - - -
EcXA169 - + -
EcXA171 - - -
EcXA172 - - -
EcXA173 - - -
EcXA174 - - -
EcXA175 - - -
EcXA176 - - -
EcXA178 - - -
EcXA179 - - -
EcXA180 + - -
EcXA181 - - -
EcXA182 - - -
EcXA183 - - -
EcXA184 - - -
EcXA185 - - -
EcXA186 - - -
EcXA187 + + +
EcXA189 + - -
EcXA190 + + +
EcXA191 + + -
EcXA192 - + -
【０３５０】
したがって、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドをコードする核酸は、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンスの増殖を阻害するアンチセンス核酸の、他の生物の成長を阻害する能力を測定することにより特定され得る。これは、アンチセンス核酸が得られた生物以外の種に直接アンチセンス核酸を形質転換することにより評価され得る。特に、アナプラスマ・マージナーレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテロイド・フラギリス(Bacteroides fragilis)、ボルデテラ・ペルタスシス(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・トラコマタス(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ディフィシレ(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イムミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ネイセリア・ゴナホエア(Neisseria gonorrhoeae)、ネイセリア・メニンジチジス(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリーニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・エルジノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラシス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラティフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・ティフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・タフィマリアム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディセンテリエ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレクスナー(Shigella flexneri)、シゲラ・ゾンネ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・ニューモニアエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ムタンス(Streptococcus mutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、およびエルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、あるいは上記種のいずれかの属内の範疇にある任意の種の成長を阻害するアンチセンス核酸の能力を評価し得る。本発明の幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸の、エシェリヒア・コリ以外の生物の成長を阻害する能力を評価してもよい。幾つかの実施形態では、アンチセンス核酸は、アンチセンス核酸が評価される生物において機能的である発現ベクターに挿入される。
【０３５１】
アンチセンス核酸の、異種生物の増殖を阻害する能力を評価する上記方法は、スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な核酸のいずれかに相補的なアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸のような、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４に相補的なアンチセンス核酸を含む）またはその一部、相同コード核酸に相補的なアンチセンス核酸またはその一部、あるいは相同アンチセンス核酸を用いて実施され得ることが理解されよう。
【０３５２】
異種細胞または微生物における陰性の結果は、その細胞または微生物がその遺伝子を欠如していることを意味するのでなく、かつ陰性の結果はその遺伝子が必須でないことを意味するのでもないことを当業者は理解するであろう。しかしながら、陽性の結果は、異種細胞または微生物がその細胞または微生物の増殖に必要とされる相同遺伝子を含むことを意味する。相同遺伝子は、本明細書中に記載の方法を用いて得ることができる。例えば、相同遺伝子は、相同遺伝子によりコードされる遺伝子産物のレベルまたは活性を低減したアンチセンス配列に基づいたプライマーを用いてＰＣＲ手順を実施することにより、またはサザンブロットを実施することにより単離され得る。
【０３５３】
当業者は、アンチセンス核酸が得られた微生物で作動するアンチセンス分子が、異種細胞または微生物で必ずしも作動するとは限らないことを理解するであろう。
【実施例６】
【０３５４】
他の細菌種におけるスタフィロコッカス・アウレウスの増殖に必要とされる核酸に相同的な核酸の特定
スタフィロコッカス・アウレウス由来の増殖に必要な核酸に相同的な核酸を以下のように特定した。スタフィロコッカス・アウレウスの成長を阻害する３９個のアンチセンス核酸を発現ベクターに挿入し、発現をキシロース誘導Ｘｙｌ−Ｔ５プロモーターの制御下においた。Ｘｙｌ−Ｔ５プロモーターの制御下にあるグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有するベクターを用いて、表皮ブドウ球菌におけるＸｙｌ−Ｔ５プロモーターからの発現がスタフィロコッカス・アウレウスにおける発現に匹敵することを示した。
【０３５５】
以下のようにエレクトロポレーションによりベクターを表皮ブドウ球菌に導入した：表皮ブドウ球菌を液体培地中で中対数相(mid-log phase)にまで成長させた後、遠心分離により収集した。細胞ペレットを１／３培養容量の氷冷ＥＰ緩衝液（０．６２５Ｍ スクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、ｐＨ＝４．０）に再懸濁して、再び遠心分離により収集した。次に、細胞ペレットを１／４０容量のＥＰ緩衝液を用いて再懸濁し、氷上で１時間インキュベートさせた。続いて、細胞を保管のために−８０℃で凍結させた。エレクトロポレーションするために、解凍したエレクトロコンピテント細胞５０μｌをプラスミドＤＮＡ０．５μｇと合わせた後、biorad製の遺伝子パルサエレクトロポレーション装置を用いて、１０ｋＶ／ｃｍ、２６μＦａｒａｄ、２００オームの電気パルスに付した。細胞を外殖培地２００μｌ中にすぐに再懸濁し、２時間インキュベートした後、プラスミドベクターを維持するための選択薬剤とともに、固体成長培地上で平板培養した。これらの平板培養の一晩の成長により得られるコロニーを選択し、選択薬剤とともに液体培地中で培養し、続いてスタフィロコッカス・アウレウスに関して上記したように希釈平板培養分析して、誘導物質キシロースの存在下での成長感受性を試験した。
【０３５６】
結果を以下の表ＩＩに示す。第１カラムは、表皮ブドウ球菌に導入したスタフィロコッカス・アウレウスのアンチセンス核酸の分子番号を示す。第２カラムは、アンチセンス核酸が表皮ブドウ球菌の成長を阻害したかどうかを示し、「＋」は成長が阻害されたことを示す。評価した３９個のスタフィロコッカス・アウレウスのアンチセンス核酸のうち、２０個が表皮ブドウ球菌の成長を阻害した。
【０３５７】
表ＩＩ
スタフィロコッカス・アウレアスの増殖を阻害するアンチセンス核酸に対する他の微生物の感受性
分子番号 S. epidermid
SaXA005 +
SaXA007 +
SaXA008 +
SaXA009 +
SaXA010 +
SaXA011 -
SaXA012 -
SaXA013 -
SaXA015 +
SaXA017 -
SaXA022 +
SaXA023 -
SaXA024 -
SaXA025 +
SaXA026 +
SaXA027 -
SaXA027b -
SaXA02c -
SaXA028 -
SaXA029 +
SaXA030 +
SaXA032 +
SaXA033 +
SaXA034 -
SaXA035 +
SaXA037 +
SaXA039 -
SaXA042 -
SaXA043 -
SaXA044 -
SaXA045 +
SaXA051 +
SaXA053 -
SaXA056b -
SaXA059a +
SaXA060 -
SaXA061 +
SaXA062 +
SaXA063 -
SaXA065 -
【０３５８】
スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な核酸のいずれかに相補的なアンチセンス核酸（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸のような、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４に相補的なアンチセンス核酸を含む）またはその一部、相同コード核酸に相補的なアンチセンス核酸またはその一部、あるいは相同アンチセンス核酸を用いて相同遺伝子を特定する上記方法。
【０３５９】
相同核酸はまた、相補性分析を用いて特定され得る。
【実施例７】
【０３６０】
機能的補完による相同核酸の特定
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸は以下のように特定され得る。スタフィロコッカス・アウレウス、サルモネラ・タフィマリアム、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、およびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・ティフィ、またはカンジダ・アルビカンス由来の増殖に必要な遺伝子産物または相同ポリペプチドにより活性が補完され得る遺伝子産物は、遺伝子産物の活性を低減または排除する必須遺伝子中に突然変異を有する生物に対してプラスミドまたは細菌人工染色体を導入することにより創出される部分二倍体を用いて特定される。幾つかの実施形態では、突然変異は、温度感受性突然変異のような条件的な突然変異であってもよく、その結果生物は許容条件下では増殖するが、プラスミドまたは細菌人工染色体上の遺伝子による補完がされていない非許容条件下では増殖することは不可能である。あるいは、Roth et al. (1987） Biosynthesis of Aromatic Amino Acids in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, F.C. Neidhardt, ed., American Society for Microbiology, Publisher, pp.2269-2270（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるように複製が構築されてもよい。かかる方法は当業者によく知られている。あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸は、上述のように調節プロモーターの制御下に、増殖に必要とされる遺伝子または増殖に必要とされる遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸をおいて、細胞にプラスミドまたは細菌人工染色体を導入し、プラスミドまたは細菌人工染色体の非存在下で増殖を防止または低減する条件下で増殖することが可能な細胞を特定することにより特定され得る。
【０３６１】
相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、相同ポリペプチドをコードする核酸は、以下のようにデータベースを用いて特定され得る。
【実施例８】
【０３６２】
データベース解析による相同核酸の特定
必須遺伝子に相同的であることを見出すのにデータベース方法論を用いることができることを実証するために、９個の原核生物を分析して、詳細に比較した。まず、各生物の遺伝子配列の最も信頼性の高い供給源を、公的および私的データ源の調査を実施することにより評価した。研究した９個の生物は、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニアエ、シュードモナス・エルジノーザ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、およびサルモネラ・ティフィである。これらの生物の完全長遺伝子タンパク質およびヌクレオチド配列は様々な供給源から構築された。エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、およびヘリコバクター・ピロリに関しては、遺伝子配列は、公的配列決定プロジェクトから採択され、ＧｅｎＰｅｐｔ１１５データベース（NCBIから利用可能）から得られた。シュードモナス・エルジノーザに関しては、遺伝子配列は、シュードモナス属(Pseudomonas)ゲノム配列決定プロジェクトから採択された（http://www.pseudomonas.comからダウンロード）。クレブシエラ・ニューモニアエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、およびサルモネラ・ティフィに関しては、ＰａｔｈｏＳｅｑ ｖ４．１（２０００年３月に公開）からのゲノム配列を、GenePro Inc. 451 Bishop St., N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USAから購入される遺伝子発見ソフトウェアＧｅｎｅＭａｒｋ ｖ２．４ａを用いてＯＲＦについて再解析した。
【０３６３】
続いて、所定の遺伝子に対する全ての相同遺伝子を見つけ出すために、アンチセンス方法論により見出された必須遺伝子を、所定の得られたプロテオームと比較した。この比較は、ＦＡＳＴＡプログラムｖ３．３を用いて行われた。２５％を超えて同一であり、かつ２つの遺伝子間のアラインメントが１の遺伝子の７０％を超える長さを網羅する(cover)場合に、相同的である遺伝子とみなした。上記基準を満たす最も有意なスコアリングマッチとして定義される、９個の生物それぞれに関する最良の相同体を表ＩＩＩに示した。表ＩＩＩは、上述のように評価した９個の生物それぞれで特定した遺伝子に関して、上述のように特定した最良ＯＲＦ（遺伝子座(LOCUS)ＩＤと表示したカラム）、配列番号、同一性、およびクエリー配列と良好にアラインするタンパク質の量（範囲）を列挙する。
【０３６４】
表ＩＶは、本明細書中に記載する方法を用いて、エンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・エルジノーザ、およびスタフィロコッカス・アウレウスにおいて増殖に必要とされると特定された遺伝子のＰａｔｈｏＳｅｑクラスターＩＤを列挙する。同じＰａｔｈｏＳｅｑクラスターＩＤに表示したカラムに示す場合、これらの配列は互いに対して相同性を有し、したがって、同じＰａｔｈｏＳｅｑクラスターに分類される。したがって、本明細書中に記載する方法は、相同性を共有する幾つかの種において増殖に必要とされる遺伝子を特定した。
【０３６５】
【表１】

Figure 2004528846
【表２】
Figure 2004528846
【表３】
Figure 2004528846
【表４】
Figure 2004528846
【表５】
Figure 2004528846
【表６】
Figure 2004528846
【表７】
Figure 2004528846
【表８】
Figure 2004528846
【表９】
Figure 2004528846
【表１０】
Figure 2004528846
【表１１】
Figure 2004528846
【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
Figure 2004528846
【表１７】
Figure 2004528846
【表１８】
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【表１９】
Figure 2004528846
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
Figure 2004528846
【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
Figure 2004528846
【表３２】
Figure 2004528846
【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
Figure 2004528846
【表３６】
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【表３７】
Figure 2004528846
【表３８】
Figure 2004528846
【表３９】
Figure 2004528846
【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
Figure 2004528846
【表４８】
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【表４９】
Figure 2004528846
【表５０】
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【表５１】
Figure 2004528846
【表５２】
Figure 2004528846
【表５３】
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【表５４】
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【表５５】
Figure 2004528846
【表５６】
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【表５７】
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【表５８】
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【表５９】
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【表６０】
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【表６１】
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【表６２】
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【表６３】
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【表６４】
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【表６５】
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【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
Figure 2004528846
【表６９】
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【表７０】
Figure 2004528846
【表７１】
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【表７２】
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【表７３】
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【表７４】
Figure 2004528846
【表７５】
Figure 2004528846
【表７６】
Figure 2004528846
【表７７】
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【表７８】
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【表７９】
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【表８０】
Figure 2004528846
【表８１】
Figure 2004528846
【表８２】
Figure 2004528846
【表８３】
Figure 2004528846
【表８４】
Figure 2004528846
【表８５】
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【表８６】
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【表８７】
Figure 2004528846
【表８８】
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【表８９】
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【表９０】
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【表９１】
Figure 2004528846
【表９２】
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【表９３】
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【表９４】
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【表９５】
Figure 2004528846
【表９６】
Figure 2004528846
【表９７】
Figure 2004528846
【表９８】
Figure 2004528846
【表９９】
Figure 2004528846
【表１００】
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【表１０１】
Figure 2004528846
【表１０２】
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【表１０３】
Figure 2004528846
【表１０４】
Figure 2004528846
【表１０５】
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【表１０６】
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【表１０７】
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【表１０８】
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【表１０９】
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【表１１０】
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【表１１１】
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【表１１２】
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【表１１３】
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【表１１４】
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【表１１５】
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【表１１６】
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【表１１７】
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【表１１８】
Figure 2004528846
【表１１９】
Figure 2004528846
【表１２０】
Figure 2004528846
【表１２１】
Figure 2004528846
【表１２２】
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【表１２３】
Figure 2004528846
【表１２４】
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【表１２５】
Figure 2004528846
【表１２６】
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【表１２７】
Figure 2004528846
【表１２８】
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【表１２９】
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【表１３０】
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【表１３１】
Figure 2004528846
【表１３２】
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【表１３３】
Figure 2004528846
【表１３４】
Figure 2004528846
【０３６６】
表ＩＶ
PathoSeq Enterococcus Escherichia Pseudomonas Staphylococcus
クラスター faecalis coli aeruginosa aureus
ID
15 EFA102326 ECO101796 PAE100280 SAU102515
55 EFA100151 ECO104157 PAE100416 SAU100633
57 EFA100617 ECO102690 PAE105434 SAU100158
1443 EFA100689 ECO103692 PAE101987 SAU100952
1861 EFA101412 ECO103231 PAE104331 SAU101793
2286 EFA103268 ECO103265 PAE104314 SAU101756
2362 EFA101425 ECO100662 PAE101537 SAU101236
2367 EFA101417 ECO103226 PAE103206 SAU101798
2549 EFA101410 ECO103233 PAE104329 SAU101791
3816 EFA101159 ECO103243 PAE104319 SAU100546
3857 EFA101415 ECO103228 PAE103204 SAU101796
4322 EFA101165 ECO103237 PAE104325 SAU100141
4569 EFA100955 ECO103217 PAE103215 SAU101808
4948 EFA101160 ECO103242 PAE104320 SAU100547
5818 EFA100742 ECO103224 PAE103208 SAU101800
8159 EFA101163 ECO103239 PAE104323 SAU100139
8296 EFA101164 ECO103238 PAE104324 SAU100140
8316 EFA101409 ECO103234 PAE104328 SAU101790
8494 EFA103062 ECO103884 PAE104311 SAU100433
8498 EFA101411 ECO103232 PAE104330 SAU101792
8499 EFA101416 ECO103227 PAE103205 SAU101797
7 ECO100071 PAE100837 SAU102674
8 EFA101340 PAE106580 SAU100118
28 EFA101403 PAE102647 SAU100514
41 EFA101753 ECO100148 SAU101565
63 EFA101685 PAE103857 SAU100331
147 ECO100645 PAE100543 SAU100053
548 ECO100377 PAE100604 SAU100747
730 ECO103592 PAE103108 SAU100061
1721 EFA101686 ECO100663 SAU101996
1749 EFA101477 ECO102557 SAU100613
2153 EFA102656 ECO100184 SAU101869
2790 EFA102764 ECO100500 SAU101578
3164 EFA101162 ECO103240 SAU102602
3312 EFA103174 PAE105008 SAU100521
3926 EFA100194 ECO103220 SAU101806
4441 EFA102541 PAE105364 SAU101814
5685 EFA100190 ECO103264 SAU100157
7417 EFA102788 ECO101684 SAU102992
7437 EFA102351 ECO100084 SAU100056
7579 ECO102470 PAE102641 SAU100607
7726 EFA102551 ECO103221 SAU101805
7727 EFA100978 ECO103218 SAU101807
8092 ECO102035 PAE102964 SAU100794
8158 EFA103365 PAE104318 SAU102880
8161 EFA100210 PAE104326 SAU102527
8162 EFA101414 PAE103203 SAU101795
8164 EFA100741 ECO103223 SAU101801
8493 EFA101141 PAE104310 SAU100432
10185 EFA102728 ECO104092 SAU102578
35 ECO102870 SAU100497
44 PAE101061 SAU101143
54 PAE100225 SAU100123
85 ECO101104 SAU101262
184 PAE104901 SAU101366
362 EFA102736 SAU100414
575 EFA101790 SAU100133
579 EFA102110 SAU101624
911 PAE105432 SAU102054
941 ECO101365 SAU102162
952 EFA100615 SAU100964
1084 EFA100289 ECO102819
1141 ECO102255 SAU102356
1232 ECO100703 SAU101346
1274 PAE103655 SAU102264
1337 ECO102562 SAU100567
1350 ECO100930 PAE103901
1374 ECO103659 SAU101385
1427 EFA100394 SAU100714
1535 ECO101207 SAU101561
1653 EFA102655 SAU101868
1849 EFA100642 SAU101653
1932 EFA100919 SAU101365
2156 EFA101150 SAU101271
2189 ECO102827 PAE100476
2238 ECO101436 SAU101092
2338 EFA103038 SAU100518
2411 EFA102802 SAU102246
2501 EFA101121 SAU100996
2974 PAE102537 SAU102125
3027 ECO103959 SAU200242
3239 EFA103021 SAU100300
3244 EFA100399 SAU101891
3386 EFA100426 SAU100886
3447 EFA102915 SAU102112
3460 EFA102023 SAU101399
3682 EFA100740 SAU101802
3771 EFA101540 SAU100275
4424 EFA102542 SAU101815
4654 ECO100488 PAE106184
5148 EFA100065 SAU100658
7227 EFA100023 SAU100436
7240 ECO103672 SAU101682
7278 PAE101620 SAU301370
7374 PAE106765 SAU103042
7375 EFA102051 SAU103038
7402 ECO103572 PAE106044
7419 ECO101686 SAU102693
7436 EFA101792 SAU101495
7504 EFA101670 SAU102603
7653 EFA100397 SAU100246
7660 EFA102352 ECO103698
7719 EFA100756 SAU100496
7725 EFA100739 SAU101803
8040 EFA101736 SAU101197
8058 EFA103571 SAU101242
8077 EFA100200 SAU102231
8082 EFA101080 SAU100199
8116 EFA101963 SAU101028
8122 EFA101737 SAU101198
8141 EFA102780 SAU102433
8177 EFA103348 SAU202126
8178 EFA101022 SAU102283
8181 EFA101541 SAU102909
8191 EFA102022 SAU101398
8234 EFA103033 SAU100745
8237 EFA101682 SAU101266
8238 EFA103295 SAU100963
8251 PAE100662 SAU100596
8300 EFA101120 SAU100944
8539 EFA101339 SAU101400
8610 ECO103661 SAU102298
8874 EFA100748 SAU101155
9028 EFA103210 SAU100731
9996 EFA102338 SAU100175
10234 EFA102186 SAU102933
10248 ECO102828 SAU101220
10297 PAE105229 SAU101381
10328 EFA101079 SAU101547
10345 EFA100295 SAU100659
10365 EFA100641 SAU101655
10393 EFA103504 SAU100961
10402 EFA101833 SAU100880
12426 EFA101413 SAU101794
14277 EFA103081 SAU200088
14330 EFA101161 SAU102881
14455 EFA101424 SAU101771
14520 EFA100211 SAU101789
15660 EFA103375 SAU102694
【０３６７】
本明細書の最後にある表ＶＩＡは、上記解析で使用される配列に関する、配列番号、クローン名、および生物を示す。本明細書の最後にある表ＶＩＢは、上記解析で使用される配列に関する、クローン名、クローン配列番号、ＰａｔｈｏＳｅｑ遺伝子座、遺伝子配列番号（タンパク質）、遺伝子マーク付き (Genemarked) 遺伝子、および完全長ＯＲＦタンパク質配列番号を示す。本明細書の最後にある表ＶＩＣは、上記解析で使用される配列のＰａｔｈｏＳｅｑ遺伝子座、ヌクレオチド配列番号、およびタンパク質配列番号を示す。
【０３６８】
本発明の幾つかの実施形態では、細胞増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、所望のレベルの発現を提供する構成的または調節可能なプロモーターのような所望のプロモーターの制御下にある株は、以下の実施例９〜１３において記載するように、相同組換えにより、天然プロモーターを所望のプロモーターで置き換えることにより構築される。実施例９〜１３では代表生物としてカンジダ・アルビカンスを使用しているが、他の生物において同様の方法が利用され得ることが理解されよう。
【実施例９】
【０３６９】
プロモーターを置き換えることによる、増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株の構築
増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株はまた、これらの遺伝子産物の転写を自然に誘導するプロモーターを、所望レベルの発現を提供するプロモーターで置き換えることにより構築され得る。上述のように、かかる株は、増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法、ならびに増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を特定する方法において有用である。
【０３７０】
例えば、幾つかの実施形態では、天然プロモーターは、細胞の染色体上に存在するプロモーターを所望のプロモーターと交換するための相同組換えを用いる技法を用いることにより置き換えることができる。かかる方法論では、プロモーター置換カセット(cassette)を含む核酸が細胞に導入される。図５Ａに示すように、プロモーター置換カセットは、染色体中の天然プロモーターの５’である配列に相同的な５’領域、染色体プロモーターを置き換えるためのプロモーター、および染色体中の天然プロモーターの配列３’に相同的な３’領域を含む。幾つかの実施形態では、プロモーター置換カセットはまた、天然プロモーターの配列５’に相同的な５’領域と染色体プロモーターを置き換えるためのプロモーターとの間に配置された特定可能マーカーまたは選択可能マーカーをコードする核酸を含んでもよい。望ましい場合、プロモーター置換カセットはまた、図５Ｂに示すように、特定可能マーカーまたは選択可能マーカーをコードする遺伝子の転写ターミネーター３’を含んでもよい。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、相同組換えは、天然プロモーターを含有する染色体領域とプロモーター置換カセットとの間で行われ得る。プロモーター置換カセットが染色体に組み込まれた細胞が特定または選択される。相同組換えが起こったことを確認するために、細胞の染色体構造をサザンブロット分析またはＰＣＲにより確証してもよい。
【０３７１】
幾つかの実施形態では、プロモーター置換カセットは、ＰＣＲ産物または制限断片のような線状核酸として細胞に導入されてもよい。あるいは、プロモーター置換は、プラスミド上で細胞に導入されてもよい。図５Ａおよび図５Ｂは、相同組換えによる染色体プロモーターの、所望のプロモーターによる置換を示す。
【０３７２】
幾つかの実施形態では、プロモーター置換カセットが導入された細胞は、線状ＤＮＡで形質転換される細胞の能力を高める突然変異、または相同組換えの頻度を高める突然変異を有し得る。例えば、細胞がエシェリヒア・コリ細胞である場合、その細胞は、ＲｅｃＢＣＤ組換え複合体のエキソヌクレアーゼＶをコードする遺伝子において突然変異を有し得る。細胞がエシェリヒア・コリ細胞である場合、その細胞は、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥＴレコンビナーゼを活性化する突然変異、および／またはＲｅｃＦ経路による組換えを高める突然変異を有し得る。例えば、エシェリヒア・コリ細胞は、ｓｂｃＡまたはｓｂｃＢ突然変異を有するＲｅｃＢまたはＲｅｃＣ突然変異体であり得る。あるいはエシェリヒア・コリ細胞は、ｒｅｃＤ突然変異体であってもよい。他の実施形態では、エシェリヒア・コリ細胞は、λ Ｒｅｄ組換え遺伝子を発現してもよい。例えば、相同組換えを利用する技法で使用するのに適したエシェリヒア・コリ細胞は、Datsenko, K.A. and Wanner,B.L., PNAS 97:6640-6645 (2000)、Murphy, K.C., J. Bact 180:2053-2071 (1998)、Zhang, Y., et al., Nature Genetics 20: 123-128 (1998)、およびMuyrers, J.P.P. et al., Genes & Development 14: 1971-1982 (2000)（これらの開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。同様の遺伝子において突然変異を有する細胞がエシェリヒア・コリ以外の生物で構築され得ることが理解されよう。
【０３７３】
幾つかの実施形態では、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および米国特許出願第０９／９４８，９９３号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載される方法を用いて、調節可能なプロモーターの制御下に、増殖に必要である遺伝子を置いてもよい。
【０３７４】
プロモーター置換が実施されるべき生物が二倍体である場合、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が所望のプロモーターの制御下にある株は、２００１年２月２０日に出願された米国特許出願第０９／７９２，０２４号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、および２００１年１２月２０日に出願された米国特許出願第１０／０３２，５８５号（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）（本発明の方法のいずれかで使用されうる増殖に必要とされる遺伝子および遺伝子産物を開示する）に記載される方法を用いて構築され得る。かかる方法では、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の染色体コピーの１つが不活性化される。例えば、遺伝子は、薬剤に対する耐性を提供するか、またはある特定の培養条件下での成長を可能にするポリペプチドのような選択可能または検出可能遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の挿入、あるいはヌクレオチド配列による置換により不活性化され得る。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の他の染色体コピーは、相同組換えにより調節プロモーターの制御下に置かれる。得られた株は、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を特定するために、および本発明の方法で使用され得る。
【０３７５】
例えば、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が調節プロモーターの制御下にある、二倍体細胞を構築する方法の１つを図６Ａおよび図６Ｂに示す。図６Ａおよび図６Ｂに示した方法では、必須カンジダ・アルビカンス遺伝子ＣａＫＲＥ９の染色体コピーの１つを、ＣａＫＲＥ９遺伝子に相同的な核酸配列がＡＣＴ−１プロモーターおよびＳＡＴ１遺伝子の３’末端にあるＰＣＫ１ターミネーター配列の制御下にあるＳＡＴ１遺伝子を含む核酸に隣接するカセットを用いて崩壊させる。カンジダ・アルビカンス内のエシェリヒア・コリＳＡＴ１遺伝子の存在により、薬剤のアセチル化を可能とし、薬剤を無毒化して、１ミリリットル当たり２００マイクログラムの濃度のストレプトスリシンの存在下で株が成長するのを可能にする。カンジダ・アルビカンス中のＳＡＴ１遺伝子の発現は、そのＤＮＡ配列がこの生物の遺伝コードに順応するように変更されるように遺伝子を操作することにより、ならびにＣａＡＣＴ１プロモーター(Morschhauser et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 257:412-420)およびＣａＰＣＫ１ターミネーター配列(Leuker et al. (1997) Gene 192:235-40)を提供することにより可能となる。この遺伝的に改変されたマーカーはＣａＳＡＴ１と呼ばれ、これは２００１年２月１６日に出願された同時係属中の米国特許出願第０９／７８５，６６９号（公開番号ＵＳ２００１−００３１７２４−Ａ１）（この開示は、その全体が参照により本明細書に援用される）の主題である。
【０３７６】
カンジダ・アルビカンスはまた、第２の殺真菌化合物であるブラストサイジンに対して感受性であり、バシラス・セレウス(Bacillus cereus)由来のその同族耐性遺伝子は、カンジダ・アルビカンスにおける発現のために同様に遺伝的に操作され（ＣａＢＳＲ１）、優性薬剤耐性表現型を付与することがわかった。崩壊されるべきカンジダ・アルビカンス遺伝子の配列５’および３’と同一の約６５ｂｐのフランキング配列を含むいずれかの優性選択可能マーカーのＰＣＲ増幅により、任意の所定のカンジダ・アルビカンス遺伝子用の遺伝子崩壊カセットの構築が可能となる。
【０３７７】
Baudin等(1993, Nucleic Acids Research 21:3329-30)の方法を用いることで、遺伝子崩壊現象が、ＰＣＲ増幅遺伝子崩壊カセットによるカンジダ・アルビカンス株の形質転換、および野生型遺伝子を優性選択可能マーカーで正確に置換させた薬剤耐性形質転換体に関する選択後に達成され得る。かかる突然変異株は、ストレプトスリシン（しかしこれに限定されない）のような薬剤の存在下における成長に関して選択され得る。生じた遺伝子崩壊は一般に、二倍体のカンジダ・アルビカンスにおいてヘテロ接合性であり、１つの相同染色体上の対立遺伝子対の１コピーが崩壊され、他の相同染色体上の他の対立遺伝子は、初期の親株に見られるように野生型対立遺伝子として残存する。崩壊対立遺伝子は非機能的であり、この対立遺伝子からの遺伝子の発現は皆無である。生物のゲノム中の遺伝子全てに関してこのプロセスを繰り返すことにより、遺伝子崩壊の組を生物中のあらゆる遺伝子に関して得ることができる。上記方法は遺伝子の望ましいサブセットにも適用させることができる。
【０３７８】
図６Ａおよび図６Ｂに示す方法では、カンジダ・アルビカンスＣａＫＲＥ９遺伝子の第２の染色体コピーは、置き換えられるべきプロモーター領域に相同的な核酸配列がＣａＨＩＳ３遺伝子（選択可能マーカーをコードする）、ＡＤＨターミネーター（ＣＡＨＩＳ３遺伝子の３’末端に存在する）、およびテトラサイクリン調節可能なプロモーター（以下に記載）を含む核酸に隣接するプロモーター置換カセットを用いて、調節可能なプロモーターの制御下に置かれる。
【０３７９】
テトラサイクリンの調節可能なプロモーター系は、最初はＳ．セレビシエのために開発されたが、カンジダ・アルビカンスで使用するために改変される。Gari et al., 1997, Yeast 13:837-848、およびNagahashi et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255:372-375を参照されたい。簡潔に言えば、条件発現は、まずＳ．セレビシエＧＡＬ４（アミノ酸７８５〜８８１）またはＨＡＰ４（アミノ酸４２４〜５５４）の転写活性化ドメインに融合されたエシェリヒア・コリＴｅｔＲテトラサイクリンレプレッサドメインまたはＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜２０７）を含む、トランス活性化融合タンパク質を構築することにより達成される。多重ＣＴＧコドン補正が導入されて、カンジダ・アルビカンス遺伝コードに従った。エシェリヒア・コリＴｅｔＲ（アミノ酸１〜２０７）＋Ｓ．セレビシエＧＡＬ４（アミノ酸７８５〜８８１）、ならびにエシェリヒア・コリＴｅｔＲ（アミノ酸１〜２０７）＋Ｓ．セレビシエＨＡＰ４（アミノ酸４２４〜５５４）のトランス活性化融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列はともに、カンジダ・アルビカンスにおける適正な発現のために改変された。
【０３８０】
カンジダ・アルビカンスにおけるトランス活性化タンパク質の構成的発現は、ＣａＡＣＴ１プロモーターおよびＣａＡＣＴ１ターミネーター配列を提供することにより達成することができる。しかしながら、融合タンパク質を発現させるのに、カンジダ・アルビカンスにおいて機能的である任意の調節領域、プロモーターおよびターミネーターを使用することができることが理解されよう。したがって、カンジダ・アルビカンスにおいて機能的なプロモーター、トランス活性化融合タンパク質のコード領域、およびカンジダ・アルビカンスにおいて機能的なターミネーターを含む核酸分子を用いて、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能なプロモーターの制御下にある細胞を得ることができる。かかる核酸分子は、プラスミド、コスミド、トランスポゾン、または可動性遺伝子要素であり得る。好ましい実施形態では、ＴｅｔＲ−Ｇａｌ４またはＴｅｔＲ−Ｈａｐ４トランス活性化因子は、ｕｒａ３およびｈｉｓ３栄養要求性マーカーのいずれかを用いることにより、カンジダ・アルビカンス株に安定に組み込むことができる。
【０３８１】
最初はＳ．セレビシエ遺伝子発現のために開発されたヘテロテトラサイクリンプロモーターは、ＡＤＨＩ ３’ターミネーター配列、可変数のテトラサイクリンオペレーター配列のコピー（２個、４個、または７個のコピー）、およびＣＹＣ１基底プロモーターを含有する。テトラサイクリンプロモーターは、所定の遺伝子のオープンリーディングフレームのすぐ上流に置かれる場合に、テトラサイクリンプロモーター依存性調節に好ましい配向性で、ＣａＨＩＳ３およびＣａＳＡＴ１選択可能マーカーの両方に隣接してサブクローニングされた。ＣａＨＩＳ３−ＴｅｔプロモーターカセットのＰＣＲ増幅により、標的遺伝子のヌクレオチド位置−２００および−１（開始コドンに対して）付近のプロモーター配列に相同的な６５ｂｐのフランキング配列が組み込まれ、それにより形質転換のための条件プロモーター置換断片が産生される。ＣａＳＡＴ１崩壊カセットを用いて、本明細書中に記載するように、ヘテロ接合体とされたカンジダ・アルビカンス株に形質転換されると、プロモーター置換断片と野生型対立遺伝子のプロモーターとの間での相同組換えにより、残存野生型遺伝子がテトラサイクリンプロモーターにより条件付きで調節される遺伝子である株が生成される。形質転換体は、Ｈｉｓ原栄養株として選択され、サザンブロットおよびＰＣＲ分析により確証される。
【０３８２】
図６Ａおよび図６Ｂに示した方法では、プロモーターは、テトラサイクリンの非存在下で誘導され、テトラサイクリンの存在下で抑制される。クロルテトラシクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メクロサイクリン、メトサイクリン、塩酸ミノサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、およびオキシテトラサイクリンを含むが、これらに限定されないテトラサイクリンの類縁体もまた、改変遺伝子対立遺伝子の発現を抑制するのに使用することができる。
【０３８３】
発現を促進するための抗生物質エフェクター分子の結合により活性化され（すなわち、その同族オペレーター配列に結合し）、かつ抗生物質エフェクターの非存在下で抑制される（すなわち、オペレーター配列に結合しない）、ｔｅｔＲ’と称される突然変異テトラサイクリンレプレッサ（ｔｅｔＲ）分子に基づいたテトラサイクリンプロモーター系の代替的変異体を、野生型ｔｅｔＲの代わりに、あるいはｔｅｔＲに加えて使用してもよい。例えば、上記方法は、発現が薬剤輸送に関与する遺伝子（例えば、ＣａＣＤＲ１、ＣａＰＤＲ５、またはＣａＭＤＲ１）が遮断されているような、テトラサイクリンの非存在条件下において抑制されるのが望ましい場合に、ｔｅｔＲの代わりにｔｅｔＲ’を用いて実施することができる。また、上記方法は、抗生物質エフェクター分子の存在下で発現を高めるか、またはさらに抑制するために、ｔｅｔＲが活性化ドメインに融合され、ｔｅｔＲ’が一般的なレプレッサ（例えば、ＣａＳｓｒ６またはＣａＴｕｐ１）に融合された二重活性化／レプレッサ系においてｔｅｔＲおよびｔｅｔＲ’分子の両方を組み込むように適応させることができる(Belli et al., 1998, Nucl Acid Res 26: 942-947、これは参照により本明細書に援用される）。条件発現を提供するこの方法もまた意図される。
【０３８４】
上記方法はまた、対立遺伝子の組換えによる遺伝子の単一対立遺伝子を、ヘテロプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含むプロモーター置換断片で改変することにより一倍体生物に適用させてもよく、その結果遺伝子の発現は、ヘテロプロモーターにより条件付きで調節される。一倍体病原体生物における好ましい遺伝子サブセット、またはその全ゲノムに関してこのプロセスを繰り返すことにより、条件付き突然変異株の収集物または完全な組を得ることができる。好ましい遺伝子サブセットは、他の生物（例えばカンジダ・アルビカンスおよびＳ．セレビシエ）の標的遺伝子と実質的なヌクレオチド配列相同性を共有する遺伝子を含む。例えば、上記方法は、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、黒色アスペルギルス (Aspergillus niger)、黄色アスペルギルス(Aspergillus flavis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、コクシジオイデス・イムミチス(Coccidioides immitis)、エキソファリア・ダーマティディティス(Exophalia dermatiditis)、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、ニューモシスティス・カリーニー(Phneumocystis carinii)、トリコスポロン・ベイゲリイ(Trichosporon beigelii)、リゾープス・アルヒズス(Rhizopus arrhizus)、ムコール・ロウキシイ(Mucor rouxii)、リゾムコール・プシスル(Rhizomucor pusillus)、またはアブシディア・コリムビゲラ(Absidia corymbigera)のような動物真菌病原体、またはボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)、エリシフェ・グラミニス(Erysiphe graminis)、マグナポルテ・グリセア(Magnaporthe grisea)、プシニア・レコディタ(Puccinia recodita)、セプトリア・トリチシイ(Septoria triticii)、チレチア・コントロベルサ(Tilletia controversa)、ウスチラゴ・マイディス(Ustilago maydis)のような植物真菌病原体、あるいは上記種のいずれかの属の範疇にある任意の種を含むが、これらに限定されない一倍体真菌病原体に適用させてもよい。同様に、上記方法は、上記細菌種および属を含む細菌に適用させてもよい。
【０３８５】
条件発現を達成するための手段はテトラサイクリンプロモーター系に制限されず、他の条件プロモーターを用いて実施することができることが理解されよう。かかる条件プロモーターは、例えば、特定の条件下でプロモーターからの転写を抑制するレプレッサにより、あるいは例えば誘導物質の存在下にある場合、プロモーターからの転写を増加するトランス活性化因子により調節され得る。例えば、カンジダ・アルビカンスＣａＰＣＫ１プロモーターは、グルコースの存在下では転写されないが、コハク酸塩のような他の炭素源上で成長させた細胞において高発現レベルを有し、したがって、改変対立遺伝子の条件発現に採用することもできる。この目的のために、ＣａＨＩＳ１およびＣａＳＡＴ１の両方が、上記説明におけるテトラサイクリンプロモーターに対する代替物としてＣａＰＣＫ１プロモーターを用いてグルコース含有培地で成長させるのに必須であることがわかっている。この場合は、ＣａＰＣＫ１プロモーターは、発現される遺伝子にとって異種であり、生物にとっては異種ではなく、かかるヘテロプロモーターもまた本発明に含まれる。テトラサイクリンプロモーターを機能的に置き換えることができる代替的プロモーターとしては、他の抗生物質ベースの調節可能プロモーター系（例えば、プリスチナマイシン誘導性プロモーター、すなわちＰＩＰ）、ならびにカンジダ・アルビカンス条件付き調節プロモーター（例えば、ＭＥＴ２５、ＭＡＬ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、１０、ＳＴＥ２、またはＳＴＥ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３８６】
必須ではないが、まず遺伝子崩壊を実施し、ヘテロ接合性株を構築し、薬剤標的確証プロセス中のヘテロ接合体株収集物として別々に収集することができる。所定の遺伝子に関するヘテロ接合性株は、およそ半分の正常一倍体レベルの特定遺伝子産物を発現する。したがって、これらの株は、低減されたレベルのコードされた遺伝子産物を有する構築物を提供し、これらの株は、本明細書中に記載される方法で使用され得る。しかしながら、本発明のこの実施形態で採用されている対立遺伝子改変の手順の順序は重要でなく、条件発現対立遺伝子をまず構築し、続いて残存野生型対立遺伝子を崩壊するなど、種々の順序でこれらの工程を実施することが可能であることが、当業者には明らかである。しかしながら、プロモーター置き換え工程が最初に実施される場合、遺伝子崩壊工程で使用される配列に相同的な配列を欠失させることが好ましい。
【０３８７】
あるいは、条件発現は、条件プロモーターに依存する手段以外の手段により達成することができる。例えば、条件発現は、一倍体またはヘテロ接合性株における野生型対立遺伝子を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで得られる温度感受性対立遺伝子で置換することにより達成することができ、次に、それらの表現型を非許容温度で解析する。関連するアプローチでは、ヘテロ接合性株において、活性化条件中に遺伝子産物を不安定化するための、残存野生型対立遺伝子へのユビキチン化シグナルの挿入は、遺伝子不活性化に起因する表現型の影響を検査するのに採択され得る。
【０３８８】
別の代替法では、切除可能なトランス活性化因子により調節される構成的プロモーターを使用することができる。プロモーターは、プロモーターに特徴的な基底レベルにまで発現を抑制するために、標的遺伝子に対して上流に置かれる。例えば、株が真菌生物である場合、ｌｅｘＡオペレーター要素を含有する異種プロモーターはｌｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインおよび任意の転写活性化因子ドメイン（例えば、ＧＡＬ４、ＨＡＰ４、ＶＰ１６）から構成される融合タンパク質と併用して、標的遺伝子の構成的発現を提供してもよい。５−ＦＯＡにより媒介される対抗選択を用いて、融合タンパク質をコードする遺伝子を切除した細胞を選択することができる。この手順により、機能的転写活性化因子の非存在下で、ｌｅｘＡ異種プロモーターにより提供される基底レベルへの標的遺伝子の発現の抑制に関連した表現型の検査が可能となる。このアプローチにより生成される株は、本発明で使用され得る。
【０３８９】
あるいは、標的遺伝子の条件発現は、ＤＮＡ結合転写活性化因子ドメインを含有するトランス活性化因子を用いることなく達成することができる。カセットは、標的遺伝子の５’部分に相同的な配列を含有する直列反復配列と隣接した、例えばＵＲＡ３選択可能マーカーの下流にある異種構成プロモーターを含有するように構築され得る。標的の上流にあるさらなる相同配列は、このカセットに付加されると、天然プロモーターの、標的遺伝子の開始コドンまたはオープンリーディングフレームのすぐ上流にある上述の異種プロモーターカセットによる相同組換えおよび置換を促進する。条件発現は、異種構成的プロモーターおよびＵＲＡ３マーカーを切除した（したがって、遺伝子の発現に必要とされる標的遺伝子の上流にある調節配列を欠如する）株を５−ＦＯＡ含有培地を用いることで選択し、同一条件下で成長させた野生型株に対する得られた株の成長を検査することにより達成される。
【０３９０】
標的遺伝子ＣａＫＲＥ９の改変対立遺伝子を構築するのに使用される場合の上記方法の特定の用途を以下の実施例１０に提供する。
【実施例１０】
【０３９１】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能プロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株の構築
工程１（すなわち、遺伝子置換）で使用されるＳＡＴ選択可能マーカーのＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＲＣ−ＡＳＰにおけるＳＡＴ崩壊カセットに相補的な２５個のヌクレオチド、およびＣａＫＲＥ９オープンリーディングフレームに隣接する領域に相同的な６５個のヌクレオチドを含有する。図６Ａおよび図６Ｂは、遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能プロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株を構築する手順を示す。図６Ａおよび図６Ｂが示すように、２．２ｋｂのｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ崩壊断片は、ＰＣＲ増幅および形質転換後の相同組換えによる第１の野生型ＣａＫＲＥ９対立遺伝子の生じた遺伝子置換後に生じた。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：ｐＲＣ１８−ＡＳＰ ５〜５０ｎｇ、各プライマー１００ｐｍｏｌ、２００μＭ ｄＮＴＰ、１０ｍＭ トリス−ｐＨ８．３、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５０ｍＭ ＫＣｌ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Gibco)１ユニット。ＰＣＲ増幅は、５分 ９４℃、１分 ５４℃、２分 ７２℃を１サイクル、４５秒 ９４℃、４５秒 ５４℃、２分 ７２℃を３０サイクルであった。形質転換は、BraunおよびJohnson(Braun, B.R., and A.D. Johnson(1997), Control of filament formation in Candida albicans by the transcriptional repressor TUP1, Science 277:105-109)に従って、カンジダ・アルビカンスに適応させるためにわずかに変更（３０℃および４２℃でのより短いインキュベート時間（それぞれ１時間および５分）、ならびに形質転換される物質のより多い量（エタノール沈殿したｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ ＰＣＲ産物５０μｇ）を含む）した酢酸リチウム法を用いて実施した。形質転換した細胞をＹＰＤプレート上へ延展して、３０℃で一晩インキュベートし、ＳＡＴの発現のためのプレインキュベーション時間を提供し、その後ストレプトスリシン（４００μｇ／ｍｌ）を含有するＹＰＤ培地上へのレプリカ平板法を行った。ストレプトスリシン耐性コロニーは、３６時間後に検出され、ｃａｋｒｅ９Δ：ＳＡＴ／ＣａＫＲＥ９ヘテロ接合体は、ＣａＫＲＥ９およびｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ対立遺伝子の両方を増幅する適切なプライマーを用いたＰＣＲ分析により特定された。
【０３９２】
工程２（プロモーター置換）で使用される条件プロモーターのＰＣＲ増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐＢＳＫ−ＨＴ４におけるＣａＨＩＳマーク付きテトラサイクリン調節プロモーターカセットに相補的な２５個のヌクレオチド、および転写開始点に対して−２７０〜−２０５のプロモーター領域に相当する相同配列の６５個のヌクレオチド、およびＣａＫＲＥ９オープンリーディングフレームのヌクレオチド１〜６５を含有する。生じた２．２ｋｂのＰＣＲ産物を、工程１で産生したｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ／ＣａＫＲＥ９ヘテロ接合性株に形質転換して、Ｈｉｓ+形質転換体をＹＮＢ寒天上で選択した。ｃａｋｒｅ９Δ：：ＳＡＴ対立遺伝子およびＣａＨＩＳ３−Ｔｅｔ−ＣａＫＲＥ９対立遺伝子の両方を含有する真正ＣａＫＲＥ９株をＰＣＲ分析により決定した。通常、２個の別個の株を構築して評価し、任意の所定の薬剤標的の最終的な表現型について信頼性の高い決定をする。最終的な表現型は、必須遺伝子の遺伝子産物の非存在により引き起こされる表現型である。
【０３９３】
生じた株の表現型を以下のように評価した。
【実施例１１】
【０３９４】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が、調節可能なプロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株の表現型の評価
３つの別個の方法を用いて、ＣａＫＲＥ９遺伝子の１コピーが崩壊され、他方の１コピーが調節可能なプロモーターの制御下にあるカンジダ・アルビカンス株の表現型を評価した。最初に、ＹＮＢプレート、および１００μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含有するＹＮＢプレートの両方の上に、およそ１．０×１０6個の細胞を画線(streak)して、室温で４８時間後の成長速度を比較することにより、株の最終的な表現型を迅速に決定した。ＣａＫＲＥ９のような必須遺伝子に関して、テトラサイクリンの存在下では有意な成長は検出されない。第２のアプローチでは、テトラサイクリンプロモーター調節標的遺伝子の発現に通常必要とされるトランス活性化因子遺伝子が（標的化組み込み中に創出されるＣａＬＥＵ２配列複製間の組換えにより）切除されたｕｒａ-細胞を選択するために、６２５μｇ／ｍｌ ５−フルオロ酸(flororotic acid)（５ＦＯＡ）および１００μｇ／ｍｌ ウリジンを含有するカザミノ酸プレート上に細胞を画線することにより、遺伝子の本質的性質が決定され得る。また、増殖に必要とされない遺伝子の１コピーが崩壊され、他のコピーが調節可能なプロモーターの制御下にある株がかかる条件下で活発な成長を示すのに対して、上述のように調製したＣａＫＲＥ９株は成長できない。ＣａＫＲＥ９株と関連した最終的な表現型の定量的評価は、１００μｇ／ｍｌ テトラサイクリンを補充しないＹＮＢ５．０ｍｌ、またはそれを補充したＹＮＢ５．０ｍｌに接種した２×１０3個の細胞／ｍｌの一晩培養物を用いて、３０℃での２４時間および４８時間のインキュベーション後に、光学密度（Ｏ．Ｄ．600）を測定することにより実施される。通常、増殖に必要とされる遺伝子が誘導プロモーターの制御下にある株に関して、光学密度の有意な増加が、誘導物質の非存在下で４８時間後に検出されることはない。実証した必須遺伝子に関する細胞死（殺傷性(cidal)）と成長阻害（静止(static)）の最終的な表現型の区別は、２４時間および４８時間のインキュベーション後の上記テトラサイクリン処理培養物からの生存細胞（Ｔ＝０での２×１０3個の洗浄細胞の等価物からのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）の数により判断されるような）の割合を決定することにより達成される。殺傷性の最終的な表現型をもたらす株は、抑制条件下におけるインキュベーション後に生存細胞の割合の減少（すなわち、２×１０3個ＣＦＵ未満）を示す株である。
【０３９５】
テトラサイクリンで調節可能なプロモーターの制御下にある遺伝子産物レベルの変動を決定するために、実施例１２に記載する実験を実施した。
【実施例１２】
【０３９６】
誘導条件および抑制条件下での標的レベルの変動
ＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株、およびＣａＨＩＳ３遺伝子の染色体の１コピーが崩壊され、他方が調節可能なプロモーターの制御下にあるテトラサイクリンプロモーター調節ＣａＨＩＳ３株の両方を、３−アミノトリアゾール（３−ＡＴ）に対する感受性に関して野生型（二倍体）ＣａＨＩＳ３株と比較した（図７Ａ〜図７Ｄ）。３−ＡＴとは、ＣＡＨＩＳ３によりコードされる酵素であるイミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼの競合阻害剤であり、ともにそれぞれ薬剤のモデルおよび薬剤標的として作用する。テトラサイクリンプロモーターにより維持されるＣａＨＩＳ３の構成的発現レベルにより達成される過剰発現は、野生型およびＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株の両方の成長を完全に阻害するのに十分な濃度で３−ＡＴ耐性を付与する（図７Ａ）。観察される表現型は、ノーザンブロット分析により決定されるＣａＨＩＳ３の予測７．５倍過剰発現を考慮して予測されたものと一致している（図８を参照）。ヘテロ接合性ＣａＨＩＳ３株は、野生型またはテトラサイクリンプロモーターベースの過剰産生ＣａＨＩＳ３株のいずれかに顕著に影響を及ぼすことが不可能な中程度の３−ＡＴ濃度に対して感受性の増加（すなわち、ハプロ不全表現型）を示す（図７Ｂ）。３−ＡＴに対する差次的感受性に関して評価した第３のＣａＨＩＳ３発現レベルは、完全な遮断を達成するのに通常使用されるテトラサイクリン０．１％の閾値濃度を用いて、テトラサイクリン調節株の部分的抑制によりもたらされた。
【０３９７】
このＣａＨＩＳ３発現のレベルは、生育に必要とされる最小発現レベルを表し、予想通り、中程度の３−ＡＴ濃度でヘテロ接合性ＣａＨＩＳ３株に対して薬剤感受性の増加を示す（図７Ｃ）。同様に、フルコナゾールおよびツニカマイシンに対する株特異的薬剤耐性および感受性表現型は、それらのそれぞれ既知の薬剤標的であるＣａＥＲＧ１１およびＣａＡＬＧ７の発現レベルの増加および減少により示された。ともにこれらの結果は、３つの異なる発現レベルがカンジダ・アルビカンス株収集物を用いて達成され、それらは、既知の薬剤とそれらの既知の薬剤標的との間の予測薬剤感受性表現型を示すことを実証する。
【実施例１３】
【０３９８】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードするカンジダ・アルビカンス遺伝子の特定
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードするカンジダ・アルビカンス遺伝子は、上述のように遺伝子の染色体の１コピーが崩壊され、遺伝子の他の染色体コピーが調節可能なプロモーターの制御下にある株を構築することにより特定される。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を特定するために、遺伝子の改変対立遺伝子を含有する株を、条件発現下にある遺伝子の第２の改変対立遺伝子が実質的に過小発現されるか、または発現されない条件下で培養した。株の生存度および／または成長を、同じ条件下で培養した野生型株の生存度および／ｍまたは成長と比較した。生存度もしくは成長の損失または低減は、遺伝子によりコードされる遺伝子産物が増殖に必要とされることを示した。上述に記載するようにして調製した株が遺伝子を発現するレベルは、非改変対立遺伝子の５０％未満、３０％未満、２０％未満、好ましいくは１０％未満であり得る。使用される異種プロモーターに応じて、発現レベルは、例えば抗生物質、金属イオン、特定の化学物質、栄養分、ｐＨ、温度等により制御され得る。
【０３９９】
例えば、上述の方法を用いたカンジダ・アルビカンス条件遺伝子発現は、ＣａＫＲＥ１、ＣａＫＲＥ５、ＣａＫＲＥ６、およびＣａＫＲＥ９を用いて実施された（図９）。ＣａＫＲＥ５、ＣａＫＲＥ６、およびＣａＫＲＥ９は、Ｕｒａブラスター法を用いた遺伝子崩壊により実証されるように、カンジダ・アルビカンスにおいて必須であるか、または条件付きで必須であることが予測される（ＣａＫＲＥ９ヌル株は、グルコース上で生存不可能であるが、ガラクトース上では生存可能である）。ＣａＫＲＥ１は、カンジダ・アルビカンスにおいて、Ｕｒａブラスター法を用いて非必須遺伝子として実証されている。上記遺伝子に関してヘテロ接合性株は、ＣａＳＡＴ１崩壊カセットを用いたＰＣＲベースの遺伝子崩壊方法、続いて野生型対立遺伝子の天然プロモーターのテトラサイクリン調節プロモーター置換により構築された。これらの株がそれぞれ活発に成長することは、テトラサイクリンの非存在下で発現が正常に進行することを示唆する。テトラサイクリンが成長培地に添加されると、これらのテトラサイクリンプロモーター調節遺伝子の発現は有意に減少されるか、または発現しなくなる。テトラサイクリンの存在下では、上記の３つの必須のカンジダ・アルビカンス遺伝子それぞれが調節可能なプロモーターの制御下にある株は成長が止まった。予想通り、ＣａＫＲＥ１株のみが、ＣａＫＲＥ１発現の抑制にもかかわらず活発な成長を示す。
【０４００】
標的の確証における上記方法の有用性をさらに検査するために、４つの既知の必須遺伝子ＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ７、ＣａＡＵＲ１、およびＣａＦＫＳ１、ならびに予測必須遺伝子ＣａＳＡＴ２、およびＣａＫＲＥ１の発現が調節可能なプロモーターの制御下にある株の成長を、誘導条件下と抑制条件下とで比較した（図１０）。予想通り、ＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ７、ＣａＡＵＲ１、およびＣａＦＫＳ１が調節可能なプロモーターの制御下にある株は、非必須遺伝子ＣａＫＲＥ１が調節可能プロモーターの制御下にある株と異なり、抑制条件下で成長することはできなかった。さらに、予想通り、ＣａＳＴＡ２遺伝子が調節可能プロモーターの制御下にある株は、カンジダ・アルビカンスにおいてこの遺伝子が不可欠であることを示す。カンジダ・アルビカンスにおいて使用するための優性選択可能マーカーとして操作されたＣａＳＡＴ２遺伝子は、Ｓ．セレビシエ遺伝子に相同的であるが、エシェリヒア・コリのＳａｔ１遺伝子に無関係であるカンジダ・アルビカンス遺伝子である。
【０４０１】
生成された他の崩壊データに基づくすべての場合に、テトラサイクリン調節遺伝子がテトラサイクリンの存在下で非機能的であるレベルに抑制されることは、予測される応答である。さらに、Ｓ．セレビシエ対応物が必須でないことが既知である２つのさらなるカンジダ・アルビカンス遺伝子（ＣａＹＰＤ１、およびＣａＹＮＬ１９４ｃ）に、条件遺伝子崩壊の上記方法論を適用する際に、これらの株がテトラサイクリンの存在下でインキュベートされる場合に成長阻害は観察されなかった。これらの結果は、条件遺伝子発現の上記方法が遺伝子不可欠性に関して信頼性の高い指標であることを示す。
【０４０２】
さらに、カンジダ・アルビカンスにおける必須遺伝子の完全組を特定するための迅速かつ正確な手段であるこの方法の有用性は、遺伝子崩壊および条件発現の上記２工程方法を用いた、多数の遺伝子のヌル表現型の分析により実証された。標的遺伝子は、真菌特異的かつ必須であるとして選択された。かかる遺伝子は、以下に記載するスクリーニングアッセイにおける標的必須遺伝子と称される。
【０４０３】
文献検索により、総計８９個の遺伝子に関するＵＲＡブラスターベースの遺伝子崩壊実験の報告を特定し、ホモ接合性欠失株を構築することができないことに基づいて総計８９個の遺伝子のうちの１３個の遺伝子を必須であると推定した。１３個の遺伝子は、ＣａＣＣＴ８(Rademacher et al., Microbiology, UK 144, 2951-2960 (1998))、ＣａＦＫＳ１(Mio et al., J. Bacteriol, 179, 4096-105 (1997)、およびDouglas, et al., Antimicrob Agents Chemother 41, 2471-9 (1997))、ＣａＨＳＰ９０(Swoboda et al., Infect Immun 63, 4506-14 (1995))、ＣａＫＲＥ６(Mio et al., J. Bacteriol 179, 2363-72 (1997))、ＣａＮＭＴ１(Weinberg et al., Mol Microbiol 16,241-50 (1995))、ＣａＰＲＳ１(Payne et al., J. Med. Vet. Mycol. 35, 305-12 (1997))、ＣａＰＳＡ１(Care et al., Mol Microbiol 34, 792-798 (1999))、ＣａＲＡＤ６(Care et al., Mol Microbiol 34, 792-798 (1999))、ＣａＳＥＣ４（Mao et al., J. Bacteriol 181, 7235-7242 (1999))、ＣａＳＥＣ１４(Monteoliva et al., Yeast 12, 1097-105 (1996))、ＣａＳＮＦ１(Petter et al., Infect Immun. 65, 4909-17 (1997))、ＣａＴＯＰ２(Keller, et al., Biochem J., 329-39 (1997))、およびＣａＥＦＴ２(Mendoza et al., Gene 229, 183-1991 (1999))である。これらの１３個の推定必須遺伝子、ならびにカンジダ・アルビカンスのＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ１、およびＣａＡＵＲ１は、上記方法によって最初は特定されない。しかしながら、これらの１７個の遺伝子のいずれか１つが調節可能なプロモーターの制御下にある株（例えば、図１０のＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ１、およびＣａＡＵＲ１株、ならびに図９のＣａＫＲＥ６株）は、本発明の方法で使用され得る。これらの１７個の遺伝子のいずれかは、上述の方法における比較対照として、あるいは必須遺伝子の収集における不可欠性に関する陽性対照として含まれてもよい。これらの１７個の遺伝子のいずれかに対応するヌクレオチド配列を含む核酸分子は、薬剤標的として本発明の方法において使用されてもよく、あるいはそれらは、キット中または核酸マイクロアレイ中の対照として、別個にあるいはサブグループに含まれてもよい。
【０４０４】
上述に記載するような方法を用いて、配列番号１４９４５〜１５７７８のポリペプチドをコードする配列番号１４１１１〜１４９４４の遺伝子は、増殖に必要であると特定された。本明細書の最後に提供した表ＶＩＩに、それらのカンジダ属名称とともに特定遺伝子の配列番号を列挙する。表ＶＩＩに示されるカンジダ属名称は、特定カンジダ・アルビカンス遺伝子に相同的であるサッカロミセス・セレビシエ遺伝子を特定することにより系統立てられた。カンジダ属名称はまた、サッカロミセス・セレビシエゲノムにおける相同サッカロミセス・セレビシエ遺伝子の位置を参照して記載している。例えば、カンジダ名称ＣａＹＡＬ０３８Ｗは、相同サッカロミセス・セレビシエ遺伝子が酵母染色体１（例えば、ＹＢは酵母染色体２を意味する）、セントロメアの左アーム（Ｒはセントロメアの右アームを意味する）、位置０３８、ワトソン鎖に関するｗ（クリック鎖に関するｃ）上に存在していたことを意味する。相同サッカロミセス・セレビシエ遺伝子は、genome-www.stanford.edu/saccharomycesから特定された。配列番号１４１１１〜１４９４４の遺伝子、配列番号１４１１１〜１４９４４に相補的な核酸、または配列番号１４９４５〜１５７７８のポリペプチドに対する相同性を有する相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、および相同ポリペプチドは、上述の方法のいずれかを用いて特定され得る。
【０４０５】
上述のように構築される株の改変遺伝子の不可欠性を評価するために、代替的方法が利用可能である。上述のように構築された株内の改変遺伝子対立遺伝子の発現の抑制は、トランス活性化因子タンパク質をコードする遺伝子の相同組換え媒介性切除により可能である。例えば、標的遺伝子の条件発現がテトラサイクリン調節プロモーターを用いて達成される場合、構成的発現（非抑制条件下）は、トランス活性化因子遺伝子（ＴｅｔＲ−ＧＡＬ４ＡＤ）の相同組換え媒介性切除により抑制され得る。このようにして、無条件に達成可能な抑制レベルは、トランス活性化因子タンパク質のテトラサイクリン媒介性不活性化により産生されるレベルとは別個に産生される。トランス活性化因子遺伝子の切除は、株構築に使用される選択可能マーカーおよび組み込み戦略により可能となる。ＴｅｔＲ−ＧＡＬ４ＡＤトランス活性化因子遺伝子を含有するＣａＵＲＡ３マーク付きプラスミドの、ＣａＬＥＵ２遺伝子座への安定な組み込みは、組み込まれたプラスミドに隣接するＣａＬＥＵ２のタンデム複製をもたらす。続いて５−ＦＯＡ含有培地上での対抗選択を実施して、ＣａＵＲＡ３マーク付きトランス活性化因子遺伝子の切除に関して選択し、この代替的な抑制戦略により標的遺伝子は必須であることがわかるかどうかを直接検査することができる。
【０４０６】
５−ＦＯＡ含有培地上で必須であると特定されたが、テトラサイクリン補充培地上で任意の検出可能な成長障害のない遺伝子の例は、遺伝子ＣａＹＣＬ０５２ｃ、ＣａＹＮＬ１９４ｃ、およびＣａＹＪＲ０４６ｃの３つである。おそらくこれは、テトラサイクリンの添加により不完全に不活性化される遺伝子産物よりも、トランス活性化因子遺伝子が完全に排除された条件下でより低い基底レベルの発現を示す標的遺伝子に起因する。したがって、上述の方法は、所定の遺伝子が宿主株の生存に必須であるかどうかを決定するための２つの別個のアプローチを提供する。
【実施例１４】
【０４０７】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現または過小発現することが可能な細胞を生成するためのプロモーター置換
プロモーター置換のための標的を選択する。プロモーター置換カセットは、ｒｒｎＢターミネーターおよびｌａｃプロモーターがＣＡＴ遺伝子の３’に位置するように、ｐＡＣＹＣ１８４に、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２転写ターミネーター、続いてｌａｃプロモーターを含む核酸を挿入することにより得られる。プロモーター置換カセット（ＣＡＴ−ｒｒｎＢＴ１Ｔ２−ｐｌａｃ）はＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ産物は、標的プロモーター（すなわち、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を誘導するプロモーター）に対する相同性を有する６０〜８０ｂｐ、および上述のようにＣＡＴ／ｒｒｎＢＴ１Ｔ２／ｐｌａｃテンプレートに対する相同性を有する２０ｂｐを有するプライマーを用いた別のラウンドのＰＣＲのためのテンプレートとして使用される。相同性を有する領域は、相同組換え時に、ＣＡＴ／ｒｒｎＢＴ１Ｔ２／ｐｌａｃカセットが標的遺伝子のプロモーターを置換するが、そのShine-Delgarnoモチーフは影響を受けない状態にしておくように選択される。
【０４０８】
プロモーター置換カセットは、コンピテントＪＣ８６７９に形質転換される。ＪＣ８６７９は、E. coli genetics stock centerから入手可能である。ＪＣ８６７９は、短い線状ＤＮＡの組換えを可能とし、またｌａｃプロモーターの滴定調節を可能とするｌａｃＹ突然変異を含有する。様々なレベルのＩＰＴＧを含有するＬＢ／クロラムフェニコールプレート上に形質転換細胞を蒔き、正確なレベルの発現が達成されることを保証し、生存可能とする。プロモーター置換カセットが正確に組み込まれたかどうかは、コロニーＰＣＲにより確認される。望ましい場合、挿入プロモーターによる標的遺伝子の適正な調節は、誘導物質が存在しないか、またはもとのコロニーが得られるレベルよりも低レベルで存在する場合に、成長欠陥に関して組み込み体を試験することにより確認され得る。誘導物質（ＩＰＴＧ）の非存在下、またはクローンを得るのに使用されたよりも低レベルの誘導物質の存在下で成長することができないことにより、標的遺伝子が挿入プロモーターにより適正に調節されることが確認される。ｌａｃプロモーターおよび株ＪＣ８６７９を例として使用しているが、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現または過小発現することが可能な細胞を生成するために、上記方法は、任意の適切な調節可能プロモーターおよび生物または株を用いて実施することもできることが理解されよう。
【実施例１５】
【０４０９】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現または過小発現することが可能な細胞を生成するためのオペレーター挿入
それぞれの側に標的プロモーターに相同的な４０個のヌクレオチドが隣接したｌａｃオペレーターを含むオリゴヌクレオチドを設計する。標的プロモーターは、オペロン中のｙａｂＢ ｙａｂＣ ｆｔｓＬ ｆｔｓＩ ｍｕｒＥ遺伝子のような増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。オリゴヌクレオチド配列（配列番号１５８１０）およびプロモーターに相同的な領域の位置を図１１に示す。プロモーターの配列はまた、示した−１０領域および−３５領域の位置ととともに示されている（配列番号１５８１１）。一本鎖オリゴヌクレオチドを、λ ＢｅｔａおよびＧａｍタンパク質を発現する細菌に形質転換する。形質転換混合物中の細胞を希釈して、ＩＰＴＧを含有する培地上で平板培養する。ｌａｃオペレーターが標的プロモーターに組み込まれたコロニーを、コロニーＰＣＲにより特定する。望ましい場合、挿入オペレーターによる標的プロモーターの適正な調節は、ＩＰＴＧを含有するか、またはＩＰＴＧを含有しない培地中で特定されたコロニーを成長させることにより確認される。コロニーは、ＩＰＴＧを含有する培地上で増殖するが、ＩＰＴＧを含有しない培地上では成長することができず、それにより標的プロモーターが挿入オペレーターにより適正に調節されることを確認する。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を過剰発現または過小発現する細胞を生成するために、上述の方法は、任意の標的プロモーターおよび任意のオペレーターを用いて実施することができることが理解されよう。
【０４１０】
本発明の方法において、増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株は、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定するか、または化合物の活性をプロファイリングするために使用される。実施例１６〜１８は、増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する細胞を用いて、生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法について記載している。
【実施例１６】
【０４１１】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を過剰発現する株は、高い抗生物質濃度において成長することが可能である
増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する細胞が高い抗生物質濃度において成長することが可能であることを確認するために、既知の抗生物質の標的であるスタフィロコッカス・アウレウス由来の１１個の遺伝子を、以下のように上述のキシロース誘導性プロモーターＸｙｌＴ５に作動可能に連結した。遺伝子、およびこれらの遺伝子の産物を標的とする抗生物質を以下の表Ｖに列挙する。
【０４１２】
表Ｖに示すようにスタフィロコッカス・アウレウスの増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする１１個の遺伝子それぞれに関して、ＰＣＲプライマー対を設計した。各遺伝子用の上流プライマーは、天然リボソーム結合部位（Ｓ−Ｄ配列）を含んでいた。さらに、遺伝子の指向性クローニングを促進するために、適切な制限酵素用の制限部位をプライマーに設計した。ＰＣＲ反応は、反応容量５０μｌ当たり、以下の条件（Ｐｆｕポリメラーゼ２Ｕ、ｄＮＴＰ ２００μＭ、プライマーそれぞれ４００ｎＭ、スタフィロコッカス・アウレウスＲＮ４５０ゲノムＤＮＡ（テンプレート）５〜１０ｎｇ）下で、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ(Stratagene, San Diego)を用いて実施した。反応は、９４℃で５分間の初期加熱、続いて９４℃で３０秒／５５℃で３０秒／７２℃で５分間を２５サイクル、および７２℃での伸長を７分で終了という条件で行った。
【０４１３】
増幅遺伝子を、以下のようにＸｙｌＴ５プロモーターに作動可能に連結した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲクリーニングキットを用いて精製し、続いて適正な制限酵素を用いて消化した。得られた断片を、ＸｙｌＴ５プロモーターを含有するプレカットベクターＤＮＡと１６℃で一晩連結させた。連結混合物を、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムの存在下で−８０℃で２０分間エタノール沈殿した。沈殿ＤＮＡを４℃にて３０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心沈殿させ、７０％ＥｔＯＨ１ｍｌで洗浄した。ＤＮＡペレットを風乾し、ＥＢまたは滅菌水中に溶解した。スタフィロコッカス・アウレウス細胞を形質転換するために、沈殿ＤＮＡをエレクトロポレーションコンピテント細胞４５μｌと混合して、室温で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ／細胞混合物を、２ｍｍキュベット中でエレクトロポレートし（設定：２ボルト、２５μＦ、２００Ω）、０．２μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＢ２培地４５０μｌと混合した。細胞を振とうしながら３７℃で９０分間インキュベートした。形質転換細胞を、プラスミド選択のためにクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレート上へ蒔いた。各クローニング反応のための幾つかのコロニーを採取し、画線して、純粋な培養物を得た。ベクター特異的プライマーを用いたコロニーＰＣＲ反応を実施して、挿入物の大きさと独自性を確認した。
【０４１４】
遺伝子歩行(gene-walking)配列決定を用いて、各クローニングされた遺伝子の幾つかのクローンに関して全挿入物を完全に配列決定した。ＰＣＲプロセス中にＤＮＡ配列が突然変異されたクローン化遺伝子を使用することを回避するためにこれを実施した。
【０４１５】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子が適正な誘導物質レベルでの誘導時にそれらの特定の阻害剤に対する耐性を付与することができることを実証するために、その遺伝子がキシロース誘導性プロモーターに作動可能に連結された各クローンの細胞を、種々の抗生物質濃度および誘導物質濃度の組合せで、クロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を有するＬＢ培地中で成長させた。これは、１０倍過剰量でマトリックスフォーマットにおいて勾配濃度で抗生物質および誘導物質を含有するマイクロタイタープレート（９６または３８４ウェル）を用いて達成された（図１２を参照）。播種した細胞を含む培地（９倍容量）を、５０μｌ（３８４ウェルプレートに関して）または２００μｌ（９６ウェルプレートに関して）の最終容量のために、抗生物質／誘導物質１倍容量を含有するウェルに分配した。プレートを周期的に振とうしながら３７℃でインキュベートし、細胞の成長を、Ｕｌｔｒａｍａｒｋリーダーを用いてＯＤ６００での光学密度の自動測定によりモニタリングした。有意な成長が、適切な誘導物質濃度において特定濃度の抗生物質が存在する条件下では観察されたが、その特定の抗生物質濃度において誘導物質が非存在である条件下では観察されなかった場合、特定の遺伝子を過剰発現するクローンをその特定抗生物質（阻害剤）に対して耐性であるとした。
【０４１６】
結果を図１３および図１４に示す。図１３に示すように、適切な濃度の誘導物質においてｄｅｆＢ遺伝子産物を過剰発現する細胞は、ｄｅｆＢ遺伝子産物に作用する高濃度の抗生物質アクチノニンで成長することが可能であった。同様に、図１４に示すように、適切な濃度の誘導物質においてｆｏｌＡ遺伝子産物を過剰発現する細胞は、ｆｏｌＡ遺伝子産物に作用する高濃度の抗生物質トリメトプリムで成長することが可能であった。
【０４１７】
したがって、増殖に必要とされる遺伝子産物の高発現は、野生型細胞の成長を阻害または防止する抗生物質濃度の存在下で細胞を成長させることが可能である。
【０４１８】
【表１３５】
Figure 2004528846
【実施例１７】
【０４１９】
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の過剰発現は、過剰発現される遺伝子産物を標的とする抗生物質に対する特異的耐性を付与する
増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子を過剰発現する細胞が、その遺伝子産物を標的とする抗生物質に対して特異的に耐性であることを明らかにするために、以下の実験を実施した。幾つかの同一化合物プレートを上記実施例１４のように調製し、ここでは異なる抗生物質を異なるウェル中に存在させた。種々の遺伝子を過剰発現する細胞を含む培地を、これらのプレートのそれぞれに別個に分配した。プレートインキュベーションおよび成長測定は上記実施例１６に記載するのと同様に行った。１つの特定の遺伝子のみを過剰発現する細胞が、過剰発現される遺伝子の産物を標的とする抗生物質に対する耐性を獲得したが、過剰発現されなかった遺伝子の産物を標的とする他の抗生物質に対する耐性を獲得しなかった場合、成長は特異的であると考えられた。
【０４２０】
図１５に示すように、ｆａｂＩ遺伝子の過剰発現は、ｆａｂＩ遺伝子の遺伝子産物であるエノール−アシル担体タンパク質レダクターゼに作用するトリクロサンに対する耐性を付与した。しかしながら、ｆａｂＩ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するセルレニン、トリメトプリム、またはアクチノニンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２１】
同様に、図１６に示すように、ｆｏｌＡ遺伝子の過剰発現は、ｆｏｌＡ遺伝子の遺伝子産物であるジヒドロ葉酸レダクターゼに作用するトリメトプリムに対する耐性を付与した。しかしながら、ｆｏｌＡ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するトリクロサン、セルレニン、またはアクチノニンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２２】
図１７に示すように、ｄｅｆＢ遺伝子の過剰発現は、ｄｅｆＢ遺伝子の遺伝子産物であるペプチドデフォルミラーゼに作用するアクチノニンに対する耐性を付与した。しかしながら、ｄｅｆＢ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するセルレニン、トリメトプリム、またはトリクロサンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２３】
図１８に示すように、ｆａｂＦ遺伝子の過剰発現は、ｆａｂＦ遺伝子の遺伝子産物であるβケト−アシル担体タンパク質シンターゼＩＩに作用するセルレニンに対する耐性を付与した。しかしながら、ｆａｂＦ遺伝子の過剰発現は、それぞれ他の遺伝子産物に作用するトリクロサン、トリメトプリム、またはアクチノニンに対する耐性を付与しなかった。
【０４２４】
したがって、増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする遺伝子の過剰発現は、過剰発現される遺伝子産物を標的とする抗生物質に対する特異的耐性を付与する。
【実施例１８】
【０４２５】
増殖に必要とされる遺伝子を過剰発現する株の混合物からの標的遺伝子産物をコードする遺伝子を、過剰発現する株の選択
抗生物質の標的とされる遺伝子産物を発現する株が、それぞれ増殖に必要とされる異なる遺伝子を過剰発現する株の混合物から選択され得ることを確認するために、以下の実験を実施した。増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする９個の遺伝子の１つを過剰発現するスタフィロコッカス・アウレウス株を上述のように構築した。９個の過剰発現される遺伝子とは、ｆａｂＦ、ｄｅｆＢ、ｆｏｌＡ、ｆａｂＩ、ｉｌｅＳ、ｆｕｓＡ、ｇｙｒＢ、ｍｕｒＡ、ｒｐｏＢであった。９個の株の混合物を、様々な濃度の誘導物質、およびアクチノニン、セルレニン、トリクロサン、またはトリメトプリムの標的を過剰発現しない株の成長を阻害するのに十分な濃度のこれらの抗生物質を含有する培地中で、９６ウェルプレート中のウェルで成長させた。
【０４２６】
成長は、適切な誘導物質濃度および４個の抗生物質のうちの１つをそれぞれ含有するウェル中で観察された（図１９を参照）。抗生物質のうちの１つの存在下で成長した培養物を以下のように分析した。培養物をプレートのウェルから取り出し、適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上で段階希釈物を平板培養することにより単一コロニーを得た。各培養物に関して少なくとも６０個の個々のコロニーからプラスミドを単離して、抗生物質耐性を付与する遺伝子を、ベクター特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を実施することにより増幅した。続いて、ＰＣＲ産物を配列決定した。
【０４２７】
セルレニンの存在下で成長した培養物から得られるプラスミドはすべてｆａｂＦ配列を含有していた。同様に、トリクロサンの存在下で成長したクローンから得られるプラスミドはすべて、ｆａｂＩ遺伝子を含有していた。アクチノニンの存在下で成長したコロニーから得られるプラスミドはすべて、ｄｅｆＢ遺伝子を含有していた。さらに、トリメトプリムの存在下で成長したコロニーから得られるプラスミドの８１％はｆｏｌＡ遺伝子を含有していた。ｆｏｌＡ遺伝子を含有するプラスミドの１００％回収を提供するように成長条件をさらに最適化することができた。
【０４２８】
これらの結果は、抗生物質により標的とされる遺伝子産物を発現する株が、増殖に必要とされるそれぞれ異なる遺伝子を過剰発現する株の混合物から選択されうることを実証する。
【実施例１９】
【０４２９】
識別可能な長さを有する増幅産物の特定
上述のように、ｐｂｐＣ、ｓｅｃＡ、ｙｌａＯ（Ｂｓ）、ｙｐｈＣ（Ｂｓ）、ｔｒｐＳ、ｐｏｌＣ、ｆａｂＩ、ｒｐｓＲ（Ｂｓ）、ｆａｂＦ（ｙｊａＹ）、ｉｌｅＳ、ｍｕｒＣ、ｆｍｈＢ、ｍｕｒＡ（Ｂｓ）、ｍｕｒＦ（Ｂｓ）、ｆｔｓＺ、ｔｕｆＡ、ｇｙｒＡ、ｒｐｏＢ、ｇｒｌＡ、またはｆｏｌＡ（ｄｆｒＡ）遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸がＸｙｌＴ５プロモーターから転写されたプラスミドを用いて、増殖に必要とされるとして上述の遺伝子を特定した。アンチセンス核酸の配列を以下のように本明細書中で提供する：
ｔｕｆＡ 配列盤後１３５９
ｙｌａＯ 配列盤後１３８０
ｒｐｏＢ 配列番号１３９２
ｐｏｌＣ 配列番号１４０９
ｍｕｒＣ 配列番号１４１６
ｆｍｈＢ 配列番号１４４４
ｙｐｈＣ 配列番号１４６３
ｇｙｒＡ 配列番号１４８３
ｉｌｅＳ 配列番号１６３６
ｓｅｃＡ 配列番号１６５１
ｆａｂＩ 配列番号１６９７
ｍｕｒＡ 配列番号２０８６
ｇｒｌＡ 配列番号２３３１
ｔｒｐＳ 配列番号２５０５
ｆｏｌＡ 配列番号２５２６
ｐｂｐＣ 配列番号２６３４
ｆａｂＦ 配列番号２９８８
ｍｕｒＦ 配列番号３５２２
ｒｐｓＲ 配列番号３５６３
ｆｔｓＺ 配列番号３５９８
相当するアンチセンス核酸をコードするプラスミドが核酸の混合物中に存在する場合に、以下の長さを有する増幅産物を生じる増幅プライマーを設計した：
ｙｐｈＣ ２６０ｂｐ ｓｅｃＡ ２６７ｂｐ
ｆｏｌＡ ２３０ｂｐ ｔｕｆＡ ２４３ｂｐ
ｆａｂＩ ２２０ｂｐ ｇｙｒＡ ２２５ｂｐ
ｔｒｐＳ ２０８ｂｐ ｉｌｅＳ ２１５ｂｐ
ｆａｂＦ １８９ｂｐ ｍｕｒＦ ２０３ｂｐ
ｍｕｒＡ １７６ｂｐ ｆｍｈＢ １８１ｂｐ
ｒｐｏＢ １５９ｂｐ ｙｌａＯ １６９ｂｐ
ｇｒｌＡ １５１ｂｐ ｐｂｐＣ １５６ｂｐ
ｍｕｒＣ １２９ｂｐ ｐｏｌＣ １４５ｂｐ
ｒｐｓＲ １０９ｂｐ ｆｔｓＺ １１７ｂｐ
【０４３０】
各プライマーの５’プライマーは、ｘｙｌＴ５プロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である一方で、３’プライマーは、アンチセンスクローン内のヌクレオチド配列に相補的であった。各対の５’プライマーは、各増幅反応に関して同一であった。ヌクレオチド配列ＧＴＴＴＣＴＴが、３’プライマーの５’末端上に添付された。各対のプライマーの１つをＶＩＣまたは６ＦＡＭのいずれかで標識した。
【０４３１】
ｇｒｌＡ遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸をコードするプラスミド、またはｆｍｈＢ遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸をコードするプラスミドのいずれかが、１１個のチューブそれぞれに２倍に段階希釈される（すなわち、第１のチューブは、ｇｒｌＡプラスミドまたはｆｍｈＢプラスミドを１００ｐｇ有し、一方最後のチューブは、ｇｒｌＡプラスミドまたはｆｍｈＢプラスミドを０．１０ｐｇ有する）以外は、上欄それぞれに列挙した遺伝子に相補的なアンチセンス核酸を含有する１０個のプラスミドの２組を、１１個のチューブ中に等量で混合した。増幅反応を混合物で実施し、増幅産物を５％ＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロースゲル(Bio Whittaker Molecular Applications Rockland, ME)上で分離した。ｇｒｌＡまたはｆｍｈＢプライマーそれぞれに関する１５１ｂｐまたは１８１ｂｐ増幅産物のレベルは、希釈度が増大するとともに段階的に特異的に減少する一方、未希釈の産物のレベルは一定のままであった。アッセイにより、ｇｒｌＡまたはｆｍｈＢプラスミドに相当する増幅産物で示されるテンプレート濃度が１／１０に減少したことが容易に検出された。
【実施例２０】
【０４３２】
増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を過小発現する株に相当する増幅産物の選択的消失
ｙｐｈＣ、ｆｏｌＡ、ｆａｂＩ、ｔｒｐＳ、ｆａｂＦ、ｍｕｒＡ、ｒｐｏＢ、ｇｒｌＡ、ｍｕｒＣ、またはｒｐｓＲ遺伝子内のヌクレオチド配列に相補的なアンチセンス核酸（上記実施例１９に記載）をコードするプラスミドを含有するスタフィロコッカス・アウレウス株を、培養物中の各株の細胞数が同一となるように、同一培養物中で一緒に混合した。１０個の株を含む培養物それぞれを、以下のいずれかの濃度で、以下のいずれかの抗生物質と接触させた：
スペクチノマイシン−２．５、５．０μｇ／ｍｌ
ムプリオシン−４．３、８．６、１７．２μｇ／ｍｌ
セルレニン−４．５、９．０、１８．０μｇ／ｍｌ
【０４３３】
スペクチノマイシンはｒｐｓＲ遺伝子の産物に作用し、ムプリオシンはｉｌｅＳ遺伝子の産物に作用し、セルレニンはＦａｂＦ遺伝子の産物に作用する。各抗生物質に関する中間濃度はそのＩＣ５０である。
【０４３４】
細胞が初期ｌｏｇ相に到達するまで、１０個の株を含有する培養物を富培地(rich medium)（Ｌ−ブロス、アンチセンスＬＢ＋アンチセンスプラスミドを維持するためのクロラムフェニコール用）で成長させ、続いて上記に列挙したいずれかの濃度（好ましくはＩＣ５０付近）で上述の化合物の１つと接触させた。培養物を、化合物がその標的を過小発現する株の成長を特異的に阻害するのを可能にするのに十分な時間成長させた。好ましくは、培養物を少なくとも１６時間、より好ましくは２４〜４８時間成長させた。偽陽性を招き得る株に選択的圧力をかける間は、培養物を成長させないことが望ましい。
【０４３５】
遠心分離により細胞を収集し、培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。ＰＣＲ増幅は、実施例１９に記載するように実施した。増幅産物を上述のようにＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上に流した。各アンチセンス核酸に対応する増幅産物の量を決定し、薬剤と接触させていない対照培養物中の量、または化合物が作用する遺伝子産物をコードする遺伝子中のヌクレオチド配列に相補的でない他のアンチセンス核酸に相当する増幅産物の量と比較した。それぞれの場合において、抗生物質が作用する標的に対応する増幅産物のみがゲル上で検出できなかった。
【０４３６】
遺伝子産物のレベルまたは活性が、増殖に必要とされる遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写することにより、またはかかる遺伝子の天然プロモーターを調節可能プロモーターで置き換えることにより調節される実施形態では、アンチセンス核酸の転写を誘導するのに、または調節可能なプロモーターからの転写を誘導するのに使用される誘導物質に関する用量反応曲線を完成することが望ましい。かかる実施形態では、化合物が作用する標的を過剰発現または過小発現しない株の成長をできるだけ妨害せずに、特定の試験化合物の効果を検出するために最適転写レベルを提供する最低濃度の誘導物質を使用することが望ましい。また、化合物が作用する標的を過剰発現または過小発現する株の差次的成長を得るための最適量を決定するために、さまざまな量の試験化合物に培養物を接触させることも望ましい。好ましくは、株が増殖に必要とされる遺伝子産物を過剰発現する場合、化合物レベルは、好ましくは約ＩＣ90以上である。好ましくは、株が増殖に必要とされる遺伝子産物を過小発現する場合、化合物レベルは好ましくは約ＩＣ50以下である。
【０４３７】
望ましい場合には、増幅産物は上述の色素を用いて検出され得ることが理解されよう。また、増幅産物はＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲを含む任意の望ましい増幅方法を用いて検出され得ることも理解されよう。
【０４３８】
たとえ本明細書において前述の記載がどんなに詳細に見えたとしても、本発明は多くの方法で実施することができることが理解されよう。また上述するように、本発明の特定の形態または態様を記載する際に特定の専門用語を使用することは、かかる専門用語の最も広い合理的な意義が意図されないこと、または専門用語が関連する本発明の形態または態様の任意の特定の特徴を包含することを制限するように本明細書中で再定義されることを含意するものと解釈されるべきではないことにさらに留意されるべきである。したがって、本発明を特定の好ましい実施形態に関して記載してきたが、本明細書中の開示を鑑みて当業者には明らかであろう他の実施形態もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の範囲は、併記の特許請求の範囲およびその任意の等価物のみを参照することにより規定されると意図される。本明細書中に引用した文書はすべて、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０４３９】
表ＶＩＡ
配列番号 クローン名 生物
8 E3M10000001A02 Enterococcus faecalis
9 E3M10000001A06 Enterococcus faecalis
10 E3M10000001B01 Enterococcus faecalis
11 E3M10000001B02 Enterococcus faecalis
12 E3M10000001B05 Enterococcus faecalis
13 E3M10000001B06 Enterococcus faecalis
14 E3M10000001B08 Enterococcus faecalis
15 E3M10000001B10 Enterococcus faecalis
16 E3M10000001C02 Enterococcus faecalis
17 E3M10000001C09 Enterococcus faecalis
18 E3M10000001D02 Enterococcus faecalis
19 E3M10000001D04 Enterococcus faecalis
20 E3M10000001D05 Enterococcus faecalis
21 E3M10000001D09 Enterococcus faecalis
22 E3M10000001E01 Enterococcus faecalis
23 E3M10000001E02 Enterococcus faecalis
24 E3M10000001E03 Enterococcus faecalis
25 E3M10000001E04 Enterococcus faecalis
26 E3M10000001E08 Enterococcus faecalis
27 E3M10000001E09 Enterococcus faecalis
28 E3M10000001F02 Enterococcus faecalis
29 E3M10000001F04 Enterococcus faecalis
30 E3M10000001F06 Enterococcus faecalis
31 E3M10000001F07 Enterococcus faecalis
32 E3M10000001G02 Enterococcus faecalis
33 E3M10000001G03 Enterococcus faecalis
34 E3M10000001G04 Enterococcus faecalis
35 E3M10000001G05 Enterococcus faecalis
36 E3M10000001H02 Enterococcus faecalis
37 E3M10000001H03 Enterococcus faecalis
38 E3M10000001H04 Enterococcus faecalis
39 E3M10000004A04 Enterococcus faecalis
40 E3M10000004C03 Enterococcus faecalis
41 E3M10000004D01 Enterococcus faecalis
42 E3M10000004D02 Enterococcus faecalis
43 E3M10000004D10 Enterococcus faecalis
44 E3M10000004E11 Enterococcus faecalis
45 E3M10000004F08 Enterococcus faecalis
46 E3M10000004F10 Enterococcus faecalis
47 E3M10000004G01 Enterococcus faecalis
48 E3M10000004H11 Enterococcus faecalis
49 E3M10000005A07 Enterococcus faecalis
50 E3M10000005B01 Enterococcus faecalis
51 E3M10000005B08 Enterococcus faecalis
52 E3M10000005C01 Enterococcus faecalis
53 E3M10000005C03 Enterococcus faecalis
54 E3M10000005C04 Enterococcus faecalis
55 E3M10000005D03 Enterococcus faecalis
56 E3M10000005D04 Enterococcus faecalis
57 E3M10000005D10 Enterococcus faecalis
58 E3M10000005E01 Enterococcus faecalis
59 E3M10000005E02 Enterococcus faecalis
60 E3M10000005E03 Enterococcus faecalis
61 E3M10000005E08 Enterococcus faecalis
62 E3M10000005F07 Enterococcus faecalis
63 E3M10000005F10 Enterococcus faecalis
64 E3M10000005G05 Enterococcus faecalis
65 E3M10000005H04 Enterococcus faecalis
66 E3M10000006B03 Enterococcus faecalis
67 E3M10000006C01 Enterococcus faecalis
68 E3M10000006C12 Enterococcus faecalis
69 E3M10000006D03 Enterococcus faecalis
70 E3M10000006E11 Enterococcus faecalis
71 E3M10000006F04 Enterococcus faecalis
72 E3M10000006G04 Enterococcus faecalis
73 E3M10000006G12 Enterococcus faecalis
74 E3M10000006H09 Enterococcus faecalis
75 E3M10000007A02 Enterococcus faecalis
76 E3M10000007B02 Enterococcus faecalis
77 E3M10000007B03 Enterococcus faecalis
78 E3M10000007C03 Enterococcus faecalis
79 E3M10000007C04 Enterococcus faecalis
80 E3M10000007D03 Enterococcus faecalis
81 E3M10000007E05 Enterococcus faecalis
82 E3M10000007F01 Enterococcus faecalis
83 E3M10000007F06 Enterococcus faecalis
84 E3M10000007G01 Enterococcus faecalis
85 E3M10000008C03 Enterococcus faecalis
86 E3M10000008C08 Enterococcus faecalis
87 E3M10000008C09 Enterococcus faecalis
88 E3M10000008D08 Enterococcus faecalis
89 E3M10000008E02 Enterococcus faecalis
90 E3M10000008G05 Enterococcus faecalis
91 E3M10000008G09 Enterococcus faecalis
92 E3M10000008H02 Enterococcus faecalis
93 E3M10000009C07 Enterococcus faecalis
94 E3M10000009C09 Enterococcus faecalis
95 E3M10000009D01 Enterococcus faecalis
96 E3M10000009E02 Enterococcus faecalis
97 E3M10000009E03 Enterococcus faecalis
98 E3M10000009E05 Enterococcus faecalis
99 E3M10000009G02 Enterococcus faecalis
100 E3M10000010C08 Enterococcus faecalis
101 E3M10000010D05 Enterococcus faecalis
102 E3M10000010F01 Enterococcus faecalis
103 E3M10000010G05 Enterococcus faecalis
104 E3M10000010G07 Enterococcus faecalis
105 E3M10000010G09 Enterococcus faecalis
106 E3M10000010G10 Enterococcus faecalis
107 E3M10000010H02 Enterococcus faecalis
108 E3M10000011A09 Enterococcus faecalis
109 E3M10000011B03 Enterococcus faecalis
110 E3M10000011B09 Enterococcus faecalis
111 E3M10000011C07 Enterococcus faecalis
112 E3M10000011D03 Enterococcus faecalis
113 E3M10000011H02 Enterococcus faecalis
114 E3M10000011H05 Enterococcus faecalis
115 E3M10000012B01 Enterococcus faecalis
116 E3M10000012B02 Enterococcus faecalis
117 E3M10000012B07 Enterococcus faecalis
118 E3M10000012B08 Enterococcus faecalis
119 E3M10000012C01 Enterococcus faecalis
120 E3M10000012D10 Enterococcus faecalis
121 E3M10000012E08 Enterococcus faecalis
122 E3M10000012F05 Enterococcus faecalis
123 E3M10000012F06 Enterococcus faecalis
124 E3M10000012F07 Enterococcus faecalis
125 E3M10000012F10 Enterococcus faecalis
126 E3M10000012G02 Enterococcus faecalis
127 E3M10000012G07 Enterococcus faecalis
128 E3M10000013A06 Enterococcus faecalis
129 E3M10000013A07 Enterococcus faecalis
130 E3M10000013C05 Enterococcus faecalis
131 E3M10000013D02 Enterococcus faecalis
132 E3M10000013D08 Enterococcus faecalis
133 E3M10000013D10 Enterococcus faecalis
134 E3M10000013E02 Enterococcus faecalis
135 E3M10000013E08 Enterococcus faecalis
136 E3M10000013F05 Enterococcus faecalis
137 E3M10000013F12 Enterococcus faecalis
138 E3M10000013G10 Enterococcus faecalis
139 E3M10000013H03 Enterococcus faecalis
140 E3M10000013H05 Enterococcus faecalis
141 E3M10000013H10 Enterococcus faecalis
142 E3M10000014B12 Enterococcus faecalis
143 E3M10000014E12 Enterococcus faecalis
144 E3M10000014G09 Enterococcus faecalis
145 E3M10000015B04 Enterococcus faecalis
146 E3M10000015B12 Enterococcus faecalis
147 E3M10000015E12 Enterococcus faecalis
148 E3M10000016A03 Enterococcus faecalis
149 E3M10000016A04 Enterococcus faecalis
150 E3M10000016C11 Enterococcus faecalis
151 E3M10000016D03 Enterococcus faecalis
152 E3M10000016F06 Enterococcus faecalis
153 E3M10000016F10 Enterococcus faecalis
154 E3M10000016H05 Enterococcus faecalis
155 E3M10000016H10 Enterococcus faecalis
156 E3M10000017A09 Enterococcus faecalis
157 E3M10000017D09 Enterococcus faecalis
158 E3M10000018A07 Enterococcus faecalis
159 E3M10000018C02 Enterococcus faecalis
160 E3M10000018E01 Enterococcus faecalis
161 E3M10000018G09 Enterococcus faecalis
162 E3M10000018H06 Enterococcus faecalis
163 E3M10000019B06 Enterococcus faecalis
164 E3M10000019D02 Enterococcus faecalis
165 E3M10000019E03 Enterococcus faecalis
166 E3M10000019E04 Enterococcus faecalis
167 E3M10000020G04 Enterococcus faecalis
168 E3M10000020H05 Enterococcus faecalis
169 E3M10000021A08 Enterococcus faecalis
170 E3M10000021A11 Enterococcus faecalis
171 E3M10000021B10 Enterococcus faecalis
172 E3M10000021C03 Enterococcus faecalis
173 E3M10000021C04 Enterococcus faecalis
174 E3M10000021C08 Enterococcus faecalis
175 E3M10000021D04 Enterococcus faecalis
176 E3M10000021E10 Enterococcus faecalis
177 E3M10000021G04 Enterococcus faecalis
178 E3M10000021G10 Enterococcus faecalis
179 E3M10000021G11 Enterococcus faecalis
180 E3M10000021H11 Enterococcus faecalis
181 E3M10000022A04 Enterococcus faecalis
182 E3M10000022A11 Enterococcus faecalis
183 E3M10000022B04 Enterococcus faecalis
184 E3M10000022B05 Enterococcus faecalis
185 E3M10000022B07 Enterococcus faecalis
186 E3M10000022C05 Enterococcus faecalis
187 E3M10000022C06 Enterococcus faecalis
188 E3M10000022C09 Enterococcus faecalis
189 E3M10000022D04 Enterococcus faecalis
190 E3M10000022F05 Enterococcus faecalis
191 E3M10000022F06 Enterococcus faecalis
192 E3M10000022F08 Enterococcus faecalis
193 E3M10000022G02 Enterococcus faecalis
194 E3M10000022G12 Enterococcus faecalis
195 E3M10000023A03 Enterococcus faecalis
196 E3M10000023A06 Enterococcus faecalis
197 E3M10000023A07 Enterococcus faecalis
198 E3M10000023A09 Enterococcus faecalis
199 E3M10000023B02 Enterococcus faecalis
200 E3M10000023B06 Enterococcus faecalis
201 E3M10000023C03 Enterococcus faecalis
202 E3M10000023C04 Enterococcus faecalis
203 E3M10000023C06 Enterococcus faecalis
204 E3M10000023C08 Enterococcus faecalis
205 E3M10000023C09 Enterococcus faecalis
206 E3M10000023D02 Enterococcus faecalis
207 E3M10000023D04 Enterococcus faecalis
208 E3M10000023D10 Enterococcus faecalis
209 E3M10000023E04 Enterococcus faecalis
210 E3M10000023E07 Enterococcus faecalis
211 E3M10000023E09 Enterococcus faecalis
212 E3M10000023F02 Enterococcus faecalis
213 E3M10000023F10 Enterococcus faecalis
214 E3M10000023G02 Enterococcus faecalis
215 E3M10000023G04 Enterococcus faecalis
216 E3M10000023G10 Enterococcus faecalis
217 E3M10000023H08 Enterococcus faecalis
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220 E3M10000024A08 Enterococcus faecalis
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225 E3M10000025B05 Enterococcus faecalis
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230 E3M10000025C07 Enterococcus faecalis
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390 E3M10000030E04 Enterococcus faecalis
391 E3M10000030E08 Enterococcus faecalis
392 E3M10000030E09 Enterococcus faecalis
393 E3M10000030E10 Enterococcus faecalis
394 E3M10000030F01 Enterococcus faecalis
395 E3M10000030F04 Enterococcus faecalis
396 E3M10000030F06 Enterococcus faecalis
397 E3M10000030F07 Enterococcus faecalis
398 E3M10000030F10 Enterococcus faecalis
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515 E3M10000033B04 Enterococcus faecalis
516 E3M10000033B05 Enterococcus faecalis
517 E3M10000033B06 Enterococcus faecalis
518 E3M10000033B08 Enterococcus faecalis
519 E3M10000033B09 Enterococcus faecalis
520 E3M10000033C01 Enterococcus faecalis
521 E3M10000033C02 Enterococcus faecalis
522 E3M10000033C05 Enterococcus faecalis
523 E3M10000033C09 Enterococcus faecalis
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532 E3M10000033D10 Enterococcus faecalis
533 E3M10000033D11 Enterococcus faecalis
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535 E3M10000033E03 Enterococcus faecalis
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546 E3M10000033F07 Enterococcus faecalis
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834 E3M10000039D06 Enterococcus faecalis
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3623 S1M10000048H10 Staphylococcus aureus
3624 S1M10000048H11 Staphylococcus aureus
3625 S1M10000009E10 Staphylococcus aureus
3626 S1M10000001F01 Staphylococcus aureus
3627 S1M10000006B12 Staphylococcus aureus
3628 S1M10000003D09 Staphylococcus aureus
3629 S1M10000001D11 Staphylococcus aureus
3630 S1M10000003B07 Staphylococcus aureus
3631 S1M10000002A07 Staphylococcus aureus
3632 S1M10000003F11 Staphylococcus aureus
3633 S1M10000047C07 Staphylococcus aureus
3634 S1M10000013F10 Staphylococcus aureus
3635 S1M10000014D11 Staphylococcus aureus
3636 S1M10000015F05 Staphylococcus aureus
3637 S1M10000048D01 Staphylococcus aureus
3638 S1M10000011C03 Staphylococcus aureus
3639 S1M10000012F03 Staphylococcus aureus
3640 S1M10000002F07 Staphylococcus aureus
3641 S1M10000048G01 Staphylococcus aureus
3642 S1M10000009G12 Staphylococcus aureus
3643 S1M10000012D05 Staphylococcus aureus
3644 S1M10000014D07 Staphylococcus aureus
3645 S1M10000047C05 Staphylococcus aureus
3646 S1M10000018D08* Staphylococcus aureus
3647 S1M10000047B01 Staphylococcus aureus
3648 S1M10000047H10 Staphylococcus aureus
3649 S1M10000001A04 Staphylococcus aureus
3650 S1M10000016E01 Staphylococcus aureus
3651 S1M10000017E12 Staphylococcus aureus
3652 S1M10000019B01 Staphylococcus aureus
3653 S1M10000048F03 Staphylococcus aureus
3654 S1M10000034A07 Staphylococcus aureus
3655 S1M10000023G01 Staphylococcus aureus
3656 S1M10000021G12 Staphylococcus aureus
3657 S1M10000024E04 Staphylococcus aureus
3658 S1M10000028H08 Staphylococcus aureus
3659 S1M10000022B07 Staphylococcus aureus
3660 S1M10000003A05 Staphylococcus aureus
3661 S1M10000003A09 Staphylococcus aureus
3662 S1M10000003E01 Staphylococcus aureus
3663 S1M10000004C11 Staphylococcus aureus
3664 S1M10000007E08 Staphylococcus aureus
3665 S1M10000021G06 Staphylococcus aureus
3666 S1M10000024C06 Staphylococcus aureus
3667 S1M10000024D01 Staphylococcus aureus
3668 S1M10000027D07 Staphylococcus aureus
3669 S1M10000027E03 Staphylococcus aureus
3670 S1M10000027G01 Staphylococcus aureus
3671 S1M10000029A03 Staphylococcus aureus
3672 S1M10000032B10 Staphylococcus aureus
3673 S1M10000032C07 Staphylococcus aureus
3674 S1M10000038D04 Staphylococcus aureus
3675 S1M10000047D07 Staphylococcus aureus
3676 S1M10000048B03 Staphylococcus aureus
3677 S1M10000048B06 Staphylococcus aureus
3678 S1M10000048C10 Staphylococcus aureus
3679 S1M10000048F05 Staphylococcus aureus
3680 S4M10000001C01 Salmonella typhimurium
3681 S4M10000002B06 Salmonella typhimurium
3682 S4M10000002B09 Salmonella typhimurium
3683 S4M10000002G04 Salmonella typhimurium
3684 S4M10000002G08 Salmonella typhimurium
3685 S4M10000005G05 Salmonella typhimurium
3686 S4M10000005H02 Salmonella typhimurium
3687 S4M10000006A06 Salmonella typhimurium
3688 S4M10000006A08 Salmonella typhimurium
3689 S4M10000006C05 Salmonella typhimurium
3690 S4M10000006F08 Salmonella typhimurium
3691 S4M10000007G01 Salmonella typhimurium
3692 S4M10000008C08 Salmonella typhimurium
3693 S4M10000008H10 Salmonella typhimurium
3694 S4M10000009A05 Salmonella typhimurium
3695 S4M10000010B05 Salmonella typhimurium
3696 S4M10000010D04 Salmonella typhimurium
3697 S4M10000010H04 Salmonella typhimurium
3698 S4M10000011D08 Salmonella typhimurium
3699 S4M10000011E08 Salmonella typhimurium
3700 S4M10000012B06 Salmonella typhimurium
3701 S4M10000012B12 Salmonella typhimurium
3702 S4M10000012D02 Salmonella typhimurium
3703 S4M10000013H02 Salmonella typhimurium
3704 S4M10000014B05 Salmonella typhimurium
3705 S4M10000014D04 Salmonella typhimurium
3706 S4M10000014D07 Salmonella typhimurium
3707 S4M10000014H02 Salmonella typhimurium
3708 S4M10000015B11 Salmonella typhimurium
3709 S4M10000015E09 Salmonella typhimurium
3710 S4M10000016A02 Salmonella typhimurium
3711 S4M10000018D09 Salmonella typhimurium
3712 S4M10000018E10 Salmonella typhimurium
3713 S4M10000018F10 Salmonella typhimurium
3714 S4M10000018G03 Salmonella typhimurium
3715 S4M10000018H04 Salmonella typhimurium
3716 S4M10000019F05 Salmonella typhimurium
3717 S4M10000019G04 Salmonella typhimurium
3718 S4M10000019G05 Salmonella typhimurium
3719 S4M10000019H06 Salmonella typhimurium
3720 S4M10000020A04 Salmonella typhimurium
3721 S4M10000020F05 Salmonella typhimurium
3722 S4M10000020G10 Salmonella typhimurium
3723 S4M10000022D04 Salmonella typhimurium
3724 S4M10000022D12 Salmonella typhimurium
3725 S4M10000022E12 Salmonella typhimurium
3726 S4M10000022G07 Salmonella typhimurium
3727 S4M10000022H06 Salmonella typhimurium
3728 S4M10000023F01 Salmonella typhimurium
3729 S4M10000024B02 Salmonella typhimurium
3730 S4M10000024C06 Salmonella typhimurium
3731 S4M10000024C11 Salmonella typhimurium
3732 S4M10000024F08 Salmonella typhimurium
3733 S4M10000024G01 Salmonella typhimurium
3734 S4M10000024G04 Salmonella typhimurium
3735 S4M10000024G09 Salmonella typhimurium
3736 S4M10000024H02 Salmonella typhimurium
3737 S4M10000025A11 Salmonella typhimurium
3738 S4M10000025E02 Salmonella typhimurium
3739 S4M10000025E05 Salmonella typhimurium
3740 S4M10000025H07 Salmonella typhimurium
3741 S4M10000026C10 Salmonella typhimurium
3742 S4M10000026D04 Salmonella typhimurium
3743 S4M10000026E06 Salmonella typhimurium
3744 S4M10000026E12 Salmonella typhimurium
3745 S4M10000027C10 Salmonella typhimurium
3746 S4M10000027E02 Salmonella typhimurium
3747 S4M10000029B12 Salmonella typhimurium
3748 S4M10000029D12 Salmonella typhimurium
3749 S4M10000030D03 Salmonella typhimurium
3750 S4M10000030F07 Salmonella typhimurium
3751 S4M10000030G11 Salmonella typhimurium
3752 S4M10000032B12 Salmonella typhimurium
3753 S4M10000033F08 Salmonella typhimurium
3754 S4M10000033G05 Salmonella typhimurium
3755 S4M10000033G09 Salmonella typhimurium
3756 S4M10000034A02 Salmonella typhimurium
3757 S4M10000034A09 Salmonella typhimurium
3758 S4M10000034D06 Salmonella typhimurium
3759 S4M10000034H05 Salmonella typhimurium
3760 S4M10000034H09 Salmonella typhimurium
3761 S4M10000035B01 Salmonella typhimurium
3762 S4M10000035D01 Salmonella typhimurium
3763 S4M10000035D02 Salmonella typhimurium
3764 S4M10000035E03 Salmonella typhimurium
3765 S4M10000035F02 Salmonella typhimurium
3766 S4M10000035F09 Salmonella typhimurium
3767 S4M10000036D07 Salmonella typhimurium
3768 S4M10000036F07 Salmonella typhimurium
3769 S4M10000037A04 Salmonella typhimurium
3770 S4M10000037A10 Salmonella typhimurium
3771 S4M10000037E10 Salmonella typhimurium
3772 S4M10000037H09 Salmonella typhimurium
3773 S4M10000001H01 Salmonella typhimurium
3774 S4M10000002F06 Salmonella typhimurium
3775 S4M10000008D01 Salmonella typhimurium
3776 S4M10000009G11 Salmonella typhimurium
3777 S4M10000011F09 Salmonella typhimurium
3778 S4M10000020F08 Salmonella typhimurium
3779 S4M10000021E07 Salmonella typhimurium
3780 S4M10000022B05 Salmonella typhimurium
3781 S4M10000025H11 Salmonella typhimurium
3782 S4M10000026B10 Salmonella typhimurium
3783 S4M10000026E03 Salmonella typhimurium
3784 S4M10000029A03 Salmonella typhimurium
3785 S4M10000029C11 Salmonella typhimurium
3786 S4M10000030F06 Salmonella typhimurium
3787 S4M10000032F03 Salmonella typhimurium
3788 S4M10000032G01 Salmonella typhimurium
3789 S4M10000034C05 Salmonella typhimurium
3790 S4M10000034H04 Salmonella typhimurium
3791 S4M10000035A09 Salmonella typhimurium
3792 S4M10000035B06 Salmonella typhimurium
3793 S4M10000035F01 Salmonella typhimurium
3794 S4M10000037A08 Salmonella typhimurium
3795 S4M10000037E03 Salmonella typhimurium
【０４４０】
表ＶＩＢ
クローン名 クローン PathoSeq 遺伝子 Genemarked 完全長 ORF
配列番号 遺伝子座 配列番号 遺伝子 タンパク質
(protein) 配列番号
E3M10000001A02 8 EFA101409 4934 EFA1c0022_orf_11 10524
E3M10000001A06 9 EFA100642 4884 EFA1c0041_orf_56 10792
E3M10000001B01 10 EFA101409 4934 EFA1c0022_orf_11 10524
E3M10000001B02 11 EFA100739 4888 EFA1c0022_orf_23 10537
E3M10000001B02 11 EFA102549 5000 EFA1c0022_orf_24 10538
E3M10000001B02 11 EFA102551 5001 EFA1c0022_orf_25 10539
E3M10000001B05 12 EFA101165 4922 EFA1c0022_orf_8p 10559
E3M10000001B06 13 EFA101164 4921 EFA1c0022_orf_7p 10558
E3M10000001B08 14 EFA100642 4884 EFA1c0041_orf_56 10792
E3M10000001B10 15 EFA101409 4934 EFA1c0022_orf_11 10524
E3M10000001C02 16 EFA103038 5017 EFA1c0030_orf_17 10613
E3M10000001C09 17 EFA103021 5015 EFA1c0030_orf_16 10612
E3M10000001D02 18 EFA101159 4916 EFA1c0022_orf_2p 10543
E3M10000001D04 19 EFA100742 4891 EFA1c0022_orf_20 10534
E3M10000001D04 19 EFA101417 4942 EFA1c0022_orf_18 10531
E3M10000001D04 19 EFA102554 5002 EFA1c0022_orf_19 10532
E3M10000001D05 20 EFA100955 4902 EFA1c0022_orf_28 10542
E3M10000001D05 20 EFA100978 4904 EFA1c0022_orf_27 10541
E3M10000001D09 21 EFA100210 4870 EFA1c0022_orf_9p 10560
E3M10000001D09 21 EFA100211 4871 EFA1c0022_orf_10 10523
E3M10000001E01 22 EFA101162 4919 EFA1c0022_orf_5p 10555
E3M10000001E01 22 EFA101163 4920 EFA1c0022_orf_6p 10557
E3M10000001E02 23 EFA103038 5017 EFA1c0030_orf_17 10613
E3M10000001E03 24 EFA100210 4870 EFA1c0022_orf_9p 10560
E3M10000001E03 24 EFA100211 4871 EFA1c0022_orf_10 10523
E3M10000001E04 25 EFA100642 4884 EFA1c0041_orf_56 10792
E3M10000001E08 26 EFA102502 4995 EFA1c0031_orf_36 10627
E3M10000001E09 27 EFA100210 4870 EFA1c0022_orf_9p 10560
E3M10000001E09 27 EFA100211 4871 EFA1c0022_orf_10 10523
E3M10000001F02 28 EFA102502 4995 EFA1c0031_orf_36 10627
E3M10000001F04 29 EFA102541 4998 EFA1c0028_orf_3p 10602
E3M10000001F06 30 EFA100642 4884 EFA1c0041_orf_56 10792
E3M10000001F07 31 EFA101164 4921 EFA1c0022_orf_7p 10558
E3M10000001G02 32 EFA101409 4934 EFA1c0022_orf_11 10524
E3M10000001G03 33 EFA100210 4870 EFA1c0022_orf_9p 10560
E3M10000001G03 33 EFA100211 4871 EFA1c0022_orf_10 10523
E3M10000001G04 34 EFA101165 4922 EFA1c0022_orf_8p 10559
E3M10000001G05 35 EFA101160 4917 EFA1c0022_orf_3p 10549
E3M10000001H02 36 EFA102541 4998 EFA1c0028_orf_3p 10602
E3M10000001H03 37 EFA100210 4870 EFA1c0022_orf_9p 10560
E3M10000001H03 37 EFA100211 4871 EFA1c0022_orf_10 10523
E3M10000001H04 38 EFA100742 4891 EFA1c0022_orf_20 10534
E3M10000001H04 38 EFA101417 4942 EFA1c0022_orf_18 10531
E3M10000001H04 38 EFA102554 5002 EFA1c0022_orf_19 10532
E3M10000004A04 39 EFA101417 4942 EFA1c0022_orf_18 10531
E3M10000004A04 39 EFA102554 5002 EFA1c0022_orf_19 10532
E3M10000004C03 40 EFA100478 4880 EFA1c0012_orf_2p 10486
E3M10000004D01 41 EFA101412 4937 EFA1c0022_orf_14 10527
E3M10000004D01 41 EFA101413 4938 #N/A #N/A
E3M10000004D01 41 EFA101414 4939 EFA1c0022_orf_15 10528
E3M10000004D02 42 EFA102022 4974 EFA1c0044_orf_10 10881
E3M10000004D02 42 EFA102023 4975 EFA1c0044_orf_10 10882
E3M10000004D10 43 EFA101162 4919 EFA1c0022_orf_5p 10555
E3M10000004D10 43 EFA101163 4920 EFA1c0022_orf_6p 10557
E3M10000004E11 44 EFA101086 4910 EFA1c0040_orf_90 10763
E3M10000004F08 45 EFA102549 5000 EFA1c0022_orf_24 10538
E3M10000004F08 45 EFA102551 5001 EFA1c0022_orf_25 10539
E3M10000004F10 46 EFA101086 4910 EFA1c0040_orf_90 10763
E3M10000004G01 47 EFA103021 5015 EFA1c0030_orf_16 10612
E3M10000004H11 48 EFA102549 5000 EFA1c0022_orf_24 10538
E3M10000004H11 48 EFA102551 5001 EFA1c0022_orf_25 10539
E3M10000005A07 49 EFA102541 4998 EFA1c0028_orf_3p 10602
E3M10000005B01 50 EFA101414 4939 EFA1c0022_orf_15 10528
E3M10000005B01 50 EFA101415 4940 EFA1c0022_orf_16 10529
E3M10000005B08 51 EFA102549 5000 EFA1c0022_orf_24 10538
E3M10000005B08 51 EFA102551 5001 EFA1c0022_orf_25 10539
E3M10000005C01 52 EFA103021 5015 EFA1c0030_orf_16 10612
E3M10000005C03 53 EFA102541 4998 EFA1c0028_orf_3p 10602
E3M10000005C04 54 EFA102186 4981 EFA1c0045_orf_94 10949
E3M10000005C04 54 EFA102453 4993 EFA1c0045_orf_20 10931
E3M10000005C04 54 EFA102728 5006 EFA1c0045_orf_93 10948
E3M10000005D03 55 EFA102541 4998 EFA1c0028_orf_3p 10602
E3M10000005D04 56 EFA103021 5015 EFA1c0030_orf_16 10612
E3M10000005D10 57 EFA102549 5000 EFA1c0022_orf_24 10538
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E3M10000005E01 58 EFA102549 5000 EFA1c0022_orf_24 10538
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S4M10000018F10 3713 STY004239 #N/A #N/A #N/A
S4M10000019G04 3717 STY004239 #N/A #N/A #N/A
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K1M10000007F01 1057 STY001433 #N/A STYc00148_orf_12 13916
K1M10000036G08 1076 STY001867 #N/A STYc00180_orf_50 13948
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【０４４１】
表ＶＩＣ
PathoSeq ヌクレオチド タンパク質
遺伝子座 配列番号 配列番号
EFA100001 3806 4861
EFA100023 3807 4862
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EFA100151 3809 4864
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EFA100329 3820 4875
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EFA100668 3830 4885
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EFA100704 3832 4887
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SAU103038 4702 5757
SAU103042 4703 5758
SAU103077 4704 5759
SAU103115 4705 5760
SAU103144 4706 5761
SAU103159 4707 5762
SAU103169 4708 5763
SAU103175 4709 5764
SAU103191 4710 5765
SAU103198 4711 5766
SAU103204 4712 5767
SAU103226 4713 5768
SAU103232 4714 5769
SAU200006 4715 5770
SAU200028 4716 5771
SAU200030 4717 5772
SAU200058 4718 5773
SAU200059 4719 5774
SAU200088 4720 5775
SAU200157 4721 5776
SAU200242 4722 5777
SAU200297 4723 5778
SAU200345 4724 5779
SAU200392 4725 5780
SAU200468 4726 5781
SAU200558 4727 5782
SAU200561 4728 5783
SAU200564 4729 5784
SAU200565 4730 5785
SAU200593 4731 5786
SAU200601 4732 5787
SAU200628 4733 5788
SAU200657 4734 5789
SAU200685 4735 5790
SAU200721 4736 5791
SAU200725 4737 5792
SAU200731 4738 5793
SAU200740 4739 5794
SAU200752 4740 5795
SAU200914 4741 5796
SAU200916 4742 5797
SAU200928 4743 5798
SAU200934 4744 5799
SAU200949 4745 5800
SAU200960 4746 5801
SAU200994 4747 5802
SAU201167 4748 5803
SAU201168 4749 5804
SAU201184 4750 5805
SAU201197 4751 5806
SAU201225 4752 5807
SAU201236 4753 5808
SAU201301 4754 5809
SAU201333 4755 5810
SAU201375 4756 5811
SAU201380 4757 5812
SAU201381 4758 5813
SAU201385 4759 5814
SAU201403 4760 5815
SAU201469 4761 5816
SAU201486 4762 5817
SAU201506 4763 5818
SAU201508 4764 5819
SAU201513 4765 5820
SAU201539 4766 5821
SAU201541 4767 5822
SAU201558 4768 5823
SAU201571 4769 5824
SAU201611 4770 5825
SAU201615 4771 5826
SAU201620 4772 5827
SAU201621 4773 5828
SAU201654 4774 5829
SAU201666 4775 5830
SAU201743 4776 5831
SAU201752 4777 5832
SAU201765 4778 5833
SAU201773 4779 5834
SAU201775 4780 5835
SAU201810 4781 5836
SAU201827 4782 5837
SAU201929 4783 5838
SAU201952 4784 5839
SAU201961 4785 5840
SAU201971 4786 5841
SAU202006 4787 5842
SAU202039 4788 5843
SAU202126 4789 5844
SAU202174 4790 5845
SAU202176 4791 5846
SAU202186 4792 5847
SAU202267 4793 5848
SAU202708 4794 5849
SAU202731 4795 5850
SAU202736 4796 5851
SAU202756 4797 5852
SAU202781 4798 5853
SAU202872 4799 5854
SAU202882 4800 5855
SAU202930 4801 5856
SAU202945 4802 5857
SAU202968 4803 5858
SAU203001 4804 5859
SAU203007 4805 5860
SAU203196 4806 5861
SAU203293 4807 5862
SAU203296 4808 5863
SAU203524 4809 5864
SAU300110 4810 5865
SAU300131 4811 5866
SAU300156 4812 5867
SAU300191 4813 5868
SAU300269 4814 5869
SAU300335 4815 5870
SAU300338 4816 5871
SAU300455 4817 5872
SAU300572 4818 5873
SAU300617 4819 5874
SAU300713 4820 5875
SAU300719 4821 5876
SAU300732 4822 5877
SAU300825 4823 5878
SAU300868 4824 5879
SAU300975 4825 5880
SAU300998 4826 5881
SAU301004 4827 5882
SAU301030 4828 5883
SAU301054 4829 5884
SAU301080 4830 5885
SAU301118 4831 5886
SAU301133 4832 5887
SAU301148 4833 5888
SAU301223 4834 5889
SAU301230 4835 5890
SAU301268 4836 5891
SAU301275 4837 5892
SAU301357 4838 5893
SAU301363 4839 5894
SAU301433 4840 5895
SAU301465 4841 5896
SAU301472 4842 5897
SAU301592 4843 5898
SAU301620 4844 5899
SAU301758 4845 5900
SAU301773 4846 5901
SAU301829 4847 5902
SAU301869 4848 5903
SAU301898 4849 5904
SAU302060 4850 5905
SAU302513 4851 5906
SAU302626 4852 5907
SAU302685 4853 5908
SAU302698 4854 5909
SAU302699 4855 5910
SAU302805 4856 5911
SAU302901 4857 5912
SAU302931 4858 5913
SAU302950 4859 5914
SAU302956 4860 5915
【０４４２】
表ＶＩＩ
配列番号 カンジダ
名称
14111 CaYDL105W
14112 CaYJL090C
14113 CaYLR127C
14114 CaYNL151C
14115 CaYPL083C
14116 CaYHR036W
14117 CaYNL256W
14118 CaYOL149W
14119 CaYDR361C
14120 CaYDR407C
14121 CaYBR070C
14122 CaYOR148C
14123 CaYJR041C
14124 CaYGR090W
14125 CaYBR123C
14126 CaYHR118C
14127 CaYKR063C
14128 CaYOR004W
14129 CaYML025C
14130 CaYKL033W
14131 CaYDR498C
14132 CaYIR011C
14133 CaYMR220W
14134 CaYPR105C
14135 CaYDL153C
14136 CaYPL128C
14137 CaYER026C
14138 CaYKL004W
14139 CaYMR200W
14140 CaYPR165W
14141 CaYHR007C
14142 CaYJL087C
14143 CaYLR229C
14144 CaYER118C
14145 CaYPL228W
14146 CaYPL160W
14147 CaYHR101C
14148 CaYML085C
14149 CaYBR243C
14150 CaYLR342W
14151 CaYOL026C
14152 CaYGR251W
14153 CaYDR118W
14154 CaYJL085W
14155 CaYDR052C
14156 CaYGR002C
14157 CaYLL004W
14158 CaYOR075W
14159 CaYMR005W
14160 CaYHR172W
14161 CaYGL122C
14162 CaYOR287C
14163 CaYMR149W
14164 CaYKR071C
14165 CaYDR412W
14166 CaYKR025W
14167 CaYJR112W
14168 CaYMR277W
14169 CaYKR083C
14170 CaYNL245C
14171 CaYNL181W
14172 CaYNL260C
14173 CaYDR365C
14174 CaYNL149C
14175 CaYGL029W
14176 CaYOR057W
14177 CaYIL022W
14178 CaYMR203W
14179 CaYOR206W
14180 CaYBR167C
14181 CaYDR016C
14182 CaYNL306W
14183 CaYJR067C
14184 CaYDR362C
14185 CaYLR355C
14186 CaYLR105C
14187 CaYML127W
14188 CaYPL011C
14189 CaYKL108W
14190 CaYCR035C
14191 CaYML114C
14192 CaYNL118C
14193 CaYDR527W
14194 CaYBR256C
14195 CaYGL233W
14196 CaYLR103C
14197 CaYOR340C
14198 CaYPR175W
14199 CaYJR093C
14200 CaYCL031C
14201 CaYML130C
14202 CaYAL033W
14203 CaYNL062C
14204 CaYNL132W
14205 CaYDL193W
14206 CaYDR489W
14207 CaYJL069C
14208 CaYPL063W
14209 CaYNL232W
14210 CaYNR054C
14211 CaYGR245C
14212 CaYPR162C
14213 CaYHR058C
14214 CaYKR081C
14215 CaYNL240C
14216 CaYPR168W
14217 CaYKL099C
14218 CaYLR008C
14219 CaYOL142W
14220 CaYDL015C
14221 CaYDR472W
14222 CaYNR046W
14223 CaYDR473C
14224 CaYGL207W
14225 CaYHR088W
14226 CaYIR015W
14227 CaYHR197W
14228 CaYMR218C
14229 CaYKL182W
14230 CaYDR325W
14231 CaYLL003W
14232 CaYNR026C
14233 CaYNL251C
14234 CaYPL126W
14235 CaYLR002C
14236 CaYJL061W
14237 CaYLR071C
14238 CaYML031W
14239 CaYIL147C
14240 CaYJL025W
14241 CaYOR353C
14242 CaYKR008W
14243 CaYMR033W
14244 CaYNL313C
14245 CaYGL225W
14246 CaYNL308C
14247 CaYDR353W
14248 CaYIL068C
14249 CaYPR190C
14250 CaYOR174W
14251 CaYDL150W
14252 CaYAL041W
14253 CaYMR227C
14254 CaYPL043W
14255 CaYDR324C
14256 CaYOL022C
14257 CaYOL069W
14258 CaYGR156W
14259 CaYDL003W
14260 CaYDR228C
14261 CaYKR062W
14262 CaYDR398W
14263 CaYNL126W
14264 CaYKL089W
14265 CaYMR028W
14266 CaYDR299W
14267 CaYOL034W
14268 CaYGR119C
14269 CaYDL111C
14270 CaYHR052W
14271 CaYKL021C
14272 CaYLL031C
14273 CaYHR040W
14274 CaYML015C
14275 CaYIL004C
14276 CaYDR302W
14277 CaYPR133C
14278 CaYDL195W
14279 CaYCR052W
14280 CaYFR042W
14281 CaYNR017W
14282 CaYOR254C
14283 CaYFL029C
14284 CaYBR265W
14285 CaYNL312W
14286 CaYBR155W
14287 CaYGR280C
14288 CaYJL203W
14289 CaYIR012W
14290 CaYMR093W
14291 CaYPR137W
14292 CaYLR298C
14293 CaYBR192W
14294 CaYPR112C
14295 CaYLL011W
14296 CaYER082C
14297 CaYDL217C
14298 CaYFL035C
14299 CaYOR262W
14300 CaYLR323C
14301 CaYAR007C
14302 CaYBL023C
14303 CaYBL026W
14304 CaYBL030C
14305 CaYBL035C
14306 CaYBL040C
14307 CaYBL050W
14308 CaYBL076C
14309 CaYBR002C
14310 CaYBR029C
14311 CaYBR080C
14312 CaYBR091C
14313 CaYBR135W
14314 CaYBR142W
14315 CaYBR143C
14316 CaYBR160W
14317 CaYBR196C
14318 CaYBR198C
14319 CaYBR202W
14320 CaYBR234C
14321 CaYBR236C
14322 CaYBR237W
14323 CaYBR253W
14324 CaYBR254C
14325 CaYCL003W
14326 CaYCL017C
14327 CaYCL054W
14328 CaYCR012W
14329 CaYCR057C
14330 CaYCR072C
14331 CaYDL030W
14332 CaYDL043C
14333 CaYDL055C
14334 CaYDL060W
14335 CaYDL084W
14336 CaYDL087C
14337 CaYDL126C
14338 CaYDL132W
14339 CaYDL141W
14340 CaYKL059C
14341 CaYDL108W
14342 CaYKL060C
14343 CaYHR070W
14344 CaYGR195W
14345 CaYOL102C
14346 CaYOR074C
14347 CaYGL155W
14348 CaYLR305C
14349 CaYNL222W
14350 CaYDR236C
14351 CaYBL020W
14352 CaYNL261W
14353 CaYDR246W
14354 CaYNL075W
14355 CaYOR145C
14356 CaYOL077C
14357 CaYBR257W
14358 CaYHR170W
14359 CaYNL263C
14360 CaYKR068C
14361 CaYPR016C
14362 CaYGR172C
14363 CaYHR089C
14364 CaYMR197C
14365 CaYHR188C
14366 CaYPL266W
14367 CaYBR011C
14368 CaYCL059C
14369 CaYDL008W
14370 CaYDL097C
14371 CaYDL143W
14372 CaYDL205C
14373 CaYDL208W
14374 CaYDR002W
14375 CaYDR013W
14376 CaYDR023W
14377 CaYDR037W
14378 CaYDR045C
14379 CaYDR054C
14380 CaYDR086C
14381 CaYDR087C
14382 CaYDR091C
14383 CaYDR167W
14384 CaYDR172W
14385 CaYDR189W
14386 CaYDR196C
14387 CaYDR212W
14388 CaYDR238C
14389 CaYDR280W
14390 CaYDR331W
14391 CaYDR373W
14392 CaYDR376W
14393 CaYDR390C
14394 CaYDR394W
14395 CaYDR404C
14396 CaYDR429C
14397 CaYDR454C
14398 CaYEL020W-A
14399 CaYEL026W
14400 CaYER003C
14401 CaYER006W
14402 CaYER012W
14403 CaYER021W
14404 CaYER036C
14405 CaYER094C
14406 CaYER125W
14407 CaYER148W
14408 CaYER159C
14409 CaYFL002C
14410 CaYFL005W
14411 CaYFL017C
14412 CaYFL022C
14413 CaYFL038C
14414 CaYFL045C
14415 CaYFR004W
14416 CaYFR037C
14417 CaYFR050C
14418 CaYFR052W
14419 CaYDL029W
14420 CaYDL147W
14421 CaYDL148C
14422 CaYDR060W
14423 CaYDR062W
14424 CaYDR211W
14425 CaYDR328C
14426 CaYER025W
14427 CaYER136W
14428 CaYER171W
14429 CaYFL008W
14430 CaYGL001C
14431 CaYGL008C
14432 CaYGL011C
14433 CaYGL022W
14434 CaYGL044C
14435 CaYGL048C
14436 CaYGL068W
14437 CaYGL097W
14438 CaYGL112C
14439 CaYGL120C
14440 CaYGL130W
14441 CaYGR029W
14442 CaYGR060W
14443 CaYGR094W
14444 CaYGR103W
14445 CaYGR185C
14446 CaYGR211W
14447 CaYGR218W
14448 CaYGR246C
14449 CaYGR253C
14450 CaYHL015W
14451 CaYHR005C-A
14452 CaYHR019C
14453 CaYHR020W
14454 CaYHR024C
14455 CaYHR062C
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14457 CaYHR072W-A
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14464 CaYHR169W
14465 CaYHR190W
14466 CaYIL003W
14467 CaYIL021W
14468 CaYIL075C
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14473 CaYJL001W
14474 CaYJL014W
14475 CaYJL050W
14476 CaYJL074C
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14478 CaYJL104W
14479 CaYJL111W
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14481 CaYJL167W
14482 CaYJL194W
14483 CaYJR006W
14484 CaYJR017C
14485 CaYJR064W
14486 CaYJR065C
14487 CaYJR072C
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14490 CaYKL019W
14491 CaYKL028W
14492 CaYKL058W
14493 CaYKL104C
14494 CaYKL144C
14495 CaYKL145W
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14497 CaYKL210W
14498 CaYKR079C
14499 CaYKR086W
14500 CaYLL018C
14501 CaYLR005W
14502 CaYLR009W
14503 CaYLR022C
14504 CaYLR026C
14505 CaYLR051C
14506 CaYLR060W
14507 CaYLR078C
14508 CaYLR100W
14509 CaYLR116W
14510 CaYLR117C
14511 CaYLR129W
14512 CaYLR147C
14513 CaYLR153C
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14515 CaYLR175W
14516 CaYLR186W
14517 CaYLR197W
14518 CaYLR208W
14519 CaYLR222C
14520 CaYLR259C
14521 CaYLR276C
14522 CaYLR277C
14523 CaYLR291C
14524 CaYLR293C
14525 CaYLR347C
14526 CaYLR378C
14527 CaYLR397C
14528 CaYML064C
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14530 CaYML092C
14531 CaYML093W
14532 CaYML125C
14533 CaYML126C
14534 CaYMR113W
14535 CaYMR131C
14536 CaYMR146C
14537 CaYMR208W
14538 CaYMR213W
14539 CaYMR240C
14540 CaYMR260C
14541 CaYMR308C
14542 CaYMR314W
14543 CaYNL002C
14544 CaYNL006W
14545 CaYNL061W
14546 CaYNL102W
14547 CaYNL113W
14548 CaYNL178W
14549 CaYNL189W
14550 CaYNL244C
14551 CaYNL247W
14552 CaYNL287W
14553 CaYNR043W
14554 CaYOL005C
14555 CaYOL010W
14556 CaYOL094C
14557 CaYOL139C
14558 CaYOR048C
14559 CaYOR056C
14560 CaYOR063W
14561 CaYOR103C
14562 CaYOR116C
14563 CaYOR117W
14564 CaYOR151C
14565 CaYOR157C
14566 CaYOR159C
14567 CaYOR168W
14568 CaYOR194C
14569 CaYOR207C
14570 CaYOR210W
14571 CaYOR217W
14572 CaYOR224C
14573 CaYOR232W
14574 CaYOR259C
14575 CaYOR261C
14576 CaYOR272W
14577 CaYOR294W
14578 CaYOR310C
14579 CaYOR335C
14580 CaYOR341W
14581 CaYPL010W
14582 CaYPL076W
14583 CaYPL094C
14584 CaYPL117C
14585 CaYPL122C
14586 CaYPL131W
14587 CaYPL211W
14588 CaYPL235W
14589 CaYPL252C
14590 CaYPR019W
14591 CaYPR025C
14592 CaYPR034W
14593 CaYPR055W
14594 CaYPR056W
14595 CaYPR082C
14596 CaYPR103W
14597 CaYPR107C
14598 CaYPR108W
14599 CaYPR110C
14600 CaYPR113W
14601 CaYPR176C
14602 CaYPR183W
14603 CaYPR186C
14604 CaYPR187W
14605 CaYGL123W
14606 CaYHR042W
14607 CaYIL062C
14608 CaYJR042W
14609 CaYJR063W
14610 CaYJR076C
14611 CaYKL013C
14612 CaYLR196W
14613 CaYLR272C
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14616 CaYDR397C
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14618 CaYBR060C
14619 CaYBR154C
14620 CaYDL028C
14621 CaYDR088C
14622 CaYDR235W
14623 CaYDR267C
14624 CaYDR460W
14625 CaYEL032W
14626 CaYER013W
14627 CaYER048W-A
14628 CaYER172C
14629 CaYFR031C
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14631 CaYGL073W
14632 CaYGL091C
14633 CaYGL103W
14634 CaYGL116W
14635 CaYGL201C
14636 CaYGL245W
14637 CaYGL247W
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14640 CaYGR083C
14641 CaYGR128C
14642 CaYHR074W
14643 CaYHR107C
14644 CaYIL126W
14645 CaYJL010C
14646 CaYJL011C
14647 CaYJL026W
14648 CaYJL039C
14649 CaYJL041W
14650 CaYJR045C
14651 CaYKL049C
14652 CaYKL152C
14653 CaYKL181W
14654 CaYLR086W
14655 CaYLR115W
14656 CaYLR223C
14657 CaYLR274W
14658 CaYLR336C
14659 CaYML065W
14660 CaYML098W
14661 CaYMR043W
14662 CaYMR112C
14663 CaYMR281W
14664 CaYMR288W
14665 CaYMR290C
14666 CaYMR309C
14667 CaYNL039W
14668 CaYNL110C
14669 CaYNL221C
14670 CaYNL317W
14671 CaYNR053C
14672 CaYOL038W
14673 CaYOR095C
14674 CaYOR204W
14675 CaYOR249C
14676 CaYOR250C
14677 CaYOR257W
14678 CaYOR370C
14679 CaYPL151C
14680 CaYPL204W
14681 CaYPL209C
14682 CaYPL242C
14683 CaYPR048W
14684 CaYPR086W
14685 CaYPR178W
14686 CaYIL109C
14687 CaYKL045W
14688 CaYLR316C
14689 CaYBR087W
14690 CaYGR048W
14691 CaYPL169C
14692 CaYGR186W
14693 CaYNL131W
14694 CaYLR088W
14695 CaYKL193C
14696 CaYJR007W
14697 CaYJL034W
14698 CaYDL207W
14699 CaYDL017W
14700 CaYAL035W
14701 CaYBR038W
14702 CaYBR159W
14703 CaYDR120C
14704 CaYER070W
14705 CaYGL003C
14706 CaYGL206C
14707 CaYAL043C
14708 CaYBL097W
14709 CaYBL105C
14710 CaYBR079C
14711 CaYBR088C
14712 CaYDL145C
14713 CaYDL166C
14714 CaYDR145W
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14732 CaYLR029C
14733 CaYLR167W
14734 CaYLR243W
14735 CaYLR249W
14736 CaYLR321C
14737 CaYLR383W
14738 CaYMR239C
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14740 CaYNL163C
14741 CaYNR038W
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14744 CaYPL028W
14745 CaYPL153C
14746 CaYPL210C
14747 CaYPL217C
14748 CaYPR010C
14749 CaYPR144C
14750 CaYPR169W
14751 CaYDL140C
14752 CaYDL031W
14753 CaYHR186C
14754 CaYPL093W
14755 CaYKL035W
14756 CaYDL058W
14757 CaYDR341C
14758 CaYGL238W
14759 CaYFR028C
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14761 CaYDR190C
14762 CaYEL055C
14763 CaYPR041W
14764 CaYGR255C
14765 CaYBR055C
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14769 CaYMR015C
14770 CaYNL280C
14771 CaYML075C
14772 CaYCR042C
14773 CaYMR235C
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14778 CaYHR005C
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14780 CaYIL115C
14781 CaYGR147C
14782 CaYOR336W
14783 CaYPR159W
14784 CaYJL174W
14785 CaYOL130W
14786 CaYNL048W
14787 CaYER007W
14788 CaYGL106W
14789 CaYDL102W
14790 CaYDL007W
14791 CaYER031C
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14802 CaYLR306W
14803 CaYLR300W
14804 CaYKL046C
14805 CaYDR311W
14806 CaYDR449C
14807 CaYER023W
14808 CaYGL040C
14809 CaYGR009C
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14811 CaYOL066C
14812 CaYOR119C
14813 CaYMR049C
14814 CaYNR050C
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14816 CaYER113C
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14818 CaYGR006W
14819 CaYJL122W
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14891 CaYCR048W
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14894 CaYGR070W
14895 CaYGR209C
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14941 orf6.8461
14942 orf6.8607
14943 orf6.8654
14944 orf6.8716
【図面の簡単な説明】
【０４４３】
【図１Ａ】ＡおよびＢは、培養物中で過小発現または過剰発現される増幅産物を特定する１つの方法を説明する。
【図１Ｂ】ＡおよびＢは、培養物中で過小発現または過剰発現される増幅産物を特定する１つの方法を説明する。
【図２Ａ】ＡおよびＢは、培養物中で過小発現または過剰発現される増幅産物を特定する別の方法を説明する。
【図２Ｂ】ＡおよびＢは、培養物中で過小発現または過剰発現される増幅産物を特定する別の方法を説明する。
【図３】ハイブリダイゼーション分析の結果を示し、この結果によれば培養物中の株により発現されるアンチセンス核酸が化合物の標的をコードする遺伝子のすべてまたは一部に相補的ではない（すなわち非特異的な株）。
【図４】ハイブリダイゼーション分析の結果を示し、この結果によれば培養物中の株により発現されるアンチセンス核酸が化合物の標的をコードする遺伝子のすべてまたは一部に相補的であり、その株に関するハイブリダイゼーション強度は化合物の濃度に緊密に相関している（すなわち、特定の株）。
【図５】Ａは、染色体における天然プロモーターの５’にある配列に相同的な５’領域、および染色体プロモーターを置換するためのプロモーター、および染色体における天然プロモーターの３’の配列に相同的である３’領域を含むプロモーター置換カセットを用いてプロモーターを置換する方法を説明する。 Ｂは、天然プロモーターの５’にある配列に相同的な５’領域と、染色体プロモーターを置換するためのプロモーターとの間に配置された特定可能マーカーまたは選択可能マーカーをコードする核酸、および特定可能マーカーまたは選択可能マーカーをコードする遺伝子の３’の転写終結因子を含むプロモーター置換カセットを用いてプロモーターを置換する方法を説明する。
【図６Ａ】ＡおよびＢは、遺伝子（ＣａＫＲＥ９）の１つの対立遺伝子の遺伝子崩壊、および標的遺伝子の第２の対立遺伝子のプロモーター置換を構築し、第２の対立遺伝子を異種プロモーターによる条件調節制御下に置くＧＲＡＣＥ方法を表す。
【図６Ｂ】ＡおよびＢは、遺伝子（ＣａＫＲＥ９）の１つの対立遺伝子の遺伝子崩壊、および標的遺伝子の第２の対立遺伝子のプロモーター置換を構築し、第２の対立遺伝子を異種プロモーターによる条件調節制御下に置くＧＲＡＣＥ方法を表す。
【図７】Ａは、阻害レベルの３−アミノトリアゾールの存在下での、テトラサイクリンプロモーター調節イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼを構成的に発現するＣａＨＩＳ３ ＧＲＡＣＥ株と比較した場合の、野生型株およびＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株の成長を表す。 Ｂは、中間レベルの３−アミノトリアゾールの存在下での、野生型株、ハプロ不全(haploinsufficient)ＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株、およびテトラサイクリンプロモーター調節イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼを構成的に発現するＣａＨＩＳ３ ＧＲＡＣＥ株の成長を表す。 Ｃは、中間レベルの３−アミノトリアゾールの存在下での、野生型株、ハプロ不全(haploinsufficient)ＣａＨＩＳ３ヘテロ接合体株、およびテトラサイクリンプロモーター調節イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼを最小限に発現するＣａＨＩＳ３ ＧＲＡＣＥ株の成長を表す。 Ｄは、中間レベルの３−アミノトリアゾールの存在下での、テトラサイクリンプロモーター調節イミダゾールグリセロールリン酸デヒドラターゼを最小限に発現するＣａＨＩＳ３ ＧＲＡＣＥ株の過感受性を表す。
【図８】非抑制条件下での発現の上昇を示すための、ＧＲＡＣＥ株から単離したＣａＨＩＳ３、ＣａＡＬＲ１、ＣａＣＤＣ２４、およびＣａＫＲＥ９ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
【図９】ＫＲＥ１、ＫＲＥ５、ＫＲＥ６、およびＫＲＥ９による、ＧＲＡＣＥ技術を用いた条件遺伝子発現を示す。
【図１０】ＣａＫＲＥ１、ＣａＴＵＢ１、ＣａＡＬＧ７、ＣａＡＵＲ１、ＣａＦＫＳ１、およびＣａＳＡＴ２による、ＧＲＡＣＥ技術を用いた条件遺伝子発現を示す。
【図１１】それぞれの側にプロモーターに相同的な４０個のヌクレオチドが隣接したｌａｃオペレータを含むオリゴヌクレオチドが、プロモーターにｌａｃオペレータを挿入する際に使用するためのオペロン中のｙａｂＢ ｙａｂＣ ｆｔｓＬ ｆｔｓＩ ｍｕｒＥ遺伝子の発現を駆動するプロモーターであることを示す。
【図１２】１０倍過剰量でマトリクスフォーマットにおいて勾配濃度で抗生物質および誘導物質を含有する微量滴定プレートを示す。
【図１３】適切な誘導物質濃度で、ｄｅｆＢ遺伝子産物を過剰発現する細胞が高濃度の抗生物質アクチノニンで成長することが可能であったことを実証する実験の結果を示す。
【図１４】適切な誘導物質濃度で、ｆｏｌＡ遺伝子産物を過剰発現する細胞が高濃度の抗生物質トリメトプリムで成長することが可能であったことを実証する実験の結果を示す。
【図１５】ｆａｂＩ遺伝子の過剰発現が、ｆａｂＩ遺伝子の遺伝子産物に対して作用するトリクロサンに対する耐性を付与するが、それぞれが他の遺伝子産物に対して作用するセルレニン、トリメトプリム、またはアクチノニンに対する耐性を付与しないことを実証する実験の結果を示す。
【図１６】ｆｏｌＡ遺伝子の過剰発現が、ｆｏｌＡ遺伝子の遺伝子産物に対して作用するトリメトプリムに対する耐性を付与するが、それぞれが他の遺伝子産物に対して作用するトリクロサン、セルレニン、またはアクチノニンに対する耐性を付与しないことを実証する実験の結果を示す。
【図１７】ｄｅｆＢ遺伝子の過剰発現が、ｄｅｆＢ遺伝子の遺伝子産物に対して作用するアクチノニンに対する耐性を付与するが、それぞれが他の遺伝子産物に対して作用するセルレニン、トリメトプリム、またはトリクロサンに対する耐性を付与しないことを実証する実験の結果を示す。
【図１８】ｆａｂＢ遺伝子の過剰発現が、ｆａｂＢ遺伝子の遺伝子産物であるβケト−アシル担体タンパク質シンターゼに対して作用するセルレニンに対する耐性を付与するが、それぞれが他の遺伝子産物に対して作用するトリクロサン、トリメトプリム、またはアクチノニンに対する耐性を付与しないことを実証する実験の結果を示す。
【図１９】９個の株の混合物が、様々な濃度の誘導物質、およびアクチノニン、セルレニン、トリクロサン、またはトリメトプリムの標的を過剰発現しない株の成長を阻害するのに十分な濃度のこれらの抗生物質を含有する培地中で、９６ウェルプレート中のウェルで成長させた実験の結果を示す。【Technical field】
[0001]
[Field of the Invention]
The present invention provides reagents and methods for identifying targets for compounds that reduce the activity or level of a gene product required for cell growth. Further, the present invention provides reagents and methods for identifying new therapeutic compounds or compounds that act on new targets.
[Background Art]
[0002]
[Background of the Invention]
Many important therapeutic compounds act by reducing or eliminating the activity or level of a gene product that is required for cell growth. For example, most antibiotic compounds act by reducing or eliminating the activity or level of a gene product that is required for the growth of a pathogen. Similarly, compounds used to treat or ameliorate cancer also reduce or inhibit the activity or levels of gene products required for cell growth.
[0003]
Current drug discovery methods involve screening large numbers of potential therapeutic compounds to identify those that are or can be optimized to provide effective therapeutics. . For example, a compound to be evaluated for therapeutic activity may be a member of a compound library generated by combinatorial chemistry, or a member of a natural product library.
[0004]
Unfortunately, current methods are laborious and time consuming, and can result in compounds that act on gene products that have already been identified or that are already targeted by existing therapeutics. Therefore, there is a need for rapid screening techniques that result in new compounds or compounds that act against new targets.
[0005]
In addition, a large number of compounds have been identified that have antibacterial activity but cannot be administered to individuals suffering from infection due to the fact that their targets are unknown. Therefore, there is a need for a method that allows the identification of targets on which compounds having antibacterial activity act.
[0006]
Sequence listing
This application is filed with four copies of a CD-ROM labeled "Copy 1", "Copy 2", "Copy 3", and "CRF" containing a sequence listing in electronic format. Each copy of the CD-ROM has a file name of 028vpc-final.file created on February 8, 2002 and having a size of 36,220,587 bytes. txt. The information on these duplicate CD-ROMs is incorporated herein by reference in its entirety.
[0007]
Definition
As used herein, the term "required for growth" or "required for growth" refers to the absence or substantial reduction in gene transcripts and / or gene products that completely eliminates cell growth. And the absence of gene transcripts and / or gene products merely reduces cell growth.
[0008]
"E. coli or Escherichia coli" refers to Escherichia coli or Shigella boydii, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Shigella sonne (Shigella sonne). ), And any organism that has been classified as a species of the genus Shigella, including Shigella 2A.
[0009]
"Homologous encoding nucleic acid" means a nucleic acid homologous to a nucleic acid encoding a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 or a portion thereof. In some embodiments, the homologous encoding nucleic acid is SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, and at least 10, 15, 20, 25, 30, At least a nucleotide sequence selected from the group consisting of fragments comprising 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides; It may have 97%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, or at least 70% nucleotide sequence identity. In other embodiments, the homologous encoding nucleic acid is a nucleotide sequence complementary to one of SEQ ID NOs: 8-3795, and at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 thereof. At least 97%, at least 95%, based on a nucleotide sequence selected from the group consisting of: 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides. %, At least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, or at least 40% nucleotide sequence identity. Identity can be measured using the default parameter BLASTN version 2.0, or the default parameter tBLASTX (Altschul, SF et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res). 25: 3389-3402 (1997), the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety). Alternatively, a “homologous encoding nucleic acid” can be identified by a member of a given gene for a functional ortholog cluster. All other members of this ortholog cluster are considered homologous. A library of such functional ortholog clusters can be found at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG. Genes can be obtained by using the COGNITOR program available on the website above, or by direct BLASTP comparison of a given gene to COG members and Tatusov, RL, Galperin, MY, Natale, DA and Koonin, EV (2000) The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution. Nucleic Acids Research v.28 n.1, pp. Analysis of these results, as described in 33-36, allows categorization into orthologous clusters, or COGs.
[0010]
The term "homologous coding nucleic acid" also refers to one of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778, as determined using the FASTA version 3.0t78 algorithm with default parameters. Or a polypeptide whose expression is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence of one of SEQ ID NOs: 8 to 3795, or at least 5, 10, 15, 20, 25 For fragments containing 30, 30, 35, 40, 50, 75, 100, or 150 contiguous amino acids, at least 99%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, low Kutomo 50%, encompasses a nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a polypeptide having at least 40%, or at least 25% amino acid identity or similarity. Alternatively, protein identity or similarity can be identified using BLASTP with default parameters, BLASTX with default parameters, BLASTN with default parameters, or tBLASTX with default parameters (Altschul, SF et al. Gapped BLAST and PSI- BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety).
[0011]
The term "homologous encoding nucleic acid" also includes stringent nucleic acids selected from the group consisting of nucleotide sequences complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. At least 10, 15, 20, complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Fragments containing 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides are hybridized under stringent conditions. Includes coding nucleic acids that include a soybean nucleotide sequence. As used herein, “stringent conditions” refers to hybridization to filter-bound nucleic acid in 6 × SSC at about 45 ° C., followed by 0.1 × SSC / 0.2% at about 68 ° C. Means one or more washes in SDS. Other exemplary stringent conditions are, for example, in 6 × SSC / 0.05% sodium pyrophosphate at 37 ° C., 48 ° C., 55 ° C., and 60 ° C. as appropriate for the particular probe used. Cleaning may be referred to.
[0012]
The term “homologous encoding nucleic acid” also refers to a nucleotide sequence selected from the group consisting of sequences complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. And at least 10, 15 of the sequences complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 Moderate to fragments containing 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides Includes an encoding nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under conditions. As used herein, “moderate conditions” refers to hybridization to filter-bound DNA in 6 × sodium chloride / sodium citrate (SSC) at about 45 ° C., followed by about 42-65 ° C. One wash, preferably three to five washes in 0.2 × SSC / 0.1% SDS.
[0013]
The term "homologous coding nucleic acid" also encodes a gene product whose activity can be complemented by a gene encoding a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Includes nucleic acids comprising nucleotide sequences. In some embodiments, the homologous encoding nucleic acid is activated by a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. May encode a gene product that is complemented. In other embodiments, the homologous encoding nucleic acid is a nucleotide sequence encoding a gene product whose activity is complemented by one of the polypeptides of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. May be included.
[0014]
The term "homologous antisense nucleic acid" refers to one of the sequences of SEQ ID NOs: 8 to 3795, and at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 of them. At least 97%, at least 95%, at least 95%, based on a nucleotide sequence selected from the group consisting of: fragments comprising 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides. Include nucleic acids comprising nucleotide sequences having 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, or at least 40% nucleotide sequence identity. Homologous antisense nucleic acids can also include one of the sequences of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, and at least 10, 15, 20, 25, 30 of them. , 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 or 500 contiguous nucleotides. Nucleotide sequence having at least 97%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, or at least 40% nucleotide sequence identity to the nucleotide sequence May be a nucleic acid containing Nucleic acid identity can be determined as described above.
[0015]
The term "homologous antisense nucleic acid" also includes antisense nucleic acids that include a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence that is complementary to one of SEQ ID NOs: 8-3795; At least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 of sequences complementary to one of 3795 And antisense nucleic acids comprising nucleotide sequences that hybridize under stringent conditions to fragments containing 400, 400, or 500 contiguous nucleotides. A homologous antisense nucleic acid also includes a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acids and at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 of one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 , 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides, including antisense nucleic acids comprising nucleotide sequences that hybridize under stringent conditions.
[0016]
The term "homologous antisense nucleic acid" also includes antisense nucleic acids that include a nucleotide sequence that hybridizes under moderate conditions to a nucleotide sequence that is complementary to one of SEQ ID NOs: 8-3795; At least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 of sequences complementary to one of 3795 And antisense nucleic acids that include nucleotide sequences that hybridize under moderate conditions to fragments containing 400, 400, or 500 contiguous nucleotides. A homologous antisense nucleic acid also includes a nucleotide sequence that hybridizes under moderate conditions to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acids and at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 of one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 , 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides, including antisense nucleic acids comprising nucleotide sequences that hybridize under moderate conditions.
[0017]
"Homologous polypeptide" refers to a polypeptide homologous to a polypeptide whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, or by a homologous antisense nucleic acid. Means peptide. The term "homologous polypeptide" refers to at least 99%, at least 95%, of a polypeptide whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, or by a homologous antisense nucleic acid. A polypeptide having at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 40%, or at least 25% amino acid identity or similarity, or SEQ ID NOs: 8-3795. Or at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 polypeptides whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of, or by a homologous antisense nucleic acid. , 50, 75, 100, or 150 contiguous nets At least 99%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 40%, or at least 25%, relative to the polypeptide for the acid-containing fragment. % Polypeptides having amino acid identity or similarity. Identity or similarity can be determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters. Alternatively, protein identity or similarity can be identified using BLASTP with default parameters, TBLASTX with default parameters, or BLASTN with default parameters (Altschul, SF et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety).
[0018]
The term homologous polypeptide also refers to a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778, at least 99%, 95%, at least 90%, A polypeptide having at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 40%, or at least 25% amino acid identity or similarity; and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, At least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100 of polypeptides selected from the group consisting of 10013 to 14110, and 14945 to 15778 Or 150 consecutive At least 99%, 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, at least 60%, at least 50%, at least 40%, or at least 25% amino acid identity or similarity to the amino acid Includes polypeptides having sex properties.
[0019]
The term Salmonella is a generic name for a large group of gram-negative enterobacteria closely related to Escherichia coli. Diseases caused by Salmonella are often due to contamination of food or water supplies, affecting hundreds of people each year. The traditional method of Salmonella taxonomy was based on assigning a distinct species name to each serologically identifiable strain (Kauffmann, F 1966 The bacteriology of the Enterobacteriaceae. Munksgaard, Copenhagen). Salmonella serology is based on surface antigens (O [cells] and H [flagells]). More than 2,400 serotypes or subtypes of Salmonella are known (Popoff, et al. 2000 Res. Microbiol. 151: 63-65). Thus, each serotype is considered to be a distinct species, and thus is often named (eg, S. paratyphi, S. typhimurium, S. typhimurium). (S. typhi), s. Enteriditis, etc.).
[0020]
However, by the 1970s and 1980's, this system was found to be not only cumbersome but also inaccurate. Subsequently, many Salmonella species are grouped into a single species (all serotypes and serovars I, II and IV, and all serotypes in Arizona), and the second species, S. aureus. Bongori was also recognized (Crosa, et al. 1973,
J. Bacteriol. 115: 307-315). Species names are based on highly variable surface antigens, but Salmonella is very similar in other situations, mainly except for pathogenic determinants.
[0021]
There have been some debates about the official names for Salmonella species. Generally (Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38: 2465-2467), the accepted name is Salmonella enterica. S. Enterica has six subspecies (I: S. enterica subsp. Enterica, II: S. enterica subsp. Salamae, IIIa: S. enterica subsp. Arizonae, IIIb: S. enterica subsp. Diarizonae ( diarizonae), IV: S. enterica subsp. houtenae, and VI: S. enterica subsp. indica). Within subspecies I, serotypes are used to identify serotypes or blood group subspecies, respectively (eg, S. enterica serotype Enteriditis, S. enterica serotype Tafimarium, S. enterica serotype Typhi, and S. enterica serotype Choleraesuis). The conventional convention is to spell this (Salmonella enterica serovar Tafimariam) on first use and use its abbreviation (Salmonella tafimariam or S. tafimariam tafimariam). Note that the genus and species names (Salmonella enterica) are written in italics, but the serotype / serogroup variants (tafimariam) are not written in italics. This latter system is to be used by the CDC, as the taxonomy committee still has to recommend officially correct species names (Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38: 2465-2467). Due to the relationship between both taxonomic preferences and medical significance, some of these serotypes may eventually receive full species names (s. Typhi would be most prominent).
[0022]
Thus, as described herein, "Salmonella enterica, also S. enterica" encompasses serovar subtypes chifi, tafimariam, Paratyphi cholera swiss and the like. However, the "official" name claim is pending and the taxonomic name can change (S. cholera suisse is a species name that can simply replace S. enterica on a priority basis).
[0023]
By "inducer" is meant an agent or solution that increases transcription, or inhibitor and / or promoter clearance / fidelity, from a desired promoter when placed in contact with a cell or microorganism.
[0024]
As used herein, "nucleic acid" means DNA, RNA, or modified nucleic acids. Accordingly, the terminology "nucleic acid of SEQ ID NO: X" or "nucleic acid comprising a nucleotide sequence" refers to the DNA sequence of SEQ ID NO: X, and to replace thymidine in the DNA sequence with uridine in the RNA sequence and to deoxygenate the DNA sequence. It includes both RNA sequences in which the ribose backbone has been replaced by a ribose backbone in the RNA sequence. Modified nucleic acids are nucleic acids having non-naturally occurring nucleotides or structures, for example, nucleic acids in which the internucleotide phosphate residues are methylphosphonate, phosphorothioate, phosphoramidate, and phosphate. Between non-phosphate nucleotides such as siloxane bridges, carbonate bridges, thioester bridges, as well as many others known in the art, can also be used for modified nucleic acids.
[0025]
Modified nucleic acids also include α-anomeric nucleotide units and 1,2-dideoxy-d-ribofuranose, 1,2-dideoxy-1-phenylribofuranose, and N Four , N Four Modified nucleotides such as -ethano-5-methyl-cytosine may be included and are contemplated for use in the present invention. Modified nucleic acids are also peptide nucleic acids in which the entire deoxyribose-phosphate backbone has been replaced with a completely chemically similar but structurally similar polyamide (peptide) backbone containing 2-aminoethylglycine units. You may.
[0026]
As used herein, the term "overexpressing" refers to any gene product level that is higher than the level carried by the wild-type cell, or the affinity for a test compound that is lower than the affinity of the wild-type gene product. While the term "underexpressed" refers to a gene product level that is lower than that carried by a wild-type cell, or an affinity for a test compound that is higher than that of a wild-type gene product. Refers to a stock that holds any of the above.
DISCLOSURE OF THE INVENTION
[Means for Solving the Problems]
[0027]
[Summary of the Invention]
Some aspects of the invention are described in the following numbered paragraphs.
[0028]
1. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0029]
2. The method of paragraph 1, wherein the culture comprises at least one strain that does not overexpress a gene product that is essential for growth of the organism.
[0030]
3. The method of paragraph 1, wherein the strain that overexpresses the gene product comprises a nucleic acid encoding the gene product that is essential for growth of the organism, operably linked to a regulatable promoter.
[0031]
4. The method of paragraph 1, wherein the strain that overexpresses the gene product comprises a nucleic acid encoding the gene product that is essential for growth of the organism, operably linked to a constitutive promoter.
[0032]
5. The method of paragraph 1, wherein said identifying step comprises determining a nucleotide sequence of a nucleic acid encoding said gene product in said cells that have grown more rapidly in said culture.
[0033]
6. The method of paragraph 1, wherein the identifying step comprises performing an amplification reaction to identify a nucleic acid encoding the gene product in the cells that have grown more rapidly in the cell culture.
[0034]
7. The method of paragraph 6, wherein the product of the amplification reaction is labeled with a detectable dye.
[0035]
8. The method of paragraph 1, wherein said identifying step comprises performing a hybridization procedure.
[0036]
9. The method of paragraph 1, wherein the identifying step comprises contacting a nucleic acid encoding the gene product in the cell that has grown more rapidly in the cell culture with a nucleic acid array.
[0037]
10. The method of paragraph 1, wherein the organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa.
[0038]
11. The culture may be Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, Bordetella pertussis (Burkholderia cepacia), Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called Torulopsis glabrata), Candida tropicalis and Candida tropicalis・ Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr (Candida pseudotropicalis) ), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium difficile (Clostridium perfringens), Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae, Enterococcus ocococ Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori licobacter pylori), Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis r. Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneurosis m. Bulgaris (Proteus vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella Enterelica (Salmonella enterica), Salmonella paratyphi (Salmonella paratyphi), Salmonella typhi (Salmonella typhimur), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), cats Boigy (Shigella boydii), Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus neum, Staphylococcus neum Selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis A culture object, a method according to paragraph 1.
[0039]
12. The method of paragraph 1, wherein the compound is obtained from a library of natural compounds.
[0040]
13. The method of paragraph 1, wherein the compound is obtained from a library of synthetic compounds.
[0041]
14． The method of paragraph 1, wherein the compound is present in a crude or incompletely purified state.
[0042]
15. The method of paragraph 1, further comprising determining whether the gene product in the strain that grew more rapidly in the culture has a counterpart in at least one other organism.
[0043]
16. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for growth of the organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the gene product that is
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
A method comprising identifying a gene product that is overexpressed by a strain that grew faster in said culture.
[0044]
17. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for growth of the organism, and selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5916 to 10012, and 14111 to 14944. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0045]
18. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Obtaining a culture containing a strain that overexpresses a gene product comprising the amino acid sequence,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0046]
19. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism and comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for the gene product to be selected, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising Consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from: A gene product encoded by a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, from a group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions Activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid containing the selected nucleotide sequence and a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 Group consisting of gene products that can be To obtain a culture containing strains overexpressing the gene product al selected,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0047]
20. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a given nucleotide sequence, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of -4860, 5916-10012, and 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under moderate conditions. and Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence hybridizing to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 4111-14944 thing,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0048]
21. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Obtaining a culture containing a strain overexpressing a gene product containing a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0049]
22. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining an array of strains on a solid growth medium, overexpressing various gene products essential for the growth of said organism;
Contacting the array of strains with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts to overexpress the gene product on which the compound acts Growing the strain faster than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are overexpressed by strains that grew more rapidly in the culture
A method that includes
[0050]
23. 22. The method of paragraph 21, wherein at least one strain in the array does not overexpress a gene product that is essential for growth of the organism.
[0051]
24. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a plurality of cultures containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism,
Contacting each of said plurality of cultures with said compound at various concentrations; and
Identifying a gene product that is overexpressed by a strain whose growth is inhibited by the compound
A method that includes
[0052]
25. 24. The method of paragraph 23, wherein at least one strain in said plurality of cultures does not overexpress a gene product that is essential for growth of said organism.
[0053]
26. A method for profiling the activity of a compound, comprising:
Performing the method of paragraph 1 on a first culture with a first compound;
Performing the method of paragraph 1 on a second culture with a second compound; and
A method comprising comparing a strain identified in said first culture with a strain identified in said second culture.
[0054]
27. A method for profiling the activity of a first compound, comprising:
An array of strains, including strains that overexpress various gene products essential for the growth of an organism, on a first solid medium containing the first compound that inhibits the growth of the organism, and growth of the organism Growing on a second solid medium comprising a second compound that inhibits
Comparing the pattern of strains grown on the first solid medium with the pattern of strains grown on the second solid medium.
A method that includes
[0055]
28. 28. The method of paragraph 26 or 27, wherein the first compound is present in a crude or incompletely purified state.
[0056]
29. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0057]
30. 30. The method of paragraph 29, wherein at least one strain in the culture does not underexpress a gene product that is essential for growth of the organism.
[0058]
31. The paragraph underexpressing the gene product comprises a nucleic acid complementary to at least a portion of a gene encoding the gene product that is essential for growth of the organism, operably linked to a regulatable promoter. 29. The method according to 29.
[0059]
32. The strain underexpressing the gene product expresses an antisense nucleic acid complementary to at least a part of a gene encoding the gene product that is essential for growth of the organism, and the expression of the antisense nucleic acid 30. The method of paragraph 29, wherein expression of said gene product in the strain is reduced.
[0060]
33. 30. The method of paragraph 29, wherein said identifying comprises determining the nucleotide sequence of a nucleic acid encoding said gene product in said more slowly growing strain.
[0061]
34. 30. The method of paragraph 29, wherein said identifying step comprises performing an amplification reaction to identify a nucleic acid encoding said gene product in said more slowly growing cells.
[0062]
35. 35. The method of paragraph 34, wherein the product of the amplification reaction is labeled with a detectable dye.
[0063]
36. 30. The method according to paragraph 29, wherein said identifying comprises performing a hybridization procedure.
[0064]
37. 30. The method of paragraph 29, wherein said identifying step comprises contacting a nucleic acid array with a nucleic acid encoding said gene product in said more slowly growing cells.
[0065]
38. 30. The method of paragraph 29, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa.
[0066]
39. 30. The method of paragraph 29, wherein said compound is obtained from a library of natural compounds.
[0067]
40. 30. The method of paragraph 29, wherein said compound is obtained from a library of synthetic compounds.
[0068]
41. 30. The method according to paragraph 29, wherein said compound is present in a crude or incompletely purified state.
[0069]
42. 30. The method of paragraph 29, further comprising determining whether the gene product in the strain that grew more slowly in the culture has a counterpart in at least one other organism.
[0070]
43. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of said organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0071]
44. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0072]
45. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising the amino acid sequence,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0073]
46. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by the containing antisense nucleic acid A gene product, the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions The activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid containing the nucleotide sequence to be synthesized, and a gene product whose activity is inhibited by the nucleic acid containing the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. From the group of gene products To obtain a culture containing strains under-express the gene product-option,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0074]
47. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a strain that underexpresses various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity to a nucleotide sequence as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, under stringent conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806- A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of 4860, 5916-10012, and 14111-14944; and, under moderate conditions, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14 Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 11-14944; thing,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0075]
48. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying gene products that are underexpressed by strains that grow more slowly in the culture
A method that includes
[0076]
49. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a plurality of cultures containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism,
Contacting each of said cultures with said compound at various concentrations; and
Identifying a gene product that is underexpressed by a strain whose growth rate is reduced by the compound
A method that includes
[0077]
50. A method for profiling the activity of a compound, comprising:
Performing the method of paragraph 29 on the first culture with the first compound;
Performing the method of paragraph 29 on a second culture with a second compound; and
A method comprising comparing a strain identified in said first culture with a strain identified in said second culture.
[0078]
51. A method for profiling the activity of a first compound, comprising:
An array of strains comprising a plurality of strains that underexpress various gene products that are essential for the growth of an organism, on a first solid medium containing the first compound that inhibits the growth of the organism, and Growing on a second solid medium comprising a second compound that inhibits growth;
Comparing the pattern of strains grown on the first solid medium with the pattern of strains grown on the second solid medium.
A method that includes
[0079]
52. 51. The method of paragraphs 49 or 50, wherein the first compound is present in a crude or incompletely purified state.
[0080]
53. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a plurality of cultures containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism,
Contacting each of the plurality of cultures with various concentrations of a regulator that regulates the level of expression of the gene product that is essential for growth of the organism; and
Identifying a gene product that is underexpressed by a strain whose growth rate is reduced by the compound
A method that includes
[0081]
54. A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism.
[0082]
55. 55. The culture of paragraph 54, wherein said strain overexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a regulatable promoter.
[0083]
56. 55. The culture of paragraph 54, wherein said strain overexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a constitutive promoter.
[0084]
57. The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea The culture according to paragraph 54, which is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis.
[0085]
58. A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for growth of the organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A culture comprising a strain that overexpresses a gene product.
[0086]
59. A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A culture comprising a strain that overexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence.
[0087]
60. A culture containing a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. A culture comprising a strain that overexpresses a gene product comprising the amino acid sequence.
[0088]
61. A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by the containing antisense nucleic acid A gene product, the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions The activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid containing the nucleotide sequence to be synthesized, and a gene product whose activity is inhibited by the nucleic acid containing the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. From the group of gene products Culture containing strains overexpressing the gene product-option.
[0089]
62. A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a given nucleotide sequence, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of -4860, 5916-10012, and 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under moderate conditions. and Culture containing strains overexpressing the gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 4,111 to 14,944.
[0090]
63. A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 A culture comprising a strain overexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of:
[0091]
64. A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism.
[0092]
65. 65. The culture of paragraph 64, wherein said strain that underexpresses said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a regulatable promoter.
[0093]
66. 65. The culture of paragraph 64, wherein said strain that underexpresses said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a constitutive promoter.
[0094]
67. The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea 65. The culture of paragraph 64, which is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis.
[0095]
68. A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of said organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A culture comprising a strain that underexpresses a gene product.
[0096]
69. A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A culture comprising a strain that underexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence.
[0097]
70. A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. A culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising the amino acid sequence.
[0098]
71. A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by the containing antisense nucleic acid A gene product, the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions The activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid containing the nucleotide sequence to be synthesized, and a gene product whose activity is inhibited by the nucleic acid containing the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. From the group of gene products Culture containing strains under-express the gene product-option.
[0099]
72. A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a given nucleotide sequence, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of -4860, 5916-10012, and 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under moderate conditions. and Culture containing strains under-express the gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 4,111 to 14,944.
[0100]
73. A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 A culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of:
[0101]
74. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A plurality of strains that overexpress various gene products that are essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes produces a unique product corresponding to each of the overexpressed genes. Obtaining a culture that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying the gene product overexpressed by a strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0102]
75. 75. The method of paragraph 74, wherein the nucleotide sequence of each of the genes encoding the overexpressed gene product has been altered by replacing the native promoter of the gene with a promoter that promotes overexpression of the gene product.
[0103]
76. In paragraph 74, the nucleotide sequence of each of the genes encoding the overexpressed gene product has been altered by inserting, in the native promoter of the gene, a regulatory element having a promoter that promotes overexpression of the gene product. The described method.
[0104]
77. The regulatory element is a group consisting of a regulatable promoter, an operator recognized by a repressor, a nucleotide sequence recognized by a transcription activator, a transcription terminator, a nucleotide sequence that introduces a bend into DNA, and an upstream activation sequence. 77. The method of paragraph 76 selected from:
[0105]
78. Identifying the gene product overexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene, performing an amplification reaction; and 75. The method of paragraph 74, comprising detecting a corresponding unique amplification product.
[0106]
79. 76. The method of paragraph 75, wherein the native promoter of each of the genes encoding the gene products essential for growth has been replaced with the same promoter.
[0107]
80. 76. The method of paragraph 75, wherein the native promoter for each of the genes encoding the gene products essential for growth is replaced with a plurality of promoters selected such that each gene product is expressed at the desired expression level.
[0108]
81. 76. The method of paragraph 75, wherein said promoter replacing the native promoter in each strain comprises a regulatable promoter.
[0109]
82. 76. The method of paragraph 75, wherein the promoter that replaces the native promoter in each strain comprises a constitutive promoter.
[0110]
83. 75. The method of paragraph 74, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa.
[0111]
84. The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea 75. The method of paragraph 74, wherein the method is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis.
[0112]
85. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Overexpressing a gene product that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product and that is inhibited in activity or level by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Obtaining a culture comprising the strain,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying the gene product overexpressed by a strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0113]
86. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product and that is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the encoded gene product;
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying the gene product overexpressed by a strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0114]
87. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of said organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes corresponds to each of the overexpressed genes. The amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, 14945-15778. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the gene product,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying the gene product overexpressed by a strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0115]
88. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. For a gene product that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product and that is inhibited from expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, Expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide product selected from the group consisting of a gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 8-3795. Default parameters for the nucleic acid encoding the gene product to be inhibited An antisense comprising a nucleotide product selected from the group consisting of: a gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 For a gene product whose expression is inhibited by a nucleic acid, a gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, under stringent conditions, SEQ ID NOS: 8- A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 3795, to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions; Encoded by the hybridizing nucleic acid Overexpression of a gene product selected from the group consisting of a gene product whose activity is complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 Obtaining a culture containing the strain
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
Identifying the gene product overexpressed by a strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0116]
89. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Obtaining a culture that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product;
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
A method comprising identifying a gene product overexpressed by a strain that grew more rapidly in said culture by detecting said unique product corresponding to said gene.
[0117]
90. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. To a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product; A nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, under stringent conditions And from 1411-14944 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under moderate conditions. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the sequence;
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Growing faster than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and
By detecting the unique product corresponding to the gene, a FASTA version 3.0.1 polypeptide against a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Active by a polypeptide having at least 25% amino acid identity as determined using 0t78, and a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Identifying a gene product overexpressed by a more rapidly growing strain in a culture comprising a strain that overexpresses a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides that can be complemented by
A method that includes
[0118]
91. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Obtaining a culture that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product;
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying the gene product underexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0119]
92. The method of paragraph 91, wherein the nucleotide sequence of each of the genes encoding the underexpressed gene product has been altered by replacing the native promoter of the gene with a promoter that promotes underexpression of the gene product.
[0120]
93. In paragraph 91, the nucleotide sequence of each of the genes encoding the underexpressed gene product has been altered by inserting, in the native promoter of the gene, a regulatory element having a promoter that promotes underexpression of the gene product. The described method.
[0121]
94. The regulatory element is a group consisting of a regulatable promoter, an operator recognized by a repressor, a nucleotide sequence recognized by a transcription activator, a transcription terminator, a nucleotide sequence that introduces a bend into DNA, and an upstream activation sequence. 94. The method of paragraph 93 selected from:
[0122]
95. Identifying the gene product underexpressed by a strain that grew more slowly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene, performing an amplification reaction; and 92. The method of paragraph 91, comprising detecting a corresponding unique amplification product.
[0123]
96. 93. The method of paragraph 92, wherein the native promoter of each of the genes encoding the gene products essential for growth is replaced with the same promoter.
[0124]
97. 93. The method of paragraph 92, wherein the native promoter of each of the genes encoding the gene products essential for growth is replaced with a plurality of promoters selected such that each gene product is expressed at the desired level.
[0125]
98. 93. The method according to paragraph 92, wherein the promoter that replaces the native promoter in each strain comprises a regulatable promoter.
[0126]
99. 93. The method according to paragraph 92, wherein the promoter that replaces the native promoter in each strain comprises a constitutive promoter.
[0127]
100. 92. The method of paragraph 91, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa.
[0128]
101. The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea The method of paragraph 91, wherein the method is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis.
[0129]
102. 92. The method of paragraph 91, wherein said culture comprises a strain that underexpresses a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795.
[0130]
103. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product, including a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product encoded by the nucleic acid,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying the gene product underexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0131]
104. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A gene that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to generate a product, and that comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, 14945-15778. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the product,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying the gene product underexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0132]
105. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A gene product that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product, and that is inhibited from expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product selected from the group consisting of gene products having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Gene products whose expression is inhibited by antisense nucleic acids containing Gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for the nucleic acid to load, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions A nucleus containing the selected nucleotide sequence And a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product of choice,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying the gene product underexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0133]
106. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique sequence corresponding to each of the overexpressed genes. It has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product, wherein the nucleotide sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, under stringent conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of 5916-10012, and 14111-14944, and under moderate conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111- Obtaining a culture comprising a strain in which a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence hybridizing to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14944 is underexpressed ,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
A method comprising identifying a gene product that underexpresses a strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene.
[0134]
107. A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Activated by the polypeptide To obtain a culture containing strains under-expresses the gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of the polypeptides can be supplemented,
A strain that contacts the compound with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of the strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts Growing more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts; and
Identifying the gene product underexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene
A method that includes
[0135]
108. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample containing nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0136]
109. The method of paragraph 108, wherein one of the members of each primer pair for each of the genes is labeled with a detectable dye.
[0137]
110. The nucleic acid sample is divided into N aliquots, and the amplification reaction is performed using each primer pair complementary to a nucleotide sequence within 1 / N of or flanking 1 / N of the gene encoding the gene product. 109. The method of paragraph 108, performed in aliquots, wherein one of said members of each primer pair in each aliquot is labeled with a dye, and wherein said dyes in said primers in each aliquot are distinguishable from each other.
[0138]
111. 110. The method of paragraph 109, further comprising pooling the amplification products from each of the aliquots before determining the length of the amplification products.
[0139]
112. The paragraph 108 wherein the native promoter of the gene encoding the gene product is replaced with a regulatable promoter and one of the primers in the primer pair is complementary to a nucleotide sequence within the regulatable promoter. The described method.
[0140]
113. 111. The method of paragraph 111, wherein the native promoter for each of the genes has been replaced with the same regulatable promoter.
[0141]
114. 111. The method of paragraph 111, wherein a plurality of regulatable promoters are used to replace the promoter of the gene, and some of the genes are under the control of various regulatable promoters.
[0142]
115. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, wherein said nucleic acid comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection comprising a strain that over- or under-expresses a gene product whose activity or level is inhibited by
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0143]
116. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111- Obtaining a nucleic acid sample comprising a nucleic acid from a culture or collection comprising a strain overexpressing or underexpressing a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14944;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0144]
117. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945. Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection comprising a strain that over- or under-expresses a gene product comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 15778;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0145]
118. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection containing a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising an antiserum containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by a sense nucleic acid, the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 At least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from: Product and sequence encoded by nucleic acid having Nos. 8 to 3795 for gene products whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of at least 25% amino acids as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters A gene product having identity, a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795; The activity is inhibited by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 8-3795, and a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 Activity complemented by gene products From the culture, or collection includes strains that over- or under-express a gene product selected from the group consisting of the gene product obtained, to obtain a nucleic acid sample comprising nucleic acids,
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0146]
119. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111- A nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14944, under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under moderate conditions ~ 4860, Overexpression or underexpression of a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence hybridizing to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 916-10012, and 14111-14944 Obtaining a nucleic acid sample containing nucleic acids from a culture or collection containing the strain
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0147]
120. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945. A polypeptide having at least 25% amino acid identity, as determined using FASTA version 3.0t78, to a polypeptide selected from the group consisting of 15778, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013 Culture comprising a strain overexpressing or underexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activities can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of -14110 and 14945-15778 Or from the collection To obtain a non-nucleic acid sample,
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0148]
121. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A first culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of said organism, wherein said first culture or collection has been contacted with said compound; Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the collection;
A second culture or collection comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said second culture or collection comprises a nucleic acid from a second culture or collection that has not been contacted with said compound. Obtaining a nucleic acid sample of 2,
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set as the primer pair set used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene, and the first amplification relative to the second amplification reaction A decrease in the level of the amplification product in the reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target for the compound if the culture or strain overexpresses the gene.
A method that includes
[0149]
122. 122. The method of paragraph 121, wherein one of the members of each primer pair for each of the genes is labeled with a detectable dye.
[0150]
123. The native promoter of the gene encoding the gene product has been replaced by a regulatable promoter, and one of the primers in the primer pair is complementary to a nucleotide sequence within the regulatable promoter. 121. The method according to 121.
[0151]
124. 122. The method of paragraph 121, wherein the native promoter of each of the genes has been replaced with the same regulatable promoter.
[0152]
125. 122. The method of paragraph 121, wherein the more than one regulatable promoter is used to replace the promoter of the gene, and some of the genes are under the control of various regulatable promoters.
[0153]
126. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a strain that over- or under-expresses various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the object or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said culture or collection of a second strain was not contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same set of primer pairs used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene, and the first amplification relative to the second amplification reaction A decrease in the level of the amplification product in the reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains may be overexpressed or have a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A method comprising a strain that is underexpressed.
[0154]
127. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the culture or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of the first strain, wherein the culture or collection of the second strain is not contacted with the compound. Obtaining a second nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of the second strain obtained.
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same set of primer pairs used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target for the compound when the culture or strain overexpresses the gene product, and the first product relative to the second amplification reaction is A decrease in the level of the amplification product in the amplification reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A method comprising comparing, comprising strains in which the encoded gene product is over- or under-expressed.
[0155]
128. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the culture or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said culture or collection of a second strain was not contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same set of primer pairs as the set of primer pairs used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target for the compound when the culture or strain overexpresses the gene product, and the first product relative to the second amplification reaction is A decrease in the level of the amplification product in the amplification reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains is a gene product comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Comprises a strain in which is overexpressed or underexpressed.
[0156]
129. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain was not contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of the first strain, wherein the nucleic acid is obtained from a culture or collection of the second strain that has been contacted with the compound. Obtaining a second nucleic acid sample comprising:
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set as the primer pair set used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is the target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene, and the first amplification relative to the second amplification reaction A decrease in the level of the amplification product in the reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the cultures or collections of the first and second strains are prepared based on a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795 Expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide product selected from the group consisting of a gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 8-3795. For a nucleic acid encoding a gene product to be inhibited, a gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOS: 8- A nucleotide sequence selected from the group consisting of 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 under moderate conditions. And a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795, and a gene product which is encoded by a nucleic acid which hybridizes to the containing nucleic acid. Overproduction of gene products selected from the group Or overexpressed method comprising strains are.
[0157]
130. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the culture or collection of the strain comprises the compound Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of the first strain contacted with
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein the culture or collection of a second strain that has not been contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set as the primer pair set used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is the target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene, and the first amplification relative to the second amplification reaction A decrease in the level of the amplification product in the reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains has a default sequence with respect to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 and 14111-14944. A gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 as a parameter; A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under conditions to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 and 14111-14944; and, under moderate conditions, SEQ ID NOs: 3796-3800 , 38 6～4860,5916～10012 and methods including strains nucleic acid comprising a nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 14,111 to 14,944 is overexpressed or underexpressed.
[0158]
131. A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the culture or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said culture or collection of a second strain was not contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set as the primer pair set used in the first amplification reaction; and
By comparing the amount of each amplification product in the first amplification reaction with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction Indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene, and the first amplification relative to the second amplification reaction A decrease in the level of the amplification product in the reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the cultures or collections of the first and second strains are prepared by FASTA against a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. A polypeptide having at least 25% amino acid identity as determined using version 3.0t78, and a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 A method comprising a strain in which a gene product containing a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by the gene is over- or under-expressed.
[0159]
132. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the proliferative reaction being performed, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0160]
133. 133. The method of paragraph 132, wherein one of the members of each primer pair for each of said genes is labeled with a detectable dye.
[0161]
134. The nucleic acid sample is divided into N aliquots;
The amplification reaction is performed in each aliquot using a primer pair complementary to a nucleotide sequence within 1 / N of or flanking the 1 / N of the gene encoding the gene product, and each primer in each aliquot is 133. The method of paragraph 132, wherein one of said members of the pair is labeled with a dye, and wherein said dye in said primer in each aliquot is distinguishable from each other.
[0162]
135. 135. The method of paragraph 134, further comprising pooling amplification products from each of said aliquots before determining the length of the amplification products.
[0163]
136. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains including a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed, and
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
The method wherein the culture comprises a strain in which a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 is over- or under-expressed.
[0164]
137. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, in the culture, a gene product encoded by a nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5916 to 10012, 14111 to 14944 is overexpressed or underexpressed. Methods involving strains.
[0165]
138. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the above-mentioned culture is a method comprising a strain in which a gene product containing an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778 is overexpressed or underexpressed.
[0166]
139. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is performed using BLASTN version 2.0 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity, as determined, to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Expression by antisense nucleic acid A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for the gene product to be impaired, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 under stringent conditions A gene product encoded by the nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence, the nucleic acid hybridizing under moderate conditions to the nucleic acid comprising the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product selected from the group consisting of an encoded gene product and a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795; Including strains that are overexpressed or underexpressed .
[0167]
140. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
Performing an amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein the members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing a specific nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair will produce an amplification product having a length that is distinguishable from the amplification product length from the other primer pair. Performing an amplification reaction designed for
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture was determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 and 14111-14944. A gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleic acids comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity, under stringent conditions, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806- A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 4860, 5916-10012 and 14111-14944, and under moderate conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 59 6-10012 and methods including strains nucleic acid comprising a nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 14111 to 14944 is overexpressed or underexpressed.
[0168]
141. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is determined by using FASTA version 3.0t78 for a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. And a polypeptide whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110 and 14945-15778. A method comprising a strain in which a gene product comprising a polypeptide selected from: is overexpressed or underexpressed.
[0169]
142. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying the amplification product obtained in the amplification reaction
A method that includes
[0170]
143. The primer pairs are divided into at least two sets, each primer pair including a primer labeled with a distinguishable dye, wherein the distinguishable dye used to label each primer pair is the other of the primer pair. 146. The method of paragraph 142 that is distinguishable from the dye used to label the set of
[0171]
144. The nucleic acid sample is divided into N aliquots;
The amplification reaction is performed in each aliquot using a primer pair complementary to a nucleotide sequence within 1 / N of or flanking the 1 / N of the gene encoding the gene product, and each primer in each aliquot is 144. The method of paragraph 142, wherein one of said members of the pair is labeled with a dye, and wherein said dye in said primer in each aliquot is distinguishable from each other.
[0172]
145. 154. The method of paragraph 144, further comprising pooling amplification products from each of said aliquots before determining the length of the amplification products.
[0173]
146. The native promoter of the gene encoding the gene product has been replaced by a regulatable promoter, and one of the primers of the primer pair is complementary to a nucleotide sequence within the regulatable promoter. The method of paragraph 142.
[0174]
147. 146. The method of paragraph 146, wherein the native promoter for each of said genes has been replaced with the same regulatable promoter.
[0175]
148. 146. The method of paragraph 146, wherein the promoter of the gene is replaced with more than one regulatable promoter, and wherein some of the genes are under the control of various regulatable promoters.
[0176]
149. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. When present in a culture or collection of strains, each primer pair may have a length, a detectable label, and other primer pairs based on a selection from the group consisting of both length and detectable label. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced;
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
The method wherein the culture comprises a strain in which a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 is over- or under-expressed.
[0177]
150. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
Performing an amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the primer pair comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain comprising the sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is selected from the group consisting of length, detectable label, and both length and detectable label. Is designed to produce an amplification product that is distinguishable from amplification products produced by other primer pairs based on
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, in the culture, a gene product encoded by a nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5910 to 10012, and 1411 to 14944 is overexpressed or underexpressed. Methods involving strains.
[0178]
151. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the above-mentioned culture is a method comprising a strain in which a gene product containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778 is overexpressed or underexpressed. .
[0179]
152. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is performed using BLASTN version 2.0 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity, as determined, to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Expression by antisense nucleic acid A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for the gene product to be impaired, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 under stringent conditions A gene product encoded by the nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence, the nucleic acid hybridizing under moderate conditions to the nucleic acid comprising the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product selected from the group consisting of an encoded gene product and a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795; Including strains that are overexpressed or underexpressed .
[0180]
153. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture uses BLASTN version 2.0 with default parameters for nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined, to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes and hybridizes under moderate conditions to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Methods including strains gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence is overexpressed or underexpressed to.
[0181]
154. A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primers, when present in a culture or collection of the strain, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by the pair;
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is determined using FASTA version 3.0t78 for a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity, and polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. A method comprising a strain overexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of:
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0182]
The present invention utilizes a collection or culture of strains, including strains that overexpress the various gene products required for cell growth or underexpress the various gene products required for cell growth. (Ie, at least some of the strains in culture over- or under-express gene products required for cell growth). In some embodiments, the present invention provides a collection of strains, including both strains that overexpress a gene product required for cell growth and strains that underexpress the same gene product required for cell growth. Or use a culture. Preferably, the strains present in the culture or collection, respectively, over- or under-express the various gene products required for cell growth (ie, all of the strains in culture are required for cell growth). Over- or under-expressed gene products). The gene product over- or under-expressed in each strain may be any gene product required for cell growth. Gene products may be nucleic acids or polypeptides. As used herein, the term "culture" refers to multiple strains growing in a single aliquot of liquid growth medium, and the term "collection" refers to separate strains of liquid growth medium each. Refers to multiple strains growing in aliquots or on various locations on solid growth media.
[0183]
In some embodiments, if desired, one or more strains in a culture or collection of strains may over- or under-express multiple gene products required for cell growth. In this embodiment, a gene product that is over- or under-expressed in one or more strains may be functionally related or functionally unrelated. This may facilitate the identification of compounds where two or more gene products share similar functions in a cell, or where the cell has multiple biochemical pathways leading to a particular end product.
[0184]
Alternatively, if the over- or under-expressed gene product is encoded by a gene that is part of an operon containing multiple genes, the desired gene can be over- or under-expressed while the remaining gene in the operon is Genes are expressed at levels that do not affect the ability of the cell to grow in the presence of a particular compound. For example, the desired gene may be placed under the control of a regulatable promoter, the transcription terminator may be located 3 'of the desired gene, and the promoter, preferably a constitutive promoter, is a transcription terminator. 3 'and 5' of the remaining genes in the operon.
[0185]
In some embodiments, the culture or collection of strains over- or under-expresses a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. May include strains. In some embodiments, the culture or collection of strains comprises at least two gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, SEQ ID NOs: 8-3795. At least 10 gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of, and at least 20 gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 At least 30 gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 By at least 50 gene products, a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 At least 100 gene products whose sex or level is inhibited, at least 300 gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, or SEQ ID NOs: 8 to 3795 May include strains that over- or under-express more than 300 gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group, wherein each strain in a culture or collection of strains comprises SEQ ID NO: A single gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of 8-3795 is over- or under-expressed. Alternatively, if desired, one or more strains in the culture or collection of strains overexpress multiple gene products whose activity or level is inhibited by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Alternatively, it may be underexpressed.
[0186]
In another embodiment, the culture or collection of strains comprises a gene encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Strains that over- or under-express the product may be included. In some embodiments, the culture or collection of strains is encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence generally selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. At least two gene products, at least 10 gene products encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, sequences At least 20 gene products encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of Nos. 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, SEQ ID NOs: 3796-3800 At least 30 gene products encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 3806-4860, 5916-10012, and 1411-14944, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and At least 50 gene products encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14111-14944, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. At least 100 gene products encoded by a nucleic acid comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. At least 300 gene products encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of: or nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 May also include strains that over- or under-express more than 300 gene products encoded by nucleic acids comprising SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860 , 5916-10012, and 14111-14944 over- or under-express a single gene product encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of: Alternatively, if desired, the one or more strains in the culture or collection of strains is encoded by a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. The multiple gene products to be expressed may be over- or under-expressed.
[0187]
In some embodiments, the culture or collection of strains overexpresses a gene product comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Or underexpressed strains. In some embodiments, the culture or collection of strains comprises at least two amino acids comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. At least 10 gene products comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of gene products, SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778, SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013 At least 20 gene products comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 14110, and 14945 to 15778, SEQ ID NOS: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 1577 At least 30 gene products comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 At least 100 gene products comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778; SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915; At least 300 gene products comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 10013-14110, and 14945-15778, or SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14 10, and 14945-15778 may include strains that over- or under-express more than 300 gene products comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of: Overexpressing or underexpressing a single gene product selected from the group consisting of: SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Alternatively, if desired, the one or more strains in the culture or collection of strains is one more selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Many gene products may be over- or under-expressed.
[0188]
In other embodiments, the culture or collection of strains comprises at least 1, at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 50, encoded by a homologous encoding nucleic acid as defined above. Include strains where 100, at least 300, or more than 300 gene products are over- or under-expressed. If desired, a culture or collection of strains may include one or more strains that over- or under-express more than one gene product encoded by the homologous encoding nucleic acid. In a further embodiment, the culture or collection of strains is at least 1, at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 100, at least 300, or 300 as defined above. Include strains where more homologous polypeptides are over- or under-expressed. If desired, a culture or collection of strains may include one or more strains that over- or under-express more than one homologous polypeptide.
[0189]
For example, in some embodiments, a culture or collection of the strain is characterized by a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence generally selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide product selected from the group consisting of a gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 8-3795. For a nucleic acid encoding a gene product to be inhibited, a gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOS: 8- Nucleoti selected from the group consisting of 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by the antisense nucleic acid comprising the sequence, under stringent conditions A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions And a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, At least selected from the group consisting of , At least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 100, at least 300, or a strain or group of strains in which more than 300 gene products are over- or under-expressed. Each strain over- or under-expresses one gene product.
[0190]
If desired, the one or more strains in the culture or collection of strains are directed against a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, expressed by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 Gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, relative to the nucleic acid encoding the gene product in which is inhibited, SEQ ID NO: 8 Nucleoti selected from the group consisting of: A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by the antisense nucleic acid comprising the sequence, under stringent conditions A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions And a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, Multiple genes selected from a group It objects to be over- or under-expression.
[0191]
In a further embodiment, the culture or collection of strains comprises BLASTN with default parameters, generally against a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acids comprising nucleic acids having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using version 2.0; SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under stringent conditions And a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under moderate conditions. At least one, at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from: , At least 100, at least 300, or more than 300 gene products, including strains or groups of strains, wherein each strain overexpresses or underexpresses one gene product. .
[0192]
If desired, the one or more strains in the culture or collection of strains may have a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acids comprising nucleic acids having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under stringent conditions , And a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of: 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under moderate conditions. A plurality of gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from Ranaru group may over- or under-expression.
[0193]
In a further embodiment, a culture or collection of strains is FASTA version 3.0.1 against a polypeptide generally selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Active by a polypeptide having at least 25% amino acid identity as determined using 0t78, and a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 At least 1, at least 10, at least 20, at least 30, at least 50, at least 100, at least 300, or 3 comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides that can be complemented by Includes zero or more strains or groups of strains gene product is over expressed or under-expressed, where each strain is over- or under-expression of one gene product.
[0194]
If desired, the one or more strains in the culture or collection of strains may comprise a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. And polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. A plurality of polypeptides selected from the group consisting of polypeptides whose activities can be complemented by a given polypeptide can be over- or under-expressed.
[0195]
The methods of the invention can be used to identify the target of a compound that inhibits the growth of any desired cell or organism. In some embodiments, the methods of the invention are used to identify targets for compounds that inhibit the growth of bacteria, fungi, or protozoa. In a further embodiment, the method of the present invention comprises the steps of Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (torropsis) Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruzei, Candida kefir (also called Candida pseudotropicalis), Candida deviliensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Koxy Odes immitis, Corynebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella newia Monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonauair, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis culini, Proteus bulgaris, Pseudomonas elder Salmonella vongori, Salmonella cholerasis, Lumonella enterica, salmonella paratyfi, salmonella typhi, salmonella tafimariam, staphylococcus aureus, moraxella catarharis, shigera boidi, shigera discentelier, shigera flexner, shigera sonne, stafilocicosfispi epistro It is used to identify the target of a compound that inhibits the growth of an organism selected from the group consisting of Coccus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis.
[0196]
Overexpression may be obtained using various techniques familiar to those skilled in the art. For example, overexpression can be obtained by operably linking the gene encoding a gene product to a promoter that encodes the gene product or transcribes mRNA containing the gene product at a higher level than wild-type cells. Is also good. Various promoters may be used to overexpress the gene product. The promoter used to overexpress the gene product may be a relatively strong promoter, a promoter that retains moderate levels of activity, or a relatively weak promoter, and may be a constitutive or regulatable promoter. It may be. In some embodiments, to optimize the degree of overexpression of a gene product, several strains, each overexpressing the gene product to different degrees, may be used.
[0197]
In some embodiments, each of the gene products required for growth is under the control of several different promoters of varying strengths to create several different strains expressing the gene products at various levels. May be placed. The expression level of the gene product of each strain is determined by determining the level of expression of the wild-type Is compared to Subsequently, the strain having the desired expression level is included in a culture or collection of the strain to be contacted with the test compound, as described below.
[0198]
The promoter is selected to be active in the cell type in which the gene product will be expressed. For example, for overexpression of a gene product in a mammalian cell, the gene encoding the gene product may be an SV40 promoter, a metallothionein promoter, a MMTV promoter, a RSV promoter, a tetP promoter, an adenovirus major late promoter, or other known to those skilled in the art. It can be operably linked to a promoter, such as a promoter. In yeast, the gene encoding the gene product may be operably linked to a promoter, such as CYC1, ADHI, ADHII, GAL1, GAL10, PHO5, PGK, or other promoters used in the art. Similarly, in bacteria, the genes encoding the gene products are SP6, T3, trc promoter, lac promoter, temperature-regulated λ promoter, Bacillus aprE and nprE promoters (US Pat. No. 5,387,521), bacteriophage λP L And P R Promoter (Renaut, et al., (1981) Gene 15:81), trp promoter (Russell, et al., (1982) Gene 20:23), tac promoter (de Boer et al., (1983) Proc. Natl Acad. Sci. USA 80:21), B. subtilis alkaline protease promoter (Stahl et al, (1984) J. Bacteriol. 158, 411-418), B. subtilis (Yang et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 237-249) or B.I. Α-amylase promoter of B. amyloliquefaciens (Tarkinen, et al, (1983) J. Biol. Chem. 258, 1007-1013), neutral protease promoter derived from B. subtilis (Yang et al, ( 1984) J. Bacteriol. 160, 15-21), T7 RNA polymerase promoter (Studier and Moffatt (1986) J Mol Biol. 189 (1): 113-30), B. subtilis xyl promoter active in Bacillus or suddenly. Mutant tetR promoter (Geissendorfer & Hillen (1990) Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 657-663), Staphylococcus enterotoxin D promoter (Zhang and Stewart (2000) J. Bacteriol. 182 (8) 2321-5), The cap8 operon promoter from F. aureus (Ouyang et al., (1999) J. Bacteriol. 181 (8): 2492-500), the lactococcal nisA promoter (Eichenbaum (1998) Appl Environ Microbiol. 64 ( 8): 2763-9), Akore Promoter derived from Acholeplasma laidlawii (Jarhede et al., (1995) Microbiology 141 (Pt 9): 2071-9), porA promoter of Neisseria meningitidis (Sawaya et al., (1999) Gene 233: 49 -57), Neisseria gonahoeae fbp promoter (Forng et al., (1997) J. Bacteriol. 179: 3047-3052), Corynebacterium diphtheria toxin gene promoter (Schmitt and Holmes (1994) J. Bacteriol. 176 (4): 1141-9), a group A streptococcus (Streptococci) derived hasA promoter (Alberti et al., (1998) Mol Microbiol 28 (2): 343-53), of Pseudomonas putida (Pseudomonas putida). operably linked to the rpoS promoter (Kojic and Venturi (2001) J. Bacteriol. 183: 3712-3720) and the IPTG-inducible promoter in pLUEX5BA (Krause et al., J. Mol. Biol. 274: 365 (1997)). obtain. In another embodiment that may be useful in Staphylococcus aureus, the promoter is XylT5, a novel inducible promoter system that includes a modified T5 promoter fused to the xylO operator from the xylA promoter of Staphylococcus aureus. . This promoter is described in US patent application Ser. No. 10 / 032,393, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. In another embodiment, the promoter may be a lacO2 inducible promoter system, in which the T7 RNA polymerase gene is integrated on the chromosome and is regulated by lacUV5 / lacO (Brunschwig, E. and Darzins, A. et al. 1992. Gene 111: 35-41, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety), the T7 gene 10 promoter transcribed by T7 RNA polymerase is fused to a lacO operator. In another embodiment, the promoter is described in US Patent Application Serial No. 10 / 032,393, the disclosure of which is incorporated by reference herein in its entirety. It may be a promoter derived from plasmid pEPEF3 or pEPEF14, which carries a xylose-inducible promoter functional in E. faecalis. Other promoters that may be used are those familiar to those skilled in the art. In fungi, the gene encoding the gene product is the CaACT1 promoter (Morschhauser, Mol. Gen. Genet. 257: 412-420 (1998), the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety), 2001. US Patent Application Serial No. 09 / 792,024, filed February 20, 2001, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety, or 2001 The promoter described in U.S. Patent Application No. 10 / 032,585, filed December 20, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, or is familiar to those skilled in the art. It can be operably linked to another promoter. It will be appreciated that other combinations of organisms and promoters may be used in the present invention.
[0199]
In some embodiments, overexpression can be achieved by using homologous recombination to replace a native promoter driving the expression of a gene required for growth with a regulatable promoter. For example, U.S. Patent Application Serial No. 09 / 792,024, filed February 20, 2001, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, filed December 20, 2001. U.S. Patent Application Serial No. 10 / 032,585, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, U.S. Patent Application Serial No. 09 / 948,993, the disclosure of which is incorporated by reference in its entirety. The methods described in US patent application Ser. No. 09 / 948,993, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety, are incorporated herein by reference. It can be used to place genes required for growth under control. U.S. patent application Ser. No. 09 / 792,024, filed Feb. 20, 2001, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, U.S. application Ser. Patent Application No. 10 / 032,585, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, US Patent Application No. 09 / 815,242, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. US patent application Ser. No. 09 / 492,709, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, and US patent application Ser. No. 09 / 711,164, the disclosure of which is hereby incorporated by reference. No. 09 / 741,669, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety, is incorporated herein by reference in its entirety. Used in any of Discloses genes and gene products that are required to be capable proliferation.
[0200]
Briefly, in some embodiments of these methods, the cells may be haploid cells, such as bacterial cells. A linear promoter replacement cassette comprising a regulatable promoter flanked by nucleotide sequences having homology to the native promoter is introduced into the cell. In some embodiments, the cassette also includes a nucleotide sequence encoding a selectable marker or a marker whose expression is readily identified. The cassette may be a double-stranded or single-stranded nucleic acid, as described in US patent application Ser. No. 09 / 948,993, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Is also good. Upon homologous recombination, the native promoter is replaced with a regulatable promoter, and the genes required for growth are placed under the control of the regulatable promoter. Strains in which the gene required for growth is under the control of a regulatable promoter are grown under conditions in which the regulatable promoter provides a gene product level required for growth above that in wild-type cells. For example, the strain may be grown in the presence of an inducer that induces expression from a regulatable promoter, or under conditions that reduce or eliminate the effect of the repressor on the regulatable promoter.
[0201]
Alternatively, rather than replacing each natural promoter of the gene encoding the gene product required for growth with a single desired replacement promoter, provide the desired expression level for the gene product to be over- or under-expressed Multiple replacement promoters are used. This method does not use a single labeled primer that is complementary to the nucleotide sequence in a single replacement promoter, but rather uses multiple labeled primers that are complementary to the appropriate nucleotide sequence in multiple replacement promoters. Is performed as described above.
[0202]
Alternatively, in embodiments where the level or activity of the gene product required for growth is reduced by transcribing an antisense nucleic acid complementary to at least a portion of the gene encoding such gene product, the antisense nucleic acid is Strains may be designed such that the length of the encoding nucleotide sequence is different for each gene. Amplification reactions are performed at each end of the gene encoding the antisense nucleic acid such that the amplification product corresponding to each gene has a unique length or a dye that can be distinguished from other amplification products of the same length. It is performed as described above using certain primers. Alternatively, the length of the nucleotide sequence encoding the antisense nucleic acid may not be unique for each gene, but the primers used in the amplification reaction may be such that the length of the amplification product corresponding to each gene is unique. Can be selected.
[0203]
In another embodiment, the native promoter is replaced in the culture of the strain or in the collection by a promoter that contains, internally or adjacent to, a unique nucleotide sequence that differs from the nucleotide sequence present in other recombinant promoters. Is also good. In this embodiment, each promoter contains, adjacent to the promoter, a unique "tag" that can be used to identify a strain that grows faster or more slowly in the culture or collection of the strain. Or have. Tags can be detected using hybridization-based or amplification-based methods, including amplification methods that produce an amplification product having a unique size for each of the genes required for growth described above.
[0204]
Alternatively, a natural promoter that induces transcription of a gene required for amplification can be regulated by inserting a regulatory element into the chromosome of a cell by homologous recombination such that the regulatory element regulates the level of transcription from the promoter. May be. A regulatory element may be an operator recognized by a repressor (eg, lac, tet, araBAD repressor), or a nucleotide sequence recognized by a transcriptional activator. In some embodiments, the regulatory element may be a transcription termination factor, a nucleotide sequence that introduces a bend in DNA, or an upstream activation sequence. A linear regulatory element insertion cassette containing regulatory elements flanked by nucleotide sequences having homology to the native promoter may be introduced into cells. In some embodiments, the cassette also includes a nucleotide sequence encoding a selectable marker or a marker whose expression is readily identified. The cassette may be a double-stranded or single-stranded nucleic acid, as described in US patent application Ser. No. 09 / 948,993, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Is also good. Upon homologous recombination, the regulatory elements are introduced into the chromosome and the genes required for growth are placed under the control of the regulatory elements. Strains in which the genes required for growth are under the control of regulatory elements are grown under conditions where the regulatable promoter provides the level of gene product required for growth above that in wild-type cells. For example, the strain may be grown in the presence of an inducer that induces expression from the promoter, or under conditions that reduce or eliminate the effect of the repressor on the promoter. Detecting overrepresented or underrepresented strains in a culture or collection of strains using an amplification method that produces an amplified product having a unique size for each gene required for growth It will be appreciated that this is also acceptable. For example, if desired, primers complementary to the nucleotide sequence within the regulatory element may be used in the amplification reaction.
[0205]
The promoter replacement cassette or regulatory element insertion cassette may be a double-stranded nucleic acid such as an amplicon generated by PCR or other amplification methods, or a single-stranded nucleic acid such as an oligonucleotide. For example, single-stranded nucleic acids can be introduced into chromosomes using the methods described in Ellis et al., PNAS 98: 6742-6746, 2001, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Can be done.
[0206]
In some embodiments, cells into which the promoter replacement cassette or regulatory element insertion cassette has been introduced have an increased recombination frequency. For example, a cell may lack one or more exonucleases that normally degrade DNA inserted into a chromosome, or may have reduced levels or activities thereof. In a further embodiment, the cells may lack or have reduced levels of exonuclease and express or overexpress proteins involved in mediating homologous recombination. For example, when the method is performed in Escherichia coli or other intestinal prokaryotes, cells with reduced or eliminated exonuclease V activity in the RecBCD recombination pathway that degrade linear nucleic acids (eg, recB, recC, or recD mutant). In some embodiments, the cells have more than one mutation in the recB, recC, and recD genes that increase the frequency of homologous recombination. For example, a cell can have mutations in both the recB and recC genes.
[0207]
Promoter replacement or regulatory element insertion methods may also be performed in Escherichia coli cells in which the activity of the Rac prophage RecET recombinase system has been activated, such as cells carrying the sbcA mutation. The RecE gene of rac prophage encodes an ExoVIII 5'-3 'exonuclease, while the RecT gene of Rac prophage encodes a single-stranded DNA binding protein that promotes regeneration and D-loop formation. Thus, RecE and RecT gene products or proteins with similar functions promote homologous recombination. The RecE and RecT genes are present on the same operon but are not normally expressed. However, sbcA mutants activate the expression of RecE and RecT genes. In some embodiments, the method may be performed on cells that carry mutations in the recB and recC genes and the sbcA mutation. RecE and RecT genes can be expressed constitutively or conditionally. For example, the above method may be performed on Escherichia coli strain JC8679, which carries the sbcA23, recB21, and recC22 mutations.
[0208]
In some embodiments, the above methods may be performed on Escherichia coli cells with enhanced recombination via the RecF pathway, such as cells carrying the sbcB mutation.
[0209]
It will be appreciated that the recE and recT gene products, or proteins with similar functions, can be conditionally or constitutively expressed in prokaryotes other than Escherichia coli. In some embodiments, these proteins are anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertassis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata ( Tollopsis glabrata), Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruzei, Candida kefir (also called Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis , Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Csidiodes immitis, Corynebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella terrieria Monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonauair, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis culini, Proteus bulgaris, Pseudomonas elder Salmonella vongori, salmonella cholera , Salmonella enterica, Salmonella paratyfi, Salmonella typhi, Salmonella tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Shigera boidi, Shigera discentelier, Shigera flexner, Shigera sonne, Staphylocoscus It can be expressed conditionally or constitutively in Staphylococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. For example, plasmids encoding these gene products may be introduced into an organism. If desired, the coding sequences encoding these gene products can be optimized to reflect the codon choice of the organism in which these gene products are expressed. Similarly, in some embodiments, an organism may contain a mutation similar to a recB, recC, recD, sbcA, or sbcB mutation that increases the frequency of homologous recombination.
[0210]
In a further embodiment, the method of promoter replacement or insertion of regulatory elements may also be performed in cells utilizing the Red system of bacteriophage lambda (λ), or similar systems derived from other phages to increase the frequency of homologous recombination. Good. The Red system contains three genes, γ, β, and exo, whose products are Gam, Bet, and Exo proteins (Ellis et al. PNAS 98: 6742-6746, 2001, the disclosure of which is hereby incorporated by reference). Is hereby incorporated by reference in its entirety). The Gam protein inhibits RecBCD exonuclease V, thus allowing Beta and Exo to gain access to the ends of the DNA to be integrated, promoting homologous recombination. Beta proteins are single-stranded DNA binding proteins that promote the annealing of single-stranded nucleic acids to complementary single-stranded nucleic acids and mediate strand exchange. Exo protein is a double-stranded DNA-dependent 5'-3 'exonuclease that leaves a 3' overhang that can act as a substrate for recombination. Thus, constitutive or conditional expression of a λred protein or a protein with a similar function promotes homologous recombination.
[0211]
It will be appreciated that λ Beta, Gam and Exo proteins, or proteins with similar functions, can be constitutively or conditionally expressed in prokaryotes other than Escherichia coli. In some embodiments, these proteins are anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertassis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata ( Tollopsis glabrata), Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruzei, Candida kefir (also called Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis , Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Csidiodes immitis, Corynebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella terrieria Monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonauair, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis culini, Proteus bulgaris, Pseudomonas elder Salmonella vongori, salmonella cholera , Salmonella enterica, Salmonella paratyfi, Salmonella typhi, Salmonella tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Shigera boidi, Shigera discentelier, Shigera flexner, Shigera sonne, Staphylocoscus It may be conditionally or constitutively expressed in Staphylococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. For example, plasmids encoding these gene products may be introduced into an organism. If desired, the coding sequences encoding these gene products can be optimized to reflect the codon choice of the organism in which these gene products are expressed.
[0212]
In some embodiments, the cells may have an increased frequency of homologous recombination as a result of more than one of the above properties. In some embodiments, the increased recombination frequency may be a condition characteristic of the cell that depends on the culture conditions under which the cell is grown. For example, in some embodiments, the expression of λ Red Gam, Exo, and Beta proteins, or recE and recT proteins, can be regulated. Thus, cells may have an increased frequency of homologous recombination as a result of any combination of the above properties. For example, in some embodiments, the cells may carry sbcA and recBC mutations.
[0213]
In some embodiments, the linear double-stranded DNA to be inserted into the chromosome of the organism comprises recE and recT, or λ Beta, Gam and Exo proteins, or proteins with similar functions, as described above. It is introduced into a constitutively or conditionally expressing organism. In some embodiments, the organism is an Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (torulopsis Glabrata), Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonjii, Candida cruzei, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida deviliensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium trachomatis・ Botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes Immitis, Corynebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae monemone , Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curryny, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa monkey Bongori, Salmonella cholerasis, Salmonet -Enterelica, Salmonella Paratyfi, Salmonella Tiffy, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boyidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Stagellococcus epidermicus epidermicdis -Pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. In some embodiments, double-stranded DNA may be introduced into an organism having a recBC and sbcA mutation or a similar mutation.
[0214]
In other embodiments, the single-stranded DNA to be inserted into the chromosome of the organism is introduced into an organism that expresses a λ Beta protein, or a protein with a similar function. In some embodiments, single-stranded DNA is introduced into an organism that expresses both λ Beta and Gam proteins, or a protein with a similar function. In a further embodiment, the single-stranded DNA is introduced into an organism that expresses λ Beta, Gam and Exo proteins, or proteins with similar functions. The λ protein or similar protein can be expressed constitutively or conditionally. In some embodiments, the organism is an Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (torulopsis Glabrata), Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonjii, Candida cruzei, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida deviliensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium trachomatis・ Botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes Immitis, Corynebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae monemone , Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curryny, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa monkey Bongori, Salmonella cholerasis, Salmonet -Enterelica, Salmonella Paratyfi, Salmonella Tiffy, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boyidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Stagellococcus epidermicus epidermicdis -Pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis.
[0215]
In some embodiments, the linear nucleic acid is inserted into a chromosome of a first organism having an increased frequency of homologous recombination and subsequently transferred to a second organism to which the method is not directly applicable. Good. For example, a linear nucleic acid may be inserted into the chromosome of Escherichia coli and subsequently transferred to a second organism by conjugation or transduction. After introduction into the second organism, the nucleic acid is introduced into the chromosome of the second organism by homologous recombination, thereby moving the regulatory element from the chromosome of the first organism to a corresponding position on the chromosome of the second organism. To populate efficiently.
[0216]
In other embodiments, the cells may be diploid cells, such as fungal cells. In some embodiments, one of the copies of the gene encoding the gene product required for growth may be disrupted, rendering the gene inactive. In a further embodiment, one of the copies of the gene encoding the gene product required for growth may be disrupted and under the control of a promoter capable of regulating the other copy of the gene encoding the gene product required for growth. May be placed in Such strains are constructed by using a disruption cassette containing a nucleotide sequence encoding an expressible dominant selectable marker flanked on each side by a nucleic acid homologous to the target sequence to be disrupted, using genes required for growth by homologous recombination. It can be produced by disrupting a first copy of the gene encoding the product. A second copy of the gene encoding the gene product required for growth was obtained using a promoter recombination cassette containing a regulatable promoter flanked on each side by nucleic acids homologous to the native promoter for the gene required for growth. Can be placed under the control of a promoter that can be regulated by homologous recombination. The promoter recombination cassette may also include a nucleotide sequence encoding a selectable marker located 5 ′ to the regulatable promoter, but between a nucleic acid homologous to the native promoter.
[0219]
In other embodiments, overexpression can be achieved by operably linking the gene required for growth to the desired promoter in the vector. The vector may be a vector that replicates extrachromosomally or a vector that integrates into a chromosome. For example, if the vector is used in a bacterial cell, the vector may be a pBR322-based vector or a bacteriophage-based vector such as P1 or λ. If the vector is used in Saccharomyces cerevisiae, the vector may be a 2 micron circle-based vector or a vector that incorporates the yeast chromosome origin of replication. If the vector is used in a mammalian cell, the vector may be a retroviral vector, an SV40-based vector, a bovine papillomavirus-based vector, an adenovirus-based vector, or an adeno-associated virus-based vector. . When the vector is used in Candida albicans, the vector may be a vector comprising a promoter selected from the group consisting of the CaPCK1, MET25, MAL2, PHO5, GAL1, 10, STE2, or STE3 promoter. In some embodiments, the vectors described in the following publications, the disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety, may be used: CIp10 (Efficiency for Candida albicans) Efficient and convenient integration vector) (Murad et al., Yeast 16 (4): 325-7 (2000); Transformation vector pCPW7 (Kvaal et al.,: Infect Immun 67 (12): 6652-62) (1999); Transformation vector pCWOP16 (Kvaal et al.,: Infect Immun 65 (11): 4668-75 (1997); used for direct cloning in Ca by complementing the histidine auxotrophy of strain CA9. A dual ARS vector, pRM1 (Pla et al., Gene 165 (1): 115-20 (1995); developed for the transformation of Candida albicans, promotes the ADE2 gene marker and self-renewal Possesses Candida self-replicating sequence (CARS) elements pMK16 (Sanglard and Fiechter Yeast 8 (12): 1065-75 (1992); a plasmid vector (represented by pRC2312) that replicated autonomously in Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans was constructed (this plasmid is LEU2 , URA3, and a self-replicating sequence (ARS) from Candida albicans) (Cannon et al., Mol Gen Genet 235 (2-3): 453-7 (1992); the gene of interest is the CaMAL2 maltase promoter. An expression vector (CIp10-MLA2p) has been constructed for use in Candida albicans that can be under control and stably integrate at the CaRP10 locus (Backen et al., Yeast 16 (12) 1121-9 (2000)); (Volker, RS, A. Sonneborn, CE Leuker, and JF Ernst. 1997. Efg1p, morphogenesis of the human pathogen Candida albicans. Are members of a conserved class of bHLH proteins that regulate morphogenetic processes in fungi (EMBO 16: 1982-1991), and Saccharomyces containing the Candida albicans URA3 gene, Candida ARS sequence, and origin of replication A Candida albicans transformation vector containing a portion of the S. cerevisiae 2 micron circle was constructed (Goshorn et al., Infect Immun 60 (3): 876-84 (1992)). A variety of other vectors suitable for use in the organisms described above or any other organism in which the invention is practiced are familiar to those skilled in the art.
[0218]
Underexpression of a gene product can be obtained in various ways. For example, in one embodiment, under-expression of a gene product can be achieved by providing an agent that reduces the level or activity of the gene product in a cell. In one embodiment, the agent may include an antisense nucleic acid that is complementary to the nucleic acid encoding the gene product or that is complementary to a portion of the nucleic acid encoding the gene product. For example, a nucleic acid encoding an antisense nucleic acid may be operably linked to a regulatable promoter. When grown under appropriate conditions, such as media containing an inducer of transcription or an agent that alleviates repression of transcription, the antisense nucleic acid is expressed in the cell, thereby increasing the level or activity of the gene product in the cell. Reduced. In some embodiments, the concentration of the inducer of transcription or the agent that mitigates repression of transcription may be varied to provide optimal results. Such methods are described in U.S. patent application Ser. No. 09 / 815,242, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, U.S. patent application Ser. No. 09 / 492,709, the disclosure of No. 09 / 711,164, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety, U.S. Patent Application No. 09 / 741,669. No. 09 / 792,024, filed Feb. 20, 2001, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Or US Patent Application Serial No. 10 / 032,585, filed December 20, 2001, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Have been. Each of the patent applications cited in the preamble discloses genes and gene products required for growth that can be used in any of the methods of the present invention.
[0219]
Alternatively, underexpression of a gene product required for growth can be achieved under the control of a promoter whose expression of the gene product is constitutive or regulatable using methods such as those described above with respect to the method by which the gene product is overexpressed. This can be achieved by constructing a strain. To provide cells that under-express the gene product, the cells are grown under conditions where expression of the gene product is expressed at levels below those of wild-type cells. For example, cells may be grown under conditions where the repressor reduces the level of transcription from a regulatable promoter.
[0220]
In other embodiments, the underexpression operably links the gene required for growth to the desired promoter in the vector, as described above for the embodiment in which the gene product required for growth is overexpressed. Can be achieved. In some embodiments, the vector may be in a cell that has disrupted the chromosomal copy (s) of the gene.
[0221]
Gene products required for propagation are described in U.S. Patent Application Serial No. 09 / 792,024, filed February 20, 2001, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. U.S. Patent Application Serial No. 10 / 032,585, filed December 20, 1998, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, U.S. Patent Application Serial No. 09 / 815,242, which is incorporated herein by reference. The disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety), US patent application Ser. No. 09 / 492,709 (the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety); No. 09 / 711,164, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, and U.S. Patent Application Serial No. 09 / 741,669, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Will be incorporated) It may be identified using a variety of methods, including the methods described. The genes and gene products required for growth disclosed in the applications listed in the preamble can each be used in any of the methods of the present invention. Briefly, in one embodiment, the gene product required for growth is identified by operably linking a random genomic fragment to a regulatable promoter in a vector. Random genomic fragments can be generated by partial digestion with restriction enzymes, mechanical shearing using techniques such as sonication and nebulization, or DNase I digestion. Upon induction of transcription from the promoter with an appropriate agent, the expression vector produces an RNA molecule corresponding to the inserted genomic fragment. In cases where the inserted genomic fragment is in the antisense orientation with respect to the promoter, the transcript produced is complementary to at least a portion of the mRNA encoding the gene product, such that the transcript is a sense mRNA produced from various genes. And thereby reduce the translation efficiency or level of sense messenger RNA (mRNA), and thus reduce the production of proteins encoded by these sense mRNA molecules. If the sense mRNA encodes a protein required for growth, cells grown under inducible conditions will be unable to grow or will grow at a substantially reduced rate. Further, if the transcript produced is complementary to at least a portion of the untranslated RNA and the untranslated RNA is required for growth, cells grown under inducible conditions may also grow. Cannot or grow at a substantially reduced rate. In contrast, cells grown under non-inducing conditions grow at a normal rate. Subsequently, the gene to which the antisense nucleic acid is complementary is identified and utilized in the methods of the invention.
[0222]
Alternatively, the genes required for growth can be identified by replacing the native promoter for the gene required for growth with a regulatable promoter, as described above. The growth of such a strain under conditions where the promoter is active or unrepressed is compared to growth under conditions where the promoter is inactive or repressed. The strain is unable to grow under conditions where the promoter is inactive or repressed, or grows at a substantially reduced rate, but the promoter is active or not repressed When grown normally under conditions, the gene operably linked to the regulatable promoter encodes the gene product required for growth. For example, genes and gene products required for growth identified using promoter replacement are described in US patent application Ser. No. 09 / 948,993, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. US patent application Ser. No. 09 / 792,024, filed Feb. 20, 2001, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, and US patent application Ser. No. 10 / 032,585, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Each of the genes and gene products described in the applications listed above can be used in any of the methods of the present invention.
[0223]
The present invention includes a method of identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts. The method uses a culture containing a mixture of strains of an organism. At least some of the strains in culture overexpress various gene products required for growth of the organism. Preferably, each of the strains in the culture overexpresses the various gene products required for growth of the organism (ie, all the strains in the culture contain the gene products required for growth of the organism). Overexpressed). Such strains can be obtained using the methods described above. The culture may contain any number of strains. For example, the culture may comprise at least 2 strains, at least 10 strains, at least 20 strains, at least 30 strains, at least 50 strains, at least 100 strains, at least 300 strains, or 300 strains. It may contain more than one strain. In some embodiments, the culture may comprise a strain that generally overexpresses all or most of the gene products required for growth of the organism.
[0224]
The culture is contacted with a compound that inhibits the growth of the organism. The compound may be a candidate drug compound obtained from any source. For example, the compound is a compound produced using combinatorial chemistry, a compound from a natural product library, or an impure or incompletely purified compound (eg, a compound in an incompletely purified natural extract). Is also good. The culture is contacted with a compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of an organism in culture that does not overexpress the gene product on which the compound acts, resulting in excess of the gene product on which the compound acts. Expressing strains will grow faster in culture than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts. Thus, after a sufficient period of time, strains that overexpress the gene product on which the compound acts will dominate in culture over strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts. In a preferred embodiment, the growth conditions and incubation period are selected such that only one strain, ie, a strain that overexpresses the target of the compound, is recovered from the culture. Thus, in one embodiment, multiple cultures, each containing multiple strains that overexpress a gene product required for various growth, may be grown in the presence of various concentrations of the compound. In embodiments where, besides altering the compound concentration, the expression of the gene product required for growth is under the control of a regulatable promoter, the multiple cultures may be induced by an inducer or a reducing agent to reduce the effect of the repressor on transcription from the promoter. Various concentrations of an agent, such as an agent, that regulates the level of expression from a promoter may be grown. The culture may be grown in liquid culture in the presence of the compound whose target is specified (and, where appropriate, in the presence of an agent that modulates the level of expression from the promoter), or Liquid cultures containing strains that overexpress the gene expression required for expression contain the compound after growth in the absence of the compound whose target is specified (and, if appropriate, expression from a promoter). It will be appreciated that it may be introduced on a solid medium (which also contains the agent that modulates the level).
[0225]
Identification of the overexpressed gene product that is the target of the compound can be made using a variety of methods. For example, in some embodiments, a nucleic acid present in a culture or collection of a strain that has been contacted with a compound is compared to a nucleic acid present in a control culture or collection of a strain that has not been contacted with the compound. Thus, nucleic acids that are overexpressed in a culture or collection of a strain that has been contacted with a test compound relative to a control culture or collection of the strain may be identified. Alternatively, in some embodiments, the nucleic acid present in a culture or collection of the strain that has been contacted with the test compound is analyzed to determine the nucleic acid present without comparison to a control culture or collection of the strain. It may be specified.
[0226]
In some embodiments of the invention, the ability to grow in the presence of a test compound relative to a strain that grew more rapidly in a culture or collection of strains, i.e., other strains in a culture or collection of strains. Higher strains are identified as follows: Amplification products that correlate with each overexpressed gene and are distinguishable from each other are obtained from cultures or collections grown in the presence of the test compound. Amplification products are distinguished from each other to determine if a particular amplification product is overexpressed in a culture or collection of strains. In some embodiments, the amplification products corresponding to each of the gene products have a length such that the amplification products can be distinguished from each other. In another embodiment, the one or more amplification products have similar or identical lengths, but are distinguishable from one another based on a detectable agent, such as a dye, attached to the amplification product. In some embodiments, the overexpressed amplification product is an amplification product from a culture or collection of a strain that has been contacted with a test compound, the amplification product from a culture or collection of a strain that has not been contacted with the test compound. It is identified by comparing with the amplification product. Alternatively, overexpressed amplification products may be identified by simply identifying amplification products obtained from cultures or collections of strains that have been contacted with the test compound (eg, only one strain or several strains). The strain can be grown in the presence of the test compound). The above method of producing a discriminable amplification product is required for the amplification described herein to facilitate the identification of strains that grow faster or more slowly in the presence of the test compound. It may be used in conjunction with any of the methods for producing a strain that overexpresses a gene product.
[0227]
For example, in some embodiments of the invention, each natural promoter of each gene encoding a gene product required for growth may be replaced with a single desired replacement promoter. After growing a culture or collection of the strain containing the strain in which the promoter has been replaced in the presence of the test compound for a desired period of time, the amplification reaction is performed on nucleic acid obtained from the culture as follows.
[0228]
Nucleic acids from a culture or collection of the strain may be split into at least two aliquots if desired. In a preferred embodiment, nucleic acids from a culture or collection of the strain are split into four aliquots. A single primer complementary to a nucleotide sequence in a replacement promoter, in a gene required for growth, or in a nucleic acid sequence adjacent to the promoter or gene required for growth, should have at least two portions (each split amount of nucleic acid) On the other hand). Each portion of the primer is a separate detectable dye, such as 6FAM ™, TET ™, VIC ™, HEX ™, NED ™ available from Applied Biosystems (Foster City, CA). , And PET ™ dye. For example, the primers may be labeled using a set of DS-31 or DS-33 dyes available from Applied Biosystems (Foster City, CA). Alternatively, HEX ™, NED, JOE, TMR, and TET ™ dyes available from Amersham Biosciences may be used. Thus, if the nucleic acid from the culture is split into aliquots, a single primer labeled with a single dye may be used. Where the nucleic acid from the culture is split into aliquots, at least 2, at least 3, at least 4, or more than 4 primers labeled with a distinguishable dye may be used. Each portion of the labeled primer is added to each of the aliquots of nucleic acid from the culture or collection of strains, such that each aliquot of nucleic acid is a single labeled with a single detectable dye on the primer Receive the primer. In some embodiments, the primer is divided into three parts, four parts, or more than four parts, each part having a dye on that part that is distinguishable from dyes on other parts. .
[0229]
Each of the aliquots of nucleic acid may also be within the promoter, within a nucleotide sequence unique to one of the genes encoding the gene product required for growth placed under the control of the replacement promoter, or required for the promoter or growth. Receive a set of unlabeled primers, each having an unlabeled primer that is complementary to a nucleotide sequence within the nucleotide sequence adjacent to the particular gene. Each aliquot receives a primer specific to the gene required for 1 / N growth (where N is the number of aliquots) placed under the control of the replacement promoter (ie, a culture or collection of strains). If the gene required for growth is under the control of a replacement promoter and consists of 100 strains that are split into four aliquots, the quadrant of nucleic acid from a culture or collection of strains Each receives primers complementary to the 25 genes). The unlabeled primers are each selected to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product produced by the other unlabeled primer. Preferably, the amplification products are from about 100 to about 400 nucleotides in length, but any length that can be distinguished from each other may be used. Furthermore, in some embodiments, some of the amplification products may have the same or very similar lengths, but are labeled with a distinguishable dye and may be distinguishable from each other.
[0230]
The nucleic acid amplification reaction is performed for each of the divided nucleic acids. The amplification products are then separated by length so that the amplification products have increased expression in the culture or collection of the strain (ie, amplification products from cells that grew more rapidly in the culture or collection of the strain). To identify. The amplification products are then correlated with the corresponding gene to determine which strains grew more rapidly in the culture or collection of strains. If desired, in a culture, the amplification product obtained from a culture or collection of a strain that has been contacted with the compound can be compared with an amplification product obtained from a control culture or collection of a strain that has not been contacted with the compound. Amplified products with increased expression may be identified. Alternatively, if desired, amplification products obtained from cultures contacted with the compound may be directly identified without comparison to control cultures not contacted with the compound.
[0231]
For example, in some embodiments, amplification products from each nucleic acid aliquot are pooled and subjected to capillary electrophoresis. Amplification products are detected by detecting the fluorescent dye bound to the amplification products and determining their length to identify amplification products that have increased or decreased expression in a culture or collection of strains. 1A and 1B illustrate one embodiment of this method, wherein the absence of amplification products from an amplification reaction performed in a culture containing multiple strains that underexpress the genes required for growth, Shows that the test compound acts on the gene corresponding to the missing amplification product. The method also identifies amplification products that are overexpressed in amplification reactions performed on cultures or collections of strains that overexpress the gene required for growth because the test compound acted on the corresponding gene. It will be understood that they can also be used.
[0232]
Alternatively, in another embodiment, the first amplification reaction comprises a first primer complementary to a nucleotide sequence present upstream or downstream of all overexpressed genes (eg, upstream of all overexpressed genes). Primers complementary to the nucleotide sequence in the replacement promoter described in (1) and primers complementary to the nucleotide sequence unique to each strain (eg, primers complementary to the nucleotide sequences in each of the genes required for growth). Performed on nucleic acids obtained from a culture or collection of strains that have been contacted with the compound. One of the two amplification primers for each of the genes required for growth is labeled with a dye as described above. Preferably, a common primer complementary to the upstream or downstream nucleotide sequence of all overexpressed genes is labeled with a dye. The primers used in the amplification reaction are designed such that the amplification products corresponding to each of the genes required for growth have a dye of a specific length or that can be distinguished from other amplification products of the same length. You. The second amplification reaction is performed on a control culture or collection of strains that have not been contacted with the compound using the same primers as in the first amplification reaction. The amplification product from the first amplification reaction is compared to the amplification product from the second amplification reaction to identify one or more amplification products that are overexpressed in the culture or collection of the strain. For example, the amplification product from the first amplification reaction may be run on a separate polyacrylamide gel lane from the amplification product from the second amplification reaction, or on a separate capillary therefrom, and the two lanes or capillaries may be connected to each other. Compare. If desired, in embodiments where the amplification product from the first amplification reaction is run on a different lane or capillary than the amplification product from the second amplification reaction, the same amplification can be used to perform the first amplification reaction and the second amplification reaction. The primer in the reaction may be labeled. Alternatively, if desired, different dyes may be used to label the primers in the first and second amplification reactions. If desired, in embodiments where the amplification product from the first amplification reaction is run on a different lane or capillary than the amplification product from the second amplification reaction, the same amplification can be used to perform the first amplification reaction and the second amplification reaction. The primer in the reaction may be labeled. Alternatively, if desired, different dyes may be used to label the primers in the first and second amplification reactions.
[0233]
Alternatively, in some embodiments, the primers in the second amplification reaction are labeled with a different dye that is distinguishable from the dye used in the first amplification reaction. In this embodiment, amplification reactions may be pooled and run on the same lane or the same capillary on a polyacrylamide gel, and the products from each amplification reaction compare the amount of each dye present for each amplification product Are compared by 2A and 2B illustrate one embodiment of this method, wherein an amplification product from an amplification reaction performed in a culture comprising a plurality of strains that underexpress a gene required for growth in contact with a compound Indicates that the test compound acts on the gene corresponding to the missing amplification product. The method also identifies amplification products that are overexpressed in amplification reactions performed on cultures or collections of strains that overexpress the gene required for growth because the test compound acted on the corresponding gene. It will be understood that they can also be used.
[0234]
If desired, rather than splitting the culture into aliquots, individual amplification reactions may be performed on nucleic acids obtained from a culture or collection of strains. Each amplification reaction contains primers that produce an amplification product specific for only one of the genes required for growth. Amplification products resulting from each individual amplification reaction are pooled, and amplification products with increased expression in culture are identified as described above.
[0235]
In another embodiment, the culture or collection of strains in which the gene products required for growth are overexpressed from a regulatable promoter that has replaced the native promoters of the genes encoding these gene products, is a desired number. In the presence of test compounds. Preferably, a culture or collection of the strain is allowed to grow in the presence of the test compound for at least 20 generations. A primer whose nucleic acid is isolated from a culture or collection of strains and is complementary to the nucleotide sequence within the nucleotide sequence adjacent to the replacement promoter (s) or 5 'end thereof, and the gene required for amplification or adjacent thereto An amplification reaction is performed using a primer that is complementary to the nucleotide sequence within the selected nucleotide sequence. The resulting amplification product (s) are sequenced directly using primers complementary to the nucleotide sequence in the replacement promoter.
[0236]
In one embodiment of the invention, the vector containing the nucleotide sequence encoding the gene product required for growth is obtained from a strain that has grown more rapidly in culture using methods such as plasmid preparation techniques. Subsequently, the nucleotide sequence of the overexpressed gene is determined using nucleic acid sequencing techniques.
[0237]
Alternatively, the identity of the overexpressed gene product that is the target of the compound is determined by performing a nucleic acid amplification reaction, such as the polymerase chain reaction (PCR), to identify the nucleotide sequence of the overexpressed gene. May be done. For example, an aliquot of a nucleic acid preparation (eg, a purified plasmid) from a strain recovered from a culture is contacted with a PCR primer pair that amplifies genes required for various growths, with each primer pair producing an amplification product. May be determined.
[0238]
Yet another method of determining the identity of a gene product that is the target of a compound involves obtaining a nucleic acid array, such as a DNA chip, containing each of the genes required for growth that have been overexpressed in a strain in culture. I do. The genes required for each growth occupy a known location in the array. Nucleic acid preparations (eg, plasmid preparations) from the recovered strain are labeled with a detectable agent, such as a radioactive or fluorescent moiety, to allow the labeled nucleic acids to hybridize to complementary nucleic acids on the array. It is placed in contact with the nucleic acid array under conditions that allow it. The location on the array to which the labeled nucleic acid hybridizes is determined to identify genes that are overexpressed in the recovered strain. If desired, a hybridized nucleic acid from a culture that has been contacted with the compound may be compared to a hybridized nucleic acid from a subject culture that has not been contacted with the compound. Alternatively, hybridized nucleic acids from a culture that has been contacted with a compound may be directly identified without comparison to nucleic acids from a control culture.
[0239]
In some embodiments of the invention, multiple strains may grow more rapidly in the presence of the compound. This can be due to various causes. For example, the concentration of the compound may not be high enough to restrict growth to only cells that overexpress one gene product (ie, the target gene product). Strains that overexpress the target gene product are the most prevalent strains in culture, while other strains may grow. In such cases, the identity of the gene product in the strain that is most prevalent in the culture can be identified by quantifying the level of each of the genes encoding the proteins required for growth in the culture. This can be achieved using quantitative PCR, DNA sequencing, hybridization, or the array technology described above.
[0240]
In other cases, many strains show faster growth in culture as a result of common functional attributes. For example, each of the more rapidly growing strains may overexpress a gene product that has a common enzymatic activity, such as, for example, a serine protease activity. Alternatively, each of the more rapidly growing strains may overexpress a gene product having a common functional domain, such as a cAMP binding domain. In such cases, the common attributes of the more rapidly growing strains may provide information about the mode of action of the compound or the biochemical activity of the target of the compound. For example, if all of the genes that are overexpressed in more rapidly growing strains are serine proteases, the compound acts by inhibiting serine protease activity and the target protein is a serine protease. If desired, the compound may be derivatized, and the effectiveness of the derivatized compound on each of the more rapidly growing strains will depend on the derivative capable of interacting with a wide range of targets that share a common activity or binding site (I.e., derivatives that have a greater ability to inhibit the growth of all strains than the original compound) or that have greater specificity for the desired target (i.e., the original compound). Derivatives with greater specificity for one of the strains) can be evaluated as described herein. For example, in addition to the gene products required for growth, non-essential gene products expressed in the cell can also bind to the initial test compound. In such cases, it is desirable to obtain a derivative of the initial test compound that is specific for the gene product required for growth. Furthermore, it is possible that the two gene products required for growth may bind to the initial test compound, but specificity for one of the gene products is desirable.
[0241]
In some embodiments, rather than using a single culture containing each of a number of strains that overexpress the gene product required for growth, the methods of the invention provide for overexpressing the gene product required for different growth. Of each individual strain (ie, a collection of strains). For example, each individual strain that overexpresses a gene product required for different growth may be grown in different wells of a multi-well plate. Each well is contacted with a compound (and, where appropriate, an agent that regulates the level of expression from a promoter). The growth level of the strain in each well is determined to identify the strain that grew faster. The identity of the overexpressed gene product in more rapidly growing strains is determined as described above.
[0242]
In another embodiment, each individual strain (ie, a collection of strains) that overexpresses a gene product required for different growth may be grown at different locations on a solid medium such as an agar plate. The medium contains the compound and, where appropriate, an agent that regulates the level of expression from the promoter. The growth level of each strain is determined to identify the strain that grew faster. The identity of the overexpressed gene product in more rapidly growing strains is determined as described above.
[0243]
The methods described above may be used to prioritize compound development or to determine if a compound has already been identified or if the target of a compound is already the target of an identified drug. In particular, if the product is a natural product, it is preferable to determine if the compound has already been identified before devoting considerable effort in developing the compound. Thus, in some embodiments of the present invention, the targets of partially purified or purified natural products, or compounds produced by combinatorial chemistry, are identified using the methods described above and compared to targets of known agents. . If the target is the same as that of a known drug, further development of the compound is stopped.
[0244]
In some embodiments of the invention, an array of each strain overexpressing a different gene product (ie, a collection of strains) is grown on a solid medium containing the compound to be evaluated. The location of each strain in the array and the gene product overexpressed by that strain is known. The colony pattern growing in the presence of the compound is evaluated and compared to the colony pattern growing in the presence of the already specified drug. If the colony pattern that grows in the presence of the compound being evaluated is the same as the colony pattern that grows in the presence of the already specified agent, further development of the compound is stopped.
[0245]
In another embodiment, the sequence of the gene product in a strain that grew more rapidly in the assay described above is compared to the sequence of a gene product from a heterologous organism to determine the potential range of species that growth is inhibited by the compound. decide. If the gene product has a high degree of homology to gene products from heterologous species, the compound is also likely to inhibit the growth of these heterologous species. Homology may be determined using any of a variety of methods familiar to those skilled in the art. For example, homology can be determined using a computer program such as BLASTP or FASTA. Subsequently, the ability of the compound to inhibit the growth of a heterologous species can be confirmed by comparing the growth of cells of a heterologous species in the presence and absence of the compound.
[0246]
In some embodiments, the present invention provides a collection of strains, including both strains that overexpress a gene product required for cell growth and strains that underexpress the same gene product required for cell growth. Or use a culture. The culture or collection of the strain is contacted with a compound to analyze the nucleic acids present in the culture or collection of the strain. Preferably, nucleic acids from overexpressing strains can be distinguished from nucleic acids from underexpressing strains. For example, overexpressing strains may be obtained using promoter replacement as described above, while underexpressing strains may be obtained by expressing antisense nucleic acids. Thus, in one embodiment, amplification primers can be designed that uniquely amplify nucleic acids from overexpressing or underexpressing strains. If the compound acts on a gene product that is over- and under-expressed in the culture, amplification products obtained from strains in the culture or collection over-expressing the gene product are over-expressed in the culture or collection. On the other hand, amplification products obtained from strains that underexpress the gene product are underexpressed in culture or harvest. If desired, nucleic acid from a culture or collection that has been contacted with the compound may be compared to nucleic acid from a subject culture or collection that has not been contacted with the compound. Alternatively, nucleic acids from a culture or collection that has been contacted with the compound may be analyzed directly without comparison to a control culture or collection.
[0247]
Current methods of identifying targets for compounds that inhibit cell proliferation are tedious and time consuming. Using the above methods, it may be possible to rapidly identify targets for a large number of compounds. In such a method, the above-described method is performed simultaneously for each of a number of compounds. For example, the compound may be a member of a compound library produced using combinatorial chemistry, or a member of a natural product library. In such a method, each of a plurality of cultures, each containing a plurality of strains overexpressing various gene products required for growth, or each individual strain overexpressing various gene products required for growth, Multiple collections are obtained. The culture or collection of each strain is contacted with various compounds in the library and the targets of the compounds are identified as described above.
[0248]
In another embodiment of the invention, the gene product on which the compound inhibiting growth of the organism acts is a mixture of strains of the organism, including strains that underexpress the different gene products required for growth of the organism (ie, cultures). At least some of the strains in the product are identified using a culture that contains the gene product required for growth of the organism. Preferably, each of the strains in the culture is underexpressed a different gene product that is required for growth of the organism (ie, all of the strains in culture have the gene product that is required for growth of the organism) Underexpressed). Such strains can be obtained using the methods described above. The culture may contain any number of strains. For example, the culture may comprise at least 2 strains, at least 10 strains, at least 20 strains, at least 30 strains, at least 50 strains, at least 100 strains, at least 300 strains, or 300 strains. It may contain more than one strain. In some embodiments, strains in culture may include strains that generally underexpress all or most of the gene products required for growth of an organism.
[0249]
The culture is contacted with a compound that inhibits the growth of the organism. The compound may be a candidate drug compound obtained from any source. For example, the compound is a compound produced using combinatorial chemistry, a compound from a natural product library, or an impure or incompletely purified compound (eg, a compound in an incompletely purified natural extract). Is also good. Contacting the culture with a compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of an organism in culture that underexpresses the gene product on which the compound acts, resulting in an underexpression of the gene product on which the compound acts. Strains that do not express grow in culture more rapidly than strains that underexpress the gene product on which the compound acts. Thus, after a sufficient period of time, strains that under-express the gene product on which the compound acts are less predominant in culture than strains that do not under-express the gene product on which the compound acts. In one embodiment, the growth conditions and incubation period are selected such that only one strain, ie, a strain that underexpresses the target of the compound, grows in culture at a reduced rate. In another embodiment, the growth conditions are selected such that strains that under-express the target of the compound are not recovered from the culture. Thus, in one embodiment, multiple cultures, each containing multiple strains that underexpress the gene products required for various growth, may be grown in the presence of various concentrations of the compound. In embodiments where, besides altering the compound concentration, the expression of a gene product required for growth is under the control of a regulatable promoter, reducing the effect of the repressor on transcription from the inducer or promoter is achieved in multiple cultures. Various concentrations of an agent, such as an agent, that regulates the level of expression from a promoter may be grown. The culture may be grown in liquid culture in the presence of the compound whose target is specified (and, where appropriate, in the presence of an agent that regulates the level of expression from the promoter), or A liquid culture containing a strain that under-expresses the gene expression required for expression contains the compound after growth in the absence of the compound whose target is specified (and, if appropriate, expression from the promoter). (Which also contains agents that regulate levels).
[0250]
The identity of the underexpressed gene product that is the target of a compound can be determined using a variety of methods. For example, in some embodiments, a nucleic acid present in a culture or collection of a strain that has been contacted with a compound is compared to a nucleic acid present in a control culture or collection of a strain that has not been contacted with the compound. A nucleic acid may be identified that is underexpressed in a culture or collection of a strain that has been contacted with a test compound relative to a control culture or collection of the strain. Alternatively, in some embodiments, the nucleic acid present in the culture or collection of the strain that has been contacted with the test compound is analyzed to determine whether the nucleic acid is absent without comparison to a control culture or collection of the strain. Alternatively, nucleic acids present at reduced levels may be identified.
[0251]
In some embodiments of the invention, a strain that grows more slowly in a culture or collection of strains, i.e., a strain that has a lower ability to grow in the presence of a test compound or does not grow in the presence of a test compound, It is specified as follows. Amplification products that correlate with each under-expressed gene and are distinguishable from each other are obtained from cultures or collections grown in the presence of the test compound. Amplification products are distinguished from each other to determine if a particular amplification product is underexpressed in a culture or collection of strains. In some embodiments, the amplification products corresponding to each of the gene products have a length such that the amplification products can be distinguished from each other. In another embodiment, the one or more amplification products have similar or identical lengths, but are distinguishable from one another based on a detectable agent, such as a dye, attached to the amplification product. In some embodiments, the underexpressed amplification product is an amplification product from a culture or collection of a strain that has been contacted with a test compound, the amplification product from a culture or collection of a strain that has not been contacted with the test compound. It is identified by comparing with the amplification product. Alternatively, underexpressed amplification products in a culture or collection of strains simply indicate which amplification products are absent or present at reduced levels in the culture or collection of strains. It may be specified by determining. The above method of producing a discriminable amplification product reduces the gene product required for the amplification described herein to facilitate identification of strains that grow more slowly in the presence of the test compound. It may be used in combination with any of the methods for producing a strain that expresses.
[0252]
For example, in some embodiments of the invention, each natural promoter of each gene encoding a gene product required for growth may be replaced with a single desired replacement promoter. After growing a culture or collection of the strain containing the strain in which the promoter has been replaced in the presence of the test compound for a desired period of time, the amplification reaction is performed on nucleic acid obtained from the culture as follows.
[0253]
Nucleic acid from a culture or collection of strains is split into at least two aliquots. In a preferred embodiment, nucleic acids from a culture or collection of strains are split into four aliquots. Single primers that are complementary to nucleotide sequences in the replacement promoter, in the gene required for growth, or in the nucleic acid sequence adjacent to the promoter or gene required for growth, are divided into four groups. Each group contains a separate detectable dye, such as 6FAM ™, TET ™, VIC ™, HEX ™, NED ™, and 6FAM ™ available from Applied Biosystems (Foster City, CA). Labeled with PET ™ dye. For example, the primers may be labeled using a DS-31 or DS-33 dye set available from Applied Biosystems (Foster City, CA). Each group of labeled primers is added to each of the aliquots of nucleic acid from a culture or collection of strains, such that each aliquot of nucleic acid has a single labeled primer with a single detectable dye on the primer. receive.
[0254]
Each aliquot of nucleic acid may also contain a nucleotide sequence unique to one of the genes encoding the gene product required for growth placed under the control of the replacement promoter, within the promoter, or required for the promoter or growth. An unlabeled primer set is received having a respective unlabeled primer that is complementary to a nucleotide sequence within the nucleotide sequence adjacent to the gene. Each aliquot receives a primer specific to the gene required for 1 / N growth, where N is the number of aliquots, placed under the control of a replacement promoter (ie, the culture or collection of strain is If the genes required for growth were placed under the control of a replacement promoter and consisted of 100 strains split into 4 aliquots, each 4 aliquots of nucleic acid from a culture or collection of strains would have 25 Primers complementary to this gene). The unlabeled primers are each selected to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product produced by the other unlabeled primer. Preferably, the amplification products are from about 100 to about 400 nucleotides in length, but any length that can be distinguished from each other may be used. Further, in some embodiments, some of the amplification products may have the same or very similar lengths, but may be distinguishable from each other by labeling with a distinguishable dye.
[0255]
The nucleic acid amplification reaction is performed for each nucleic acid aliquot. The amplification products are then separated by length to identify amplification products with reduced or absent expression in a culture or collection of strains. The amplification products are then correlated with the corresponding gene to determine which strains grew more slowly in a culture or collection of strains. If desired, in a culture, the amplification product obtained from a culture or collection of a strain that has been contacted with the compound can be compared with an amplification product obtained from a control culture or collection of a strain that has not been contacted with the compound. Amplified products with reduced expression may be identified. Alternatively, if desired, amplicons that are missing or present at reduced levels in a culture that has been contacted with a compound may be directly identified without comparison to a control culture that has not been contacted with the compound.
[0256]
For example, in some embodiments, amplification products from each nucleic acid aliquot are pooled and subjected to capillary electrophoresis. Amplification products are detected by detecting the fluorescent dye bound to the amplification product and determining their length to identify those amplification products that have reduced expression in a culture or collection of strains. 1A and 1B illustrate one embodiment of this method, wherein the absence of amplification products from an amplification reaction performed in a culture containing multiple strains that underexpress the genes required for growth, Shows that the test compound acts on the gene corresponding to the missing amplification product.
[0257]
Alternatively, in another embodiment, the first amplification reaction comprises a first primer complementary to a nucleotide sequence present upstream or downstream of all overexpressed genes (eg, upstream of all overexpressed genes). Primers complementary to the nucleotide sequence in the replacement promoter described in (1) and primers complementary to the nucleotide sequence unique to each strain (eg, primers complementary to the nucleotide sequences in each of the genes required for growth). Performed on nucleic acids obtained from a culture or collection of strains contacted with the compound. One of the two amplification primers for each of the genes required for growth is labeled with a dye as described above. Preferably, a common primer complementary to the upstream or downstream nucleotide sequence of all overexpressed genes is labeled with a dye. The primer used in the amplification reaction is designed so that the amplification product corresponding to the gene required for each propagation has a specific length. The second amplification reaction is performed on a control culture or collection of strains that have not been contacted with the compound using the same primers as in the first amplification reaction. The amplification product from the first amplification reaction is compared to the amplification product from the second amplification reaction to identify one or more amplification products that are underexpressed in the culture or collection of the strain. For example, the amplification product from the first amplification reaction may be run on a separate polyacrylamide gel lane from the amplification product from the second amplification reaction, or on a separate capillary from the amplification product, Compare capillaries to each other.
[0258]
Alternatively, in some embodiments, the primers in the second amplification reaction are labeled with a different dye that is distinguishable from the dye used in the first amplification reaction. In this embodiment, amplification reactions may be pooled and run on the same lane or the same capillary on a polyacrylamide gel, and the products from each amplification reaction compare the amount of each dye present for each amplification product Are compared by 2A and 2B illustrate one embodiment of this method, wherein an amplification product from an amplification reaction performed in a culture comprising a plurality of strains that underexpress a gene required for growth in contact with a compound Indicates that the test compound acts on the gene corresponding to the missing amplification product.
[0259]
If desired, rather than splitting the culture into aliquots, individual amplification reactions may be performed on nucleic acids obtained from a culture or collection of strains. Each amplification reaction contains primers that produce an amplification product specific for only one of the genes required for growth. Amplification products resulting from each individual amplification reaction are pooled, and amplification products with reduced expression in culture are identified as described above.
[0260]
In one embodiment, the expression of each strain in the culture is expressed in an array comprising nucleic acids encoding the genes required for growth or a portion thereof, the genes required for growth or one of the genes required for growth obtained from the culture. Can be assessed by hybridizing a detectably labeled nucleic acid encoding a moiety. Each nucleic acid encoding a gene product or a portion thereof required for growth occupies a known location on the array. The signal from each location on the array is quantified to identify nucleic acids encoding gene products required for growth that are underexpressed in culture. If desired, a hybridized nucleic acid from a culture that has been contacted with the compound may be compared to a hybridized nucleic acid from a control culture that has not been contacted with the compound. Alternatively, hybridized nucleic acids from a culture that has been contacted with a compound may be directly identified without comparison to nucleic acids from a control culture.
[0261]
Alternatively, each strain that under-expresses the gene product required for growth can be constructed to contain a unique nucleic acid sequence (also referred to herein as a "tag"). The tag may be included in the chromosome of each strain or in an extrachromosomal vector. For example, a tag can be included in a vector encoding an antisense nucleic acid complementary to a gene product required for growth or a gene encoding a portion of such a gene, or the tag can be included in the antisense nucleic acid itself. It may be. Expression of each strain in the culture is underexpressed or absent from the culture by performing an amplification reaction using primers complementary to each of the tags to quantify the level of amplification product generated It can be evaluated by specifying the tag. Since each tag corresponds to one strain, strains that are under-expressed or absent from the culture can be identified. If desired, the tag present in the culture that has been contacted with the compound may be compared to the tag present in a control culture that has not been contacted with the compound. Alternatively, tags present in a culture that has been contacted with the compound may be analyzed without comparison to a control culture.
[0262]
It will be appreciated that, if desired, unique tags may also be used in embodiments where the gene product required for growth is overexpressed. In some aspects of such embodiments, the tag can be in or adjacent to a promoter that drives expression of the gene encoding the gene product. In such embodiments, a gene product that is overexpressed in a strain that grows more rapidly in culture can be identified by detecting the presence or amount of a unique tag corresponding to the gene product in culture.
[0263]
In some embodiments of the invention, the multiple strains cannot grow very quickly in the presence of the compound. This can be due to various causes. For example, the concentration of the compound may not be high enough to reduce proliferation only in cells that underexpress one gene product (ie, the target gene product). Strains that underexpress the target gene product are less predominant in culture, while other strains can also be underexpressed. In such cases, the identity of the gene product in the least prevalent (or not recovered) strain in the culture is identified by quantifying the level of each of the genes encoding the proteins required for growth in culture. Can be done. This can be achieved using quantitative PCR, DNA sequencing, hybridization, or the array technology described above.
[0264]
In other cases, many strains show less rapid growth in culture as a result of common functional attributes. For example, each strain that grows less rapidly (or that is not recovered from culture) may underexpress a gene product that has a common enzymatic activity, such as, for example, serine protease activity. Alternatively, each strain that grows less rapidly (or that is not recovered from culture) may underexpress gene products that have a common functional domain, such as a cAMP binding domain. In such cases, the common attributes of strains that grow less rapidly (or that are not recovered from culture) may provide information about the mode of action of the compound or the biochemical activity of the target of the compound. For example, if all of the genes that are underexpressed in strains that grow less rapidly are serine proteases, the compound acts by inhibiting serine protease activity and the target protein is a serine protease. If desired, the compound may be derivatized, and the effectiveness of the derivatized compound on each of the more rapidly growing strains will depend on the derivative capable of interacting with a wide range of targets that share a common activity or binding site (I.e., derivatives that have a greater ability to inhibit the growth of all strains than the original compound) or that have greater specificity for the desired target (i.e., the original compound). Derivatives with greater specificity for one of the strains) can be evaluated as described herein.
[0265]
In some embodiments, rather than using a single culture containing each of a number of strains that underexpress the gene product required for growth, the methods of the invention provide for underexpressing the gene product required for different growth. Of each individual strain (ie, a collection of strains). For example, each individual strain that underexpresses a gene product required for different growth may be grown in different wells of a multi-well plate. Each well is contacted with a compound (and, where appropriate, an agent that regulates the level of expression from a promoter). The growth level of the strain in each well is determined to identify strains that grew less rapidly or did not grow at all. The identity of the underexpressed gene product in strains that grew less rapidly or did not grow at all is determined as described above.
[0266]
In another embodiment, each individual strain (ie, a collection of strains) that underexpresses a gene product required for different growth may be grown at different locations on a solid medium such as an agar plate. The medium contains the compound and, where appropriate, an agent that regulates the level of expression from the promoter. The growth level of each strain is determined to identify those strains that have grown less rapidly (or that are not recovered from culture). The identity of the gene product that is underexpressed in strains that grew less rapidly (or strains that are not recovered from culture) is determined as described above.
[0267]
The methods described above may be used to prioritize compound development or to determine if a compound has already been identified or if the target of a compound is already the target of an identified drug. In particular, if the product is a natural product, it is preferable to determine if the compound has already been identified before devoting considerable effort in developing the compound. Thus, in some embodiments of the invention, the targets of incompletely purified or purified natural products, or compounds produced by combinatorial chemistry, are identified using the methods described above and compared to targets of known drugs. You. If the target is the same as that of a known drug, further development of the compound is stopped.
[0268]
In some embodiments of the invention, an array of each strain that underexpresses a different gene product (ie, a collection of strains) is grown on a solid medium containing the compound to be evaluated. The location of each strain in the array and the gene product underexpressed by that strain is known. A colony pattern that grows poorly or cannot grow in the presence of the compound is assessed and compared to a colony pattern that grows too fast or cannot grow in the presence of the already specified agent. If the colony pattern that grows poorly or cannot grow in the presence of the compound being evaluated is the same as the colony pattern grows poorly or cannot grow in the presence of the already identified drug Further development of the compound will be discontinued.
[0269]
In another embodiment, the nucleotide sequence of the gene product in a strain that grew less rapidly in the assay described above (or a strain that was not recovered from culture) is compared to the nucleotide sequence of a gene product from a heterologous organism. Determine the potential range of species whose growth will be inhibited by the compound. If the gene product has a high degree of homology to gene products from heterologous species, the compound is also likely to inhibit the growth of these heterologous species. Homology may be determined using any of a variety of methods familiar to those skilled in the art. For example, homology can be determined using a computer program such as BLASTP or FASTA. Subsequently, the ability of the compound to inhibit the growth of a heterologous species can be confirmed by comparing the growth of cells of a heterologous species in the presence and absence of the compound.
[0270]
Current methods of identifying targets for compounds that inhibit cell proliferation are tedious and time consuming. Using the above methods, it may be possible to rapidly identify targets for a large number of compounds. In such a method, the above-described method is performed simultaneously for each of a number of compounds. For example, the compound may be a member of a compound library produced using combinatorial chemistry, or a member of a natural product library. In such a method, each of a plurality of cultures, each including a plurality of strains that underexpress various gene products required for growth, or each individual strain that underexpresses various gene products required for growth, Multiple collections are obtained. The culture or collection of each strain is contacted with various compounds in the library and the targets of the compounds are identified as described above.
[0271]
In some embodiments of the invention, a nucleic acid that is complementary to a gene or a portion thereof that encodes a gene product that is required for growth (ie, a gene that encodes a gene product that is required for growth or a portion thereof) A strain is constructed in which the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid is operably linked to a regulatable promoter. Cultures containing multiple such strains, each expressing an antisense nucleic acid against a gene product required for different growth, are grown in the presence of varying levels of compounds that inhibit growth and from regulatable promoters. Grow in the presence of various levels of agents that regulate transcription levels. A nucleic acid sample is obtained from the culture, detectably labeled, and hybridized to a solid support containing nucleic acids containing genes encoding gene products required for growth or portions thereof. The level of hybridization is quantified for each nucleic acid encoding each of the gene products required for growth to determine the rate at which each strain has grown in culture. If the antisense nucleic acid expressed by the strain in culture is not complementary to all or part of the gene encoding the compound's target (ie, a non-specific strain), the hybridization intensity for that strain is determined by the compound concentration If the antisense nucleic acid expressed by a strain in culture is complementary to all or part of the gene encoding the target of the compound, while not correlating with (see FIG. 3), the hybridization intensity for that strain Is closely correlated with compound concentration (see FIG. 4). In this manner, the target of the compound may be identified. It will be appreciated that instead of growing the strains in a single culture as described above, each strain may be grown at a different location on solid media or in different wells of a multi-well plate.
[0272]
The methods herein may be performed simultaneously on each of a plurality of compounds that inhibit growth, since it is possible to rapidly identify the targets of these compounds.
[0273]
Some embodiments of the invention are outlined in the following columns. It will be appreciated that the invention may be applied to cultures of any organism and that any gene product required for growth of the organism may be over- or under-expressed. Thus, the organisms and gene products described in the following examples are merely illustrative and do not limit the scope of the invention.
[0274]
Genes required for cell growth for use in the present invention may be identified from the literature, may be identified using the following methods, or using other methods familiar to those of skill in the art. It may be specified. In some embodiments of the present invention, the culture is a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806- A gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 4860, 5916-10012, and 14111-14944, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Includes strains in which a gene product selected from the group consisting of gene products comprising an amino acid sequence selected from the group is over- or under-expressed. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5916 to 10012, and 14111 to 14944; The identification of a gene product comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 is described below.
Embodiment 1
[0275]
Identification of genes required for cell growth by expressing antisense RNA complementary to at least a part of genes required for cell growth
Random genomic fragments are obtained from an organism in which it is desired to identify genes required for cell growth. Random genomic fragments can be obtained by partial digestion with restriction enzymes, mechanical shearing using techniques such as sonication and spraying, or DNase I digestion. The random genomic fragment is operably linked to a regulatable promoter in the vector. When the inserted genomic fragment is in the antisense orientation with respect to the promoter, the transcript produced is complementary to at least a portion of the mRNA encoding the gene product, such that the transcript is produced from the sense gene produced from various genes. Interacts with mRNA, thereby reducing the translation efficiency or level of sense messenger RNA (mRNA), and thus reducing the production of proteins encoded by these sense mRNA molecules. If the sense mRNA encodes a protein that is required for growth, cells grown under inducible conditions will not be able to grow, or will have a significantly reduced growth rate. Furthermore, if the transcript produced is complementary to at least a portion of the untranslated RNA and the untranslated RNA is required for growth, cells grown under inducible conditions may also grow. No, or the growth rate is significantly reduced. In contrast, cells grown under non-inducing conditions grow at a normal rate. Subsequently, the gene to which the antisense nucleic acid is complementary is identified and utilized in the methods of the invention. Thus, to identify the genes required for cell growth, the extent of vector-containing cell growth in the presence of an agent that induces transcription from a regulatable promoter is determined by cell growth in the absence of the agent. To the degree of. Cells that grow well in the absence of the agent, but show a significant decrease in proliferation in the presence of the agent, encode antisense nucleic acids complementary to at least some of the genes required for cell growth. Vector.
[0276]
Using the above method, genes required for cell growth in Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis were identified. The identification of genes required for cell growth in Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis is described in the following U.S. patent applications ( The disclosures of which are incorporated herein by reference in their entirety): U.S. Patent Application Serial No. 09 / 815,242, filed March 21, 2001, filed January 27, 2000. U.S. patent application Ser. No. 09 / 492,709, U.S. patent application Ser. No. 09 / 711,164, filed Nov. 9, 2000, U.S. patent application Ser. No. 09 / 741,669, filed Dec. 19, 2000, and 2001 U.S. Patent Application Serial No. 09 / 815,242 filed March 21 The methods used to identify these genes required for cell growth are outlined below.
[0277]
In order to identify the genes required for the growth of Escherichia coli, a random genomic fragment was transformed into the IPTG-inducible expression vector pLEX5BA (Krause et al., J. Mol. Biol. 274: 365 (1997): PLEX5BA-3 ', a modified version of pLEX5BA (a synthetic linker containing the T7 terminator) is linked between the PstI and HindIII sites of pLEX5BA, which is hereby incorporated by reference in its entirety. ). In particular, to construct pLEX5BA-3 ′, the following oligonucleotides were annealed and inserted into the PstI and HindIII sites of pLEX5BA:
5'-GTCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCCTTGAGGGGTTTTTGA-3 '(SEQ ID NO: 15779) The exact SEQ ID NO inserted throughout this application)
5′-AGCTTCAAAAACCCCTCCAAGGACCCGTTTAGAGCCCCAAGGGGTTATGCTAGACTGCA-3 ′ (SEQ ID NO: 15780).
[0278]
Random fragments of Escherichia coli genomic DNA were generated by DNase I digestion or sonication, filled in with T4 polymerase and cloned into the Smal site of pLEX5BA or pLEX5BA-3 '. Upon activation or induction, the promoter transcribed random genomic fragments.
[0279]
To investigate the effect of transcription induction in liquid medium, the culture was reverse diluted 1: 200 in fresh medium with or without 1 mM IPTG and the OD was changed every 30 minutes (min). 450 Was measured to create a growth curve. To investigate the effect of transcription induction on solid media, 10 Two , 10 Three , 10 Four , 10 Five , 10 6 , 10 7 , And 10 8 A two-fold dilution was prepared. Aliquots of 0.5-3 μl of these dilutions were spotted on selective agar plates with or without 1 mM IPTG. After overnight incubation, the plates were compared to assess the sensitivity of the clone to IPTG.
[0280]
Of the large number of clones tested, some clones were identified as containing sequences that inhibit the growth of Escherichia coli following IPTG induction. Thus, the gene to which the inserted nucleic acid sequence corresponds, or the gene in the operon containing the inserted nucleic acid, is required for the growth of Escherichia coli.
[0281]
The nucleic acids required for the growth of Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, and Klebsiella pneumoniae were identified as follows. Randomly generated fragments of genomic DNA of Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis were transcribed from an inducible promoter.
[0282]
In the case of Staphylococcus aureus, a novel inducible promoter system, XylT5, containing a modified T5 promoter fused to the xylO operator from the xylA promoter of Staphylococcus aureus was used. This promoter is described in US patent application Ser. No. 10 / 032,393, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Transcription from this hybrid promoter can be induced by xylose.
[0283]
A randomly generated fragment of Salmonella tafimariam genomic DNA was transcribed in pLEX5BA from the IPTG-inducible promoter (Krause et al., J. Mol. Biol. 274: 365 (1997)), or a derivative thereof. A randomly generated fragment of Klebsiella pneumoniae genomic DNA was expressed from the IPTG-inducible promoter in pLEX5BA-Kan. To construct pLEX5BA-Kan, pLEX5BA was completely digested with ClaI to remove the bla gene. Next, the plasmid was partially NotI digested and blunt-ended with T4 DNA polymerase. Next, the 3.2 kbp fragment was gel purified and ligated to the blunt-ended 1.3 kbp kan gene from pKanπ. Kan resistant transformants were selected on Kan plates. The orientation of the kan gene was examined by SmaI digestion. Clones having the kan gene in the same orientation as the bla gene were used to identify genes required for the growth of Klebsiella pneumoniae.
[0284]
A randomly generated fragment of Pseudomonas aeruginosa genomic DNA was transcribed from a two-component inducible promoter system. A lacUV5 / lacO regulated T7 RNA polymerase gene was integrated on the chromosome (Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111: 35-41: the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Incorporated). On a separate plasmid, the T7 gene 10 promoter transcribed by T7 RNA polymerase was fused with the lacO operator and a number of cloning sites.
[0285]
In the case of Staphylococcus aureus, a shotgun library of genomic fragments of Staphylococcus aureus was cloned into the vector pXyIT5-P15a carrying an XyIT5-inducible promoter. The vector was linearized at a unique BamHI site immediately downstream of the XyIT5 promoter / operator. The linearized vector was treated with shrimp alkaline phosphatase to prevent resequestering of the linearized ends. Genomic DNA isolated from Staphylococcus aureus strain RN450 was either completely digested with the restriction enzyme Sau3A or partially digested with DNase I and "blunt-ended" by incubation with T4 DNA polymerase. did. Random genomic fragments of 200-800 base pairs in length were selected by gel purification. The size-selected genomic fragments were added to the linearized and dephosphorylated vector at a molar ratio of 0.1 to 1 and ligated to form a shotgun library.
[0286]
The ligation product was transformed into electrocompetent Escherichia coli strain XL1-Blue MRF '(Stratagene) and plated on LB medium supplemented with carbenicillin at 100 μg / ml. 5 × 10 in total Five More colonies were scraped together and subsequently plasmid purified.
[0287]
Next, the purified library was transformed into Staphylococcus aureus RN4220 electrocompetent. To generate a 100-150 plate culture of 500 colonies per plating, the resulting transformants contained LB + 0.2% glucose (LBG medium) +15 μg / ml chloramphenicol (LBG + CM15 medium) Plated on agar. Colonies were robotically picked and arrayed into the wells of a 384 well culture dish. Each well had 100 μl of LBG + CM15 liquid medium. The inoculated 384-well dishes were incubated at 37 ° C. for 16 hours and each well was robotically gridded onto solid LBG + CM15 medium with or without 2% xylose. The gridded plates were incubated at 37 ° C. for 16 hours, followed by manual scoring of aligned colonies that grew slowly in the presence of xylose.
[0288]
Aligned colonies that are growth sensitive on media containing 2% xylose can grow on similar media without xylose and were further analyzed for growth sensitivity as follows. Colonies from the xylose-free plates were manually picked and inoculated into individual wells of a 96-well culture dish with LBG + CM15 and incubated at 37 ° C. for 16 hours. These cultures are automatically diluted 1/100 into fresh medium and allowed to incubate at 37 ° C. for 4 hours, after which they are serially diluted in a 384-well array followed by 2% xylose Grids were placed on medium or medium without xylose. After growing at 37 ° C. for 16 hours, the arrays generated on the two media were compared to each other. Clones that grew similarly in all dilutions on both media were scored as negative and were not considered further. Clones that grew on xylose medium but failed to grow with the same serial dilution on non-xylose plates were scored based on the differences. That is, on a xylose plate, 10 Four Grow with the following serial dilutions and 10 on non-xylose plates 8 Clones growing at the following serial dilutions were given a score of "4" representing the difference in log of growth observed.
[0289]
For Salmonella tafimariam and Klebsiella pneumoniae, the culture was reverse diluted 1: 200 in fresh or IPTG-free medium with 1 mM IPTG and OD every 30 minutes (min). 450 Was measured to create a growth curve. To investigate the effect of transcription induction on solid medium, 10 Two , 10 Three , 10 Four , 10 Five , 10 6 , 10 7 , And 10 8 A two-fold dilution was prepared. Aliquots of 0.5-3 μl of these dilutions were spotted on selective agar plates with or without 1 mM IPTG. After overnight incubation, the plates were compared to assess the sensitivity of the clone to IPTG.
[0290]
Nucleic acids involved in the growth of Pseudomonas aeruginosa were identified as follows. A randomly generated fragment of Pseudomonas aeruginosa genomic DNA was transcribed from a two-component inducible promoter system. The T7 RNA polymerase gene regulated by lacUV5 / lacO was integrated on the chromosome (Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111: 35-41). On the expression plasmid there was a T7 gene 10 promoter transcribed by T7 RNA polymerase fused to the lacO operator as well as a number of cloning sites. Transcription from this hybrid promoter can be induced by IPTG. If the genomic DNA downstream of the promoter contains, in the antisense direction, at least a portion of an mRNA encoding a gene product involved in growth, induction of expression from the promoter will inhibit growth to a detectable extent. .
[0291]
A shotgun library of Pseudomonas aeruginosa genomic fragments was cloned into pEP5, pEP5S, or other similarly constructed vectors carrying a T71acO inducible promoter. The vector was linearized with a unique SmaI site just downstream of the T71acO promoter / operator. The linearized vector was treated with shrimp alkaline phosphatase to prevent resequestering of the linearized ends. Genomic DNA isolated from Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 was partially digested with DNase I and "blunt-ended" by incubating with T4 DNA polymerase. Random genomic fragments of 200-800 base pairs in length were selected by gel purification. The size-selected genomic fragments were added to the linearized and dephosphorylated vector at a 2: 1 molar ratio and ligated to create a shotgun library.
[0292]
The ligation product was transformed into Escherichia coli strain XL1-Blue MRF ′ (Stratagene) electrocompetent and plated on LB medium with 100 μg / ml carbenicillin or 100 μg / ml streptomycin. 5 × 10 in total Five More than one resulting colony was scraped together and subsequently plasmid purified.
[0293]
Next, the purified library was transformed into electrocompetent Pseudomonas aeruginosa strain PAO1. The resulting transformants were plated on LB agar with 100 μg / ml carbenicillin or streptomycin 40 μg / ml in order to generate 100-150 platings of 500 colonies per plating. Colonies were robotically picked and arrayed into the wells of a 384 well culture dish. Each well had 100 μl of LB + CB100 or Streptomycin 40 liquid medium. The inoculated 384-well dishes were incubated for 16 hours at room temperature, and each well was robotically gridded onto solid LB + CB100 or streptomycin 40 medium with or without 1 mM IPTG. The gridded plates were incubated at 37 ° C. for 16 hours, and then scored manually for aligned colonies that grew slow in the presence of IPTG.
[0294]
Aligned colonies that are growth sensitive on media containing 1 mM IPTG can grow on similar media without IPTG and were further analyzed for growth sensitivity as follows. Colonies were manually picked from plates without IPTG and inoculated into individual wells of a 96-well culture dish with LB + CB100 or streptomycin 40 and incubated at 30 ° C. for 16 hours. These cultures are automatically diluted 1/100 into fresh medium and allowed to incubate at 37 ° C. for 4 hours, after which they are serially diluted in a 384-well array followed by 1 mM IPTG Alternatively, the cells were arranged in a grid on a medium not containing the cells. After growing for 16 hours at 37 ° C., the resulting array of serially diluted spots was compared between the two media. Clones that grew similarly in all dilutions on both media were scored as negative and were not considered further. Clones that grew on IPTG medium but failed to grow at the same serial dilution on non-IPTG plates were scored based on the differences. That is, 10 on the IPTG plate Four Grow at the following serial dilutions and grow on a non-IPTG plate 8 Clones growing at the following serial dilutions were given a score of "4" representing the difference in log of growth observed.
[0295]
After identifying those vectors that negatively affected the growth or proliferation of Pseudomonas aeruginosa upon induction, the inserts or nucleic acid fragments contained in those vectors were isolated for further characterization. Certain vectors were nucleic acid sequenced.
[0296]
E. FIG. Nucleic acids involved in the growth of E. faecalis were identified as follows. Randomly generated fragments of genomic DNA were expressed from vectors pEPEF3 or pEPEF14 containing the CP25 or P59 promoter, respectively, regulated by the xyl operator / repressor. If the genomic DNA downstream of the promoter contains, in the antisense direction, at least a portion of the mRNA encoding a gene product involved in growth, induction of expression from the promoter will inhibit growth to a detectable extent. You.
[0297]
E. FIG. A shotgun library of E. faecalis genomic fragments was cloned into the vector pEPEF3 or pEPEF14 with a xylose-inducible promoter. The vector was linearized with a unique Smal site immediately downstream of the promoter / operator. The linearized vector was treated with alkaline phosphatase to prevent resequestering of the linearized ends. E. FIG. Genomic DNA isolated from E. faecalis strain OG1RF was "blunt-ended" by partial digestion with DNase I and incubation with T4 DNA polymerase. Random genomic fragments of 200-800 base pairs in length were selected by gel purification. The size-selected genomic fragments were added to the linearized and dephosphorylated vector at a 2: 1 molar ratio and ligated to create a shotgun library.
[0298]
The ligation product was transformed into E. coli strain TOP10 electrocompetent cells (Invitrogen) and plated on LB medium containing 150 μg / ml erythromycin (Erm). 5 × 10 in total Five More than one resulting colony was scraped together and subsequently plasmid purified.
[0299]
Next, the purified library was placed in E. coli. E. faecalis strain OG1RF electrocompetent. The resulting transformants were plated on Todd-Hewitt (TH) agar with 10 μg / ml erythromycin to generate 500-100 colonies of 100-150 plating per plating. Colonies were robotically picked and arrayed into the wells of a 384 well culture dish. Each well had 100 μl of THB + Erm 10 μg / ml. The inoculated 384-well dishes were incubated for 16 hours at room temperature, and each well was robotically gridded onto solid TH agar + Erm with or without 5% xylose. The gridded plates were incubated at 37 ° C. for 16 hours, followed by manual scoring of aligned colonies that grew slowly in the presence of xylose.
[0300]
Aligned colonies that are growth sensitive on media containing 5% xylose were able to grow on similar media without xylose and were further analyzed for growth sensitivity. Colonies were manually picked from xylose-free plates and inoculated into individual wells of a 96-well culture dish containing THB + Erm10 and incubated at 30 ° C. for 16 hours. These cultures were automatically diluted 1/100 into fresh medium, allowed to incubate at 37 ° C. for 4 hours, and then serially diluted on plates with or without 5% xylose. After growing at 37 ° C. for 16 hours, the resulting array of serial dilution spots was compared between the two media. Colonies that grew similarly on both media were scored negative, and the corresponding colonies were not considered further. Colonies on xylose medium that failed to grow at the same serial dilution as on non-xylose plates were scored based on the difference. For example, if a colony on xylose medium grows only for a serial dilution of -4, but can grow on a non-xylose plate for a serial dilution of -8, the corresponding transformant colony Received a score of "4" representing the difference in log of observed growth.
[0301]
At the time of induction, After identifying those vectors that negatively affected the growth or growth of E. faecalis, the inserts or nucleic acid fragments contained in their expression vectors were isolated for further characterization. The insert in a given vector was nucleotide sequenced.
[0302]
It will be appreciated that other restriction enzymes and other endonucleases or methodologies may be used to generate random genomic fragments. Further, random genomic fragments may be generated by mechanical shearing. Sonication and spraying are techniques commonly used for mechanical shearing of DNA.
Embodiment 2
[0303]
Nucleotide sequencing of specific clones that transcribe nucleic acid fragments that have deleterious effects on the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimarium, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis
The nucleotide sequence of the nucleic acid sequence that inhibits the growth of Escherichia coli was determined using QIAPREP (Qiagen, Valencia, CA) and plasmid DNA isolated using methods provided by the manufacturer. The primers used to sequence the insert were 5'-TGTTTATCAGACCGCTT-3 '(SEQ ID NO: 15781) and 5'-ACAAATTTCACACAGCCTC-3' (SEQ ID NO: 15782). These sequences are adjacent to the polylinker in pLEX5BA.
[0304]
The nucleotide sequence of the nucleic acid sequence that inhibits the growth of Staphylococcus aureus was determined as follows. Staphylococcus aureus was grown in standard laboratory medium (LB or TB with 15 μg / ml chloramphenicol for plasmid selection). Grow overnight at 37 ° C. in culture tubes or 2 ml deep well microtiter plates.
[0305]
Lysis of Staphylococcus aureus was performed as follows. After centrifuging the culture (2-5 ml) and resuspending the cell pellet in a 1.5 mg / ml solution of lysostaphin (20 μl / ml of the original culture), suspending buffer (Qiagen) 250 μl was added. Alternatively, the cell pellet was resuspended directly in 250 μl of suspension buffer (Qiagen) and 5-20 μl of a 1 mg / ml lysostaphin solution was added thereto.
[0306]
DNA was isolated using a Qiagene miniprep kit or Wizard (Qiagen) miniprep kit according to the instructions provided by the manufacturer.
[0307]
Genomic DNA inserts were amplified from purified plasmids by PCR as follows.
[0308]
1 μl of Qiagen purified plasmid was placed in a 25 μl total reaction volume of the Qiagen Hot Start PCRmix. For Staphylococcus aureus, the following primers were used in the PCR reaction:
pXylT5F: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG (SEQ ID NO: 15783)
LexL TGTTTATCACGACCGCTT (SEQ ID NO: 15784)
[0309]
The same procedure was performed for Salmonella Tafimaliam and Klebsiella pneumoniae. The following primers were used for Salmonella Tafimariam and Klebsiella pneumoniae:
5'-TGTTTTATCAGACCGCTT-3 '(SEQ ID NO: 15784), and
5'-ACAATTTCACACAGCCTC-3 '(SEQ ID NO: 15782).
PCR was performed on PE GenAmp using the following cycle times:
Step 1. 95 ° C for 15 minutes
Step 2. 94 ° C 45 seconds
Process 3.54 ° C 45 seconds
Step 4.72 ° C. for 1 minute
Step 5. Return to step 2 and 29 times
Step 6.72 ° C. for 10 minutes
Step 7.4 Hold at 4O 0 C
PCR products were purified using Qiagen Qiaquick PCR plates according to the manufacturer's instructions.
[0310]
For Pseudomonas aeruginosa, plasmids from transformed colonies given a dilution plating score of “2” or higher were isolated as follows to obtain genomic DNA inserts that cause growth inhibition. Pseudomonas aeruginosa was grown in standard laboratory medium (LB with 100 μg / ml carbenicillin or streptomycin 40 μg / ml for plasmid selection). Grow overnight at 30 ° C. in 100 μl culture wells in microtiter plates. To amplify the insert DNA, 2 μl of the culture was placed in 25 μl of Qiagen Hot Start PCR mix. PCR reactions were performed in 96-well microtiter plates. For plasmid pEP5S, the following primers were used in the PCR reaction:
T7L1 +: GTCGGGCGATATAGGCGCAGCAACCG (SEQ ID NO: 15785)
pStrA3: ATAATCGAGCATGAGTATCATACCG (SEQ ID NO: 15786).
PCR was performed on PE GenAmp with the following cycle times:
Step 1. 95 ° C for 15 minutes
Step 2. 94 ° C 45 seconds
Process 3.54 ° C 45 seconds
Step 4.72 ° C. for 1 minute
Step 5. Return to step 2 and 29 times
Step 6.72 ° C. for 10 minutes
Step 7.4 Hold at 4O 0 C
PCR products were purified using Qiagen Qiaquick PCR plates according to the manufacturer's instructions.
[0311]
Subsequently, the purified PCR products were directly cycle-sequenced (sequenced) using Qiagen Hot Start PCRmix. The following primers were used in the sequencing reaction:
T7 / L2: ATGCGTCCGGCGTAGAGGGAT (SEQ ID NO: 15787).
PCR was performed on PE GenAmp with the following cycle times:
Step 1. 94 ° C 15 minutes
Step 2. 96 ° C. for 10 seconds
Step 3. 50 ° C. for 5 seconds
Step 4. 60 ° C. for 4 minutes
Step 5. Return to step 2 and repeat 24 times
Step 6.4 Keep at ℃
PCR products were purified using Qiagen Qiaquick PCR plates according to the manufacturer's instructions.
[0312]
E. FIG. Plasmids from transformed colonies that received a dilution plating score of "2" or greater for E. faecalis were isolated as follows to obtain genomic DNA inserts that cause growth inhibition. E. FIG. E. faecalis was grown overnight in 100 μl culture wells in microtiter plates at 30 ° C. in 10 μg / ml Erm of THB. To amplify the insert DNA, 2 μl of the culture was placed in 25 μl of Qiagen Hot Start PCR mix. PCR reactions were performed in 96-well microtiter plates. The following primers were used in the PCR reaction:
pXylT5: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG (SEQ ID NO: 15783), and pEP / pAK1 primer.
PCR was performed on PE GenAmp with the following cycle times:
Step 1. 95 ° C for 15 minutes
Step 2. 94 ° C 45 seconds
Process 3.54 ° C 45 seconds
Step 4.72 ° C. for 1 minute
Step 5. Return to step 2 and 29 times
Step 6.72 ° C. for 10 minutes
Step 7.4 Hold at 4O 0 C
PCR products were purified using Qiagen Qiaquick PCR plates according to the manufacturer's instructions.
[0313]
Subsequently, the purified PCR products were directly cycle-sequenced (sequenced) using Qiagen Hot Start PCRmix. The following primers were used in the PCR reaction:
pXylT5: CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG (SEQ ID NO: 15783).
PCR was performed on PE GenAmp with the following cycle times:
Step 1. 94 ° C 15 minutes
Step 2. 96 ° C. for 10 seconds
Step 3. 50 ° C. for 5 seconds
Step 4. 60 ° C. for 4 minutes
Step 5. Return to step 2 and repeat 24 times
Step 6.4 Keep at ℃
[0314]
PCR products were purified using Qiagen Qiaquick PCR plates according to the manufacturer's instructions.
[0315]
The amplified genomic DNA insert from each of the above procedures was automatically sequenced. The nucleotide sequences of the antisense nucleic acids that inhibited the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis are shown in the attached sequence listing in SEQ ID NOs: 8 to 3795. It is listed as.
Embodiment 3
[0316]
Comparison of isolated nucleic acids to known sequences
The nucleic acid sequence of the subcloned Escherichia coli genomic fragment obtained from the above-described vector is converted to the following default parameters:
Filtering off, cost to open the gap = 5,
Cost to expand the gap = 2,
Penalty for mismatch in blast part of run = −3,
Reward for matches in the blast part of the run = 1,
Expected value (e) = 10.0,
Word size = 11,
Number of notations per line = 100,
Using the number of alignments to be displayed (B) = 100,
BLAST version 1.4 or version 2.0.6 was used to compare against known Escherichia coli sequences in GenBank. BLAST is described in Altschul, J Mol Biol. 215: 403-10 (1990), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. The vector was found to contain nucleic acid sequences in both sense and antisense directions. The presence of known genes, open reading frames, and ribosome binding sites was determined by comparing to a public database with genetic information and various computer programs such as the Genetics Computer Group programs FRAMES and CODONPREFERENCE. A clone was termed "antisense" if the cloned fragment was directed to a promoter such that the RNA transcript produced was complementary to expressed mRNA (or untranslated RNA) from the chromosomal locus. If the clone encoded an RNA fragment that was identical to a portion of the wild-type mRNA from the chromosomal locus, the clone was called "sense".
[0317]
The nucleotide sequence of a subcloned fragment derived from Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, or Enterococcus faecalis obtained from the above-described expression vector, as follows, Staphylococcus aureus, Comparisons were made with known sequences from Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, or Enterococcus faecalis, and other microorganisms. First, in order to confirm that each clone originated from one position on the chromosome and that it was not chimeric, the nucleotide sequence of the selected clone was changed to Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Alternatively, clones were aligned at precise locations on the chromosome as compared to the genomic sequence of Enterococcus faecalis. Incomplete Staphylococcus aureus genomic sequences, which were compared using the NCBI BLASTN v2.0.9 program and approved by TIGR, as well as the NCBI non-redundant GenBank database were used as sources of genomic data. Salmonella tafimariam sequences are available from Genome Sequencing Center (http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml) and Sanger Center (http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi) Was compared with the sequence. Pseudomonas aeruginosa sequences were compared to a proprietary database and the NCBI GenBank database. E. FIG. The E. faecalis sequences were compared to a proprietary database.
[0318]
BLASTN analysis was performed using default parameters except that filtering was turned off. No further analysis was performed on the insert resulting from the ligation of the multiple fragments.
[0319]
Generally, antisense molecules and their complementary genes are identified as follows. First, a possible full-length open reading frame (ORF) is extracted from available genome databases. Such databases include the GenBank non-redundant (nr) database, the incomplete genome database available from TIGR, and the PathoSeq database developed by Incyte Genomics. The latter database contains more than 40 annotated bacterial genomes, including complete ORF analysis. If the database is incomplete for a given bacterial genome, it is not necessary to extract all ORFs in the genome, but only those ORFs in a portion of the available genomic sequence that are complementary to a given clone. is necessary. Computer algorithms for identifying ORFs such as GeneMark are available and are known in the art. Comparison of the cloned DNA with the complementary ORF (s) can determine whether the clone is a sense clone or an antisense clone. In addition, each ORF extracted from the database can be compared to sequences in fully annotated databases, including the GenBank (nr) protein database, SWISSPROT, and the like. Descriptions of the genes in the closely related microorganisms or closely related genes are often available from these databases. Using a similar method, an antisense clone corresponding to the gene encoding the untranslated RNA is identified.
[0320]
PathoSeq v4.1 of the microbial genomic sequence (March 2000) using each of the above-described cloned nucleic acid sequences that inhibit the growth of Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis. The corresponding ORFs of Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis in the database were identified. For this purpose, the NCBI BLASTN 2.0.9 computer algorithm was used. The default parameters were used except for turning off filtering. The default parameters for BLASTN and BLASTX analysis were as follows:
Expected value (e) = 10
Alignment View Options: Pairwise
Filter query sequence (DUST when using BLAATN, SEG when using others) = T
Cost to open gap (zero induces behavior) = 0
Cost to extend gap (zero induces behavior) = 0
X falling value (in bits) for gap alignment (zero induces behavior) = 0
Display of GI in differential line = F
Penalty for nucleotide mismatch (BLAST only) =-3
Reward for nucleotide match (BLAST only) = 1
Notation number per line (V) = 500
Number of alignments to display (B) = 250
Threshold for extending hits = default
Perform gap alignment (not available when using BLASTX) = T
Query genetic code to use = 1
DB genetic code (for TBLAST [nx] only) = 1
Number of processors used = 1
SeqAlign file
Query differential line confidence = F
Matrix = BLOSUM62
Word size = default
Effective length of database (uses zero for actual size) = 0
Best hits from retained area = 100
Area length used to determine hit = 20
Effective length of search space (use zero for actual size) = 0
Query chains to search against the database (for BLAST [nx] and TBLASTX), 3 both, 1 upper, 2 lower = 3
Create HTML output = F
[0321]
Alternatively, ORFs were identified and refined by surveying public and private data sources. Full-length gene proteins and nucleotide sequences for these organisms were constructed from various sources. For Pseudomonas aeruginosa, the gene sequence was adopted from the Pseudomonas genome sequencing project (download from http://www.pseudomonas.com). For Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae and Salmonella typhi, the genomic sequence from PathoSeq v4.1 (published March 2000) was compiled from GenePro Inc. 451 Bishop St., NW. ORF was re-analyzed using GeneMark v2.4a, gene discovery software purchased from Suite B, Atlanta, GA, 30318, USA.
[0322]
The antisense clone was identified as a clone whose transcription from an inducible promoter resulted in expression of RNA antisense to a complementary ORF, intergenic or intragenic sequence.
[0323]
It will be appreciated that ORFs may be specified using databases other than PathoSeq. For example, the ORF describes a method described in U.S. Provisional Patent Application No. 60 / 191,078, filed March 21, 2000, the disclosure of which is hereby incorporated by reference in its entirety. Can be identified using
[0324]
ORFs corresponding to antisense nucleic acids that inhibit the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis can be found in the attached Sequence Listing in SEQ ID NO: 3796- 3800, 3806-4860, and 5916-10012. The polypeptides encoded by the identified ORFs are shown in the accompanying sequences as SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, and 10013-14110.
[0325]
In another embodiment, the culture comprises a strain that over- or under-expresses the gene product encoded by the homologous encoding nucleic acid as defined above. In a further embodiment, the culture comprises a strain that over- or under-expresses a homologous polypeptide as defined above.
[0326]
Homologous encoding nucleic acids can be obtained as described in Example 4 below.
Embodiment 4
[0327]
Identification of homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, or homologous polypeptides
Homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, or homologous polypeptides from other pathogens (nucleic acids homologous to nucleic acids SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, SEQ ID NOs: 8-3795) (Including polypeptides homologous to the polypeptides of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778)) as described below. Can be specified.
[0328]
For example, in some embodiments, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilis influenza described herein. , Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, or Candida albicans required for growth, antisense nucleic acids and polypeptides (SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806) -4860, 5916-10012, and 14111-14944, the antisense nucleic acids of SEQ ID NOs: 8 to 3795, and SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778) are homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, or homologous nucleic acids required for growth in prokaryotes and eukaryotes. Can be used to identify a polypeptide. For example, protists, plants, such as Plasmodium species, animals, such as Entamoeba and Contracaecum species, and Candida species (eg, Candida albicans), Cryptococcus neos. Nucleic acids or polypeptides required for the growth of fungi, such as formans, and Aspergillus fumigatus can be identified. In one embodiment of the present invention, Monella, specifically bacteria including both Gram-positive and Gram-negative bacteria, is probed to identify genes required for cell growth. Similarly, homologous antisense nucleic acids can be identified.
[0329]
Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella nemozierozhaechus, Monascus -Genes and polypeptides required for growth from Aureus, Salmonella typhi, or Candida albicans (nucleic acids of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, SEQ ID NOs: 3796-3800) 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 (Including the polypeptides of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778) can be used to generate these organisms using methods such as nucleic acid hybridization and computer database analysis. It can be used to identify homologous encoding nucleic acids or polypeptides required for growth from other organisms. Similarly, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae monas Antisense nucleic acids that inhibit the growth of Staphylococcus aureus or Salmonella typhi (including the antisense nucleic acids of SEQ ID NOs: 8-3795, or sequences complementary thereto) can also be used for nucleic acid hybridization or computer database analysis. And can be used to identify homologous antisense nucleic acids.
[0330]
For example, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella nomonius e. Nucleic acid sequences from P. aureus, Salmonella typhi, or Candida albicans (SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, and antisense nucleic acids of SEQ ID NOs: 8-3795 Including Staphylococcus aureus, Salmonella Tafimariam, Klebsiella Moniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella difican, Salmonella difican or Salmonella difican And for screening genomic libraries generated from certain other bacterial or fungal species. For example, genomic libraries include Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, or Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella fragilis. Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called tolulopsis glabrata) , Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr, Candida pseudotropicalis), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium botulinum (Clostridium difficile), Clostridium perfringens, Coccidiodes immmitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterocobacter e. Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus haemophilus Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella haemolytica pastel Pneumocystis carinii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonel vongori la bongori), Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnek, Staphylococcus epidermidis), Staphylococcus pneumoniae, Streptococcus mutans (Streptococcus mutans), Treponema pallidum (Treponema pallidum), Yersinia enterocolitica, Fine Yersinia pestis (Yersinia pestis) other organisms, including, or may be any kind of biological origin that are in the category of the species in any genus including coagulase-negative species of Staphylococcus. In some embodiments, the genomic library can be from an organism other than Escherichia coli.
[0331]
Genomic libraries are created from various cells or microorganisms using standard molecular biology techniques. In one aspect, a library is created and bound to nitrocellulose paper. The library is then screened for homologous sequences using the nucleic acids of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, or SEQ ID NOs: 8-3795, or portions thereof as probes. be able to.
[0332]
For example, by screening a library, a homologous coding nucleic acid or a homologous antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, under stringent conditions At least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 of one of SEQ ID NOs: 8 to 3795 , A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a fragment comprising 400 or 500 contiguous nucleotides, a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid that is complementary to one of SEQ ID NOs: 8-3795 A nucleic acid comprising, complementary to one of SEQ ID NOs: 8-3795 under stringent conditions At least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a fragment comprising contiguous nucleotides; hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that, under stringent conditions, is at least 10, 15, 20, 25, 30 of one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Pieces, 35 pieces, 40 pieces, 50 pieces, 75 pieces, 100 pieces, 15 pieces A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a fragment comprising 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides; SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleic acid complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under stringent conditions. At least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 of the sequences complementary to one of , Or a fragment containing 500 contiguous nucleotides. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944; and At least 10, 15, 20, 25, 30, 30, 35, 40 of one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under stringent conditions A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a fragment comprising 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides may be identified.
[0333]
Also, the library is screened to obtain a homologous coding nucleic acid or a homologous antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence that hybridizes under moderate conditions to a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, under moderate conditions. At least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300 of one of SEQ ID NOs: 8 to 3795 , A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a fragment comprising 400 or 500 contiguous nucleotides, a nucleotide sequence that hybridizes under moderate conditions to a nucleic acid complementary to one of SEQ ID NOs: 8-3795 A nucleic acid comprising at least 10, 15, 20 of the sequences complementary to one of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions Contains nucleotide sequences that hybridize to fragments containing 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under moderate conditions to a nucleic acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, under moderate conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75 of one of 14111-14944 , 100, 150, 200, 300, 400, or 500 consecutive nuclei A nucleic acid comprising a nucleic acid sequence that hybridizes to a fragment comprising a tide, which hybridizes under moderate conditions to a nucleic acid complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence to soy, and at least 10, 15 of the sequences complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under moderate conditions Hybridizes to a fragment containing 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides A nucleic acid comprising a nucleotide sequence may be specified.
[0334]
Subsequently, the homologous coding nucleic acid, homologous antisense nucleic acid or homologous polypeptide identified above can be used in the methods described herein. In some embodiments, homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, or homologous polypeptides can be used to identify genes required for the growth of multiple microorganisms. Such genes are important targets for a wide range of antibiotics that are effective against multiple microorganisms.
[0335]
For example, using the method described above, one of the sequences of SEQ ID NOs: 8 to 3795, at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 of those sequences , A fragment comprising 75, 100, 150, 200, 300, 400 or 500 contiguous nucleotides, and a sequence complementary thereto. , At least 97%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, or at least 70% homologous coding or antisense nucleic acids comprising nucleotide sequences having nucleotide sequence homology. . Also, using the method described above, one of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, at least 10, 15, 20, 25 of them A fragment comprising 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides and a sequence complementary thereto A homologous encoding nucleic acid or homology comprising a nucleotide sequence having at least 97%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, or at least 70% nucleotide sequence homology to a nucleotide sequence selected from the group Antisense nucleic acids can be isolated. In some embodiments, using the methods described above, one of the sequences of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, at least 10, 15, 20, , 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400 or 500 contiguous nucleotides and fragments complementary thereto A nucleotide sequence having at least 97%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, or at least 70% nucleotide sequence homology to a nucleic acid sequence selected from the group consisting of Encoding nucleic acids or homologous antisense nucleic acids can be isolated. Homology may be measured using BLASTN version 2.0 with default parameters (Altschul, SF et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389- 3402 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety). For example, a homologous polynucleotide may include a coding sequence that is a naturally occurring allelic variant of one of the coding sequences described herein. Such allelic variants have one nucleotide when compared to the nucleic acids of SEQ ID NOs: 8-3795, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, or nucleotide sequences complementary thereto. Or may have multiple nucleotide substitutions, nucleotide deletions or nucleotide additions.
[0336]
In addition, using the above procedure, the sequence of one of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778, as determined using the FASTA version 3.0t78 algorithm with default parameters. Or a nucleic acid of one of SEQ ID NOs: 8 to 3795, or at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, At least 99%, 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, for a polypeptide whose expression is inhibited by a fragment comprising 75, 100, or 150 contiguous amino acids; At least 60%, at least 50%, at least 40%, or less Homologous encoding nucleic acid encoding a polypeptide having 25% amino acid sequence homology or similarity Kutomo be isolated. Alternatively, protein homology or similarity can be identified using BLASTP with default parameters, BLASTX with default parameters, or TBLASTN with default parameters (Altschul, SF et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402 (1997), the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety).
[0337]
Alternatively, a homologous coding nucleic acid, homologous antisense nucleic acid, or homologous polypeptide is a sequence having a desired level of nucleotide or amino acid sequence homology to a nucleic acid or polypeptide involved in growth, or an antisense nucleic acid to a nucleic acid involved in microbial growth. Can be identified by searching a database for identifying A variety of such databases are available to one of skill in the art, including GenBank and GenSeq. In some embodiments, screening of a database results in a nucleic acid required for proliferation, an antisense nucleic acid that inhibits proliferation, or a portion of a nucleic acid that is required for proliferation, or an antisense nucleic acid that inhibits proliferation. Identify nucleic acids having at least 97%, at least 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, or at least 70% nucleotide sequence identity to a portion of the sequence. For example, a homologous coding sequence is a nucleic acid homologous to one of SEQ ID NOs: 8-3795, at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 of those sequences. , Nucleic acids homologous to fragments comprising 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and A nucleic acid homologous to one of 14111-14944, at least 10, 15, 20, 25, of one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944; 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 runs A nucleic acid homologous to a fragment comprising nucleotides, a nucleic acid homologous to one of SEQ ID NOs: 8 to 3795, at least 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, Nucleic acids homologous to fragments containing 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, or 500 contiguous nucleotides, or homologous to sequences complementary to any of the above nucleic acids It can be identified by using a database for identifying specific nucleic acids. In other embodiments, screening the database provides at least 99%, 95%, at least 90%, at least 85%, at least 80%, at least 70%, Polypeptides having at least 60%, at least 50%, at least 40%, or at least 25% amino acid sequence homology or similarity are identified. For example, by screening a database, a polypeptide homologous to a polypeptide comprising one of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778; A polypeptide whose expression is inhibited by one nucleic acid of the above, or at least 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, Polypeptides homologous to fragments containing 100 or 150 contiguous amino acids can be identified. In some embodiments, screening a database yields a homologous coding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a homologous polypeptide, resulting in Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus. Homologous nucleic acids, homology from cells or microorganisms other than sp. Antisense nucleic acids or homologous polypeptides can be identified. For example, by screening a database, homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, or anaplasma marginale (Anaplasma marginale), Aspergillus fumigatus (Aspergillus fumigatus), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacteroides fragilis (Bacteroides fragilis) , Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (Tollopsis glabrata lapula sis glabrata) Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei Candida kefyr (also called Candida pseudotropicalis), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatum, Chlamydia trachomatum (Clostridium botulinum), Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immmitis, Corynebacterium diptheria, Cryptococcus neoformans Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli richia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Plasmodium bacterium Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis (Noissia meningitidis), Nocardia asteroides (Nocardia asteroides), Pasteurella haemolytica lytica pasta Pasteurella multocida), Pneumocystis carinii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmo Salmonella bongori, Salmonella cholerasis, Salmonella enterica, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhi, Salmonella typhi mona Staphylococcus aureus, Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella flexneri, Shigella flexneri Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica (Ye) (rsinia enterocolitica), and microorganisms such as Yersinia pestis, or homologous polypeptides from any species of organism within the genus of any of the above species, including coagulase-negative staphylococci. obtain. In some embodiments, the homologous encoding nucleic acid, homologous antisense nucleic acid, or homologous polypeptide is from an organism other than Escherichia coli.
[0338]
In another embodiment, nucleic acid arrays and microarrays can be used to identify homologous encoding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids or nucleic acids encoding homologous polypeptides. A nucleic acid array is a high-density array of DNA samples deposited at specific locations on a glass chip, nylon membrane, or the like. This technique is found, for example, in US Pat. No. 5,807,522, which is incorporated herein by reference. In such embodiments, an array comprising nucleic acids from an organism in which one wishes to identify a homologous encoding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide is homologated under conditions where the probe can specifically hybridize to the homolog. The body is contacted with a detectable probe containing the nucleic acid or a portion thereof that one wishes to identify. For example, the array can consist of a 12 × 24 cm nylon filter containing PCR products corresponding to ORFs from the organism for which homologous nucleic acids are to be identified. For example, a homologous encoding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide, Anaplasma marginale (Anaplasma marginale), Aspergillus fumigatus (Aspergillus fumigatus), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacteroides fragilis (Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (torropsis) glabrata), Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida krusei・ Kefia (Candida kefyr) (also called Candida pseudotropicalis), Candida dubliniensis (Candida dubliniensis), Chlamydia pneumoniae (Chlamydia pneumoniae), Chlamydia trachomatum Clostridium botulinum), Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immmitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neop.・ Black fly (Enterobacter cloacae), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli , Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, mycoplasma, Mycoplasma , Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella haemolytica , Pneumocystis carinii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bo Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica, Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhi, Salmonella typhia murium phiumalium murium Aureus (Staphylococcus aureus), Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella flexneri Epidermidis (Staphylococcus epidermidis), Staphylococcus pneumoniae, Streptococcus mutans (Streptococcus mutans), Treponema pallidum (Treponema pallidum), Yersinia enterocolitica (Yersinia enter) ocolitica) and Yersinia pestis, or in any species within the genus of any of the above species, including coagulase-negative staphylococci.
[0339]
Alternatively, a homologous coding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide can be isolated from a heterologous cell using Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli. , Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, or a nucleotide sequence complementary to a part necessary for growth derived from Salmonella typhi sp. Transcribe the antisense nucleic acid and determine if the antisense nucleic acid inhibits cell or microbial growth. It is possible.
[0340]
Alternatively, a homologous coding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide can be replaced with a nucleic acid encoding SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 in a microorganism in which the homologous antisense nucleic acid has been identified. An antisense nucleic acid homologous to a nucleotide sequence complementary to one of them, an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence homologous to one of SEQ ID NOs: 8 to 3795, or a portion of any of the above nucleic acids A homologous antisense nucleic acid, such as an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence complementary to a nucleic acid, can be transcribed and identified by determining whether the growth of a microorganism is inhibited as described above.
[0341]
In another embodiment, a homologous encoding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide is converted to nucleotides required for growth to generate degenerate primers for use in the polymerase chain reaction (PCR). It can be identified by using the conserved part of the sequence. PCR techniques are known in the art. Successful production of a PCR product using a degenerate probe generated from the nucleotide sequences identified herein indicates the presence of a homologous gene sequence in the species being screened. Subsequently, this homologous gene is used in the present invention.
[0342]
Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella nemozierozhaechus, Monascus A nucleic acid homologous to a gene required for the growth of Aureus, Salmonella typhi, or Candida albicans, or a sequence complementary thereto, may be Staphylococcus aureus, Salmonella taffymariam, as described below. , Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia , Enterococcus faecalis, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, or homologous coding nucleic acid, homologous polypeptide from a cell other than Candida albicans Or a homologous antisense nucleic acid. For example, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella nomonius e. Nucleic acids homologous to genes required for growth from F. aureus, Salmonella typhi, or Candida albicans, or to sequences complementary thereto, may be Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus. , Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella pertus (Bordetella pertussis), Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called Torulopsis gla) Candida tropicalis; Candida parapsilosis; Candida guilliermondii; Candida krusei; Candida kefyr; ), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium botulinum Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus neoformans , Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma scapula astoplasma・ Pneumoniae (Klebsiella pneumoniae), Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes), Mycobacterium leprae (Mycobacterium leprae), Mycobacterium Um tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Ursultocula, Pasteurella haemolytica, Pasteurella haemolytica Pneumocystis carinii, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasu, Salmonella cholerasual, Salmonella cholerasual・ Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Moxalera Catarrhalis (Moxarella catarrhalis), Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermycus, epidermidis Coccus pneumoniae (Streptococcus pneumoniae), Streptococcus mutans (Streptococcus mutans), Treponema pallidum (Treponema pallidum), Yersinia enterocolitica (Yersinia enterocolitica), and any of the above Yersinia pestis, Yersinia pestis It can be used to identify a homologous coding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide in any species within the genus. In some embodiments of the invention, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella, A nucleic acid homologous to a sequence required for growth from Pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, or Salmonella typhi or a sequence complementary thereto (homologous to one of SEQ ID NOs: 8 to 3795) (Including nucleic acids) are used to identify sequences required for growth in organisms other than Escherichia coli.
[0343]
In another embodiment of the invention, the homologous encoding nucleic acid, homologous antisense nucleic acid, or nucleic acid encoding the homologous polypeptide is an antisense complementary to a sequence identified as required for growth, or a portion thereof. Nucleic acid (nucleotide sequence complementary to one of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 1411-14944, or a portion of those sequences, such as the nucleic acids of SEQ ID NOs: 8-3795) (Including an antisense nucleic acid comprising) is transferred to a vector capable of functioning in a species other than the species from which the sequence was obtained. For example, vectors include Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, Burgetella pertussis, and Bordetella pertussis. (Burkholderia cepacia), Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called Torulopsis glabrata), Candida tropicalis and Candida tropicalis・ Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr (Candida pseudotropicalis (Candida pseudotropicalis) ), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile (Clostridium perfringens), Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae, Enterococcus ocococ Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori (Helicobacter pylori), Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis) Gonahoeae (Neisseria gonorrhoeae), Neisseria meningitidis (Neisseria meningitidis), Nocardia asteroides (Nocardia asteroides), Pasteurella haemolytica (Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocida (Pasteurella multocida)・ Bulgaris (Proteus vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella Enterica (Salmonella enterica), Salmonella paratyphi (Salmonella paratyphi), Salmonella typhi (Salmonella typhi), Salmonella typhimurium (Salmonella typhimurium), Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Moxalella oxarellax -Voidy (Shigella boydii), Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus pneum. , Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis, or as described above. May be functional in any species within the category within any of the genera. In some embodiments of the present invention, the vector may be functional in a microorganism other than Escherichia coli. As will be appreciated by those skilled in the art, vectors may contain certain species-specific elements. These elements include a promoter sequence, operator sequence, repressor gene, origin of replication, ribosome binding sequence, termination sequence, and the like. In order to use antisense nucleic acids, one of skill in the art would isolate vectors containing predetermined sequences from cultured bacterial cells, isolate and purify these sequences, and screen these sequences for the bacteria to be screened. It is understood that standard molecular biology techniques for subcloning into a vector adapted for use in the species will be used.
[0344]
Vectors for various other species are known in the art. For example, many vectors that function in Escherichia coli are known in the art. Also, Pla et al. Report expression vectors that function in a number of related hosts, including Salmonella tafimariam, Pseudomonas putida, and Pseudomonas aeruginosa (J. Bacteriol. 172 (8): 4448-55 (1990 )). Brunschwig and Darzins (Gene (1992) 111: 35-4, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety) described a shuttle expression vector for Pseudomonas aeruginosa. Similarly, there are many examples of expression vectors that are freely transferable across various Gram-positive microorganisms. Expression vectors for Enterococcus faecalis can be engineered by incorporating an appropriate promoter into the pAK80 backbone (Israelsen, H., SM Madsen, A. Vrang, EB Hansen and E. Johansen. 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2540-2547, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety).
[0345]
Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella nemozierozhaechus, Monascus An antisense nucleic acid complementary to a sequence required for growth from Aureus, Salmonella typhi, or Candida albicans, or a portion thereof, is provided in a predetermined second cell or microorganism (ie, the specified nucleic acid is obtained). After subcloning into a vector that is functional in a cell or microorganism other than the isolated cell or microorganism), to test for bacterial growth inhibition, Transferring the antisense nucleic conditionally. Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis, which, when transcribed, inhibit the growth of second cells or microorganisms. The nucleotide sequence of the nucleic acid from influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, or Candida albicans is compared to the known genomic sequence of a second cell or microorganism to identify homologous genes from the second organism. If the homologous sequence from the second cell or microorganism is not known, the homologous sequence may be, as described above, the required Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, required for growth. PCR primers based on hybridization to Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, or Candida albicans sequences, or based on nucleotide sequences required for predetermined growth May be identified and isolated by amplification with In this way, sequences that may be required for growth of a second cell or microorganism can be identified. For example, the second microorganism is Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, Bordetella pertussis. Buriaholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called Torulopsis glabrata), Candida tropicalis ), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr, Candida pseudotropicalis icalis), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacaesoc, Enterobacter cloacaesoc , Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori Lori (Helicobacter pylori), Histoplasma capsulatum (Histoplasma capsulatum), Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae), Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes), Mycobacterium leprae (Mycobacterium leprae), Mycobacterium bacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae (Neisseria gonorrhoeae), Neisseria meningitidis (Neisseria meningitidis), Nocardia asteroides (Nocardia asteroides), Pasteurella haemolytica (Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocsii (Pasteurella multocus), New Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, monkey Salmonella enterica; Salmonella paratyphi; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus; Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, staphylocea ), Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis Can be any species within the genus of any of the above species. In some embodiments of the present invention, the second microorganism is an organism other than Escherichia coli.
[0346]
Next, the homologous nucleic acid sequence from the second cell or microorganism identified as described above is operably linked to a promoter, such as an inducible promoter, in the antisense orientation and introduced into the second cell or microorganism. Can be done. Thus, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae required for growth , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, or identified nucleotides from a second cell or microorganism using the techniques described herein for identifying Candida albicans genes. One can determine whether the sequence inhibits the growth of a second cell or microorganism. For example, the second microorganism is Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, Bordetella pertussis. Buriaholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called Torulopsis glabrata), Candida tropicalis ), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr, Candida pseudotropicalis icalis), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacaesoc, Enterobacter cloacaesoc , Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori Lori (Helicobacter pylori), Histoplasma capsulatum (Histoplasma capsulatum), Klebsiella pneumoniae (Klebsiella pneumoniae), Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes), Mycobacterium leprae (Mycobacterium leprae), Mycobacterium bacterium tuberculosis Neisseria gonorrhoeae (Neisseria gonorrhoeae), Neisseria meningitidis (Neisseria meningitidis), Nocardia asteroides (Nocardia asteroides), Pasteurella haemolytica (Pasteurella haemolytica), Pasteurella multocsii (Pasteurella multocus), New Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, monkey Salmonella enterica; Salmonella paratyphi; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus; Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, staphylocea ), Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis Can be any species within the genus of any of the above species. In some embodiments of the present invention, the second microorganism can be an organism other than Escherichia coli.
[0347]
Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi or Candida microorganism Antisense nucleic acids required for the growth of, or genes corresponding thereto, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Salmonella te , Or microarrays containing the Candida albicans ORFs (including the nucleic acids of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944), and Staphylococcus aureus, Salmonella. Tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, or Candida albicans sequences and growth from other cells or microorganisms The homology with the required nucleic acid may be determined. For example, nucleic acids that require propagation are Anaplasma marginale, Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis fragiles -Pertasis (Bordetella pertussis), Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called torropsis glabrata) ), Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefia r) (also called Candida pseudotropicalis), Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum botulinum Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Neoformans bacterium, Cryptocococcus neoformans cloacae), Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis inn Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae Um tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Ursultocula, Pasteurella haemolytica, Pasteurella haemolytica Ptismocarinii (Pneumocystis carinii), Proteus vulgaris (Proteus vulgaris), Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa), Salmonella bongori (Salmonella bongori) Salmonella cholerasis (Salmonella cholerasuis), Salmonella enterica (Salmonella enterica), Salmonella paratyphi (Salmonella paratyphi), Salmonella typhi (Salmonella typhi), Salmonella taphimaria (Salmonella typhimurus), stafioccus austaoccus Moxarella catarrhalis, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermis Staphylococcus pneumoniae, Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Elle Or it is derived from the near pestis (Yersinia pestis), or may be derived from any species in the category of the any genus of the species. In some embodiments, Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Salmonella phylloris. Alternatively, a nucleotide sequence required for growth from Candida albicans, or a homologous nucleic acid, is used to identify a sequence required for growth of an organism other than Escherichia coli. In some embodiments of the present invention, the sequence required for growth may be a sequence from a microorganism other than Escherichia coli. Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, or Candida albicans Alternatively, nucleic acids required for growth from a microorganism may be hybridized to the array under various conditions under which hybridization can occur if the probe has various levels of homology to the nucleotide sequence on the microarray. . This provides an indication of homology between cells or microorganisms, as well as clues to other possible essential genes in these cells or microorganisms.
Embodiment 5
[0348]
Identification of nucleic acid homology to nucleic acids required for propagation of Escherichia coli in other bacterial species
A homologous coding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide can be specified as follows. The ability of the antisense molecule identified in the first organism to inhibit the growth of the second organism (whereby the gene in the second organism that is homologous to the gene from the first organism will (Required for the growth of two organisms) was demonstrated by using some of the antisense nucleic acids that inhibit the growth of Escherichia coli. An expression vector that inhibits the growth of Escherichia coli when inducing antisense RNA expression using IPTG was directly transformed into Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, or Salmonella tafimariam. The transformed cells were then assayed for growth inhibition according to the method described above. After growth in liquid medium, the cells are plated at various serial dilutions, with respect to "induced versus uninduced" antisense RNA expression as determined by dilutions up to 10 times the observed dilution. The score was determined by calculating the log difference in growth. The results of these experiments are shown in Table I below. Clones are shown as negative (-) in Table I if no effect of antisense RNA expression is observed in the microorganism. In contrast, the plus (+) in Table I indicates that under the conditions used, the colonies on the induction plate were more than the number of cells required to observe the colonies on the non-induction plate in that microorganism. It means that the number of cells needed to observe is at least more than 10-fold.
[0349]
Table I
Susceptibility of other microorganisms to antisense nucleic acids that inhibit the growth of Escherichia coli
Molecular number S. typhimurium E. cloacae K. pneumoniae
EcXA001 + +-
EcXA004 +--
EcXA005 + + +
EcXA006---
EcXA007-+-
EcXA008 +-+
EcXA009---
EcXA010 + + +
EcXA011-+-
EcXA012-+-
EcXA013 + + +
EcXA014 + +-
EcXA015 + + +
EcXA016 + + +
EcXA017 + + +
EcXA018 + + +
EcXA019 + + +
EcXA020 + + +
EcXA021 + + +
EcXA023 + + +
EcXA024 +-+
EcXA025---
EcXA026 + +-
EcXA027 + +-
EcXA028 +--
EcXA029---
EcXA030 + + +
EcXA031 +--
EcXA032 + +-
EcXA033 + + +
EcXA034 + + +
EcXA035---
EcXA036 +-+
EcXA037 + +-
EcXA038 + + +
EcXA039 +--
EcXA041 + + +
EcXA042-+ +
EcXA043---
EcXA044---
EcXA045 + + +
EcXA046---
EcXA047 + +-
EcXA048---
EcXA049 +--
EcXA050---
EcXA051 +--
EcXA052 +--
EcXA053 + + +
EcXA054--+
EcXA055 +--
EcXA056 +-+
EcXA057 + +-
EcXA058---
EcXA059 + + +
EcXA060---
EcXA061---
EcXA062---
EcXA063 + +-
EcXA064---
EcXA065 + +-
EcXA066---
EcXA067-+-
EcXA068---
EcXA069-+-
EcXA070---
EcXA071 +--
EcXA072 +-+
EcXA073 + + +
EcXA074 + + +
EcXA075 +--
EcXA076-+-
EcXA077 + +-
EcXA079 + + +
EcXA080 +--
EcXA082-+-
EcXA083---
EcXA084-+-
EcXA086---
EcXA087---
EcXA088---
EcXA089---
EcXA090---
EcXA091---
EcXA092---
EcXA093---
EcXA094 + + +
EcXA095 + +-
EcXA096---
EcXA097 +--
EcXA098 +--
EcXA099---
EcXA100---
EcXA101---
EcXA102---
EcXA103-+-
EcXA104 + + +
EcXA106 + +-
EcXA107---
EcXA108---
EcXA109---
EcXA110 + +-
EcXA111---
EcXA112-+-
EcXA113 + + +
EcXA114-+-
EcXA115-+-
EcXA116 + +-
EcXA117 +--
EcXA118---
EcXA119 + +-
EcXA120---
EcXA121---
EcXA122 +-+
EcXA123 +--
EcXA124---
EcXA125---
EcXA126---
EcXA127 + +-
EcXA128---
EcXA129-+-
EcXA130 + +-
EcXA132---
EcXA133---
EcXA136---
EcXA137---
EcXA138 +--
EcXA139---
EcXA140 +--
EcXA141 +--
EcXA142---
EcXA143-+-
EcXA144 + +-
EcXA145---
EcXA146---
EcXA147---
EcXA148---
EcXA149 + + +
EcXA150---
EcXA151 +--
EcXA152---
EcXA153 + +-
EcXA154---
EcXA155--ND
EcXA156-+-
EcXA157---
EcXA158---
EcXA159 +--
EcXA160 +--
EcXA162---
EcXA163---
EcXA164---
EcXA165---
EcXA166---
EcXA167---
EcXA168---
EcXA169-+-
EcXA171---
EcXA172---
EcXA173---
EcXA174---
EcXA175---
EcXA176---
EcXA178---
EcXA179---
EcXA180 +--
EcXA181---
EcXA182---
EcXA183---
EcXA184---
EcXA185---
EcXA186---
EcXA187 + + +
EcXA189 +--
EcXA190 + + +
EcXA191 + +-
EcXA192-+-
[0350]
Accordingly, a homologous encoding nucleic acid, a homologous antisense nucleic acid, or a nucleic acid encoding a homologous polypeptide can be obtained from Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus sp. E. faecalis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, or an antisense nucleic acid that inhibits the growth of Candida albicans can be identified by measuring the ability to inhibit the growth of other organisms. This can be assessed by directly transforming the antisense nucleic acid into a species other than the organism from which the antisense nucleic acid was obtained. In particular, Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroides fragilis, Bordetella pertussis, ciapa de cepapa ), Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also called Torulopsis glabrata), Candida tropicalis, Candida tropicalis, Candida tropicalis Also called Candida parapsilosis, Candida guilliermondii, Candida krusei, Candida kefyr (Candida pseudotropicalis) , Candida dubliniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile (Clostridium difficile) , Coccidiodes immitis, Corynebacterium diptheriae, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecalis Enterococcus faecium), Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori , Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis gonorrhoeae), Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, No. Proteus vulgaris), Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongori, Salmonella cholerasuis, Salmonella enterica ( Salmonella enterica), Salmonella paratyphi, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Moxalella cathaleris arox Shigella boydii), Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus pneumoniae ococne pneumoniae Mutans (Streptococcus mutans), Treponema pallidum (Treponema pallidum), Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis, or a category within any genus of any of the above species The ability of an antisense nucleic acid to inhibit the growth of any species of E. coli can be assessed. In some embodiments of the invention, the ability of antisense nucleic acids to inhibit the growth of organisms other than Escherichia coli may be evaluated. In some embodiments, the antisense nucleic acid is inserted into an expression vector that is functional in the organism in which the antisense nucleic acid is being evaluated.
[0351]
The above methods for assessing the ability of antisense nucleic acids to inhibit the growth of heterologous organisms are described in Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis An antisense nucleic acid (such as the antisense nucleic acids of SEQ ID NOs: 8 to 3795, complementary to any of the nucleic acids required for growth from Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, or Candida albicans. 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944) or a portion thereof, an antisense nucleic acid complementary to a homologous encoding nucleic acid. Nsu nucleic acid or a portion thereof, or it will be appreciated that the phase can be performed using the same anti-sense nucleic acid.
[0352]
One of skill in the art will appreciate that a negative result in a heterologous cell or microorganism does not mean that the cell or microorganism lacks the gene, and that a negative result does not mean that the gene is not essential. Will understand. However, a positive result means that the heterologous cell or microorganism contains a homologous gene required for growth of the cell or microorganism. Homologous genes can be obtained using the methods described herein. For example, a homologous gene is isolated by performing a PCR procedure using primers based on an antisense sequence that reduces the level or activity of the gene product encoded by the homologous gene, or by performing a Southern blot. obtain.
[0353]
One skilled in the art will appreciate that antisense molecules that operate in the microorganism from which the antisense nucleic acid was derived do not necessarily operate in heterologous cells or microorganisms.
Embodiment 6
[0354]
Identification of nucleic acids homologous to nucleic acids required for growth of Staphylococcus aureus in other bacterial species
Nucleic acids homologous to the nucleic acids required for growth from Staphylococcus aureus were identified as follows. 39 antisense nucleic acids that inhibit the growth of Staphylococcus aureus were inserted into an expression vector and expression was under the control of a xylose-inducible Xyl-T5 promoter. Using a vector with green fluorescent protein (GFP) under the control of the Xyl-T5 promoter, expression from the Xyl-T5 promoter in S. epidermidis was shown to be comparable to expression in Staphylococcus aureus.
[0355]
The vector was introduced into Staphylococcus epidermidis by electroporation as follows: Staphylococcus epidermidis was grown to mid-log phase in liquid medium and collected by centrifugation. The cell pellet is diluted with 1/3 culture volume of ice-cold EP buffer (0.625 M sucrose, 1 mM MgCl 2). Two , PH = 4.0) and collected again by centrifugation. The cell pellet was then resuspended using 1/40 volume of EP buffer and allowed to incubate on ice for 1 hour. Subsequently, cells were frozen at -80 ° C for storage. For electroporation, 50 μl of thawed electrocompetent cells were combined with 0.5 μg of plasmid DNA, and then subjected to an electric pulse of 10 kV / cm, 26 μFarad, 200 ohm using a biorad Gene Pulser electroporation apparatus. did. Cells were immediately resuspended in 200 μl of explant medium and incubated for 2 hours before plating on solid growth medium with selection agents to maintain the plasmid vector. Colonies resulting from overnight growth of these platings were selected and cultured in liquid medium with the selection agent, followed by dilution plating analysis as described above for Staphylococcus aureus to identify the inducer xylose. The growth sensitivity in the presence was tested.
[0356]
The results are shown in Table II below. The first column shows the molecular number of the antisense nucleic acid of Staphylococcus aureus introduced into S. epidermidis. The second column indicates whether the antisense nucleic acid inhibited the growth of Staphylococcus epidermidis, with a "+" indicating that growth was inhibited. Of the 39 antisense nucleic acids of Staphylococcus aureus evaluated, 20 inhibited the growth of Staphylococcus epidermidis.
[0357]
Table II
Susceptibility of other microorganisms to antisense nucleic acids that inhibit the growth of Staphylococcus aureas
Molecular number S. epidermid
SaXA005 +
SaXA007 +
SaXA008 +
SaXA009 +
SaXA010 +
SaXA011-
SaXA012-
SaXA013-
SaXA015 +
SaXA017-
SaXA022 +
SaXA023-
SaXA024-
SaXA025 +
SaXA026 +
SaXA027-
SaXA027b-
SaXA02c-
SaXA028-
SaXA029 +
SaXA030 +
SaXA032 +
SaXA033 +
SaXA034-
SaXA035 +
SaXA037 +
SaXA039-
SaXA042-
SaXA043-
SaXA044-
SaXA045 +
SaXA051 +
SaXA053-
SaXA056b-
SaXA059a +
SaXA060-
SaXA061 +
SaXA062 +
SaXA063-
SaXA065-
[0358]
Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi or Candida bifi from Candida An antisense nucleic acid that is complementary to any of the nucleic acids required for SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, such as the antisense nucleic acids of SEQ ID NOs: 8-3795. Or a part thereof, an antisense nucleic acid or a part thereof complementary to a homologous coding nucleic acid, or a homologous gene using a homologous antisense nucleic acid. The above-described method to identify.
[0359]
Homologous nucleic acids can also be identified using complementation analysis.
Embodiment 7
[0360]
Identification of homologous nucleic acids by functional complementation
Homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, and nucleic acids encoding homologous polypeptides can be specified as follows. Staphylococcus aureus, Salmonella tafimariam, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, and Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Hemophilis influenza, Helicobacter pylori, Salmonella typhi or Candida bifi from Candida The gene product required for or a gene product whose activity can be complemented by a homologous polypeptide is obtained by introducing a plasmid or a bacterial artificial chromosome into an organism having a mutation in an essential gene that reduces or eliminates the activity of the gene product. Identified using the partial diploid created. In some embodiments, the mutation may be a conditional mutation, such as a temperature-sensitive mutation, such that the organism grows under permissive conditions, but is due to a plasmid or a gene on a bacterial artificial chromosome. It is impossible to grow under non-permissive conditions without complementation. Alternatively, Roth et al. (1987) Biosynthesis of Aromatic Amino Acids in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, FC Neidhardt, ed., American Society for Microbiology, Publisher, pp. 2269-2270 (the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety. Replicas may be constructed as described in US Pat. Such methods are well-known to those skilled in the art. Alternatively, the homologous coding nucleic acid, the homologous antisense nucleic acid, and the nucleic acid encoding the homologous polypeptide are at least a part of a gene required for growth or a gene required for growth under the control of a regulatory promoter as described above. Introducing a plasmid or a bacterial artificial chromosome into a cell, with a nucleic acid complementary to the above, to identify cells capable of growing under conditions that prevent or reduce growth in the absence of the plasmid or bacterial artificial chromosome Can be specified by
[0361]
Homologous coding nucleic acids, homologous antisense nucleic acids, and nucleic acids encoding homologous polypeptides can be identified using databases as follows.
Embodiment 8
[0362]
Identification of homologous nucleic acids by database analysis
Nine prokaryotes were analyzed and compared in detail to demonstrate that database methodology can be used to find homology to essential genes. First, the most reliable sources of gene sequences for each organism were assessed by conducting a survey of public and private data sources. The nine organisms studied were Escherichia coli, Haemophilus influenza, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae, and Salmonella typhi. The full-length gene proteins and nucleotide sequences of these organisms were constructed from various sources. For Escherichia coli, Haemophilus influenzae, and Helicobacter pylori, gene sequences were adopted from public sequencing projects and obtained from the GenPept 115 database (available from NCBI). For Pseudomonas aeruginosa, the gene sequence was adopted from the Pseudomonas genome sequencing project (download from http://www.pseudomonas.com). For Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus pneumoniae, and Salmonella typhi, the genomic sequence from PathoSeq v4.1 (published March 2000) was compiled from GenePro Inc. 451 Bishop St., NW. ORFs were re-analyzed using GeneMark v2.4a, gene discovery software purchased from Suite B, Atlanta, GA, 30318, USA.
[0363]
Subsequently, the essential genes found by antisense methodology were compared with the given proteome to find all homologous genes to the given gene. This comparison was performed using the FASTA program v3.3. A gene was considered to be homologous if it was more than 25% identical and the alignment between the two genes covered more than 70% of the length of one gene. The best homologs for each of the nine organisms, defined as the most significant scoring matches meeting the above criteria, are shown in Table III. Table III shows the best ORFs identified above (column labeled LOCUS ID), SEQ ID NOs, identities, and queries for the genes identified in each of the nine organisms evaluated as described above. List the amount (range) of protein that aligns well with the sequence.
[0364]
Table IV shows the PathoSeq cluster ID of the genes identified as required for growth in Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and Staphylococcus aureus using the methods described herein. Are listed. These sequences have homology to each other when indicated in the column labeled with the same PathoSeq cluster ID, and thus fall into the same PathoSeq cluster. Thus, the methods described herein have identified genes that are required for growth in some species that share homology.
[0365]
[Table 1]
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[0366]
Table IV
PathoSeq Enterococcus Escherichia Pseudomonas Staphylococcus
Cluster faecalis coli aeruginosa aureus
ID
15 EFA102326 ECO101796 PAE100280 SAU102515
55 EFA100151 ECO104157 PAE100416 SAU100633
57 EFA100617 ECO102690 PAE105434 SAU100158
1443 EFA100689 ECO103692 PAE101987 SAU100952
1861 EFA101412 ECO103231 PAE104331 SAU101793
2286 EFA103268 ECO103265 PAE104314 SAU101756
2362 EFA101425 ECO100662 PAE101537 SAU101236
2367 EFA101417 ECO103226 PAE103206 SAU101798
2549 EFA101410 ECO103233 PAE104329 SAU101791
3816 EFA101159 ECO103243 PAE104319 SAU100546
3857 EFA101415 ECO103228 PAE103204 SAU101796
4322 EFA101165 ECO103237 PAE104325 SAU100141
4569 EFA100955 ECO103217 PAE103215 SAU101808
4948 EFA101160 ECO103242 PAE104320 SAU100547
5818 EFA100742 ECO103224 PAE103208 SAU101800
8159 EFA101163 ECO103239 PAE104323 SAU100139
8296 EFA101164 ECO103238 PAE104324 SAU100140
8316 EFA101409 ECO103234 PAE104328 SAU101790
8494 EFA103062 ECO103884 PAE104311 SAU100433
8498 EFA101411 ECO103232 PAE104330 SAU101792
8499 EFA101416 ECO103227 PAE103205 SAU101797
7 ECO100071 PAE100837 SAU102674
8 EFA101340 PAE106580 SAU100118
28 EFA101403 PAE102647 SAU100514
41 EFA101753 ECO100148 SAU101565
63 EFA101685 PAE103857 SAU100331
147 ECO100645 PAE100543 SAU100053
548 ECO100377 PAE100604 SAU100747
730 ECO103592 PAE103108 SAU100061
1721 EFA101686 ECO100663 SAU101996
1749 EFA101477 ECO102557 SAU100613
2153 EFA102656 ECO100184 SAU101869
2790 EFA102764 ECO100500 SAU101578
3164 EFA101162 ECO103240 SAU102602
3312 EFA103174 PAE105008 SAU100521
3926 EFA100194 ECO103220 SAU101806
4441 EFA102541 PAE105364 SAU101814
5685 EFA100190 ECO103264 SAU100157
7417 EFA102788 ECO101684 SAU102992
7437 EFA102351 ECO100084 SAU100056
7579 ECO102470 PAE102641 SAU100607
7726 EFA102551 ECO103221 SAU101805
7727 EFA100978 ECO103218 SAU101807
8092 ECO102035 PAE102964 SAU100794
8158 EFA103365 PAE104318 SAU102880
8161 EFA100210 PAE104326 SAU102527
8162 EFA101414 PAE103203 SAU101795
8164 EFA100741 ECO103223 SAU101801
8493 EFA101141 PAE104310 SAU100432
10185 EFA102728 ECO104092 SAU102578
35 ECO102870 SAU100497
44 PAE101061 SAU101143
54 PAE100225 SAU100123
85 ECO101104 SAU101262
184 PAE104901 SAU101366
362 EFA102736 SAU100414
575 EFA101790 SAU100133
579 EFA102110 SAU101624
911 PAE105432 SAU102054
941 ECO101365 SAU102162
952 EFA100615 SAU100964
1084 EFA100289 ECO102819
1141 ECO102255 SAU102356
1232 ECO100703 SAU101346
1274 PAE103655 SAU102264
1337 ECO102562 SAU100567
1350 ECO100930 PAE103901
1374 ECO103659 SAU101385
1427 EFA100394 SAU100714
1535 ECO101207 SAU101561
1653 EFA102655 SAU101868
1849 EFA100642 SAU101653
1932 EFA100919 SAU101365
2156 EFA101150 SAU101271
2189 ECO102827 PAE100476
2238 ECO101436 SAU101092
2338 EFA103038 SAU100518
2411 EFA102802 SAU102246
2501 EFA101121 SAU100996
2974 PAE102537 SAU102125
3027 ECO103959 SAU200242
3239 EFA103021 SAU100300
3244 EFA100399 SAU101891
3386 EFA100426 SAU100886
3447 EFA102915 SAU102112
3460 EFA102023 SAU101399
3682 EFA100740 SAU101802
3771 EFA101540 SAU100275
4424 EFA102542 SAU101815
4654 ECO100488 PAE106184
5148 EFA100065 SAU100658
7227 EFA100023 SAU100436
7240 ECO103672 SAU101682
7278 PAE101620 SAU301370
7374 PAE106765 SAU103042
7375 EFA102051 SAU103038
7402 ECO103572 PAE106044
7419 ECO101686 SAU102693
7436 EFA101792 SAU101495
7504 EFA101670 SAU102603
7653 EFA100397 SAU100246
7660 EFA102352 ECO103698
7719 EFA100756 SAU100496
7725 EFA100739 SAU101803
8040 EFA101736 SAU101197
8058 EFA103571 SAU101242
8077 EFA100200 SAU102231
8082 EFA101080 SAU100199
8116 EFA101963 SAU101028
8122 EFA101737 SAU101198
8141 EFA102780 SAU102433
8177 EFA103348 SAU202126
8178 EFA101022 SAU102283
8181 EFA101541 SAU102909
8191 EFA102022 SAU101398
8234 EFA103033 SAU100745
8237 EFA101682 SAU101266
8238 EFA103295 SAU100963
8251 PAE100662 SAU100596
8300 EFA101120 SAU100944
8539 EFA101339 SAU101400
8610 ECO103661 SAU102298
8874 EFA100748 SAU101155
9028 EFA103210 SAU100731
9996 EFA102338 SAU100175
10234 EFA102186 SAU102933
10248 ECO102828 SAU101220
10297 PAE105229 SAU101381
10328 EFA101079 SAU101547
10345 EFA100295 SAU100659
10365 EFA100641 SAU101655
10393 EFA103504 SAU100961
10402 EFA101833 SAU100880
12426 EFA101413 SAU101794
14277 EFA103081 SAU200088
14330 EFA101161 SAU102881
14455 EFA101424 SAU101771
14520 EFA100211 SAU101789
15660 EFA103375 SAU102694
[0367]
Table VIA at the end of this specification shows the SEQ ID NOs, clone names, and organisms for the sequences used in the above analysis. Table VIB at the end of this specification contains the clone name, clone sequence number, PathoSeq locus, gene sequence number (protein), gene marked gene, and full length ORF for the sequences used in the above analysis. Shows the protein sequence number. Table VIC at the end of this specification shows the PathoSeq locus, nucleotide SEQ ID NO, and protein SEQ ID NO of the sequences used in the above analysis.
[0368]
In some embodiments of the invention, the gene encoding the gene product required for cell growth is under the control of a desired promoter, such as a constitutive or regulatable promoter that provides the desired level of expression. Certain strains are constructed by replacing the native promoter with the desired promoter by homologous recombination, as described in Examples 9-13 below. Although Examples 9-13 use Candida albicans as a representative organism, it will be appreciated that similar methods may be utilized in other organisms.
Embodiment 9
[0369]
Construction of strains that over- or under-express gene products required for growth by replacing promoters
Strains that over- or under-express the gene products required for growth can also be constructed by replacing promoters that naturally induce transcription of these gene products with promoters that provide the desired level of expression. As noted above, such strains are useful in methods of identifying the target of a compound that inhibits growth, as well as methods of identifying the gene encoding the gene product required for growth.
[0370]
For example, in some embodiments, the native promoter can be replaced by using a technique that uses homologous recombination to replace the promoter present on the chromosome of the cell with the desired promoter. In such a methodology, a nucleic acid containing a promoter replacement cassette is introduced into a cell. As shown in FIG. 5A, the promoter replacement cassette contains a 5 ′ region homologous to the sequence 5 ′ of the native promoter in the chromosome, a promoter to replace the chromosomal promoter, and a sequence 3 ′ of the native promoter in the chromosome. Contains a homologous 3 'region. In some embodiments, the promoter replacement cassette also encodes a identifiable or selectable marker located between the 5 'region homologous to sequence 5' of the native promoter and the promoter to replace the chromosomal promoter. May be included. If desired, the promoter replacement cassette may also include a transcription terminator 3 'of the gene encoding the identifiable or selectable marker, as shown in FIG. 5B. As shown in FIGS. 5A and 5B, homologous recombination can be performed between the chromosomal region containing the native promoter and the promoter replacement cassette. Cells in which the promoter replacement cassette has been integrated into the chromosome are identified or selected. To confirm that homologous recombination has occurred, the chromosomal structure of the cells may be confirmed by Southern blot analysis or PCR.
[0371]
In some embodiments, a promoter replacement cassette may be introduced into a cell as a linear nucleic acid, such as a PCR product or a restriction fragment. Alternatively, the promoter substitution may be introduced into the cell on a plasmid. 5A and 5B show the replacement of a chromosomal promoter by homologous recombination with a desired promoter.
[0372]
In some embodiments, the cells into which the promoter replacement cassette has been introduced may have mutations that enhance the ability of the cells to be transformed with the linear DNA, or that increase the frequency of homologous recombination. For example, if the cell is an Escherichia coli cell, the cell may have a mutation in the gene encoding exonuclease V of the RecBCD recombination complex. If the cell is an Escherichia coli cell, the cell may have a mutation that activates the RecET recombinase of Rac prophage and / or enhances recombination by the RecF pathway. For example, an Escherichia coli cell can be a RecB or RecC mutant having an sbcA or sbcB mutation. Alternatively, the Escherichia coli cell may be a recD mutant. In other embodiments, the Escherichia coli cells may express a λ Red recombinant gene. For example, Escherichia coli cells suitable for use in techniques utilizing homologous recombination are described in Datsenko, KA and Wanner, BL, PNAS 97: 6640-6645 (2000), Murphy, KC, J. Bact 180: 2053. -2071 (1998), Zhang, Y., et al., Nature Genetics 20: 123-128 (1998), and Muyrers, JPP et al., Genes & Development 14: 1971-1982 (2000) (these disclosures are , Incorporated herein by reference in its entirety). It will be appreciated that cells having mutations in similar genes can be constructed in organisms other than Escherichia coli.
[0373]
In some embodiments, US patent application Ser. No. 09 / 792,024, filed Feb. 20, 2001, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, December 2001. US patent application Ser. No. 10 / 032,585, filed on the 20th, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, and US patent application Ser. No. 09 / 948,993, the disclosure of which is hereby incorporated by reference. The genes required for growth may be placed under the control of a regulatable promoter, using the methods described in U.S. Pat.
[0374]
If the organism in which the promoter replacement is to be performed is diploid, a strain in which the gene encoding the gene product required for growth is under the control of the desired promoter was filed on February 20, 2001 US patent application Ser. No. 09 / 792,024, the disclosure of which is incorporated herein by reference in its entirety, and US patent application Ser. No. 10 / 032,585, filed Dec. 20, 2001. (This disclosure is hereby incorporated by reference in its entirety) (discloses the genes and gene products required for growth that can be used in any of the methods of the present invention). Can be constructed using In such a method, one of the chromosomal copies of the gene encoding the gene product required for growth is inactivated. For example, a gene may have a nucleotide sequence that encodes a selectable or detectable gene product, such as a polypeptide that provides resistance to a drug, or that allows growth under certain culture conditions, or a nucleotide sequence. Can be inactivated by substitution with Another chromosomal copy of the gene encoding the gene product required for growth is placed under the control of a regulated promoter by homologous recombination. The resulting strain can be used to identify genes encoding gene products required for growth and in the methods of the invention.
[0375]
For example, one method of constructing a diploid cell in which the gene encoding the gene product required for growth is under the control of a regulated promoter is shown in FIGS. 6A and 6B. In the method shown in FIGS. 6A and 6B, one of the chromosomal copies of the essential Candida albicans gene CaKRE9 is replaced by a PCK1 terminator sequence in which the nucleic acid sequence homologous to the CaKRE9 gene is at the 3 ′ end of the ACT-1 promoter and SAT1 gene. Is disrupted using a cassette adjacent to the nucleic acid containing the SAT1 gene under the control of The presence of the Escherichia coli SAT1 gene in Candida albicans allows for acetylation of the drug, detoxifies the drug, and allows the strain to grow in the presence of 200 micrograms per milliliter of streptothricin. enable. Expression of the SAT1 gene in Candida albicans is accomplished by manipulating the gene such that its DNA sequence is altered to accommodate the genetic code of this organism, as well as by the CaACT1 promoter (Morschhauser et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 257: 412-420) and the CaPCK1 terminator sequence (Leuker et al. (1997) Gene 192: 235-40). This genetically modified marker is called CaSAT1, which is a co-pending U.S. patent application Ser. No. 09 / 785,669 filed Feb. 16, 2001 (Publication No. US2001-0031724-A1) ( This disclosure is the subject of (herein incorporated by reference in its entirety).
[0376]
Candida albicans is also susceptible to a second fungicide, blasticidin, and its cognate resistance gene from Bacillus cereus is similarly inherited for expression in Candida albicans. (CaBSR1) was found to confer a dominant drug resistance phenotype. Gene disruption for any given Candida albicans gene by PCR amplification of any dominant selectable marker containing an approximately 65 bp flanking sequence identical to sequences 5 'and 3' of the Candida albicans gene to be disrupted Construction of a cassette becomes possible.
[0377]
By using the method of Baudin et al. (1993, Nucleic Acids Research 21: 3329-30), the gene disruption phenomenon was caused by transformation of a Candida albicans strain with a PCR amplified gene disruption cassette, and a wild-type gene as a dominant selectable marker. This can be achieved after selection for the precisely substituted drug resistant transformants. Such mutants can be selected for growth in the presence of an agent such as, but not limited to, streptothricin. The resulting gene disruption is generally heterozygous in diploid Candida albicans, where one copy of the allele pair on one homologous chromosome is disrupted and the other allele on the other homologous chromosome is Remains as a wild-type allele as seen in the parent strain. The collapsed allele is non-functional and there is no expression of the gene from this allele. By repeating this process for every gene in the genome of an organism, a set of gene disruptions can be obtained for every gene in the organism. The above method can be applied to a desired subset of genes.
[0378]
In the method shown in FIGS. 6A and 6B, the second chromosomal copy of the Candida albicans CaKRE9 gene has a nucleic acid sequence homologous to the promoter region to be replaced, a CaHIS3 gene (encoding a selectable marker), an ADH terminator (CAHIS3 Under the control of a regulatable promoter, using a promoter replacement cassette adjacent to the nucleic acid containing the 3 ′ end of the gene) and a tetracycline regulatable promoter (described below).
[0379]
The regulatable promoter system for tetracycline was initially described by S. Developed for C. cerevisiae but modified for use in Candida albicans. See Gari et al., 1997, Yeast 13: 837-848, and Nagahashi et al., 1997, Mol. Gen. Genet. 255: 372-375. Briefly, conditional expression was first performed by S. A transactivation fusion comprising an Escherichia coli TetR tetracycline repressor domain or a DNA binding domain (amino acids 1-207) fused to the transcription activation domain of S. cerevisiae GAL4 (amino acids 785-881) or HAP4 (amino acids 424-554). This is achieved by constructing the protein. Multiple CTG codon corrections were introduced to follow the Candida albicans genetic code. Escherichia coli TetR (amino acids 1-207) + S. Cerevisiae GAL4 (amino acids 785 to 881), and Escherichia coli TetR (amino acids 1 to 207) + S. Both nucleotide sequences encoding the transactivating fusion protein of S. cerevisiae HAP4 (amino acids 424-554) were modified for proper expression in Candida albicans.
[0380]
Constitutive expression of the transactivating protein in Candida albicans can be achieved by providing a CaACT1 promoter and a CaACT1 terminator sequence. However, it will be appreciated that any regulatory region, promoter and terminator that is functional in Candida albicans can be used to express the fusion protein. Therefore, using a nucleic acid molecule containing a promoter functional in Candida albicans, a coding region of a transactivation fusion protein, and a terminator functional in Candida albicans, a gene encoding a gene product required for growth is obtained. Thus, cells under the control of a regulatable promoter can be obtained. Such a nucleic acid molecule can be a plasmid, cosmid, transposon, or mobile genetic element. In a preferred embodiment, the TetR-Gal4 or TetR-Hap4 transactivator can be stably incorporated into Candida albicans strains by using either the ura3 and his3 auxotrophic markers.
[0381]
Initially S. Heterotetracycline promoters developed for S. cerevisiae gene expression contain an ADHI 3 'terminator sequence, a variable number of copies of the tetracycline operator sequence (2, 4, or 7 copies), and the CYC1 basal promoter. The tetracycline promoter was subcloned adjacent to both the CaHIS3 and CaSAT1 selectable markers in a preferred orientation for tetracycline promoter-dependent regulation when placed immediately upstream of the open reading frame of the given gene. PCR amplification of the CaHIS3-Tet promoter cassette incorporates a 65 bp flanking sequence homologous to the promoter sequence near nucleotide positions -200 and -1 (relative to the start codon) of the target gene, thereby transforming it. Is generated. When transformed into a heterozygous Candida albicans strain as described herein using the CaSAT1 decay cassette, homology between the promoter-substituted fragment and the promoter of the wild-type allele is Recombination produces a strain in which the remaining wild-type gene is a gene conditionally regulated by the tetracycline promoter. Transformants are selected as His prototrophy and confirmed by Southern blot and PCR analysis.
[0382]
6A and 6B, the promoter is induced in the absence of tetracycline and is repressed in the presence of tetracycline. Analogues of tetracycline, including, but not limited to, chlortetracycline, demeclocycline, doxycycline, meclocycline, metocycline, minocycline hydrochloride, anhydrotetracycline, and oxytetracycline, also express altered gene alleles. Can be used to control.
[0383]
Activated by binding of an antibiotic effector molecule to promote expression (ie, binds to its cognate operator sequence) and repressed in the absence of the antibiotic effector (ie, does not bind to the operator sequence); An alternative mutant of the tetracycline promoter system based on a mutant tetracycline repressor (tetR) molecule, termed tetR ', may be used in place of or in addition to wild-type tetR. For example, the method described above may be used to inhibit the expression of tetR when it is desirable to suppress expression under conditions in the absence of tetracycline, such as when genes involved in drug transport (eg, CaCDR1, CaPDR5, or CaMDR1) are blocked. Alternatively, it can be implemented using tetR '. In addition, the above method also provides that tetR is fused to the activation domain and tetR ′ is linked to a common repressor (eg, CaSsr6 or CaTup1) to enhance or even suppress expression in the presence of the antibiotic effector molecule. It can be adapted to incorporate both tetR and tetR 'molecules in a fused dual activation / repressor system (Belli et al., 1998, Nucl Acid Res 26: 942-947, which is hereby incorporated by reference). Book). This method of providing conditional expression is also contemplated.
[0384]
The above methods may also be applied to haploid organisms by modifying a single allele of the gene by recombination of the allele with a promoter replacement fragment comprising a nucleotide sequence encoding a heteropromoter. Is conditionally regulated by a heteropromoter. By repeating this process for a preferred subset of genes in a haploid pathogen, or its entire genome, a collection or complete set of conditional mutant strains can be obtained. Preferred gene subsets include genes that share substantial nucleotide sequence homology with target genes of other organisms (eg, Candida albicans and S. cerevisiae). For example, the methods described above include Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus niger, Aspergillus flavis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans (Cryptococcus neoformans). (Coccidioides immitis), Exophalia dermatiditis, Fusarium oxysporum, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii, Trichosporion trichosporioni Animal fungal diseases such as Rhizopus arrhizus, Mucor rouxii, Rhizomucor pusillus, or Absidia corymbigera Body, or Botrytis cinerea, Erysiphe graminis, Magnaporthe grisea, Puccinia recodita, Septoria triticii, contora versatilla ), Plant fungal pathogens such as Ustilago maydis, or any species within the genus of any of the above species, including but not limited to haploid fungal pathogens . Similarly, the methods may be applied to bacteria, including the bacterial species and genera.
[0385]
It will be appreciated that the means for achieving conditional expression is not limited to the tetracycline promoter system and can be implemented with other conditional promoters. Such a conditional promoter can be regulated, for example, by a repressor that represses transcription from the promoter under certain conditions, or by a transactivator that increases transcription from the promoter, for example, in the presence of an inducer. For example, the Candida albicans CaPCK1 promoter is not transcribed in the presence of glucose, but has high expression levels in cells grown on other carbon sources, such as succinate, and therefore conditional expression of the modified allele Can also be adopted. To this end, both CaHIS1 and CaSAT1 have been found to be essential for growth in glucose-containing media using the CaPCK1 promoter as an alternative to the tetracycline promoter in the above description. In this case, the CaPCK1 promoter is heterologous for the gene to be expressed and not for the organism, and such heteropromoters are also included in the present invention. Alternative promoters that can functionally replace the tetracycline promoter include other antibiotic-based regulatable promoter systems (eg, pristinamycin-inducible promoter, or PIP), as well as Candida albicans conditional regulated promoters (eg, , MET25, MAL2, PHO5, GAL1, 10, STE2, or STE3), but are not limited thereto.
[0386]
Although not required, a gene disruption can first be performed to establish a heterozygous strain and collected separately as a heterozygous strain collection during the drug target validation process. Heterozygous strains for a given gene express approximately half the normal haploid level of a particular gene product. Thus, these strains provide constructs having reduced levels of the encoded gene product, and these strains can be used in the methods described herein. However, the order of the allelic modification procedure employed in this embodiment of the invention is not critical and may be in various orders, such as constructing the conditionally expressed allele first followed by disruption of the remaining wild-type allele. It will be apparent to one skilled in the art that these steps can be performed. However, when the promoter replacement step is performed first, it is preferable to delete sequences homologous to the sequences used in the gene disruption step.
[0387]
Alternatively, conditional expression can be achieved by means other than those dependent on a conditional promoter. For example, conditional expression can be achieved by replacing wild-type alleles in haploid or heterozygous strains with temperature-sensitive alleles obtained in vitro and then converting their phenotypes to non- Analyze at allowable temperature. In a related approach, in heterozygous strains, insertion of a ubiquitination signal into the remaining wild-type allele to destabilize the gene product during activation conditions results in the phenotype attributable to gene inactivation. Can be adopted to check for effects.
[0388]
In another alternative, a constitutive promoter regulated by an excisable transactivator can be used. The promoter is placed upstream relative to the target gene to repress expression to a basal level characteristic of the promoter. For example, if the strain is a fungal organism, a heterologous promoter containing a lexA operator element may be used in conjunction with a fusion protein composed of a lexA DNA binding domain and any transcriptional activator domains (eg, GAL4, HAP4, VP16). Alternatively, constitutive expression of the target gene may be provided. Using 5-FOA mediated counter-selection, one can select cells in which the gene encoding the fusion protein has been excised. This procedure allows for the examination of phenotypes associated with the repression of target gene expression to the basal level provided by the lexA heterologous promoter in the absence of a functional transcriptional activator. Strains generated by this approach can be used in the present invention.
[0389]
Alternatively, conditional expression of the target gene can be achieved without using a transactivator containing a DNA-binding transcriptional activator domain. The cassette can be constructed to contain a heterologous constitutive promoter, eg, downstream of a URA3 selectable marker, flanked by tandem repeats containing sequences homologous to the 5 'portion of the target gene. Additional homologous sequences upstream of the target, when added to this cassette, facilitate homologous recombination and replacement of the native promoter with the above-described heterologous promoter cassette immediately upstream of the start codon or open reading frame of the target gene. . Conditional expression was selected by using a 5-FOA containing medium to select for strains that had the heterologous constitutive promoter and URA3 marker excised (and thus lack regulatory sequences upstream of the target gene required for gene expression). By testing the growth of the resulting strain against a wild-type strain grown under the same conditions.
[0390]
A specific use of the above method when used to construct a modified allele of the target gene CaKRE9 is provided in Example 10 below.
Embodiment 10
[0391]
Construction of a Candida albicans strain in which the gene encoding the gene product required for growth is under the control of a regulatable promoter
Oligonucleotide primers for PCR amplification of the SAT selectable marker used in step 1 (ie, gene replacement) are 25 nucleotides complementary to the SAT decay cassette in pRC-ASP, and adjacent to the CaKRE9 open reading frame. Contains 65 nucleotides homologous to the region. 6A and 6B show the procedure for constructing a Candida albicans strain in which the gene encoding the gene product is under the control of a regulatable promoter. As shown in FIGS. 6A and 6B, a 2.2 kb cacre9Δ :: SAT decay fragment was generated following PCR amplification and subsequent gene replacement of the first wild-type CaKRE9 allele by homologous recombination after transformation. The PCR conditions were as follows: 5-50 ng of pRC18-ASP, 100 pmol of each primer, 200 μM dNTP, 10 mM Tris-pH 8.3, 1.5 mM MgCl Two , 50 mM KCl, 1 unit of Taq DNA polymerase (Gibco). The PCR amplification was carried out for 1 cycle of 5 minutes 94 ° C, 1 minute 54 ° C, 2 minutes 72 ° C, and 30 cycles of 45 seconds 94 ° C, 45 seconds 54 ° C, 2 minutes 72 ° C. Transformation is limited to adapt to Candida albicans according to Braun and Johnson (Braun, BR, and AD Johnson (1997), Control of filament formation in Candida albicans by the transcriptional repressor TUP1, Science 277: 105-109). Acetic acid with shorter incubation times at 30 ° C. and 42 ° C. (1 hour and 5 minutes, respectively), and higher amounts of material to be transformed (50 μg of ethanol precipitated cacre9Δ :: SAT PCR product) Performed using the lithium method. The transformed cells were spread on YPD plates and incubated at 30 ° C. overnight to provide a pre-incubation time for SAT expression, and then onto YPD medium containing streptothricin (400 μg / ml). Replica plate method. Streptothricin-resistant colonies were detected after 36 hours, and the cacre9Δ: SAT / CaKRE9 heterozygote was identified by PCR analysis using appropriate primers that amplify both CaKRE9 and cacre9Δ :: SAT allele.
[0392]
Oligonucleotide primers for PCR amplification of the conditional promoter used in step 2 (promoter replacement) were 25 nucleotides complementary to the CaHIS-marked tetracycline-regulated promoter cassette in pBSK-HT4, and- It contains 65 nucleotides of homologous sequence corresponding to the promoter region of 270-205, and nucleotides 1-65 of the CaKRE9 open reading frame. The resulting 2.2 kb PCR product was transformed into the cacre9Δ :: SAT / CaKRE9 heterozygous strain produced in step 1 + Transformants were selected on YNB agar. Authentic CaKRE9 strains containing both the cacre9Δ :: SAT allele and the CaHIS3-Tet-CaKRE9 allele were determined by PCR analysis. Usually, two separate strains are constructed and evaluated to make a reliable decision on the final phenotype of any given drug target. The final phenotype is the phenotype caused by the absence of the gene product of the essential gene.
[0393]
The phenotype of the resulting strain was evaluated as follows.
Embodiment 11
[0394]
Evaluation of the phenotype of Candida albicans strains in which the gene encoding the gene product required for growth is under the control of a regulatable promoter
Three separate methods were used to assess the phenotype of Candida albicans strains in which one copy of the CaKRE9 gene was disrupted and one copy was under the control of a regulatable promoter. Initially, approximately 1.0 × 10 5 on both the YNB plate and the YNB plate containing 100 μg / ml tetracycline. 6 The final phenotype of the strain was rapidly determined by streaking individual cells and comparing growth rates after 48 hours at room temperature. For essential genes such as CaKRE9, no significant growth is detected in the presence of tetracycline. In the second approach, the transactivator gene normally required for the expression of the tetracycline promoter-regulated target gene is excised (by recombination between the CaLEU2 sequence copies created during targeted integration). - To select cells, the essential properties of the gene were determined by streaking the cells on a casamino acid plate containing 625 μg / ml 5-fluoroic acid (5FOA) and 100 μg / ml uridine. obtain. Also prepared as described above, whereas one copy of the gene not required for growth was disrupted and the other copy under control of a regulatable promoter showed active growth under such conditions. The CaKRE9 strain cannot grow. Quantitative assessment of the final phenotype associated with the CaKRE9 strain was based on 2 × 10 5 inoculations of 5.0 ml of YNB without 100 μg / ml tetracycline or 5.0 ml of YNB supplemented with it. Three After 24 and 48 hours of incubation at 30 ° C. with an overnight culture of cells / ml, the optical density (OD. 600 ) Is performed. Normally, for strains in which the gene required for growth is under the control of an inducible promoter, no significant increase in optical density is detected after 48 hours in the absence of the inducer. The final phenotypic distinction between cell death (cidal) and growth inhibition (static) for the demonstrated essential genes is due to the survival from the tetracycline-treated cultures after 24 and 48 hours of incubation. Cells (2 × 10 at T = 0) Three By determining the percentage of colony forming units (CFU) from the equivalent of one washed cell. Strains that produce a terminal killing phenotype have a reduced percentage of viable cells (ie, 2 × 10 Three (Less than one CFU).
[0395]
The experiments described in Example 12 were performed to determine the variation in gene product levels under the control of a tetracycline-regulatable promoter.
Embodiment 12
[0396]
Variation of target levels under inducing and suppressing conditions
Both the CaHIS3 heterozygous strain and the tetracycline promoter-regulated CaHIS3 strain, in which one copy of the chromosome of the CaHIS3 gene has been disrupted and the other is under the control of a regulatable promoter, have been shown to be sensitive to 3-aminotriazole (3-AT). Comparison with the wild-type (diploid) CaHIS3 strain (FIGS. 7A to 7D). 3-AT is a competitive inhibitor of imidazole glycerol phosphate dehydratase, an enzyme encoded by CAHIS3, and both act as a drug model and drug target, respectively. Overexpression achieved by constitutive CaHIS3 expression levels maintained by the tetracycline promoter confers 3-AT resistance at a concentration sufficient to completely inhibit the growth of both wild-type and CaHIS3 heterozygous strains (FIG. 7A). The observed phenotype is consistent with that predicted taking into account the predicted 7.5-fold overexpression of CaHIS3 as determined by Northern blot analysis (see FIG. 8). Heterozygous CaHIS3 strains have increased sensitivity (ie, haploinsufficiency) to moderate 3-AT concentrations that cannot significantly affect either wild-type or tetracycline promoter-based overproducing CaHIS3 strains. Phenotype) (FIG. 7B). A third CaHIS3 expression level, evaluated for differential sensitivity to 3-AT, indicates that partial suppression of the tetracycline-regulated strain was achieved using a threshold concentration of tetracycline 0.1% that is commonly used to achieve complete blockade. Brought by.
[0397]
This level of CaHIS3 expression represents the minimum expression level required for growth and, as expected, shows an increased drug sensitivity to heterozygous CaHIS3 strains at moderate 3-AT concentrations (FIG. 7C). Similarly, strain-specific drug resistance and susceptibility phenotypes to fluconazole and tunicamycin were demonstrated by increased and decreased expression levels of their known drug targets, CaERG11 and CaALG7, respectively. Together, these results indicate that three different expression levels were achieved using the Candida albicans strain collection, which show a predictive drug-susceptibility phenotype between known drugs and their known drug targets. Demonstrate.
Embodiment 13
[0398]
Identification of Candida albicans genes encoding gene products required for growth
The Candida albicans gene, which encodes the gene product required for growth, constructs a strain in which one copy of the chromosome of the gene is disrupted and the other chromosomal copy of the gene is under the control of a regulatable promoter, as described above. Specified. In order to identify a gene that encodes a gene product required for growth, the strain containing the modified allele of the gene is substantially underexpressed with the second modified allele of the gene under conditional expression Or cultured under non-expressed conditions. The viability and / or growth of the strain was compared to that of a wild-type strain cultured under the same conditions. Loss or reduction in viability or growth indicated that the gene product encoded by the gene was required for growth. The level of expression of the gene by a strain prepared as described above may be less than 50%, less than 30%, less than 20%, preferably less than 10% of the unmodified allele. Depending on the heterologous promoter used, expression levels can be controlled, for example, by antibiotics, metal ions, specific chemicals, nutrients, pH, temperature, and the like.
[0399]
For example, Candida albicans conditional gene expression using the method described above was performed using CaKRE1, CaKRE5, CaKRE6, and CaKRE9 (FIG. 9). CaKRE5, CaKRE6, and CaKRE9 are either essential in Candida albicans or are predicted to be conditionally essential in Candida albicans, as demonstrated by gene disruption using the Ura blaster method (CaKRE9 null strain, It is not viable on glucose, but is viable on galactose). CaKRE1 has been demonstrated in Candida albicans as a non-essential gene using the Ura blaster method. Heterozygous strains for the above genes were constructed by a PCR-based gene disruption method using the CaSAT1 disruption cassette, followed by replacement of the native promoter of the wild-type allele with a tetracycline-regulated promoter. Active growth of each of these strains suggests that expression proceeds normally in the absence of tetracycline. When tetracycline is added to the growth medium, the expression of these tetracycline promoter-regulated genes is significantly reduced or absent. In the presence of tetracycline, strains under the control of a regulatable promoter in each of the three essential Candida albicans genes described above stopped growing. As expected, only the CaKRE1 strain shows active growth despite suppression of CaKRE1 expression.
[0400]
To further test the utility of the above method in target validation, the expression of the four known essential genes CaTUB1, CaALG7, CaAUR1, and CaFKS1, and the predicted essential genes CaSAT2, and CaKRE1, are controlled under the control of a promoter that is regulatable. The growth of a strain was compared under induction and suppression conditions (FIG. 10). As expected, strains under the control of a CaTUB1, CaALG7, CaAUR1, and CaFKS1 regulatable promoter are unlikely to grow under repressed conditions, unlike strains under the control of a non-essential gene CaKRE1 regulatable promoter. Did not. Furthermore, as expected, strains in which the CaSTA2 gene is under the control of a regulatable promoter, indicate that this gene is essential in Candida albicans. The CaSAT2 gene, engineered as a dominant selectable marker for use in Candida albicans, has been described by A Candida albicans gene that is homologous to the S. cerevisiae gene but is unrelated to the Escherichia coli Sat1 gene.
[0401]
In all cases based on other decay data generated, it is the expected response that the tetracycline regulatory gene is suppressed to a level that is non-functional in the presence of tetracycline. Further, S.I. These strains are incubated in the presence of tetracycline in applying the above methodology of conditional gene disruption to two additional Candida albicans genes (CaYPD1 and CaYNL194c) whose S. cerevisiae counterparts are known to be non-essential In no case was growth inhibition observed. These results indicate that the above method of conditional gene expression is a reliable indicator of gene essentiality.
[0402]
Furthermore, the utility of this method, a rapid and accurate means for identifying the complete set of essential genes in Candida albicans, is due to the null expression of large numbers of genes using the above two-step method of gene disruption and conditional expression. Demonstrated by type analysis. The target gene was selected as fungal specific and essential. Such genes are referred to as target essential genes in the screening assays described below.
[0403]
Literature searches identified reports of URA blaster-based gene disruption experiments for a total of 89 genes and identified 13 out of a total of 89 genes based on the inability to construct homozygous deletion strains. The gene was presumed to be essential. Thirteen genes were CaCCT8 (Rademacher et al., Microbiology, UK 144, 2951-2960 (1998)), CaFKS1 (Mio et al., J. Bacteriol, 179, 4096-105 (1997), and Douglas, et al. al., Antimicrob Agents Chemother 41, 2471-9 (1997)), CaHSP90 (Swoboda et al., Infect Immun 63, 4506-14 (1995)), CaKRE6 (Mio et al., J. Bacteriol 179, 2363-72). (1997)), CaNMT1 (Weinberg et al., Mol Microbiol 16,241-50 (1995)), CaPRS1 (Payne et al., J. Med. Vet. Mycol. 35, 305-12 (1997)), CaPSA1 (Care et al., Mol Microbiol 34, 792-798 (1999)), CaRAD6 (Care et al., Mol Microbiol 34, 792-798 (1999)), CaSEC4 (Mao et al., J. Bacteriol 181, 7235-7242). (1999)), CaSEC14 (Monteoliva et al., Yeast 12, 1097-105 (1996)), CaSNF1 (Petter et al., Infect Immun. 65, 4909-17 (1997)), CaTOP2 (Keller, et al. , Biochem J., 329-39 (1997)), and CaEFT2 (Mendoza et al., Gene 229, 1). 83-1991 (1999)). These 13 putative essential genes, as well as Candida albicans CaTUB1, CaALG1, and CaAUR1, are not initially identified by the above method. However, strains in which any one of these 17 genes is under the control of a regulatable promoter (eg, the strains CaTUB1, CaALG1, and CaAUR1 in FIG. 10, and the strain CaKRE6 in FIG. 9) are not subject to the method of the present invention. Can be used in Any of these 17 genes may be included as a control in the methods described above, or as a positive control for essentiality in collecting essential genes. Nucleic acid molecules comprising nucleotide sequences corresponding to any of these 17 genes may be used in the methods of the invention as drug targets, or they may be separately treated as a control in a kit or nucleic acid microarray. Alternatively, it may be included in a subgroup.
[0404]
Using the methods described above, the genes of SEQ ID NOs: 14111-14944 encoding the polypeptides of SEQ ID NOs: 14945-15778 were identified as required for growth. Table VII, provided at the end of this specification, lists the SEQ ID NOs of particular genes along with their Candida designations. The Candida genus names shown in Table VII were established by identifying a Saccharomyces cerevisiae gene that is homologous to a particular Candida albicans gene. The Candida name is also described with reference to the location of the homologous Saccharomyces cerevisiae gene in the Saccharomyces cerevisiae genome. For example, the Candida name CaYAL038W indicates that the homologous Saccharomyces cerevisiae gene has the yeast chromosome 1 (eg, YB means yeast chromosome 2), the left arm of the centromere (R means the right arm of the centromere), position 038, the Watson strand. On the w (c for the click strand). The homologous Saccharomyces cerevisiae gene was identified from genome-www.stanford.edu/saccharomyces. The homologous coding nucleic acid, homologous antisense nucleic acid, and homologous polypeptide having homology to the gene of SEQ ID NO: 14111 to 14944, the nucleic acid complementary to SEQ ID NO: 14111 to 14944, or the polypeptide of SEQ ID NO: 14945 to 15778 are as described above. It can be identified using any of the methods.
[0405]
Alternative methods are available to assess the indispensability of the modified gene in strains constructed as described above. Suppression of the expression of the modified gene allele in the strain constructed as described above is possible by homologous recombination-mediated excision of the gene encoding the transactivator protein. For example, if conditional expression of the target gene is achieved using a tetracycline-regulated promoter, constitutive expression (under unrepressed conditions) is suppressed by homologous recombination-mediated excision of the transactivator gene (TetR-GAL4AD). obtain. In this way, unconditionally achievable levels of repression are produced separately from the levels produced by tetracycline-mediated inactivation of the transactivator protein. Excision of the transactivator gene is made possible by the selectable marker and integration strategy used for strain construction. Stable integration of the CaURA3 marked plasmid containing the TetR-GAL4AD transactivator gene into the CaLEU2 locus results in tandem replication of CaLEU2 flanking the integrated plasmid. A counter-selection was then performed on 5-FOA containing media to select for excision of the CaURA3 marked transactivator gene and to determine whether this alternative repression strategy indicated that the target gene was essential. Can be inspected directly.
[0406]
Three examples of genes identified as essential on 5-FOA containing media but without any detectable growth impairment on tetracycline supplemented media are the genes CaYCL052c, CaYNL194c, and CaYJR046c. Presumably this is due to the target gene displaying lower basal levels of expression under conditions where the transactivator gene is completely eliminated than the gene product which is incompletely inactivated by the addition of tetracycline. Thus, the methods described above provide two distinct approaches for determining whether a given gene is essential for the survival of a host strain.
Embodiment 14
[0407]
Promoter replacement to generate cells capable of over- or under-expressing a gene encoding a gene product required for growth
Select a target for promoter replacement. The promoter replacement cassette is obtained by inserting into pACYC184 a rrnBT1T2 transcription terminator, followed by a nucleic acid containing the lac promoter, such that the rrnB terminator and the lac promoter are located 3 'of the CAT gene. The promoter replacement cassette (CAT-rrnBT1T2-plac) is amplified by PCR. The PCR product is 60-80 bp homologous to the target promoter (ie, a promoter that drives the expression of the gene encoding the gene product required for growth), and homology to the CAT / rrnBT1T2 / plac template as described above Used as a template for another round of PCR using primers with 20 bp of sex. The region of homology is selected such that the CAT / rrnBT1T2 / plac cassette replaces the target gene promoter during homologous recombination, but leaves the Shine-Delgarno motif unaffected.
[0408]
The promoter replacement cassette is transformed into competent JC8679. JC8679 is available from the E. coli genetics stock center. JC8679 contains a lacY mutation that allows recombination of short linear DNA and allows for titration regulation of the lac promoter. Transformed cells are plated on LB / chloramphenicol plates containing various levels of IPTG to ensure that the correct level of expression is achieved and to be viable. Correct integration of the promoter replacement cassette is confirmed by colony PCR. If desired, proper regulation of the target gene by the inserted promoter can be achieved by testing the integrant for growth defects when no inducer is present or at a level lower than that at which the original colony was obtained. Can be confirmed. The inability to grow in the absence of an inducer (IPTG) or in the presence of lower levels of the inducer than that used to obtain the clone ensures that the target gene is properly regulated by the inserted promoter. It is confirmed. Although the lac promoter and strain JC8679 are used as examples, to generate cells capable of over- or under-expressing the gene encoding the gene product required for growth, the above method is optional. It will be understood that the present invention can also be carried out using any suitable regulatable promoter and organism or strain.
Embodiment 15
[0409]
Operator insertion to generate cells capable of over- or under-expressing the gene encoding the gene product required for growth
Design an oligonucleotide containing a lac operator flanked on each side by 40 nucleotides homologous to the target promoter. A target promoter is a promoter that drives the expression of a gene encoding a gene product required for growth, such as the yabB yabC ftsL ftsI murE gene in the operon. FIG. 11 shows the oligonucleotide sequence (SEQ ID NO: 15810) and the location of the region homologous to the promoter. The sequence of the promoter is also given, with the positions of the −10 and −35 regions indicated (SEQ ID NO: 15811). The single-stranded oligonucleotide is transformed into bacteria that express λ Beta and Gam proteins. The cells in the transformation mixture are diluted and plated on medium containing IPTG. Colonies in which the lac operator has been integrated into the target promoter are identified by colony PCR. If desired, proper regulation of the target promoter by the insertion operator is confirmed by growing identified colonies in media containing or not containing IPTG. Colonies grow on media containing IPTG but cannot grow on media without IPTG, thereby confirming that the target promoter is properly regulated by the insertion operator. It is understood that the methods described above can be performed with any target promoter and any operator to generate cells that over- or under-express the gene encoding the gene product required for growth. Like.
[0410]
In the method of the present invention, a strain that over- or under-expresses a gene product required for growth is used to identify a gene product on which a compound that inhibits growth of an organism acts or to profile the activity of the compound. used. Examples 16-18 describe methods for identifying a gene product on which a compound that inhibits growth of an organism acts, using cells that over- or under-express the gene product required for growth.
Embodiment 16
[0411]
Strains that overexpress the gene encoding the gene product required for growth are able to grow at high antibiotic concentrations
To confirm that cells overexpressing the gene product required for growth are able to grow at high antibiotic concentrations, 11 cells from Staphylococcus aureus, a known antibiotic target, were used. Was operably linked to the xylose-inducible promoter XylT5 described above as follows. The genes and antibiotics targeting the products of these genes are listed in Table V below.
[0412]
As shown in Table V, PCR primer pairs were designed for each of the 11 genes encoding the gene products required for the growth of Staphylococcus aureus. The upstream primer for each gene contained a natural ribosome binding site (SD sequence). In addition, primers were designed with appropriate restriction sites for restriction enzymes to facilitate directional cloning of the gene. The PCR reaction was performed under the following conditions (50 μl of Pfu polymerase, 200 μM of dNTP, 400 nM of each primer, 5 to 10 ng of Staphylococcus aureus RN450 genomic DNA (template) per 5 μl of a reaction volume) under the following conditions: Pfu DNA polymerase (Stratagene, San Diego) ). The reaction was carried out under the conditions of initial heating at 94 ° C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C for 30 seconds / 55 ° C for 30 seconds / 72 ° C for 5 minutes, and extension at 72 ° C in 7 minutes. Was.
[0413]
The amplified gene was operably linked to the XylT5 promoter as follows. PCR products were purified using the QIAGEN PCR cleaning kit, followed by digestion with the appropriate restriction enzymes. The obtained fragment was ligated overnight at 16 ° C. with a precut vector DNA containing the XylT5 promoter. The ligation mixture was ethanol precipitated for 20 minutes at -80 ° C in the presence of 0.3 M sodium acetate. The precipitated DNA was spun down at 14,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. and washed with 1 ml of 70% EtOH. The DNA pellet was air dried and dissolved in EB or sterile water. To transform Staphylococcus aureus cells, the precipitated DNA was mixed with 45 μl of electroporation competent cells and incubated for 30 minutes at room temperature. The DNA / cell mixture was electroporated in a 2 mm cuvette (settings: 2 volts, 25 μF, 200Ω) and mixed with 450 μl of B2 medium containing 0.2 μg / ml chloramphenicol. The cells were incubated for 90 minutes at 37 ° C. with shaking. Transformed cells were plated on LB agar plates containing chloramphenicol (34 μg / ml) for plasmid selection. Several colonies for each cloning reaction were picked and streaked to obtain a pure culture. A colony PCR reaction using vector-specific primers was performed to confirm the size and uniqueness of the insert.
[0414]
All inserts were completely sequenced for several clones of each cloned gene using gene-walking sequencing. This was done to avoid using a cloned gene whose DNA sequence was mutated during the PCR process.
[0415]
To demonstrate that a gene encoding a gene product required for growth can confer resistance to those particular inhibitors upon induction at the appropriate inducer level, the gene was added to a xylose-inducible promoter. Cells of each operably linked clone were grown in LB medium with chloramphenicol (34 μg / ml) at various combinations of antibiotic and inducer concentrations. This was achieved using microtiter plates (96 or 384 wells) containing antibiotics and inducers in gradient concentrations in matrix format with a 10-fold excess (see FIG. 12). Medium containing seeded cells (9 volumes) was dispensed into wells containing 1 volume of antibiotic / inducer for a final volume of 50 μl (for 384-well plates) or 200 μl (for 96-well plates). . Plates were incubated at 37 ° C. with periodic shaking and cell growth was monitored by automated measurement of optical density at OD600 using an Ultramark reader. Significant growth was observed under conditions where a certain concentration of antibiotic was present at the appropriate inducer concentration, but was not observed under conditions where the inducer was absent at that particular antibiotic concentration. Clones overexpressing a particular gene were designated as resistant to that particular antibiotic (inhibitor).
[0416]
The results are shown in FIGS. As shown in FIG. 13, cells overexpressing the defB gene product at the appropriate concentration of inducer were able to grow at high concentrations of the antibiotic actinonin acting on the defB gene product. Similarly, as shown in FIG. 14, cells overexpressing the foA gene product at the appropriate concentration of inducer were able to grow with high concentrations of the antibiotic trimethoprim, which acts on the foA gene product.
[0417]
Thus, high expression of the gene product required for growth allows cells to grow in the presence of antibiotic concentrations that inhibit or prevent the growth of wild-type cells.
[0418]
[Table 135]
Figure 2004528846
Embodiment 17
[0419]
Overexpression of a gene encoding a gene product required for growth confers specific resistance to antibiotics targeting the overexpressed gene product
The following experiments were performed to demonstrate that cells overexpressing the gene encoding the gene product required for growth are specifically resistant to antibiotics targeting that gene product. did. Several identical compound plates were prepared as in Example 14 above, where different antibiotics were present in different wells. Medium containing cells overexpressing various genes was separately distributed on each of these plates. Plate incubations and growth measurements were performed as described in Example 16 above. Cells that overexpress only one particular gene have acquired resistance to antibiotics that target the product of the overexpressed gene, but are resistant to other antibiotics that target the product of the non-overexpressed gene. If resistance was not gained, growth was considered specific.
[0420]
As shown in FIG. 15, overexpression of the fabI gene conferred resistance to triclosan, which acts on the enol-acyl carrier protein reductase, a gene product of the fabI gene. However, overexpression of the fabI gene did not confer resistance to cerulenin, trimethoprim, or actinonin, which act on other gene products, respectively.
[0421]
Similarly, as shown in FIG. 16, overexpression of the fo1A gene conferred resistance to trimethoprim, which acts on dihydrofolate reductase, a gene product of the fo1A gene. However, overexpression of the fo1A gene did not confer resistance to triclosan, cerulenin, or actinonin, which act on other gene products, respectively.
[0422]
As shown in FIG. 17, overexpression of the defB gene conferred resistance to actinonin acting on peptide deformylase, a gene product of the defB gene. However, overexpression of the defB gene did not confer resistance to cerulenin, trimethoprim, or triclosan, which act on other gene products, respectively.
[0423]
As shown in FIG. 18, overexpression of the fabF gene conferred resistance to cerulenin acting on β-keto-acyl carrier protein synthase II, the gene product of the fabF gene. However, overexpression of the fabF gene did not confer resistance to triclosan, trimethoprim, or actinonin, which act on other gene products, respectively.
[0424]
Thus, overexpression of a gene encoding a gene product required for growth confers specific resistance to antibiotics targeting the overexpressed gene product.
Embodiment 18
[0425]
Selection of strains that overexpress the gene encoding the target gene product from a mixture of strains that overexpress the gene required for growth
The following experiments were performed to confirm that strains expressing the gene product targeted by the antibiotic could be selected from a mixture of strains each overexpressing a different gene required for growth. A Staphylococcus aureus strain over-expressing one of the nine genes encoding the gene products required for growth was constructed as described above. The nine overexpressed genes were fabF, defB, foIA, fabI, ileS, fusA, gyrB, murA, rpoB. A mixture of nine strains is incubated with various concentrations of inducer and a medium containing these antibiotics at a concentration sufficient to inhibit the growth of strains that do not overexpress the target of actinonin, cerulenin, triclosan or trimethoprim In a well in a 96-well plate.
[0426]
Growth was observed in wells containing the appropriate inducer concentration and one of each of the four antibiotics (see FIG. 19). Cultures grown in the presence of one of the antibiotics were analyzed as follows. Cultures were removed from plate wells and single colonies were obtained by plating serial dilutions on LB agar plates containing the appropriate antibiotic. Plasmids were isolated from at least 60 individual colonies for each culture and the gene conferring antibiotic resistance was amplified by performing a PCR reaction with vector-specific primers. Subsequently, the PCR products were sequenced.
[0427]
All plasmids obtained from cultures grown in the presence of cerulenin contained the fabF sequence. Similarly, all plasmids obtained from clones grown in the presence of triclosan contained the fabI gene. All plasmids obtained from colonies grown in the presence of actinonin contained the defB gene. In addition, 81% of the plasmids obtained from colonies grown in the presence of trimethoprim contained the foIA gene. Growth conditions could be further optimized to provide 100% recovery of the plasmid containing the foIA gene.
[0428]
These results demonstrate that strains expressing the gene product targeted by the antibiotic can be selected from a mixture of strains that overexpress different genes required for growth.
Embodiment 19
[0429]
Identification of amplification products with identifiable lengths
As described above, pbpC, secA, ilaO (Bs), yphC (Bs), trpS, polC, fabI, rpsR (Bs), fabF (yjaY), ileS, murC, fmhB, murA (Bs), murF (Bs) , FtsZ, tufA, gyrA, rpoB, grIA, or antisense nucleic acid complementary to the nucleotide sequence in the folA (dfrA) gene, using the plasmid described above as required for growth using a plasmid transcribed from the XylT5 promoter. Identified. The sequence of the antisense nucleic acid is provided herein as follows:
1359 after the tufA array board
1380 after array
rpoB SEQ ID NO: 1392
polC SEQ ID NO: 1409
murC SEQ ID NO: 1416
fmhB SEQ ID NO: 1444
yphC SEQ ID NO: 1463
gyrA SEQ ID NO: 1483
ileS SEQ ID NO: 1636
secA SEQ ID NO: 1651
fabI SEQ ID NO: 1697
murA SEQ ID NO: 2086
grlA SEQ ID NO: 2331
trpS SEQ ID NO: 2505
folA SEQ ID NO: 2526
pbpC SEQ ID NO: 2634
fabF SEQ ID NO: 2988
murF SEQ ID NO: 3522
rpsR SEQ ID NO: 3563
ftsZ SEQ ID NO: 3598
Amplification primers were designed that, when a plasmid encoding the corresponding antisense nucleic acid were present in the mixture of nucleic acids, yield an amplification product having the following lengths:
yphC 260 bp secA 267 bp
folA 230bp tufA 243bp
fabI 220 bp gyrA 225 bp
trpS 208 bp ileS 215 bp
fabF 189 bp murF 203 bp
murA 176 bp fmhB 181 bp
rpoB 159 bp yla 169 bp
grlA 151 bp pbpC 156 bp
murC 129 bp polC 145 bp
rpsR 109bp ftsZ 117bp
[0430]
The 5 'primer of each primer was complementary to the nucleotide sequence in the xylT5 promoter, while the 3' primer was complementary to the nucleotide sequence in the antisense clone. The 5 'primer for each pair was identical for each amplification reaction. The nucleotide sequence GTTTCTT was appended on the 5 'end of the 3' primer. One of the primers in each pair was labeled with either VIC or 6FAM.
[0431]
Either the plasmid encoding the antisense nucleic acid complementary to the nucleotide sequence in the grlA gene or the plasmid encoding the antisense nucleic acid complementary to the nucleotide sequence in the fmhB gene was doubled in each of the 11 tubes. Genes listed in each of the above columns, except for serial dilutions (ie, the first tube has 100 pg of the glA or fmhB plasmid, while the last tube has 0.10 pg of the grlA or fmhB plasmid) Two sets of 10 plasmids containing the antisense nucleic acid complementary to were mixed in equal volumes in 11 tubes. Amplification reactions were performed on the mixture and amplification products were separated on a 5% NuSieve 3: 1 agarose gel (Bio Whittaker Molecular Applications Rockland, ME). The level of the 151 bp or 181 bp amplification product for the grA or fmhB primers, respectively, decreased stepwise specifically with increasing dilution, while the level of the undiluted product remained constant. The assay readily detected a 1/10 reduction in template concentration as indicated by the amplification product corresponding to the grAA or fmhB plasmids.
Embodiment 20
[0432]
Selective loss of amplification products corresponding to strains that underexpress the gene products on which growth-inhibiting compounds act
Staphylococcus containing a plasmid encoding an antisense nucleic acid (as described in Example 19 above) complementary to a nucleotide sequence in the yphC, foA, fabI, trpS, fabF, murA, rpoB, glA, murC, or rpsR gene. Aureus strains were mixed together in the same culture so that each strain in the culture had the same cell number. Each culture containing the ten strains was contacted with any of the following antibiotics at any of the following concentrations:
Spectinomycin-2.5, 5.0 μg / ml
Mupriocin-4.3, 8.6, 17.2 μg / ml
Cerulenin-4.5, 9.0, 18.0 μg / ml
[0433]
Spectinomycin acts on the product of the rpsR gene, mupriocin acts on the product of the ileS gene, and cerulenin acts on the product of the FabF gene. The intermediate concentration for each antibiotic is its IC50.
[0434]
Cultures containing 10 strains are grown in rich medium (L-broth, chloramphenicol to maintain antisense LB + antisense plasmid) until cells reach the early log phase. Followed by contact with one of the above compounds at any of the concentrations listed above, preferably near the IC50. Cultures were grown for a period of time sufficient to allow the compound to specifically inhibit the growth of strains that underexpressed its target. Preferably, the culture has been grown for at least 16 hours, more preferably 24-48 hours. It is desirable not to grow the culture while applying selective pressure to strains that can result in false positives.
[0435]
Cells were harvested by centrifugation and plasmid DNA was isolated from the culture. PCR amplification was performed as described in Example 19. Amplification products were run on NuSieve agarose gels as described above. Determine the amount of amplification product corresponding to each antisense nucleic acid and determine the amount in control cultures that have not been contacted with the drug or other antisense nucleotide sequence in the gene that encodes the gene product on which the compound acts. It was compared with the amount of the amplification product corresponding to the sense nucleic acid. In each case, only amplification products corresponding to the target on which the antibiotic acted could not be detected on the gel.
[0436]
In embodiments where the level or activity of the gene product is regulated by transcribing an antisense nucleic acid complementary to the gene product required for growth, or by replacing the native promoter of such a gene with a regulatable promoter, It is desirable to complete a dose response curve for the inducer used to induce transcription of the antisense nucleic acid or to induce transcription from a regulatable promoter. In such embodiments, the lowest concentration of inducer that provides the optimal level of transcription to detect the effect of a particular test compound, with as little interruption as possible in the growth of a strain that does not over- or under-express the target on which the compound acts, It is desirable to use. It is also desirable to contact the culture with various amounts of the test compound to determine the optimal amount for obtaining differential growth of a strain that over- or under-expresses the target on which the compound acts. Preferably, if the strain overexpresses the gene product required for growth, the compound level is preferably about IC 90 That is all. Preferably, if the strain underexpresses the gene product required for growth, the compound level is preferably about IC 50 It is as follows.
[0437]
It will be appreciated that if desired, the amplification product can be detected using the dyes described above. It will also be appreciated that the amplification product can be detected using any desired amplification method, including RT-PCR and PCR.
[0438]
It will be appreciated that the present invention may be implemented in many ways, no matter how detailed the preceding description may appear herein. Also, as noted above, the use of certain terminology in describing certain forms or aspects of the present invention is not intended to be the broadest reasonable meaning of such terminology, or is not relevant to the terminology. It should further be noted that this should not be construed as implying that it is redefined herein to limit the inclusion of any particular feature of an aspect or aspect of the present invention. is there. Thus, while the invention has been described in terms of certain preferred embodiments, other embodiments that will be apparent to those skilled in the art in view of the disclosure herein are also within the scope of the invention. Accordingly, the scope of the invention is intended to be defined only by reference to the appended claims and any equivalents thereof. All documents cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.
[0439]
Table VIA
SEQ ID NO: Clone name Organism
8 E3M10000001A02 Enterococcus faecalis
9 E3M10000001A06 Enterococcus faecalis
10 E3M10000001B01 Enterococcus faecalis
11 E3M10000001B02 Enterococcus faecalis
12 E3M10000001B05 Enterococcus faecalis
13 E3M10000001B06 Enterococcus faecalis
14 E3M10000001B08 Enterococcus faecalis
15 E3M10000001B10 Enterococcus faecalis
16 E3M10000001C02 Enterococcus faecalis
17 E3M10000001C09 Enterococcus faecalis
18 E3M10000001D02 Enterococcus faecalis
19 E3M10000001D04 Enterococcus faecalis
20 E3M10000001D05 Enterococcus faecalis
21 E3M10000001D09 Enterococcus faecalis
22 E3M10000001E01 Enterococcus faecalis
23 E3M10000001E02 Enterococcus faecalis
24 E3M10000001E03 Enterococcus faecalis
25 E3M10000001E04 Enterococcus faecalis
26 E3M10000001E08 Enterococcus faecalis
27 E3M10000001E09 Enterococcus faecalis
28 E3M10000001F02 Enterococcus faecalis
29 E3M10000001F04 Enterococcus faecalis
30 E3M10000001F06 Enterococcus faecalis
31 E3M10000001F07 Enterococcus faecalis
32 E3M10000001G02 Enterococcus faecalis
33 E3M10000001G03 Enterococcus faecalis
34 E3M10000001G04 Enterococcus faecalis
35 E3M10000001G05 Enterococcus faecalis
36 E3M10000001H02 Enterococcus faecalis
37 E3M10000001H03 Enterococcus faecalis
38 E3M10000001H04 Enterococcus faecalis
39 E3M10000004A04 Enterococcus faecalis
40 E3M10000004C03 Enterococcus faecalis
41 E3M10000004D01 Enterococcus faecalis
42 E3M10000004D02 Enterococcus faecalis
43 E3M10000004D10 Enterococcus faecalis
44 E3M10000004E11 Enterococcus faecalis
45 E3M10000004F08 Enterococcus faecalis
46 E3M10000004F10 Enterococcus faecalis
47 E3M10000004G01 Enterococcus faecalis
48 E3M10000004H11 Enterococcus faecalis
49 E3M10000005A07 Enterococcus faecalis
50 E3M10000005B01 Enterococcus faecalis
51 E3M10000005B08 Enterococcus faecalis
52 E3M10000005C01 Enterococcus faecalis
53 E3M10000005C03 Enterococcus faecalis
54 E3M10000005C04 Enterococcus faecalis
55 E3M10000005D03 Enterococcus faecalis
56 E3M10000005D04 Enterococcus faecalis
57 E3M10000005D10 Enterococcus faecalis
58 E3M10000005E01 Enterococcus faecalis
59 E3M10000005E02 Enterococcus faecalis
60 E3M10000005E03 Enterococcus faecalis
61 E3M10000005E08 Enterococcus faecalis
62 E3M10000005F07 Enterococcus faecalis
63 E3M10000005F10 Enterococcus faecalis
64 E3M10000005G05 Enterococcus faecalis
65 E3M10000005H04 Enterococcus faecalis
66 E3M10000006B03 Enterococcus faecalis
67 E3M10000006C01 Enterococcus faecalis
68 E3M10000006C12 Enterococcus faecalis
69 E3M10000006D03 Enterococcus faecalis
70 E3M10000006E11 Enterococcus faecalis
71 E3M10000006F04 Enterococcus faecalis
72 E3M10000006G04 Enterococcus faecalis
73 E3M10000006G12 Enterococcus faecalis
74 E3M10000006H09 Enterococcus faecalis
75 E3M10000007A02 Enterococcus faecalis
76 E3M10000007B02 Enterococcus faecalis
77 E3M10000007B03 Enterococcus faecalis
78 E3M10000007C03 Enterococcus faecalis
79 E3M10000007C04 Enterococcus faecalis
80 E3M10000007D03 Enterococcus faecalis
81 E3M10000007E05 Enterococcus faecalis
82 E3M10000007F01 Enterococcus faecalis
83 E3M10000007F06 Enterococcus faecalis
84 E3M10000007G01 Enterococcus faecalis
85 E3M10000008C03 Enterococcus faecalis
86 E3M10000008C08 Enterococcus faecalis
87 E3M10000008C09 Enterococcus faecalis
88 E3M10000008D08 Enterococcus faecalis
89 E3M10000008E02 Enterococcus faecalis
90 E3M10000008G05 Enterococcus faecalis
91 E3M10000008G09 Enterococcus faecalis
92 E3M10000008H02 Enterococcus faecalis
93 E3M10000009C07 Enterococcus faecalis
94 E3M10000009C09 Enterococcus faecalis
95 E3M10000009D01 Enterococcus faecalis
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97 E3M10000009E03 Enterococcus faecalis
98 E3M10000009E05 Enterococcus faecalis
99 E3M10000009G02 Enterococcus faecalis
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101 E3M10000010D05 Enterococcus faecalis
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110 E3M10000011B09 Enterococcus faecalis
111 E3M10000011C07 Enterococcus faecalis
112 E3M10000011D03 Enterococcus faecalis
113 E3M10000011H02 Enterococcus faecalis
114 E3M10000011H05 Enterococcus faecalis
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121 E3M10000012E08 Enterococcus faecalis
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131 E3M10000013D02 Enterococcus faecalis
132 E3M10000013D08 Enterococcus faecalis
133 E3M10000013D10 Enterococcus faecalis
134 E3M10000013E02 Enterococcus faecalis
135 E3M10000013E08 Enterococcus faecalis
136 E3M10000013F05 Enterococcus faecalis
137 E3M10000013F12 Enterococcus faecalis
138 E3M10000013G10 Enterococcus faecalis
139 E3M10000013H03 Enterococcus faecalis
140 E3M10000013H05 Enterococcus faecalis
141 E3M10000013H10 Enterococcus faecalis
142 E3M10000014B12 Enterococcus faecalis
143 E3M10000014E12 Enterococcus faecalis
144 E3M10000014G09 Enterococcus faecalis
145 E3M10000015B04 Enterococcus faecalis
146 E3M10000015B12 Enterococcus faecalis
147 E3M10000015E12 Enterococcus faecalis
148 E3M10000016A03 Enterococcus faecalis
149 E3M10000016A04 Enterococcus faecalis
150 E3M10000016C11 Enterococcus faecalis
151 E3M10000016D03 Enterococcus faecalis
152 E3M10000016F06 Enterococcus faecalis
153 E3M10000016F10 Enterococcus faecalis
154 E3M10000016H05 Enterococcus faecalis
155 E3M10000016H10 Enterococcus faecalis
156 E3M10000017A09 Enterococcus faecalis
157 E3M10000017D09 Enterococcus faecalis
158 E3M10000018A07 Enterococcus faecalis
159 E3M10000018C02 Enterococcus faecalis
160 E3M10000018E01 Enterococcus faecalis
161 E3M10000018G09 Enterococcus faecalis
162 E3M10000018H06 Enterococcus faecalis
163 E3M10000019B06 Enterococcus faecalis
164 E3M10000019D02 Enterococcus faecalis
165 E3M10000019E03 Enterococcus faecalis
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170 E3M10000021A11 Enterococcus faecalis
171 E3M10000021B10 Enterococcus faecalis
172 E3M10000021C03 Enterococcus faecalis
173 E3M10000021C04 Enterococcus faecalis
174 E3M10000021C08 Enterococcus faecalis
175 E3M10000021D04 Enterococcus faecalis
176 E3M10000021E10 Enterococcus faecalis
177 E3M10000021G04 Enterococcus faecalis
178 E3M10000021G10 Enterococcus faecalis
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191 E3M10000022F06 Enterococcus faecalis
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261 E3M10000027D10 Enterococcus faecalis
262 E3M10000027G01 Enterococcus faecalis
263 E3M10000027G08 Enterococcus faecalis
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386 E3M10000030D10 Enterococcus faecalis
387 E3M10000030D12 Enterococcus faecalis
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389 E3M10000030E02 Enterococcus faecalis
390 E3M10000030E04 Enterococcus faecalis
391 E3M10000030E08 Enterococcus faecalis
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1006 E3M10000043A05 Enterococcus faecalis
1007 E3M10000043A08 Enterococcus faecalis
1008 E3M10000043A09 Enterococcus faecalis
1009 E3M10000043A10 Enterococcus faecalis
1010 E3M10000043A11 Enterococcus faecalis
1011 E3M10000043B01 Enterococcus faecalis
1012 E3M10000043B02 Enterococcus faecalis
1013 E3M10000043B03 Enterococcus faecalis
1014 E3M10000043B06 Enterococcus faecalis
1015 E3M10000043B08 Enterococcus faecalis
1016 E3M10000043B09 Enterococcus faecalis
1017 E3M10000043B10 Enterococcus faecalis
1018 E3M10000043B11 Enterococcus faecalis
1019 E3M10000043B12 Enterococcus faecalis
1020 E3M10000043C01 Enterococcus faecalis
1021 E3M10000043C08 Enterococcus faecalis
1022 E3M10000043C09 Enterococcus faecalis
1023 E3M10000043D01 Enterococcus faecalis
1024 E3M10000043D02 Enterococcus faecalis
1025 E3M10000043D09 Enterococcus faecalis
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1028 E3M10000043E03 Enterococcus faecalis
1029 E3M10000043E07 Enterococcus faecalis
1030 E3M10000043E08 Enterococcus faecalis
1031 E3M10000043E10 Enterococcus faecalis
1032 E3M10000043E11 Enterococcus faecalis
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1041 E3M10000043G05 Enterococcus faecalis
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1071 K1M10000030E07 Klebsiella pneumoniae
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[0440]
Table VIB
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(protein) SEQ ID NO
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[0441]
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[0442]
Table VII
SEQ ID NO: Candida
name
14111 CaYDL105W
14112 CaYJL090C
14113 CaYLR127C
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14136 CaYPL128C
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14462 CaYHR165C
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14772 CaYCR042C
14773 CaYMR235C
14774 CaYIL026C
14775 CaYPL085W
14776 CaYGR005C
14777 CaYOL144W
14778 CaYHR005C
14779 CaYGR013W
14780 CaYIL115C
14781 CaYGR147C
14782 CaYOR336W
14783 CaYPR159W
14784 CaYJL174W
14785 CaYOL130W
14786 CaYNL048W
14787 CaYER007W
14788 CaYGL106W
14789 CaYDL102W
14790 CaYDL007W
14791 CaYER031C
14792 CaYDR226W
14793 CaYOR349W
14794 CaYNL148C
14795 CaYPR119W
14796 CaYMR055C
14797 CaYFL018C
14798 CaYNL238W
14799 CaYPL231W
14800 CaYNL025C
14801 CaYJL141C
14802 CaYLR306W
14803 CaYLR300W
14804 CaYKL046C
14805 CaYDR311W
14806 CaYDR449C
14807 CaYER023W
14808 CaYGL040C
14809 CaYGR009C
14810 CaYNR003C
14811 CaYOL066C
14812 CaYOR119C
14813 CaYMR049C
14814 CaYNR050C
14815 CaYPL203W
14816 CaYER113C
14817 CaYOR280C
14818 CaYGR006W
14819 CaYJL122W
14820 CaORF6_3320
14821 CaORF6_7574
14822 CaORF6_6275
14823 CaORF6_1979
14824 CaORF6_8942
14825 CaYJL153C
14826 CaYNL277W
14827 CaYIL104C
14828 CaYOL027C
14829 CaYJL134W
14830 CaYLL012W
14831 CaORF6_7779
14832 CaORF6_3262
14833 CaORF6_7304
14834 CaORF6_2028
14835 CaORF6_1717
14836 CaORF6_1780
14837 CaORF6_1932
14838 CaORF6_1934
14839 CaORF6_2193
14840 CaORF6_2398
14841 orf6.3168
14842 orf6.3295
14843 orf6.3939
14844 orf6.4497
14845 orf6.4499
14846 orf6.4537
14847 orf6.4747
14848 orf6.4899
14849 orf6.4974
14850 orf6.5147
14851 orf6.5199
14852 orf6.5210
14853 orf6.5520
14854 orf6.569
14855 orf6.5739
14856 orf6.6011
14857 orf6.7375
14858 orf6.7629
14859 orf6.8025
14860 orf6.804
14861 orf6.8362
14862 orf6.8377
14863 orf6.8395
14864 orf6.8482
14865 orf6.8837
14866 orf6.889
14867 orf6.8938
14868 orf6.9113
14869 CaLYS4
14870 CaTRP5
14871 CaPRO1
14872 CaPBS2
14873 CaYBL041W
14874 CaYBR170C
14875 CaYDR188W
14876 CaYGR098C
14877 CaYGR267C
14878 CaYGR274C
14879 CaYJL002C
14880 CaYKL125W
14881 CaYLL035W
14882 CaYPL016W
14883 CaYPL218W
14884 CaYKL141W
14885 CaYHR174W
14886 CaYDR356W
14887 CaYNL124W
14888 CaYAL015C
14889 CaYBR001C
14890 CaYCL035C
14891 CaYCR048W
14892 CaYDR379W
14893 CaYER059W
14894 CaYGR070W
14895 CaYGR209C
14896 orf6.1498
14897 orf6.2086
14898 orf6.3026
14899 orf6.3261
14900 orf6.3819
14901 orf6.3864
14902 orf6.3972
14903 orf6.4005
14904 orf6.4010
14905 orf6.4114
14906 orf6.4153
14907 orf6.4206
14908 orf6.4293
14909 orf6.4463
14910 orf6.4555
14911 orf6.4628
14912 orf6.4837
14913 orf6.4854
14914 orf6.4923
14915 orf6.4927
14916 orf6.5092
14917 orf6.5279
14918 orf6.5786
14919 orf6.5919
14920 orf6.5920
14921 orf6.6022
14922 orf6.6026
14923 orf6.6030
14924 orf6.6069
14925 orf6.6140
14926 orf6.6218
14927 orf6.6390
14928 orf6.6550
14929 orf6.6562
14930 orf6.6660
14931 orf6.6664
14932 orf6.6670
14933 orf6.6700
14934 orf6.6933
14935 orf6.6939
14936 orf6.7203
14937 orf6.7214
14938 orf6.7847
14939 orf6.7893
14940 orf6.8239
14941 orf6.8461
14942 orf6.8607
14943 orf6.8654
14944 orf6.8716
[Brief description of the drawings]
[0443]
1A and 1B illustrate one method of identifying amplification products that are under- or over-expressed in culture.
1A and 1B illustrate one method of identifying amplification products that are under- or over-expressed in culture.
FIGS. 2A and B illustrate another method of identifying amplification products that are under- or over-expressed in culture.
FIGS. 2A and 2B illustrate another method of identifying amplification products that are under- or over-expressed in culture.
FIG. 3 shows the results of a hybridization analysis in which the antisense nucleic acid expressed by the strain in culture is not complementary to all or part of the gene encoding the target of the compound (ie, non- Specific strain).
FIG. 4 shows the results of a hybridization analysis, wherein the antisense nucleic acid expressed by the strain in culture is complementary to all or part of the gene encoding the target of the compound, Hybridization intensity is closely correlated with compound concentration (ie, a particular strain).
FIG. 5A is a 5 ′ region homologous to the sequence 5 ′ of the native promoter in the chromosome, and a promoter to replace the chromosomal promoter, and homologous to the sequence 3 ′ of the native promoter in the chromosome. A method for replacing a promoter using a promoter replacement cassette containing a 3 ′ region will be described. B is a nucleic acid encoding a identifiable or selectable marker located between the 5 'region homologous to the sequence 5' of the native promoter and the promoter to replace the chromosomal promoter; A method for replacing a promoter using a promoter replacement cassette containing a transcription terminator 3 ′ of a gene encoding a marker or a selectable marker will be described.
FIGS. 6A and 6B show gene disruption of one allele of the gene (CaKRE9) and promoter replacement of the second allele of the target gene, and conditioning of the second allele by a heterologous promoter. Represents the GRACE method to be placed below.
FIGS. 6A and 6B show gene disruption of one allele of the gene (CaKRE9) and promoter replacement of the second allele of the target gene, and conditioning of the second allele by a heterologous promoter. Represents the GRACE method to be placed below.
FIG. 7A shows wild-type and CaHIS3 heterozygotes when compared to a CaHIS3 GRACE strain that constitutively expresses a tetracycline promoter-regulated imidazole glycerol phosphate dehydratase in the presence of inhibitory levels of 3-aminotriazole. Represents the growth of the strain. B shows wild-type, haploinsufficient CaHIS3 heterozygous strain and CaHIS3 GRACE strain constitutively expressing tetracycline promoter-regulated imidazole glycerol phosphate dehydratase in the presence of intermediate levels of 3-aminotriazole. Represents growth. C shows wild-type strains, haploinsufficient CaHIS3 heterozygous strains, and CaHIS3 GRACE strains that minimally express tetracycline promoter-regulated imidazole glycerol phosphate dehydratase in the presence of intermediate levels of 3-aminotriazole. Represents growth. D represents hypersensitivity of a CaHIS3 GRACE strain that minimally expresses tetracycline promoter-regulated imidazole glycerol phosphate dehydratase in the presence of intermediate levels of 3-aminotriazole.
FIG. 8 shows Northern blot analysis of CaHIS3, CaALR1, CaCDC24, and CaKRE9 mRNA isolated from GRACE strain to show increased expression under non-suppressed conditions.
FIG. 9 shows conditional gene expression using GRACE technology by KRE1, KRE5, KRE6, and KRE9.
FIG. 10 shows conditional gene expression using GRACE technology by CaKRE1, CaTUB1, CaALG7, CaAUR1, CaFKS1, and CaSAT2.
FIG. 11. Oligonucleotides containing a lac operator flanked by 40 nucleotides homologous to the promoter on each side, the yabB yabC ftsL ftsI murE gene in the operon for use in inserting the lac operator into the promoter. Indicates that the promoter drives the expression of
FIG. 12 shows a microtiter plate containing antibiotics and inducers at gradient concentrations in matrix format with a 10-fold excess.
FIG. 13 shows the results of an experiment demonstrating that at appropriate inducer concentrations, cells overexpressing the defB gene product were able to grow at high concentrations of the antibiotic actinonin.
FIG. 14 shows the results of experiments demonstrating that at appropriate inducer concentrations, cells overexpressing the foIA gene product were able to grow at high concentrations of the antibiotic trimethoprim.
FIG. 15. Overexpression of the fabI gene confers resistance to triclosan, which acts on the gene product of the fabI gene, but confers resistance to cerulenin, trimethoprim, or actinonin, each of which acts on other gene products. The result of the experiment which demonstrates that it does not do is shown.
FIG. 16. Overexpression of the fo1A gene confers resistance to trimethoprim, which acts on the gene product of the fo1A gene, but confers resistance to triclosan, cerulenin, or actinonin, each of which acts on other gene products. The result of the experiment which demonstrates that it does not do is shown.
FIG. 17. Overexpression of the defB gene confers resistance to actinonin, which acts on the gene product of the defB gene, but confers resistance to cerulenin, trimethoprim, or triclosan, each of which acts on other gene products. The result of the experiment which demonstrates that it does not do is shown.
FIG. 18. Triclosan overexpression of the fabB gene confers resistance to cerulenin, which acts on the gene product of the fabB gene, β-keto-acyl carrier protein synthase, each of which acts on other gene products. , Trimethoprim, or the results of experiments demonstrating that they do not confer resistance to actinonin.
FIG. 19: A mixture of nine strains has varying concentrations of inducers and sufficient concentrations of these antibiotics to inhibit the growth of strains that do not overexpress the target of actinonin, cerulenin, triclosan, or trimethoprim 5 shows the results of experiments grown in wells of a 96-well plate in media containing.

Claims (154)

生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 前記培養物は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない株を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the culture comprises at least one strain that does not overexpress a gene product that is essential for growth of the organism. 前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said strain overexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a regulatable promoter. 前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said strain overexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a constitutive promoter. 前記特定工程は、前記培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said identifying step comprises determining the nucleotide sequence of a nucleic acid encoding said gene product in said cells that have grown more rapidly in said culture. 前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the identifying step comprises performing an amplification reaction to identify a nucleic acid encoding the gene product in the cells that have grown more rapidly in the cell culture. 前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、請求項６に記載の方法。7. The method of claim 6, wherein the product of the amplification reaction is labeled with a detectable dye. 前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein said identifying step comprises performing a hybridization procedure. 前記特定工程は、前記細胞培養物中でより迅速に増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the identifying step comprises contacting a nucleic acid array with a nucleic acid encoding the gene product in the cell that has grown more rapidly in the cell culture. 前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa. 前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオ
フォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項１に記載の方法。The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea The method according to claim 1, wherein the method is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. 前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the compound is obtained from a library of natural compounds. 前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、請求項１に記載の方法。The method of claim 1, wherein the compound is obtained from a library of synthetic compounds. 前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, wherein the compound is present in a crude or incompletely purified state. 前記培養物中でより迅速に増殖した前記株における前記遺伝子産物が、少なくとも１つの他の生物においておいて相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。2. The method of claim 1, further comprising determining whether the gene product in the strain that grew more rapidly in the culture has a counterpart in at least one other organism. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for growth of the organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the gene product that is
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for growth of the organism, and selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5916 to 10012, and 14111 to 14944. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Obtaining a culture containing a strain that overexpresses a gene product comprising the amino acid sequence,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、かつ配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism and comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for the gene product to be selected, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising Consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from: A gene product encoded by a nucleic acid which hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795, from a group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions Activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid containing the selected nucleotide sequence and a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 Group consisting of gene products that can be To obtain a culture containing strains overexpressing the gene product al selected,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a given nucleotide sequence, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of -4860, 5916-10012, and 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under moderate conditions. and Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence hybridizing to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 4111-14944 thing,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Obtaining a culture containing a strain overexpressing a gene product containing a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grows more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that overexpresses the strain in the culture more rapidly. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する、固体成長培地上の株のアレイを得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記株のアレイを接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining an array of strains on a solid growth medium, overexpressing various gene products essential for the growth of said organism;
Contacting the array of strains with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, to overexpress the gene product on which the compound acts A method comprising growing a strain more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product overexpressed by the strain that grew faster in the culture. 前記アレイ中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、請求項２１に記載の方法。22. The method of claim 21, wherein at least one strain in the array does not overexpress a gene product that is essential for growth of the organism. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記複数の培養物のそれぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖が阻害される株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a plurality of cultures containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism,
A method comprising contacting each of the plurality of cultures with a varying concentration of the compound, and identifying a gene product that overexpresses a strain whose growth is inhibited by the compound. 前記複数の培養物における少なくとも１つの株が、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過剰発現しない、請求項２３に記載の方法。24. The method of claim 23, wherein at least one strain in said plurality of cultures does not overexpress a gene product that is essential for growth of said organism. 化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で請求項１に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で請求項１に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。A method for profiling the activity of a compound, comprising:
Performing the method of claim 1 on a first culture with a first compound;
Performing the method of claim 1 on a second culture with a second compound; and identifying the strain identified in the first culture with the second culture. A method comprising comparing to a strain. 第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、および
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。A method for profiling the activity of a first compound, comprising:
An array of strains, including strains that overexpress various gene products essential for the growth of an organism, on a first solid medium containing the first compound that inhibits the growth of the organism, and growth of the organism Growing on a second solid medium containing a second compound that inhibits the growth of the strain on the second solid medium, and the pattern of the strain grown on the first solid medium is the same as the pattern of the strain grown on the second solid medium. A method that includes comparing. 前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項２６または２７に記載の方法。28. The method according to claim 26 or claim 27, wherein the first compound is present in a crude or incompletely purified state. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 前記培養物中の少なくとも１つの株は、前記生物の増殖に必須である遺伝子産物を過小発現しない、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein at least one strain in the culture does not underexpress a gene product that is essential for growth of the organism. 前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部に相補的な核酸を含む、請求項２９に記載の方法。The strain underexpressing the gene product comprises a nucleic acid complementary to at least a portion of the gene encoding the gene product that is essential for growth of the organism, operably linked to a regulatable promoter. Item 30. The method according to Item 29. 前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする遺伝子の少なくとも一部と相補的なアンチセンス核酸を発現し、前記アンチセンス核酸の発現により、前記株における前記遺伝子産物の発現が低下する、請求項２９に記載の方法。The strain underexpressing the gene product expresses an antisense nucleic acid complementary to at least a part of a gene encoding the gene product that is essential for growth of the organism, and the expression of the antisense nucleic acid 30. The method of claim 29, wherein expression of said gene product in the strain is reduced. 前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物をコードする核酸のヌクレオチド配列を決定することを含む、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein said identifying step comprises determining the nucleotide sequence of a nucleic acid encoding said gene product in said more slowly growing strain. 前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸を特定するための増幅反応を実施することを含む、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein the identifying step comprises performing an amplification reaction to identify a nucleic acid encoding the gene product in the slower growing cells. 前記増幅反応の産物は、検出可能な色素で標識される、請求項３４に記載の方法。35. The method of claim 34, wherein the products of the amplification reaction are labeled with a detectable dye. 前記特定工程は、ハイブリダイゼーション手順を実施することを含む、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein said identifying step comprises performing a hybridization procedure. 前記特定工程は、よりゆっくりと増殖した前記細胞における前記遺伝子産物をコードする核酸と、核酸アレイを接触させることを含む、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein said identifying step comprises contacting a nucleic acid array with a nucleic acid encoding said gene product in said more slowly growing cells. 前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa. 前記化合物は、天然化合物のライブラリーから得られる、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein the compound is obtained from a library of natural compounds. 前記化合物は、合成化合物のライブラリーから得られる、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein said compound is obtained from a library of synthetic compounds. 前記化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, wherein said compound is present in a crude or incompletely purified state. 前記培養物中でよりゆっくりと増殖した前記株における前記遺伝子産物が少なくとも１つの他の生物において相当する物を有するかどうかを決定することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。30. The method of claim 29, further comprising determining whether the gene product in the strain that grew more slowly in the culture has a counterpart in at least one other organism. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of said organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising the amino acid sequence,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by the containing antisense nucleic acid A gene product, the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions The activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid containing the nucleotide sequence to be synthesized, and a gene product whose activity is inhibited by the nucleic acid containing the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. From the group of gene products To obtain a culture containing strains under-express the gene product-option,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture containing a strain that underexpresses various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity to a nucleotide sequence as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, under stringent conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806- A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of 4860, 5916-10012, and 14111-14944; and, under moderate conditions, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14 Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 11-14944; thing,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grows more slowly than a strain that does not underexpress the gene product on which the compound acts, and identifying a gene product that is underexpressed by a strain that grows more slowly in the culture. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
種々の濃度の前記化合物と、前記培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a plurality of cultures containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism,
A method comprising contacting each of said cultures with said compound at various concentrations, and identifying a gene product that underexpresses a strain whose growth rate is reduced by said compound. 化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
第１の化合物を用いて第１の培養物上で請求項２９に記載の方法を実施すること、
第２の化合物を用いて第２の培養物上で請求項２９に記載の方法を実施すること、および
前記第１の培養物で特定された株を、前記第２の培養物で特定された株と比較することを含む方法。A method for profiling the activity of a compound, comprising:
Performing the method of claim 29 on a first culture with a first compound;
30. Performing the method of claim 29 on a second culture with a second compound, and identifying the strain identified in the first culture in the second culture. A method comprising comparing to a strain. 第１の化合物の活性をプロファイリングする方法であって、
生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む株のアレイを、前記生物の増殖を阻害する前記第１の化合物を含む第１の固体培地上で、および前記生物の増殖を阻害する第２の化合物を含む第２の固体培地上で成長させること、
前記第１の固体培地上で成長した株のパターンを、前記第２の固体培地上で成長した株のパターンと比較すること
を含む方法。A method for profiling the activity of a first compound, comprising:
An array of strains comprising a plurality of strains that underexpress various gene products that are essential for the growth of an organism, on a first solid medium containing the first compound that inhibits the growth of the organism, and Growing on a second solid medium comprising a second compound that inhibits growth;
A method comprising comparing the pattern of strains grown on said first solid medium to the pattern of strains grown on said second solid medium. 前記第１の化合物は、粗製状態または不完全な精製状態で存在する、請求項４９または５０に記載の方法。51. The method of claim 49 or 50, wherein the first compound is present in a crude or incompletely purified state. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物を複数得ること、
前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物の発現レベルを調節する様々な濃度の調節剤と、前記複数の培養物それぞれを接触させること、および
前記化合物により増殖速度が低減される株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a plurality of cultures containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism,
Contacting each of the plurality of cultures with various concentrations of a regulator that regulates the level of expression of the gene product that is essential for growth of the organism, and underexpressing a strain whose growth rate is reduced by the compound A method comprising identifying a gene product to be expressed. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物。A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism. 前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項５４に記載の培養物。55. The culture of claim 54, wherein said strain overexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a regulatable promoter. 前記遺伝子産物を過剰発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項５４に記載の培養物。55. The culture of claim 54, wherein said strain overexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a constitutive promoter. 前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項５４に記載の培養物。The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea 55. The culture of claim 54, wherein the culture is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for growth of the organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A culture comprising a strain that overexpresses a gene product. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A culture comprising a strain that overexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. A culture comprising a strain that overexpresses a gene product comprising the amino acid sequence. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by the containing antisense nucleic acid A gene product, the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions The activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid containing the nucleotide sequence to be synthesized, and a gene product whose activity is inhibited by the nucleic acid containing the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. From the group of gene products Culture containing strains overexpressing the gene product-option. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。A culture comprising a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of said organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a nucleotide sequence, SEQ ID NOS: 3796-3800, 3806 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of -4860, 5916-10012, and 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under moderate conditions. and Culture containing strains overexpressing the gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 4,111 to 14,944. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物。A culture containing a plurality of strains overexpressing various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 A culture comprising a strain overexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of: 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物。A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism. 前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、調節可能なプロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項６４に記載の培養物。65. The culture of claim 64, wherein said strain that underexpresses said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a regulatable promoter. 前記遺伝子産物を過小発現する前記株は、構成的プロモーターに作動可能に連結される前記生物の増殖に必須である前記遺伝子産物をコードする核酸を含む、請求項６４に記載の培養物。65. The culture of claim 64, wherein said strain underexpressing said gene product comprises a nucleic acid encoding said gene product that is essential for growth of said organism, operably linked to a constitutive promoter. 前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項６４に記載の培養物。The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea 65. The culture of claim 64, wherein the culture is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of said organism, wherein the activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A culture comprising a strain that underexpresses a gene product. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A culture comprising a strain that underexpresses the gene product encoded by the nucleic acid comprising the nucleotide sequence. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. A culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising the amino acid sequence. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by the containing antisense nucleic acid A gene product, the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions The activity is complemented by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid containing the nucleotide sequence to be synthesized, and a gene product whose activity is inhibited by the nucleic acid containing the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. From the group of gene products Culture containing strains under-express the gene product-option. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a given nucleotide sequence, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of -4860, 5916-10012, and 14111-14944; and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 under moderate conditions. and Culture containing strains under-express the gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 4,111 to 14,944. 前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物。A culture containing a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the culture is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 A culture comprising a strain that underexpresses a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of: 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含み、、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A plurality of strains that overexpress various gene products that are essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes produces a unique product corresponding to each of the overexpressed genes. Obtaining a culture that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is overexpressed. 過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、請求項７４に記載の方法。75. The method of claim 74, wherein the nucleotide sequence of each of the genes encoding the overexpressed gene product has been altered by replacing the native promoter of the gene with a promoter that promotes overexpression of the gene product. 過剰発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過剰発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、請求項７４に記載の方法。75. The nucleotide sequence of each of the genes encoding the overexpressed gene product has been altered by inserting into the native promoter of the gene a regulatory element having a promoter that promotes overexpression of the gene product. The method described in. 前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、請求項７６に記載の方法。The regulatory element is a group consisting of a regulatable promoter, an operator recognized by a repressor, a nucleotide sequence recognized by a transcription activator, a transcription terminator, a nucleotide sequence that introduces a bend into DNA, and an upstream activation sequence. 77. The method of claim 76, wherein the method is selected from: 前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、請求項７４に記載の方法。Identifying the gene product overexpressed by the strain that grew more rapidly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene, performing an amplification reaction; and 75. The method of claim 74, comprising detecting a corresponding unique amplification product. 増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、請求項７５に記載の方法。76. The method of claim 75, wherein the native promoter of each of the genes encoding the gene products essential for growth has been replaced with the same promoter. 増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望の発現レベルで発現されるように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、請求項７５に記載の方法。76. The method of claim 75, wherein the native promoter for each of the genes encoding the gene products essential for growth is replaced with a plurality of promoters selected such that each gene product is expressed at the desired expression level. 各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、請求項７５に記載の方法。78. The method of claim 75, wherein said promoter replacing the native promoter in each strain comprises a regulatable promoter. 各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、請求項７５に記載の方法。76. The method of claim 75, wherein said promoter replacing the native promoter in each strain comprises a constitutive promoter. 前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。75. The method of claim 74, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa. 前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項７４に記載の方法。The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea 75. The method of claim 74, wherein the method is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Overexpressing a gene product that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product and that is inhibited in activity or level by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Obtaining a culture comprising the strain,
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is overexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product and that is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the encoded gene product;
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is overexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物を得ることであって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
Obtaining a culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of said organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes corresponds to each of the overexpressed genes. The amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, 14945-15778. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses the gene product,
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is overexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. For a gene product that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product and that is inhibited from expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, Expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide product selected from the group consisting of a gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 8-3795. Default parameters for the nucleic acid encoding the gene product to be inhibited An antisense comprising a nucleotide product selected from the group consisting of: a gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 For a gene product whose expression is inhibited by a nucleic acid, a gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, under stringent conditions, SEQ ID NOS: 8- A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 3795, to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions; Encoded by the hybridizing nucleic acid Overexpression of a gene product selected from the group consisting of a gene product whose activity is complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 Obtaining a culture containing the strain
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is overexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Obtaining a culture that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product;
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more rapidly than a strain that does not overexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is overexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過剰発現する株を複数含む培養物であって、該過剰発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更され、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過剰発現しない株よりも迅速に増殖させること、および
前記遺伝子に相当する該特有の産物を検出することにより、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現する株を含む培養物中で、より迅速に増殖した株が過剰発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that overexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the overexpressed genes has a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. To a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product; A nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, under stringent conditions And from 1411-14944 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under moderate conditions. Obtaining a culture comprising a strain that overexpresses a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to the sequence;
A strain that contacts the compound with the culture at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that does not overexpress the gene product on which the compound acts, and overexpresses the gene product on which the compound acts Are grown more rapidly than strains that do not overexpress the gene product on which the compound acts, and by detecting the unique product corresponding to the gene, SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013 Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, to a polypeptide selected from the group consisting of -14141 and 14945-15778, and SEQ ID NOs: 3801-3805 , 4861-5915, 10013-14110, and 149 Grew more rapidly in cultures containing strains overexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of 5-15778. A method comprising identifying a gene product whose strain is overexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されている培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Obtaining a culture that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product;
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more slowly than a strain that did not underexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is underexpressed. 過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターを、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターで置き換えることにより変更されている、請求項９１に記載の方法。92. The method of claim 91, wherein the nucleotide sequence of each of the genes encoding the under-expressed gene product has been altered by replacing the native promoter of the gene with a promoter that promotes under-expression of the gene product. 過小発現される遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、前記遺伝子の天然プロモーターに、前記遺伝子産物の過小発現を促進するプロモーターを有する調節要素を挿入することにより変更されている、請求項９１に記載の方法。92. The nucleotide sequence of each of the genes encoding the underexpressed gene product has been altered by inserting into the native promoter of the gene a regulatory element having a promoter that promotes underexpression of the gene product. The method described in. 前記調節要素は、調節可能なプロモーター、レプレッサにより認識されるオペレーター、転写活性化因子により認識されるヌクレオチド配列、転写終結因子、ＤＮＡ中に屈曲を導入するヌクレオチド配列、および上流活性化配列からなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。The regulatory element is a group consisting of a regulatable promoter, an operator recognized by a repressor, a nucleotide sequence recognized by a transcription activator, a transcription terminator, a nucleotide sequence that introduces a bend into DNA, and an upstream activation sequence. 94. The method of claim 93, wherein the method is selected from: 前記遺伝子に対応する前記特有の産物を検出することにより、前記培養物中でよりゆっくりと増殖した株が過小発現する前記遺伝子産物を特定する工程は、増幅反応を実施すること、および前記遺伝子に対応する特有の増幅産物を検出することを含む、請求項９１に記載の方法。Identifying the gene product underexpressed by a strain that grew more slowly in the culture by detecting the unique product corresponding to the gene, performing an amplification reaction; and 92. The method of claim 91, comprising detecting a corresponding unique amplification product. 増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じプロモーターで置き換えられている、請求項９２に記載の方法。93. The method of claim 92, wherein the native promoter of each of the genes encoding the gene products essential for growth has been replaced with the same promoter. 増殖に必須の遺伝子産物をコードする遺伝子それぞれの天然プロモーターは、各遺伝子産物が所望のレベルで発現するように選択された複数のプロモーターで置き換えられている、請求項９２に記載の方法。93. The method of claim 92, wherein the native promoter of each of the genes encoding the gene products essential for growth has been replaced by a plurality of promoters selected such that each gene product is expressed at the desired level. 各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、調節可能なプロモーターを含む、請求項９２に記載の方法。93. The method of claim 92, wherein said promoter replacing the native promoter in each strain comprises a regulatable promoter. 各株において天然プロモーターを置き換えた前記プロモーターは、構成的プロモーターを含む、請求項９２に記載の方法。93. The method of claim 92, wherein said promoter replacing the native promoter in each strain comprises a constitutive promoter. 前記生物は、細菌、真菌、および原生動物からなる群から選択される、請求項９１に記
載の方法。92. The method of claim 91, wherein said organism is selected from the group consisting of bacteria, fungi, and protozoa. 前記培養物は、アナプラスマ・マージナーレ、アスペルギルス・フミガーツス、バチルス・アンスラシス、バクテロイド・フラギリス、ボルデテラ・ペルタスシス、ブルクホルデリア・セパシア、カンピロバクター・ジェジュニ、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・グラブラタ（トルロプシス・グラブラタとも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・ギリエルモンジイ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ケフィア（カンジダ・シュードトロピカリスとも呼ばれる）、カンジダ・ドゥビリニエンシス、クラミジア・ニューモニエ、クラミジア・トラコマタス、クロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシレ、クロストリジウム・パーフリンゲンス、コクシジオデス・イムミチス、コリネバクテリウム・ジフテリア、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、エンテロバクター・クロアカエ、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エシェリヒア・コリ、ヘモフィリス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、ヒストプラスマ・カプスラツム、クレブシエラ・ニューモニアエ、リステリア・モノシトゲネス、マイコバクテリウム・レプラ、マイコバクテリウム・ツベクローシス、ネイセリア・ゴナホエア、ネイセリア・メニンジチジス、ノカルジア・アステロイデス、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、ニューモシスティス・カリーニー、プロテウス・ブルガリス、シュードモナス・エルギノーザ、サルモネラ・ボンゴリ、サルモネラ・コレラシス、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・パラティフィ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・タフィマリアム、スタフィロコッカス・アウレウス、モラクセラ・カタルハリス、シゲラ・ボイディ、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスナー、シゲラ・ゾンネ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・ニューモニアエ、ストレプトコッカス・ムタンス、トレポネーマ・パリダム、エルシニア・エンテロコリチカ、およびエルシニア・ペスチスからなる群から選択される生物の培養物である、請求項９１に記載の方法。The culture may be called Anaplasma marginale, Aspergillus fumigatus, Bacillus anthracis, Bacteroid fragilis, Bordetella pertussis, Burgholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Candida glabrata (also referred to as Torulopsis glabrata). Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida gilielmonzi, Candida cruisia, Candida kefir (also known as Candida pseudotropicalis), Candida duviriniensis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatas, Clostridium botulinum Difficile, Clostridium perfringens, Coccidiodes immitis, Ko Nebacterium diphtheria, Cryptococcus neoformans, Enterobacter cloacae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilis influenza, Helicobacter pylori, Histoplasma capsatum, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes Lepra, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonahoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Pneumocystis curinii, Proteus bulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella bongo Cholerasis, salmonella enterica, Lumonella Paratifi, Salmonella Tifi, Salmonella Tafimariam, Staphylococcus aureus, Moraxella Catarrhalis, Shigera Boidi, Shigera Disentelier, Shigera Flexner, Shigera Sonne, Staphylococcus epidermidis, Staphylocea 92. The method of claim 91, wherein the method is a culture of an organism selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Treponema pallidum, Yersinia enterocolitica, and Yersinia pestis. 前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過小発現する株を含む、請求項９１に記載の方法。92. The method of claim 91, wherein said culture comprises a strain that underexpresses a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. Has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product, including a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product encoded by the nucleic acid,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more slowly than a strain that did not underexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A gene that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to generate a product, and that comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, 14945-15778. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the product,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more slowly than a strain that did not underexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A gene product that has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce the product, and that is inhibited from expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product selected from the group consisting of gene products having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Gene products whose expression is inhibited by antisense nucleic acids containing Gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for the nucleic acid to load, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters, to a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under mild conditions, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 under moderate conditions A nucleus containing the selected nucleotide sequence And a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795. Obtaining a culture comprising a strain that underexpresses the gene product of choice,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more slowly than a strain that did not underexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに相当する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過小発現される株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定することを含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for the growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique sequence corresponding to each of the overexpressed genes. It has been modified to include a nucleotide sequence that can be used to produce a product, wherein the nucleotide sequence is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, under stringent conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of 5916-10012, and 14111-14944, and under moderate conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111- Obtaining a culture comprising a strain in which a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence hybridizing to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14944 is underexpressed ,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more slowly than a strain that did not underexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物が作用する遺伝子産物を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必須である種々の遺伝子産物を過小発現する株を複数含む培養物であって、該過小発現された遺伝子それぞれのヌクレオチド配列は、該過剰発現された遺伝子それぞれに対応する特有の産物を生成するのに使用され得るヌクレオチド配列を包含するように変更されており、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過小発現する株を含む培養物を得ること、
前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する前記生物の株の増殖を阻害するのに十分な濃度の前記化合物と前記培養物を接触させ、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現する株を、前記化合物が作用する前記遺伝子産物を過小発現しない株よりもゆっくりと増殖させること、および
前記遺伝子に対応する該特有の産物を検出することにより、前記培養物中でより迅速に増殖した株が過小発現する遺伝子産物を特定すること
を含む方法。A method for identifying a gene product on which a compound that inhibits the growth of an organism acts,
A culture comprising a plurality of strains that underexpress various gene products essential for growth of the organism, wherein the nucleotide sequence of each of the underexpressed genes is a unique nucleotide sequence corresponding to each of the overexpressed genes. A polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78, and selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 Activated by the polypeptide To obtain a culture containing strains under-expresses the gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of the polypeptides can be supplemented,
A strain that contacts the culture with the compound at a concentration sufficient to inhibit the growth of a strain of the organism that underexpresses the gene product on which the compound acts, and underexpresses the gene product on which the compound acts. A strain that grew more rapidly in the culture by growing it more slowly than a strain that did not underexpress the gene product on which the compound acts and detecting the unique product corresponding to the gene. Identifying a gene product that is underexpressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む株の培養物または収集物から核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample containing nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction described above, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction. 前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、請求項１０８に記載の方法。109. The method of claim 108, wherein one of the members of each primer pair for each of the genes is labeled with a detectable dye. 前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、請求項１０８に記載の方法。The nucleic acid sample is divided into N aliquots, and the amplification reaction is performed using each primer pair complementary to a nucleotide sequence within 1 / N of or flanking 1 / N of the gene encoding the gene product. 109. The method of claim 108, performed in aliquots, wherein one of said members of each primer pair in each aliquot is labeled with a dye, and wherein said dyes in said primers in each aliquot are distinguishable from each other. 増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。110. The method of claim 109, further comprising pooling amplification products from each of the aliquots before determining the length of the amplification products. 前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられ、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１０８に記載の方法。108. The native promoter of the gene encoding the gene product is replaced with a regulatable promoter, and one of the primers in the primer pair is complementary to a nucleotide sequence within the regulatable promoter. The method described in. それぞれの前記遺伝子に関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、請求項１１１に記載の方法。112. The method of claim 111, wherein the native promoter for each of said genes has been replaced with the same regulatable promoter. 複数の調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、請求項１１１に記載の方法。112. The method of claim 111, wherein a plurality of regulatable promoters are used to replace the promoter of the gene, and wherein some of the genes are under the control of various regulatable promoters. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, wherein said nucleic acid comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection comprising a strain that over- or under-expresses a gene product whose activity or level is inhibited by
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction,
A method comprising determining the length of an amplification product obtained in the amplification reaction. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111- Obtaining a nucleic acid sample comprising a nucleic acid from a culture or collection comprising a strain overexpressing or underexpressing a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14944;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction described above, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945. Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection comprising a strain that over- or under-expresses a gene product comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of 15778;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction described above, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection containing a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising an antiserum containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by a sense nucleic acid, the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 At least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from: Product and sequence encoded by nucleic acid having Nos. 8 to 3795 for gene products whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of at least 25% amino acids as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters A gene product having identity, a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795; The activity is inhibited by a gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of 8-3795, and a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 Activity complemented by gene products From the culture, or collection includes strains that over- or under-express a gene product selected from the group consisting of the gene product obtained, to obtain a nucleic acid sample comprising nucleic acids,
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to yield an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction,
A method comprising determining the length of an amplification product obtained in the amplification reaction. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111- A nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for a nucleotide sequence selected from the group consisting of 14944, under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944, and SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806 under moderate conditions ~ 4860, Overexpression or underexpression of a gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleotide sequence hybridizing to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 916-10012, and 14111-14944 Obtaining a nucleic acid sample containing nucleic acids from a culture or collection containing the strain
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction described above, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む培養物または収集物であって、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドによりその活性が相補され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
A culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for the growth of said organism, comprising: SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945. A polypeptide having at least 25% amino acid identity, as determined using FASTA version 3.0t78, to a polypeptide selected from the group consisting of 15778, and SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013 Culture comprising a strain overexpressing or underexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activities can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of -14110 and 14945-15778 Or from the collection To obtain a non-nucleic acid sample,
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the pair of primer pairs comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain containing the sequence is present in a culture or collection of the strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction described above, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の培養物または収集物であって、前記化合物と接触させられている第１の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられていない第２の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に対応する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと
を含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A first culture or collection comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of said organism, wherein said first culture or collection has been contacted with said compound; Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the collection;
A second culture or collection comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said second culture or collection comprises a nucleic acid from a second culture or collection that has not been contacted with said compound. Obtaining a nucleic acid sample of 2,
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set used in the first amplification reaction, and performing each amplification in the first amplification reaction By comparing the amount of the product with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, an increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction corresponds to the amplification product. Indicating that the culture or strain is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene, and a decrease in the level of the amplified product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction is A method wherein the gene product corresponding to the amplification product indicates that the culture or strain overexpresses the gene is a target for the compound. 前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、請求項１２１に記載の方法。122. The method of claim 121, wherein one of the members of each primer pair for each of the genes is labeled with a detectable dye. 前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対中のプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１２１に記載の方法。The native promoter of the gene encoding the gene product has been replaced by a regulatable promoter, and one of the primers in the primer pair is complementary to a nucleotide sequence within the regulatable promoter. 121. The method according to item 121. 前記遺伝子それぞれの天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、請求項１２１に記載の方法。122. The method of claim 121, wherein the native promoter of each of the genes has been replaced with the same regulatable promoter. 前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換え、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においた、請求項１２１に記載の方法。122. The method of claim 121, wherein the more than one regulatable promoter is used to replace the promoter of the gene, and some of the genes are under the control of various regulatable promoters. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a strain that over- or under-expresses various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the object or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said culture or collection of a second strain was not contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same set of primer pairs used in the first amplification reaction, and determining the amount of each amplification product in the first amplification reaction. By comparing with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, the increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction indicates that the gene product corresponding to the amplification product is: The culture or strain indicates that it is a target of the compound when the gene is overexpressed, and a decrease in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction indicates that the amplification product A corresponding gene product, indicating that the culture or strain overexpresses the gene is a target of the compound;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains may be overexpressed or have a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A method comprising a strain that is underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記第２の株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用した同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the culture or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of the first strain, wherein the culture or collection of the second strain is not contacted with the compound. Obtaining a second nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of the second strain obtained.
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same set of primer pairs used in the first amplification reaction, and determining the amount of each amplification product in the first amplification reaction. By comparing with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, an increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction with respect to the second amplification reaction indicates that a gene product corresponding to the amplification product is: The culture or strain indicates that it is a target of the compound when overexpressing the gene product, and a decrease in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction is indicative of the amplification product Indicating that the culture or strain is a target for the compound when the culture or strain overexpresses the gene product,
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains is a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A method comprising comparing, comprising strains in which the encoded gene product is over- or under-expressed. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同一のプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む、比較することを含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the culture or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said culture or collection of a second strain was not contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same pair of primer pairs as the pair of primer pairs used in the first amplification reaction; and performing each of the first amplification reaction. By comparing the amount of the amplification product with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, an increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction will The corresponding gene product indicates that the culture or strain is a target of the compound if the gene product is overexpressed, and the level of amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction A decrease indicating that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains is a gene product comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. Comprises a strain in which is overexpressed or underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過剰発現される株を含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain was not contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of the first strain, wherein the nucleic acid is obtained from a culture or collection of the second strain that has been contacted with the compound. Obtaining a second nucleic acid sample comprising:
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set used in the first amplification reaction, and performing each amplification in the first amplification reaction By comparing the amount of the product with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, an increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction corresponds to the amplification product. Indicates that the culture or strain is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene, and a decrease in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction is Indicating that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the cultures or collections of the first and second strains are prepared based on a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795 Expression by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide product selected from the group consisting of a gene product having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOs: 8-3795. For a nucleic acid encoding a gene product to be inhibited, a gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, SEQ ID NOS: 8- A nucleotide sequence selected from the group consisting of 3795 A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid; A gene product encoded by a nucleic acid that hybridizes to a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 under moderate conditions. And a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOS: 8 to 3795, and a gene product which is encoded by a nucleic acid which hybridizes to the containing nucleic acid. Overproduction of gene products selected from the group Or overexpressed method comprising strains are. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記株の培養物または収集物は、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物、から核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株が前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the culture or collection of the strain comprises the compound Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of the first strain contacted with
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein the culture or collection of a second strain that has not been contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set used in the first amplification reaction, and performing each amplification in the first amplification reaction By comparing the amount of the product with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, an increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction corresponds to the amplification product. Indicates that the culture or strain is a target of the compound if the culture or strain overexpresses the gene, and a decrease in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction is Indicating that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the culture or collection of the first and second strains has a default sequence with respect to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 and 14111-14944. A gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 as a parameter; A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes under conditions to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 and 14111-14944; and, under moderate conditions, SEQ ID NOs: 3796-3800 , 38 6～4860,5916～10012 and methods including strains nucleic acid comprising a nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 14,111 to 14,944 is overexpressed or underexpressed. 生物の増殖を阻害する化合物の標的を特定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する株を複数含む第１の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられた第１の株の培養物または収集物から、核酸を含む第１の核酸試料を得ること、
前記第１の株の培養物または収集物と同じ株を含む第２の株の培養物または収集物であって、前記化合物を接触させられなかった第２の株の培養物または収集物から、核酸を含む第２の核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた、前記第１の核酸試料の第１の増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記第１の増幅反応で使用したプライマー対の組と同じプライマー対の組を用いて、前記第２の核酸試料の第２の増幅反応を実施すること、および
前記第１の増幅反応における各増幅産物の量を、前記第２の増幅反応における該増幅産物の量と比較することにより、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの増加は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示し、前記第２の増幅反応に対する前記第１の増幅反応における増幅産物のレベルの減少は、前記増幅産物に相当する遺伝子産物が、前記培養物または株は前記遺伝子産物を過剰発現する場合に前記化合物の標的であることを示すこと、
を含む方法であって、
ここで、前記第１および第２の株の培養物または収集物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method for identifying a target of a compound that inhibits growth of an organism, comprising:
A culture or collection of a first strain comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism, wherein the first strain has been contacted with the compound. Obtaining a first nucleic acid sample comprising nucleic acids from the culture or collection;
A culture or collection of a second strain comprising the same strain as the culture or collection of said first strain, wherein said culture or collection of a second strain was not contacted with said compound; Obtaining a second nucleic acid sample containing nucleic acids;
A first amplification reaction of the first nucleic acid sample using a set of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the first amplification reaction comprises: The members are such that each primer pair is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair when a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair is present in a culture or collection of the strain. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product having
Performing a second amplification reaction of the second nucleic acid sample using the same primer pair set used in the first amplification reaction, and performing each amplification in the first amplification reaction By comparing the amount of the product with the amount of the amplification product in the second amplification reaction, an increase in the level of the amplification product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction corresponds to the amplification product. Indicating that the culture or strain is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene, and a decrease in the level of the amplified product in the first amplification reaction relative to the second amplification reaction is Indicating that the gene product corresponding to the amplification product is a target of the compound when the culture or strain overexpresses the gene product;
A method comprising:
Here, the cultures or collections of the first and second strains are prepared by FASTA against a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. A polypeptide having at least 25% amino acid identity as determined using version 3.0t78, and a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778 A method comprising a strain in which a gene product containing a polypeptide selected from the group consisting of polypeptides whose activity can be complemented by the gene is over- or under-expressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増殖反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein the members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction that has been performed, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction. 前記遺伝子それぞれのためのの各プライマー対の成員の１つは、検出可能な色素で標識される、請求項１３２に記載の方法。133. The method of claim 132, wherein one of the members of each primer pair for each of the genes is labeled with a detectable dye. 前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、請求項１３２に記載の方法。The nucleic acid sample is divided into N aliquots;
The amplification reaction is performed in each aliquot using a primer pair complementary to the nucleotide sequence within 1 / N of or flanking the 1 / N of the gene encoding the gene product, and each primer in each aliquot is 133. The method of claim 132, wherein one of said members of the pair is labeled with a dye, and wherein said dye in said primer in each aliquot is distinguishable from each other. 増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、請求項１３４に記載の方法。135. The method of claim 134, further comprising pooling amplification products from each of said aliquots before determining the length of the amplification products. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains including a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein the members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of the amplification product from the other primer pair. Performing the amplification reaction being performed, and determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
The method wherein the culture comprises a strain in which a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 is over- or under-expressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, in the culture, a gene product encoded by a nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5916 to 10012, 14111 to 14944 is overexpressed or underexpressed. Methods involving strains. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the above-mentioned culture is a method comprising a strain in which a gene product containing an amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778 is overexpressed or underexpressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is performed using BLASTN version 2.0 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity, as determined, to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Expression by antisense nucleic acid A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for the gene product to be impaired, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 under stringent conditions A gene product encoded by the nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence, the nucleic acid hybridizing under moderate conditions to the nucleic acid comprising the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product selected from the group consisting of an encoded gene product and a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795; Including strains that are overexpressed or underexpressed . 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応を実施であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
Performing an amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein the members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing a specific nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair will produce an amplification product having a length that is distinguishable from the amplification product length from the other primer pair. Performing an amplification reaction designed for
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture was determined using BLASTN version 2.0 with default parameters for nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012 and 14111-14944. A gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleic acids comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity, under stringent conditions, SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806- A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of 4860, 5916-10012 and 14111-14944, and under moderate conditions SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 59 6-10012 and methods including strains nucleic acid comprising a nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence selected from the group consisting of from 14111 to 14944 is overexpressed or underexpressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物に相補的なアンチセンス核酸を転写する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記アンチセンス核酸をコードする核酸内または該核酸に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対の組を用いた増幅反応であって、前記プライマー対の組の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が他のプライマー対からの増幅産物の長さと識別可能な長さを有する増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物の長さを決定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that transcribe antisense nucleic acids complementary to various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a pair of primer pairs complementary to a nucleotide sequence within or adjacent to the nucleic acid encoding the antisense nucleic acid, wherein members of the pair of primer pairs are complementary to the pair of primers. When a strain containing the nucleotide sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is designed to produce an amplification product having a length that is distinguishable from the length of amplification products from other primer pairs. Performing the amplification reaction being performed,
Determining the length of the amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is determined by using FASTA version 3.0t78 for a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778. And a polypeptide whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110 and 14945-15778. A method comprising a strain in which a gene product comprising a polypeptide selected from: is overexpressed or underexpressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、および
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること
を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by the method, and identifying the amplification product obtained in said amplification reaction. 前記プライマー対は少なくとも２つの組に分けられ、各プライマー対は識別可能な色素で標識されるプライマーを含み、各プライマー対を標識するのに使用される前記識別可能な色素は、プライマー対の他の組を標識するのに使用される色素と識別可能である、請求項１４２に記載の方法。The primer pairs are divided into at least two sets, each primer pair including a primer labeled with a distinguishable dye, wherein the distinguishable dye used to label each primer pair is the other of the primer pair. 144. The method of claim 142, wherein the method is distinguishable from the dye used to label the set of. 前記核酸試料はＮのアリコットに分割され、
前記増幅反応は、前記遺伝子産物をコードする遺伝子の１／Ｎ内または該遺伝子の１／Ｎに隣接するヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて各アリコットで実施され、各アリコット中の各プライマー対の前記成員の１つは色素で標識され、各アリコット中の該プライマー中の該色素は互いに識別可能である、請求項１４２に記載の方法。The nucleic acid sample is divided into N aliquots;
The amplification reaction is performed in each aliquot using a primer pair complementary to a nucleotide sequence within 1 / N of or flanking the 1 / N of the gene encoding the gene product, and each primer in each aliquot is 144. The method of claim 142, wherein one of said members of the pair is labeled with a dye, and said dyes in said primer in each aliquot are distinguishable from each other. 増幅産物の長さを決定する前に、前記アリコットのそれぞれからの増幅産物をプールすることをさらに含む、請求項１４４に記載の方法。153. The method of claim 144, further comprising pooling amplification products from each of said aliquots before determining the length of the amplification products. 前記遺伝子産物をコードする前記遺伝子の天然プロモーターは、調節可能なプロモーターで置き換えられており、前記プライマー対のうちのプライマーの１つは、前記調節可能なプロモーター内のヌクレオチド配列に相補的である、請求項１４２に記載の方法。The native promoter of the gene encoding the gene product has been replaced by a regulatable promoter, and one of the primers of the primer pair is complementary to a nucleotide sequence within the regulatable promoter. 142. The method of claim 142. 前記遺伝子それぞれに関する天然プロモーターは、同じ調節可能なプロモーターで置き換えられている、請求項１４６に記載の方法。147. The method of claim 146, wherein the native promoter for each of said genes has been replaced with the same regulatable promoter. 前記１つより多い調節可能なプロモーターを用いて前記遺伝子のプロモーターを置き換えられており、前記遺伝子のいくつかを種々の調節可能なプロモーターの制御下においている、請求項１４６に記載の方法。149. The method of claim 146, wherein the more than one regulatable promoter has been used to replace the promoter of the gene, and some of the genes are under the control of various regulatable promoters. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群からの選択に基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性またはレベルが阻害される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. When present in a culture or collection of strains, each primer pair may have a length, a detectable label, and other primer pairs based on a selection from the group consisting of both length and detectable label. Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced;
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
The method wherein the culture comprises a strain in which a gene product whose activity or level is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795 is over- or under-expressed. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いて増幅反応を実施することであって、前記プライマー対の成員は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識、ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計される、実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１０〜１００１２および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
Performing an amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the members of the primer pair comprise nucleotides complementary to the primer pair. When a strain comprising the sequence is present in a culture or collection of said strain, each primer pair is selected from the group consisting of length, detectable label, and both length and detectable label. Is designed to produce an amplification product that is distinguishable from amplification products produced by other primer pairs based on
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, in the culture, a gene product encoded by a nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796 to 3800, 3806 to 4860, 5910 to 10012, and 1411 to 14944 is overexpressed or underexpressed. Methods involving strains. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子産物をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene product, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the above-mentioned culture is a method comprising a strain in which a gene product containing an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801 to 3805, 4861 to 5915, 10013 to 14110, and 14945 to 15778 is overexpressed or underexpressed. . 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物からの核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が阻害される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有する遺伝子産物、ストリンジェントな条件下で配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、中程度の条件下で配列番号８〜３７９５のからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が阻害される遺伝子産物により活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選択される遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is performed using BLASTN version 2.0 with default parameters for a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid containing a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795. A gene product having at least 70% nucleotide sequence identity, as determined, to a nucleic acid encoding a gene product whose expression is inhibited by an antisense nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product encoded by a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined using BLASTN version 2.0 with default parameters, a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. Expression by antisense nucleic acid A gene product having at least 25% amino acid identity as determined using FASTA version 3.0t78 with default parameters for the gene product to be impaired, from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795 under stringent conditions A gene product encoded by the nucleic acid that hybridizes to the nucleic acid comprising the selected nucleotide sequence, the nucleic acid hybridizing under moderate conditions to the nucleic acid comprising the nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8-3795. A gene product selected from the group consisting of an encoded gene product and a gene product whose activity can be complemented by a gene product whose activity is inhibited by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 8 to 3795; Including strains that are overexpressed or underexpressed . 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％ヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、緊縮条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択される配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および中程度の条件下で配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、および１４１１１〜１４９４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物が過剰発現または過小発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primer pairs, when present in a culture or collection of strains, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture uses BLASTN version 2.0 with default parameters for nucleotide sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. A nucleic acid comprising a nucleic acid having at least 70% nucleotide sequence identity as determined, to a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944 under stringent conditions. A nucleic acid comprising a nucleotide sequence that hybridizes and hybridizes under moderate conditions to a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3796-3800, 3806-4860, 5916-10012, and 14111-14944. Methods including strains gene product encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of a nucleic acid comprising a nucleotide sequence is overexpressed or underexpressed to. 複数の株それぞれが株の培養物または収集物中に存在する程度を決定する方法であって、
前記生物の増殖に必要とされる種々の遺伝子産物を過剰発現または過小発現する複数の株を含む株の培養物または収集物から、核酸を含む核酸試料を得ること、
前記遺伝子核酸をコードする遺伝子内または該遺伝子に隣接したヌクレオチド配列に相補的なプライマー対を用いてた増幅反応であって、前記プライマー対は、前記プライマー対に相補的なヌクレオチド配列を含む株が前記株の培養物または収集物中に存在する場合に、各プライマー対が長さ、検出可能な標識ならびに長さおよび検出可能な標識の両方からなる群から選択されることに基づいて他のプライマー対により生産される増幅産物と識別可能な増幅産物を生じるように設計されている増幅反応を実施すること、
前記増幅反応で得られる増幅産物を特定すること、
を含む方法であって、
ここで、前記培養物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％アミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０、および１４９４５〜１５７７８からなる群から選択されるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドを含む遺伝子産物が過剰発現される株を含む方法。A method of determining the degree to which each of a plurality of strains is present in a culture or collection of strains,
Obtaining a nucleic acid sample comprising nucleic acids from a culture or collection of strains comprising a plurality of strains that over- or under-express various gene products required for growth of the organism;
An amplification reaction using a primer pair complementary to a nucleotide sequence in or adjacent to the gene encoding the gene nucleic acid, wherein the primer pair is a strain containing a nucleotide sequence complementary to the primer pair. Other primers, when present in a culture or collection of the strain, based on each primer pair being selected from the group consisting of length, detectable label and both length and detectable label Performing an amplification reaction designed to produce an amplification product that is distinguishable from the amplification product produced by the pair;
Specifying an amplification product obtained in the amplification reaction,
A method comprising:
Here, the culture is determined using FASTA version 3.0t78 for a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. Polypeptides having at least 25% amino acid identity, and polypeptides whose activity can be complemented by a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3801-3805, 4861-5915, 10013-14110, and 14945-15778. A method comprising a strain overexpressing a gene product comprising a polypeptide selected from the group consisting of:
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