JP2004527202A - 新規ポリヌクレオチドおよびそれにコードされるポリペプチド - Google Patents

新規ポリヌクレオチドおよびそれにコードされるポリペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、単離されたＮＯＶＸポリペプチド、ならびにＮＯＶＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＮＯＶＸに免疫特異的に結合する抗体、またはＮＯＶＸポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体の任意の誘導体、改変体、変異体またはフラグメントを提供する。本発明はさらに、ＮＯＶＸポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が、広範な病理学的状態の検出および処置、ならびに他の用途に使用される方法を提供する。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、核酸およびそれらによってコードされるポリペプチド、ならびにそれらの核酸およびポリペプチドの使用方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
真核生物細胞は、膜によって複数の機能的に異なる区画に細分され、これらは、オルガネラと呼ばれている。各オルガネラは、その適切な機能について必須であるタンパク質を含む。これらのタンパク質は、しばしばソーティングシグナルと呼ばれる配列モチーフを含み得る。このソーティングシグナルは、適切な細胞オルガネラに対してそのタンパク質を標的化することを補助し得る。さらに、ソーティングシグナルは、いくつかのタンパク質が細胞外に搬出または分泌されることを指向する。
【０００３】
１つのタイプのソーティングシグナルは、シグナル配列（シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれている）である。このシグナル配列は、新たに合成されるポリペプチド鎖上にアミノ末端拡張として存在する。シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）と呼ばれる細胞内オルガネラへタンパク質を標的化する。
【０００４】
シグナル配列は、多くのタンパク質同士およびタンパク質−脂質の相互作用に関与し、これは、シグナル配列を含むポリペプチドを、ＥＲにおけるチャネルを介して転位させる。転位後、膜結合酵素（シグナルペプチダーゼと呼ばれる）は、成熟タンパク質をシグナル配列から遊離させる。
【０００５】
ＥＲは、膜結合タンパク質と分泌タンパク質とを、細胞質に残るタンパク質から分離するように機能する。一旦ＥＲに標的化されると、分泌および膜結合の両方のタンパク質は、ゴルジ装置と呼ばれる別の細胞オルガネラへとさらに再分配され得る。そのゴルジは、ベシクル、リソソーム、原形質膜、ミトコンドリアおよびマイクロボディのような他の細胞オルガネラに対してタンパク質を指向させる。
【０００６】
分泌タンパク質および膜結合タンパク質は、多くの生物学的に多様な活性に関与する。公知の分泌タンパク質の例としては、ヒトインスリン、インターフェロン、インターロイキン、トランスフォーミング増殖因子β、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチンおよびリンホカインが挙げられる。ヒト膜結合タンパク質および分泌タンパク質をコードする限定された数の遺伝子のみが、同定されている。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、新規のポリペプチド（分泌および膜結合ポリペプチドを含む）をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸、ならびにそれらによってコードされるポリペプチドの発見に部分的に基づく。核酸およびポリペプチドを、本明細書中でまとめて「ＮＯＶＸ」という。
【０００８】
従って、１つの局面において、本発明は、単離された核酸分子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３または４５）を提供する。これらは、新規のポリペプチド、あるいはそれらのフラグメント、ホモログ、アナログまたは誘導体をコードする。核酸としては、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに、少なくとも８５％同一なポリペプチドをコードする核酸もまた含まれ得る。核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメントまたはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００９】
本明細書中に記載される１以上の核酸を含むベクター、および本明細書中に記載されるベクターまたは核酸を含む細胞もまた本発明に含まれる。
【００１０】
本発明はまた、上記の任意の核酸分子を含む組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＮＯＶＸ核酸および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【００１２】
さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＮＯＶＸポリペプチド（例えば、ＮＯＶＸ核酸によってコードされるＮＯＶＸポリペプチド、ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体のいずれか）を含む。本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【００１３】
なおさらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。抗体は、例えばモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、ならびにそのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体であり得る。本発明はまた、ＮＯＶＸ抗体および薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物を含む。本発明はまた、上記の任意の核酸分子によってコードされるポリペプチド上のエピトープに結合する単離された抗体に関する。
【００１４】
本発明はまた、上記の任意の薬学的組成物を備えるキットを含む。
【００１５】
本発明はさらに、ＮＯＶＸ核酸（例えば、ＮＯＶＸ核酸を含むベクター）を含む細胞を提供し、そしてこの核酸によってコードされるＮＯＶＸポリペプチドを発現するのに十分な条件下で細胞を培養することによって、ＮＯＶＸポリペプチドを産生する方法を提供する。次いで、発現されたＮＯＶＸポリペプチドをこの細胞から収集する。好ましくは、この細胞は内因性ＮＯＶＸポリペプチドをほとんど産生しないか、または全く産生しない。この細胞は、例えば、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００１６】
本発明はまた、サンプルを、ポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する化合物と接触させ、そして存在する場合、複合体形成を検出することによって、サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドまたは核酸を同定する方法に関する。
【００１７】
本発明はさらに、ＮＯＶＸポリペプチドを化合物と接触させ、そしてＮＯＶＸポリペプチド活性が変更されたか否かを決定することによって、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、ＮＯＶＸポリペプチドを化合物と接触させ、そしてこの化合物が、ＮＯＶＸポリペプチドの活性を変更するか否かを決定することによって同定されるＮＯＶＸポリペプチド活性を調節する化合物に関する。この核酸は、ＮＯＶＸポリペプチドに結合するか、またはＮＯＶＸポリペプチドをコードする核酸分子に結合する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、被験体におけるＮＯＶＸ関連障害の存在または素因を決定する方法を決定する。この方法は、被験体由来のサンプルを提供し、そして被験体サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドの量を測定する工程を包含する。次いで、被験体サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドの量を、コントロールにおけるＮＯＶＸポリペプチドの量と比較する。コントロールタンパク質サンプルにおけるＮＯＶＸポリペプチドの量と比較した被験体タンパク質サンプルのＮＯＶＸポリペプチドの量の変化は、この被験体が組織増殖関連状態を有することを示す。コントロールサンプルは、好ましくは、一致した個体（すなわち、類似の年齢、性別、または他の一般的な状態の個体であるが、組織増殖関連状態を有すると疑われない）より採取される。あるいは、コントロールサンプルは、被験体が組織増殖関連障害を有すると疑われない時に、その被験体より採取され得る。いくつかの実施形態において、ＮＯＶＸは、ＮＯＶＸ抗体を使用して検出され得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、被験体におけるＮＯＶＸ関連疾患の存在または素因を決定する方法を提供する。この方法は、核酸サンプル（例えば、被験体由来のＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはその両方）を提供し、そして被験体核酸サンプルにおけるＮＯＶＸ核酸の量を測定する工程を包含する。次いで、被験体核酸におけるＮＯＶＸ核酸サンプルの量を、コントロールサンプルにおけるＮＯＶＸ核酸の量と比較する。コントロールサンプルにおけるＮＯＶＸの量と比較した、サンプルにおけるＮＯＶＸ核酸の量における変化は、被験体が組織増殖関連障害を有することを示す。
【００２１】
またさらなる局面において、本発明は、ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防または遅延する方法を提供する。この方法は、このような処置または予防または遅延が所望される被験体へ、その被験体における組織増殖関連障害を処置、予防または遅延するのに十分な量でＮＯＶＸ核酸、ＮＯＶＸポリペプチド、またはＮＯＶＸ抗体を投与する工程を包含する。
【００２２】
他に規定しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって通常理解されるのと同様の意味を有する。本明細書において記載される方法および材料と類似または等価である方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書において参考として援用される。相反する場合、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみであり、そして限定を意図しない。
【００２３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、新規のポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドを提供する。ポリヌクレオチドおよびそれらのコードされるポリペプチドは、それらの遺伝子産物によって果たされる機能によってグループ化され得る。このような機能は、構造タンパク質およびタンパク質を含み、代謝経路脂肪酸代謝、解糖作用、中間代謝、カルシウム代謝、プロテアーゼ、およびアミノ酸代謝などに関連する。
【００２５】
本発明に含まれるのは、新規の核酸配列およびそれらのコードされるポリペプチドである。配列をまとめて、「ＮＯＶＸ核酸」または「ＮＯＶＸポリヌクレオチド」といい、そして対応するコードされるポリペプチドは、「ＮＯＶＸポリペプチド」または「ＮＯＶＸタンパク質」といわれる。例えば、本発明に従う１つのＮＯＶＸ核酸は、ＮＯＶ１核酸を含む核酸であり、そして本発明に従う１つのＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶ１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。他に示されない限り、「ＮＯＶＸ」は、本明細書中に開示される任意のＮＯＶ１〜２３配列を言及することを意味する。
【００２６】
【表１】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
【００２７】
【表２】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
表１のカラム１は、本発明の新規の核酸およびコードされたポリペプチドのＮＯＶＸアサイメントを提供する。カラム２は、様々なＮＯＶＸ配列に対応する開示された配列のクローン同定番号を提供する。カラム３は、開示されるＮＯＶＸ核酸の長さを示す。カラム４は、ＮＯＶＸ配列が発現される組織についての情報を提供する。カラム５は、開示されるＮＯＶＸ核酸配列に見出されるオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）によりコードされるポリペプチド（アミノ酸中）の長さを示す。カラム６および７は、それぞれ、このＯＲＦの開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドンのヌクレオチド位置を示す。カラム８は、本発明のポリペプチドのそれぞれについてのタンパク質類似性情報を含む。カラム９は、各ポリペプチドの推定される細胞の局在化を提供し、そしてカラム１０は、シグナルペプチド切断に最も適切な部位を示す。
【００２８】
本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびそれらのコードされたポリペプチドは、様々な用途および状況において有用である。例えば、本発明に従う様々なＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドは、表１のカラム８に要約されるように、以前に記載されたタンパク質に対するそれらの関連性に基づいて有用である。
【００２９】
ＮＯＶＸ核酸はまた、細胞サンプル中の細胞を同定するために使用され得る。例えば、所定のＮＯＶＸ核酸に対するＲＮＡ種の相同性の同定は、その組織が、所定のＮＯＶＸについて、表１のカラム４で同定されるものの１つである。同様に、細胞サンプル中のＮＯＶＸポリペプチドの検出は、このサンプルが、ＮＯＶＸポリペプチドについて、表１のカラム４で同定される細胞型の１つ以上を含むことを示す。
【００３０】
表１に列挙される各ポリペプチドについて、非コード領域は、ＯＲＦ内にないポリペプチドの領域である。例えば、開示されるＮＯＶ１核酸配列について、非コード領域は、ヌクレオチド１−１６８およびヌクレオチド６９６−８３６から伸長する。同様に、開示されるＮＯＶ２核酸配列について、非コード領域は、ヌクレオチド１−１１０および１７５１−２３４２から伸長する。これらの例から、表１に示される情報と共に、当業者は、ＮＯＶ１−２３のそれぞれの非コード領域の位置を決定し得る。
【００３１】
表２は、表１のカラム４に示される細胞型のいくつかについての説明的な情報を提供する。表２のカラム１は、細胞名を同定する。特に、表２のカラム１は、表１のカラム４で使用される組織名の略語に対応する。表２のカラム２は、特定の組織型の起源を同定する。最後に、表２のカラム３は、特定の細胞型と関連した任意の疾患関連性についての情報を提供する。
【００３２】
【表３】
Figure 2004527202
表３は、本発明に従って開示されるＮＯＶＸ核酸配列およびコードされたポリペプチド配列の配列番号を提供する。表３のカラム１は、同定された配列のそれぞれのＮＯＶＸアサイメントを提供し、一方、カラム２は、各ＮＯＶＸ配列のクローン同定番号を示す。カラム３は、開示されるＮＯＶ：１〜２３核酸配列について割り当てられた配列番号を示す。最後に、カラム４は、コードされたポリペプチドに割り当てられた配列番号を示す。
【００３３】
本発明に従う様々なＮＯＶＸ核酸およびコードされたポリペプチドの配列は、以下の通りである：
（ＮＯＶ１（配列番号１および２））
翻訳されたポリペプチド−ヌクレオチド１８９〜６９５
【００３４】
【化１】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ２（配列番号３および４））
翻訳されたポリペプチド−ヌクレオチド１１０〜１７５０
【００３５】
【化２】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ３（配列番号５および６））
翻訳されたポリペプチド−ヌクレオチド１４３〜４８７
【００３６】
【化３】
Figure 2004527202
（ＮＯＶ４（配列番号７および８））
翻訳されたポリペプチド−ヌクレオチド９９１〜１４４６
【００３７】
【化４】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ５（配列番号９および１０））
翻訳されたポリペプチド−ヌクレオチド５８７〜１３４２
【００３８】
【化５】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ２１（配列番号４１および４２））
翻訳されたタンパク質−フレーム：２−ヌクレオチド１０８２〜１８３７
【００３９】
【化６】
Figure 2004527202
（ＮＯＶ２２（配列番号４３および４４））
【００４０】
【化７】
Figure 2004527202
（ＮＯＶ６（配列番号１１および１２））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド１８３〜１３６１
【００４１】
【化８】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ７（配列番号１３および１４））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド９１〜４８６
【００４２】
【化９】
Figure 2004527202
（ＮＯＶ８（配列番号１５および１６））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド１４６〜４６０
【００４３】
【化１０】
Figure 2004527202
（ＮＯＶ９（配列番号１７および１８））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド２４４〜１４７３
【００４４】
【化１１】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１０（配列番号１９および２０））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド８１３〜３００８
【００４５】
【化１２】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１１（配列番号２１および２２））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド６９〜１２１１
【００４６】
【化１３】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１２（配列番号２３および２４））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド５１７〜１７２８
【００４７】
【化１４】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１３（配列番号２５および２６））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド５０８〜２５５６
【００４８】
【化１５】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１４（配列番号２７および２８））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド５２０〜２４５４
【００４９】
【化１６】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ２３（配列番号４５および４６））
【００５０】
【化１７】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１５（配列番号２９および３０））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド３１２〜５６０
【００５１】
【化１８】
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１６（配列番号３１および３２））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド２８８〜２０２１
【００５２】
【化１９】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１７（配列番号３３および３４））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド２８９〜２４１２
【００５３】
【化２０】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１８（配列番号３５および３６））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド１３５〜５４５
【００５４】
【化２１】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ１９（配列番号３７および３８））
翻訳されたタンパク質−フレーム：２−ヌクレオチド３８９〜８５６
【００５５】
【化２２】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（ＮＯＶ２０（配列番号３９および４０））
翻訳されたタンパク質−ヌクレオチド５０５〜１２８４
【００５６】
【化２３】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
表１に記載されるＮＯＶＸポリペプチドおよび核酸の簡単な説明が以下に続く。本発明に従うＮＯＶＸ核酸およびポリペプチドに対するさらなる有用性がまた、本明細書中に開示される。
【００５７】
（ＮＯＶ１）
本発明に従うＮＯＶ１核酸分子は、核酸配列（配列番号１）（これは、クローン８８９２４０に存在する）を含む。配列番号１は、Ｔ１／ＳＴ２（レセプター結合ポリペプチド）に類似するタンパク質をコードする８３６ｂｐを含む。このヌクレオチド配列は、１９６６２．４Ｄａの推定分子量を有する１６９アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２）をコードするオープンリーデングフレームを有する。開始コドンは、ヌクレオチド１８９−１９１に存在し、そして終止コドンは、ヌクレオチド６９６−６９８に存在する。配列番号２のタンパク質は、０．８２００の確率で、細胞外に局在することがＰＳＯＲＴプログラムにより推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチド（配列ＡＡＧ−ＦＴにおける残基２７と残基２８との間におそらく切断部位を有する）が存在するということを推定する。
【００５８】
コードされるポリペプチドにおいて、２２７残基のヒト推定Ｔ１／ＳＴ２レセプター結合タンパク質前駆体（ＡＣＣ：Ｑ１３４４５）に対して、１４７残基のうちの８５残基（５７％）が同一であり、そして１４７残基のうちの１０７残基（７２％）がポジティブである。このポリペプチドはまた、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓプロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｅ）を鋳型（ＳＰＴＲＥＭＢＬ−ＡＣＣ：Ｑ９Ｙ３Ａ６）として使用する、比較遺伝子クローニングにより同定された２２９残基のヒトＣＧＩ−１００タンパク質に対して、１５８残基のうちの１５４残基（９７％）が同一であり、１５８残基のうちの１５５残基（９８％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。
【００５９】
さらに、このタンパク質は、サイトカイン、免疫系調節因子、組織増殖因子、Ｔ１レセプター様リガンドＩＩおよびｐ２４小胞輸送タンパク質ならびにアゴニスト（ＷＯ９８３６０８３；ＷＯ９８０７７５４；ＷＯ９９４６２８１およびＷＯ９９３１２３６）のような活性を有するものとして開示される、２２９残基のヒトタンパク質に対して、１５８残基のうちの１５４残基（９７％）が同一であり、そして１５８残基のうちの１５５残基（９８％）がポジティブである残基を有する。
【００６０】
Ｔ１／ＳＴ２は、Ｉ型インターロイキン−１レセプターに対して相同であるレセプター様分子である。Ｔ１／ＳＴ２は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）細胞の表面上で構成的かつ安定に発現されるが、Ｔｈ１細胞上では発現されない。Ｔ１／ＳＴ２はまた、肥満細胞上で発現される。
【００６１】
ＮＯＶ１は、胎児肝臓、甲状腺、胎児腎臓および脾臓において見出される。ＮＯＶ１核酸配列によりコードされる本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされているような開示された完全タンパク質ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから生じる任意の成熟タンパク質が挙げられる。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１タンパク質の前駆体および任意の活性化形態の両方を包含する。
【００６２】
インターロイキン１レセプター関連Ｔ１／ＳＴ２遺伝子についての推定リガンドに対するＮＯＶ１の類似性は、この新規な配列は、インターロイキン１レセプターファミリーに対して相同性を有するレセプターについてのリガンドとして機能し得るということを示唆する。これらのレセプターは、免疫応答系において重要な役割を果たし、従って、この新規な遺伝子は、免疫応答経路における類似のレセプター−リガンド系に関連し得る。この新規な遺伝子は、診断マーカーまたは予後徴候マーカー、治療タンパク質および免疫応答経路における障害を処置するための抗体標的もしくは低分子薬物標的として治療的に使用され得る。
【００６３】
（ＮＯＶ２）
本発明のＮＯＶ２核酸配列は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列（配列番号３）は、５４７アミノ酸残基（配列番号４）のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１１０〜１１２における開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１７５１〜１７５３における終止コドンで終わる。配列番号４のタンパク質は、０．７０００の確率で、核に局在することがＰＳＯＲＴプログラムにより推定される。Ｎ末端シグナル配列は、このタンパク質について推定されない。
【００６４】
開示されたポリペプチドは、ヒトＫＩＡＡ０５５４ＰＲＯＴＥＩＮ（ＡＣＣ：Ｏ６０３０１）においてコードされる６７４残基のタンパク質フラグメントに対して、３４２アミノ酸残基のうちの１８８残基（５４％）が同一であり、そして３４２基のうちの２６５残基（７７％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。さらに、ＮＯＶ２は、５４５残基のヒトＣＤＣ４２相互作用タンパク質４（ＡＣＣ：Ｏ１５１８４）に対して、５４４残基のうちの３００残基（５５％）が同一であり、そして５４４基のうちの４０１残基（７３％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。
【００６５】
さらに、このタンパク質は、２６５残基のヒトＳｒｃ相同性３ドメイン（ＳＨ３）含有タンパク質１に対して２４６残基に渡って６０％同一および７４％類似性を有し；そして１７５残基のヒトＳＨ３含有タンパク質２（米国特許第５，９１６，７５３号、１９９９年６月２９日発行）に対して１６８残基に渡って５０％同一および６７％類似性を有する。これらのタンパク質は、癌および免疫障害または発達障害の診断、処置または予防のために使用され得る。
【００６６】
実施例２における結果（後述）は、ＮＯＶ２は優先的に種々の組織（いくつかの癌細胞株（例えば、骨肉腫、甲状腺、胎児脳、胎盤、膵臓、子宮、胎児肺）を含む）およびＲＮＡプール（副腎、乳腺、前立腺、精巣、子宮、骨髄、黒色腫、下垂体、甲状腺および脾臓に由来する）において発現されることを示す。
【００６７】
ＮＯＶ２核酸によりコードされる本発明のタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされているような開示された完全タンパク質ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから生じる任意の成熟タンパク質が挙げられる。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ２タンパク質の前駆体および任意の活性化形態の両方を包含する。
【００６８】
（ＮＯＶ３）
本発明に従うＮＯＶ３核酸は、配列番号５の核酸配列を含み得る。このクローンのヌクレオチド配列（配列番号５）は、７１１ｂｐ長てあり、そして５３９４５．０Ｄａの推定分子量を有する１１５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号６）をコードするオープンリーデングフレームを有する。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド１４３−１４５に存在し、そして終止コドンは、ヌクレオチド４８８−４９０に存在する。配列番号６のタンパク質は、０．９１９０の確率で、原形質膜に局在することがＰＳＯＲＴプログラムにより推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチド（残基１９と残基２０との間におそらく切断部位を有する：ＡＱＡ−ＬＤ）がおそらく存在するということを推定する。
【００６９】
コードされるポリペプチドは、１２８残基のヒトＥ４８抗原前駆体ＡＣＣ：Ｑ１４２１０に対して、９７残基のうちの４１残基（４２％）が同一であり、そして９７残基のうちの４７残基（４８％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。このコードされるポリペプチドはまた、遺伝子８９（ＷＯ９９０２５４６）によりコードされる１１７残基のヒト分泌タンパク質に対して、１１６残基のうちの１１１残基（９５％）が同一であり、そして１１６残基のうちの１１２残基（９６％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。
【００７０】
ＮＯＶ３は、心臓において発現される。それはまた、腎臓、視床、骨髄、副腎および／または腎上体、ならびに胎児脳において発現される。
【００７１】
ＮＯＶ３核酸により提供されるタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされているような開示された完全タンパク質ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから生じる任意の成熟タンパク質が挙げられる。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ３タンパク質の前駆体および任意の活性化形態の両方を包含する。
【００７２】
（ＮＯＶ４）
ＮＯＶ４は、心臓、骨髄、脾臓および視床において発現されると考えられる。本発明のＮＯＶ４核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み得る。このクローンは、１９８７ｂｐ長であり、そして１５２アミノ酸残基（配列番号８）のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。開始コドンは、ヌクレオチド９９１〜９９３に存在し、そして終止コドンは、ヌクレオチド１４４７−１４４９に存在する。配列番号８のタンパク質は、０．６４００の確率で、マイクロボディ（ペルオキシソーム）に局在することがＰＳＯＲＴプログラムにより推定される。おそらくシグナルペプチドは存在しない。
【００７３】
開示されたＮＯＶ４タンパク質は、ヒト乳房腫瘍関連タンパク質４７（ＤＥ１９８１３８３５）に由来する１０２残基の発現された配列タグに対して、１００アミノ酸残基のうちの９０残基（９０％）が同一であり、そして１００残基のうちの９３残基（９３％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。
【００７４】
ＮＯＶ４核酸配列によりコードされるタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされているような開示された完全タンパク質ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから生じる任意の成熟タンパク質が挙げられる。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ４タンパク質の前駆体および任意の活性化形態の両方を包含する。
【００７５】
（ＮＯＶ５、ＮＯＶ２１、およびＮＯＶ２２）
ＮＯＶ５、ＮＯＶ２１、およびＮＯＶ２２もまた、本発明に含まれ、これらは、関連核酸およびそれらのコードされたポリペプチドを含む。
【００７６】
（ＮＯＶ５）
本発明に従うＮＯＶ５核酸は、配列番号９の１４２３ヌクレオチドを含む。この核酸は、ヌクレオチド５８７におけるＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１３４３における終止コドンで終わるオープンリーディングフレームに由来する新規な甲状腺ホルモン結合タンパク質様タンパク質をコードする。このコードされたポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する２５２アミノ酸残基を有する。
【００７７】
コードされるポリペプチドは、５１０残基のウシタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）（プロリル４−ヒドロキシラーゼβサブユニット）（細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質）（ＡＣＣ：Ｐ０５３０７）に対して、２２４残基のうちの７５残基（３３％）が同一であり、そして２２４残基のうちの７３残基（３２％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。さらに、このコードされるポリペプチドは、５０８残基のヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）（プロリル４−ヒドロキシラーゼβサブユニット）（細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質）（ｐ５５）（ＡＣＣ：Ｐ０７２３７）に対して、２２４残基のうちの７３残基（３２％）が同一であり、そして２２４残基のうちの１２１残基（５４％）がポジティブであるアミノ酸残基を有する。ＰＤＩ、プロリル４−ヒドロキシラーゼのβサブユニット、および細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質は同一である（例えば、Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ１４６（３）：１４８５−１４９２（１９８７）を参照のこと）。ＮＯＶ５の触媒活性は、ネイティブ構造を形成するためのタンパク質における内部鎖（ｉｎｔｒａｃｈａｉｎ）および間鎖（ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ）ジスルフィド結合の再構成を含む。その非細胞の位置は、小胞体管腔内に存在する。それは、２つのチオレドキシンドメインを含む。
【００７８】
ＰＳＯＲＴ分析は、開示されたＮＯＶ５ポリペプチドは、０．４６００の確率で、原形質膜に局在するということを推定する。ＳＩＧＮＡＬＰ分析を使用して、本発明のタンパク質は、切断可能なＮ末端シグナル配列（２５位と２６位との間におそらく存在する切断部位を有する（ＶＡＡ−ＥＶ））を有する。本発明のタンパク質の推定分子量は、２８１４１．９ダルトンである。このＮＯＶ５タンパク質は、以下に記載されるＮＯＶ２１およびＮＯＶ２２核酸配列によりコードされるタンパク質に由来する２つの位置において異なる。開示されたＮＯＶ２１およびＮＯＶ２２ポリペプチドは、配列において同一である。
【００７９】
甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）は、ステロイドホルモン／レチノイン酸レセプタースーパーファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、ホメオスタシス、発生および分化を調節する。それらの転写活性は、甲状腺ホルモン３，３’，５−トリヨード−Ｌ−サイロニン（Ｔ３）により調節され、（Ｌｅｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ２２２（３）：８３９−４３（１９９６））細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質（インスリン分解酵素ではなく）の発現（インスリン結合タンパク質も同様に）が３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞が分化する間増加することが見出されている。従って、細胞甲状腺ホルモン結合タンパク質は、いくつかのインスリン作用を調節する際に役割（特に、脂肪細胞の分化の間のインスリンと他のホルモンとの間に生じるカウンター調節（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ））を果たし得る。
【００８０】
ＮＯＶ５は、乳腺において高度に発現される。
【００８１】
本発明のＮＯＶ５核酸によりコードされるタンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされているような開示された完全タンパク質ならびに翻訳後修飾の結果としてそれから生じる任意の成熟タンパク質が挙げられる。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ５タンパク質の前駆体および任意の活性化形態の両方を包含する。
【００８２】
本発明に従うＮＯＶ５核酸およびタンパク質は、以下の障害および病理学に関連する潜在的な治療用途において有用である：糖尿病、代謝性障害および内分泌障害、発達障害、および／または他の病理学ならびに障害。例えば、甲状腺ホルモン結合タンパク質様タンパク質をコードするｃＤＮＡは、甲状腺ホルモン結合治療において有用であり得る。同様に、甲状腺ホルモン結合タンパク質様タンパク質は、その必要にある被験体に投与する場合に有用であり得る。甲状腺ホルモン結合タンパク質様タンパク質ならびに本発明の甲状腺ホルモン結合タンパク質様タンパク質新規な核酸、またはそのフラグメントをコードする新規な核酸は、診断的用途においてさらに有用であり得、ここで、核酸またはタンパク質の存在および量は、評価される必要がある。これらの材料は、治療的または診断的方法における使用のための本発明の新規な物質に免疫特異的に結合する抗体の甲状腺ホルモン結合タンパク質配給においてさらに有用である。
【００８３】
（ＮＯＶ２１）
本発明に従うＮＯＶ２１核酸配列は、配列番号４１の核酸配列を含む。このヌクレオチド配列（配列番号４１）は、１９１８ｂｐを有し、そして２５２アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号４２）をコードするオープンリーディングフレームを含む。開始コドンは、ヌクレオチド１０８２〜１０８４であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド１８３８〜１８４０である。配列番号４２のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．４６００の確率で形質膜に局在することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、この開示されたＮＯＶ２１タンパク質が、残基２５と２６との間（ＶＡＡ−ＥＶ）の最も可能性の高い切断部位を含む、切断可能なＮ末端シグナルペプチドを有する。この開示されたＮＯＶ２１タンパク質は、ＮＯＶ５核酸（上記を参照のこと）によってコードされるタンパク質と２つの位置で異なり、そしてＮＯＶ２２核酸配列（以下を参照のこと）によってコードされるタンパク質と同一である。
【００８４】
開示されたＮＯＶ２１ポリペプチドは、５１０残基のウシタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体（ＰＤＩ）（ＥＣ．５．３．４．１）（プロリル４−ヒドロキシラーゼβサブユニット）（細胞性甲状腺ホルモン結合タンパク質）（ＡＣＣ：Ｐ０５３０７）に対して同一な２２４残基のうちの７５残基（３３％）、およびこのタンパク質に対してポジティブな２２４残基中の１２４残基（５５％）を有する。
【００８５】
本発明に従うＮＯＶ２１タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによってコードされている開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果としてその全長タンパク質から生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ２１タンパク質の前駆体および活性形態の両方を包含する。
【００８６】
（ＮＯＶ２２）
本発明に従うＮＯＶ２２核酸配列は、配列番号４３の核酸配列を含む。このヌクレオチド配列は、１９１４ヌクレオチドを含む。オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１０７８〜１０８０のＡＴＧ開始コドンで始まり、そしてヌクレオチド１８３４〜１８３６の終止コドンで終結することが同定された。当業者は、この配列番号４３として示される配列が、コード鎖の逆相補体であることを認識する。コードされるポリペプチドは、２５２アミノ酸残基（配列番号４４）を有する。このコードされるＮＯＶ２２ポリペプチドは、ＮＯＶ５タンパク質（上記を参照のこと）と２つの位置で異なり、そしてＮＯＶ２１（上記を参照のこと）と同一である。
【００８７】
このコードされるポリペプチドは、Ｂｏｃ ｔａｕｒｕｓタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体（ＰＤＩ）（ＥＣ．５．３．４．１）（プロリル−４−ヒドロキシラーゼβサブユニット）（細胞性甲状腺ホルモン結合タンパク質）（ｐ５５）（ＡＣＣ：Ｐ０５３０７）に対して、２２４アミノ酸中の１２５アミノ酸（５５％）の相同性を有する。開示されるヌクレオチド配列は、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓジスルフィドイソメラーゼ前駆体（ＰＤＩｐ）ｍＲＮＡ（ＧＥＮＢＡＮＫ−ＩＤ：ＨＳＵ１９９４８｜ａｃｃ：Ｕ１９９４８）に対して、６９４ヌクレオチド中３９５ヌクレオチド（５６％）の同一性／相同性を有する。
【００８８】
ＰＳＯＲＴ分析により、本発明のこのタンパク質が０．４６００の確率で形質膜に局在することが推定される。ＳＩＧＮＡＬＰ分析を使用して、本発明のタンパク質が、２５位と２６位との間（ＶＡＡ−ＥＶ）の最も可能性の高い切断部位を含む、切断可能なＮ末端シグナル配列を有するようであることが予測される。本発明のこのタンパク質の推定分子量は、２８１４１．９ダルトンである。
【００８９】
ＮＯＶ５、ＮＯＶ２１およびＮＯＶ２２の核酸およびタンパク質は、主に膵臓および甲状腺において発現され、さらに、末梢血、リンパ節、骨、乳房、卵巣、腎臓、肺、心臓、上皮小体、脳、骨髄、扁桃、副腎および肝臓において発現される。
【００９０】
ＮＯＶ５、ＮＯＶ２１およびＮＯＶ２２の核酸およびタンパク質は、タンパク質治療剤、抗体標的、ならびに、免疫学的疾患、甲状腺疾患および代謝疾患、骨代謝障害、膵臓の疾患（糖尿病および消化疾患）、組織再生および組織発生を処置するための潜在的な治療適用における、低分子薬物標的として有用である。
【００９１】
（ＮＯＶ６）
本発明に従うＮＯＶ６核酸配列は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。この配列は、１４１８ｂｐの長さであり、そして３９３アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１２）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１８３〜１８５で開始コドンを、そしてヌクレオチド１３６２〜１３６４で終止コドンを含む。この配列番号１２のコードされるタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．３７００の確率で細胞外に局在することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、この３２１８７１５タンパク質が、残基２２と２３との間（ＴＬＳ−ＫＳ）の最も可能性の高い切断部位を含む、切断可能なＮ末端シグナルペプチドを有する
このコードされるタンパク質は、９６８残基のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｔｈａｌｉａｎａのタンパク質（カラシナ（ｍｏｕｓｅ−ｅａｒ Ｃｒｅｓｓ）；ＡＣＣ：Ｏ０４６２３）に対して同一な１７７残基のうちの７０残基（３９％）、およびこのタンパク質に対してポジティブな１７７残基のうちの１０７残基（６０％）を有する。
【００９２】
本発明に従うＮＯＶ６タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによってコードされている開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果としてその全長タンパク質から生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ６タンパク質の前駆体および活性形態の両方を包含する。
【００９３】
（ＮＯＶ７）
ＮＯＶ７は、膵臓において同定された。さらに、胎児脳、唾液腺、視床、胎児脳、脾臓、心臓において見出された。本発明に従うＮＯＶ７ヌクレオチド配列は、配列番号１３の核酸配列（これは、８１１ヌクレオチド長である）を含む。開示されたヌクレオチド（配列番号１３）は、１３２アミノ酸残基（配列番号１４）のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを有する。開始コドンは、ヌクレオチド９１〜９３であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド４８７〜４８９である。配列番号１４のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．７０００の確実性で形質膜に位置することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチドが、おそらく残基５７と５８との間：ＩＶＡ−ＮＩに切断部位を有する可能性が最も高いことを推定する。
【００９４】
コードされたポリペプチドは、ヒトロドプシン（ＡＣＣ：Ｑ１５３０９）の５１残基フラグメントと同一な３０残基のうち１４残基（４６％）、およびこの５１残基フラグメントに対してポジティブな３０残基のうち１８残基（６０％）を有する。
【００９５】
ＮＯＶ７は、膵臓において同定された。これはまた、胎児脳、唾液腺、視床、脾臓、および心臓において見出され、そして多くの他の正常細胞株および癌細胞株において見出された。
【００９６】
ＮＯＶ７タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ７タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【００９７】
（ＮＯＶ８）
本発明に従うＮＯＶ８核酸は、配列番号１５（これは、７３４ヌクレオチド長であり、１０５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１６）をコードするオープンリーディングフレームを有する）を含む。オープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド１４６〜１４８であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド４６１〜４６３である。コードされたポリペプチドは、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．４６００の確実性で形質膜に位置することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチドが存在するという確率が低いことを推定する。
【００９８】
コードされたタンパク質は、ヒトインターフェロンα−１偽遺伝子由来の３０残基フラグメント、すなわち５’末端前駆体（ＡＣＣ：Ｅ１５８５０３）と同一な１９残基のうち１１残基（５７％）、およびこの３０残基フラグメントに対してポジティブな１９残基のうち１５残基（７８％）を有する。
【００９９】
ＮＯＶ８は、大部分の試験される正常組織および癌組織において種々の程度で広く発現される。
【０１００】
本発明に従うＮＯＶ８タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ８タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１０１】
（ＮＯＶ９）
本発明のＮＯＶ９核酸配列は、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。配列番号１７は、１６５９ヌクレオチド長であり、そして４１０アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１８）をコードするオープンリーディングフレームを有する。開始コドンは、ヌクレオチド２４４〜２４６であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド１４７４〜１４７６である。配列番号１８のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．９０００の確実性でゴルジ体に位置することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、おそらくシグナルペプチドが存在しないことを推定する。
【０１０２】
コードされたＮＯＶ９タンパク質は、５７０残基のヒトＩＬ−１レセプターアクセサリタンパク質（ＡＣＣ：Ｏ１４９１５）と２７％同一であり、そしてこのタンパク質に対して４７％ポジティブである。
【０１０３】
ＮＯＶ９は、胎児脳、リンパ節、膵臓、胎盤、骨原性肉腫、腎臓、胎盤、唾液腺、胎児腎臓、前立腺、脾臓、膵臓、造血幹細胞、および胎児肺において見出される。
【０１０４】
ＮＯＶ９タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ９タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１０５】
（ＮＯＶ１０）
本発明に従うＮＯＶ１０核酸配列は、２２６１ヌクレオチド長であるヌクレオチド配列（配列番号１９）を含む。この核酸配列は、７３２アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２０）をコードするオープンリーディングフレームを含む。開始コドンは、ヌクレオチド８１３〜８１５であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド３００９〜３０１１である。配列番号２０のポリペプチドは、ＰＳＯＲＴプログラムにより、低い確率で核に位置することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、おそらくシグナルペプチドが存在しないことを推定する。
【０１０６】
ＮＯＶ１０タンパク質は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来の第Ｖ染色体（ＡＣＣ：Ｑ１７４２９）における８８４残基のハイポセティカル９６．８ｋＤａタンパク質Ｂ００２４．１４と同一な７０１残基のうち２５７残基（３６％）、およびこのＢ００２４．１４に対してポジティブな７０１残基のうち３６０残基（５１％）を有する。さらに、これは、８１０残基のヒトＮＥＬ関連タンパク質（ＡＣＣ：ＢＡＡ１１６８０）と同一な５２９残基のうち１４２残基（２６％）、およびこのタンパク質に対してポジティブな５２９残基のうちの２１５残基（４０％）を有する。
【０１０７】
ＮＯＶ１０タンパク質は、１０３６残基のヒト分泌タンパク質クローンｄｊ１６７＿１９（ＷＯ９９５７１３２−Ａ１）と同一な７２１残基のうち７１５残基（９９％）、およびｄｊ１６７＿１９に対してポジティブな７２１残基のうち７１６残基（９９％）を有する。
【０１０８】
実施例２（後述）は、ＮＯＶ１０が、試験される大部分の細胞株において広く発現され、いくつかの腫瘍細胞株において高レベルの発現が見られることを示す。
【０１０９】
ＮＯＶ１０は、脾臓、胸腺、心臓および副腎から単離された。さらに、ＮＯＶ１０はまた、脳／下垂体、肝臓、胎児肝臓、腎臓、胎児腎臓、骨、骨肉腫、および心臓において見出される。
【０１１０】
本発明のＮＯＶ１０タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１０タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１１１】
（ＮＯＶ１１）
本発明に従うＮＯＶ１１核酸は、配列番号２１のヌクレオチド配列（これは、１４３１ヌクレオチド長である）を含む。この核酸は、本来心臓組織において同定され、そして配列番号２１の６９〜７１位から１２１２〜１２１４位までの３８１アミノ酸残基のＮＯＶ１２ポリペプチド（配列番号２２）をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【０１１２】
コードされたタンパク質は、７６８残基を有するヒトγ−ヒレグリンタンパク質（ＡＣＣ：Ｏ１４６６７）と同一の１３４残基のうち７４残基（５５％）、およびこのタンパク質に対してポジティブな１３４残基のうち９６残基（７１％）を有する。このタンパク質は、０．８５００の確実性で小胞体（膜）に位置することは推定される。配列中のＮ末端シグナルペプチドは推定されていないようである。
【０１１３】
ヒレグリンは、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）またはグリア増殖因子２（ＧＧＦ２）としても公知である。ヒレグリンは、タンパク質ニューレスチン（ｎｅｕｒｅｓｔｉｎ）に対する相同性を示す。次いで、ニューレスチンは、テネイシンファミリーのタンパク質のメンバーに対する相同性を示す、ヒレグリンは、ＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ２／ＮＥＵ、乳癌および前立腺癌進行に関与するプロトオンコジーンレセプターチロシンキナーゼ（これは、本来ラット神経芽腫／神経膠芽腫細胞株において同定された）についてのリガンドである。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳腺癌細胞におけるＨＥＲ−２／ＥｒｂＢ２／ＮＥＵの異所性発現は、ベクタートランスフェクトしたコントロール細胞に対してタキソール誘導性アポトーシスに対する化学療法抵抗性を付与する（Ｙｕら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ２：５８１−５９１（１９９８））。
【０１１４】
テネイシンは、胚発生に重要な組織相互作用において顕著な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質の増大しているファミリーである。テネイシンの過剰発現は、複数のヒト固形悪性癌（ｓｏｌｉｄ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）において記載される。関連タンパク質のテネイシンファミリーの役割は、上皮−間質相互作用を調節し、フィブロネクチン依存性細胞接着および相互作用に関与することである。実際に、テネイシン−Ｃ（ＴＮ）は、悪性卵巣腫瘍の間質において、特に上皮と間質との間の境界において過剰発現され、このことにより、テネイシン−Ｃが侵襲プロセスに関与し得るという示唆（Ｗｉｌｓｏｎら，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７４：９９９−１００４（１９９６））が導かれる。テネイシン−Ｃは、特定の悪性脳腫瘍に対する治療標的と考えられる（Ｇｌａｄｓｏｎ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ ５８（１０）：１０２９−４０（１９９９））。
【０１１５】
ＤＣＩＳにおける間質の、または中程度から強い管周辺のＴｎ−Ｃ発現は、腫瘍細胞侵襲と相関する（Ｊａｈｋｏｌａら，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３４（１１）：１６８７−９２（１９９８）；Ｊａｈｋｏｌａら，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．７８（１１）：１５０７−１３（１９９８））。
【０１１６】
テネイシン（ＴＮ）は、発生の間に細胞転移の領域において見出され、そして転移性神経膠腫細胞において高レベルで発現される細胞外マトリックスタンパク質である（Ｔｒｅａｓｕｒｙｗａｌａら，Ｇｌｉａ ２４（２）：２３６−４３（１９９８））．Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１１（Ｐｔ ８）：１０９５−１０４（１９９８））。胸部および子宮内膜というホルモン依存性組織におけるテネイシン発現は、テネイシン発現が悪性進行を反映することを示す（Ｖｏｌｌｍｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２（１７）：４６４２−８ （１９９２））。
【０１１７】
開示されたＮＯＶ１１ポリペプチドはまた、ニューレスチン（Ｏｔａｋｉ ＪＭ，ら，Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１２（１）：１６５−８１（１９９９））に関連する。ニューレスチンは、神経発生に関与する推定膜貫通分子である。ニューレスチンは、ニューレグリン遺伝子産物、ヒトγ−ヒレグリン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａレセプター型ペアルール遺伝子産物、Ｏｄｄ Ｏｚ（Ｏｄｚ）／Ｔｅｎ（ｍ）、およびＴｅｎ（ａ）に対する相同性を示す。ニューレスチンは、シナプス形成および形態形成に関与すると推定される。マウスニューレスチンホモログ（ＤＯＣ４）は、ＮＩＨ−３Ｔ３ ＤＯＣ４から独立して単離され、テネイシンＭ（ＴＮＭ）、細胞外ＥＧＦ様反復を含有するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａペアルール遺伝子ホモログとしても公知である。
【０１１８】
関連する分子の医学的文献に記載される生物活性に基づいて、ＮＯＶ１１核酸またはそれがコードするポリペプチドは、腫瘍上皮細胞の間質成分との相互作用を変化させる腫瘍細胞生物学の１つ以上の局面において役割を果たし得る。例えば、ＮＯＶ１１は、以下の悪性特性において役割を果たし得る：腫瘍細胞増殖のオートクリン／パラクリン刺激；細胞傷害治療に対する腫瘍細胞生存および腫瘍細胞耐性のオートクリン／パラクリン刺激；局所的組織再モデリング、腫瘍細胞の実質（ｐａｒａｎｅｃｈｍａｌ）および基底膜浸潤および運動性（これらが転移に寄与している）；ならびに免疫監視機構から腫瘍が逃れる結果となるＴ細胞媒介免疫エフェクター細胞および経路の腫瘍媒介免疫抑制。
【０１１９】
発現プロフィールからの推定疾患指標としては、ヒト神経膠腫、星状細胞腫、神経膠腫／星状細胞腫の混合、腎臓細胞癌腫、乳腺癌、卵巣癌、黒色腫のサブセットが挙げられる。ＮＯＶ１１とそのコグネイトレセプターとの推定される相互作用を破壊することが示されたヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体によりＮＯＶ１１を標的化することは、有意な抗腫瘍／抗転移活性および関連する総合的症状の改善を生じ得る。ＮＯＶ１１レセプター相互作用により連結した（ｅｎｇａｇｅ）下流のシグナル伝達成分を特異的におよび／または選択的に妨げる低分子の同定はまた、有意な抗腫瘍／抗転移活性および関連する総合的症状の改善を生じると予測される。同様に、ＮＯＶ１１転写物／メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の発現を減少させることが示された、改変したアンチセンスリボヌクレオチドまたはアンチセンス遺伝子発現構築物（例えば、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および「裸の」ＤＮＡアプローチ）は、抗腫瘍影響を有するＮＯＶ１１の推定特性に基づいて予測される。
【０１２０】
ニューレグリン（グリア増殖因子２）は、多発性硬化症についての慢性再発モデルにおける自己免疫脱髄を減少させ、そして再ミエリン化（ｒｅｍｙｅｌｉｎａｔｉｏｎ）を増強させる（Ｃａｎｎｅｌｌａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：１０１００−１０１０５（１９９８））。
【０１２１】
ＮＯＶ１１は、さらに、中枢神経系ミエリン化、細胞外マトリックスにおける位置決定、および神経芽腫細胞の誘導に関与するタンパク質であり得る（Ｎｏｔｔｅｒｐｅｋら，Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ １６（５−６）：２６７−７８（１９９４））。Ｏｔａｋｉら（Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２１２（１）：１６５−８１（１９９９））は、ノーザンブロット分析により検出されるように、ニューレスチンは、脳において高度に発現され、そして他の組織においては、比較的低く発現されることが報告された。組織切片に対するインサイチュハイブリダイゼーションは、ニューレスチンが多くの型のニューロン（大脳皮質中の錐体細胞および発生中の嗅球における房飾細胞を含む）において発現されることを示す。成体において、ニューレスチンは、主に嗅覚細胞および海馬顆粒細胞において発現される。それにも拘わらず、成体において、ニューレスチン発現は、嗅覚ニューロンの再生中に外部嗅球（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｔｕｆｔｅｄ ｃｅｌｌ）において誘導され得る。
【０１２２】
精製組換えＮＯＶ１１またはＮＯＶ１１のフラグメントの脳実質領域への直接送達は、虚血、脳外傷、および種々の神経変性疾患から生じた損傷中枢神経系細胞の再生／修復／再ミエリン化を促進し得る。
【０１２３】
ＮＯＶ１１は、とりわけ、脳および中枢神経系細胞において広く発現されることが見出された。
【０１２４】
ＮＯＶ１１タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１１タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１２５】
（ＮＯＶ１２）
本発明に従うＮＯＶ１２核酸は、配列番号２３のヌクレオチド配列（これは、２１１６ｂｐの長さである）を含む。この核酸配列は、４０４アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２４）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド５１７〜５１９であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド１７２９〜１７３１である。配列番号２４のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．４６００の確実性で形質膜に位置することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、シグナルペプチドが、おそらく残基２４と２５との間：ＡＡＳ−ＫＮに切断部位を有する可能性が最も高いことを推定する。
【０１２６】
開示されたＮＯＶ１２タンパク質は、４３３残基のヒト細胞接着分子タンパク質（ＴＲＥＭＢＬＮＥＷ−ＡＣＣ：ＡＡＤ１７５４０）と同一な３７４残基のうちの２００残基（５３％）、およびこのタンパク質に対してポジティブな３７４残基のうちの２６９残基（７１％）を有する。
【０１２７】
さらに、この開示されたＮＯＶ１２タンパク質は、４４４残基のヒトβセクレターゼ（１９９９年８月２４日に発行された米国特許第５，９４２，４００号）と同一な３２９残基のうち３２７残基（５３％）、およびこのセクレターゼに対してポジティブな３２９残基のうち３２７残基（９９％）を有する。この酵素は、アルツハイマー病に関与するベータアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（Ｙ３３７４２；スウェーデン人の変異ＡＰＰ）を切断し得る。
【０１２８】
ＮＯＶ１２は、脳組織から単離された。ＮＯＶ１２は、脳および大細胞肺癌において高度に発現される。ＮＯＶ１２ ＲＮＡ配列は、脳組織（例えば、下垂体組織）から単離され得る。
【０１２９】
本発明により提供されるＮＯＶ１２タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１２タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１３０】
（ＮＯＶ１３）
本発明に従うＮＯＶ１３ヌクレオチド配列は、２８６２ヌクレオチド長である配列番号２５を含む。配列番号２５は、６８３アミノ酸残基のＮＯＶ１３ポリペプチド（配列番号２６）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド５０８〜５１０であり、そして終止コドンは、ヌクレオチド２５５７〜２５５９である。配列番号２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．６０００の確実性で形質膜に位置することが推定される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、おそらくシグナルペプチドが存在しないことを推定する。
【０１３１】
コードされたタンパク質は、ヒトＫＩＡＡ０７６８タンパク質（ＡＣＣ：ＢＡＡ３４４８８）の８７２残基フラグメントと同一な５４１残基のうちの２２７残基（４１％）、およびこのフラグメントに対してポジティブな５４１残基のうちの３３５残基（６１％）を有する。さらに、コードされたタンパク質は、６９０残基のヒトタンパク質ＰＲＯ２２８（Ｗ０９９１４３２８−Ａ２（１９９９年３月２５日公開））と同一な６８３残基のうちの６８０残基（９９％）、およびこのタンパク質に対してポジティブな６８３残基のうちの６８２残基（９９％）を有する。
【０１３２】
ＮＯＶ１３タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされる開示された全長タンパク質、ならびに翻訳後修飾の結果として全長タンパク質から生じた任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１３タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１３３】
（ＮＯＶ１４およびＮＯＶ２３）
ＮＯＶ１４およびＮＯＶ２３核酸もまた本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、本発明に従うＮＯＶ１４およびＮＯＶ２３核酸は、ＮＯＶ１３核酸配列によりコードされるタンパク質の改変体である同一のタンパク質をコードする。ＮＯＶ１３によりコードされるタンパク質は、他の２つのタンパク質に存在しないそのアミノ末端領域の中の配列を含む。開示されるＮＯＶ１４核酸配列およびＮＯＶ２３核酸配列は、それらの非翻訳領域において異なる。コードされるＮＯＶ１３、ＮＯＶ１４、およびＮＯＶ２３ポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３４】
本発明に従うＮＯＶ１４核酸配列は、（配列番号２７）の２７６０ヌクレオチドを含む。この核酸は、６４５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号２８）をコードするオープンリーディングフレームを含む。開始コドンは、ヌクレオチド５２０〜５２２であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド２４５５〜２４５７である。
【０１３５】
本発明に従うＮＯＶ２３核酸配列は、（配列番号４５）の３０８１ヌクレオチドを含み得る。このオープンリーディングフレームは、６４５アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号４６）をコードするオープンリーディングフレームを有する。開始コドンは、ヌクレオチド４６０〜４６２であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド２３９５〜２３９７である。このコードされたポリペプチドは、配列番号２６によりコードされるＮＯＶ１４ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する。
【０１３６】
さらに、ＮＯＶ１４およびＮＯＶ２３タンパク質は、６９０残基のヒトタンパク質ＰＲＯ２２８（ＰＮ ＷＯ９９１４３２８）に同一の６４５残基のうちの６４３残基（９９％）、およびこのタンパク質と陽性の６４５残基のうち６４４残基（９９％）を有する。
【０１３７】
本発明に従うＮＯＶ１４およびＮＯＶ２３タンパク質は、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１４およびＮＯＶ２１タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１３８】
（ＮＯＶ１５）
本発明に従うＮＯＶ１５核酸配列は、ヌクレオチド配列（配列番号２９）を含む。この配列は、７２７ｂｐの長さであり、そして８３アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３０）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド３１２〜３１４であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド５６０〜５６２である。配列番号３０のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．５９の確実性でミトコンドリアマトリクス空間に局在することが予想される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、残基２５と残基２６との間（ＣＲＴ−ＤＬ）に最も有望な切断部位を有するシグナルペプチドが存在するという中程度の確率を予想する。
【０１３９】
このタンパク質は、８４残基のヒトＰＳ２タンパク質前駆体（ＨＰ１．Ａ）（乳癌エストロゲン誘導タンパク質）（ＰＮＲ−２）（ＡＣＣ：Ｐ０４１５５）に同一の３６残基のうちの１０残基（２７％）、およびこのタンパク質と陽性の３６残基のうち１７残基（４７％）を有する。これはまた、コムギレセプター様キナーゼ（ＡＣＣ：ＰＯ８１１１）の２８４残基のフラグメントに同一の４６残基のうちの１５残基（３２％）、およびこのタンパク質と陽性の４６残基のうち２５残基（５４％）を有する。
【０１４０】
開示されるＮＯＶ１５配列は、下垂体から単離された。さらに、ＮＯＶ１５相同配列は、膵臓および唾液腺において見出される。
【０１４１】
ＮＯＶ１５タンパク質は、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１５タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１４２】
（ＮＯＶ１６）
本発明に従うＮＯＶ１６核酸配列は、ヌクレオチド配列（配列番号３１）を含む。この配列は、２７４１ヌクレオチドの長さであり、そして５７８アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３２）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド２８８〜２９０であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド２０２２〜２０２４である。配列番号３２のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．８９２０の確実性で核に局在することが予想される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、おそらく、シグナルペプチドが存在しないことを予想する。
【０１４３】
このコードされたタンパク質は、ヒト上皮成長因子レセプター関連タンパク質（ＡＣＣ：Ｑ０４８４２）の８０残基のフラグメントに同一の４３残基のうちの３７残基（８６％）、およびこのタンパク質と陽性の４３残基のうち３９残基（９０％）を有する。
【０１４４】
ＮＯＶ１６発現は、対応する正常細胞株と比較して、多くの腫瘍細胞株においてダウンレギュレートされる（以下の実施例２を参照のこと）。
【０１４５】
ＮＯＶ１６タンパク質は、本明細書中に記載されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１６タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１４６】
（ＮＯＶ１７）
ＮＯＶ１７は、ＮＯＶ１８の改変体（以下に議論される）である。ＮＯＶ１７は骨髄から単離された。これはまた、骨肉腫、胸腺、胎児腎臓、およびリンパ節において見出される。本発明に従うＮＯＶ１７核酸は、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。この配列は、２５９６ｂｐであり、そして７０８アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３４）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド２８９〜２９１であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド２４１３〜２４１５である。配列番号３４のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．６０００の確実性で原形質膜に局在することが予想される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、おそらく、シグナルペプチドが存在しないことを予想する。
【０１４７】
このコードされたタンパク質は、ヒト上皮成長因子レセプター関連タンパク質（ＡＣＣ：Ｑ０４８４２）の８０残基のフラグメントに同一の８０残基のうちの７０残基（８７％）、およびこのタンパク質と陽性の８０残基のうち７５残基（９３％）を有する。
【０１４８】
ＮＯＶ１７タンパク質は、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１７タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１４９】
（ＮＯＶ１８）
本発明に従うＮＯＶ１８核酸は、配列番号３５のヌクレオチド配列を含む。この核酸は、７０５ヌクレオチドの長さであり、そして１３７アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３６）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド１３５〜１３７であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド５４６〜５４８である。配列番号３６のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．６５０の確実性で原形質膜に局在することが予想される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、残基５２と残基５３との間（ＡＰＳ−ＥＤ）に最も有望な切断部位を有するシグナルペプチドが存在するという確率を予想する。
【０１５０】
このコードされたタンパク質は、４８８残基のヒトストロメライシン−３前駆体（ＥＣ ３．４．２４．−）（マトリクスメタロプロテイナーゼ−１１）（ＭＭＰ−１１）（ＳＴ３）（ＳＬ−３）タンパク質（ＡＣＣ：Ｐ２４３４７）に同一の７３残基のうちの２５残基（３４％）、およびこのタンパク質と陽性の７３残基のうち３６残基（４９％）を有する。
【０１５１】
ＮＯＶ１８は、子宮から単離された。さらに、ＮＯＶ１８は、胎児肝臓、骨髄、子宮、胎児脳、および骨原性肉腫において見出される。
【０１５２】
本発明に従うＮＯＶ１８タンパク質は、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１５タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１５３】
（ＮＯＶ１９）
本発明に従うＮＯＶ１９核酸配列は、配列番号３７のヌクレオチド配列を含む。この核酸配列は、１１５０ヌクレオチドの長さであり、そして１５６アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号３８）をコードするオープンリーディングフレームを含む。配列番号３８のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．６０００の確実性で原形質膜に局在することが予想される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、残基５８と残基５９との間（ＩＳＡ−ＹＭ）に最も有望な切断部位を有するシグナルペプチドが存在するという中程度の確率を予想する。
【０１５４】
このコードされたタンパク質は、１５２残基のヒト腸膜Ａ４タンパク質（分化依存タンパク質Ａ４）（ＡＣＣ：Ｑ０４９４１）に同一の１１２残基のうちの４０残基（３５％）、およびこのタンパク質と陽性の１１２残基のうち６１残基（５４％）を有する。
【０１５５】
本発明に従うＮＯＶ１９タンパク質は、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ１９タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１５６】
ＮＯＶ１９配列は、視床および骨髄において発現される。
【０１５７】
（ＮＯＶ２０）
本発明に従うＮＯＶ２０核酸配列は、（配列番号３９）のヌクレオチド配列を含む。この配列は、１１６１ヌクレオチドの長さであり、そして２６０アミノ酸残基のポリペプチド（配列番号４０）をコードするオープンリーディングフレームを含む。このオープンリーディングフレームの開始コドンは、ヌクレオチド５０５〜５０７であり、そして停止コドンは、ヌクレオチド１２８５〜１２８７である。配列番号４０のタンパク質は、ＰＳＯＲＴプログラムにより、０．４６００の確実性で原形質膜に局在することが予想される。プログラムＳｉｇｎａｌＰは、残基２９と残基３０との間（ＶＶＡ−ＶＰ）に最も有望な切断部位を有するシグナルペプチドが存在するという確率を予想する。
【０１５８】
このコードされたタンパク質は、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ由来の５９５残基のＦ４０Ｅ１０．６タンパク質（ＡＣＣ：Ｑ１９９８５）に同一の２０４残基のうちの７３残基（３５％）、およびこのタンパク質と陽性の２０４残基のうち１１９残基（５８％）を有する。
【０１５９】
ＮＯＶ２０の発現は、多くの組織（例えば、胎盤）に広範に分散される。ＮＯＶ２０は、リンパ節組織から単離された。
【０１６０】
本発明に従うＮＯＶ２０タンパク質は、本明細書中に開示されるＯＲＦによりコードされるものとして開示される完全タンパク質、および翻訳後修飾の結果としてそこから生じる任意の成熟タンパク質を含む。従って、本発明のタンパク質は、ＮＯＶ２０タンパク質の前駆体および活性形態の両方を含む。
【０１６１】
（ＮＯＶＸ核酸）
本発明の新規の核酸は、ＮＯＶＸもしくはＮＯＶＸ様タンパク質、またはその生物学的に活性な部分をコードする核酸を含む。この核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６の１つ以上のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。従って、コードされるポリペプチドは、例えば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、および４２のアミノ酸配列を含み得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６の１つ以上のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかの核酸配列か、またはそのフラグメントを含む。さらに、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかの変異体核酸もしくは改変体核酸か、またはそのフラグメントを含み、これらの塩基のいずれかは、開示される配列から変化され得るが、そのＮＯＶＸ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をまだコードする。本発明はさらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかの核酸配列（これらのフラグメント、誘導体、アナログおよびホモログを含む）の相補鎖を含む。本発明は、さらに、核酸もしくは核酸フラグメント、またはこれらに対する相補鎖を含み、これらの構造は化学修飾を含む。
【０１６３】
ＮＯＶＸコード核酸（例えば、ＮＯＶＸｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸フラグメント、およびＮＯＶＸ核酸分子の増幅または変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとして使用するためのフラグメントがまた含まれる。本明細書中で用いられる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて生成したＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ、ならびにこれらの誘導体、フラグメント、およびホモログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１６４】
「プローブ」とは、可変の長さの核酸配列をいい、好ましくは、使用に依存して、少なくとも約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、１００ｎｔ、または例えば、約６，０００ｎｔの間である。プローブは、同一、類似または相補的な核酸配列の検出において使用される。より長いプローブは、通常、天然供給源または組換え供給源から入手され、非常に特異的であり、そしてオリゴマーよりもはるかに遅くハイブリダイズする。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得、そしてＰＣＲ、メンブレンベースのハイブリダイゼーション技術またはＥＬＩＳＡのような技術において特異性を有するように設計される。
【０１６５】
「単離された」核酸分子は、この核酸の天然の供給源中に存在するその他の核酸分子から分離されているものである。単離された核酸分子の例としては、ベクター中に含まれる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞中に維持される組換えＤＮＡ分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、「単離された」核酸は、この核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中でこの核酸に天然で隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）がない。例えば、種々の実施形態で、単離されたＮＯＶＸ核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然で隣接する、約５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂより少ないヌクレオチド配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ分子は、組換え技法により産生されるとき、その他の細胞物質または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成されるとき、化学物質前駆体もしくはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１６６】
本発明の核酸分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこのヌクレオチド配列のいずれかの相補鎖は、標準的な分子生物学的技法および本明細書で提供される配列情報を用いて単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかの核酸配列のすべてもしくは一部分を用いて、ＮＯＶＸ核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹＹ ＭＡＮＵＡＬ第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、（編）、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるような技法）を用いて単離され得る。
【０１６７】
本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技法に従って、テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡ、および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクター中にクローン化され、そしてＤＮＡ配列分析により特徴付けられ得る。さらに、ＮＯＶＸヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技法、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を用いることにより調製され得る。
【０１６８】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結されたヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応で用いられ得る十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列を基礎にし得るか、またはそれから設計され得、そして特定の細胞もしくは組織において、同一、類似もしくは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅し、確認し、もしくはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ、５０ｎｔ、または１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１５ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さを有する核酸配列の部分を含む。１つの実施形態では、１００ヌクレオチドより少ない長さの核酸分子を含むオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかの少なくとも６つの連続するヌクレオチド、またはその相補物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、化学的に合成され得、そしてプローブとして用いられ得る。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかに示されるヌクレオチド配列の相補鎖である核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかに示されるヌクレオチド配列またはこのヌクレオチド配列の一部、の相補鎖である核酸分子を含む。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に補的である核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して、ミスマッチがほとんどなく水素結合し得る、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかに示されるヌクレオチド配列に十分に相補的な核酸分子である。
【０１７０】
本明細書で用いる用語「相補的」は、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−ＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合をいい、そして用語「結合」は、２つのポリペプチドまたは化合物または関連ポリペプチドまたは化合物またはその組合せ間の物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン的、非イオン的、Ｖｏｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ的、疎水的相互作用などを含む。物理的相互作用は直接的であるかまたは間接的であり得る。間接的相互作用は、別のポリペプチドまたは化合物によるか、またはその影響に起因し得る。直接的結合は、別のポリペプチドもしくは化合物によらないか、またはその影響に起因せずに生じるか、あるいはその他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。
【０１７１】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のいずれかの核酸配列の一部のみ（例えば、プローブもしくはプライマーとして用いられ得るフラグメント、またはＮＯＶＸの生物学的に活性な部分をコードするフラグメント）を含み得る。本明細書中で提供されるフラグメントは、少なくとも６つの（連続した）核酸または少なくとも４つの（連続した）アミノ酸の配列として定義される。これらの長さは、核酸の場合は特異的なハイブリダイゼーションを可能にするのに、アミノ酸の場合はエピトープの特異的認識を可能にするのに、それぞれ十分であり、そして多くとも全長配列よりもいくらか短い。フラグメントは、選択した核酸またはアミノ酸配列の任意の連続した部分に由来し得る。誘導体は、直接的にまたは修飾もしくは部分置換によってのいずれかで、ネイティブ化合物から形成された核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、ネイティブ化合物に類似であるが同一ではなく、特定の成分または側鎖に関して異なる構造を有する、核酸配列またはアミノ酸配列である。アナログは、合成であり得るか、または異なる進化起源に由来し得、そして野生型に比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。
【０１７２】
誘導体およびアナログは、以下に記載のように、誘導体またはアナログが、修飾された核酸またはアミノ酸を含む場合、全長、または全長以外のものであり得る。本発明の核酸またはタンパク質の誘導体またはアナログは、種々の実施形態において、本発明の核酸もしくはタンパク質に、同一の大きさの核酸またはアミノ酸配列にわたって、または整列した配列に比較した場合（この整列は、当該分野で公知であるコンピューター相同性プログラムによって実施される）、少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％もの同一性（好ましい同一性は、８０〜９９％）で実質的に相同であるか、あるいはそのコードする核酸がストリンジェントの、中程度にストリンジェントの、または低いストリンジェントの条件下で上記のタンパク質をコードする配列の相補体にハイブリダイズし得る、領域を含む分子を包含するが、これらに限定されない。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３、および以下を参照のこと。例示のプログラムは、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ ＵＮＩＸＴＭ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）（デフォルト設定を使用；これは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１、２：４８２−４８９、これらは、その全体が参考として本明細書中に援用される）を使用する）である。
【０１７３】
「相同な核酸配列」もしくは「相同なアミノ酸配列」、またはその改変体とは、上記で考察したように、ヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける相同性によって特徴付けられる配列をいう。相同なヌクレオチド配列は、ＮＯＶＸポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの選択的スプライシングの結果として、同一の器官の異なる組織において発現され得る。あるいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種（哺乳動物が挙げられるが、これに限定されず、従って、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよび他の生物が挙げられ得る）のＮＯＶＸポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。相同なヌクレオチド配列はまた、天然に存在する対立遺伝子改変体および本明細書に記載されるヌクレオチド配列の変異体が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、相同なヌクレオチド配列は、ヒトＮＯＶＸタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかの保存的アミノ酸置換（以下参照）、ならびにＮＯＶＸ活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は以下に記載されている。相同なアミノ酸配列は、ヒトＮＯＶＸポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【０１７４】
ヒトＮＯＶＸ遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、例えば他の組織由来の他の細胞型におけるＮＯＶＸ相同体、および他の哺乳動物由来のＮＯＶＸ相同体の開示された細胞型の同定および／またはクローニングにおける使用のために設計されたプローブおよびプライマーの生成を可能にする。代表的には、このプローブ／プライマーは、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。代表的には、このオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５の少なくとも約１２、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００以上の連続的なセンス鎖ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；または配列番号、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５の天然に存在する変異体のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【０１７５】
ヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に基づくプローブを用いて、転写物またはこのタンパク質または相同体タンパク質をコードするゲノム配列を検出し得る。種々の実施形態において、このプローブはさらに、それに結合した標識基を含む。例えば、この標識基は、放射線同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。このようなプローブは、例えば、被験体からの細胞のサンプル中のＮＯＶＸをコードする核酸のレベルを測定すること（例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡレベルを検出することかまたはゲノムＮＯＶＸ遺伝子が変異したかまたは欠失したかどうかを検出すること）により、ＮＯＶＸタンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの一部分として用いられ得る。
【０１７６】
「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、特定の生物学的アッセイで測定した場合、用量依存性であるかまたは用量依存性でない、成熟形態を含む、本発明のポリペプチドの活性に類似の（ただし、必ずしも同一である必要はない）活性を示すポリペプチドをいう。「ＮＯＶＸの生物学的に活性な部分」をコードする核酸フラグメントは、ＮＯＶＸの生物学的活性（ＮＯＶＸタンパク質の生物学的活性は表１にまとめられている）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５の一部を単離すること、（例えば、インビトロの組換え発現により）ＮＯＶＸのコードされた部分を発現すること、およびＮＯＶＸのコードされた部分の活性を評価することにより調製され得る。
【０１７７】
（ＮＯＶＸ改変体）
本発明はさらに、遺伝子コードの縮重に起因して、開示されたＮＯＶＸヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。従って、これらの核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、または４５に示されるヌクレオチド配列によりコードされるのと同じＮＯＶＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１７８】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、または４５のいずれかに示されるヒトＮＯＶＸヌクレオチド配列に加えて、ＮＯＶＸのアミノ酸配列中の変化に至るＤＮＡ配列の多型が集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることとが当業者に認識され得る。ＮＯＶＸ遺伝子におけるこのような遺伝的多型は、自然の対立遺伝子のバリエーションに起因して集団内の個体間で存在し得る。本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子」および「組換え遺伝子」は、ＮＯＶＸタンパク質、好ましくは哺乳動物ＮＯＶＸタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような自然の対立遺伝子バリエーションは、代表的には、ＮＯＶＸ遺伝子のヌクレオチド配列において１−５％の分散を生じ得る。自然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、そしてＮＯＶＸの機能的活性を変えないＮＯＶＸ中のこのようなヌクレオチドのバリエーションおよび得られるアミノ酸多型のいずれかおよび全てが、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１７９】
さらに、他の種からのＮＯＶＸタンパク質をコードし、それ故、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、または４５のいずれかのヒト配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が、本発明の範囲内に含まれることが意図される。本発明のＮＯＶＸ ｃＤＮＡの自然の対立遺伝子改変体および相同体に対応する核酸分子は、ヒトｃＤＮＡ、またはその一部分を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標準的なハイブリダイゼーション技法によるハイブリダイゼーションプローブとして用い、本明細書に開示されたヒトＮＯＶＸ核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離され得る。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、長さが少なくとも６ヌクレオチドであり、そしてストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、または４５のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする。別の実施形態では、この核酸は、長さが少なくとも１０、２５、５０、１００、２５０、５００または７５０ヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、コード領域にハイブリダイズする。本明細書で用いられる場合、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、その条件下で、互いに少なくとも６０％相同性であるヌクレオチド配列が、代表的には互いにハイブリダイズしたままである、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を記載することを意図する。
【０１８１】
相同体（すなわち、ヒト以外の種に由来するＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸）またはその他の関連配列（例えばパラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングについて当該分野において周知の方法を用い、プローブとして特定のヒト配列のすべてまたは一部分との、低、中程度または高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションにより得られ得る。
【０１８２】
本明細書で用いられる場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、プローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、そして異なる状況で異なる。より長い配列は、より短い配列より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下）温度である。標的配列は一般に過剰で存在するので、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態で占有されている。代表的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオンより少なく、代表的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（またはその他の塩）、そして温度が短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０ｎｔ〜５０ｎｔ）について少なくとも約３０℃、そしてより長いプローブ、プライマーおよびオリゴヌクレオチドについて少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような、脱安定化材の添加で達成され得る。
【０１８３】
ストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６に見出され得る。好ましくは、この条件は、代表的には、互いに少なくとも約６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同な配列が、互いにハイブリダイズしたままであるような条件である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非制限的な例は、６５℃における、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む高塩緩衝液におけるハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションは、次いで５０℃における０．２×ＳＳＣ、０．０１％ＢＳＡ中の１回以上の洗浄である。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかの配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書で用いられる場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子をいう。
【０１８４】
第２の実施形態では、配列番号、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子、またはそのフラグメント、アナログまたは誘導体に、中程度のストリンジェンシーの条件下で、ハイブリダイズ可能である核酸配列が提供される。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限的な例は、５５℃における、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーション、続いて３７℃における１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中における１回以上の洗浄である。用いられ得る中程度のストリンジェンシーのその他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【０１８５】
第３の実施形態では、低ストリンジェンシーの条件下で、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のいずれかのヌクレオチド配列を含む核酸分子、そのフラグメント、アナログまたは誘導体にハイブリダイズ可能である核酸が提供される。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の非制限的な例は、４０℃における、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン中のハイブリダイゼーション、次いで５０℃における２×ＳＳＣ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中の１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーのその他の条件は当該分野で周知である（例えば、異種間（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ）ハイブリダイゼーションに用いられる）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ、およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：６７８９−６７９２を参照のこと。
【０１８６】
（保存的変異）
集団中に存在し得るＮＯＶＸ配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、変化が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のいずれかのヌクレオチド配列中に変異により導入され得、それによってＮＯＶＸタンパク質の機能的能力を改変することなく、コードされたＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸中の変化をもたらすことをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換が、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のいずれかの配列中に作成され得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変することなく、ＮＯＶＸの野生型配列から改変され得る残基であり、ここで「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、本発明のＮＯＶＸタンパク質間で保存されているアミノ酸残基は、特に改変されにくいことが予測される。
【０１８７】
ＮＯＶＸファミリーメンバーのメンバー間で保存されているアミノ酸残基は、改変を受けにくいことが予想される。例えば、本発明によるＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸファミリーメンバーにおける代表的に保存された領域である少なくとも１つのドメイン（例えば、表１に示される）を含み得る。従って、これらの保存されたドメインは、変異を受けやすくはないようである。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、ＮＯＶＸファミリーのメンバー間で保存されていないか、または半分だけ保存されたアミノ酸残基）は、活性に必須ではないかもしれず、従って改変を受けやすいようである。
【０１８８】
本発明の別の局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基中の変化を含む、ＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＮＯＶＸタンパク質は、アミノ酸配列において、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれか１つとは異なり、なお生物学的活性を保持する。１つの実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７５％相同であるアミノ酸配列を含む。好ましくは、この核酸分子によりコードされるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれかに少なくとも約８０％相同であり、より好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれか１つに少なくとも約９０％、９５％、９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同である。
【０１８９】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれかのタンパク質に相同であるＮＯＶＸタンパク質をコードする単離された核酸分子は、対応するヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５）中に１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作成され得、これにより１つ以上のアミノ酸置換、付加または欠失がコードされたタンパク質中に導入される。
【０１９０】
変異は、標準技術（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発）によって配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のヌクレオチド配列に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換が、１以上の推定非必須アミノ酸残基にて作製される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される、アミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、以下が挙げられる：塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アルパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）。従って、ＮＯＶＸ中の推定された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖のファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、変異は、ＮＯＶＸコード配列の全てまたは一部に沿って（例えば、飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって）ランダムに導入され得、そして得られる変異体は、ＮＯＶＸの生物学的活性についてスクリーニングされて、活性を維持する変異体を同定し得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５の変異誘発に続いて、コードされるタンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技術によって発現され得、そしてこのタンパク質の活性が決定され得る。
【０１９１】
１つの実施形態では、変異ＮＯＶＸタンパク質は、以下についてアッセイされ得る：（１）他のＮＯＶＸタンパク質、他の細胞表面タンパク質、または生物学的に活性なそれらの部分と、タンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力、（２）変異ＮＯＶＸタンパク質と、ＮＯＶＸのレセプターとの間の複合体形成；（３）変異ＮＯＶＸタンパク質が細胞内標的タンパク質またはその生物学的に活性な部分に結合する能力；（例えば、アビジンタンパク質）；（４）ＢＲＡタンパク質に結合する能力；あるいは（５）抗ＮＯＶＸタンパク質抗体に特異的に結合する能力。
【０１９２】
（アンチセンス）
本発明の別の局面は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体のヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズし得るかまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的であるかまたはｍＲＮＡ配列に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面では、ＮＯＶＸコード鎖の少なくとも約１０、約２５、約５０、約１００、約２５０もしくは約５００ヌクレオチドまたはその全体に、またはそれらの一部のみに相補的な配列を含む、アンチセンス核酸分子が提供される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかのＮＯＶＸタンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のＮＯＶＸの核酸配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【０１９３】
１つの実施形態では、アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域をいう（例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかに対応する、ヒトＮＯＶＸのタンパク質コード領域）。別の実施形態では、このアンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、コード領域に隣接する、アミノ酸に翻訳されない、５’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいわれる）。
【０１９４】
本明細書中に開示されるＮＯＶＸをコードするコード鎖配列（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５）を考慮すれば、本発明のアンチセンス核酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の規則に従って設計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５または約５０ヌクレオチドであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学的合成または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、またはこの分子の生物学的安定性を増大させるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成され得る（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが用いられ得る）。
【０１９５】
アンチセンス核酸を作製するために用いられ得る改変されたヌクレオチドの例としては以下が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下の小節にさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向のＲＮＡである）。
【０１９６】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には被験体に投与されるか、またはインサイチュで生成され、その結果それらは、ＮＯＶＸタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか、またはそれに結合し、それによってこのタンパク質の発現を、例えば転写および／または翻訳を阻害することによって阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によってか、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝（ｍａｊｏｒ ｇｒｏｏｖｅ）における特異的相互作用を介してであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例としては、組織部位での直接的注射が挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するように改変され得、次いで全身に投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、そのアンチセンス核酸分子を細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することによって、選択された細胞表面上に発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。このアンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載されるベクターを用いて細胞に送達され得る。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれているベクター構築物が、好ましい。
【０１９７】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する。ここで、通常のβ−ユニットとは対照的に、鎖は、互いに平行に走行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６６２５〜６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５：６１３１〜６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２１５：３２７〜３３０）を含み得る。
【０１９８】
（リボザイムおよびＰＮＡ部分）
このような改変としては、非限定的な例として、改変塩基、および糖リン酸骨格が改変または誘導体化された核酸が挙げられる。これらの改変は、少なくとも一部は、改変された核酸の化学的安定性を増強するために実施され、その結果、それらは、例えば、被験体での治療的適用におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０１９９】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムは、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を切断し得るリボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡ分子であり、これらは、その一本鎖核酸に対して相補領域を有する。従って、リボザイム（例えば、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５〜５９１に記載される））を使用して、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断し、それによってＮＯＶＸ ｍＲＮＡの翻訳を阻害し得る。ＮＯＶＸをコードする核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＮＯＶＸ ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５）に基づいて設計され得る。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＮＯＶＸをコードするｍＲＮＡ内で切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９ ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体が構築され得る。例えば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。あるいは、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒性ＲＮＡを選択し得る。例えば、Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１４１１〜１４１８を参照のこと。
【０２００】
あるいは、ＮＯＶＸ遺伝子発現は、ＮＯＶＸの調節領域（例えば、ＮＯＶＸのプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化し、標的細胞中でＮＯＶＸ遺伝子の転写を妨害する三重らせん構造を形成することによって阻害され得る。一般には、Ｈｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６：５６９〜８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７〜３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １４：８０７〜１５を参照のこと。
【０２０１】
種々の実施形態において、ＮＯＶＸの核酸は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格で改変され、例えば、その分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは可溶性を改善し得る。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を生成し得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４：５〜２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」は、デオキシリボースリン酸骨格が偽ペプチド骨格によって置換され、そして４つの天然の核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）のみが保持されている核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）をいう。ＰＮＡの中性の骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、上記のＨｙｒｕｐら（１９９６）；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ ９３：１４６７０〜６７５において記載されるような標準的固相ペプチド合成プロトコルを用いて行われ得る。
【０２０２】
ＮＯＶＸのＰＮＡは、治療的適用および診断的適用において使用され得る。例えば、ＰＮＡは、例えば転写または翻訳の停止を誘導することまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンスまたは抗遺伝子剤として使用され得る。ＮＯＶＸのＰＮＡはまた、例えばＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピングによる遺伝子における一塩基対変異の分析において；他の酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ）と組み合わせて使用される場合に人工制限酵素として（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．（１９９６）上記）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブもしくはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６）、上記）、使用され得る。
【０２０３】
別の実施形態において、ＮＯＶＸのＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細胞性取り込みを増強するために、ＰＮＡに親油性基または他のヘルパー基を結合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、またはリポソームもしくは当該分野において公知の薬物送達の他の技術の使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組合せ得る、ＮＯＶＸのＰＮＡ−ＤＮＡキメラが生成され得る。ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供する一方で、そのようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基のスタッキング、核塩基間の結合数および方向に関して選択される適切な長さのリンカーを使用して連結され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３３５７〜６３において記載されるように行われ得る。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的なホスホルアミダイトカップリング化学を用いて固体支持体上で合成され得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）が、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １７：５９７３〜８８）。次いで、ＰＮＡモノマーが段階様式でカップリングされ、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成する（Ｆｉｎｎら（１９９６）上記）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを用いて、キメラ分子が合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ５：１１１９〜１１１２４を参照のこと。
【０２０４】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付属の基を含み得る：ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、または細胞膜を横切る輸送を容易にする因子（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８〜９７６を参照のこと）、またはインターカレーター剤（例えば、Ｚｏｎ，１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）で改変され得る。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤など）に結合され得る。
【０２０５】
（ＮＯＶＸポリペプチド）
本発明の新規のタンパク質は、その配列が配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかに提供されるＮＯＶＸ様タンパク質を含む。本発明はまた、なおそのＮＯＶＸ様活性および生理学的機能を維持するタンパク質またはその機能的フラグメントをコードするが、その任意の残基が図１に示される対応する残基から変化し得る、変異体または改変体タンパク質を含む。例えば、本発明は、上記の改変体ＮＯＶＸ核酸によってコードされるポリペプチドを含む。この変異体または改変体タンパク質において、２０％までまたはそれ以上の残基がそのように変更され得る。
【０２０６】
一般に、ＮＯＶＸ様機能を保持するＮＯＶＸ様改変体は、配列中の特定位置の残基が他のアミノ酸により置換された任意の改変体を含み、そしてさらに、親タンパク質の２つの残基の間にさらなる残基を挿入する可能性、および親配列から１つ以上の残基を欠失する可能性を含む。任意のアミノ酸の置換、挿入または欠失が、本発明によって包含される。好適な状況では、この置換は、上記で規定されるような保存的置換である。さらに、本発明の範囲を限定しないが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかの位置が、変異体または改変体タンパク質が１以上の置換を含み得るように置換され得る。
【０２０７】
本発明はまた、単離されたＮＯＶＸタンパク質、およびその生物学的に活性な部分、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログを含む。抗ＮＯＶＸ抗体を惹起するための免疫原としての使用に適するポリペプチドフラグメントもまた提供される。１つの実施形態では、ネイティブなＮＯＶＸタンパク質が、標準的なタンパク質精製技術を用いる適切な精製スキームにより、細胞または組織供給源から単離され得る。別の実施形態では、ＮＯＶＸタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生産される。組換え発現の代替法として、ＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成され得る。
【０２０８】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の由来する細胞または組織供給源由来の細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合に化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含み、この調製物において、このタンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性成分から、このタンパク質は分離されている。１つの実施形態において、用語「細胞性物質を実質的に含まない」は、非ＮＯＶＸタンパク質（本明細書中において「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約２０％未満、なおより好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約１０％未満、そして最も好ましくは非ＮＯＶＸタンパク質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、好ましくは、これはまた培養培地を実質的に含まない。すなわち、培養培地は、そのタンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最も好ましくは約５％未満に相当する。
【０２０９】
用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、タンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から分離されているＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」は、化学物質前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約３０％未満（乾燥重量にて）、より好ましくは化学物質前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約２０％未満、なおより好ましくは化学物質前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約１０％未満、そして最も好ましくは化学物質前駆体または非ＮＯＶＸ化学物質を約５％未満有する、ＮＯＶＸタンパク質の調製物を含む。
【０２１０】
ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、全長ＮＯＶＸタンパク質より少ないアミノ酸を含みかつＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を示す、ＮＯＶＸタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列）に十分に相同であるかまたはそのようなアミノ酸配列に由来する、アミノ酸配列を含むペプチドを含む。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００またはそれより多いアミノ酸である、ポリペプチドであり得る。
【０２１１】
本発明のＮＯＶＸタンパク質の生物学的に活性な部分は、ＦＧＦファミリータンパク質間に保存される上記の同定されたドメインの少なくとも１つ（例えば、ＴＳＲモジュール）を含み得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、そしてネイティブなＮＯＶＸタンパク質の機能的活性のうちの１つ以上について評価され得る。
【０２１２】
１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかに示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかに実質的に相同であり、そして以下に詳細に議論されるように、天然の対立遺伝子の変動または変異誘発に起因してアミノ酸配列が異なるが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかのタンパク質の機能的活性を保持する。従って、別の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同、より好ましくは約５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％までも相同なアミノ酸配列を含み、かつ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６の配列を有する対応するポリペプチドのＮＯＶＸタンパク質の機能的活性を保持する、タンパク質である。
【０２１３】
（２つ以上の配列間の相同性の決定）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性の百分率を決定するために、配列は、至適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップが、配列間の最適な整列について比較される配列のいずれかに導入され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、分子はその位置で相同である（すなわち、本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等価である）。
【０２１４】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当該分野において公知のコンピュータープログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて提供されるＧＡＰソフトウェア）を用いて決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ １９７０ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４８：４４３〜４５３を参照のこと。核酸配列比較のための以下の設定（ＧＡＰ作製ペナルティー、５．０、およびＧＡＰ伸長ペナルティー、０．３）を用いてＧＣＧ ＧＡＰソフトウェアを使用すると、上記で言及される類似の核酸配列のコード領域は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性の程度を示す。
【０２１５】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、特定の比較領域にわたって、残基毎を基準として同一である程度をいう。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、以下により算出される：その比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、核酸の場合にはＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を明らかにすること、この一致した位置の数を比較領域の内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して、配列同一性のパーセンテージを導くこと。用語「実質的な同一性」は、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここでこのポリヌクレオチドは、比較領域にわたり参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、そして頻繁には９０〜９５％の配列同一性、より通常には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）残基の百分率」は、以下により算出される：その比較領域にわたって最適に整列された２つの配列を比較すること、同一のアミノ酸および上記のように規定される保存的アミノ酸置換が両方の配列において存在する位置の数を決定して一致した位置の数を導くこと、この一致した位置の数を比較領域中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算すること、およびその結果を１００で乗算して陽性残基の百分率を導くこと。
【０２１６】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用される場合、ＮＯＶＸ「キメラタンパク質」またはＮＯＶＸ「融合タンパク質」は、非ＮＯＶＸポリペプチドに作動可能に連結された、ＮＯＶＸポリペプチドを含む。「ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＮＯＶＸポリペプチド」は、ＮＯＶＸタンパク質に対して実質的に相同ではないタンパク質（例えば、ＮＯＶＸタンパク質とは異なりかつ同一生物かまたは異なる生物に由来する、タンパク質）に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。ＮＯＶＸ融合タンパク質において、このＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸタンパク質のすべてまたは一部分に対応し得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質において、用語「作動可能に連結された」は、ＮＯＶＸポリペプチドおよび非ＮＯＶＸポリペプチドが、インフレームで互いに融合されていることを示すことが意図される。非ＮＯＶＸポリペプチドは、ＮＯＶＸポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。
【０２１７】
例えば、１つの実施形態では、ＮＯＶＸ融合タンパク質は、第２のタンパク質の細胞外ドメインに作動可能に連結されたＮＯＶＸポリペプチドを含む。このような融合タンパク質は、ＮＯＶＸ活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイでさらに利用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【０２１８】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質であり、ここではＮＯＶＸ配列が、ＧＳＴ（すなわち、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合される。このような融合タンパク質は、組換えＮＯＶＸの精製を容易にし得る。
【０２１９】
なお別の実施形態において、この融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含むＮＯＶＸタンパク質である。例えば、ネイティブＮＯＶＸシグナル配列が除去され得、そして別のたんぱく質由来のシグナル配列で置換され得る。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）において、ＮＯＶＸの発現および／または分泌は、異種シグナル配列の使用を介して増加され得る。
【０２２０】
別の実施形態においては、この融合タンパク質は、ＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質であり、ここでは１つ以上のドメインを含むＮＯＶＸ配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合される。本発明のこのＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、薬学的組成物中に取り込まれ得、そして被験体に投与され得て、細胞の表面上でＮＯＶＸリガントとＮＯＶＸタンパク質との間の相互作用を阻害し、それによってインビボでＮＯＶＸ媒介シグナル伝達を抑制し得る。１つの非限定的な例においては、意図される本発明のＮＯＶＸリガンドは、ＮＯＶＸレセプターである。このＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質を用い、ＮＯＶＸ同族リガンドのバイオアベイラビリティーを調節し得る。ＮＯＶＸリガンド／ＮＯＶＸ相互作用の阻害は、増殖障害および分化障害（例えば、癌）の処置、および細胞生存を調節（例えば、促進または阻害）することの両方に、治療的に有用であり得る。さらに、本発明のＮＯＶＸ−免疫グロブリン融合タンパク質は、被験体中で抗ＮＯＶＸ抗体を産生するための免疫原として、ＮＯＶＸリガンドを精製するため、そしてＮＯＶＸリガンドとのＮＯＶＸの相互作用を阻害する分子を同定するスクリーニングアッセイにおいて、用いられ得る。
【０２２１】
本発明のＮＯＶＸキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技法により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを、従来の技法に従って、例えば、連結のための平滑化末端または付着化（ｓｔａｇｇｅｒ）末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な付着（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端の充填、所望しない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用することにより、インフレームで一緒に連結する。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技法により合成し得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を、２つの連続する遺伝子フラグメント間に相補的突出を生じるアンカープライマーを用いて実施し得、この遺伝子フラグメントは、キメラ遺伝子配列を生成するために次いでアニールおよび再増幅され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードした多くの発現ベクターが市販されている。ＮＯＶＸをコードする核酸は、この融合部分がＮＯＶＸタンパク質にインフレーム連結されるように、このような発現ベクター中にクローン化され得る。
【０２２２】
（ＮＯＶＸアゴニストおよびＮＯＶＸアンタゴニスト）
本発明はまた、ＮＯＶＸアゴニスト（模倣物）またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体に関する。ＮＯＶＸタンパク質の改変体が、変異誘発（例えば、ＮＯＶＸタンパク質の分散した点変異または短縮）により生成され得る。ＮＯＶＸタンパク質のアゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質と実質的に同じ生物学的活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。ＮＯＶＸタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在する形態のＮＯＶＸタンパク質の１つ以上の活性を、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流メンバーに競合的に結合することにより阻害し得る。従って、特定の生物学的効果が、限られた機能の改変体を用いた処理により惹起され得る。１つの実施形態では、このタンパク質の天然に存在する形態の生物学活性のサブセットを有する改変体を用いた被験体の処置は、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する形態を用いた処置に対してより少ない副作用を被験体において有する。
【０２２３】
ＮＯＶＸアゴニスト（模倣物）またはＮＯＶＸアンタゴニストのいずれかとして機能するＮＯＶＸタンパク質の改変体は、ＮＯＶＸタンパク質のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性のためのＮＯＶＸタンパク質の変異体（例えば短縮型変異体）のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る。１つの実施形態では、ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、核酸レベルのコンビナトリアル変異誘発により生成され、そして多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ＮＯＶＸ改変体の多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を、潜在的なＮＯＶＸ配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとしてかあるいはその中にＮＯＶＸ配列のセットを含む（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質のセットとして発現可能であるように、遺伝子配列に酵素的に連結することにより産生され得る。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＮＯＶＸ改変体のライブラリーを産生するために用いられ得る種々の方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は、自動化ＤＮＡ合成機中で実施され得、次いでこの合成遺伝子は、適切な発現ベクター中に連結される。遺伝子の縮重セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＮＯＶＸ配列の所望のセットをコードする配列のすべての供給を可能にする。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当該分野で公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １１：４７７を参照のこと）。
【０２２４】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＮＯＶＸタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーを用いて、ＮＯＶＸタンパク質の改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のためのＮＯＶＸフラグメントの多彩な集団を生成し得る。１つの実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリーは、ＮＯＶＸコード配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、１分子あたり約１つのみニックが生じる条件下でヌクレアーゼで処理すること、二本鎖ＤＮＡを変性させること、異なるニック産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成するためにこのＤＮＡを再生すること、Ｓ１ヌクレアーゼを用いた処理により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去すること、および得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に連結することにより生成し得る。この方法により、ＮＯＶＸタンパク質の種々のサイズのＮ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーが派生し得る。
【０２２５】
点変異または短縮により作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された性質を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技法が当該分野で公知である。このような技法を、ＮＯＶＸタンパク質のコンビナトリアル変異誘発により生成された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適用可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット分析に適した最も広く用いられる技法は、代表的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングすること、得られるベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、およびこのコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で発現することを含む。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を増大する新規技法である再帰性アンサンブル変異誘発（ｒｅｃｒｕｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて用い、ＮＯＶＸ改変体を同定し得る（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６：３２７−３３１）。
【０２２６】
（抗ＮＯＶＸ抗体）
本発明は、本発明のタンパク質のいずれかに免疫特異的に結合する抗体および抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２）をさらに包含する。
【０２２７】
単離されたＮＯＶＸタンパク質またはその一部もしくはフラグメントは、ポリクロナール抗体およびモノクロナール抗体の調製のための標準的な技術を用いて、ＮＯＶＸに結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。全長ＮＯＶＸタンパク質が使用され得る。あるいは、本発明は、免疫原として使用するためのＮＯＶＸの抗原性ペプチドフラグメントを提供する。ＮＯＶＸの抗原性ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のいずれかにおいて示されるアミノ酸配列の少なくとも４アミノ酸残基を含む。この抗原性ペプチドは、そのペプチドに対して惹起された抗体がＮＯＶＸと特異的な免疫複合体を形成するように、ＮＯＶＸのエピトープを含む。この抗原性ペプチドは、少なくとも６アミノ酸残基、少なくとも８アミノ酸残基、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、または少なくとも３０アミノ酸残基を含み得る。本発明の１つの実施形態において、この抗原性ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれかの少なくとも６個連続するアミノ酸を含む、ポリペプチドを含む。
【０２２８】
本発明の１つの実施形態では、抗原性ペプチドにより包含されるエピトープは、ＮＯＶＸタンパク質の表面上に位置するＮＯＶＸの領域（例えば、親水性領域）である。抗体産生を標的とするための手段として、親水性領域および疎水性領域を示すヒドロパシープロットを、例えば、フーリエ変換を用いるかまたは用いない、Ｋｙｔｅ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法またはＨｏｐｐ Ｗｏｏｄｓ法を含む、当該分野で周知の任意の方法により生成し得る。例えば、それらの全体が各々本明細書に参考として援用される、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ １９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２を参照のこと。
【０２２９】
本明細書中に開示されるように、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれかのＮＯＶＸタンパク質配列、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の産生における免疫原として使用され得る。用語「抗体」とは、本明細書中に使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原（例えば、ＮＯＶＸ）に特異的に結合（免疫反応）する、抗原結合部位を含む分子）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヒトＮＯＶＸタンパク質に対する抗体が開示される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、および４６のいずれかのＮＯＶＸタンパク質配列、あるいはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生のための当該分野で公知の種々の手順が、使用され得る。
【０２３０】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）を、ネイティプタンパク質、またはその合成改変体、または前述の誘導体での注射により免疫化し得る。適切な免疫原調製物は、例えば、組換えにより発現されたＮＯＶＸタンパク質または化学的に合成されたＮＯＶＸポリペプチドを含有し得る。この調製物は、アジュバントをさらに含み得る。免疫学的応答を増大するために用いられる種々のアジュバントは、制限されずに、フロイントの完全および不完全アジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍのようなヒトアジュバント、または類似の免疫刺激剤を含む。所望であれば、ＮＯＶＸに対して惹起された抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液）から単離され、そしてさらに、ＩｇＧフラクションを得るためのプロテインＡクロマトグラフィーのような、周知の技法により精製され得る。
【０２３１】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、ＮＯＶＸの特定のエピトープと免疫反応し得る抗原結合部位の特定の１種のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、代表的には、モノクローナル抗体組成物は、それと免疫反応する特定のＮＯＶＸタンパク質に対し、単一の結合親和性を示す。特定のＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは相同体に対して惹起されたモノクローナル抗体の調製には、連続的な細胞株培養による抗体分子の産生のために提供する任意の技法が利用され得る。このような技法は、制限されずに、ハイブリドーマ技法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ技法；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）を含む。ヒトモノクローナル抗体を、本発明の実施において利用し得、そしてヒトハイブリドーマを用いることによるか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８０：２０２６−２０３０を参照のこと）、またはインビトロでヒトＢ細胞をエプスタイン−バーウイルスで形質転換することにより（Ｃｏｌｅら、１９８５ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ ＣＡＮＣＥＲ ＴＨＥＲＡＰＹ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．７７−９６頁を参照のこと）産生され得る。上記の引用の各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０２３２】
本発明によれば、技法は、ＮＯＶＸタンパク質に特異的な単鎖抗体の産生のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適合され得（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）、ＮＯＶＸタンパク質配列、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくは相同体に対し、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にする。非ヒト抗体は、当該分野で周知の技法により「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。上記引用文献の各々は、本明細書中で参考として援用される。ＮＯＶＸタンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントを、当該分野で公知の技法により産生し得、これには、制限されないで：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）抗体分子のパパインおよび還元剤での処理により生成されるＦａｂフラグメントおよび（ｉｖ）Ｆｖフラグメントが含まれる。
【０２３３】
さらに、ヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体のような、組換え抗ＮＯＶＸ抗体（これらは、標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野で公知の組換えＤＮＡ技術により生成され得る。この技術は例えば、以下に記載の方法を用いる：国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願番号１８４，１８７号；欧州特許出願番号１７１，４９６；欧州特許出願番号１７３、４９４；ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８０：１５５３〜１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；ならびにＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４１：４０５３〜４０６０。上記引用の各々は、それらの全体において参考として本明細書中に援用される。
【０２３４】
１つの実施形態において、所望の特異性を保有する抗体のスクリーニングのための方法論は、当該分野内で公知の酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これに限定されない。特定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質の特定のドメインに対して特異的である抗体の選抜は、このようなドメインを所有しているＮＯＶＸタンパク質のフラグメントに結合するハイブリドーマの生成により容易にされる。ＮＯＶＸタンパク質内の１つ以上のドメイン（例えば、ＦＧＦ−９、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログと比較した場合、ＮＯＶＸに特異的な第１の５０個のアミノ酸残基をスパニングするドメイン）に対して特異的である抗体もまた、本明細書中に提供される。
【０２３５】
抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質の局在化および／または定量化に関する当該分野で公知の方法において用いられ得る（例えば、適切な生理学的なサンプル内のＮＯＶＸタンパク質のレベルを測定する使用のために、診断的方法における使用のために、タンパク質の画像化における使用のために、など）。所定の実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログの抗体（抗体由来の結合ドメインを含む）は、薬理学的に活性な化合物［本明細書中、以降において「治療剤」］として利用される。
【０２３６】
抗ＮＯＶＸ抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、標準技術（例えばアフィニティークロマトグラフィまたは免疫沈降）によって、ＮＯＶＸを単離するために用いられ得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、細胞からの天然のＮＯＶＸ、そして宿主細胞において発現される組換え的に産生されたＮＯＶＸの精製を容易にし得る。さらに、抗ＮＯＶＸ抗体が、（例えば、細胞の溶菌液または細胞上清における）ＮＯＶＸタンパク質を検出するために用いられ、ＮＯＶＸタンパク質の発現の量およびパターンを評価し得る。抗ＮＯＶＸ抗体は、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験の手順の一部として組織におけるタンパク質レベルを診断的にモニターするために用いられ得る。検出は、抗体を検出可能物質に連結する（すなわち、物理的に連結する）ことにより容易になり得る。検出可能物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光材料、生物発光材料および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光材料の例としては、ルミノールが挙げられる；生物発光材料の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして、適切な放射性物質の例としては１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２３７】
（ＮＯＶＸ組換えベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＮＯＶＸタンパク質、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、これが接続された別の核酸を輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、これはさらなるＤＮＡセグメントが連結し得る環状の二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の型はウイルス性ベクターであり、ここでさらなるＤＮＡセグメントはこのウイルス性ゲノムに連結され得る。特定のベクターは宿主細胞中で自発的に複製し得、この中に導入される（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入される際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、そしてこれによって宿主のゲノムと同調して複製される。さらに、特定のベクターは、これが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、このプラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、ウイルス性ベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのこのような他の形態を含むことを意図し、これは等価な機能を果たす。
【０２３８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で含み、これはこの組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に基いて選択される１つ以上の調節配列を含むこと意味し、これは発現される核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする（例えば、このベクターが宿主細胞に導入される場合、インビトロ転写／翻訳系または宿主細胞において）ような様式で調節配列に連結されることを意味することを意図する。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指向する配列、および特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指向する配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計が形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどのような因子に依存し得ることは当業者に理解される。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それにより、本明細書に記載されるような核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融合ペプチドを含む）（例えば、ＮＯＶＸタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０２３９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞における、ＮＯＶＸタンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞において発現され得る。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）においてさらに考察される。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０２４０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、最も頻繁には、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を指向する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含むベクターを有するＥ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質に、通常、組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、代表的には、以下の３つの目的のために役立つ：（１）組換えタンパク質の発現を増加させること；（２）組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および（３）親和性精製においてリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製の際に補助すること。しばしば、融合発現ベクターにおいて、タンパク質分解の切断部位が、融合部分の結合部に導入され、そして融合タンパク質の精製の後に、組換えタンパク質が組換えタンパク質の融合部分から分離されることを可能にする。このような酵素、およびその同族の認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼを含む。代表的な融合発現ベクターとしては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ、標的の組換えタンパク質に融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられる。
【０２４１】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。
【０２４２】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための１つのストラテジーは、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中でタンパク質を発現させることである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９−１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術によって実行され得る。
【０２４３】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅにおける発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、（１９８２）Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、（１９８７）Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０２４４】
あるいは、ＮＯＶＸは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）中でタンパク質の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（ＬｕｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
【０２４５】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ ６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞中で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核生物細胞および真核生物細胞の両方のための他の適切な発現系については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章および第１７章を参照のこと。
【０２４６】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）中で優先的に核酸の発現を指向し得る。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例としては、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞レセプタープロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ ８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、ミルク乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターもまた含まれる（例えば、マウスホックス（ｍｕｒｉｎｅ ｈｏｘ）プロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：５３７−５４６）。
【０２４７】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写によって）を可能にする様式で調節配列に作動可能に連結される。種々の細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の連続的な発現を指向する、アンチセンス方向でクローニングされた核酸に作動可能に連結される調節配列が選択され得る。例えば、アンチセンスＲＮＡの直接的な構成的発現、組織特異的発現、または細胞型特異的発現を指向する、ウイルスプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、または調節配列が選択され得る。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒化されたウイルスの形態であり得、ここではアンチセンス核酸は、高効率調節領域の制御下で産生され、その活性は、ベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺伝子を使用する遺伝子発現の調節の議論については、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１巻（１）１９８６を参照のこと。
【０２４８】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現べクターが導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で、交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象の細胞をいうのみでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫をいうことが理解される。変異または環境的影響のいずれかに起因して、特定の改変は次の世代において存在し得るので、このような子孫は、実際、親の細胞と同一でないかもしれないが、なお、本明細書中で使用されるような用語の範囲内に含まれる。
【０２４９】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０２５０】
ベクターＤＮＡは、従来的な形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、外来性の核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための当該分野で認識される種々の技術をいうことを意図し、これらには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）および他の実験室マニュアルに見出され得る。
【０２５１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部のみが外来ＤＮＡをそのゲノムに組み込み得ることが知られている。これらの組込み物を同定および選択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、一般的には目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーには、薬物に対する耐性を付与するもの（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキセート）が含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ＮＯＶＸをコードするベクターと同じベクター上で宿主細胞に導入され得るか、あるいは別々のベクター上で導入され得る。導入された核酸とともに安定にトランスフェクトされる細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存し、一方、他の細胞は死滅する）。
【０２５２】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）は、ＮＯＶＸタンパク質を産生（すなわち、発現）するために使用され得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用して、ＮＯＶＸタンパク質を産生するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸタンパク質が産生されるような適切な培地中で、本発明の宿主細胞（ここに、ＮＯＶＸをコードする組換え発現ベクターが導入された）を培養する工程を包含する。別の実施形態において、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＮＯＶＸを単離する工程を包含する。
【０２５３】
（トランスジェニック動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＮＯＶＸコード配列が導入される、受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような宿主細胞は、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得、ここで外因性のＮＯＶＸ配列は、それらのゲノムまたは相同組換え動物（ここで内因性のＮＯＶＸ配列が変更されている）に導入される。このような動物は、ＮＯＶＸの機能および／または活性を研究するため、ならびにＮＯＶＸの活性のモジュレーターを同定および／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」とは、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯動物であり、ここでこれらの動物の１つ以上の細胞は、導入遺伝子を含む。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれ（この細胞からトランスジェニック動物が発生する）、そして成熟動物のゲノムに残存する外因性のＤＮＡであり、それによって、このトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード遺伝子産物の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは、非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスであり、ここで、内因性ＮＯＶＸ遺伝子は、この内因性の遺伝子と、動物の発生の前に動物の細胞（例えば、動物の胚細胞）に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって、変更されている。
【０２５４】
本発明のトランスジェニック動物は、ＮＯＶＸをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染によって、受精した卵母細胞の雄性前核に導入すること、およびこの卵母細胞が偽妊娠雌性フォスター動物（ｆｏｓｔｅｒ ａｎｉｍａｌ）中で発生することを可能にすることによって作製され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５の、ヒトＮＯＶＸ ＤＮＡ配列は、非ヒト動物のゲノムに導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログ（例えば、マウスＮＯＶＸ遺伝子）は、ヒトＮＯＶＸ ｃＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて単離され得（上にさらに記載される）、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルもまた導入遺伝子中に含まれ、その導入遺伝子の発現の効率を増大させ得る。組織特異的調節配列（単数または複数）は、特定の細胞に対して、ＮＯＶＸタンパク質の発現を指向するために、ＮＯＶＸ導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚の操作およびマイクロインジェクションを介するトランスジェニック動物（特に、マウスのような動物）を生成するための方法は、当該分野で従来的になっており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ １９８６、ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ ＴＨＥ ＭＯＵＳＥ ＥＭＢＲＹＯ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。同様の方法は、他のトランスジェニック動物の作製のために使用される。トランスジェニック初代動物は、そのゲノムにおけるＮＯＶＸ導入遺伝子の存在および／またはその動物の組織または細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェニック初代動物は、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させるために使用され得る。さらに、ＮＯＶＸをコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、さらに、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物に繁殖され得る。
【０２５５】
相同組換え動物を作製するために、欠失、付加、または置換が導入されて、それによってＮＯＶＸ遺伝子が変化（例えば、機能的に破壊）されている、少なくとも、ＮＯＶＸ遺伝子の一部を含むベクターを調製する。ＮＯＶＸ遺伝子はヒト遺伝子（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５）であり得るが、より好ましくは、ヒトＮＯＶＸ遺伝子の非ヒトホモログである。例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、および４５のヒトＮＯＶＸ遺伝子のマウスホモログは、マウスゲノムにおいて内因性ＮＯＶＸ遺伝子を変更するのに適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施形態において、そのベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が、機能的に破壊される（すなわち、機能的タンパク質をもはやコードしない；「ノックアウト」ベクターともいわれる）ように設計される。
【０２５６】
あるいは、このベクターは、相同組換えに際して、内因性ＮＯＶＸ遺伝子が変異されるか、あるいは他の様式で変更されるが、なお機能性タンパク質をコードするように設計され得る（例えば、上流の調節領域を変更して、それによって内因性ＮＯＶＸタンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＮＯＶＸ遺伝子の変更された部分は、ＮＯＶＸ遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端および３’末端で隣接され、相同組換えが、ベクターによって運ばれる外因性ＮＯＶＸ遺伝子と胚幹細胞中の内因性ＮＯＶＸ遺伝子との間で起こることを可能にする。さらなる隣接するＮＯＶＸ核酸は、内因性遺伝子との首尾よい相同組換えに十分な長さである。代表的に、数キロベースの隣接するＤＮＡ（５’末端および３’末端の両方における）が、ベクターに含まれる。例えば、相同組換えベクターの記載について、Ｔｈｏｍａｓら（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：５０３を参照のこと。このベクターは、胚幹細胞株に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、この導入されたＮＯＶＸ遺伝子が内因性ＮＯＶＸ遺伝子と相同組換えされた細胞が、選択される（例えば、Ｌｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６９：９１５を参照のこと）。
【０２５７】
次いで、この選択された細胞を、動物（例えば、マウス）の胚盤胞へ注入して、凝集キメラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９８７）のＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡＳ ＡＮＤ ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ、Ｏｘｆｏｒｄ １１３頁〜１５２頁を参照のこと。次いで、このキメラ胚を、適切な偽妊娠雌性フォスター動物に移植し得、そしてこの胚を、一定期間置く。それらの胚芽細胞中に相同組換えＤＮＡを保有する子孫を使用して、動物を繁殖し得、ここで、この動物の全ての細胞は、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同組換えされたＤＮＡを含む。相同的組換えベクターおよび相同的組換え動物を構築するための方法が、さらに以下に記載される；Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２：８２３−８２９；ＰＣＴ国際公開番号：ＷＯ９０／１１３５４；ＷＯ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９。
【０２５８】
別の実施形態において、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択された系を含む、非ヒトトランスジェニック動物が産生され得る。このような系の１つの例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系である（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が導入遺伝子の発現を調節するために使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が、必要となる。このような動物は、例えば、２種のトランスジェニック動物（一方は選択されたタンパク質をコードした導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードした導入遺伝子を含む）を交配することによる、「二重の」トランスジェニック動物の構築によって提供され得る。
【０２５９】
本明細書中に記載されるトランスジェニック非ヒト動物のクローンがまた、Ｗｉｌｍｕｔら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３に記載される方法に従って、産生され得る。簡単には、トランスジェニック動物からの細胞（例えば、体細胞）を、単離および誘導し、増殖サイクルから出させて、そしてＧ０期に入らせ得る。次いで、静止細胞を、例えば、電気パルスの使用により、静止細胞が単離される同種動物由来の、摘出された卵母細胞へ融合し得る。次いで、この再構成された卵母細胞を培養し、これにより、これは桑実胚または未分化胚芽細胞に発達し、次いで、偽妊娠雌性フォスター動物に移される。この雌性フォスター動物の産生子孫は、この細胞（例えば、体細胞）が単離される動物のクローンである。
【０２６０】
（薬学的組成物）
本発明のＮＯＶＸ核酸分子、ＮＯＶＸタンパク質、および抗ＮＯＶＸ抗体（これはまた、本明細書中で「活性化合物」と称される）、ならびにそれらの誘導体、フラグメント、アナログ、およびホモログが、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、核酸分子、タンパク質または抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与に適合した、任意および全ての溶媒、分散液、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤（ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などを含むことが意図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参考書である、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版（本明細書中で参考として援用される）に記載される。このようなキャリアまたは希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学的に活性な物質に対する、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、この活性化合物と不適合である限りを除いて、この組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助活性化合物もまた、組成物へ組み込まれ得る。
【０２６１】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合するように処方される。投与の経路の例には、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下）投与、経口（例えば、吸入）投与、経皮（局所的）投与、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）投与、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒のような滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度の調節のための薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整され得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジあるいはガラスまたはプラスチックから作製される多用量のバイアル中に入れられ得る。
【０２６２】
注入使用に適した薬学的組成物は、滅菌の水溶液（水溶性である場合）または水性分散液、滅菌の注入可能な溶液または分散液の即座調製のための滅菌粉末を含む。静脈内投与について、適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌性でなければならず、そして容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して維持されなければならない。このキャリアは、例えば、以下を含む溶媒または分散液であり得る：水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）ならびにそれらの適切な混合物。適切な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合、要求される粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤（例えば、糖、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトールなどのポリアルコール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらされ得る。
【０２６３】
滅菌注射可能液剤は、必要量のこの活性化合物（例えば、ＮＯＶＸタンパク質あるいは抗ＮＯＶＸ抗体）を、適切な溶媒中に、必要な場合、上記で列挙される成分の１つまたは組み合わせと共に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本（ｂａｓｉｃ）分散媒および上記で列挙される成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中へ組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、調製方法は、減圧乾燥および凍結乾燥であり、これにより、既に滅菌濾過されたその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る。
【０２６４】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤へ圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、この活性化合物は、賦形剤とともに組み込まれ得、そして錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォッシュ（ｍｏｕｔｈｗａｓｈ）としての使用のために流体キャリアを使用して調製され得、ここで、この流体キャリア中のこの化合物は、経口的に適用され、そして素早く動かされ（スイッシュ）（ｓｗｉｓｈ）、そして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント材料が、この組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などが、任意の以下の成分または同様の性質を有する化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶セルロース、ガムトラガントまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸）、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；グライダント（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；あるいは香味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバー）。
【０２６５】
吸入による投与について、この化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体）を含む圧縮容器またはディスペンサー、あるいは噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【０２６６】
全身的投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が、処方において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野で公知であり、そして、例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与については、この活性化合物は、当該分野で一般的に公知である軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリーム剤へ処方される。
【０２６７】
この化合物はまた、直腸送達のための坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来の坐剤ベースと共に）または保持浣腸の形態で調製され得る。
【０２６８】
１つの実施形態において、この活性化合物は、身体からの迅速な排出に対してこの化合物を保護するキャリアを用いて調製され（例えば、制御放出処方物）、これには、移植片およびマイクロカプセル化された送達系が挙げられる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性の生体適合性ポリマーが使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当該業者には明らかである。これらの材料はまた、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染させた細胞へ標的化されるリポソームを含む）がまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２６９】
投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬単位形態で、経口組成物または非経口組成物を処方することが、特に有益である。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置される被験体のための単一の投薬量として適切な、物理的に別個の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアとともに、所望の治療的効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての詳細は、この活性化合物の固有の特性、および達成される特定の治療効果によって決定され、そしてこれらに直接依存する。
【０２７０】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、被験体へ、例えば米国特許第５，７０３，０５５号に記載されるような、多数の経路のいずれかによって送達され得る。従って、送達はまた、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）を含み得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物には、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターが挙げられ得、または遺伝子送達ビヒクルが組み込まれる徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトで産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２７１】
薬学的組成物は、投与のための使用説明書を伴って、容器、包装、またはディスペンサーに含まれ得る。
【０２７２】
（本発明のさらなる使用および方法）
本明細書中に記載される核酸分子、タンパク質、タンパク質ホモログ、および抗体が、以下の方法の１つ以上において使用され得る：（ａ）スクリーニングアッセイ；（ｂ）検出アッセイ（例えば、染色体マッピング、細胞および組織型決定、司法生物学）、（ｃ）予測医学（例えば、診断アッセイ、予後アッセイ、臨床試験モニタリング、および薬理ゲノミックス）；および（ｄ）処置方法（例えば、治療および予防）。
【０２７３】
本発明の単離された核酸分子は、ＮＯＶＸタンパク質を発現するために（例えば、遺伝子治療適用の際に宿主細胞における組み換え発現ベクターを介して）使用され、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおける）またはＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的病変を検出し得、かつ以下にさらに記載されるようなＮＯＶＸ活性を調節し得る。さらに、ＮＯＶＸタンパク質は、ＮＯＶＸタンパク質活性または発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングし、ならびにＮＯＶＸタンパク質の不十分かもしくは過剰な産生（例えば、増殖障害または分化障害）あるいはＮＯＶＸ野生型タンパク質と比較して減少または異常な活性を有するＮＯＶＸタンパク質形態の産生のによって特徴づけられる障害を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＮＯＶＸ抗体は、ＮＯＶＸタンパク質を検出および単離し、ならびにＮＯＶＸ活性を調節するために使用され得る。例えば、ＮＯＶＸ活性は、成長および分化、抗体産生、および腫瘍増殖を含む。
【０２７４】
本発明は、さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規の薬剤および本明細書中に記載される処置のためのそれらの使用に関する。
【０２７５】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、調節因子、すなわち、ＮＯＶＸタンパク質に結合するか、あるいは例えば、ＮＯＶＸ発現またはＮＯＶＸ活性に対して刺激効果または阻害効果を有する、候補化合物または候補薬剤、あるいは試験化合物または試験薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書中において「スクリーニングアッセイ」とも称される）を提供する。
【０２７６】
１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質またはポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはそれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多数のアプローチを使用して得られ得、これらのライブラリーには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ １２：１４５）。
【０２７７】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
【０２７８】
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２３３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１〜３１０；上記Ｌａｄｎｅｒ）において示され得る。
【０２７９】
１つの実施形態において、アッセイは細胞ベースのアッセイであり、ここで、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上に発現する細胞が、試験化合物と接触され、そしてこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質に結合する能力が、決定される。例えば、細胞は、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質に結合する能力の決定は、例えば、その試験化合物を放射性同位体標識または酵素標識とカップリングさせて、その結果、この試験化合物のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分に対する結合が、複合体におけるその標識化合物を検出することによって決定され得ることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接的または間接的のいずれかで標識され得、そしてその放射性同位体が、放射線放射の直接の計数により、またはシンチレーション計数により、検出され得る。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素的に標識され得、そしてこの酵素的標識が、適切な基質の生成物への転換を決定することにより、検出され得る。１つの実施形態において、このアッセイは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質、またはその生物学的に活性な部分をその細胞表面上に発現する細胞を、ＮＯＶＸと結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物に試験化合物を接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程が、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分と優先的に結合する能力を決定する工程を包含する。
【０２８０】
別の実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、これは、膜結合形態のＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を細胞表面上で発現する細胞を、試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物が、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物が、ＮＯＶＸまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合またはこれら標的分子と相互作用する能力を決定することによって、達成され得る。本明細書中において使用する場合には、「標的分子」とは、ＮＯＶＸタンパク質が自然に結合または相互作用する分子であり、例えば、ＮＯＶＸタンパク質を発現する細胞表面上の分子、第二の細胞表面上の分子、細胞外環境中の分子、細胞膜の内部表面と会合する分子、または細胞質分子である。ＮＯＶＸ標的分子は、非ＮＯＶＸ分子あるいは本発明のＮＯＶＸタンパク質またはポリペプチドである。１つの実施形態において、ＮＯＶＸ標的分子は、シグナル伝達経路の構成要素であり、これは、細胞膜を通って細胞内への細胞外シグナル（例えば、化合物が膜結合ＮＯＶＸ分子に結合することにより発生するシグナル）の伝達を促進する。その標的は、例えば、触媒活性を有する第二の細胞内タンパク質、または下流シグナル分子のＮＯＶＸとの会合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２８１】
ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、直接的結合を決定するための上記方法の１つにより、達成され得る。１つの実施形態において、ＮＯＶＸタンパク質がＮＯＶＸ標的分子に結合するかまたはその標的分子と相互作用する能力の決定は、その標的分子の活性を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の活性は、その標的の細胞セカンドメッセンジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を検出すること、適切な基質への標的の触媒活性／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動的に連結されたＮＯＶＸ応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出すること、または細胞応答（例えば、細胞生存度、細胞分化、または細胞増殖）を検出することにより、決定され得る。
【０２８２】
なお別の実施形態において、本発明のアッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分と結合する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物の、ＮＯＶＸタンパク質への結合は、上記のように、直接的または間接的にのいずれかで決定され得る。１つのこのような実施形態において、このアッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸを結合する公知の化合物に接触させて、アッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物に接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程は、この試験化合物が、公知の化合物と比較して、ＮＯＶＸ、またはその生物学的に活性な部分と優先的に相互作用する能力を決定する工程を包含する。
【０２８３】
別の実施形態において、アッセイは、無細胞アッセイであり、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、ならびにその試験化合物がＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定する工程を包含する。この試験化合物がＮＯＶＸの活性を調節する能力の決定は、例えば、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子に結合する能力を、直接的結合の決定のための上記方法の１つによって決定することにより、達成され得る。代替の実施形態において、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質の活性を調節する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子をさらに調節する能力を決定することにより、達成され得る。例えば、この標的分子の適切な基質に対する触媒活性／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０２８４】
なお別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＮＯＶＸタンパク質またはその生物学的に活性な部分を、ＮＯＶＸタンパク質を結合する公知の化合物に接触させてアッセイ混合物を形成する工程、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、ならびにこの試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力を決定する工程を包含し、ここで、この試験化合物がＮＯＶＸタンパク質と相互作用する能力の決定は、ＮＯＶＸタンパク質が、ＮＯＶＸ標的分子と優先的に結合するか、またはその標的分子の活性を優先的に調節する能力を決定する工程を包含する。
【０２８５】
本発明の無細胞アッセイは、ＮＯＶＸの、可溶性形態または膜結合形態の両方の使用に受け入れられる。ＮＯＶＸの膜結合形態を含む無細胞アッセイの場合には、ＮＯＶＸの膜結合形態が溶液中に維持されるように、可溶化剤を利用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例には、非イオン性界面活性剤が挙げられ、例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｅｔｈｅｒ）ｎ）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（３−（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ−２−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＣＨＡＰＳＯ）である。
【０２８６】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、ＮＯＶＸまたはその標的分子のいずれかを固定して、そのタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合形態の分離を促進し、そしてそのアッセイの自動化に適用させることが、望ましくあり得る。試験化合物の、ＮＯＶＸへの結合、または候補化合物の存在下および非存在下での、ＮＯＶＸの標的分子との相互作用は、これらの反応物を収容するために適切な任意の容器内で、達成され得る。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態において、融合タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加するその融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＮＯＶＸ融合タンパク質またはＧＳＴ標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され得、次いでこれらは、試験化合物と合わせられるか、あるいは試験化合物および吸着されない標的タンパク質、またはＮＯＶＸタンパク質のいずれかと合わせられ、そしてこの混合物が、複合体形成に貢献する条件下（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、結合していないあらゆる成分を除去し、ビーズの場合にはマトリックスを固定し、例えば上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体がマトリックスから解離され得、そしてＮＯＶＸの結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して決定し得る。
【０２８７】
タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術がまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＮＯＶＸタンパク質、またはその標的分子のいずれかが、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して、固定され得る。ビオチニル化ＮＯＶＸ、または標的分子は、当該分野において周知の技術を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製され得（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．）、そしてストレプトアビジンで被覆した９６ウェルのプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定され得る。あるいは、ＮＯＶＸ、または標的分子と反応性であるがＮＯＶＸタンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体が、そのプレートのウェルに誘導体化され得、そして結合していない標的またはＮＯＶＸが、抗体の結合によってウェル内にトラップされ得る。このような複合体を検出するための方法には、ＧＳＴ固定複合体に関しての上記のものに加えて、ＮＯＶＸまたは標的分子と反応性の抗体を使用する、複合体の免疫検出、ならびにＮＯＶＸ、または標的分子に関する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０２８８】
別の実施形態において、ＮＯＶＸ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、そして細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較される。次いで、候補化合物は、この比較に基づいて、ＮＯＶＸ発現のモジュレーターとして同定され得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下より、その存在下における方が大きい（統計的に有意に大きい）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現の刺激物質として同定される。あるいは、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の非存在下よりその存在下の方が少ない（統計的に有意に少ない）場合、この候補化合物は、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現のインヒビターとして同定される。細胞中のＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するために本明細書中に記載の方法によって決定され得る。
【０２８９】
本発明のなお別の局面において、ＮＯＶＸタンパク質は、ツーハイブリッドアッセイまたはスリーハイブリッドアッセイにおいて「ベイトタンパク質」として使用されて（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９３ Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＮＯＶＸ（「ＮＯＶＸ結合タンパク質」または「ＮＯＶＸ−ｂｐ」）に結合するか、またはこれと相互作用し、そしてＮＯＶＸ活性を調節する他のタンパク質を同定し得る。このようなＮＯＶＸ結合タンパク質はまた、例えば、ＮＯＶＸ経路の上流または下流エレメントとしてＮＯＶＸタンパク質によるシグナル伝達に関与するようである。
【０２９０】
ツーハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる、大部分の転写因子のモジュール的性質に基づく。簡潔には、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、ＮＯＶＸをコードする遺伝子が公知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方の構築物においては、ＤＮＡ配列のライブラリー由来の、未同定タンパク質（「プレイ」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される。「ベイト」および「プレイ」タンパク質がインビボで相互作用して、ＮＯＶＸ依存性複合体を形成し得る場合、この転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、非常に近くにある。近位にあることにより、転写因子に応答性の転写調節部位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能にする。レポーター遺伝子の発現が検出され得、そして機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離され得、そしてＮＯＶＸと相互作用するタンパク質をコードするクローニングされた遺伝子を得るために使用され得る。
【０２９１】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定される新規な薬剤および本明細書中に記載されるような処置のためのこの薬剤の使用に関する。
【０２９２】
（検出アッセイ）
本明細書中で同定されるｃＤＮＡ配列の一部分またはフラグメント（および対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多くの方法で使用され得る。例えば（限定はされない）、これらの配列を使用して、（ｉ）染色体上にそれぞれの遺伝子をマッピングし得；従って遺伝病と関連する遺伝子領域を位置決定し得る；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定し得る（組織型決定）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的識別を助け得る。
【０２９３】
本発明のＮＯＶＸ配列は、わずかな生物学的サンプルから個体を識別するために使用され得る。この技術において、個体のゲノムＤＮＡは、１つ以上の制限酵素で消化され、そして同定のために独特のバンドを生成するためにサザンブロット上でプローブされる。本発明の配列は、ＲＦＬＰ（米国特許第５，２７２，０５７号に記載の「制限フラグメント長多型」）のためのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である。
【０２９４】
さらに、本発明の配列を用いて、個体のゲノムの選択された部分について実際の塩基ごとにＤＮＡ配列を決定する代替的技術を提供し得る。従って、本明細書中に記載のＮＯＶＸ配列を用いて、配列の５’末端および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製し得る。次いで、これらのプライマーを使用して、個体のＤＮＡを増幅し得、引き続いて、配列決定し得る。
【０２９５】
この様式で調製された個体由来の対応するＤＮＡ配列のパネルは、各個体が、対立遺伝子差異に起因するこのようなＤＮＡ配列の独特のセットを有するので、唯一の個体識別を提供し得る。本発明の配列は、個体由来および組織由来の配列のこのような識別を得るために使用され得る。本発明のＮＯＶＸ配列は、ヒトゲノムの部分を独特に表す。対立遺伝子バリエーションは、これらの配列のコード領域においてある程度まで生じ、そして非コード領域においてより大きな程度まで生じる。個々のヒト間での対立遺伝子バリエーションは、各５００塩基につき約１回の頻度で生じることが見積もられる。対立遺伝子バリエーションの多さは、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）を含む単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に起因する。
【０２９６】
本明細書中に記載される配列の各々は、ある程度、標準物質（これに対して個体からのＤＮＡが識別の目的で比較され得る）として使用され得る。より多くの多型が非コード領域で生じるので、個体を区別するために、それほど多くの配列が必要であるわけではない。上記のような、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５の非コード配列は、おそらく１０〜１，０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個体識別を不自由なく提供し得る。これらのプライマーは、各々が１００塩基の増幅された非コード配列を生じる。推定コード配列が使用される場合、ポジティブな個体識別に関するプライマーのより適切な数は、５００〜２，０００である。
【０２９７】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０２９８】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現またはＮＯＶＸ活性を決定し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的因子（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択するための方法を提供する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいた、個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０２９９】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬剤、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０３００】
（法生物学（ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｂｉｏｌｉｇｙ）における部分的ＮＯＶＸ配列の使用）
ＤＮＡベースの同定技術はまた、法生物学において使用され得る。法生物学は、例えば、犯罪の加害者を積極的に同定するための手段として、犯罪の現場で見出される生物学的証拠の遺伝子型決定（ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｙｐｉｎｇ）を使用する科学分野である。このような同定を行うために、ＰＣＲ技術が、犯罪現場で見出される非常に少量の生物学的サンプル（例えば、組織（例えば、髪もしくは皮膚）または体液（例えば、血液、唾液もしくは精液））から取り出されるＤＮＡ配列を増幅するために使用され得る。次いで、増幅された配列は、標準と比較され、それによってその生物学的サンプルの起源の同定を可能にする。
【０３０１】
本発明の配列は、ヒトゲノムの特定の遺伝子座に標的化されるポリヌクレオチド試薬（例えば、ＰＣＲプライマー）を提供するために使用され得る。これは、例えば、別の「同定マーカー」（すなわち、特定の個体に独特である別のＤＮＡ配列）を提供することにより、ＤＮＡベースの法医学的な同定の信頼性を増強し得る。上記のように、実際の塩基配列情報は、制限酵素が生成するフラグメントにより形成されるパターンに厳密に代わるものとして、同定のために使用され得る。配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５の非コード領域に標的化される配列は、非コード領域中に存在する大量の多型としてのこの使用に特に適切であり、この技術を使用して、個体の区別を容易にする。ポリヌクレオチド試薬の例としては、ＮＯＶＸ配列またはその部分（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のうちの１つ以上の非コード領域に由来するフラグメント）が挙げられ、これらは、少なくとも２０塩基長、好ましくは少なくとも３０塩基長を有する。
【０３０２】
本明細書中に記載されるＮＯＶＸ配列は、ポリヌクレオチド試薬（例えば、標識されたかまたは標識可能なプローブ）を提供するためにさらに使用され得、このプローブは、特定の組織（例えば、脳組織など）を同定するために、例えば、インサイチュハイブリダイゼーション技術において使用され得る。これは、法医学の病理学者が、未知の起源の組織を提示された場合、非常に有用であり得る。このようなＮＯＶＸプローブのパネルは、種および／または器官型により組織を同定するために使用され得る。
【０３０３】
同様の様式で、これらの試薬（例えば、ＮＯＶＸプライマー、またはプローブ）は、混入について組織培養物をスクリーニングする（すなわち、培養物中の異なる型の細胞の混合物の存在についてスクリーニングする）ために使用され得る。
【０３０４】
（予測医療）
本発明はまた、診断アッセイ、予後アッセイ、薬物ゲノム（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）およびモニタリング臨床試験が、予後（予測）の目的に使用され、これによって個体を予防的に処置する、予測医療の分野に関する。従って、本発明の１つの局面は、ＮＯＶＸタンパク質および／または核酸の発現、ならびにＮＯＶＸの活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の関連で決定し、これによって、異常なＮＯＶＸの発現または活性に関連して、個体が疾患または障害に罹患するかどうか、あるいは障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体が、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性と関連した障害を発症するリスクがあるかどうかを決定するための予後的（または予測的）アッセイを提供する。例えば、ＮＯＶＸ遺伝子における変異が、生物学的サンプルにおいてアッセイされ得る。このようなアッセイは、予後的または予測的な目的に使用され得、これによってＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性によって特徴付けられるかまたはそれに関連した障害の発病の前に個体を予防的に処置する。
【０３０５】
本発明の別の局面は、個体におけるＮＯＶＸタンパク質、核酸の発現またはＮＯＶＸ活性を決定し、これによって、その個体についての適切な治療的または予防的因子（本明細書において「薬物ゲノム」とよばれる）を選択するための方法を提供する。薬物ゲノムは、個体の遺伝型（例えば、特定の因子に対して応答する個体の能力を決定するために試験された個体の遺伝型）に基づいた、個体の治療的または予防的処置のための因子（例えば、薬物）の選択を可能にする。
【０３０６】
本発明のなお別の局面は、臨床試験におけるＮＯＶＸの発現または活性に対する因子（例えば、薬剤、化合物）の影響をモニタリングすることに関する。
【０３０７】
これらおよび他の因子は、以下の節にさらに詳細に記載される。
【０３０８】
（診断アッセイ）
細胞の増殖が役割を果たす他の状態としては、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病合併症、カポージ肉腫および慢性関節リウマチが挙げられる。
【０３０９】
ＮＯＶＸポリペプチドを使用して、サンプルまたは組織と相互作用するポリペプチド同定し得る。この方法は、サンプルまたは組織をＮＯＶＸと接触させる工程、ＮＯＶＸポリペプチドとその相互作用するポリペプチドとの間で複合体を形成させる工程、存在する場合、その複合体を検出する工程を包含する。
【０３１０】
本発明のタンパク質を使用して、そのタンパク質と特異的に結合する抗体の産生を刺激し得る。このような抗体を免疫診断手順において使用して、サンプル中のタンパク質の存在を検出し得る。本発明のタンパク質を使用して、このような発達が好ましい条件下で細胞成長および細胞増殖を刺激し得る。１つの例は、例えば、造血および血小板形成、消化管の裏打ち、ならびに毛包に対する化学療法剤の毒性副作用を相殺する。これらをまた使用して、神経性障害（例えば、アルツハイマー病が挙げられる）における新たな細胞成長を刺激し得る。あるいは、アンタゴニスト処置が投与され、ここで本発明のＮＯＶＸ様タンパク質と特異的に結合する抗体は、このタンパク質の特定の発達誘導効果を抑止する。このような抗体は、例えば、種々の腫瘍および良性過形成を含む増殖障害の処置において有用であり得る。
【０３１１】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５のＮＯＶＸ核酸の任意の１つの部分に対応するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを使用して、対応するＮＯＶ遺伝子を含むＤＮＡを検出し得るか、または対応するＮＯＶＸ遺伝子もしくはＮＯＶＸ様遺伝子の発現を検出し得る。例えば、表１に示されるように、特定の細胞または組織において発現されるＮＯＶＸ核酸を使用して、特定の細胞型の存在を同定し得る。
【０３１２】
生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在または非存在を検出するための例示的な方法は、試験被験体から生物学的サンプルを得る工程、およびその生物学的サンプルをＮＯＶＸタンパク質またはＮＯＶＸタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出し得る化合物もしくは薬剤とを接触させ、その結果、ＮＯＶＸの存在が、その生物学的サンプルにおいて検出される、工程を包含する。ＮＯＶＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡを検出するための薬剤は、ＮＯＶＸのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る、標識された核酸プローブである。この核酸プローブは、例えば、上記のような、全長のＮＯＶＸ核酸（例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５もしくはその部分の核酸（例えば、少なくとも、１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、かつストリンジェントな条件下でＮＯＶＸのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするに十分である核酸））であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用のための他の適切なプローブは本明細書において記載されている。
【０３１３】
ＮＯＶＸタンパク質を検出するための薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質に結合し得る抗体であり、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナルであり得るか、またはより好ましくはモノクローナル抗体であり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）が使用され得る。用語「標識（された）」とは、プローブまたは抗体に関して、検出可能な物質をそのプローブもしくは抗体にカップリングさせる（すなわち、物理的に連結する）ことによって、そのプローブまたは抗体を直接標識すること、ならびに、直接標識される別の試薬との反応性によって、そのプローブもしくは抗体を間接的に標識をすることを包含することが意図される。間接的な標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るようにＤＮＡプローブのビオチンを用いた末端標識が挙げられる。用語「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された、組織、細胞および生物学的流体ならびに被験体に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図される。すなわち、本発明の検出方法を用いて、ＮＯＶＸのｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡを、生物学的サンプル中で、インビトロおよびインビボで検出し得る。例えば、ＮＯＶＸ ｍＲＮＡの検出のためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションが挙げられる。ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビトロ技術としては、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＮＯＶＸゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＮＯＶＸタンパク質の検出のためのインビボ技術としては、標識された抗ＮＯＶＸ抗体を被験体に導入することが挙げられる。例えば、その抗体は、放射性マーカーを用いて標識され得る。この被験体における放射性マーカーの存在および位置は、標準的な画像化技術によって検出され得る。
【０３１４】
１つの実施形態において、この生物学的サンプルは、その試験被験体からのタンパク質分子を含む。あるいは、その生物学的サンプルは、その試験被験体からのｍＲＮＡ分子またはその試験被験体からのゲノムＤＮＡ分子を含み得る。好ましい生物学的サンプルは、被験体から従来の手段によって単離された末梢血白血球サンプルである。
【０３１５】
別の実施形態において、本発明の方法はさらに、コントロール被験体からコントロール生物学的サンプルを得る工程、そのコントロールサンプルを、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムを検出し得る化合物もしくは薬剤と接触させ、その結果、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在がその生物学的サンプルにおいて検出される、工程、およびそのコントロールサンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在と、その試験サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡの存在とを比較する工程を包含する。
【０３１６】
本発明はまた、生物学的サンプルにおけるＮＯＶＸの存在を検出するためのキットを包含する。例えば、このキットは、以下を備え得る：生物学的サンプルにおいてＮＯＶＸのタンパク質またはｍＲＮＡを検出し得る、標識された化合物もしくは薬剤；そのサンプルにおいてＮＯＶＸの量を決定するための手段；およびそのサンプルにおけるＮＯＶＸの量を標準と比較するための手段。この化合物または薬剤は、適切な容器内に包装され得る。このキットは、さらに、ＮＯＶＸタンパク質または核酸を検出するためにキットを用いるための説明書を備え得る。
【０３１７】
（予後アッセイ）
本明細書において記載された診断方法をさらに利用して、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連した疾患もしくは障害を有するか、またはその発症の危険にある被験体を同定し得る。例えば、本明細書に記載されるアッセイ（例えば、上述の診断アッセイまたは下記のアッセイ）を利用して、ＮＯＶＸのタンパク質、核酸の発現または活性に関連する障害（例えば、増殖性障害または分化障害（例えば、過形成、腫瘍、再狭窄、乾癬、デュプュイトラン拘縮、糖尿病合併症または慢性関節リウマチなど）；およびグリア関連障害（例えば、大脳傷害、糖尿病ニューロパシー、大脳水腫、老年痴呆、アルツハイマー病など））を有するかまたはその発症の危険に有る被験体を同定し得る。あるいは、この予後アッセイを利用して、疾患または障害を有するかまたはその発症の危険に有る被験体を同定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患もしくは障害を同定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルは、被験体から得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を有するかまたはその発症の危険にある被験体についての診断指標である。本明細書において使用される「試験サンプル」とは、目的の被験体から得られた生物学的サンプルをいう。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０３１８】
さらに、本明細書に記載される予後アッセイを使用して、被験体に薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、低分子、または他の薬物候補）を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する疾患または障害を処置され得るか否かを、決定するために使用され得る。例えば、そのような方法を用いて、被験体が障害（例えば、増殖性傷害、分化傷害、グリア関連傷害など）のための薬剤を用いて有効に処置され得るか否かを決定し得る。従って、本発明は、ＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害についての薬剤を用いて、被験体が有効に処置され得るか否かを決定するための方法を提供する。ここで、試験サンプルが得られ、そしてＮＯＶＸのタンパク質または核酸が検出される（例えば、ここで、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸の存在は、この薬剤を投与してＮＯＶＸの異常発現または異常活性に関連する障害を処置され得る被験体についての、診断指標である）。
【０３１９】
本発明の方法はまた、ＮＯＶＸ遺伝子における遺伝的損傷を検出し、それによって、その損傷遺伝子を有する被験体が増殖性傷害、分化傷害、グリア関連傷害などの危険に有るかまたはそれらに罹患しているか否かを決定するためにも使用され得る。種々の実施形態において、この方法は、その被験体からの細胞のサンプルにおいて、ＮＯＶＸタンパク質をコードする遺伝子の統合性に影響を与える変更の少なくとも１つによって特徴付けられる遺伝的損傷の存在または非存在、あるいはＮＯＶＸ遺伝子の誤発現を検出する工程を包含する。例えば、そのような遺伝的損傷は、以下の少なくとも１つの存在を確認することによって検出され得る：（１）ＮＯＶＸ遺伝子からの１つ以上のヌクレオチドの欠失；（２）ＮＯＶＸ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの付加；（３）ＮＯＶＸ遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの置換、（４）ＮＯＶＸ遺伝子の染色体再配置；（５）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルにおける変更、（６）ＮＯＶＸ遺伝子の異常改変（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常改変）、（７）ＮＯＶＸ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＮＯＶＸタンパク質の非野生型レベル、（９）ＮＯＶＸ遺伝子の対立遺伝子の欠失、ならびに（１０）ＮＯＶＸタンパク質の不適切な翻訳後修飾。本明細書において記載されるように、当該分野において、ＮＯＶＸ遺伝子における損傷を検出するために使用され得る、多数の公知のアッセイ技術が存在する。好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって被験体から単離された末梢血白血球サンプルである。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプルが使用され得、これには、例えば、頬粘膜細胞が挙げられる。
【０３２０】
特定の実施形態において、損傷の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照のこと）（例えば、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ）、あるいは、連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４を参照のこと）におけるプローブ／プライマーの使用を包含する。後者は、ＮＯＶＸ遺伝子における点変異を検出するために特に有用であり得る（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法は、患者から細胞のサンプルを収集する工程、核酸（例えば、ゲノム、ｍＲＮＡまたはその両方）をそのサンプルの細胞から単離する工程、ＮＯＶＸの遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ以上のプライマーとその核酸サンプルとを、ＮＯＶＸ遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で接触させる工程、ならびに増幅産物の存在もしくは非存在を検出する工程、またはその増幅産物のサイズを検出する工程およびその長さをコントロールサンプルと比較する工程を包含し得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載される変異を検出するために使用される技術のいずれかとともに予備的増幅工程として使用されることが望ましくあり得ることが予想される。
【０３２１】
代替的な増幅方法としては、以下が挙げられる：当業者に周知な技術を用いた、その増幅された分子の検出の前の、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、１９９０、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら、１９８９、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、または他の任意の核酸増幅方法。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に極少数で存在する場合に、そのような核酸分子の検出のために特に有用である。
【０３２２】
代替の実施形態において、サンプル細胞からのＮＯＶＸ遺伝子における変異は、制限酵素切断パターンにおける変更によって同定され得る。例えば、サンプルおよびコントロールのＤＮＡが単離され、増幅され（必要に応じて）、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼを用いて消化され、そしてフラグメント長の大きさがゲル電気泳動によって決定され、そして比較される。サンプルＤＮＡとコントロールＤＮＡとの間のフラグメント長の大きさにおける差異は、そのサンプルＤＮＡにおける変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイムの使用（例えば、米国特許第５，４９３，５３１号を参照のこと）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失によって特異的な変異の存在についてスコア付けし得る。
【０３２３】
他の実施形態において、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、サンプル核酸およびコントロール核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイに対してハイブリダイズさせることによって同定され得る（Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：７５３−７５９）。例えば、ＮＯＶＸにおける遺伝子変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（前出）に記載されるように光生成ＤＮＡプローブを含む二次元アレイにおいて同定され得る。手短には、プローブの第一ハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよびコントロール中でＤＮＡを長いストレッチにわたって走査し、連続的に重複するプローブの線形アレイを作成することによって、その配列間の塩基変化を同定し得る。この工程は、点変異の同定を可能にする。この工程に第二のハイブリダイゼーションアレイが続き、これは、検出される全ての改変体または変異体に相補的な、より小さな特化されたプローブアレイを用いることによる特定の変異の特徴付けを可能にする。各変異アレイは、一方が野生型遺伝子に対して相補的であり、そして他方が変異遺伝子に対して相補である並行プローブセットから構成される。
【０３２４】
なお別の実施形態において、当該分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを使用して、ＮＯＶＸ遺伝子を直接配列決定し得、そしてサンプルＮＯＶＸ配列と対応する野生型（コントロール）配列とを比較することによって、変異を検出し得る。配列決定反応の例としては、ＭａｘｉｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７）ＰＮＡＳ ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）ＰＮＡＳ ７４：５４６３によって開発された技術に基づくものが挙げられる。診断アッセイを実施する場合、種々の自動化配列決定手順のいずれかを利用し得ることもまた意図される（Ｎａｅｖｅら（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８）。これらには、質量分析法による配列決定法（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３８．：１４７−１５９を参照のこと）が含まれる。
【０３２５】
ＮＯＶＸ遺伝子における変異を検出するための他の方法としては、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡのヘテロ二重鎖中のミスマッチ塩基を検出する方法が挙げられる（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１２４２）。一般に、「ミスマッチ切断」の当該分野の技術は、野生型のＮＯＶＸ配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織サンプルから得られた潜在的な変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供する工程によって始まる。この二本鎖の二重鎖を、二重鎖の一本鎖領域（例えば、そのコントロールとサンプルの鎖との間の塩基対ミスマッチに起因して存在するもの）を切断する薬剤を用いて処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮａｓｅを用いて処理し得、そしてＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、そのミスマッチ領域を酵素的に消化するためにＳ１ヌクレアーゼを用いて処理し得る。他の実施形態において、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡのいずれかの二重鎖を、ミスマッチ領域を消化するために、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウム、およびピペリジンを用いて処理し得る。そのミスマッチ領域の消化後、次いで、得られた物質を変性ポリアクリルアミドゲル上で、大きさにより分離して、変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２１７：２８６−２９５を参照のこと。１つの実施形態において、コントロールのＤＮＡまたはＲＮＡは、検出のために標識され得る。
【０３２６】
なお別の実施形態において、ミスマッチ切断反応は、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチ塩基対を認識する１つ以上のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を、細胞のサンプルから得られたＮＯＶＸ ｃＤＮＡにおける点変異を検出およびマッピングするために規定された系において使用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチでＡを切断し、そしてＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチでＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １５：１６５７〜１６６２）。例示的な実施形態に従って、ＮＯＶＸ配列（例えば、野生型ＮＯＶＸ配列）に基づくプローブは、試験細胞由来のｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物にハイブリダイズされる。二重鎖は、ＤＮＡミスマッチ修復酵素を用いて処理され、そしてその切断産物（もしあれば）は、電気泳動プロトコルなどから検出され得る。例えば、米国特許第５，４５９，０３９号を参照のこと。
【０３２７】
他の実施形態において、電気泳動の移動度における変化は、ＮＯＶＸ遺伝子における変異を同定するために使用される。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）は、変異体と野生型の核酸との間の電気泳動の移動度における差異を検出するために使用され得る（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ：８６：２７６６、またＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ２８５：１２５〜１４４；Ｈａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ Ｔｅｃｈ Ａｐｐｌ ９：７３〜７９を参照のこと）。サンプルおよびコントロールのＮＯＶＸ核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントは、変性され、そして再生される。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、電気泳動の移動度において得られる変化は、１つの塩基変化の検出さえも可能にする。ＤＮＡフラグメントは、標識され得るか、または標識されたプローブを用いて検出され得る。アッセイの感度は、ＤＮＡよりもむしろ、二次構造が配列中の変化に対してより感受的であるＲＮＡを使用することによって増強され得る。１つの実施形態において、本発明の方法は、ヘテロ二重鎖分析を利用して、電気泳動の移動度における変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する。例えば、Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ ７：５を参照のこと。
【０３２８】
なお別の実施形態において、一定勾配の変性剤を含有するポリアクリルアミドゲルにおける変異体または野生型のフラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用してアッセイされる。例えば、Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：４９５を参照のこと。ＤＧＧＥが分析の方法として使用される場合、ＤＮＡは、例えば、ＰＣＲにより約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって、完全には変性されないことを確実するように改変される。さらなる実施形態において、温度勾配は、コントロールおよびサンプルのＤＮＡの移動度における差異を同定するために、変性剤勾配の代わりに使用される。例えば、ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ ２６５：１２７５３を参照のこと。
【０３２９】
点変異を検出するための他の技術の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーは、既知の変異が中心的に配置されるように調製され得、次いで、完全なマッチが見出される場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下で標的ＤＮＡにハイブリダイズされる。例えば、Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：６２３０を参照のこと。このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ膜に付着され、そして標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズされる場合に、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる変異にハイブリダイズされる。
【０３３０】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術は、本発明と合わせて使用され得る。特異的増幅についてのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中心において（その結果、増幅は、差次的ハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７：２４３７〜２４４８）か、あるいは適切な条件下でミスマッチが妨げられ得るかまたはポリメラーゼ伸長を減少し得る、１つのプライマーの３’の最末端で、目的の変異を保有し得る（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ １１：２３８）。さらに、切断に基づく検出を行うために、変異領域に新規な制限部位を導入することが望ましくあり得る。例えば、Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ６：１を参照のこと。特定の実施形態において、増幅はまた、増幅用Ｔａｑリガーゼを使用して実施され得ることが予測される。例えば、Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：１８９を参照のこと。このような場合において、連結は、５’配列の３’末端に完全なマッチが存在する場合にのみ生じ、増幅の存在または非存在を探索することによって、特定の部位における既知の変異の存在を検出することを可能にする。
【０３３１】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書中に記載れる少なくとも１つのプローブ核酸または抗体試薬を含む、予めパッケージングされた診断キットを利用することによって実施され得、これは、例えば、ＮＯＶＸ遺伝子を含む疾患または疾病の症状または家族病歴を示す患者を診断するための臨床的設定において簡便に使用され得る。
【０３３２】
さらに、ＮＯＶＸが発現される任意の細胞型または組織（好ましくは、末梢血白血球）は、本明細書中に記載される予後アッセイにおいて利用され得る。しかし、有核細胞を含む任意の生物学的サンプル（例えば、頬粘膜細胞を含む）が、使用され得る。
【０３３３】
（薬理ゲノム学（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ））
ＮＯＶＸ活性（例えば、ＮＯＶＸ遺伝子発現）に対する刺激性または阻害性の影響を有する因子、すなわちモジュレーターは、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定されるように、異常なＮＯＶＸ活性と関連する障害（例えば、神経学的障害、癌関連障害または妊娠障害）を処置（予防的または治療的に）するために個体に投与され得る。このような処置と合わせて、個体の薬理ゲノム学（すなわち、個体の遺伝子型と外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係についての研究）が、考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗を導き得る。従って、個体の薬理ゲノム学は、個体の遺伝子型の考慮に基づく予防的または治療的処置のために有効な薬剤（例えば、薬物）の選択を許容する。このような薬理ゲノム学は、さらに、適切な投薬量および治療剤レジメンを決定するために使用され得る。従って、ＮＯＶＸタンパク質の活性、ＮＯＶＸ核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸ遺伝子の変異含量が決定されて、それによって個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。
【０３３４】
薬理ゲノム学は、罹患された人おける変更された薬物の性質および異常な作用に起因して、薬物に応答する臨床的に有意な遺伝性変更を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ、１９９６、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２３：９８３〜９８５およびＬｉｎｄｅｒ、１９９７、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ，４３：２５４〜２６６を参照のこと。一般に、２つの型の薬理ゲノム学状態が、区別され得る。薬物が身体に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物作用）、または身体が薬物に作用する方法を変更する１つの因子として伝達される遺伝的状態（変更された薬物代謝）。これらの薬理ゲノム学状態は、稀な欠損としてか、または多型としてのいずれかで生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損は、一般的な遺伝性酵素病であり、この主な臨床的合併症は、酸化剤薬物（抗マラリア剤、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０３３５】
例示的な実施形態として、薬物代謝酵素の活性は、薬物作用の強度および持続期間の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝的多型の発見は、幾人かの患者が予期される薬物効果を得ないことか、または標準的かつ安全な用量の薬物を摂取した後に過大な薬物応答および深刻な毒性を示すことに関しての説明を提供した。これらの多型は、集団において２つの表現型（高い代謝能を持つ人（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低い代謝能を持つ人（ｐｏｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ））で表現される。ＰＭの有病率は、異なる集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は高度に多型であり、そしていくらかの変異がＰＭにおいて同定されており、この全ては機能的ＣＹＰ２Ｄ６の非存在に至る。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９の低い代謝能を持つ人は、彼らが標準的な用量を受ける場合に、かなり頻繁に過大な薬物応答および副作用を経験する。代謝産物が活性な治療的部分である場合、そのＣＹＰ２Ｄ６形成代謝産物であるモルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛効果について実証されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。他の極端なものは、標準的な用量に応答しない、いわゆる超迅速な代謝能を持つ人である。最近、超迅速な代謝の基準となる分子は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅に起因していることが同定されている。
【０３３６】
従って、ＮＯＶＸのタンパク質の活性、ＮＯＶＸの核酸の発現、あるいは個体におけるＮＯＶＸの遺伝子の変異内容を決定して、それによって、その個体の治療的または予防的処置のために適切な薬剤を選択し得る。さらに、薬理ゲノム学の研究を使用して、個体の薬物応答性の表現型の同定に対して薬物代謝酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型を適用し得る。この知見は、用量または薬物選択に適用される場合、有害な反応または治療の失敗を回避し得、従って、被験体をＮＯＶＸの調節因子（例えば、本明細書中に記載される例示的なスクリーニングアッセイの１つによって同定される調節因子）を用いて処置する場合に治療的または予防的効率を増強し得る。
【０３３７】
（臨床試験中の効果のモニタリング）
ＮＯＶＸの発現または活性（例えば、異常な細胞増殖および／または分化を調節する能力）に対する薬剤（例えば、薬物、化合物）の影響をモニタリングすることは、基本的な薬物スクリーニングおよび臨床試験に適用され得る。例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを増加するため、またはＮＯＶＸ活性をアップレギュレートする薬剤の効力は、減少したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはダウンレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。あるいは、スクリーニングアッセイによって決定される、ＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベルを減少、またはＮＯＶＸの活性をダウンレギュレートする薬剤の効力は、増加したＮＯＶＸの遺伝子発現、タンパク質レベル、またはアップレギュレートしたＮＯＶＸの活性を示す被験体の臨床試験においてモニターされ得る。このような臨床試験において、ＮＯＶＸの発現または活性、および好ましくは、例えば、増殖または神経障害に関与するような他の遺伝子が、「リードアウト（読み出し）（ｒｅａｄ ｏｕｔ）」、すなわち、特定の細胞の応答性のマーカーとして使用され得る。
【０３３８】
例えば、ＮＯＶＸを含む遺伝子（これは、ＮＯＶＸ活性（例えば、本明細書中に記載されるようなスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、薬物または低分子）を用いる処置によって、細胞内で調節される）が、同定され得る。従って、細胞性増殖障害に対する薬剤の効果を研究するために、例えば、臨床試験において、細胞が単離され得、そしてＲＮＡが調製され得、そしてＮＯＶＸおよびこの障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析され得る。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書中に記載されるように、ノーザンブロット分析もしくはＲＴ−ＰＣＲによるか、あるいは産生されるタンパク質の量を測定することによるか、本明細書中に記載されるような方法の１つによるか、あるいはＮＯＶＸまたは他の遺伝子の活性のレベルを測定することによって、定量され得る。この様式で、この遺伝子発現パターンは、この薬剤に対する細胞の生理学的応答の指標であるマーカーとして作用し得る。従って、この応答状態は、この薬剤を用いる個体の処置の前、および処置の間の種々の時点で、決定され得る。
【０３３９】
１つの実施形態において、本発明は、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド模倣物、低分子、または本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される他の薬物候補物）を用いる、被験体の処置の効力をモニタリングするための方法を提供し、これは、以下の工程を包含する：（ｉ）薬剤の投与の前に、被験体から投与前サンプルを得る工程；（ｉｉ）この投与前サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出する工程；（ｉｉｉ）この被験体から１つ以上の投与後サンプルを得る工程；（ｉｖ）この投与後サンプルにおいて、ＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出する工程；（ｖ）この投与前サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、この投与後サンプルにおけるＮＯＶＸのタンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルと比較する工程；ならびに（ｖｉ）従って、この被験体に対する薬剤の投与を変更する工程。例えば、この薬剤の増加した投与は、検出されるよりも高いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を増加することが（すなわち、この薬剤の効力を増加すること）望ましくあり得る。あるいは、この薬剤の減少した投与は、検出されるよりも低いレベルにＮＯＶＸの発現または活性を減少することが（すなわち、この薬剤の効力を減少すること）望ましくあり得る。
【０３４０】
（処置の方法）
本発明は、障害の危険性のある（または障害に罹患しやすい）かまたは異常なＮＯＶＸ発現または活性に関連する障害を有する被験体を処置する予防的および治療的方法の両方を提供する。
【０３４１】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）増加したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を拮抗する（すなわち、低減または阻害する）治療剤を用いて処置され得る。活性を拮抗する治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）ＮＯＶＸポリペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；（ｉｉ）上記ペプチドに対する抗体；（ｉｉｉ）ＮＯＶＸペプチドをコードする核酸；（ｉｖ）相同組換えによってＮＯＶＸペプチドの内因性機能を「ノックアウトする」ために利用される、アンチセンス核酸および「機能不全性」である（すなわち、ＮＯＶＸペプチドに対するコード配列のコード配列内の異種挿入に起因する）核酸の投与、（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８〜１２９２を参照のこと）；または（ｖ）ＮＯＶＸペプチドとその結合パートナーとの間の相互作用を変化させる、調節因子（すなわち、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト（本発明のさらなるペプチド模倣物または本発明のペプチドに対して特異的な抗体を含む））。
【０３４２】
（その疾患または障害に罹患していない被験体と比較して）減少したレベルまたは生物学的活性によって特徴付けられる疾患および障害は、活性を増加させる（すなわち、活性に対するアゴニストである）治療剤を用いて処置され得る。活性をアップレギュレートする治療剤は、治療的または予防的な様式で、投与され得る。利用され得る治療剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＮＯＶＸペプチド、またはそのアナログ、誘導体、フラグメントもしくはホモログ；あるいはバイオアベイラビリティーを増加させるアゴニスト。
【０３４３】
増加したレベルまたは減少したレベルは、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量することによって、容易に検出され得る。この定量は、患者の組織サンプルを（例えば、生検組織から）入手し、そしてそのサンプルを、その発現したペプチド（またはＮＯＶＸペプチドのｍＲＮＡ）のＲＮＡレベルまたはペプチドレベル、構造および／または活性をインビトロでアッセイすることによる。当該分野において周知の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロット分析、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動が後に続く免疫沈降、免疫細胞化学などによる）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイチュハイブリダイゼーションなど）。
【０３４４】
１つの局面において、本発明は、被験体において異常なＮＯＶＸの発現または活性と関連する疾患または状態を、ＮＯＶＸの発現または少なくとも１つのＮＯＶＸ活性を調節する薬剤をこの被験体に投与することによって予防するための方法を提供する。異常なＮＯＶＸの発現または活性によって引き起こされるかまたはこれらに起因する、疾患にかかる危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載の診断アッセイまたは予後アッセイのいずれか、またはそれらの組み合わせによって、同定され得る。予防薬剤の投与は、疾患または障害が予防されるか、あるいはその進行を遅らせられるように、このＮＯＶＸ異常の特徴である症状の発現の前に行い得る。このＮＯＶＸ異常の型に依存して、例えば、ＮＯＶＸアゴニスト薬剤またはＮＯＶＸアンタゴニスト薬剤が、その被験体を処置するために使用され得る。その適切な薬剤は、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定され得る。
【０３４５】
本発明の別の局面は、治療目的のためにＮＯＶＸの発現または活性を調節する方法に関する。本発明の調節方法は、細胞を、その細胞に関するＮＯＶＸタンパク質活性の活性のうちの１つ以上を調節する薬剤と接触させる工程を包含する。ＮＯＶＸタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸またはタンパク質、ＮＯＶＸタンパク質の天然に存在する同族リガンド、ペプチド、ＮＯＶＸペプチド模倣物、または他の低分子のような、本明細書中に記載されるような薬剤であり得る。１つの実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例としては、活性なＮＯＶＸタンパク質、およびその細胞に導入されたＮＯＶＸをコードする核酸分子が挙げられる。別の実施形態において、この薬剤は、ＮＯＶＸタンパク質活性のうちの１つ以上を阻害する。このような阻害薬剤の例としては、アンチセンスＮＯＶＸ核酸分子、および抗ＮＯＶＸ抗体が挙げられる。これらの調節方法は、インビトロで（例えば、その薬剤とともにその細胞を培養することによって）、あるいはインビボで（例えば、被験体にその薬剤を投与することによって）実施され得る。このように、本発明は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子の、異常な発現または異常な活性によって特徴付けられる、疾患または障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸの発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、本明細書中に記載のスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）あるいはそのような薬剤の組み合わせを投与する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、ＮＯＶＸのタンパク質または核酸分子を、低減したかまたは異常な、ＮＯＶＸの発現または活性を補償するための治療として、投与する工程を包含する。
【０３４６】
（治療剤の生物学的効果の決定）
本発明の種々の実施形態において、適切なインビトロまたはインビボアッセイを利用して、特定の治療剤の効果およびその投与が罹患組織の処置を示すか否かを決定する。
【０３４７】
種々の特定の実施形態において、インビトロアッセイが患者の障害に関与する代表的な細胞型で行われ、所定の治療剤がこの細胞型に対して所望の効果を発揮するか否かを決定し得る。治療において使用する化合物は、ヒト被験体において試験する前に適切な動物モデル系において試験され得る。これらの動物モデル系としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなど。同様に、インビボ試験については、当該分野で公知の任意の動物モデル系が、ヒト被験体に対する投与の前に使用され得る。
【０３４８】
（悪性疾患）
ＮＯＶＸタンパク質のいくらかは、細胞の増殖に関与し得る。従って、本発明の治療剤は、細胞の過剰増殖および／または細胞増殖の制御の欠損（例えば、癌、悪性疾患および腫瘍）に関連する疾患または障害の治療的処置または予防的処置において有用であり得る。そのような過剰増殖障害の総説について、例えば、Ｆｉｓｈｍａｎら、１９８５、ＭＥＤＩＣＩＮＥ、第２版、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。
【０３４９】
本発明の治療剤を、悪性疾患および関連する障害の処置または予防における効力について、当該分野内において公知の任意の方法によってアッセイし得る。そのようなアッセイとしては、形質転換された細胞または患者の腫瘍由来の細胞を利用するインビトロアッセイ、ならびに癌または悪性疾患の動物モデルを使用するインビボアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。可能性のある有効な治療剤は、例えば、コントロールと比較して、培養物中での腫瘍由来細胞または形質転換細胞の増殖を阻害するか、または動物モデルにおいて腫瘍の後退を生じる治療剤である。
【０３５０】
本発明の実施において、一旦、悪性疾患または癌が、活性を調節すること（すなわち、阻害するか、アンタゴナイズするか、またはアゴナイズする）による処置に対して感受性であることが示されると、引き続いて、その癌または悪性疾患が、タンパク質機能を調節するように作用する治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０３５１】
（前悪性状態）
癌または悪性疾患の治療または予防処置において有効な本発明の治療剤はまた、前悪性状態の処置および／または前悪性から新生物状態もしくは悪性疾患状態への進行を防ぐための処置のために投与され得る。そのような予防的用途または治療的用途が、先行する新生物または癌への進行が知られているか、またはそれが疑われる状態（特に、過形成、化生、または最も特に、異形成からなる非新生物細胞増殖が生じた場合）において、示される。そのような異常な細胞増殖の総説について、例えば、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ、１９７６、ＢＡＳＩＣ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、第２版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。
【０３５２】
過形成は、細胞の構造または機能における有意な変化なしに、組織または器官における細胞数の増加を含む、制御された細胞の増殖の形態である。例えば、子宮内膜の過形成は、しばしば子宮内膜癌に進行することが実証されている。化生は、成熟した細胞または十分に分化した細胞の１つの型が、成熟した細胞の別の型に置換する、制御された細胞増殖の形態である。化生は、上皮組織細胞または結合組織細胞において生じ得る。異形成は、一般に癌の前駆体であると考えられ、そして上皮において主に見出される。異形成は、非新生物細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構築上の配向の損失を含む。異形成は、慢性の刺激または炎症が存在する場所で特徴的に生じ、そしてしばしば、頸部、気道、口腔、および胆嚢において見出される。
【０３５３】
あるいは、または過形成、化生、または異形成として特徴付けられる異常な細胞増殖の存在に加えて、患者由来の細胞サンプル内で、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて示される形質転換表現型または悪性疾患表現型の１つ以上の特徴の存在が、上記のタンパク質の活性を調節する能力を有する治療剤の予防的／治療的投与の望ましさの指標である。形質転換された表現型の特徴としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）形態学的変化；（ｉｉ）よりゆるい、下層への付着；（ｉｉｉ）細胞間接触阻止の喪失；（ｉｖ）足場依存性の喪失；（ｖ）プロテアーゼ放出；（ｖｉ）増加した糖輸送；（ｖｉｉ）減少した血清要求性；（ｖｉｉ）胎児抗原の発現；（ｉｘ）２５０ｋＤａ細胞表面タンパク質の消滅など。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓら１９８６、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＡＴＨＯＬＯＧＹ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。
【０３５４】
本発明の特定の実施形態において、悪性疾患についての以下の１つ以上の素因を示す患者が、治療剤の有効量の投与によって処置される：（ｉ）悪性疾患に関連する染色体転座（例えば、慢性骨髄性白血病についてのフィラデルフィア染色体（ｂｃｒ／ａｂｌ）および濾胞性リンパ腫についてのｔ（１４；１８）など）；（ｉｉ）家族性ポリープ症またはガードナー症候群（結腸癌の可能性のある前兆）；（ｉｉｉ）未確認の重要性の単一クローン性高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄腫の可能性のある前駆体）；ならびに（ｖｉ）メンデル（遺伝子）遺伝パターンを示す癌または前癌疾患（例えば、結腸の家族性ポリープ症、ガードナー症候群、遺伝性外骨腫症、多発性内分泌腺腫症（ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｉｓ）、ポイツ−ジェガーズ症候群、フォン・レックリングハウゼン病の神経線維腫症、アミロイド産生および褐色細胞腫をともなう甲状腺髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｒｉｃｉｎｏｍａ）、網膜芽細胞腫、頸動脈小体腫瘍、皮膚の黒色癌、眼内の黒色癌、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調、チェディアック−東症候群、白子症、ファンコーニ再生不良性貧血およびブルーム症候群）を有する人の一親等。
【０３５５】
別の実施形態において、本発明の治療剤が、ヒト患者に投与されて、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、または子宮癌、あるいは黒色腫または肉腫の進行を防ぐ。
【０３５６】
（過剰増殖性障害および異常増殖性（ｄｙｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）障害）
本発明の１つの実施形態において、治療剤が、過剰増殖性障害または良性の異常増殖性障害の治療的処置または予防的処置において投与される。過剰増殖性疾患または障害の処置または予防における本発明の治療剤の効力が、当該分野において公知の任意の方法によってアッセイされ得る。そのようなアッセイとしては、インビトロの細胞増殖アッセイ、過剰増殖性疾患または障害の動物モデルを使用するインビトロまたはインビボアッセイなどが挙げられる。可能性のある効果的な治療剤は、例えば、コントロールとの比較において、培養物中の細胞増殖を促進し得るか、あるいは動物モデルにおける増殖または細胞増殖を生じ得る。
【０３５７】
本発明の特定の実施形態は、肝臓の肝硬変（瘢痕が、通常の肝臓再生プロセスを上回る状態）；瘢痕プロセスが通常の再生を妨げる、皮膚の形状を損じることを生じるケロイド（過形成性瘢痕）形成の処置；乾癬（皮膚の過剰な増殖および適切な細胞運命の決定の遅延によって特徴付けられる一般的な皮膚の状態）；良性腫瘍；線維性嚢状態および組織肥厚（例えば、良性膵臓肥厚）の処置または予防に関する。
【０３５８】
（神経変性障害）
ＮＯＶＸタンパク質は、細胞成熟の脱調節およびアポトーシス（この両方が神経変性疾患の特徴である）に関係し得る。従って、本発明の治療剤（限定されることはないが、特に上記のタンパク質の活性を調節（または供給）する治療剤）が、神経変性疾患の処置または予防において効果的であり得る。神経変性障害に関与する上記のタンパク質の活性を調節する本発明の治療剤を、そのような神経変性疾患または障害を処置または予防することにおける効力について、当該分野において公知の任意の方法によってアッセイし得る。そのようなアッセイとしては、調節された細胞成熟もしくはアポトーシスの阻害についてのインビトロアッセイ、または神経変性疾患または障害の動物モデルを使用するインビボアッセイ、あるいは以下に記載する任意のアッセイが挙げられる。可能性のある効果的な治療剤は、例えば限定されないが、コントロールと比較して、調節された細胞成熟を促進し、培養物中の細胞アポトーシスを防ぎ、あるいは動物モデルにおける神経変性を減少する。
【０３５９】
一旦、神経変性疾患または障害が、調節活性による処置に対して感受性であることが示されると、その神経変性疾患または障害が、活性を調節する治療剤の投与によって処置または予防され得る。そのような疾患としては、加齢に関与する全ての変性性障害（特に、変形性関節症および神経変性障害）が挙げられる。
【０３６０】
（器官移植に関連する障害）
いくつかのＮＯＶＸは、器官移植に関連する障害（特に、限定されないが、器官拒絶反応）に関係し得る。本発明の治療剤（特に、活性を調節（または供給）する治療剤）は、器官移植に関連する疾患または障害の処置または予防において効果的であり得る。本発明の治療剤（特に、上記タンパク質のレベルまたは活性を調節する治療剤）は、このような器官移植に関連する疾患および障害の処置または予防における効力について、当該分野で公知の任意の方法によってアッセイされ得る。このようなアッセイとしては、下記のような細胞培養モデルを使用するインビトロアッセイ、または器官移植に関連する疾患および障害の動物モデルを使用するインビボアッセイが挙げられ、例えば、以下を参照のこと。潜在的に効果的な治療剤は、例えば、限定されないが、コントロールに対して比較して、動物モデルにおける免疫拒絶応答を減少する。
【０３６１】
従って、一旦、器官移植に関連する疾患および障害が、活性の調節による処置に対して感受性であることが示されると、このような疾患または障害は、活性を調節する治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０３６２】
（心臓血管疾患）
ＮＯＶＸは、アテローム性動脈硬化症のプラーク形成を含む、心臓血管障害に関係し得る。心臓血管疾患（脳血栓症または脳出血を含む）、虚血性心疾患または虚血性腎疾患、末梢血管疾患、または他の主要な血管の血栓症、および他の疾患（真性糖尿病、高血圧、甲状腺機能不全、コレステロールエステル貯蔵病、全身性エリテマトーデス、ホモシステイン症（ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅｍｉａ）、および家族性のタンパク質または脂質プロセシング疾患などを含む）のような疾患は、アテローム性動脈硬化症に直接的または間接的のいずれかで関連する。従って、本発明の治療剤（特に、活性または形成を調節（または供給）する治療剤）は、アテローム性動脈硬化症に関連する疾患または障害の処置または予防に有効であり得る。本発明の治療剤（特に、レベルまたは活性を調節する治療剤）は、このような疾患および障害の処置または予防における効力について、当該分野で公知の任意の方法（以下に記載の方法を含む）によってアッセイされ得る。
【０３６３】
広範な動物モデルおよび細胞培養モデルが、アテローム性動脈硬化症に関与するプロセスについて存在する。動物モデルの限定的かつ非排他的な列挙としては、以下が挙げられる：早発性アテローム性動脈硬化症についてのノックアウトマウス（ＫｕｒａｂａｙａｓｈｉおよびＹａｚａｋｉ，１９９６、Ｉｎｔ．Ａｎｇｉｏｌ．１５：１８７−１９４）、アテローム動脈硬化症のトランスジェニックマウスモデル（Ｋａｐｐｅｌら、１９９４、ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：５８３−５９２）、動物モデルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処置（Ｃａｌｌｏｗ，１９９５、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１０：５６９−５７６）、アテローム性動脈硬化症についてのトランスジェニックウサギモデル（Ｔａｙｌｏｒ，１９９７，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ８１１：１４６−１５２）、高コレステロール血症動物モデル（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，１９９６，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．３０（補遺）：１−１１）、高脂血症マウス（Ｐａｉｇｅｎら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．５：２５８−２６４）、および動物におけるリポキシゲナーゼの阻害（Ｓｉｇａｌら、１９９４、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１４：２１１−２２４）。さらに、インビトロ細胞モデルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：低密度リポタンパク質に曝露された単球（Ｆｒｏｓｔｅｇａｒｄら、１９９６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １２１：９３−１０３）、クローン化された血管平滑筋細胞（Ｓｕｔｔｌｅｓら、１９９５、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２１８：３３１−３３８）、内皮細胞由来の化学誘引物質に曝されたＴ細胞（Ｋａｔｚら、１９９４、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５５：５６７−５７３）、培養されたヒト大動脈内皮細胞（Ｆａｒｂｅｒら、１９９２、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６２：Ｈ１０８８−１０８５）、および泡沫細胞培養物（Ｌｉｂｂｙら、１９９６、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ ７：３３０−３３５）。潜在的に効果的な治療剤は、例えば、限定されないが、コントロールに対して比較して、細胞培養モデルにおける泡沫細胞形成、またはアテローム性動脈硬化症の高コレステロール血症マウスモデルにおけるアテローム性動脈硬化症のプラーク形成を減少する。
【０３６４】
従って、一旦、アテローム性動脈硬化症に関連する疾患または障害が、活性または形成の調節による処置に対して感受性であることが示されると、この疾患または障害は、活性を調節する治療剤の投与によって処置または予防され得る。
【０３６５】
（サイトカインおよび細胞増殖／分化活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質は、サイトカイン活性、細胞増殖活性（誘導するか、または阻害するかのいずれか）、または細胞分化活性（誘導するか、または阻害するかのいずれか）を示し得るか、あるいは特定の細胞集団における他のサイトカインの産生を誘導し得る。全ての既知のサイトカインを含む、現在までに発見された多くのタンパク質因子は、因子依存性の１以上の細胞増殖アッセイにおいて活性を示し、従って、これらのアッセイは、サイトカイン活性の簡便な確認法として作用する。本発明のタンパク質の活性は、以下を含むが、これらに限定されない細胞株についての多くの従来の因子依存性細胞増殖アッセイの任意の１つによって確認される：３２Ｄ、ＤＡ２、ＤＡ１Ｇ、Ｔ１０、Ｂ９、Ｂ９／１１、ＢａＦ３、ＭＣ９／Ｇ、Ｍ＋（ｐｒｅＢ Ｍ＋）、２Ｅ８、ＲＢ５、ＤＡ１、１２３、Ｔ１１６５、ＨＴ２、ＣＴＬＬ２、ＴＦ−１、Ｍｏ７ｅおよびＣＭＫ。
【０３６６】
本発明のタンパク質の活性は、数ある方法でもとりわけ、以下の方法によって測定され得る：以下に記載されるアッセイを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞増殖または胸腺細胞増殖についてのアッセイ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章および第７章）；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｂｅｒｔａｇｎｏｉｌｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：１７０６−１７１２、１９９０；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３２７−３４１、１９９１；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：３７７８−３７８３、１９９２；Ｂｏｗｍａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：１７５６−１７６１，１９９４。
【０３６７】
脾細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞のサイトカイン産生および／または増殖についてのアッセイとしては、ＫｒｕｉｓｂｅｅｋおよびＳｈｅｖａｃｈ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、３．１２．１−１４頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４；およびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、第１巻、６．８．１−８頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４に記載のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６８】
造血細胞およびリンパ球産生細胞の増殖および分化についてのアッセイとしては、以下によって記載されるアッセイが挙げられるが、これに限定されない：Ｂｏｔｔｏｍｌｙら：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．３．１−６．３．１２頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１；ｄｅＶｒｉｅｓら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：１２０５−１２１１，１９９１；Ｍｏｒｅａｕら、Ｎａｔｕｒｅ ３３６：６９０−６９２、１９８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２９３１−２９３８，１９８３；Ｎｏｒｄａｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．６．１−５頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１；Ｓｍｉｔｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：１８５７−１８６１，１９８６；Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １１−Ｂｅｎｎｅｔｔら：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．１５．１頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１；Ｃｉａｒｌｅｔｔａら：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、第１巻、６．１３．１頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９１。
【０３６９】
抗原に対するＴ細胞クローン応答についてのアッセイ（とりわけ、増殖およびサイトカイン産生を測定することによって、ＡＰＣ−Ｔ細胞相互作用に影響し、そしてＴ細胞の効果を指向するタンパク質を同定する）としては、以下に記載されるアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、第６章および第７章）；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７：６０９１−６０９５，１９８０；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎ １１：４０５−４１１，１９８１；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００，１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２，１９８８。
【０３７０】
（免疫刺激活性または免疫抑制活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、免疫刺激活性または免疫抑制活性（これらの限定されない活性を含むが、これらの活性についてのアッセイが本明細書中に記載される）を示し得る。タンパク質は、種々の免疫不全および免疫障害（重症複合型免疫不全（ＳＣＤＩ）を含む）の処置（例えば、Ｔリンパ球および／またはＢリンパ球の成長および増殖の（上方または下方）調節、ならびにＮＫ細胞および他の細胞集団の細胞溶解活性の誘発）において有用であり得る。これらの免疫不全は、遺伝性であり得るか、またはウイルス（例えば、ＨＩＶ）および細菌感染または真菌感染によって引き起こされ得るか、あるいは自己免疫障害から生じ得る。より詳細には、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染または他の感染によって引き起こされる感染性疾患は、本発明のタンパク質を使用して処置可能であり得、この感染としては、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ミコバクテリア、リーシュマニア種、マラリア種による感染、およびカンジダ症のような種々の真菌感染が挙げられる。もちろん、この点に関して、本発明のタンパク質はまた、免疫系に対するブーストが、一般に所望され得る（すなわち、癌の処置において）場合に有用であり得る。
【０３７１】
本発明のタンパク質を使用して処置され得る自己免疫障害としては、例えば、以下が挙げられる：結合組織疾患、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、自己免疫性肺炎、ギヤン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性真性糖尿病、重症筋無力症、対宿主性移植片病および自己免疫性炎症性眼疾患。本発明のこのようなタンパク質はまた、喘息（特に、アレルギー性喘息）または他の呼吸系障害のような、アレルギー反応およびアレルギー状態の処置に有用であり得る。免疫抑制が所望される他の状態（例えば、器官移植を含む）もまた、本発明のタンパク質を使用して処置可能であり得る。
【０３７２】
本発明のタンパク質を使用して、多くの方法で、免疫応答することもまた可能であり得る。下方調節は、すでに進行中の免疫応答を阻害またはブロックする形態であり得るか、免疫応答の誘導を妨げることを含み得る。活性化Ｔ細胞の機能は、Ｔ細胞応答を抑制することによってか、またはＴ細胞における特異的寛容を誘導することによってか、あるいはその両方によって阻害され得る。Ｔ細胞応答の免疫抑制は、一般に、抑制剤に対するＴ細胞の連続的曝露を必要とする、能動的な非抗原特異的プロセスである。寛容（Ｔ細胞における非応答性またはアネルギー（ｅｎｅｒｇｙ）を誘導することを含む）は、一般的に抗原特異的であり、そして寛容化剤に対する曝露が停止した後で持続するという点で免疫抑制と識別可能である。操作的には、寛容は、寛容化剤の非存在下における特異的抗原に対する再曝露の際に、Ｔ細胞応答の欠如によって実証され得る。
【０３７３】
１以上の抗原機能（Ｂリンパ球抗原機能（例えば、Ｂ７のような）を含むが、限定されない）を下方調節するか、または妨げること（例えば、活性化Ｔ細胞による高レベルのリンホカイン合成を妨げること）は、組織、皮膚および器官の移植の状況、ならびに対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）において有用である。例えば、Ｔ細胞機能のブロックは、組織移植における組織破壊の減少を生じるはずである。代表的に、組織移植において、移植片の拒絶は、Ｔ細胞によるその外来としての認識、それに続く移植片を破壊する免疫反応を介して開始される。移植前に免疫細胞上でＢ７リンパ球抗原のその天然のリガンドとの相互作用を阻害またはブロックする分子（例えば、Ｂ７−２活性を有するペプチドの可溶性モノマー形態単独、あるいは別のＢリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−３）またはブロッキング抗体の活性を有するペプチドのモノマー形態との組み合わせ）は、対応する同時刺激シグナルの移行を伴わずに、免疫細胞上でその分子の天然のリガンドへの結合を導き得る。このような形態でＢリンパ球抗原機能をブロックすることは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）によるサイトカイン合成を妨げ、従って、免疫抑制剤として作用する。さらに、同時刺激の欠如はまた、Ｔ細胞を活性化して、それによって被験体において寛容を誘導するのに十分であり得る。Ｂリンパ球抗原ブロッキング試薬による長期の寛容の誘導は、これらのブロッキング試薬の繰り返しの投与の必要性を回避し得る。被験体において十分な免疫抑制または寛容を達成するために、Ｂリンパ球抗原の機能をブロックすることが必要であり得る。
【０３７４】
器官移植片拒絶またはＧＶＨＤの予防における特定のブロッキング試薬の効力は、ヒトにおける効力を予測する動物モデルを使用して評価され得る。使用され得る適切な系の例としては、ラットにおける同種異系の心臓移植片およびマウスにおける異種膵臓島細胞移植片が挙げられ、その両方は、Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：７８９−７９２（１９９２）およびＴｕｒｋａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、８９：１１１０２−１１１０５（１９９２）に記載されるようなインビボでのＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質の免疫抑制効果を試験するために使用されている。さらに、ＧＶＤＨのマウスモデル（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９、８４６〜８４７頁を参照のこと）は、その疾患の発症に対する、インビボでのＢリンパ球抗原機能のブロックの効果を決定するために使用され得る。
【０３７５】
ブロッキング抗原機能はまた、自己免疫疾患の処置に治療的に有用であり得る。多くの自己免疫疾患は、自己組織に対して反応性であり、そしてその疾患の病理に関係するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する、Ｔ細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性Ｔ細胞の活性化の予防は、疾患の症状を軽減し得るか、または排除し得る。Ｂリンパ球抗原のレセプター：リガンド相互作用を破壊することによってＴ細胞の同時刺激をブロックする試薬の投与は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、そしてその疾患プロセスに関係し得る自己抗体またはＴ細胞誘導性サイトカインの産生を妨げるために使用され得る。さらに、ブロッキング試薬は、疾患の長期の軽減を導き得る自己反応性Ｔ細胞の抗原特異的寛容を誘導し得る。自己免疫障害の予防または軽減におけるブロッキング試薬の効力は、ヒト自己免疫疾患のよく特徴付けられた多くの動物モデルを使用して決定され得る。例としては、マウス実験用自己免疫脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、ならびにマウス実験用重症筋無力症が挙げられる（Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、８４０〜８５６頁を参照のこと）。
【０３７６】
免疫応答を上方調節する手段として、抗原機能（好ましくは、Ｂリンパ球抗原機能）の上方調節もまた、治療に有用であり得る。免疫応答の上方調節は、既存の免疫応答を増強するか、または初期免疫応答を誘発する形態であり得る。例えば、Ｂリンパ球抗原機能の刺激を介して免疫応答を増強することは、ウイルス感染の場合において有用であり得る。さらに、全身性ウイルス疾患（例えば、インフルエンザ、感冒および脳炎）は、Ｂリンパ球抗原の刺激形態の全身性投与によって軽減され得る。
【０３７７】
あるいは、抗ウイルス免疫応答は、患者からＴ細胞を除去し、本発明のペプチドを発現するか、または本発明の可溶性ペプチドの刺激形態を伴うかのいずれかの、ウイルス抗原でパルスしたＡＰＣで、このＴ細胞をインビトロで同時刺激し、そして患者にこのインビトロ活性化Ｔ細胞を再導入することによって、感染患者において増強され得る。抗ウイルス免疫応答を増強する別の方法は、患者から感染細胞を単離し、本明細書中に記載されるような本発明のタンパク質をコードする核酸を、この感染細胞にトランスフェクトして（その結果、これらの細胞がその表面上にこのタンパク質の全てまたは一部を発現する）、そしてこのトランスフェクト細胞を患者に再導入することである。ここで、この感染細胞は、インビボでＴ細胞に対して同時刺激シグナルを送達し、それによってＴ細胞を活性化することが可能である。
【０３７８】
別の適用では、抗原機能（好ましくはＢリンパ球抗原機能）の上方調節または増大が腫瘍免疫の誘導において有用であり得る。本発明の少なくとも１つのペプチドをコードする核酸をトランスフェクトされた腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫）を、被験体中の腫瘍特異的寛容を克服するために被験体に投与し得る。所望であれば、腫瘍細胞はトランスフェクトされてペプチドの組み合わせを発現し得る。例えば、患者から得られた腫瘍細胞に、Ｂ７−２−様活性を有するペプチド単独、またはＢ７−１−様活性および／またはＢ７−３−様活性を有するペプチドを組み合わせて発現する発現ベクターを用いて、エクスビボでトランスフェクトし得る。このトランスフェクトされた腫瘍細胞は、患者に戻され、トランスフェクトされた細胞の表面上にペプチドの発現を生じる。あるいは、遺伝子治療技法を用いて、インビボのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的化し得る。
【０３７９】
腫瘍細胞の表面上のＢ細胞リンパ球抗原の活性を有する本発明のペプチドの存在は、Ｔ細胞に対して必要な同時刺激シグナルを提供し、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介免疫応答を誘導する。さらに、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠くか、または十分な量のＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を再発現しない腫瘍細胞は、ＭＨＣクラスＩａ鎖タンパク質およびβ２マイクログロブリンタンパク質、またはＭＨＣクラスＩＩａ鎖タンパク質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質のすべてまたは一部（例えば、細胞質−ドメイン短縮化部分）をコードする核酸でトランスフェクトされ得、それによって細胞表面上にＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現する。Ｂリンパ球抗原（例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−３）の活性を有するペプチドと組み合わせた適切なクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣの発現は、トランスフェクトされた腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性免疫応答を誘導する。必要に応じて、不変鎖（ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｃｈａｉｎ）のようなＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質の発現をブロックするアンチセンス構築物をコードする遺伝子もまた、Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチドをコードするＤＮＡで同時トランスフェクトされ得、腫瘍関連抗原の提示を促進し、そして腫瘍特異的免疫を誘導する。従って、ヒト被験体におけるＴ細胞媒介免疫応答の誘導は、被験体における腫瘍特異的寛容を十分に克服し得る。
【０３８０】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法により測定され得る：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、第７章）；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２、１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：１９６８−１９７４、１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：１５６４−１５７２、１９８５：Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２、１９８８；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８：２４８８−２４９２、１９８１；Ｈｅｒｒｍａｎｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２８：１９６８−１９７４、１９８２；Ｈａｎｄａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３５：１５６４−１５７２、１９８５；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｂｏｗｍａｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１：１９９２−１９９８；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２、１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：３２７−３４１、１９９１；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：３０７９−３０９２、１９９４に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない、胸腺細胞または脾細胞の細胞傷害性のための適切なアッセイ。
【０３８１】
Ｔ細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングのための（特に、Ｔ細胞依存性抗体応答を調節し、しかもＴｈ１／Ｔｈ２プロフィールに影響するタンパク質を同定する）アッセイとしては、Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４：３０２８−３０３３、１９９０；ならびにＭｏｎｄおよびＢｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｉｇａｎら（編）、第１巻、３．８．１．−３．８．１６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ １９９４に記載のようなアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８２】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（特に、優先的にＴｈ１およびＣＴＬ応答を生成するタンパク質を同定するアッセイ）としては、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第３章、第７章）；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３７：３４９４−３５００、１９８６；Ｔａｋａｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：５０８−５１２、１９８８；Ｂｅｒｔａｇｎｏｌｌｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４９：３７７８−３７８３、１９９２に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８３】
樹状細胞依存性アッセイ（特に、ナイーブなＴ細胞を活性化する樹状細胞により発現されるタンパク質を同定するアッセイ）としては、Ｇｕｅｒｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３４：５３６−５４４、１９９５；Ｉｎａｂａら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：５４９−５５９、１９９１；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５４：５０７１−５０７９、１９９５；Ｐｏｒｇａｄｏｒら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２：２５５−２６０、１９９５；Ｎａｉｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：４０６２−４０６９、１９９３；Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６１−９６５、１９９４；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｊ．Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６９：１２５５−１２６４、１９８９；Ｂｈａｒｄｗａｊら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ９４：７９７−８０７、１９９４；およびＩｎａｂａら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７２：６３１−６４０、１９９０に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８４】
リンパ球生存／アポトーシスのためのアッセイ（特に、スーパー抗原誘導後にアポトーシスを妨げるタンパク質およびリンパ球ホメオスタシスを調節するタンパク質を同定する）としては、Ｄａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：７９５−８０８、１９９２；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ ７：６５９−６７０、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：１９４５−１９５１、１９９３；Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌｌ ６６：２３３−２４３、１９９１；Ｚａｃｈａｒｃｈｕｋ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４５：４０３７−４０４５、１９９０；Ｚａｍａｉら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １４：８９１−８９７、１９９３；Ｇｏｒｃｚｙｃａら、Ｉｎｔｅｒｎａｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ １：６３９−６４８、１９９２に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８５】
Ｔ細胞の拘束および発生の初期段階に影響するタンパク質のアッセイとしては、Ａｎｔｉｃａら、Ｂｌｏｏｄ ８４：１１１−１１７、１９９４；Ｆｉｎｅら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５：１１１−１２２、１９９４；Ｇａｌｙら、Ｂｌｏｏｄ ８５：２７７０−２７７８、１９９５；Ｔｏｋｉら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７５４８−７５５１、１９９１に記載のアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【０３８６】
（造血調節活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質は、造血の調節において、そして結果として骨髄細胞不全またはリンパ球細胞不全の処置において有用であり得る。コロニー形成性細胞または因子依存性細胞株を支援する周縁の生物学的活性でさえ、造血を調節することにおける、例えば、単独またはその他のサイトカインとの組み合わせで、赤血球系前駆体細胞の成長および増殖を支援することにおける関与を示し、それによって、例えば、種々の貧血を処置することにおけるか、または赤血球系前駆体細胞および／または赤血球細胞の産生を刺激するための照射／化学療法と組み合わせた使用のための有用性；例えば、結果として骨髄抑制を防ぐかまたは処置するための化学療法と組み合わせて有用な、骨髄細胞（例えば、顆粒球および単球／マクロファージ）の成長および増殖を支持する（すなわち伝統的なＣＳＦ活性）ことにおける有用性；巨核球そして結果として血小板の成長および増殖を支持し、それによって血小板減少症のような種々の血小板障害の予防または処置を可能にすること、そして一般に、血小板輸血に代わる使用か、またはそれへの優待のための有用性；および／または上記の任意および全ての造血細胞に成熟し得、そしてそれ故、種々の幹細胞障害（再生不良性貧血および発作性夜間血色素尿症を含むがこれらに限定されない、通常、移植で処置されるような障害）における治療有用性を見出す、造血幹細胞の成長および増殖を支持することにおける有用性、ならびに正常細胞または遺伝子治療のために遺伝子操作された細胞として、インビボまたはエキソビボ（すなわち、骨髄移植または末梢前駆体細胞移植（同種または異種）と組み合わせた）のいずれかで、照射／化学療法後に幹細胞区画を再増殖させることにおける有用性を示す。
【０３８７】
本発明のタンパク質の活性は、特に、以下の方法により測定され得る：
種々の造血株の増殖および分化の適切なアッセイは上記で引用される。
【０３８８】
胚幹細胞分化のアッセイ（特に、胚分化造血に影響するタンパク質を同定するアッセイ）は、制限されずに、以下に記載のアッセイを含む：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５：１４１−１５１、１９９５；Ｋｅｌｌｅｒら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：４７３−４８６、１９９３；ＭｃＣｌａｎａｈａｎら、Ｂｌｏｏｄ ８１：２９０３−２９１５、１９９３。
【０３８９】
幹細胞生存および分化のアッセイ（特にリンパ−造血を調節するタンパク質を同定するアッセイ）は、制限されずに、以下に記載のアッセイを含む：メチルセルロースコロニー形成アッセイ、ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ ２６５−２６８頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ １９９４における、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、；Ｈｉｒａｙａｍａら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：５９０７−５９１１、１９９２；ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ ２３−３９頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ １９９４における、ＭｃＮｉｅｃｅおよびＢｒｉｄｄｅｌｉ；Ｎｅｂｅｎら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２２：３５３−３５９、１９９４；ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ １−２１頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ １９９４における、Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ；ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ １６３−１７９頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ １９９４における、Ｓｐｏｏｎｃｅｒｅｔら；ＣＵＬＴＵＲＥ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＰＯＩＥＴＩＣ ＣＥＬＬＳ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、編、Ｖｏｌ １３９−１６２頁、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ １９９４における、Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ。
【０３９０】
（組織増殖活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、骨、軟骨、腱、靭帯および／または神経組織成長または再生のために使用される組成物、ならびに創傷治癒および組織修復および組織置換のために使用される組成物、そして火傷、切開および潰瘍の処置における用途を有し得る。
【０３９１】
本発明のタンパク質は、骨が正常に形成されない状況で軟骨および／または骨増殖を誘導し、ヒトおよびその他の動物における骨折および軟骨損傷または欠損の治癒における適用を有する。本発明のタンパク質を使用するこのような調製物は、閉鎖骨折整復および開放骨折整復における予防的使用、そしてまた人工関節の改善された固定における使用を有し得る。骨形成剤により誘導されたデノボ骨形成は、先天的、外傷誘導、または腫瘍切除誘導脳顔面頭蓋欠陥の修復に寄与し、そしてまた美容成形手術に有用である。
【０３９２】
本発明のタンパク質はまた、歯周病の処置において、およびその他の歯修復プロセスで用いられ得る。このような薬剤は、骨形成性細胞を誘因するか、骨形成性細胞の増殖を刺激するか、骨形成性細胞の前駆体の分化を誘導する環境を提供し得る。本発明のタンパク質はまた、骨および／または軟骨修復の刺激によるか、または炎症プロセスにより媒介される組織破壊の炎症またはプロセス（コラゲナーゼ活性、破骨細胞活性など）をブロックすることによるような、骨粗鬆症または変形性関節炎の処置で有用であり得る。
【０３９３】
本発明のタンパク質に寄与し得る組織再生活性の別のカテゴリーは、腱／靭帯形成である。このような組織が通常形成されない状況で、腱／靭帯様組織またはその他の組織形成を誘導する本発明のタンパク質は、ヒトおよびその他の動物における、腱または靭帯断裂、変形およびその他の腱または靭帯欠陥の治癒における適用を有する。腱／靭帯様組織誘導性タンパク質を採用するこのような調製物は、腱または靭帯組織への損傷を防ぐことにおける予防的使用、ならびに腱または靭帯の骨またはその他の組織への改善された固定、および腱または靭帯組織への欠陥を修復することにおける使用を有し得る。本発明の組成物により誘導されるデノボの腱／靭帯様組織形成は、先天的、外傷誘導、またはその他の起源のその他の腱または靭帯欠陥の修復に寄与し、そしてまた腱または靭帯の付着または修復のための美容成形手術で有用である。本発明の組成物は、腱形成性細胞または靭帯形成性細胞を誘引するか、腱形成性細胞または靭帯形成性細胞の増殖を刺激するか、腱形成性細胞または靭帯形成性細胞の前駆体の分化を誘導するか、または組織修復を行うためにインビボに戻すためにエキソビボで腱／靭帯の細胞または前駆体の増殖を誘導する環境を提供し得る。本発明の組成物はまた、腱炎、毛根管症候群およびその他の腱または靭帯欠陥の処置において有用であり得る。この組成物はまた、当該分野で周知であるキャリアとして、適切なマトリックスおよび／または金属イオン封鎖剤を含み得る。
【０３９４】
本発明のタンパク質はまた、ニューロン細胞の増殖のため、および神経および脳組織の再生のために、すなわち、中枢神経系疾患および末梢神経系疾患および神経障害、ならびにニューロン細胞または神経組織への変性、死滅または外傷を含む機械的および外傷障害の処置のために有用であり得る。より詳細には、タンパク質は、末梢神経損傷、末梢神経障害および局所神経障害のような末梢神経系の疾患、ならびにアルツハイマー病，パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮側索硬化症、およびシャイ−ドレーガー症候群のような中枢神経系の疾患の処置で用いられ得る。本発明に従って処置され得るさらなる症状は、脊髄障害，頭部外傷および発作のような脳血管性疾患のような機械的および外傷的障害を含み得る。化学的療法またはその他の医療治療から生じる末梢神経障害もまた、本発明のタンパク質を用いて治療可能であり得る。
【０３９５】
本発明のタンパク質はまた、圧迫性潰瘍、血管不全に関連する潰瘍、手術および外傷創傷などを含むがこれらに限定されない非治癒創傷のより良好な、またはより迅速な閉鎖を促進するために有用であり得る。
【０３９６】
本発明のタンパク質がまた、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮を含む）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）および血管（血管内皮を含む）組織のようなその他の組織の生成または再生に、またはこのような組織を含む細胞の増殖を促進するために活性を示し得ることが予想される。所望の効果の一部分は、繊維症瘢痕の阻害または調整により、正常組織を再生させる。本発明のタンパク質はまた、血管形成活性を示し得る。
【０３９７】
本発明のタンパク質はまた、腸の保護または再生のため、および肺若しくは肝臓の繊維症、種々の組織における再灌流傷害、および全身サイトカイン損傷から生じる症状の処置のために有用であり得る。
【０３９８】
本発明のタンパク質はまた、前駆体組織または細胞から上記の組織の分化を促進若しくは阻害するため；または上記の組織の増殖を阻害するために有用であり得る。
【０３９９】
本発明のタンパク質の活性はまた、特に、以下の方法により測定され得る：
組織生成活性のためのアッセイは、制限されずに、以下に記載されるアッセイを含む：国際特許公開番号ＷＯ９５／１６０３５（骨、軟骨、腱）；国際特許公開番号ＷＯ９５／０５８４６（神経、ニューロン）；国際特許公開番号ＷＯ９１／０７４９１（皮膚、内皮）。
【０４００】
創傷治癒活性のためのアッセイは、制限されずに、以下に記載のアッセイを含む：ＥａｇｌｓｔｅｉｎおよびＭｅｎｚ、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ ７１：３８２−８４（１９７８）によって改変されるような、Ｗｉｎｔｅｒ、ＥＰＩＤＥＲＭＡＬ ＷＯＵＮＤ ＨＥＡＬＩＮＧ、７１−１１２頁（ＭａｉｂａｃｈおよびＲｏｖｅｅ編）、Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ。
【０４０１】
（アクチビン／インヒビン活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、アクチビン関連活性またはインヒビン関連活性を示し得る。インヒビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を阻害するその能力によって特徴付けられ、一方、アクチビンは、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出を刺激するその能力によって特徴付けられる。従って、本発明のタンパク質は、単独またはインヒビンファミリーのメンバーとのヘテロ二量体において、雌性哺乳動物における受胎能を減少し、そして雄性哺乳動物における精子形成を減少するインヒビンの能力に基づく避妊薬として有用であり得る。他のインヒビンの十分な量の投与は、これら哺乳動物における不妊症を誘導し得る。あるいは、本発明のタンパク質は、ホモ二量体としてか、またはインヒビンｂ群の他のタンパク質サブユニットとのヘテロ二量体として、下垂体前葉の細胞からのＦＳＨ放出を刺激するアクチビン分子の能力に基づいて、受胎能誘導治療として有用であり得る。例えば、米国特許第４，７９８，８８５号を参照のこと。本発明のタンパク質はまた、ウシ、ヒツジ、およびブタのような家畜の一生の生殖効率を増加するように、性的に未熟な哺乳動物における受胎能の開始の促進のために有用であり得る。
【０４０２】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
アクチビン／インヒビン活性のアッセイとしては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｖａｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ９１：５６２〜５７２、１９７２；Ｌｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７９〜７８２、１９８６；Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：７７６〜７７９、１９８６；Ｍａｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：６５９〜６６３、１９８５；Ｆｏｒａｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：３０９１〜３０９５、１９８６。
【０４０３】
（走化性／ケモキネシス活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質は、哺乳動物細胞（例えば、単球、線維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、肥満細胞、好酸球、上皮細胞および／または内皮細胞を含む）についての走化性またはケモキネシス活性（例えば、ケモカインとして作用する）を有し得る。走化性およびケモキネシスタンパク質を使用して、所望の細胞集団を所望の作用部位に動員または誘引し得る。走化性またはケモキネシスタンパク質は、組織に対する創傷および他の外傷の処置、ならびに局所的感染の処置において、特に利点を提供する。例えば、リンパ球、単球または好中球の、腫瘍または感染部位への誘引は、腫瘍または感染因子に対する改善された免疫応答を生じ得る。
【０４０４】
タンパク質またはペプチドは、それが直接的または間接的に、特定の細胞集団の指向された方向付けまたは移動を刺激し得る場合、そのような細胞集団について走化性活性を有する。好ましくは、タンパク質またはペプチドは、細胞の指向された移動を直接刺激する能力を有する。特定のタンパク質が細胞の集団について走化性活性を有するか否かは、細胞の走化性についての任意の公知のアッセイにおいて、そのようなタンパク質またはペプチドを使用することによって、容易に決定され得る。
【０４０５】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
走化性活性についてのアッセイ（走化性を誘導するか、または妨げるタンパク質を同定する）は、細胞の膜を横切る移動を誘導するタンパク質の能力、ならびに１つの細胞集団の別の細胞集団に対する接着を誘導するタンパク質の能力を測定するアッセイからなる。移動および接着についての適切なアッセイとしては以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｉｇａｎら編（第６．１２章、ＭＥＡＳＵＲＥＭＥＮＴ ＯＦ ＡＬＰＨＡ ＡＮＤ ＢＥＴＡ ＣＨＥＭＯＫＩＮＥＳ ６．１２．１〜６．１２．２８）；Ｔａｕｂら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ９５：１３７０〜１３７６、１９９５；Ｌｉｎｄら、ＡＰＭＩＳ １０３：１４０〜１４６、１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：１７４４〜１７４８；Ｇｒｕｂｅｒｅｔら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：５８６０〜５８６７、１９９４；Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３：１７６２〜１７６８、１９９４。
【０４０６】
（うっ血活性および血栓崩壊活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、うっ血活性または血栓崩壊活性を示し得る。結果として、そのようなタンパク質は、種々の凝固障害（血友病のような遺伝性障害を含む）の処置において有用であること、または凝固および外傷、外科手術または他の原因によって生じる創傷の処置における他のうっ血事象を促進することが予測される。本発明のタンパク質はまた、血栓症の溶解または形成阻害のため、およびそこから生じる状態（例えば、心臓血管および中枢神経系血管の梗塞（例えば、発作））の処置および予防のために有用であり得る。
【０４０７】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
うっ血および血栓崩壊活性のアッセイとしては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない：Ｌｉｎｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６：１３１〜１４０、１９８６；Ｂｕｒｄｉｃｋら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓ．４５：４１３〜４１９、１９８７；Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ５：７１〜７９（１９９１）；Ｓｃｈａｕｂ、Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ ３５：４６７〜４７４、１９８８。
【０４０８】
（レセプター／リガンド活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、レセプター、レセプターリガンドまたはレセプター／リガンド相互作用のインヒビターもしくはアゴニストとしての活性を実証し得る。そのようなレセプターおよびリガンドの例としては、限定することなく、サイトカインレセプターおよびそのリガンド、レセプターキナーゼおよびそのリガンド、レセプターホスファターゼおよびそのリガンド、細胞間相互作用に関与するレセプターおよびそのリガンド（限定することなく、細胞接着分子（セレクチン、インテグリンおよびそのリガンド）、ならびに抗原提示、抗原認識および細胞性免疫応答および体液性免疫応答の発生に関与するレセプター／リガンド対を含む）が挙げられる。レセプターおよびリガンドはまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の可能性のあるペプチドまたは低分子インヒビターのスクリーニングにおいて有用である。本発明のタンパク質（限定することなく、レセプターおよびリガンドのフラグメントを含む）が、それ自体で、レセプター／リガンド相互作用のインヒビターとして有用であり得る。
【０４０９】
本発明のタンパク質の活性は、とりわけ、以下の方法によって測定され得る：
レセプター−リガンド活性の適切なアッセイとしては、限定することなく、以下に記載されるものが挙げられる：ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（第７．２８章、Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ７．２８．１−７．２８．２２）、Ｔａｋａｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６８６４〜６８６８、１９８７；Ｂｉｅｒｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１１４５〜１１５６、１９８８；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１４９〜１６０ １９８９；Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １７５：５９〜６８、１９９４；Ｓｔｉｔｔら、Ｃｅｌｌ ８０：６６１〜６７０、１９９５。
【０４１０】
（抗炎症活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、抗炎症活性を示し得る。抗炎症活性は、炎症応答に関与する細胞に対する刺激を提供すること（細胞間相互作用（例えば、細胞接着）を阻害するかまたは促進することによって）によってか、炎症プロセスに関与する細胞の走化性を阻害するかまたは促進することによってか、細胞の血管外遊出を阻害するかまたは促進するかによってか、あるいは炎症応答を直接的により阻害するかまたはより促進する他の因子の産生を刺激するかまたは抑制することによって、達成され得る。そのような活性を示すタンパク質を使用して、炎症状態（慢性状態または急性状態を含む）（限定することなく、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））、虚血−灌流損傷、内毒素の致死性、関節炎、補体媒介性激症拒絶症、腎炎、サイトカイン誘導性肺損傷またはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、またはＴＮＦもしくはＩＬ−１のようなサイトカインの過剰産生より生じるものが挙げられる）を処置し得る。本発明のタンパク質はまた、抗原性物質または抗原性材料に対する、アナフィラキシーおよび過敏症の処置のためにも、有用であり得る。
【０４１１】
（腫瘍阻害活性）
腫瘍の免疫学的処置または予防について上記に記載された活性に加えて、本発明のＮＯＶＸタンパク質は、他の抗腫瘍活性を示し得る。タンパク質は、直接的または間接的（例えば、ＡＤＣＣを介して）腫瘍増殖を阻害し得る。タンパク質は、腫瘍組織または腫瘍前駆体組織に作用することによって、腫瘍増殖を支持するために必要な組織の形成を阻害することによって（例えば、新脈管形成を阻害することによって）、腫瘍増殖を阻害する他の因子、物質または細胞型の産生を生じることによって、あるいは腫瘍増殖を促進する因子、物質または細胞型を、抑制、除去または阻害することによって、その腫瘍阻害活性を示し得る。
【０４１２】
（他の活性）
本発明のＮＯＶＸタンパク質はまた、以下のさらなる活性または効果の１つ以上を示し得る：限定はされないが、細菌、ウイルス、真菌および他の寄生生物を含む感染因子の、増殖、感染または機能を阻害するか、あるいは死滅させること；身体的特徴（限定することなく身長、体重、髪の色、目の色、皮膚、赤肉に対する脂肉の比、または他の組織色素沈着、あるいは器官または身体部分のサイズまたは形状（例えば、胸部増大または減少、骨の形態または形状の変化）が挙げられる）を生じること（抑制することまたは増強すること）；バイオリズムあるいはサーカディアンサイクルまたはサーカディアンリズムを生じること；雄性被験体または雌性被験体の受胎能を生じること；食事脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子または他の栄養因子もしくは栄養成分の、代謝、異化作用、同化作用、プロセシング、利用、貯蔵または除去を生じること；行動的特徴（食欲、性欲、ストレス、認識（認識障害を含む）、うつ病（抑うつ障害を含む）および狂暴症を含むが、これらに限定されない）を生じること；鎮痛性効果または他の疼痛減少効果を提供すること；造血系列以外の系列における胚性幹細胞の分化および増殖を促進すること；ホルモン活性または内分泌活性；酵素の場合、酵素の欠損を矯正すること、および欠損関連疾患を処置すること；過剰増殖障害（例えば、乾癬）の処置；免疫グロブリン様活性（例えば、抗原または補体に結合する活性）；ならびにワクチン組成物において抗原として作用し、そのようなタンパク質または他の物質あるいはそのようなタンパク質と交差反応する実体に対する免疫応答を惹起する能力。
【０４１３】
神経障害としては、一般的に以下が挙げられる：パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、神経系の腫瘍、神経毒への曝露、急性脳損傷、末梢神経外傷または損傷、ならびに他の神経障害、てんかん、および／または振せん。
【０４１４】
（実施例１．ＮＯＶ６の染色体位置）
ヒト染色体マーカーを用いる放射ハイブリッドマッピングを、本明細書に記載の多数のクローンについて実施した。これらの結果を得るために使用した手順は、Ｓｔｅｅｎ，ＲＧら（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９９（１９９９年５月２１日オンラインで公開）第９巻：ＡＰ１−ＡＰ８、１９９９）に記載される手順に類似する。無作為化した照射により誘導したヒト染色体フラグメントを含む９３細胞クローンのパネルを、９６ウェルプレートで、所定のクローンを独特の様式で同定するよう設計したＰＣＲプライマーを使用して、スクリーニングした。この手順を使用して、本発明に従うＮＯＶ６核酸は、ＷＩ−４９２０から−０．７ｃＲおよびＷＩ−１４２１から−３．９０ｃＲの地図距離で、第１１染色体に位置決定された。
【０４１５】
（実施例２．ＮＯＶＸ核酸の定量的組織発現分析）
ＮＯＶＸ核酸を含む種々のクローンの定量的発現を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＴＡＱＭＡＭ（登録商標）分析）によって、４１個の正常サンプルおよび５５個の腫瘍サンプルで評価した（表４を参照のこと）。表４において、以下の略語が使用される：
ｃａ．＝癌、
＊＝転移から樹立された、
ｍｅｔ＝転移、
ｓ ｃｅｌｌ ｖａｒ＝小細胞変異体、
ｎｏｎ−ｓ＝ｎｏｎ−ｓｍ＝非小、
ｓｑｕａｍ＝扁平上皮（ｓｑｕａｍｏｕｓ）、
ｐｌ．ｅｆｆ＝ｐｌ ｅｆｆｕｓｉｏｎ＝胸水、
ｇｌｉｏ＝神経膠腫、
ａｓｔｒｏ＝星状細胞腫、および
ｎｅｕｒｏ＝神経芽細胞腫。
【０４１６】
第１に、９６ＲＮＡサンプルをβアクチンに対して正規化し、そしてＧＡＰＤＨ．ＲＮＡ（合計約５０ｎｇまたは約１ｎｇポリＡ＋）を、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ；ｃａｔ＃Ｎ８０８−０２３４）および製造者のプロトコールに従ったランダムな６量体を使用してｃＤＮＡに変換した。反応を、２０μｌで実施し、そして３０分間４８℃でインキュベートした。次いで、ｃＤＮＡ（５μｌ）を、製造業者のプロトコールに従って、βアクチンおよびＧＡＰＤＨ ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３１０８８１Ｅおよび４３１０８８４Ｅの各々）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０４４４７）を使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）反応のために、分離プレートに移した。反応を、以下のパラメータを使用して２５μｌで実施した：５０℃で２分；９５℃で１０分；９５℃で１５秒／６０℃で１分（４０サイクル）。結果を、対数スケールを使用するＣＴ値（所与のサンプルが、蛍光の閾値レベル超えるサイクル）として記録し、所与のサンプルと最も低いＣＴ値を有するサンプルとの間のＲＮＡ濃度の差は、２のΔＣＴ乗として示した。次いで、相対発現パーセントを、このＲＮＡの差の逆数をとって１００を掛けることにより得る。βアクチンおよびＧＡＰＤＨについて得られたＣＴの平均値は、ＲＮＡサンプルを正規化するために使用した。最も高いＣＴ値を生じるＲＮＡサンプルは、さらなる希釈を必要としないが、他の全てのサンプルは、β−アクチン／ＧＡＰＤＨの平均ＣＴ値に従ってこのサンプルと比較して希釈した。
【０４１７】
正規化ＲＮＡ（５μｌ）を、ｃＤＮＡに転換し、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ番号４３０９１６９）および遺伝子特異的プライマーを使用するＴＡＱＭＡＮ（登録商標）によって分析した。プローブおよびプライマーを、インプットとしてそれぞれのクローンの配列を使用する、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｐｐｌｅ ＣｏｍｐｕｔｅｒのＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｐｏｗｅｒ ＰＣ用のヴァージョンＩ）に従って、各アッセイに対して設定した。デフォルトの設定を、反応条件に対して使用し、そして以下のパラメータを、プライマーを選択する前に設定した：プライマーの濃度＝２５０ｎＭ、プライマーの融点（Ｔｍ）範囲＝５８℃〜６０℃、プライマーの最適Ｔｍ＝５９℃、プライマーの最大差＝２℃、プローブは、５’Ｇを有さず、プローブＴｍは、プライマーＴｍよりも１０℃高くなければならず、アンプリコンサイズ７５ｂｐ〜１００ｂｐ。選択されるプローブおよびプライマー（以下を参照のこと）は、Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって合成された。プローブを、未反応の色素を除去するために２回ＨＰＬＣ精製し、プローブのそれぞれ５’末端および３’末端へのレポーター色素およびクエンチャー色素のカップリングを立証するために、マススペクトルによって評価した。正方向プライマーおよび逆方向プライマーの最終濃度は、各々９００ｎＭであり、そしてプローブの濃度は、２００ｎＭであった。
【０４１８】
ＰＣＲ条件：各組織および各細胞株由来の正規化ＲＮＡを、９６ウエルＰＣＲプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の各ウエルにスポットした。２つのプローブ（ＮＯＶＸプローブで多重化されたＮＯＶＸ特異的プローブおよび別の遺伝子特異的プローブ）を含むＰＣＲカクテルを、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００の１×ＴａｑＭａｎＴＭＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（５ｍＭのＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ｄＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ（１：１：１：２の比））、０．２５Ｕ／ｍｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＧｏｌｄＴＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および０．４Ｕ／μｌのＲＮａｓｅインヒビター、および０．２５Ｕ／μｌの逆転写酵素を含む）を用いて設定した。逆転写を、４８℃で３０分間実施し、次いで以下の増幅／ＰＣＲサイクルを実施した：９５℃で１０分、次いで９０℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル。
【０４１９】
各クローンの発現分析において使用されたプライマー−プローブのセット、および結果の要約は、以下に与えられる。
【０４２０】
（ＮＯＶ２）
Ａｇ １４２（Ｆ）：５’−ＡＡＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＴＣＡＡＡＣＧＴＧＴＣＴ−３’（配列番号４７）
Ａｇ １４２（Ｒ）：５’−ＧＧＴＣＡＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号４８）
Ａｇ １４２（Ｐ）：ＦＡＭ−５’−ＣＣＣＡＴＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号４９）
表４の結果は、ＮＯＶ２が、いくつかの癌細胞株において優先的に発現され、転移した前立腺癌において最も高いことを示す。
【０４２１】
（ＮＯＶ５）
Ａｇ ８９（Ｆ）：５’−ＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５０）
Ａｇ ８９（Ｒ）：５’−ＧＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＧＴＡＴＧＧＡ−３’（配列番号５１）
Ａｇ ８９（Ｐ）：ＴＥＴ−５’−ＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号５２）
これらの結果は、乳腺における高い発現を示す（表４）。
【０４２２】
（ＮＯＶ７）
Ａｇ ６（Ｆ）：５’−ＧＧＡＴＧＣＡＴＧＣＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡ−３’（配列番号５３）
Ａｇ ６（Ｒ）：５’−ＣＴＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＡ−３’（配列番号５４）
Ａｇ ６（Ｐ）：−ＦＡＭ−５’−ＣＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧＴＣＡＣＴＣ−３’ＴＡＭＲＡ （配列番号５５）
これらの結果は、多数の正常細胞株（脳、膵臓、胎盤、および精巣を含む）および癌細胞株（結腸、肺および前立腺転移を含む）における高い発現を示す（表４を参照のこと）。
【０４２３】
（ＮＯＶ８）
Ａｇ７（Ｆ）：５’−ＧＣＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴＡＣ−３’（配列番号５６）
Ａｇ７（Ｒ）：５’−ＧＡＴＧＧＧＣＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＡＧ−３’（配列番号５７）
Ａｇ７（Ｐ）：−ＦＡＭ−５’−ＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号 ５８）
これらの結果は、ＮＯＶ８が、組織パネルにおいて、試験された大部分の正常組織および癌組織（肺癌を含む）で、種々の程度で広範に発現されることを示す。
【０４２４】
（ＮＯＶ１６およびＮＯＶ１７）
Ａｇ１４５（Ｆ）：５’−ＣＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＣＧＡ−３’（配列番号５９）
Ａｇ１４５（Ｒ）：５’−ＣＡＧＧＧＣＧＡＣＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号６０）
Ａｇ１４５（Ｐ）：ＦＡＭ−５’−ＴＡＧＴＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＴＡＴＣＣＣＡＣＣ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号６１）
これらの核酸配列は、同種の正常組織と比較して、多くの腫瘍細胞株において下方調節される（表４を参照のこと）。これらの結果は、これらの腫瘍型が、これらのＮＯＶＸ核酸またはコードされるポリぺプチドの活性または発現を増加させることにより、処置され得るかまたは予防され得るということを示唆する。
【０４２５】
（ＮＯＶ１１）
Ａｇ ４７ｂ（Ｆ）：５’−ＧＡＡＣＧＣＣＧＧＡＧＣＡＴＡＣＡＧＡ−３’（配列番号６２）
Ａｇ ４７ｂ（Ｒ）：５’−ＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号６３）
Ａｇ ４７ｂ（Ｐ）：ＴＥＴ−５’−ＣＣＡＧＧＴＡＣＴＧＣＡＣＡＡＡＣＡＣＧＧＣＴＴＣＡＴ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号６４）
これらの結果は、ＮＯＶ１１が、脳および中枢神経系細胞において広く発現されれ、より高い発現は、正常細胞よりも癌細胞において見出されることを示す（表４を参照のこと）。ＮＯＶ１１はまた、とりわけ乳癌細胞において発現される。
【０４２６】
（ＮＯＶ１０）
Ａｇ １５９（Ｆ）：５’−ＡＡＣＣＧＣＣＣＣＧＡＡＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号６５）
Ａｇ １５９（Ｒ）：５’−ＣＴＧＧＧＡＣＡＴＴＴＴＴＣＴＧＡＧＣＣＴＴ−３’（配列番号６６）
Ａｇ １５９（Ｐ）：ＦＡＭ−５’−ＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣＴＴ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号６７）
これらの結果は、ＮＯＶ１０が、試験された大部分の細胞株において広く発現されることを示す（表４を参照のこと）。高い発現は、例えば、黒色腫、乳癌、結腸癌、肝臓癌、および卵巣癌において見出された。
【０４２７】
（ＮＯＶ１２）
Ａｇ ４３（Ｆ）： ５’−ＡＡＡＴＣＧＣＡＡＧＡＣＡＴＴＣＡＣＴＧＴＣＡ−３’（配列番号６８）
Ａｇ ４３（Ｒ）：５’−ＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＡＣＴ−３’（配列番号６９）
Ａｇ ４３（Ｐ）：ＴＥＴ−５’−ＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＣ−３’−ＴＡＭＲＡ（配列番号７０）
ＮＯＶ１２は、特異的に脳および大細胞肺癌において高く発現されることが見出された。
【０４２８】
（ＮＯＶ２０）
Ａｇ １１９（Ｆ）：５’−ＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＧＡＴＧＣ−３ ’（配列番号７１）
Ａｇ １１９（Ｒ）：５’−ＧＣＣＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＴＡＴＴＧＧ−３ ’（配列番号７２）
Ａｇ １１９（Ｐ）：ＦＡＭ−５’−ＧＡＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＴ−３ ’−ＴＡＭＲＡ（配列番号７３）
これらの結果はまた、ＮＯＶ２０が、多くの組織において広く発現されることを示す。最も高い発現レベルは、精巣において見出される。
【０４２９】
【表４】
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
Figure 2004527202
（実施例３．ＮＯＶ４核酸（クローン３１８９６０１）の分子クローニング）
ＮＯＶ４核酸によってコードされる１５２アミノ酸残基のタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡクローンをＰＣＲ増幅するために、以下のオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した：
３１８９６０１ Ｆ−正方向：ＣＧＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＴＧ ＴＡＴ ＡＴＡ ＧＡＴ ＧＧＧ ＧＴＴ ＴＴＴ ＣＣ（配列番号９３）
３１８９６０１ Ｆ−逆方向：ＧＧＴＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＴＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＧＧ ＧＧＡ ＴＧＴ ＴＴＣ ＣＣＣ ＧＴＴ（配列番号７４）。
【０４３０】
正方向プライマーは、インフレームでＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーはインフレームでＳａｌＩ制限部位を含む。
【０４３１】
ＰＣＲ反応を、５ｎｇのヒト精巣ｃＤＮＡテンプレート、各々１μＭの３１８９６０１ Ｆ−正方向プライマーおよび３１８９６０１ Ｆ−逆方向プライマー、５μモルのｄＮＴＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）および１マイクロリットルの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＨＦ２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）（５０マイクロリットル容量中）を使用して設計した。以下の反応条件を使用した：
ａ） ９６℃ ３分間
ｂ） ９６℃ ３０秒間変性
ｃ） ７０℃ ３０秒間、プライマーアニーリング。この温度を１℃／サイクルで次第に低下させた
ｄ） ７２℃ １分間伸長
工程（ｂ）〜（ｄ）を１０回繰り返す
ｅ） ９６℃ ３０秒間変性
ｆ） ６０℃ ３０秒間アニーリング
ｇ） ７２℃ １分間伸長
工程（ｅ）〜（ｇ）を２５回繰り返す
ｈ） ７２℃ ５分間最終伸長。
【０４３２】
約３００ｂｐの単一の増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。この産物を単離し、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＳａｌＩ制限酵素で消化し、そしてｐＭｅｌＢａｃ発現ベクターおよびｐＳｅｃＴａｇ２発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）に直接連結した。クローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を、１０２アミノ酸長ポリペプチドをコードするＯＲＦとして決定した。クローニングされた構築物を、それぞれｐＭｅｌＢａｃ−ｃｇ３１８９６０１−Ｓ３およびｐＳｅｃＴａｇ２−ｃｇ３１８９６０１−Ｓ５と呼ぶ。
【０４３３】
ｐＭｅｌＢａｃ−ｃｇ３１８９６０１−Ｓ３およびｐＳｅｃＴａｇ２−ｃｇ３１８９６０１−Ｓ５中の挿入物のヌクレオチド配列は、互いに同一であることが見出されたが、配列番号７の配列とは異なっていた。この違いは、コードされたタンパク質の読み枠をそれぞれ破壊および修復する、ギャップおよび挿入を含む。この遺伝子フラグメントの配列（配列番号７５）およびコードされたポリペプチドの配列（配列番号７６）を以下に示す：
【０４３４】
【化２４】
Figure 2004527202
（実施例４．ＮＯＶ２１核酸（クローン３２１１１０１．０．１２０）の分子クローニング）
クローン３２１１１０１．０．１２０中に存在するＮＯＶ２１核酸の推定成熟細胞外ドメインをクローニングした。クローニングされたドメインは残基２６〜残基１４９までをコードした。他のポリペプチドの領域は、推定シグナルペプチド（残基１〜２５）および膜貫通ドメイン（残基１５０〜１６９）を含む。
【０４３５】
この細胞外ドメインを増幅するために使用するオリゴヌクレオチドプライマーには、ＢａｍＨＩ制限部位を含む正方向プライマーおよびＸｈｏＩ制限部位を含む逆方向プライマーが含まれる。これらのプライマーの配列を以下に示す：
３２１１１０１ Ｍａｔ正方向：ＧＧＡＴＣＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＧＡＧ ＡＡＡ ＴＣＣ ＴＣＡ ＧＡＴ ＧＧＴ（配列番号７７）
３２１１１０１ Ｍａｔ逆方向：ＣＴＣＧＡＧ ＡＧＧ ＧＴＴ ＧＴＡ ＣＴＣ ＴＧＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＴＧ（配列番号７８）。
【０４３６】
ＰＣＲ反応を、５ｎｇのヒト膵臓ｃＤＮＡテンプレート、各々１μＭの３２１１１０１ Ｍａｔ正方向プライマーおよび３２１１１０１ Ｍａｔ逆方向プライマーを使用して設計した。残りの条件および工程は、実施例ＢＡにおいて使用されるものと同じであった。
【０４３７】
約４５０ｂｐの単一の増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。この産物を単離し、そしてｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）に連結した。クローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を、残基２６〜残基１４９までのＮＯＶ２１の成熟細胞外ドメインをコードするＯＲＦとして確認した。この構築物を、ｐＣＲ２．１−３２１１１０１−Ｓ２１９−３Ｃと呼ぶ。この配列は、クローンＮＯＶ２１のＯＲＦの配列と同一である。
【０４３８】
（実施例５．ＮＯＶ６核酸（クローン３２１８７１５）の分子クローニング）
３９３残基の全長ｃｇＮＯＶ６タンパク質をコードするＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを調製した。正方向プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーはＸｈｏＩ制限部位を含む。そのプライマーの配列は以下である：
３２１８７１５ Ｆ−ＴＯＰＯ−正方向：ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＧＧ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＴＧＧ（配列番号７９）
３２１８７１５ Ｆ−ＴＯＰＯ−逆方向：ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＴＡ ＧＴＣ ＣＡＧ Ｇ（配列番号８０）。
【０４３９】
ＰＣＲ反応を、５ｎｇのヒト精巣および胎児脳のｃＤＮＡテンプレート、各々１μＭの３２１８７１５ Ｆ−ＴＯＰＯ−正方向プライマーおよび３２１８７１５ Ｆ−ＴＯＰＯ−逆方向プライマーを使用して設計した。残りの条件は、以下の工程以外は実施例３において使用されたものと同じであった：
ｄ） ７２℃ ２分間伸長；
ｇ） ７２℃ ２分間伸長。
【０４４０】
約１．２ｋｂｐの単一の増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。この産物を単離し、そしてｐｃＤＮＡ３．１−ＴＯＰＯ−Ｖ５−Ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）に直接連結した。クローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を、配列番号１１の対応するセグメントの配列と同一であると決定した。この構築物を、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ−３２１８７１５と呼ぶ。
【０４４１】
（実施例６．ＮＯＶ９核酸の細胞外ドメイン（クローン３５４００００）の分子クローニング）
残基１３８〜４１０のＮＯＶ９の細胞外ドメインをコードするＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。正方向プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーはＸｈｏＩ制限部位を含む。そのプライマーの配列は以下である：
３５４００００ Ｃ−正方向：ＣＧＴＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＡＧ ＴＧＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＡＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＧＧ ＴＡＣ（配列番号８１）
３５４００００ Ｃ−逆方向：ＣＧＴＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＡＴ ＡＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＧＧＡ ＣＡＣ ＣＡＧ ＧＣＡ Ｇ（配列番号８２）。
【０４４２】
ＰＣＲ反応を、５ｎｇのヒト胎盤ｃＤＮＡテンプレート、各々１μＭの３５４００００ Ｃ−正方向プライマーおよび３５４００００ Ｃ−逆方向プライマーを使用して設計した。残りの条件および手順は、実施例３において使用されるものと同じであった。
【０４４３】
約８００ｂｐの単一の増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。この産物を単離し、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そしてｐＳｅｃＴａｇ２発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）に連結した。クローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を、予測されたように２７３アミノ酸長ポリペプチドをコードするＯＲＦとして決定した。この構築物を、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｃｇ３５４００００−Ｓ２２Ａと名付けた。このヌクレオチド配列は、配列番号１７の対応するセグメントと同一である。
【０４４４】
（実施例７．ＮＯＶ１２核酸（クローン１０２１９６４６．０．５８）の分子クローニング）
本発明に従うＮＯＶ１２核酸の予測されたオープンリーディングフレームは、新規な４０４残基のタンパク質をコードする。このコードされたタンパク質は、残基１〜残基２５までのシグナルペプチドを有するＩ型膜貫通タンパク質であることが予測される。残基２５〜３３３までの成熟形態の細胞外ドメインをコードするＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。正方向プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含み、そして逆方向プライマーはＳａｌＩ制限部位を含む。そのプライマーの配列は以下である：
１０２１９６４６ ＭａｔＦ：ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＡＴ ＡＡＡ ＧＴＴ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＧＣ（配列番号８３）
１０２１９６４６ 逆方向：ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＴＴ ＡＧＧ ＡＴＣ ＡＴＧ ＣＡＣ（配列番号８４）。
【０４４５】
ＰＣＲ反応を、ヒト精巣、胎児脳、乳房、骨格筋由来のｃＤＮＡの等量の部分からなる５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、ならびに各々１μＭの１０２１９６４６ ＭａｔＦプライマーおよび１０２１９６４６ 逆方向プライマーを使用して設計した。残りの条件および手順は、実施例３において使用されるものと同じであった。
【０４４６】
約４００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。この産物を単離し、そしてｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｃａｒｌｓｂａｄ）に連結した。クローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を、予測されたように３０９アミノ酸長ポリペプチドをコードするＯＲＦとして決定した。この構築物を、ｐＣＲ２．１−ｃｇ１０２１９６４６−Ｓ３４４−５Ｂと名付け、そしてこの配列は、配列番号２３の対応するセグメントと同一である。
【０４４７】
（実施例８．ＮＯＶ１８核酸（クローン３７２６３９２）の分子クローニング）
１３７残基のＮＯＶ１８タンパク質をコードするＤＮＡセグメントをＰＣＲ増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計した。正方向プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位およびコンセンサスＫｏｚａｋ配列ＣＣＡＣＣを含んだ。
逆方向プライマーはＸｈｏＩ制限部位を含んだ。これらのプライマーは以下の配列を有した：
３７２６３９２ Ｆ−正方向：ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＴ ＣＡＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＣＡ ＴＡＧ（配列番号８５）
３７２６３９２ Ｆ−逆方向：ＣＧＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＴＧ ＡＡＡ ＡＧＡ ＡＡＧ ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＧＡ ＧＧＴ Ｇ（配列番号８６）。
【０４４８】
ＰＣＲ反応を、ヒト精巣、胎児脳、乳房、骨格筋由来のｃＤＮＡの等量の部分からなる５ｎｇのｃＤＮＡテンプレート、ならびに各々１μＭの３７２６３９２ Ｆ−正方向プライマーおよび３７２６３９２ Ｆ−逆方向プライマーを使用して設計した。他の条件および工程は、実施例３において記載されたものと同じであった。
【０４４９】
約４００ｂｐの増幅産物を、アガロースゲル電気泳動により検出した。この産物を単離し、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、そしてＢＩｇＨｉｓバキュロウイルス発現ベクター（以下の実施例９を参照のこと）に連結した。クローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を、１３７アミノ酸長ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームとして決定した。この構築物を、ＢＩｇＨｉｓ−ｃｇ３７２６３９２−＃２と名付けた。この構築物のヌクレオチド配列は、配列番号３５のコード配列と同一であることが見出された。
【０４５０】
（実施例９．発現ベクターｐＢＩｇＨｉｓの構築）
ｐＢＩｇＨｉｓと名付けられた発現ベクターを、ＮＯＶＸ核酸配列を発現するために構築した。ｐＢＩｇＨｉｓ発現ベクターを構築するために、オリゴヌクレオチドプライマーを、ヒト免疫グロブリン重鎖のＦｃフラグメントを増幅するように設計した。正方向プライマーは、
５’−ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＧＡ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＴＣ ＴＴＧ ＴＧＡ ＣＡＡ Ａ（配列番号８７）
であり、そして逆方向プライマーは、
５’−ＧＣＴ ＣＴＡ ＧＡＣ ＴＴＴ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＧ ＡＣＡ ＧＧＧ ＡＧ（配列番号８８）
であった。
【０４５１】
ＰＣＲを、２５μｌのＭｉｘ１（７５ｐモルのプライマー、４μｇの成体精巣ｃＤＮＡ、５μモルのｄＮＴＰ）および２５μｌのＭｉｘ２（１ユニットのＦｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｘｐａｎｄポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、５μｌの１０×Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｅｘｐａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ）を別々に９６℃で２０秒間加熱することによって開始した。次いで、Ｍｉｘ１およびＭｉｘ２をプールし、以下のＰＣＲサイクルパラメーターを使用した：９６℃、３分間（１サイクル）；９６℃、３０秒間、５５℃、１分間、６８℃、２分間（１０サイクル）；９６℃、３０秒間、６０℃、１分間、６８℃、２分間（２０サイクル）；７２℃、７分間（１サイクル）。ＰＣＲの後、約０．７５ｋｂの単一のＤＮＡフラグメントが得られた。このＤＮＡフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩの制限酵素で消化し、そしてｐＣＤＮＡ３．１Ｖ５Ｈｉｓ（Ｂ）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。このベクターはｐＣＤＮＡ３．１ Ｉｇと名付けられ、そしてＶ５エピトープおよび６×Ｈｉｓタグに融合されたＦｃフラグメントを含む。次の段階では、組換えＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、ＦｃフラグメントのＮ末端に導入した。
最初に、２つのオリゴヌクレオチド：
５’−ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＣＡ ＧＣＧ ＡＡＡ ＡＣＣ ＴＧＴ ＡＴＴ ＴＴＣ ＡＧＧ ＧＴ（配列番号８９）および
５’−ＴＣＧ ＡＡＣ ＣＣＴ ＧＡＡ ＡＡＴ ＡＣＡ ＧＧＴ ＴＴＴ ＣＧＣ ＴＧＣ ＡＧ（配列番号９０）
を設計した。
【０４５２】
これらの２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、そして２０％ポリアクリルアミドゲルを使用して精製し、そしてＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１Ｉｇに連結した。次いで、得られるプラスミドをＰｓｔＩおよびＰｍｅＩで切断して、約０．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを遊離させた。このＤＮＡフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＳｍａＩで消化したｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。得られたプラスミド構築物を、ｐＢＩｇＨｉｓと名付けた。Ｆｃフラグメントを、配列分析によって確認した。
【０４５３】
（実施例１０．哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃの構築）
ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃと名付けられた発現ベクターを、哺乳動物細胞中でＮＯＶＸ核酸配列を発現するために構築した。
【０４５４】
ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃを構築するために、オリゴヌクレオチドプライマー：
ｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ正方向：ＣＴＣ ＧＴＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＧＴ ＡＡＧ ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＣＴ ＡＡＣ（配列番号９１）および
ｐＳｅｃ−Ｖ５−Ｈｉｓ逆方向：ＣＴＣ ＧＴＣ ＧＧＧ ＣＣＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＧＣ ＧＧＧ ＴＴＴ ＡＡＡ Ｃ（配列番号９２）
を、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５Ｈｉｓ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からフラグメントを増幅するために設計した。ＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩおよびＡｐａＩで消化し、そしてＸｈｏＩ／ＡｐａＩ消化したｐＳｅｃＴａｇ Ｂベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。得られたベクター、ｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓの正確な構造を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。ベクターｐＳｅｃＶ５Ｈｉｓを、ＰｍｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、そしてＰｍｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを、ＢａｍＨＩ／ＫｌｅｎｏｗおよびＮｈｅＩで処理したベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結した。得られたベクターを、ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ発現ベクターと名付けた。このベクターは、Ｉｇκ鎖シグナルペプチドに任意のタンパク質を融合することによって、異種タンパク質の発現および分泌を可能にする。発現したタンパク質の検出および精製は、Ｃ末端におけるＶ５エピトープタグおよび６×Ｈｉｓタグの存在によって補助される（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
【０４５５】
（実施例１１．ヒト胎児性腎臓２９３細胞におけるＮＯＶ５の発現）
ＮＯＶ５配列を含むＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１−３２１１１０１−Ｓ２１９−３Ｃ（実施例４に記載されている）から単離し、そしてベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃにサブクローニングして、発現ベクターｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３２１１１０１を生成した。ｐＣＥＰ４／Ｓｅｃ−３２１１１０１ベクターを、製造業者（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ／Ｌｅｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬を使用して、２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に細胞ペレットおよび上清を収集し、そして抗Ｖ５抗体を用いるウェスタンブロッティング（還元条件）によってｈＮＯＶ５発現について試験した。図１は、ＮＯＶ５が２９３細胞によって分泌される３０ｋＤａおよび２０ｋＤａのタンパク質として発現されることを示す。これらのタンパク質は、グリコシル化の程度がより高いものおよびより低いものである、予測されるポリペプチド産物を表すようである。
【０４５６】
（実施例１２．Ｅ．ｃｏｌｉによるＮＯＶ５の発現および分泌）
ベクターｐＢＡＤｇＩＩＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩの制限酵素で消化した。ＮＯＶ５配列を含むこのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ｐＣＲ２．１−３２１１１０１−Ｓ２１９−３Ｃから単離し、そしてベクターｐＢＡＤｇＩＩＩにサブクローニングして、発現ベクターｐＢＡＤｇＩＩＩ−３２１１１０１を生成した。得られたベクターを制限分析および配列決定によって確認し、そしてｐＢＡＤｇＩＩＩ−３２１１１０１と名付けた。このベクター中で、ｈＮＯＶ５は、そのＣ末端で６×Ｈｉｓタグに融合していた。次いで、プラスミドｐＢＡＤｇＩＩＩ−３２１１１０１をＥ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３、ｐＬｙｓ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に形質転換し、そしてタンパク質ＮＯＶ５の発現誘導を、製造業者の指示書に従って実行した。誘導後、細胞全体を収集し、そしてタンパク質を、抗ＨｉｓＧｌｙ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用するウェスタンブロッティングによって分析した。図２は、ｈＮＯＶ５がＥ．ｃｏｌｉ細胞によって分泌される１６ｋＤａタンパク質として発現されたことを示す。この見かけの分子量は、配列番号１０のアミノ酸配列によって予測されたポリペプチドのサイズと一致している。
【０４５７】
（実施例１３．ヒト胎児腎臓２９３細胞におけるＮＯＶ６の発現）
製造業者（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の指示書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＰｌｕｓ試薬を使用して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ−３２１８７１５ベクター（実施例５を参照のこと）を２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション７２時間後に細胞ペレットおよび上清を収集し、そして抗Ｖ５抗体を用いるウェスタンブロッティング（還元条件）によってｈＮＯＶ６発現について試験した。図３は、ｈＮＯＶ６が２９３細胞において６０ｋＤａのタンパク質として発現されることを示す。この見かけの分子量は、ＮＯＶ６ポリペプチドのグリコシル化形態に対応すると考えられる。発現されたタンパク質は、細胞上清においては検出されなかった。
【０４５８】
（等価物）
本発明の特定の実施形態に関する前述の詳細な説明から、核酸、ポリペプチド、抗体、検出、および処置を含む、特定の新規な組成物および方法が記載されたことは、明らかであるはずである。これらの特定の実施形態が、本明細書中で詳細に開示されたが、これは例示目的のためのみに例としてなされ、そして上記の添付した特許請求の範囲に関して制限することを意図されない。特に、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者にとって慣用的に本発明に対してなされ得ることは、本発明者らによって意図される。実際に、本明細書中に開示したものに加えて本発明の種々の改変が、前述の詳細な説明および添付の図面によって当業者には明らかとなる。このような改変は、添付の特許請求の範囲に収まることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒト胎児腎臓２９３細胞による分泌ＮＯＶ５タンパク質の発現を示す。
【図２】
図２は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞による分泌ＮＯＶ５タンパク質の発現を示す。
【図３】
図３は、ヒト胎児腎臓２９３細胞におけるＮＯＶ６タンパク質の発現を示す。

Claims (38)

  1. 単離されたポリペプチドであって、以下：
    ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
    ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体；
    ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列；および
    ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該アミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の天然に存在する対立遺伝子改変体のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  3. 請求項２に記載のポリペプチドであって、前記対立遺伝子改変体が、配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群より選択される核酸配列と単一のヌクレオチドで異なる核酸配列の翻訳産物であるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
  4. 前記改変体のアミノ酸配列が、保存的アミノ酸置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 単離された核酸分子であって、該核酸分子が、以下：
    ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態；
    ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の成熟形態の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該成熟形態のアミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体；
    ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列の改変体であって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該アミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、改変体；
    ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは該ポリペプチドの改変体の少なくとも一部をコードする核酸フラグメントであって、ここで、該改変体中の１以上のアミノ酸残基が、該成熟形態のアミノ酸配列と異なり、ただし、該改変体が、該アミノ酸配列の１５％未満のアミノ酸残基で異なる、核酸フラグメント；および
    ｆ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）またはｅ）の相補体を含む核酸分子
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸分子。
  6. 天然に存在する対立遺伝子核酸改変体のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
  7. 天然に存在するポリペプチド改変体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項５に記載の核酸分子。
  8. 配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群より選択される核酸配列と単一のヌクレオチドで異なる、請求項５に記載の核酸分子。
  9. 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が以下：
    ａ）配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群より選択されるヌクレオチド配列；
    ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群より選択されるヌクレオチド配列と１以上のヌクレオチドで異なるヌクレオチド配列であって、ただし、２０％未満のヌクレオチドが、該ヌクレオチド配列と異なる、ヌクレオチド配列；
    ｃ）ａ）の核酸フラグメント；および
    ｄ）ｂ）の核酸フラグメント
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  10. 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、配列番号１、３、５、７、９、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および４５からなる群より選択されるヌクレオチド配列または該ヌクレオチド配列の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子。
  11. 請求項５に記載の核酸分子であって、ここで、該核酸分子が、以下：
    ａ）第１のヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列をコードするコード配列と１以上のヌクレオチド配列で異なるコード配列を含み、ただし、該第１のヌクレオチド配列のコード配列中の２０％未満のヌクレオチドが、該コード配列と異なる、第１のヌクレオチド配列；
    ｂ）該第１のポリヌクレオチドの相補体である、単離された第２のポリヌクレオチド；および
    ｃ）ａ）またはｂ）の核酸フラグメント
    からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  12. 請求項１１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  13. 前記核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項１２に記載のベクター。
  14. 請求項１２に記載のベクターを含む、細胞。
  15. 請求項１に記載のポリペプチドに免疫特異的に結合する、抗体。
  16. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗体。
  17. 前記抗体がヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
  18. サンプル中の請求項１に記載のポリペプチドの存在または量を測定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該サンプルを提供する工程；
    （ｂ）該サンプルに、該ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を接触させる工程；および
    （ｃ）該ポリペプチドに結合する抗体の存在または量を測定して、それによって該サンプル中のポリペプチドの存在または量を測定する工程
    を包含する、方法。
  19. サンプル中の請求項５に記載の核酸分子の存在または量を測定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該サンプルを提供する工程；
    （ｂ）該サンプルに、該核酸分子に結合するプローブを接触させる工程；および
    （ｃ）該核酸分子に結合する該プローブの存在または量を測定して、それによって該サンプル中の該核酸分子の存在または量を測定する工程
    を包含する、方法。
  20. 請求項１に記載のポリペプチドに結合する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該ポリペプチドに、該因子を接触させる工程；および
    （ｂ）該因子が該ポリペプチドに結合するか否かを決定する工程
    を包含する、方法。
  21. 請求項１に記載のポリペプチドの発現または活性を調節する因子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該ポリペプチドを発現する細胞を提供する工程
    （ｂ）該細胞に該因子を接触させる工程、および
    （ｃ）該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節するか否かを決定する工程であって、これによって、該ペプチドの発現または活性における変化が、該因子が該ポリペプチドの発現または活性を調節することを示す、工程
    を包含する、方法。
  22. 請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節するための方法であって、該方法は、請求項１に記載のポリペプチドを発現する細胞サンプルに、該ポリペプチドの活性を調節するのに十分な量の、該ポリペプチドに結合する化合物を接触させる工程を包含する、方法。
  23. ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量の、請求項１に記載のポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
  24. 前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
  25. ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量の、請求項５に記載の核酸を投与する工程を包含する、方法。
  26. 前記被験体がヒトである、請求項２５に記載の方法。
  27. ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防する方法であって、該方法は、このような処置または予防が所望される被験体に、該被験体における該ＮＯＶＸ関連障害を処置または予防するのに十分な量の、請求項１５に記載の抗体を投与する工程を包含する、方法。
  28. 前記被験体がヒトである、請求項２７に記載の方法。
  29. 請求項１に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  30. 請求項５に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  31. 請求項１５に記載の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、薬学的組成物。
  32. 請求項２９に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
  33. 請求項３０に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
  34. 請求項３１に記載の薬学的組成物を１つ以上の容器に含む、キット。
  35. 第１の哺乳動物被験体における請求項１に記載のポリペプチドのレベルの変化に関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプルにおける該ポリペプチドの発現のレベルを測定する工程；および
    ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該ポリペプチドの量を、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程であって、該第２の哺乳動物被験体は、該疾患を有さないかまたは該疾患に対する素因を有さないことが既知である、工程
    を包含し、
    ここで、該コントロールサンプルと比較した該第１の被験体における該ポリペプチドの発現レベルの変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、方法。
  36. 第１の哺乳動物被験体における請求項５に記載の核酸のレベルの変化に関連する疾患の存在または該疾患に対する素因を決定するための方法であって、該方法は、以下：
    ａ）該第１の哺乳動物被験体由来のサンプルにおける該核酸の量を測定する工程；および
    ｂ）工程（ａ）のサンプル中の該核酸の量を、第２の哺乳動物被験体由来のコントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程であって、該第２の哺乳動物被験体は、該疾患を有さないかまたは該疾患に対する素因を有さないことが既知である、工程
    を包含し、
    ここで、該コントロールサンプルと比較した該第１の被験体における該核酸のレベルの変化が、該疾患の存在または該疾患に対する素因を示す、
    方法。
  37. 哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分である量のポリペプチドを該哺乳動物に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４および４６のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドに、少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、方法。
  38. 哺乳動物における病理学的状態を処置する方法であって、該方法は、該病理学的状態を緩和するのに十分な量の請求項１５に記載の抗体を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
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