JP2004525858A - 脳への非侵襲性遺伝子ターゲッティング - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
1.発明の属する技術分野
本発明は一般に脳への遺伝子治療薬の送達に関する。より具体的には、本発明は脳への遺伝子の非侵襲性送達に有用な製剤を提供するためのリポソーム技術、血液脳関門(BBB)受容体技術、ペギレーション(pegylation)技術、および治療用遺伝子技術の組み合わせに関する。
【0002】
2.関連技術の説明
本発明の背景を説明するため、およびその実施に関する付加的な詳細を提供するために本明細書で引用される出版物および他の参考文献は本明細書に参照として引用する。便宜上、参考文献に番号を付けて表し、末尾の参考文献一覧に分類した。
【0003】
脳に外因性に投与された遺伝子の発現は、以前はウイルスベクターまたはカチオンリポソームのいずれかによりin vivoで達成されてきた(1〜4)。しかし、いずれの場合も侵襲性の高い投与経路が要求される。ウイルスまたはカチオンリポソームのいずれもin vivoで血液脳関門(BBB)を形成する脳毛細血管壁を横切ることができないため、そのような侵襲性の技術が必要とされる。BBBの存在が、開頭術による脳内投与(1)か、またはBBB破壊および一過性BBBの開口を起こす有害物質の頸動脈内注入(4)のいずれかによる外因性遺伝子の投与を余儀なくさせている。
【0004】
脳のヒト遺伝子治療はおそらく遺伝子治療薬の反復した投与を必要とするであろう。したがって、単純な静脈内投与と同じ程度に侵襲性でない経路により遺伝子を投与することは好都合であろう。この方法により、遺伝子治療薬は内因性BBB輸送系を通して当該遺伝子治療薬を脳に向かわせることで、BBBを横切って送達される(5)。キャリア媒介輸送(CMT)系がBBBを横切る栄養素の輸送のために存在する(5)。同様に、受容体媒介トランスサイトーシス(RMT)系が、インスリン、トランスフェリン、またはインスリン様成長因子のような循環ペプチドをBBBを横切って輸送するために作動する(5)。これらの内因性ペプチドはBBBを横切って薬物を輸送するための“輸送ペプチド”または“分子のトロイの木馬” として作用することができる。キメラペプチド技術と呼ばれるこの方法では、ふつうはBBBを横切って輸送されない薬物が“輸送可能なペプチド”に結合し、そして薬物/輸送可能なペプチドの結合物がBBBを通ってRMTを受ける(米国特許第4,801,575号)。
【0005】
以前の研究では、トランスフェリン受容体(TfR)またはインスリン受容体のようなBBB内の内因性輸送系に結合するペプチドミメティックモノクローナル抗体(MAb)が、in vivoでBBBを通って神経ペプチドまたはアンチセンス物質を標的へ向かわせるために使用された(5)。同じ受容体に結合する内因性ペプチドの作用を模倣する、ある種受容体結合MAbsの能力は文献(35〜37)で既知である。さらに、これらの受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に薬物を輸送する抗TfR MAbsのような、ペプチドミメティックMAbsの能力もよく知られている(38)。
【0006】
治療用遺伝子の脳における発現は、血液中に注射される遺伝子製剤がRMTによりBBBを横切るだけでなく、受容体媒介エンドサイトーシス(RME)により脳細胞膜(BCM)を横切って脳の標的細胞中に入ることを必要とする。さらに、非侵襲的に脳に遺伝子治療薬を向かわせるための内因性BBB輸送系の使用には、血流中で安定な遺伝子治療薬の適切な製剤の開発も必要である。カチオンリポソーム/DNA複合体は、in vivo遺伝子発現に使用されてきたが、これらの製剤は生理食塩水中で甚だしく凝集する(6〜11)。カチオン性リポソーム/DNA複合体の静脈内投与後のこの凝集は、肺において選択的に遺伝子が発現され、末梢組織ではほとんど発現が見られず(12〜14)、そして脳では全く発現が見られないという結果に終わる(12)。DNAプラスミドはカチオンポリリシンブリッジによりペプチドミメティックMAbに結合することが可能である(15〜17)。しかし、DNAとポリカチオン間の静電相互作用は血液中で安定ではないかもしれず、ヒストンまたはポリリシンのような高度にポリカチオン性の蛋白質はBBBに毒作用を及ぼし、in vivoでの広範なBBBの透過性変化を引き起こすおそれがある(18)。
【0007】
発明の概要
本発明によれば、治療用遺伝子は血液脳関門を横切って、脳に非侵襲的に導入される。いったん脳の内部にはいると、治療用遺伝子は脳疾患の診断および治療に有用な治療薬を発現する。本発明は血液脳関門を横切って治療用遺伝子を送達することができるリポソームの使用に基づく。
【0008】
本発明のリポソームは、外表面と治療用遺伝子が含まれる内部コンパートメントを有する中性リポソームを含む。リポソームの表面は数千のポリエチレングリコール(PEG)鎖により修飾され、この工程は“ペギレーション(pegylation)”と呼ばれる。PEG鎖はリポソームの表面を“有毛”にし、これが非保護状態ではリポソームの血液からの迅速な除去を加速する、リポソーム表面への血液蛋白質の速やかな吸収を妨げる。対照的に、ペギル化(pegylated)リポソームは保護され、ずっと遅い速度で血液から除去される。PEG鎖はまた、ペギル化リポソームの表面への“輸送可能なペプチド”の連結のための“結合物質”として作用し、in vivoでBBBを通る複合体のRMT、およびBCMを通過するRMEを引き起こすものである。治療用遺伝子には、治療薬をコードするために十分な量の遺伝子が含まれる。複数の血液脳関門ターゲッティング物質は結合物質を介してリポソーム表面に連結する。イムノリポソームターゲッティングベヒクル内にある治療用遺伝子は血液脳関門を横切って輸送され、脳の間質腔に放出される。いったんそこに到達すると、“ペギル化リポソーム”は受容体媒介エンドサイトーシスをうけ、脳の標的細胞中に送達される、なぜなら、リポソーム表面は脳細胞膜(BCM)上にある受容体を認識する“輸送可能なペプチド”により修飾されているからである。BBBおよびBCM上には共にインスリンまたはトランスフェリン受容体が存在するため、“輸送可能なペプチド”は脳の2つの障壁、BBBおよびBCMの両方を横切る輸送を触媒する。いったん標的脳細胞の内部にはいると、リポソーム複合体は脳細胞エンドソーム内に捕捉され、次いで脳細胞の細胞質中に遺伝子治療薬を放出することで、それが核内に入ることができ、治療薬が発現することになる。
【0009】
本発明によれば、ポリエチレングリコールがリポソームの表面に結合したリポソームの使用が、イムノリポソームの内部に取り込まれたDNAの血漿バイオアベイラビリティーの増加になることが見出された。イムノリポソームの内部にあるDNAの安定性がin vivoでの使用中増大することも見出された。さらに、脳において外因性遺伝子が発現されることに加え、同時に、血液脳関門ターゲッティング物質により標的にされる受容体を高レベルで含む、または発現する他の器官において遺伝子を発現させることも可能である。
【0010】
本発明の先に記載された、そして多くの他の態様および付随する利点は、添付された図面と一緒に以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【0011】
発明の詳細な説明
本発明のイムノリポソームは、血液脳関門を横切って治療用遺伝子を送達し、続いてその遺伝子によりコードされる治療薬が脳で発現されるように設計される。リポソームはナノコンテナーの形状であり、ナノ粒子またはリポソームのようなナノコンテナーは一般に薬物の封入のために使用される。リポソームは好ましくは200ナノメーター以下の直径を有する。50から150ナノメーター間の直径を有するリポソームが好ましい。約80ナノメーターの外部直径を有するリポソームまたは他のナノコンテナーがとりわけ好ましい。適切なリポソームの型は、1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロール−3−ホスホコリン(POPC)、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)、またはコレステロールのような中性リン脂質、およびリポソーム内のアニオンDNAを安定させるための少量(1%)のジドデシルジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)のようなカチオン脂質から作られる。
【0012】
リポソーム内に封入される治療用遺伝子は、治療および診断薬を発現するために使用される一般の治療用遺伝子のいずれであってもよい。代表的な治療用遺伝子には、神経変性疾患、脳卒中、または脳外傷の治療のための脳由来神経栄養因子(BDNF);パーキンソン病のためのチロシンヒドロキシラーゼおよび/または芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ;β−グルクロニダーゼ;ヘキソサミニダーゼA;脳腫瘍の治療のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたは上皮成長因子受容体に対するアンチセンスRNAをコードする遺伝子;黒内障性白痴および他のリソソーム貯蔵障害のためのリソソーム貯蔵障害置換酵素;後天性免疫不全症候群(AIDS)の脳成分治療のためのアンチセンスRNAをコードする遺伝子が挙げられる。治療用遺伝子に加えて、プラスミドDNAはまた治療配列の前または後どちらにでもDNA配列を含んでもよく、プラスミドのこれらの付加的な部分は脳の特定の細胞においてプラスミドの組織特異的転写を促進してもよく、治療用遺伝子のmRNAの増大された翻訳および/または安定化を促進してもよく、そして脳細胞においてトランスジーンのエピゾーム複製を可能にしてもよい。一般に、治療用遺伝子は少なくとも100ヌクレオチドを含むか、または30,000ダルトンより大きい分子量を有する。治療用遺伝子は、リポソームまたはナノコンテナーの内部コンパートメント内に封入するための、プラスミドまたは他の適切なキャリア内に含まれることが好ましい。
【0013】
治療用遺伝子は既知の薬物封入工程のいずれかに従ってリポソーム内に封入されてもよい。たとえば、超音波処理、凍結/解凍、およびメンブランフィルタによるエクストルージョン。
【0014】
リポソーム内に封入される治療用遺伝子の数は、治療される疾患に依存して1から多数まで変化してもよい。その数を制限する要因はリポソーム内に封入される治療用遺伝子の直径であろう。ヒストン、プロタミン、またはポリリシンのようなポリカチオン蛋白質を使用して、数千ヌクレオチドを含むプラスミドDNAのサイズを10〜30nmの直径を有する構造に圧縮することが可能である。直径100nmのリポソームの容積は、10nmおよび30nmのDNA圧縮球体の容積よりそれぞれ1000倍および35倍大きい。したがって、リポソーム内に同じ遺伝子の多くのコピー、または複数遺伝子の複数コピーを封入することが可能である。
【0015】
封入された治療用遺伝子の血液脳関門を横切る輸送を提供するために、種々の血液脳関門ターゲッティング物質がリポソーム表面に結合される。適切なターゲッティング物質としては、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、またはレプチンが含まれる、なぜなら、これらのペプチドはすべてBBB内、およびBCM上にも存在する内因性RMT系を有し、そしてこれらの内因性ペプチドは“輸送可能なペプチド”として使用できるからである。あるいは、リポソーム表面は内因性BBB受容体を標的にする1ペプチド、および内因性BCMペプチドを標的にする他のペプチドの、2種の異なる“輸送可能なペプチド”と結合することができる。後者はニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞、平滑筋細胞、またはミクログリアのような脳内の特定の細胞に特異的であってもよい。ターゲッティングペプチドは受容体の内因性ペプチドリガンド、内因性リガンドの類似体、または内因性リガンドと同じ受容体に結合するペプチドミメティックMAbsであってもよい。BBB“輸送可能なペプチド”としてのトランスフェリン受容体(TfR)−特異的ペプチドミメティックモノクローナル抗体の使用は、米国特許第5,154,924号;第5,182,107号;第5,527,527号;第5,672,683号;第5,833,988号;および第5,977,307号に詳細に記載される。BBB“輸送可能なペプチド”としてのヒトインスリン受容体(HIR)に対するMAbの使用が記載されている(33)。
【0016】
リポソーム表面に血液脳関門ターゲッティング物質を結合するために使用される結合物質はスフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール(PEG)または他の有機ポリマーのような既知のポリマー性結合物質のいずれであってもよい。PEGはとりわけ好ましい結合物質である。結合物質の分子量は好ましくは1000から50,000DAの間にある。とりわけ好ましい結合物質は一端に脂質そして、他の端にマレイミド基を有する二官能性2000DAのPEGである。PEGの脂質末端はリポソーム表面に結合し、マレイミド基は受容体特異的モノクローナル抗体または他の血液脳関門ターゲッティングベヒクルに結合する。5から1000までのターゲッティングベヒクルがおのおののリポソームに結合することが好ましい。約25〜40のターゲッティングベヒクルが結合したリポソームがとりわけ好ましい。
【0017】
リポソーム、結合物質およびターゲッティング物質の代表的な組み合わせは以下のとおりである:
輸送可能なペプチド、たとえばインスリンまたはHIRMAbがチオール化され、PEG鎖の小画分先端上のマレイミド基に結合するか;または、たとえばトランスフェリンもしくはTfRMAbのような輸送可能なペプチド上の表面カルボキシル基がPEG鎖の先端上のヒドラジド(Hz)部分に、N−メチル−N′−3(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDAC)のようなカルボキシル活性化基により結合する;輸送可能なペプチドがチオール化され、ジスルフィドリンカーにより、N−スクシンイミジル3−(2−ピリジルチオ)プロピオネート(SPDP)と反応させたリポソームに結合するか;または輸送可能なペプチドがアビジン−ビオチン技術によりリポソーム表面に結合する、たとえば輸送可能なペプチドがモノビオチン化され、PEG鎖の表面に連結したアビジンまたはストレプトアビジン(SA)に結合する。
【0018】
本発明は好ましいナノコンテナーとしてリポソームを使用することを記載してきたが、当業者は他のナノコンテナーを使用してもよいことを認識するであろう。たとえばリポソームは、DNAを封入し、製剤がまだ血中にあるか、または血液から標的細胞の細胞内コンパートメントへの輸送中に核酸をヌクレアーゼから保護することができる直径<200nmのナノ粒子または任意の他の分子ナノコンテナーと交換することができる。またPEG鎖は、リポソームまたはナノコンテナーの表面に連結して、“輸送可能なペプチド”結合用の、および血液から製剤の除去を遅延させ、血漿薬物動力学を最適化するための足場を提供するという二重の役割を果たす、スフィンゴミエリンのような多くの他のポリマーと交換してもよい。さらに、本発明は特異的な標的受容体を有する任意の細胞群または器官に遺伝子を送達することを意図する。図4に示すように、本特許出願は肝臓、肺および脾臓のような器官に遺伝子を送達するために使用してもよい。
【0019】
本発明のイムノリポソームは静脈内投与のための任意の適切な薬剤的キャリアと併用してもよい。イムノリポソームの静脈内投与は、侵襲性が最も少ないため、好ましい経路である。所望するならば、他の投与経路も可能である。適切な薬剤的に受容できるキャリアには、生理食塩水、Trisバッファー、リン酸バッファー、または他の任意の水溶液が挙げられる。
【0020】
イムノリポソームの治療的有効量は、治療される個体および投与される特定の遺伝子に依存して、広く変化するであろう。適切な量は当業者に既知の方法により証明されるであろう。
【0021】
実施例
本発明の以下の実施例は外因性プラスミドDNAについて記載し、ここでSV40プロモータにより駆動されるβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ発現プラスミドは、PEG2000と呼ばれる分子量2000ダルトンのPEGによりペギル化された中性リポソームの内部に組み込んだ。リポソーム当たり約40のPEG鎖が、ラットトランスフェリン受容体に対するOX26マウスMAbと結合する。OX26MAb、またはトランスフェリンはin vivoで受容体媒介トランスサイトーシスを受けて、BBBを通過する。OX26のようなペプチドミメティックMAbの性質は、BBBTfRを介した脳への輸送を引き起こすことにより、ペギル化イムノリポソームの脳ターゲッティングを可能にする。
【0022】
材料。POPC(1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロール−3−ホスホコリン)およびDDAB(ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド)はAvanti Polar Lipids Inc.(Alabaster、AL)から購入した。DSPE(ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン)−PEG2000−マレイミドはShearwater Polymersに特注した。〔α−32P〕dCTP(800Ci/mmol)はNEN Research Products(Boston、MA)から購入した。125NaIおよびN−スクシンイミジル−〔2,3−3〕プロピオネート(3H−NSP)はAmersham LIFE SCIENCE(Arlington Height、IL)から購入した。ニックトランスレーションシステムはGIBCO BRL(Fredrick、MD)から購入した。比活性2000Kunitz units/mgの膵臓DnアーゼI(ウシ膵臓由来)はSigma Chemicals(St.Louis、MO)から購入した。ルシフェラーゼ試薬、組換えルシフェラーゼ、6.8kb pSV−β−ガラクトシダーゼプラスミド、およびエキソヌクレアーゼIIIはPromega(Madison、WI)から得た。プロテインGセファロースCL−4BはPharmacia BioTech Inc.(Piscataway、NJ)から購入した。マウス骨髄腫腹水IgG2a(κ)はCappel(Westchester、CA)から購入した。Centriprep−30(分子量カットオフ:30,000)濃縮装置はAmicon(Beverly、MA)から得た。雄Sprague Dawleyラット(体重200〜250g)はHarlan(Indianapolis、IN)から得た。
【0023】
プラスミド産生。 共にSV40プロモータの影響下にある、ホタル、ホチヌス ピラリス(Photinus pyralis)ルシフェラーゼ遺伝子をコードする5.8kbプラスミドのpGL2、または6.8kb pSV−β−ガラクトシダーゼプラスミドはPromegaから得た。プラスミドは大腸菌JM109株で増幅した。DNAはアルカリ分解法を使用して抽出し、QIAfilter Plasmid kit(QIAGEN、Valencia、CA)を使用して、イソプロパノールによる沈殿により精製した。DNAは260nmでのUV吸収により測定し、TEバッファーに溶解した。BamHIによる消化により、線状DNAが得られた。そのサイズは0.8%アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色により確認した。
【0024】
DNA放射標識。 超らせんDNAは、DNAポリメラーゼIおよびDnase Iを使用して、ニックトランスレーション法(Nick Translation System、Promega)により〔α−32P〕dCTPで標識した。取り込まれなかったヌクレオチドはG25 Sephadexカラム(Boehringer Mannheim、IN)により除去した。標識されたプローブの比活性は5x106cpm/μgである。
【0025】
線状プラスミドはT4ポリメラーゼにより5′および3′末端を共に32Pで放射標識し、Sephadex G−25スピンカラムにより98%トリクロロ酢酸沈降能に精製した。この物質は0.8%アガロースゲル電気泳動およびフィルムオートラジオグラフィーにより分析し、5.8kbの単一バンドとして移動し、放射標識された低分子量の不純物は見られなかった。
【0026】
32P−線状プラスミドは薬物動力学実験に使用された。32P−超らせんプラスミドはリポソームへの非標識超らせんプラスミドの取り込みを測定するためにトレーサとして使用された。
【0027】
ペギル化リポソーム合成およびプラスミドDNA封入。
POPC(19.2μmol)、DDAB(0.2μmol)、DSPE−PEG2000(0.6μmol)、およびDSPE−PEG2000−マレイミド(30nmol)はクロロホルム/メタノール(2:1,vol:vol)に溶解し、つづいて留去した。脂質は1ml 0.05MTris−Clバッファー(pH=8)に分散し、10分間超音波処理した(20)。超らせんDNA(100μg)および1μCi 32P−DNAを脂質に添加した。リポソーム/DNA分散液は留去して、容積100μl、最終濃度200mMにした。分散液はエタノール/ドライアイスで4〜5分間凍結して40℃で1〜2分間解凍し、そしてこの凍結−解凍サイクルを10回繰り返した。リポソーム分散液は脂質濃度40mMに希釈し、続いて先に記載(19)の、手動のエクストルーダ(Avestin、Ottawa、Canada)を使用して、それぞれ2枚重ねの400nm、200nm、100nm、および50nmポアサイズポリカーボネート膜をとおして10回エクストルージョンした。平均粒子径は、先に記載(19)のMicrotrac Ultrafine Particle Analyzer(Leeds−Northrup、St.Petersburg、FL)を使用して、準弾性光散乱(quasielastic light scattering)により測定した。
【0028】
リポソームの外側に吸着したプラスミドはヌクレアーゼ消化により除去された(20)。非封入DNAを消化するために、エクストルージョン後、5Uの膵臓エンドヌクレアーゼIおよび5UのエキソヌクレアーゼIIIを5mM MgCl2および0.1mM DTT中のリポソーム/DNA混合物に添加した。37℃で1時間インキュベーション後、反応は7mM EDTAを添加することにより停止した。ヌクレアーゼ消化が外側のプラスミドDNAを除去した程度は、ヌクレアーゼ処理前後に採取したアリコートのアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により測定した。
【0029】
ペギル化リポソーム/DNAへのOX26 MAbまたはマウスIgG2aの結合。 抗−ラットトランスフェリン受容体OX26MAbは記載(21)のように無血清OX26ハイブリドーマならし培地から得た。OX26およびアイソタイプ対照のマウスIgG2aはプロテインG Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーにより精製した(21)。OX26は先に記載のように、3H−NSPにより放射標識した(22)。3H−OX26は比活性 0.13μCiおよびTCA沈降能 95%であった。
【0030】
OX26またはマウスIgG2a(1.5mg、10nmol)は先に記載(19)のように40:1モル過剰の2−イミノチオラン〔トラウト(Traut)の試薬〕を使用してチオール化した。リポソーム当たりの結合したOX26分子の数は、先に記載(19)のように、リポソーム当たり100,000の脂質分子が存在すると仮定して、リポソームプール中の総OX26cpmおよび標識されたOX26MAbの比活性から計算した。リポソーム製剤中の100μg pGL2の最終捕捉%は32P放射活性から計算し、典型的には30%または30μg プラスミドDNAであった。次にこれをルシフェラーゼ遺伝子発現測定のために、3匹のラットに1匹あたりプラスミドDNA10μgづつを投与した。
【0031】
薬物動力学。 薬物動力学的研究は先に記載(19)のように、ケタミン/キシラジンで麻酔した雄Sprague Dawleyラットで行った。以下の製剤3種のうち1種とした32P−pGL2(1μCi)をラットに注入した:(a)裸のDNA、(b)抗体が連結していない、ペギル化リポソームに封入されたDNA、または(c)PEG鎖に結合したOX26MAbを持つペギル化リポソームに封入されたDNA。
【0032】
in vivoでのルシフェラーゼ遺伝子発現。 OX26MAbまたはマウスIgG2aのいずれかと結合したペギル化リポソーム/ルシフェラーゼDNAを、麻酔したラットに、ラット毎にpGL2 DNA10μgの投与量で静脈内注射した。ラットは注射後24,48または72時間で屠殺した。脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓および肺組織は、0.1M リン酸カリウムバッファー、pH7.8,1%TritonX−100,1mM ジチオスレイトールおよび2mM EDTAを含む4倍容積の溶解バッファー中で、Polytronホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ホモジネートは14,000rpm、10分間、4℃で遠心分離した。上清はLuminometer(Biolumat LB 9507,Berthold、Nashua、NH)による組織ルシフェラーゼ活性の測定に使用した;100μlの再構成ルシフェラーゼ基質を組織抽出物20μlに添加した。先に記載(23)のように、ピーク発光は20℃で10秒間測定し、相対光単位(RLU)として記録した。バックグラウンドレベルは溶解バッファーのみを含む試料を測定することにより決定した。組織抽出物の蛋白質濃度は、ビシンコニン酸(BCA)蛋白質アッセイ試薬(Pierce、Rockford,IL)により決定した。
【0033】
in vivoでのβ−ガラクトシド遺伝子発現。 ペギル化イムノリポソーム/β−ガラクトシダーゼDNAは、OX26MAbに関して先に記載した方法と同様に製造し、先に記載のように0.25kgの成体ラットにつき50μg プラスミドDNAの投与量をラットに静脈内注射した。48時間後,脳および肝臓を取り出し、粉状ドライアイス中で速やかに凍結し、Tissue−Tek OCT包埋剤に浸し、15ミクロン凍結切片をBright cryostat上で作製した。製造業者の説明書に従い、切片を室温で5分間0.1M NaH2PO4中の0.5% グルタルアルデヒドで固定し、5−ブロモ4−クロロ−3−インドイル−β−ガラクトース(X−gal、Promega)によるβ−ガラクトシダーゼ組織化学分析を行うまで−70℃で保存した。スライドを37℃で一晩染色し、いくつかのスライドはMayerのヘマトキシリンで対比染色した。スライドは写真を撮るか、またはトランスイルミネータの付いた、1200dpi UMAX平面スキャナーでスキャニングし、G4 Power Macintoshを用いて、Adobe Photoshop5.5により処理した。
【0034】
結果
リポソーム内にpGL2ルシフェラーゼプラスミドを持つペギル化イムノリポソームの構造を図1Aに示す。内部にpGL2プラスミドを持つペギル化イムノリポソームの平均直径は73nm(図1b)であるため、リポソームは水溶液中で形成される。プラスミドDNAを持つペギル化イムノリポソーム形成中に、複合体はヌクレアーゼ混合物で処理される(方法)。このヌクレアーゼ処理はペギル化リポソームの外側に結合したプラスミドDNAを除去し;アガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロミド染色は外側に結合したプラスミドがいずれも製剤から完全に除去されたことを示す(図1C、レーン1)。pGL2プラスミドDNAをリポソーム内への取り込みの前に32Pで放射標識すると、5.8kb pGL2プラスミドのみが検出され、DNAの低分子量型は観察されなかった(図1C、フィルムオートラジオグラフィー)。ペギル化イムノリポソーム上のPEG鎖末端へのOX26MAbの共有結合はSepharose CL−4Bゲルろ過クロマトグラフィーによりモニターした(図1D)。これらの研究はリポソームの内部に取り込まれた32P−pGL2とPEG鎖に付着した3H−標識OX26MAbの共移動を示す。OX26の比活性に基づき、このペギル化イムノリポソームの製剤は個々のリポソームに結合したOX26MAbを39分子含むことが計算された。
【0035】
薬物動力学的研究を、末端が32Pで標識された線状pGL2プラスミドDNAに関して行った。つまり、これを以下の3種の形状の1種として麻酔したラットに注射した:(a)裸のDNA、(b)MAbと結合していないペギル化リポソームの内部に取り込まれた32P−pGL2プラスミド、または(c)OX26と結合したペギル化イムノリポソームの内部に取り込まれた32P−pGL2プラスミドDNA。これら3種の異なる製剤を異なる群のラットに注射し、トリクロロ酢酸(TCA)で沈殿した血漿放射活性を静脈内投与後2時間までの各種時点で測定した(図2、右パネル)。裸のDNAは4.1±0.5mL/分/kgのクリアランス(Cl)、514±243mL/kgの全身分布容積(Vss)で、速やかに血漿から除去された。OX26MAbを持たないペギル化リポソームの内部にDNAが取り込まれたときは、DNAのクリアランスは、0.95±0.05mL/分/kgまで4倍以上減少した(図2、左パネル)。OX26MAbがリポソームのPEG尾の先端に結合しているとき、全身クリアランスは2.3±0.2mL/分/kgに増加した。脳、肝臓、腎臓、および心臓における組織取り込みも測定した。これらのデータは、DNAを収容するペギル化リポソームの先端へのOX26MAbの連結が、ペギル化イムノリポソームの腎臓または心臓における組織取り込みのわずかな増加、肝臓における中等度の増加、そして脳取り込みの著しい増加を引き起こすことを示す(図3)。PEG鎖に結合したOX26を持たないプラスミドDNAを収容するペギル化リポソームは有意に脳に取り込まれなかった(図3)。しかし、プラスミドDNAを収容するOX26ペギル化リポソームは、静脈内注射後120分で、0.066±0.002%ID/g脳のレベルで脳に取り込まれた(図3)。この脳取り込みのレベルはモルヒネのような神経活性小分子のそれに匹敵し、麻酔したラットに注射後60分で、モルヒネは0.081±0.001%ID/g脳、脳に取り込まれた(24)。
【0036】
脳および末梢組織におけるルシフェラーゼ遺伝子発現は、OX26ペギル化イムノリポソームの内部に取り込まれたプラスミドDNAをラット毎に10μg投与したラットの群において試験した。mg組織蛋白質毎の相対光単位(RLU)として表された器官ルシフェラーゼ酵素活性は、静脈内注射後24,48および72時間後に測定した(図4)。心臓または腎臓におけるルシフェラーゼ遺伝子のターゲッティングは最小であったが、脳におけるルシフェラーゼ遺伝子発現は肺および脾臓のそれに類似し、静脈内投与後48時間で最高になった(図4)。肝細胞膜上でトランスフェリン受容体は大量発現されるために、肝臓におけるピークルシフェラーゼ遺伝子発現は脳に比較して約6倍高かった。対照実験のために、OX26と同じアイソタイプであるマウスIgG2aをOX26MAbの代わりにペギル化リポソームに結合することを除いて、同様にペギル化イムノリポソームを製造した。マウスIgG2aペギル化イムノリポソーム/pGL2DNA複合体は麻酔したラットに静脈内注射した;pGL2プラスミドDNAの投与量はラット毎に10μg、または40μgであった。しかし、静脈内注射後48時間では、脳または他のいずれの器官においても測定可能なルシフェラーゼ発現は見られなかった。この対照実験は3回繰り返し、すべての試料でルシフェラーゼ活性は検出限界以下であった。
【0037】
β−ガラクトシダーゼ組織化学は図5に示す。低倍率(図5A)で見られるように、脳はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を広く発現するが、対照脳ではβ−ガラクトシダーゼ活性は全く見られなかった(図5B)。両側脳室の脈絡叢と同様に、海馬のCA1−CA3セクターの錐体ニューロンは明確に視覚化され;第3脳室の後角および乳頭陥凹の両方においても脈絡叢は遺伝子発現に陽性である(図5A)。脳基底部にある海馬の対視索上核は低倍率で見られる(図5A)。高倍率では、微小血管(図5C)、脈絡叢上皮(図5D)、および視床核(図5E)は豊富なβ−ガラクトシダーゼ発現を示した。脳全体のニューロンにおける低レベルの遺伝子発現も視覚化された。門脈周囲パターンにおいて肝臓全体の遺伝子発現が組織化学的に検出され、図5Fに示すように遺伝子発現は肝細胞に局在した。高倍率像は肝細胞全体の酵素生成物の点状(punctate)沈着を示し、このことは酵素が小胞体の管状小胞(tubulovesicular)ネットワークに局在することを示唆する。
【0038】
先の実施例は、本発明に従って、外因性遺伝子が非侵襲的投与後に脳における広範な発現が可能であることを証明する。SV40プロモータおよびプラスミドの3−非翻訳領域(UTR)部分を組織−および遺伝子−特異的プロモータおよび3−UTR要素と交換すると、脳における領域特異的および細胞特異的遺伝子発現でさえも可能なはずである。この遺伝子治療の方法は、単に製剤(図1A)のMAb部分を、霊長動物では抗−TfRMAbより10倍近く活性が高いヒトインスリン受容体(HIR)MAb(33)に変換することにより、ヒトでの使用に適切になる。HIRMAbのキメラ型は最近記載され、遺伝子組換えキメラHIRMAbは、元のマウス抗体のように霊長動物またはヒトBBBにおいて、同一の輸送の性質を有する(34)。
【0039】
さらに別の実施例において、6.8kb pSV−β−ガラクトシドプラスミド(Promega)を、2種のターゲッティングリガンド:ラットトランスフェリン受容体(TfR)に対するOX26モノクローナル抗体(MAb)またはマウスIgG2aアイソタイプ対照抗体のうちのいずれか1種と結合したペギル化イムノリポソームの内部に取り込んだ。器官は投与後2、4、または6日にβ−ガラクトシド組織化学またはサザンブロット法のために取り出した。マウスIgG2aペギル化イムノリポソーム投与後に、肝臓、脾臓、脳または心臓で測定可能なβ−ガラクトシド遺伝子発現は見られなかった。マウスIgG2aペギル化イムノリポソームの静脈内投与後48時間では、サザンブロット法により肝臓にプラスミドを検出できなかった。しかし、OX26MAbとともに製剤されたペギル化イムノリポソームの内部にβ−ガラクトシド発現プラスミドが取り込まれると、製剤の単回静脈内注射後48時間で肝臓または脾臓に豊富なβ−ガラクトシド遺伝子発現が見られた。外因性プラスミドDNAはまた、静脈内注射後2、4、および6日に肝臓でサザンブロット法により検出された。対照的に、心筋の連続毛細血管を含む内皮上でのTfRのわずかな発現のために、心臓では測定可能なβ−ガラクトシド遺伝子発現は見られなかった。肝臓のβ−ガラクトシド組織化学は、正常ラット肝臓の肝TfRの同じ発現パターンと一致して、遺伝子発現がほとんど肝小葉全体で一様であることを示す。脾臓における高倍率のβ−ガラクトシド組織化学は、赤脾髄での著しい遺伝子発現および白脾髄でのより少ない遺伝子発現を示す。
【0040】
これらの付加的な実施例は、本発明が脳における広範な外因性遺伝子発現を提供することを示す。脳におけるβ−ガラクトシド導入遺伝子の発現は、ペギル化イムノリポソームの単回静脈内注射後少なくとも6日間持続する。肝臓または脾臓においても、単回静脈内注射後少なくとも6日間持続するβ−ガラクトシド導入遺伝子の発現が見られ、注射後6日の肝臓または脾臓の組織化学パターンは注射後2日のこれらの器官で見られたものと類似した。測定は静脈内注射後4日でも行われ、これらの組織化学的研究は、肝臓、脾臓、または脳におけるβ−ガラクトシド遺伝子発現のレベルが2日または6日の活性の中間であることを示した。外因性遺伝子は、肝臓、脾臓、および脳のような抗−TfRMAbに標的にされる器官の実質内に深く発現される。遺伝子発現は、ペギル化イムノリポソームの単回静脈内注射後少なくとも6日間持続する。β−ガラクトシド組織化学はサザンブロット法により確認され、組織でのβ−ガラクトシド酵素活性の持続がin vivoでの導入遺伝子の持続性と平行することを示した。
【0041】
本発明は第2の種、マウスにおいても証明された。ラットTfRに対するOX26MAbはマウスでは生物学的に活性ではない(34)。したがって、ペギル化イムノリポソームにマウスTfRに対するラット8D3MAbを結合し、マウスに静脈内注射した。2日後に脳を取り出し、器官におけるβ−ガラクトシド遺伝子発現レベルを標準組織化学により測定した。脳および脾臓における外因性遺伝子の広範な発現が見出された。
【0042】
本発明の典型的な態様を記載したので、当業者は開示内容は単なる例示であり、本発明の範囲内で各種の他の可能な変法、応用、および修正が行われてもよいことを理解するであろう。したがって、本発明は本明細書で説明される具体的な態様に限定されず、以下の請求項のみによって限定される。
【0043】
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1Aは、pGL2ルシフェラーゼ発現プラスミドが中性脂質から構築されたOX26(BBBターゲッティング物質)ペギル化イムノリポソームに封入される、好ましい典型的な態様の図である。リポソーム表面に連結した、PEG2000と呼ばれる分子量2000ダルトンのポリエチレングリコールが約3000鎖あり、PEG鎖の約1%がラットトランスフェリン受容体に対するOX26モノクローナル抗体と結合している。OX26MAbはペプチドミメティックMAbであり、トランスフェリンのBBB輸送を媒介する内因性経路でBBBを通るRMTを受ける(5)。
図1BはpGL2プラスミドDNAを封入するペギル化リポソームの平均直径が73nmであることを示すグラフである。
図1CはDNAse 1/エキソヌクレアーゼIII処理の前(レーン2)および後(レーン1)のリポソームの電気泳動を示す。電気泳動は0.8%アガロースゲル電気泳動で行われ、エチジウムブロミド(EtBr)で染色された。DNA分子量サイズ標準は左側に示される。ペギル化リポソームに結合したDNAの約50%はリポソームの外側に結合し(レーン2)、これはヌクレアーゼ処理により定量的に除去された(レーン1)。極微量のpGL2プラスミドが32Pで放射標識され、ゲルのフィルムオートラジオグラフィーは単一の5.8kbバンドを示し、低分子量の放射標識されたDNAは見られなかった。これらの結果は、DNAのすべてはペギル化イムノリポソームの内側に封入されていることを示す。
図1Dでは、封入されたpGL2プラスミドを有するペギル化リポソームへのOX26MAbの結合に続いてヌクレアーゼ消化したものについてセファロースCL−4Bゲルろ過クロマトグラフィーを行った。極微量の封入されたpGL2プラスミドDNAが32Pで標識され、極微量のOX26MAbが3Hで放射標識された。これは結合したOX26MAbと封入されたpGL2プラスミドDNAの共移動を示す。
【図2】図2Aは、トリクロロ酢酸(TCA)により沈殿した、血漿mLあたりの注入量(ID)の割合を、麻酔したラットに32P DNAを静脈内注射した後120分間までの時間に対してプロットしたグラフを示す。DNAは3種の製剤のうち1種として注射した:(a)“裸”のDNA(DNA)、(b)ヌクレアーゼ処理されたOX26ペギル化イムノリポソームの内部に封入されたpGL2プラスミドDNA(OX26−リポ/DNA)、および(c)連結したOX26MAbを持たない、ヌクレアーゼで処理されたペギル化リポソームの内部に封入されたpGL2プラスミドDNA(Peg−リポ/DNA)。
図2Bは、TCAにより沈殿した血漿放射活性の割合を示すグラフである。データは平均±SEである(n=3ラット/群)。
【図3】図3は、連結した抗体を持たないペギル化リポソーム(PEG/DNA)、またはOX26ペギル化イムノリポソーム(OX26−リポ/DNA)内のいずれかに封入された32PGL2プラスミドDNAの静脈内注射後120分間での肝臓、脳、腎臓、または心臓の組織1グラム毎の注入量(ID)%として表された組織取り込みを示すグラフである。データは平均±SEである(n=3ラット/群)。
【図4】図4は、本発明に従ってOX26MAbと結合したペギル化イムノリポソームに封入されたpGL2プラスミドDNA注射後24、48,72時間の脳、心臓、腎臓、肝臓、肺および脾臓の組織蛋白質1mgあたりの相対的光単位(RLU)として表した、器官ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。データは平均±SEである(n=3ラット/群)。
【図5】図5A−Fは、本発明に従ってOX26ペギル化イムノリポソームの内部に封入されたβ−ガラクトシド遺伝子の静脈内注射後48時間での脳(図5A−E)および肝臓(図5F)におけるβ−ガラクトシドの組織化学を示す写真である(図5B−F)。遺伝子投与を受けていないラット由来の対照脳は図5Bに示される。倍率=1.5mm(図5A)、2.2mm(図5B)、57μm(図5C)、23μm(図5D)、230μm(図5E)、および15μm(図5F)。図AおよびBは対比染色されていない。図5Aで、側脳室(LV)、第3脳室(III)、左または右海馬(hippo)、および視床下部視索上核(son)は標識される。図5Dは脈絡叢の毛細血管の管腔(L)を示し、そして図5Eは、図5Aでも見ることができる、第3脳室の脈絡叢下の視床(thal)核を示す。
Claims (26)
- 遺伝子を脳血液脳関門および脳細胞膜を横切って送達するための受容体特異的リポソームであり:
外表面および内部コンパートメントを有するリポソーム;
物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内にある遺伝子;
複数の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質;および
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記リポソームの外表面に連結されている複数の前記結合物質を含む前記リポソーム。 - リポソームの外表面が200ナノメーターより小さい直径を有する球を定義する、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 遺伝子が脳由来神経栄養因子、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、β−グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、チミジンキナーゼをコードする遺伝子、およびアンチセンスRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される治療薬をコードする、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 遺伝子がプラスミド中にある、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 遺伝子の分子量が30,000ダルトンより大きいか、または該遺伝子が少なくとも100ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 5から1000の間の血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質がリポソームの表面に結合している、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 25から40の間の血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質が前記リポソームの表面に結合している、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 結合物質がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリンおよび有機ポリマーからなる群から選択される、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 結合物質の分子量が1000から50,000ダルトンの間にある、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質がインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子(IGF)、レプチン、低密度リポ蛋白質(LDL)、およびこれらの内因性ペプチドを模倣し、そして血液脳関門および脳細胞膜上のインスリン、トランスフェリン、IGF、レプチン、またはLDL受容体に結合する、対応するペプチド類似モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の受容体特異的リポソーム。
- 脳における発現のために遺伝子を血液脳関門を横切って送達するための方法であって:
a)外表面および内部コンパートメントを有するリポソーム;
薬剤的物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内にある遺伝子;
複数の血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質;
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記リポソームの外表面に連結される、複数の前記結合物質;を含む受容体特異的リポソーム;および
b)前記受容体特異的リポソームが前記血液脳関門を横切って、前記脳の前記遺伝子の発現を提供する、前記受容体特異的リポソームのための薬剤的に受容できるキャリアを含む、製剤の効果的な量を動物に投与する段階を含む前記方法。 - 医薬製剤が静脈内に投与される、請求項11に記載の方法。
- リポソームの外表面が200ナノメーターより小さい直径を有する球を定義する、請求項11に記載の方法。
- 遺伝子が脳由来神経栄養因子、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼA、チミジンキナーゼをコードする遺伝子、およびアンチセンスRNAをコードする遺伝子からなる群から選択される治療薬をコードする、請求項11に記載の方法。
- 遺伝子がプラスミド中にある請求項11に記載の方法。
- 遺伝子が少なくとも100ヌクレオチドを含む、請求項11に記載の方法。
- 5から1000の間の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質がリポソームの表面に結合している、請求項11に記載の方法。
- 25から40の間の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質がリポソームの表面に結合している、請求項17に記載の方法。
- 結合物質がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリンおよび他の有機ポリマー性物質からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 結合物質の分子量が1000から50,000ダルトンの間にある、請求項19に記載の方法。
- 血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質がインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子(IGF)、レプチン、低密度リポ蛋白質(LDL)、およびこれらの内因性ペプチドを模倣し、そして血液脳関門および脳細胞膜上のインスリン、トランスフェリン、IGF、レプチン、またはLDL受容体に結合する、対応するペプチド類似モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項11に記載の非侵襲性方法。
- a)外表面および内部コンパートメントを有するリポソーム;
物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内にある遺伝子;
複数の血液脳関門ターゲッティング物質;
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記リポソームの外表面に連結されている、複数の前記結合物質;を含む受容体特異的リポソーム;および
b)前記受容体特異的リポソームのための薬剤的に受容できるキャリアを含む医薬製剤。 - 特異的受容体を有する細胞に治療用遺伝子を送達するためのナノコンテナーであって:
外表面および内部コンパートメントを有するナノコンテナー;
薬剤物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記ナノコンテナーの内部コンパートメント内にある遺伝子;
前記細胞上にある受容体を標的にすることができる、複数の受容体特異的ターゲッティング物質;および
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記ナノコンテナーの外表面に連結されている、複数の前記受容体特異的ターゲッティング物質を含む前記受容体特異的ナノコンテナー。 - 特異的受容体を有する前記細胞が脳、肝臓、肺および脾臓からなる細胞の群から選択される、請求項23に記載の受容体特異的ナノコンテナー。
- 特異的受容体を有する細胞に遺伝子を送達するための方法であって:
a)外表面および内部コンパートメントを有するナノコンテナー;
前記ナノコンテナーの内部コンパートメント内にある、薬剤的物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含む遺伝子;
前記細胞上にある受容体を標的にすることができる複数の受容体特異的ターゲッティング物質;および
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記ナノコンテナーの外表面に連結されている、複数の受容体特異的ターゲッティング物質;を含む受容体特異的ナノコンテナー;ならびに
b)前記受容体特異的ナノコンテナーのための薬剤的に受容できるキャリアを含む、効果的な量の製剤を動物に投与することを含む前記方法。 - ナノコンテナーが標的にする細胞が、脳、肝臓、肺および脾臓細胞からなる細胞の群から選択される、請求項25に記載の方法。
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