JP2004514402A - プロテインチロシンホスファターゼ−1b(ptp−1b)欠失マウスおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ターゲッティングした相同組換えによりそれらのPTP−1B遺伝子が破壊されているマウスを提供する。該マウスは、PTP−1Bタンパク質が検出不能だが、生理学的には正常に見える。しかし、普通食の給餌状態において、該マウスは、それらの野生型同腹子に比べ循環インスリンレベルが半分である。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験において、該マウスはインスリン感受性の増大を示す。高脂肪高炭水化物食を与えた場合、該マウスは、それらの野生型同腹子と比較して体重増加に対する抵抗性を示す。また、該マウスおよび該マウスから誘導される細胞系の作製方法も提供される。本発明はまた、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法ならびにそのような方法により同定されるインヒビターを提供する。
Description
【0001】
発明の分野
本発明は、破壊されたPTP−1B遺伝子を含むトランスジェニックマウスの分野に関する。このマウスは、PTP−1B遺伝子の一方または両者のコピーに破壊を含み得る。PTP−1B遺伝子の両コピーに破壊を含むマウスの場合、そのようなマウスは、PTP−1Bタンパク質の検出可能な発現が欠如している。
【0002】
発明の背景
プロテインチロシンホスファターゼ(PTPase)は、種々の調節プロセスに関与する基質を脱リン酸化する、膜貫通または細胞内酵素の大きな一群に属する(Fischerら, 1991, Science 253:401−406)。プロテインチロシンホスファターゼ−1B(PTP−1B)は、約50kdの細胞内タンパク質で、種々のヒト組織に多量に存在する(Charbonneauら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5252−5256;Goldstein, 1993, Receptor 3:1−15)。他のPTPaseと同様に、PTP−1Bは該酵素の活性にとって必須な、アルギニンおよびシステイン残基を含む配列モチーフ(I/V)HCXAGXXR(S/T)G(配列番号1)を特徴とする触媒ドメインを有する(Streuliら, 1990, EMBO J. 9:2399−2407;Guanら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1501−1505;Guan & Dixon, 1991, J. Biol. Chem. 266:17026−17030)。PTP−1Bアミノ末端の35個のアミノ酸残基のために、該タンパク質は小胞体に局在する(Frangioniら, 1992, Cell 68:545−560)。
【0003】
どのタンパク質がPTP−1Bの基質かを決定することは、かなり興味深いことである。特別な興味を起こさせる1つの基質はインスリン受容体である。インスリン受容体へのインスリンの結合は、該受容体の自己リン酸化をもたらし、最も顕著なものはキナーゼ触媒ドメインにおけるチロシン1146、1150および1151についてのものである(White & Kahn, 1994, J. Biol. Chem. 269:1−4)。これは、インスリン受容体チロシンキナーゼの活性化をもたらし、これはインスリンシグナリング事象をさらに下流へと伝播して、インスリンの種々の生物学的作用を媒介する種々のインスリン受容体基質(IRS)タンパク質をリン酸化する。
【0004】
Seelyら, 1996, Diabetes 45:1379−1385(Seely)は、in vitroにおけるPTP−1Bとインスリン受容体との関係を検討した。Seelyは、PTP−1B触媒ドメインに点突然変異を有するPTP−1BのグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、触媒的には不活性ではあるものの、精製した受容体調製物およびインスリン受容体を発現している細胞から誘導される全細胞溶解物からインスリン受容体を沈殿させるその能力により実証されるように、インスリン受容体に結合することができる。
【0005】
Ahmadら, 1995, J. Biol. Chem. 270:20503−20508は、浸透圧の負荷を用いてPTP−1B中和抗体をラットKRC−7肝ガン細胞に導入した。該細胞に該抗体が存在することにより、インスリン刺激DNA合成およびホスファチジイノシトール3′キナーゼ活性がそれぞれ42%および38%増大した。インスリン受容体の自己リン酸化およびインスリン受容体基質−1チロシンのリン酸化は、抗体負荷細胞(antibody−loading cells)においてそれぞれ2.2倍および2.0倍増大した。この抗体負荷細胞はまた、外因性ペプチド基質に対するインスリン刺激インスリン受容体キナーゼ活性において57%の増大を示した。
【0006】
本発明までは、PTP−1Bとインスリン受容体との相互作用の研究は、PTP−1Bの無細胞調製物または培養下の細胞系についての研究に限られていた。したがって、そのような研究は、PTP−1B活性が生きている哺乳動物におけるブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加に対して生理学的作用をもたらす様式でインスリン受容体の調節に影響を及ぼすか否かの問題に対処するものではなかった。インスリン受容体およびPTP−1Bのようなタンパク質とのその相互作用の調節は複雑で、生きている哺乳動物の環境とできるだけ近い環境でこの調節を研究することが必要である。本発明のノックアウトマウスは、この要件を満足するよう支援するのに有用である。本発明のノックアウトマウスはまた、それらが生きている哺乳動物においてインスリン受容体の活性をモジュレートする化合物の設計および評価に用い得る動物モデルを提供する、という点においても有用である。
【0007】
発明の概要
本発明は、標的化(ターゲッティング)した相同組換え法(targeted homologous recombination)により、PTP−1B遺伝子が破壊されているマウスを提供する。PTP−1B遺伝子の両コピーが破壊されている場合、該マウスは検出可能なPTP−1Bタンパク質を有しないが、生理学上は正常に見える。しかし、給餌状態において、該マウスは、野生型の同腹子よりもわずかに低いブドウ糖レベルおよび野生型の同腹子の半分の循環インスリンレベルを有する。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験(glucose and insulin tolerance tests)において、該マウスはインスリン感受性が増大している。高脂肪高炭水化物食を与えた場合、該マウスは、野生型の対照よりもずっとインスリン感受性が高いが、肥満抵抗性である。
また、該マウスおよび該マウスから誘導される細胞系を作製する方法も提供される。
【0008】
本発明はまた、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法、ならびにそのような方法により同定されるインヒビターを提供する。
【0009】
発明の詳細な説明
本発明の目的のために:
「トランスジェニックマウス」とは、サブ細胞レベルでの意図的遺伝子操作により(例えば、ターゲッティングした相同組換え、マイクロインジェクション、または組換えウイルスの感染により)直接的または間接的に改変または受容された遺伝情報を保有する1個以上の細胞を含む任意のマウスである。「トランスジェニックマウス」なる用語は、古典的な雑種形成(cross−breeding)または体外受精を包含しようとするものではなく、1個以上の細胞が組換えDNA分子により改変されているか組換えDNA分子を受容しているマウスを包含しようとするものである。トランスジェニックマウスは、遺伝子改変または遺伝情報が生殖細胞系に導入されていてもよく、それにより該遺伝情報を子孫に伝達する能力を賦与する。そのような子孫がその改変または遺伝情報のいくつかまたは全部を有する場合には、それらもまたトランスジェニックマウスである。
【0010】
「ノックアウトマウス」とは、予め選択した遺伝子のDNA配列のある部分を破壊するように働く新しいDNA配列をそのマウスのゲノムDNAに導入することにより、該予め選択した遺伝子の発現が抑制または排除されているマウスである。ノックアウトマウスは、破壊された該予め選択した遺伝子の両コピーを有してもよく、この場合、それはホモ接合型または「ヌル」ノックアウトマウスである。ノックアウトマウスはまた、破壊された該予め選択した遺伝子の一方だけのコピーを有してもよく、この場合、それは「ヘテロ接合型」ノックアウトマウスである。
【0011】
生物学的経路または疾患状態における特定の遺伝子の役割を決定する問題に対する一つのアプローチは、全能ES細胞において生来の野生型遺伝子を選択的に不活性化し、次いで該ES細胞を用いてトランスジェニックマウスを作製することである。そのようなトランスジェニックマウス(該特定の遺伝子が不活性化されている)は「ノックアウトマウス」として知られている。遺伝子ターゲッティングしたトランスジェニックノックアウトマウスの作製において遺伝子ターゲッティングしたES細胞を用いることは、例えばThomasら, 1987, Cell 51:503−512に記載されており、他にも概説されている(Frohmanら, 1989, Cell 56:145−147;Capecchi, 1989, Trends in Genet. 5:70−76;Baribaultら, 1989, Mol. Biol. Med. 6:481−492)。
【0012】
ターゲッティングした相同組換えを用いて特定の変化を染色体遺伝子に挿入することによる、任意の遺伝子領域を不活性化または実質的に任意の所望の突然変異へと改変するための技術が利用可能である。一般に、「ターゲッティングベクター」、すなわち突然変異させようとする遺伝子領域を部分的に含むプラスミドが用いられる。該プラスミドの該遺伝子領域のこの部分と染色体上の対応する遺伝子領域との相同性のために、相同組換えを用いて該プラスミドを該遺伝子領域に挿入し、それにより該遺伝子領域を破壊することができる。通常、ターゲッティングベクターは選択マーカー遺伝子も含む。
【0013】
相同染色体外組換え(これは100%に近い頻度で起こる)と比較して、相同プラスミド−染色体組換えは、かつて10−6〜10−3の頻度でしか検出されないと報告された(Linら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1391−1395;Smithiesら, 1985, Nature 317:230−234;Thomasら, 1986, Cell 44:419−428)。非相同プラスミド−染色体相互作用はそれよりも頻度が高く、同等の相同挿入よりも105倍(Linら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1391−1395)から102倍(Thomasら, 1986, Cell 44:419−428)高いレベルで起こる。
【0014】
マウスES細胞におけるターゲッティングした組換えのこの低比率を克服するために、極めて少ない相同組換え体を検出または選別するための種々の戦略が開発されてきた。相同改変事象を検出するための1つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、形質転換細胞のプールを相同挿入についてスクリーニングし、続いて個々のクローンをスクリーニングする(Kimら, 1988, Nucleic Acids Res. 16:8887−8903;Kimら, 1991, Gene 103:227−233)。あるいはまた、ポジティブ遺伝子選別法が開発されており、そこでは、相同挿入が起こった場合にだけ活性であり、かつこれらの組換え体を直接選別できるようにするマーカー遺伝子が構築される(Sedivyら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:227−231)。相同組換え体を選別するために開発された最も有効な方法の1つは、改変の直接的な選別が存在しない遺伝子用に開発されたポジティブ−ネガティブ選別(PNP)法である(Mansourら, 1988, Nature 336:348−352;Capecchi, 1989, Science 244:1288−1292;Capecchi, 1989, Trends in Genet. 5:70−76)。このPNS法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するために、高レベル発現の難しい遺伝子をターゲッティングする際により有効である。非相同組換え体は、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ(HSV−TK)遺伝子を用いて、ガンシクロビル(GANC)またはFIAU[1−(2−デオキシ2−フルオロ−B−D−アラビノフラノシル)−5−ヨードウラシル]のようなヘルペス薬を用いてその非相同挿入について選別することにより選別される。この逆選別(counter−selection)により、生存している形質転換体中の相同組換え体の割合を増大させることが可能になる。
【0015】
本発明は、ターゲッティングした相同組換えによりそれらのPTP−1B遺伝子が破壊されているマウスを提供する。PTP−1B遺伝子の両コピーが破壊されているマウス(「ヌル」マウス)の場合、該マウスは検出可能なPTP−1Bタンパク質を有していないが、生理学上は正常に見える。しかし、給餌状態において、該ヌルマウスは、それらの野生型同腹子よりもわずかに低いブドウ糖レベルおよび該野生型同腹子の半分の循環インスリンレベルを有する。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験において、該ヌルマウスは、インスリン感受性が増大している。さらに、インスリンを注射したヌルマウスの肝臓および筋肉においては、同様に処理した野生型マウスと比較してインスリン受容体のリン酸化が明らかに高くなっている。これらの結果から、PTP−1Bが生きている哺乳動物におけるインスリンシグナリング経路に関与し、インスリン受容体の脱リン酸化、ひいてはインスリン受容体の不活性化においてある役割を担うことが示される。
【0016】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、機能的PTP−1Bタンパク質を含まない細胞系の供給源として有用である。そのような細胞系は、ヒトPTP−1B遺伝子でトランスフェクトして、内因性マウスPTP−1Bの発現に伴う干渉を受けることなしにヒトPTP−1Bを発現する細胞系を得ることが可能である。そのような細胞系は、ヒトPTP−1Bのアクチベーターまたはインヒビターを同定するためのアッセイにおいて用い得る。したがって、本発明は、PTP−1Bノックアウトマウスに加えて、本発明のPTP−1Bノックアウトマウスから誘導される細胞系を提供する。そのような細胞系は、当業界で周知の方法により作製することができる(Williamsら, 1988, Mol. Cell. Biol. 8:3864−3871;Aaronson & Todaro, 1968, J. Cell. Physiol. 72:141−148;Jenkinsら, 1984, Nature 312:651−654)。
【0017】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、野生型マウスにおいてPTP−1Bに対する医薬の作用によりブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加をモジュレートする該医薬の作用をモニターするアッセイのネガティブ対照として有用である。そのようなアッセイのネガティブ対照としてPTP−1Bノックアウトマウスを使用すると、PTP−1B活性に対する医薬の作用によりもたらされると思われる、野生型マウスにおいて該医薬によりもたらされるブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加に対する作用が、実際に引き起こされることを判定することが可能になる。
【0018】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、インスリン受容体の弱いアゴニストを同定するためのアッセイにおいて有用である。これらのノックアウトマウスはPTP−1Bが欠失しているので、インスリン受容体のシグナルの低下に関与する重要なエレメントが欠失している。したがって、ノックアウトマウスにおいてPTP−1Bの不在下では、インスリン受容体の弱いアゴニストが同定でき、この場合、それら弱いアゴニストの作用はPTP−1Bの存在下では喪失している。そのような弱いアゴニストを先駆化合物(lead compound)として用いて、これを医化学的に修飾し、より強力で薬理学上有用なインスリン受容体のアゴニストを開発することができる。
【0019】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、代謝または生理機能の種々の局面におけるインスリン受容体の役割の研究に有用である。例えば、該マウスをモニターして、PTP−1Bの喪失が寿命に何らかの影響を及ぼすか否かを決定することができる。C. elegansにおいて、遺伝子daf−2が突然変異すると、寿命に悪影響が生ずる。daf−2は、哺乳動物インスリン受容体の同族体(homolog)である。
【0020】
db/dbマウスは、糖尿病に罹患しているヒトの合併症に似た末梢神経障害および心筋疾患などの多くの合併症を発症する。本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、PTP−1B活性と糖尿病との関係をより良く研究するために、db/dbマウスと交雑させることが可能である。本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、他の化学的または遺伝的に誘導された糖尿病マウスモデルと同様にして用いることができる。
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスにおいて、チアゾリジンジオンまたはスルホニル尿素のようなブドウ糖レベリング薬物の作用を調べることは興味深いことである。
【0021】
本明細書における、インスリン受容体のPTP−1B調節が肥満においてある役割を担うという実証に照らし、PTP−1Bノックアウトマウスにおいて、体重調節に関連しているレプチン(leptin)、メラノコルチン−4受容体、神経ペプチドY5受容体および他の分子種を調べることは興味深い。
【0022】
本発明のノックアウトマウスを作製するために、種々の方法を用いることができる。1つの方法は、導入遺伝子を標的細胞に導入し、次いでこれを胚盤胞(blastocyts)に組み込み、これを偽妊娠雌性マウスに移植することを含む。導入遺伝子の導入のための標的細胞の1つのタイプは胚性幹細胞(ES)である。ES細胞は、in vitroで培養した移植前の胚から得てもよい(Evansら, 1981, Nature 292:154−156;Bradleyら, 1984, Nature 309:255−258;Gosslerら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065−9069;Robertsonら, 1986, Nature 322,445−448;Woodら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4582−4584)。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介トランスダクションなどの一般的な技法により、効率的にES細胞に導入できる。その後、得られた形質転換ES細胞はマウスからの胚盤胞と混ぜ合わせることができる。該胚盤胞を偽妊娠仮母親に移植した後、導入したES細胞は、該胚盤胞から発達する胚をコロニー化し、得られるキメラマウスの生殖系をもたらす(Jaenisch, 1988, Science 240:1468−1474)。
【0023】
本発明のノックアウトマウスを作製するのに用い得る別の方法は、導入遺伝子を受精卵の雄前核(male proinucleus)にマイクロインジェクションすることを含む(Brinsterら, 1981, Cell 27:223;Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5016;Sterwartら, 1982, Science 217:1046−1048;Townesら, 1985, EMBO J. 4:1715)。マイクロインジェクションした導入遺伝子は、該受精卵の雄前核のDNAに組み込まれる。次いで、該受精卵を、レシピエントである雌性マウスに移植し、発育させる。この手順がうまく行けば、得られる胚はその全細胞に該導入遺伝子を含むこととなる。場合によっては、該受精卵は、該導入遺伝子がゲノムに組み込まれる前に分割する。そのような場合、キメラ胚が生じる。そのようなキメラ胚は、それらの細胞の幾つか(全部ではない)に含まれる。
【0024】
本発明は、その細胞の少なくとも幾つかが、プロテインチロシンホスファターゼ−1B(PTP−1B)の変異形態をコードする改変遺伝子を含み、かつ該改変遺伝子がそのマウス内の野生型のPTP1B遺伝子を置換するようにターゲッティングされているマウスの作製方法であって、
(a) マウス胚性幹細胞のPTP−1B遺伝子をターゲッティングするように設計されたPTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を用意し;
(b) 該PTP−1Bの改変形態をコードする改変遺伝子をマウスES細胞に導入し;
(c) 該PTP−1Bの改変形態をコードする改変遺伝子が野生型PTP−1B遺伝子を破壊しているES細胞を選択し;
(d) ステップ(c)からの該ES細胞をマウス胚盤胞に注入し;
(e) ステップ(d)からの胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し;および
(f) 該胚盤胞を胚へと発達させ、該胚を産み月まで発達させて、その細胞の少なくとも幾つかがPTP−1の変異形態をコードする改変遺伝子を含むマウスを生産させる
ことを含む上記方法を提供する。
【0025】
上記の方法により作製されるマウスが、PTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を有する生殖細胞を含む場合、該マウスを交配させて、その体細胞ならびに生殖細胞の全てが該PTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を含んでいるマウスを生産させることが可能となる。PTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を含む生殖細胞を有するマウスは交配させて、それらのPTP−1B遺伝子の両コピーに破壊を含み、そのために検出可能なPTP−1B活性を全く有しないホモ接合型マウスすなわち「ヌル」マウスを得ることができる。
【0026】
本発明のノックアウトマウスは、野生型マウスと比較してブドウ糖代謝および脂肪代謝が改変されている。本発明のノックアウトマウスにおけるPTP−1B遺伝子破壊の効果は、PTP−1Bの活性の改変により、in vivo(すなわち生きている哺乳動物)におけるインスリンシグナリングがモジュレートされ得ることを実証している。本発明のノックアウトマウスはまた、PTP−1Bの活性の改変が体重増加に対しても効果を有することも実証している。これらの結果から、PTP−1Bの阻害がII型糖尿病(非インスリン依存性糖尿病、NIDDM)および肥満の治療に有益であることが示唆される。本発明により、生きている哺乳動物における食物代謝(fuel metabolism)の血中ブドウ糖およびトリグリセライドレベルまたは体重増加のような局面に対するPTP−1Bの効果が初めて実証された。本発明以前には、精製酵素調製物または組織培養細胞中でのPTP−1Bとインスリン受容体との相互作用により、生きている哺乳動物内でしか研究できないこれら作用を類推できるとは予想されなかった。したがって、本発明以前には、PTP−1Bとインスリン受容体との相互作用のインヒビターを用いて、生体哺乳動物内での血中ブドウ糖もしくはトリグリセライドレベルをモジュレートしたり肥満を調節できるとは、なかなか予想されなかった。何故ならば、哺乳動物における食物代謝の調節について組織培養物において行われた実験の妥当性が明らかでなかったからである。
【0027】
本明細書中で提示する研究以前には、PTP−1Bだけをノックアウトするというような簡単な変化により、本発明者らにより知見されたような飛躍的な効果が生ずるとは考えられていなかった。この理由は、インスリン受容体の作用が複合様式で調節されることが知られていたからである。この調節に関与する種々のクラスのタンパク質の中で、幾つかのプロテインチロシンホスファターゼ(PTPase)だけが関与することが知られていた。例えば、Kulasら, 1995, J. Biol. Chem. 270:2435−2438は、インスリン受容体の活性がPTPase LARによって負に調節されることを実証した。他にも、PTPase SH2−PTP(aka Syp)がインスリンの活性を正に調節することが実証されている(Xiaoら, 1994, J. Biol. Chem. 269:21244−21248;Milarskiら, 1994, J. Biol. Chem. 269:21239−21243;Yamauchiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:664−668;Noguchiら, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:6674−6682)。Hashimotoら, 1992, J. Biol. Chem. 257:13811−123814は、多くのプロテインチロシンホスファターゼがPTP−1Bと同じ位効率的にインスリン受容体をin vitroで脱リン酸化できることを実証している。多数の他の報告により、PTP−1B以外のPTPも活性化インスリン受容体を脱リン酸化し得ることが実証されている(Jacobら, 1998, J. Biol. Chem. 273:4800−4809;Chiarugiら, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 238:676−682;Mollerら, 1995, J. Biol. Chem. 270:23126−23131)。
【0028】
インスリン受容体活性を調節するもののような複合調節機構が存在する場合、生体哺乳動物においてその機構の1成分をノックアウトするだけでは効果はほとんど期待薄と予期されたであろう。何故ならば、その1成分の量がそれ自体有意でなかったり、あるいは該調節機構の他の成分が該ノックアウト成分の欠如を補償して、インスリン受容体のバランスをその正常な状態へと回復させたと考えられたか、のいずれかであるからである。例えば、Ahmadら, 1995, J. Biol. Chem. 270:20503−20508、20508頁を参照されたい(彼らは、自分達の研究の結果を次のように要約している:インスリンのシグナリングは多くのPTPaseにより数段階で均衡をとっている…)。
【0029】
これらの予想に反して、本発明は、PTP−1B活性を変えることにより、生体哺乳動物においてインスリン受容体活性を調節することが可能であることを実証する。したがって、本発明のノックアウトマウスにより実証された結果に基づき、今や、生体哺乳動物内のインスリン受容体の活性をモジュレートするのに有用なPTP−1Bの酵素活性のインヒビター同定が実現可能である。そのようなインヒビターは、II型糖尿病および肥満の治療における利用性を有する。
【0030】
本発明の以前には、そのようなPTP−1Bのインヒビターは恐らくインスリン受容体に対して望ましい作用を有するかもしれないが、それらは薬理学的には有用ではないと考えられていた。何故ならば、PTP−1Bが、インスリン受容体の活性のモジュレーションにおけるその役割だけでなく、多くの必須の役割を有すると考えられていたからである。したがって、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターは、予想されるインスリン受容体に対する望ましい作用に加えて、あまりにも多くの有害な副作用を有し、薬理学的には有用ではないではと考えられていた。したがって、従来技術では、インスリン受容体へのPTP−1Bの結合のインヒビターは有用であるかもしれないが(何故ならば、そのようなインヒビターは、インスリン受容体に特異的な作用を有するからである)、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターは有用ではない(何故ならば、そのようなインヒビターは、より全般的な作用を有するからである)とされていた。例えば、国際特許出願WO97/32595、11頁、36行目〜12頁7行目:「ホスファターゼ活性は一般に細胞にとって必須なので、ホスファターゼ活性ではなく(インスリン受容体へのPTP−1Bの)結合を調節することが好ましい。」を参照されたい。従来技術がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターを用いるのを避けていた別の例は、米国特許第5,726,027号の請求項1に見ることができ、そこでは次のように書かれている:「ある組成物が、ホスファターゼ活性ではなく、リン酸化されたインスリン受容体に結合しているプロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)を阻害するか否かを判定する方法であって、該方法は………を含む」。
【0031】
PTP−1Bノックアウトマウスは、ブドウ糖およびトリグリセライド代謝が改変され、ならびに高脂肪高炭水化物食を与えた場合の改変された体重増加パターンが改変されていることを除けば、生理学的に正常である、という本発明による実証に鑑みれば、従来技術がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターには利用性がないとみなしたのは誤りであったことが明白である。本発明は、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターがII型糖尿病の治療および肥満の調節に利用性を有する可能性があることを明らかにした。したがって、本発明は、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法ならびにそのような方法により同定されたインヒビターを提供する。
【0032】
本発明は、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;および
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定すること;
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとする方法を提供する。
【0033】
もちろん、上記の方法は、ステップ(b)が、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質1種だけでなく、複数のPTP−1B酵素活性のインヒビターであると思われる物質を用いて行われるよう実施してもよい。この様式での該方法の実施の一例は、酵素的に活性なPTP−1Bの調製物に対する化合物のライブラリー(例えば、コンビナトリアルライブラリー)のスクリーニングである。そのような場合、典型的には、該ライブラリー中の物質のごく一部だけがPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることがわかる。該ライブラリーが大きい場合には、ステップ(b)での使用のために、それを便宜上化合物の小さな部分に分けてもよい。
【0034】
本発明は、PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;および
(c) 該PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定すること;
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質が該PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとする方法を提供する。
【0035】
上記の方法は、ステップ(c)が、PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる単独物質ではなく、PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる複数の物質を用いて行われるよう実施してもよい。この様式での方法の実施の一例は、化合物のライブラリー(例えば、コンビナトリアルライブラリー)のスクリーニングである。そのような場合、典型的には、該ライブラリー中の物質のごく一部だけがPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることがわかる。該ライブラリーが大きい場合には、ステップ(c)での使用のために、それを便宜上化合物の小さな部分に分けてもよい。
【0036】
ステップ(a)の細胞は、原核性もしくは真核性であってもよく、哺乳動物、両性類、細菌もしくは酵母のものであってもよい。好適であり市販されている哺乳動物種から誘導される細胞系としては、L細胞L−M(TK−)(ATCC CCL 1.3)、L細胞L−M(ATCC CCL 1.2)、293(ATCC CRL 1573)、ラジ(ATCC CCL 86)、CV−1(ATCC CCL 70)、COS−1(ATCC CRL 1650)、COS−7(ATCC CRL 1651)、CHO−K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS−C−1(ATCC CCL 26)およびMRC−5(ATCC CCL 171)が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、この細胞は、本発明のPTP−1Bヌルノックアウトマウスから誘導されている細胞である。
【0037】
トランスフェクションには、PTP−1Bタンパク質をコードするDNA配列を該細胞に導入するための当業界で公知の任意の方法を包含する。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、PTP−1Bタンパク質をコードするDNA配列を含むレトロウイルス構築物の感染、およびエレクトロポレーションが含まれる。
【0038】
PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定する方法は、当業界で公知の任意の方法により行うことができる。例えば、PTP−1Bによるインスリン受容体の脱リン酸化は、Maegawaら, 1995, J. Biol. Chem. 270:7724−7730のようにして測定できる。またHuyerら, 1997, J. Biol. Chem. 272:843−851を参照されたい。他の方法としては、例えばPTP−1Bを免疫沈降させることによる無傷の細胞内でのPTP−1Bの活性の測定、およびFDP、MUP、p−ニトロフェニルホスフェート、ホスホチロシルペプチドまたは32P/33P標識したリンペプチドもしくはリンタンパク質のような種々の人工基質を用いたその活性の測定が挙げられる。さらに、PTP−1Bの活性は、インスリン受容体だけでなくPTP−1Bの他の基質のホルホチロシル状態を追跡することにより測定できる。また、インスリン受容体が(肝臓においてのように)長期にわたってリン酸化されたままでいる場合、あるいはインスリン受容体が(筋肉においてのように)高リン酸化されている場合、インスリンカスケードに関与するタンパク質のリン酸化状態および該カスケードの生化学的作用は増大する。したがって、ブドウ糖の輸送、グリコーゲンの合成、アミノ酸の輸送、タンパク質の合成、インスリン受容体基質のリン酸化状態、P3Iキナーゼ活性、Aktキナーゼ活性などの因子を測定することにより、無傷の細胞中のPTP−1Bの活性を間接的に追跡することができる。
【0039】
上記の方法のステップ(c)において、トランスフェクトされた細胞はそのまま用いてもよいし、あるいはそれらをまず溶解させてもよく、該細胞の特定の画分または該細胞からのPTP−1Bタンパク質の部分精製または全精製した調製物を用いてもよい。
【0040】
上記の方法により同定された物質は、それら物質がPTP−1Bの酵素活性の特異的なインヒビターである場合、すなわちそれら物質が別のプロテインチロシンホスファターゼの活性を阻害しない場合に特に有用である。したがって、通常、上記の方法により同定されたインヒビターを取り出し、さらにLAR、syp、CD45等の他のプロテインチロシンホスファターゼに対してそれらをスクリーニングすることは意義がある。
【0041】
PTP−1B酵素活性のインヒビターを同定する上記の方法は、同法で同定された物質がII型糖尿病および関連する合併症の治療または肥満の調節に用い得るか否かを判定する方法となるように変更してもよい。これは、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターとして同定された物質を取り出し、それらの物質が哺乳動物(例えばマウス、ラットもしくはヒト)におけるブドウ糖レベルもしくはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否か、またはそれらの物質が高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物(例えばマウス、ラットもしくはヒト)における肥満を予防もしくは軽減するか否かを判定することを必要とする。
【0042】
したがって、本発明は、ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定し、それにより、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(c) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(d) ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする方法を提供する。
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
【0043】
本発明は、上記の方法により同定された物質を提供する。そのような物質は、ヒトのII型糖尿病および関連する合併症の治療における利用性を有することが期待される。
【0044】
本発明は、ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定し、それにより、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(c) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(d) ステップ(c)の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合のステップ(c)の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ(c)の哺乳動物の体重増加を、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする方法を提供する。
【0045】
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
本発明は、上記の方法により同定された物質を提供する。そのような物質は、ヒトの肥満の調節における利用性を有することが期待される。
【0046】
本発明は、ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;
(c) PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(d) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(e) ステップ(d)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ(d)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする方法を提供する。
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
【0047】
本発明は、ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;
(c) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(d) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(e) ステップ(d)の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合の該ステップ(c)の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ(d)の哺乳動物の体重増加を、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ(d)の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする方法を提供する。
【0048】
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
本発明は、上記の方法により同定されたPTP−1Bの酵素活性のインヒビターを包含する。そのようなインヒビターは多くの用途を有する。例えば、そのようなインヒビターは、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを肥満哺乳動物に投与することを含む肥満の治療方法において使用可能である。そのようなインヒビターはまた、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターをII型糖尿病に罹患しているヒトに投与する等、II型糖尿病および関連する合併症の治療方法においても使用可能である。
【0049】
そのようなインヒビターは、通常、使用前に製剤上許容される担体と混ぜ合わせる。そのような担体、ならびにインヒビターと担体とを含有する製薬上許容される組成物の配合方法は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに見ることができる。有効な投与に適する製薬上許容される組成物を形成するためには、そのような組成物は有効量の該インヒビターを含有する。
【0050】
治療用または予防用組成物は、肥満またはII型糖尿病の治療または予防に有効な量で個体に投与される。この有効な量は、個体の症状、体重、性別および年齢のような種々の要因に応じて様々に異なり得る。他の要因としては、投与形態が挙げられる。適切な量は、習熟した医師であれば決定できる。
組成物は単独で適切な投与量にて用いることができる。あるいはまた、他の薬物の同時投与または連続投与も望ましいものであり得る。
【0051】
該組成物は、慣用の投与用ビヒクル中での多種多様な治療剤型で投与できる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤(それぞれ、間歇放出処方および持続的放出処方を含む)、丸剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳濁剤のような経口剤型で、または注射により投与可能である。同様に、それらはまた、静脈内(ボーラスまたは輸液の両者)、腹腔内、皮下、収蔵(occlusion)を伴うもしくは伴わない局所的、または筋肉内の形態(それらは全て、製剤技術分野の当業者には周知の形態を用いる)で投与してもよい。
【0052】
有利には、組成物は単回日用量で投与してもよく、または総日用量を1日2回、3回または4回の分割用量で投与してもよい。さらに、組成物は、適切な鼻腔内用ビヒクルの局所的使用により、または当業者に周知の経皮用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路により鼻腔内の形態で投与してもよい。経皮送達システムの形態で投与されるためには、用量の投与は、もちろん投与レジュメ全体を通して断続的ではなく連続的である。
【0053】
該組成物を用いる投与レジュメは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的症状;治療しようとする症状の重篤度;投与経路;患者の腎機能、肝機能および心臓血管機能;用いるその特定の組成;などの種々の要因に応じて選択される。熟練した医師または獣医師であれば、症状の進行を予防、抑制(counter)または阻止するのに必要な該組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。毒性を伴わずに効力をもたらす範囲内の組成物濃度を達成する上での最良の正確さには、標的部位への該組成物の利用可能性の動態に基づくレジュメが必要である。これには、組成物の分布、均衡および排除を考慮することが含まれる。
本発明をより良く説明するために、以下の非限定的実施例を示す。
【0054】
実施例1
ターゲッティングベクターの構築
ターゲッティングベクターを構築するために、マウスPTP−1B遺伝子を129/Svマウスゲノムライブラリーからクローニングし、特性決定した。このマウスPTP−1B遺伝子は、ヒト(GenBank受託番号M317324;Chernoffら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2735−2739も参照されたい)およびマウス(GenBank受託番号M97590;Miyasakaら, 1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 185:818−825も参照されたい)のPTP−1B cDNAをプローブとして用いて、ラムダFIX II 129/SvJマウスのゲノムライブラリー(Stratagene, La Jolla, CA)をスクリーニングすることにより単離する。オーバーラップしている3つのλクローンを単離し、マウスPTP−1B遺伝子のゲノム構成およびエキソン配列を決定した。この3つのλクローンは、該cDNAの5′隣接領域および最初の190bpを除くPTP−1B遺伝子の大部分を含んでいた(図1A)。この遺伝子は、20kb以上にも及ぶ少なくとも9のエキソンからなる。ターゲッティングベクター(図1A)は、エキソン5およびエキソン6(これはチロシンホスファターゼ活性部位であるシステイン215を含む)を含むゲノム配列を欠失させ、この欠失配列をネオマイシン耐性遺伝子で置き換えて得た。これは、PGKプロモーターにより駆動されるneoマーカー遺伝子(PGK−neo)をpBluescript KS+(Stratagene, La Jolla, CA)のSmaI部位にクローニングすることにより達成した(pneoKS)。次に、この5.5kbのHindIII/EcoRIマウスPTP−1Bゲノム断片(エキソン5のすぐ5′側)を、HindIII/EcoRI消化pneoKSに挿入した。次に、このベクターをXbaIおよびNotIで消化し、1.6kbのXbaI/XhoIマウスPTP−1Bゲノム断片(エキソン6のすぐ3′側)およびPGKプロモーター断片により駆動されるXhoI/NotI HSV−tk遺伝子と連結させた。得られたターゲッティングベクター(pTARGET)はHindIII消化により線状にした。
【0055】
実施例2
ノックアウトマウスの作製
該ターゲッティングベクターを129/Sv胚性幹細胞(J1)にエレクトロポレーションし、先に記載(You−Tenら, 1997, J. Exp. Med. 186:683−693)のようにしてG418耐性コロニーを選択した。J1細胞は、単に説明のためのもので、例えばES−D3細胞(ATCCカタログ番号CRL−1934)のような他の胚性幹細胞系も適する。ゲノムDNAをBamHI消化した後でサザンブロッティングおよびプローブAを用いたハイブリダイゼーションにより、G418に耐性のコロニーを相同組換えについて分析した。プローブAは、図1Aで「3′プローブ」として示す800bpのXhoI/BamHI断片である。耐性コロニーの約2%が相同組換え事象を示す。次に、これらのG418耐性ES細胞クローンの2つを、先に記載(You−Tenら, 1997, J. Exp. Med. 186:683−693)のようなBalb/c胚盤胞へにマイクロインジェクションに用いた。各系統について生殖系の伝達(germline transmission)が得られ、F1ヘテロ接合体を交配させて、PTP−1B突然変異についてホモ接合型の動物(すなわちヌルマウス)を得た。サザンブロッティングにより遺伝子型決定を行った(図1B)。PTP−1Bヘテロ接合型マウスではマウス3.4kbおよび2.7kbの2本のバンドが見え、PTP−1Bヌルマウスでは1本の2.7bkのバンドが見える。肝臓ミクロソームのイムノブロット分析により、PTP−1BヌルマウスにはPTP−1Bタンパク質が存在しないことが明らかになった(図1C)。これらの結果から、PTPヌルマウスにはPTP−1B酵素が欠失していることが実証される。
【0056】
実施例3
普通食を与えたノックアウトマウスにおけるブドウ糖レベルおよびインスリンレベル
絶食させたマウスおよび普通の(すなわち非高脂肪で非高炭水化物の)食餌を与えたマウスにおいてブドウ糖レベルおよびインスリンレベルを測定した(図2)。給餌状態において、ヌルマウスは、血中ブドウ糖レベルにおいて野生型マウスと比較して有意な(P≦0.01)13%の低下があったが、ヘテロ接合体では野生型と比較した場合に8%の低下であった(図2A)。驚くべきことに、ヌルマウスはまた、循環インスリンレベルが野生型の給餌マウスの場合の約半分であった(図2B)。これらの結果から、給餌PTP−1B欠失マウスは、インスリンに対して一層感受性であり、その結果、非常に少ないインスリンに応答してブドウ糖が大きく低下することが示唆される。絶食状態では、野生型、ヌルおよびヘテロ接合型マウスの間ではブドウ糖レベルにもインスリンレベルにも有意な差はなかった。しかし、PTP−1Bヌルマウスおよびヘテロ接合型ノックアウトマウスでは、絶食状態において、野生型マウスと比較した場合にトリグリセライドレベルの実質的な低下があった。絶食させたヌルマウスにおけるトリグリセライドレベル(0.86±0.18mM/L)は、野生型マウスの場合(1.84±0.76mM/L)よりも約50%低く、ヘテロ接合体(1.43±0.44mM/L)では20%低かった。表1を参照されたい。
【0057】
【表1】
表1.普通食または高脂肪高炭水化物食を与えた雄性PTP−1B(−/−)、野生型およびヘテロ接合型の同腹子の空腹時ブドウ糖、トリグリセライドおよびインスリンレベル。値は平均±標準偏差として示す。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行い、野生型と比較した。ND、測定せず。†(P=0.1)、*(P<0.05)(n=6〜10)。
【0058】
給餌状態におけるトリグリセライドレベルは影響を受けなかった。これらのデータから、ノックアウトマウスではPTP−1Bの喪失がブドウ糖およびトリグリセライドのホメオスタシスに影響を及ぼすことが実証され、このことは初めて、無傷の哺乳動物のインスリンシグナリング経路においてPTP−1Bを強く関連付けた。
【0059】
普通食を与えたPTP−1Bヌルマウスおよび野生型マウスのインスリン感受性を、経口耐ブドウ糖能試験および腹腔内耐インスリン能試験を行うことによりさらに調べた。ブドウ糖のボーラスをPTP−1Bヌルマウスに投与したところ、野生型マウスで観察されたものよりも迅速なブドウ糖のクリアランスが起こった(図3A)。野生型動物では、PTP−1Bヌルマウスと比較した場合、胃管栄養法(gavage)後の全ての時点においてより顕著な高血糖があった。インスリンを注射した際には、インスリン感受性の増大も見られた(図3B)。ヌルマウスおよび野生型マウスのいずれでも、注射の30分後および60分後では低血糖が明らかになった。野生型のブドウ糖レベルは120分後に正常レベルに近づいたが、PTP−1Bヌルマウスは低血糖のままであった(P<0.02)。
【0060】
実施例4
ノックアウトマウスにおけるインスリン受容体およびインスリン受容体基質 −1 のチロシンリン酸化
PTP−1Bがin vivoでの(すなわち、哺乳動物生体内での)インスリン受容体のリン酸化に影響を及ぼすかを判定するため、インスリンチャレンジ後にノックアウトマウスおよび野生型マウスの両者につき、インスリン受容体のホスホチロシンレベルを測定した。インスリンはボーラスとして下大静脈に注射し、注射後の各時点で組織サンプルを採取して、インスリン受容体の脱リン酸化の経時的変化を測定した。次に、インスリン受容体β−サブユニットを組織ホモジネートの膜画分から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットして、インスリン受容体のリン酸化レベルを求めた。次に、該ブロットをストリップし、C末端β−サブユニット抗体で再プローブして該ブロット上の該β−サブユニットの量を求め、ホスホチロシンシグナルを該β−サブユニットの量に対して正規化した。ヌルマウスおよび野生型マウスの両者とも、肝臓または筋肉において、インスリン不在下でのインスリン受容体リン酸化のレベルは非常に低かった(図4AおよびB)。野生型マウスをインスリン処理したところ、肝臓におけるインスリン受容体のチロシンリン酸化レベルは飛躍的に増大し(図4A)、これは、注射後5分(図4A)までに1分の時点のレベルの約50%まで低下した(P<0.05)。肝臓におけるインスリン受容体リン酸化のこの経時的変化は、先にt1/2が6分のラットにおいて観察されていた(Rothenbergら, 1991, J. Biol. Chem. 266:8302−8311)。しかし、同様に処理したヌルマウスでは、肝臓におけるインスリン受容体リン酸化の動態は、野生型マウスにおいて見られるものとは有意に異なっていた。即ちインスリン受容体リン酸化のレベルは、注射1分後ではヌルマウスおよび野生型マウスの両者とも同じであったが、ヌルマウスにおいては注射5分後のチロシンリン酸化のレベルが野生型マウスとは違って低下せず、1分の時点のレベルと実質的に同じであった(P<0.05)。このヌルマウスにおけるインスリン受容体の高リン酸化持続から、これらのマウスではインスリン受容体もまた、より長期にわたって活性化されたままであったことが示唆される。しかし、インスリン受容体の高リン酸化に対する最も顕著な作用は、ヌルマウスの筋肉において見られた。インスリン処理したヌルマウスからの筋肉サンプ
ルにおけるインスリン受容体のホスホチロシンレベルの分析から、野生型の筋肉でのレベルと比較して、絶対的リン酸化レベルにおいて約40%の増大があったことが明らかになった(P<0.05)(図4B)。肝臓でのレベルと同様に、筋肉におけるインスリン受容体リン酸化のレベルは、ヌルマウスにおいても野生型マウスにおいても実験の経過時間にわたって低下しなかった。筋肉で見られるインスリン受容体の高リン酸化が、ヌルマウス内でのインスリン受容体の過剰発現によるものである、という可能性はほとんどない。何故ならば、全組織溶解物のイムノブロティングにより測定したところ、野生型マウスおよびヌルマウスのいずれにおいてもインスリン受容体の発現レベルに検出可能な差異は見られなかったからである。ヌルマウスにおける筋肉でのインスリン受容体リン酸化のこの実質的な増大および肝臓でのインスリン受容体の持続的リン酸化は、これらのマウスにおけるインスリン感受性増大の最も可能性の高い要因である。このことはまた、(特に筋肉における)in vivoでのPTP−1Bの基質が活性化されたインスリン受容体であることを示唆しているようでもある。
【0061】
インスリン処理したヌルマウスの筋肉におけるインスリン受容体の高リン酸化がキナーゼ活性の増大につながることを確認するために、注射2分後のサンプルにおいてインスリン受容体基質−1(IRS−1)のホスホチロシンレベルを調べた(図4C)。IRS−1は、インスリン処理したヌルマウスの筋肉では、野生型マウスと比較して、高リン酸化された(P<0.05)。さらに、肝臓におけるIRS−1脱リン酸化の経時変化はインスリン受容体よりもさらに迅速であり、わずか2〜3分以内でベースラインレベルまで回復することがわかっている(Rothenbergら, 1991, J. Biol. Chem. 266:8302−8311)。にもかかわらず、2分の時点でのレベルと同レベルのIRS−1の高リン酸化は、注射6分後のヌル筋肉サンプルにおいても明らかであった。
【0062】
実施例5
高脂肪高炭水化物食を与えた PTP−1B ノックアウトマウスにおける肥満抵抗性
高脂肪高炭水化物食を与えた野生型マウスは肥満になり、肥満誘導性のインスリン抵抗性を呈する(Uysalら, 1997, Nature, 389:610−614)。雄性および雌性PTP−1Bノックアウトマウス(ヘテロ接合体ならびにヌル)(7〜8週令)に高脂肪高炭水化物食(脂肪から50%のカロリー、5,286kcal kg−l、Bio−Serv F3282マウス餌料、Bioserv. Frenchtown, NJ)を与えた。対照として、野生型マウスに同じ食餌を与えた。この給餌の10週間後、雄性および雌性の野生型同腹子は共に肥満になったが、PTP−1B(−/−)マウスおよびPTP−1B(+/−)マウスは食餌誘導性肥満から有意に防御された(図5)。給餌した動物の出発時の体重には有意な差はなかったが(雄、+/+、27.6±1.4g;+/−、28.5±1.2g;−/−、26.3±1.2g;および雌、+/+、22.1±0.8g;+/−、22.2±0.8g;−/−、21.5±0.8g)、PTP−1Bヘテロ接合体およびヌル動物の両者と比較した場合の野生型マウスの最終体重(雄、+/+、41.4±1.3g;+/−、37.2±2.0g;−/−、33.5±1.6g;および雌、+/+、33.3±1.7g;+/−、27.3±1.3g;−/−、27.2±1.4g)は顕著な有意差を示した(ヘテロ接合型もしくはヌルに対する野生型ではP<0.05、但し、雌性のヘテロ接合体に対する野生型ではP=0.1であった)。給餌において全ての動物群で消費された食餌の量は異なっておらず、このことから、PTP−1Bの発現レベルの変化(ヘテロ接合体は野生型のPTP−1B発現レベルの約半分である、図1C)が食餌誘導肥満の発症に影響を及ぼし得ることが示唆される。
【0063】
高脂肪高炭水化物食がPTP−1B(+/+)マウス、PTP−1B(+/−)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスにおけるインスリン感受性に影響を及ぼすかを調べるために、全ての動物群について空腹時ブドウ糖およびインスリンレベル、ならびに耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験を行った(上記の表1および図6;雄の値だけが示してある、雌の値はほとんど同じ結果をもたらした。)。PTP−1B(+/+)マウスでは、高脂肪高炭水化物食により、空腹時ブドウ糖レベルは30%増大し、空腹時インスリンレベルは3倍増大した(表1)。これに対して、PTP−1B(−/−)動物は低いブドウ糖レベルおよびインスリンレベルを維持し、一方、高脂肪食では、普通食の場合の値と比較してレベルには有意な差異はない(表1)。これらの結果から、野生型同腹子では高脂肪食がインスリン抵抗性を引き起こすが、PTP−1B(−/−)マウスではそうではないことが示される。脂肪を給餌したPTP−1Bヘテロ接合体も高い空腹時インスリンレベルを示したが、野生型よりも低い空腹時ブドウ糖レベルを有していた(表1)。PTP−1B(−/−)マウスではまた、耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験の両者において、それらの野生型同腹子と比較してインスリン感受性の増大も見られ(図6AおよびB)、PTP−1B(+/−)マウスは中間の感受性を示すと思われる。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験により測定した場合のPTP−1B(−/−)マウスとPTP−1B(+/+)マウスとのインスリン感受性の差異は、高脂肪食においてさらに一層明らかになった(図3AおよびBを図6AおよびBと比較せよ)。このことはまた、高脂肪高炭水化物食を給餌したマウスにおいてインスリンチャレンジを行った後で筋肉内のインスリン受容体のチロシンリン酸化レベルを測定した場合にも同様であった(図6C)。高脂肪食が筋肉および脂肪組織において肥満に関連するインスリン受容体シグナリングの低下を引き起こすことが示されている(Uysalら, 1997, Nature, 389:610−614)。図4Bにおいて、普通食を与えたマウスのインスリン刺激により、PTP−1B(−/−)の筋肉では、PTP−1B(+/+)マウスと比較して約40%のインスリン受容体のホスホチロシンレベル増大が起こった。高脂肪食により、野生型マウスとPTP−1B(−/−)マウスとのインスリン感受性のこの差異は、PTP−1B(−/−)マウスが野生型よりも約4倍高いインスリン受容体リン酸化レベルを有し、一方PTP−1B(+/−)マウスが中間の(野生型よりも約2倍高い)レベルを示す程度まで拡大した(図6C)。高脂肪食を与えたPTP−1B(+/+)マウスでは、予想通りの表現型(つまり肥満およびインスリン抵抗性)が見られた。これに対して、PTP−1B(+/−)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスは、それらが肥満の発症に抵抗性であったという点で予想外の表現型を示した。PTP−1B(−/−)マウスではインスリン感受性は維持され、PTP−1B(+/−)マウスはPTP−1B野生型マウスおよびヌルマウスと比較して中間の感受性を示した。
【0064】
高脂肪高炭水化物食を与えたマウスにおける上記の結果から、PTP−1Bノックアウトマウスがこの食餌を与えた場合にインスリン感受性が維持されることが実証される。事実、それらはそれらの野生型同腹子よりもずっとインスリン感受性が高い。したがって、PTP−1Bノックアウトマウスは、高脂肪高炭水化物食を与えた場合に(野生型マウスよりも高くないとしても)少なくとも野生型マウスと同程度には肥満に罹り易いと予想された。何故ならば、それらのインスリン感受性の増大は、脂質生成の増大を誘発すると予期されたからである。しかし、下記の実験は、全く反対のことが起こったことを示している。
【0065】
高脂肪高炭水化物食を与えたPTP−1Bノックアウトマウスおよび野生型マウスの体重、ならびに該マウスが消費した食餌の量を各週毎に測定した。食餌の消費においては、野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ヌルマウスの間で本質的に差異はなかった。高脂肪高炭水化物食を与えた10週後、野生型マウスでは約50%体重増加し;ヘテロ接合型およびヌルマウスでは共に約25〜30%体重増加した。したがって、ノックアウトマウスでは、高脂肪高炭水化物食を与えた場合、野生型の体重増加の約半分であった。図5を参照のこと。これらの結果から、 PTP−1Bが肥満においてある役割を担うこと、およびPTP−1Bの酵素活性のインヒビターが肥満の調節において薬理学上有用であることが示される。
【0066】
実施例6
PTP−1B −/− マウスの白色脂肪組織における脱共役タンパク質の誘導
PTP−1B(−/−)マウスにおける肥満抵抗性の理由を調べるために、高脂肪食または普通食のいずれか一方を与えたマウスの空腹時トリグリセライドレベルを測定した。いずれの食餌を与えたPTP−1B(−/−)マウスも、野生型マウスおよびヘテロ接合型マウスよりも有意に低いトリグリセライドレベルを有していた。PTP−1B(+/−)マウスは、普通食を与えた場合は野生型マウスよりもわずかに低いトリグリセライドレベルを有していたが、高脂肪高炭水化物食を与えた場合は野生型と比較して差がなかった。この結果から、PTP−1Bの喪失が脂肪の代謝に影響を及ぼすことが示される。したがって、普通食または高脂肪食を与えた動物においてインスリンチャレンジを行った後で、脂肪組織内のインスリン受容体のホスホチロシンレベルを調べることとした。インスリン受容体の高リン酸化を示した肝臓および筋肉とは反対に、PTP−1B(−/−)マウスからの脂肪では、野生型と比較してインスリン受容体の低リン酸化があると思われ、このことは、PTP−1B(−/−)マウスの脂肪組織がある程度インスリン抵抗性であることを示唆している(図7A)。このことについての支持は、高脂肪食を与えた野生型マウス(インスリン抵抗性である)がここでは、脂肪組織において基本的にPTP−1B(−/−)マウスのものと同等のインスリン受容体リン酸化レベルを有している、という事実からくるものである(図7B)。したがって、PTP−1B欠失マウスは、組織特異的なインスリン感受性を示すと思われる。野生型マウスと比較して、肝臓および筋肉はより感受性が高いが、脂肪組織は抵抗性であると思われる。
【0067】
PTP−1B(−/−)マウスの脂肪組織における改変されたインスリンシグナリングは、これらの動物で見られる肥満抵抗性に関与する要因の1つであると思われる。脂肪細胞にインスリンが作用することにより、cAMPレベルの低下および脂質生成の刺激が起こる(Manganielloら, 1996, Curr. Top. Cell. Regul. 34:63−100)。PTP−1B欠失マウスにおいて、脂肪細胞はインスリン応答性の低下を有し、その結果、脂肪形成に対して抵抗性になる。βアドレナリン作用性受容体活性の作用によりcAMPレベルを増大させること、あるいは遺伝子ノックアウトによりプロテインキナーゼA(PKA)調節サブユニットを改変することのいずれかによるPKAの活性を増大させることが、脱共役タンパク質−1(UCP−1)の誘導により肥満抵抗性をもたらすことは十分に実証されている。UCP−1は、BATにおいて脂肪酸の酸化を脱共役(decouple)するミトコンドリアタンパク質トランスロケーターである。このことにより、ATP形成ではなく、脂肪酸の分解に由来するエネルギーが熱として放散され、したがって、身体の休止中の代謝速度を高める[Handbook of Obesity (Bray, G.A.編, Bouchard, C. & James, W.P.T.)のHimmis−Hagen & Ricquire, 1998, “Brown Adipose Tissue”, 415−441頁(Marcel Dekker Inc., New York;Cummingsら, 1996, Nature 382:622−626]。脂肪組織内の改変されたイスリン受容体活性のためにPTP−1B活性の喪失がPTP−1B(−/−)マウスの脂肪組織内のcAMPレベルに影響を及ぼしているならば、このことがPTP−1B(−/−)マウスにおいて見られた肥満抵抗性の表現型を説明できる。ノーザンブロット分析を行って、UCPがPTP−1B野生型マウスおよびヌルマウス(普通食)の白色脂肪組織(WAT)において誘導されるか否かを調べた。2匹の別個のPTP−1B(−/−)マウスの腹部WATにおけるUCP−1 mRNAの誘導が明らかになったが、それはPTP−1B(+/+)のWATでは検出不能であった(図8A)。UCP−2 mRNAレベルは、野生型マウスとPTP−1B(−/−)マウスとでは変わらなかった(図8A)。UCP−1 mRNAは、褐色脂肪細胞においてのみ発現され、白色脂肪デポーにおけるその発現は、この脂肪デポーにおいて褐色脂肪が誘導されたことを示す(Ghorbaniら, 1997, Biochem. Pharmacol. 54:121−131)。野生型マウスからの鼡径部WATの組織学的分析では、予想どおりの典型的な大きな単房性脂肪細胞が示された(図8B)。これに対して、PTP−1B(−/−)マウスからの鼡径部WATはより多数の小さな単房性脂肪細胞を含んでおり、そしてより重要なことに、通常この脂肪デポーでは見られない多数の多房性脂肪細胞が存在することが明らかになった(図8B)。この多房性脂肪細胞は褐色脂肪の特徴を示し、このことはPTP−1B(−/−)WATで見られたUCP−1 mRNAの発現と一致する。免疫学的染色により、PTP−1B(−/−)マウスからの鼡径部WAT内の多房性細胞は、UCPタンパク質について陽性に染色された。肩甲間のBAT(IBAT)を調べたところ、PTP−1B(+/+)マウスがPTP−1B(−/−)マウスにおいて見られるものよりも大きな脂質小滴を有する脂肪細胞を含むことが明らかになった(図8C)。
【0068】
実施例7
ブドウ糖およびインスリンの測定
麻酔したマウスの眼窩洞から血液を採取し、血清を調製した。Vitros250アナライザーを用いて血清中ブドウ糖レベルを測定し、およびラジオイムノアッセイ(Linco, St. Charles, Missouri)を用いてインスリンレベルを測定した。
【0069】
麻酔した雄性マウス(10〜14週令)において、一夜絶食させた後、胃管栄養法により1g/kgのブドウ糖を投与することにより耐ブドウ糖能を行い、t=0、30、60および120分の時点で血液を採取した。血漿を調製し、使用するまで凍結し、血清中ブドウ糖レベルを測定した。一夜絶食させた後で、0.75U/kgのレギュラーヒトインスリン(Eli Lilly, Indianapolis, IN)の腹腔内注射により耐インスリン能試験を行った。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験の両者のために、マウスの尾部から血液を採取し、1滴の血液をOne Touch Stripブドウ糖アッセイ装置にのせ、ブドウ糖レベルを対応するOne Touch Basic(Lifescan Canada Ltd., Burnaby, British Columbia, Canada)にモニターした。
【0070】
実施例8
インスリン受容体リン酸化の in vivo 分析
一夜絶食させた後、マウスを麻酔し、腹腔を暴露し、5単位のレギュラーヒトインスリン(Eli Lilly, Indianapolis, IN)または食塩水をボーラスとして下大動脈に注射した(Arakiら, 1994, Nature 372:186−190)。注射1分後、肝臓の小片を切り取り、直ちに液体窒素中で凍結した。注射の約2分後、四頭筋および腹部の脂肪の一片を切り取り、素早く凍結した。これを、肝臓、筋肉および脂肪についてそれぞれ注射の5、6および7分後にもう一度繰り返し、次いで該マウスを回復する前に犠牲にした。
【0071】
実施例9
免疫沈降およびイムノブロット分析
野生型、ヘテロ接合型およびヌルマウスの肝臓の膜画分(25μg/レーン)におけるPTP−1B発現のイムノブロット分析を、N末端特異的(アミノ酸43〜56)PTP−1Bウサギポリクローナル抗体(UBI)を用いて行った。増強化学発光(NEN)を用いてブロットを発色させた。インスリン受容体β−サブユニットの免疫沈降は次のようにして行った。肝臓、脂肪または筋肉のいずれかの組織を氷上で、50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM ピロホスフェート、100μMパーバナデート(pervanadate)(強力なPTPaseインヒビター;Huyerら, 1997, J. Biol. Chem. 272:843−851)およびプロテアーゼインヒビター溶液(Boehringer Mannheim)中でホモジナイズした。膜画分は100,000×gで1時間遠心分離することより調製し、タンパク質濃度を求めた。200μgの肝臓もしくは筋肉膜タンパク質、または100μgの脂肪膜タンパク質を免疫沈降用緩衝液(RIPA)(150mM NaCl, 10mMリン酸緩衝液 pH 7.5、1%NP−40、1%Naデオキシコレート、0.1%SDS)中に溶解し、インスリン受容体β−サブユニットの免疫沈降を1μgの抗インスリン受容体抗体(C−19)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用いて4℃にて一夜行い、続いてプロテインGセファロース(Pharmacia Biotech)の50%スラリー50μlを60分間インキュベートした。該サンプルを1mlのRIPA緩衝液で3回洗浄し、サンプルを8%SDS PAGEにかけた。該サンプルをPVDF膜に移し、ホスホチロシンの免疫検出(immunodetection)を抗ホスホチロシン4G10西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体(Upstate Biotech)を用いて製造業者推奨手順に従って行った。同じブロットを62.5mMのTris pH 6.7、2%w/v SDS、100mM β−メルカプトエタノール中で55℃にて30分間ストリップし、洗浄し、抗インスリンβ−サブユニットRb(C−19、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で再プローブした。次に、ホスホチロシンシグナルおよびβ−サブユニットレベルをデンシトメトリー(Molecular Dynamics)により定量し、ホスホチロシンレベルを各サンプル中に存在するβ−サブユニットの量について正規化した。IRS−1の免疫沈降は、2種のIRS−1ウサギポリクローナル抗体(C−20、C末端特異的;およびA−19、N末端特異的、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用い、インスリン処理マウスの筋肉からの細胞質ゾル画分を用いて上記のようにして行った。
【0072】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。事実、上記の記載から、本明細書に記載のものに加えて種々の本発明の変更が当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。種々の刊行物が本明細書中に引用されており、それらの開示内容は引用によりそれらの全文を本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、PTP−1B座の遺伝子ターゲッティングを示す。A)マウスPTP−1B遺伝子のゲノム構成およびターゲッティングベクターの設計。エキソンは枠で示し、活性部位システインを含むエキソン6は未充填である。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は次のように略す:B=BamHI;E=EcoRI;H=HindIII;Xb=XbaI;Xh=XhoI。下図は相同組換え事象のゲノム構造である。B)野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/−)およびホモ接合型(「ヌル」)(−/−)PTP−1B子孫を生じるヘテロ接合交雑からのBamHIで消化した尾部DNA上でPTP−1B 3′プローブを用いた代表的なゲノムサザンブロット。C)PTP−1B(+/+)、PTP−1B(+/−)およびPTP−1B(−/−)マウスからの肝臓膜サンプルのPTP−1Bイムノブロット分析。
【図2】
図2は、普通(すなわち、非高脂肪で非高炭水化物)の食餌を与えて自由に給餌させたPTP−1B(+/+)、PTP−1B(+/−)およびPTP−1B(−/−)マウス、および一夜絶食させたそれらマウスのブドウ糖レベルおよびインスリンレベル。A)のブドウ糖レベルおよびB)のインスリンレベルは、本明細書の実施例に記載のようにして測定した。マウスの数は、給餌群AおよびBでは(n=19〜21)であり、絶食群Aでは(n=8〜10)およびB群では(n=6)であった。値は平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行った。*、(P=0.06)、**、(P≦0.01)。
【図3】
図3は、普通(すなわち、非高脂肪で非高炭水化物)の食餌を与えたPTP−1B(+/+)(野生型)マウスおよびPTP−1B(−/−)(ヌル)マウスの耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験を示す。A)耐ブドウ糖能は10〜14週令の雄性マウス(n=11〜12)について行った;■=野生型;●=ヌル。B)耐インスリン能は10〜14週令の雄性マウス(n=5〜6)について行った;■=野生型;●=ヌル。データは平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行い、野生型と比較した。*、(P≦0.05)、**、(P≦0.02)。
【図4】
図4は、マウスPTP−1B遺伝子の破壊が普通(すなわち、非高脂肪で非高炭水化物)の食餌を与えたマウスにおけるインスリン受容体(IR)の過度で長期にわたるチロシンリン酸化を引き起こすことを示す。A)PTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスについて指示した時間にわたって肝臓においてインスリンチャレンジを行った後の、IR β−サブユニットについてのチロシンリン酸化の経時的変化を示す代表的なイムノブロット。イムノブロットからのインスリン受容体β−サブユニットホスホチロシンレベルの定量化はデンシトメトリーにより行った。データは、各動物について1分の時点でのホスホチロシンインスリン受容体β−サブユニットレベルを100%と設定し、同じ動物についてのその後5分の時点でのレべルをこの値と比較することにより表わす。結果は、3つの別個の実験から、それぞれ5匹のPTP−1B(−/−)マウスおよびPTP−1B(+/+)マウスからのものである。B)インスリン処理したPTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスからの筋肉におけるIR β−サブユニットのリン酸化レベルを示すイムノブロット。イムノブロット(n=3)からの定量データは、任意のデンシトメーター単位で、野生型マウスからの2分の時点のものを100と設定して示す。C)注射2分後の、インスリン処理したPTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウス(n=3)からの筋肉からのIRS−1イムノブロット。このイムノブロットに用いたSDSポリアクリルアミド(7.5%)ゲル(15cm×15cm)において、IRS−1は拡散した185kDのバンドとして移動した。データは平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行い、A)では1分の時点での値を5分の時点の値と比較し、B)ではPTP−1B(−/−)マウスの2分および6分の時点の値をPTP−1B(+/+)マウスのそれぞれの値と比較した、*(P≦0.05)。
【図5】
図5は、高脂肪高炭水化物食を与えたA)雄性およびB)雌性のヌルノックアウト、ヘテロ接合型ノックアウト、および野生型マウスの体重増加を示す。A)雄性マウス;◆=野生型、n=7;■=ヘテロ接合型、n=9;▲ヌル、n=8。B)雌性マウス;◆=野生型、n=9;■=ヘテロ接合型、n=9;▲ヌル、n=8。
【図6】
図6は、高脂肪高炭水化物食を与えたマウスにおけるブドウ糖およびインスリンチャレンジを示し、PTP−1B野生型マウスではインスリン抵抗性が生じ、PTP−1Bノックアウトマウスではインスリン抵抗性が相対的に欠如していることを実証している。高脂肪高炭水化物食を与えた雄性マウスにおけるA)耐ブドウ糖能試験およびB)耐インスリン能試験。◆=野生型、n=7;■=ヘテロ接合型、n=7(A)または8(B);▲ヌル、n=7。C)高脂肪高炭水化物食を与えたマウスの筋肉におけるインスリン刺激インスリン受容体チロシンリン酸化レベル[PTP−1B(−/−)およびPTP−1B(+/+)、n=2;PTP−1B(+/−)、n=3)。イムノブロットの定量化は図4に記載のようにして行った。*(P≦0.05)。
【図7】
図7は、PTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスにおけるインスリンチャレンジ後の脂肪中インスリン受容体のチロシンリン酸化レベルを示す。普通食を与えたマウスA)および高脂肪食を与えたマウスB)からの脂肪中のインスリン受容体ホスホチロシンのレベル。イムノブロットの定量化は、図4に記載のようにして、野生型マウスの3分の時点のものを100と設定した。データは、各群からの2匹のマウスの平均±標準偏差を表わす。
【図8】
図8は、PTP−1B(−/−)マウスの白色脂肪組織における脱共役タンパク質−1(uncoupling protein−1)および褐色脂肪細胞の誘導を示す。A)野生型マウス(n=2)およびPTP−1B(−/−)マウス(n=2)の腹部脂肪におけるUCP−1およびUCP−2 mRNA発現のノーザンブロット分析。B)野生型マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスからの鼡径部白色脂肪組織(IWAT)の組織学であり、PTP−1B(−/−)のIWATでは多房性脂肪細胞が誘導されることを示している。C)野生型マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスからの肩甲間褐色脂肪組織(IBAT)の組織学。野生型のIBAT脂肪細胞ではPTP−1B(−/−)マウスのIBATと比較して大きな脂肪小滴が見られることに注目されたい。
発明の分野
本発明は、破壊されたPTP−1B遺伝子を含むトランスジェニックマウスの分野に関する。このマウスは、PTP−1B遺伝子の一方または両者のコピーに破壊を含み得る。PTP−1B遺伝子の両コピーに破壊を含むマウスの場合、そのようなマウスは、PTP−1Bタンパク質の検出可能な発現が欠如している。
【0002】
発明の背景
プロテインチロシンホスファターゼ(PTPase)は、種々の調節プロセスに関与する基質を脱リン酸化する、膜貫通または細胞内酵素の大きな一群に属する(Fischerら, 1991, Science 253:401−406)。プロテインチロシンホスファターゼ−1B(PTP−1B)は、約50kdの細胞内タンパク質で、種々のヒト組織に多量に存在する(Charbonneauら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5252−5256;Goldstein, 1993, Receptor 3:1−15)。他のPTPaseと同様に、PTP−1Bは該酵素の活性にとって必須な、アルギニンおよびシステイン残基を含む配列モチーフ(I/V)HCXAGXXR(S/T)G(配列番号1)を特徴とする触媒ドメインを有する(Streuliら, 1990, EMBO J. 9:2399−2407;Guanら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1501−1505;Guan & Dixon, 1991, J. Biol. Chem. 266:17026−17030)。PTP−1Bアミノ末端の35個のアミノ酸残基のために、該タンパク質は小胞体に局在する(Frangioniら, 1992, Cell 68:545−560)。
【0003】
どのタンパク質がPTP−1Bの基質かを決定することは、かなり興味深いことである。特別な興味を起こさせる1つの基質はインスリン受容体である。インスリン受容体へのインスリンの結合は、該受容体の自己リン酸化をもたらし、最も顕著なものはキナーゼ触媒ドメインにおけるチロシン1146、1150および1151についてのものである(White & Kahn, 1994, J. Biol. Chem. 269:1−4)。これは、インスリン受容体チロシンキナーゼの活性化をもたらし、これはインスリンシグナリング事象をさらに下流へと伝播して、インスリンの種々の生物学的作用を媒介する種々のインスリン受容体基質(IRS)タンパク質をリン酸化する。
【0004】
Seelyら, 1996, Diabetes 45:1379−1385(Seely)は、in vitroにおけるPTP−1Bとインスリン受容体との関係を検討した。Seelyは、PTP−1B触媒ドメインに点突然変異を有するPTP−1BのグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、触媒的には不活性ではあるものの、精製した受容体調製物およびインスリン受容体を発現している細胞から誘導される全細胞溶解物からインスリン受容体を沈殿させるその能力により実証されるように、インスリン受容体に結合することができる。
【0005】
Ahmadら, 1995, J. Biol. Chem. 270:20503−20508は、浸透圧の負荷を用いてPTP−1B中和抗体をラットKRC−7肝ガン細胞に導入した。該細胞に該抗体が存在することにより、インスリン刺激DNA合成およびホスファチジイノシトール3′キナーゼ活性がそれぞれ42%および38%増大した。インスリン受容体の自己リン酸化およびインスリン受容体基質−1チロシンのリン酸化は、抗体負荷細胞(antibody−loading cells)においてそれぞれ2.2倍および2.0倍増大した。この抗体負荷細胞はまた、外因性ペプチド基質に対するインスリン刺激インスリン受容体キナーゼ活性において57%の増大を示した。
【0006】
本発明までは、PTP−1Bとインスリン受容体との相互作用の研究は、PTP−1Bの無細胞調製物または培養下の細胞系についての研究に限られていた。したがって、そのような研究は、PTP−1B活性が生きている哺乳動物におけるブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加に対して生理学的作用をもたらす様式でインスリン受容体の調節に影響を及ぼすか否かの問題に対処するものではなかった。インスリン受容体およびPTP−1Bのようなタンパク質とのその相互作用の調節は複雑で、生きている哺乳動物の環境とできるだけ近い環境でこの調節を研究することが必要である。本発明のノックアウトマウスは、この要件を満足するよう支援するのに有用である。本発明のノックアウトマウスはまた、それらが生きている哺乳動物においてインスリン受容体の活性をモジュレートする化合物の設計および評価に用い得る動物モデルを提供する、という点においても有用である。
【0007】
発明の概要
本発明は、標的化(ターゲッティング)した相同組換え法(targeted homologous recombination)により、PTP−1B遺伝子が破壊されているマウスを提供する。PTP−1B遺伝子の両コピーが破壊されている場合、該マウスは検出可能なPTP−1Bタンパク質を有しないが、生理学上は正常に見える。しかし、給餌状態において、該マウスは、野生型の同腹子よりもわずかに低いブドウ糖レベルおよび野生型の同腹子の半分の循環インスリンレベルを有する。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験(glucose and insulin tolerance tests)において、該マウスはインスリン感受性が増大している。高脂肪高炭水化物食を与えた場合、該マウスは、野生型の対照よりもずっとインスリン感受性が高いが、肥満抵抗性である。
また、該マウスおよび該マウスから誘導される細胞系を作製する方法も提供される。
【0008】
本発明はまた、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法、ならびにそのような方法により同定されるインヒビターを提供する。
【0009】
発明の詳細な説明
本発明の目的のために:
「トランスジェニックマウス」とは、サブ細胞レベルでの意図的遺伝子操作により(例えば、ターゲッティングした相同組換え、マイクロインジェクション、または組換えウイルスの感染により)直接的または間接的に改変または受容された遺伝情報を保有する1個以上の細胞を含む任意のマウスである。「トランスジェニックマウス」なる用語は、古典的な雑種形成(cross−breeding)または体外受精を包含しようとするものではなく、1個以上の細胞が組換えDNA分子により改変されているか組換えDNA分子を受容しているマウスを包含しようとするものである。トランスジェニックマウスは、遺伝子改変または遺伝情報が生殖細胞系に導入されていてもよく、それにより該遺伝情報を子孫に伝達する能力を賦与する。そのような子孫がその改変または遺伝情報のいくつかまたは全部を有する場合には、それらもまたトランスジェニックマウスである。
【0010】
「ノックアウトマウス」とは、予め選択した遺伝子のDNA配列のある部分を破壊するように働く新しいDNA配列をそのマウスのゲノムDNAに導入することにより、該予め選択した遺伝子の発現が抑制または排除されているマウスである。ノックアウトマウスは、破壊された該予め選択した遺伝子の両コピーを有してもよく、この場合、それはホモ接合型または「ヌル」ノックアウトマウスである。ノックアウトマウスはまた、破壊された該予め選択した遺伝子の一方だけのコピーを有してもよく、この場合、それは「ヘテロ接合型」ノックアウトマウスである。
【0011】
生物学的経路または疾患状態における特定の遺伝子の役割を決定する問題に対する一つのアプローチは、全能ES細胞において生来の野生型遺伝子を選択的に不活性化し、次いで該ES細胞を用いてトランスジェニックマウスを作製することである。そのようなトランスジェニックマウス(該特定の遺伝子が不活性化されている)は「ノックアウトマウス」として知られている。遺伝子ターゲッティングしたトランスジェニックノックアウトマウスの作製において遺伝子ターゲッティングしたES細胞を用いることは、例えばThomasら, 1987, Cell 51:503−512に記載されており、他にも概説されている(Frohmanら, 1989, Cell 56:145−147;Capecchi, 1989, Trends in Genet. 5:70−76;Baribaultら, 1989, Mol. Biol. Med. 6:481−492)。
【0012】
ターゲッティングした相同組換えを用いて特定の変化を染色体遺伝子に挿入することによる、任意の遺伝子領域を不活性化または実質的に任意の所望の突然変異へと改変するための技術が利用可能である。一般に、「ターゲッティングベクター」、すなわち突然変異させようとする遺伝子領域を部分的に含むプラスミドが用いられる。該プラスミドの該遺伝子領域のこの部分と染色体上の対応する遺伝子領域との相同性のために、相同組換えを用いて該プラスミドを該遺伝子領域に挿入し、それにより該遺伝子領域を破壊することができる。通常、ターゲッティングベクターは選択マーカー遺伝子も含む。
【0013】
相同染色体外組換え(これは100%に近い頻度で起こる)と比較して、相同プラスミド−染色体組換えは、かつて10−6〜10−3の頻度でしか検出されないと報告された(Linら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1391−1395;Smithiesら, 1985, Nature 317:230−234;Thomasら, 1986, Cell 44:419−428)。非相同プラスミド−染色体相互作用はそれよりも頻度が高く、同等の相同挿入よりも105倍(Linら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1391−1395)から102倍(Thomasら, 1986, Cell 44:419−428)高いレベルで起こる。
【0014】
マウスES細胞におけるターゲッティングした組換えのこの低比率を克服するために、極めて少ない相同組換え体を検出または選別するための種々の戦略が開発されてきた。相同改変事象を検出するための1つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、形質転換細胞のプールを相同挿入についてスクリーニングし、続いて個々のクローンをスクリーニングする(Kimら, 1988, Nucleic Acids Res. 16:8887−8903;Kimら, 1991, Gene 103:227−233)。あるいはまた、ポジティブ遺伝子選別法が開発されており、そこでは、相同挿入が起こった場合にだけ活性であり、かつこれらの組換え体を直接選別できるようにするマーカー遺伝子が構築される(Sedivyら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:227−231)。相同組換え体を選別するために開発された最も有効な方法の1つは、改変の直接的な選別が存在しない遺伝子用に開発されたポジティブ−ネガティブ選別(PNP)法である(Mansourら, 1988, Nature 336:348−352;Capecchi, 1989, Science 244:1288−1292;Capecchi, 1989, Trends in Genet. 5:70−76)。このPNS法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するために、高レベル発現の難しい遺伝子をターゲッティングする際により有効である。非相同組換え体は、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ(HSV−TK)遺伝子を用いて、ガンシクロビル(GANC)またはFIAU[1−(2−デオキシ2−フルオロ−B−D−アラビノフラノシル)−5−ヨードウラシル]のようなヘルペス薬を用いてその非相同挿入について選別することにより選別される。この逆選別(counter−selection)により、生存している形質転換体中の相同組換え体の割合を増大させることが可能になる。
【0015】
本発明は、ターゲッティングした相同組換えによりそれらのPTP−1B遺伝子が破壊されているマウスを提供する。PTP−1B遺伝子の両コピーが破壊されているマウス(「ヌル」マウス)の場合、該マウスは検出可能なPTP−1Bタンパク質を有していないが、生理学上は正常に見える。しかし、給餌状態において、該ヌルマウスは、それらの野生型同腹子よりもわずかに低いブドウ糖レベルおよび該野生型同腹子の半分の循環インスリンレベルを有する。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験において、該ヌルマウスは、インスリン感受性が増大している。さらに、インスリンを注射したヌルマウスの肝臓および筋肉においては、同様に処理した野生型マウスと比較してインスリン受容体のリン酸化が明らかに高くなっている。これらの結果から、PTP−1Bが生きている哺乳動物におけるインスリンシグナリング経路に関与し、インスリン受容体の脱リン酸化、ひいてはインスリン受容体の不活性化においてある役割を担うことが示される。
【0016】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、機能的PTP−1Bタンパク質を含まない細胞系の供給源として有用である。そのような細胞系は、ヒトPTP−1B遺伝子でトランスフェクトして、内因性マウスPTP−1Bの発現に伴う干渉を受けることなしにヒトPTP−1Bを発現する細胞系を得ることが可能である。そのような細胞系は、ヒトPTP−1Bのアクチベーターまたはインヒビターを同定するためのアッセイにおいて用い得る。したがって、本発明は、PTP−1Bノックアウトマウスに加えて、本発明のPTP−1Bノックアウトマウスから誘導される細胞系を提供する。そのような細胞系は、当業界で周知の方法により作製することができる(Williamsら, 1988, Mol. Cell. Biol. 8:3864−3871;Aaronson & Todaro, 1968, J. Cell. Physiol. 72:141−148;Jenkinsら, 1984, Nature 312:651−654)。
【0017】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、野生型マウスにおいてPTP−1Bに対する医薬の作用によりブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加をモジュレートする該医薬の作用をモニターするアッセイのネガティブ対照として有用である。そのようなアッセイのネガティブ対照としてPTP−1Bノックアウトマウスを使用すると、PTP−1B活性に対する医薬の作用によりもたらされると思われる、野生型マウスにおいて該医薬によりもたらされるブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加に対する作用が、実際に引き起こされることを判定することが可能になる。
【0018】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、インスリン受容体の弱いアゴニストを同定するためのアッセイにおいて有用である。これらのノックアウトマウスはPTP−1Bが欠失しているので、インスリン受容体のシグナルの低下に関与する重要なエレメントが欠失している。したがって、ノックアウトマウスにおいてPTP−1Bの不在下では、インスリン受容体の弱いアゴニストが同定でき、この場合、それら弱いアゴニストの作用はPTP−1Bの存在下では喪失している。そのような弱いアゴニストを先駆化合物(lead compound)として用いて、これを医化学的に修飾し、より強力で薬理学上有用なインスリン受容体のアゴニストを開発することができる。
【0019】
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、代謝または生理機能の種々の局面におけるインスリン受容体の役割の研究に有用である。例えば、該マウスをモニターして、PTP−1Bの喪失が寿命に何らかの影響を及ぼすか否かを決定することができる。C. elegansにおいて、遺伝子daf−2が突然変異すると、寿命に悪影響が生ずる。daf−2は、哺乳動物インスリン受容体の同族体(homolog)である。
【0020】
db/dbマウスは、糖尿病に罹患しているヒトの合併症に似た末梢神経障害および心筋疾患などの多くの合併症を発症する。本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、PTP−1B活性と糖尿病との関係をより良く研究するために、db/dbマウスと交雑させることが可能である。本発明のPTP−1Bノックアウトマウスは、他の化学的または遺伝的に誘導された糖尿病マウスモデルと同様にして用いることができる。
本発明のPTP−1Bノックアウトマウスにおいて、チアゾリジンジオンまたはスルホニル尿素のようなブドウ糖レベリング薬物の作用を調べることは興味深いことである。
【0021】
本明細書における、インスリン受容体のPTP−1B調節が肥満においてある役割を担うという実証に照らし、PTP−1Bノックアウトマウスにおいて、体重調節に関連しているレプチン(leptin)、メラノコルチン−4受容体、神経ペプチドY5受容体および他の分子種を調べることは興味深い。
【0022】
本発明のノックアウトマウスを作製するために、種々の方法を用いることができる。1つの方法は、導入遺伝子を標的細胞に導入し、次いでこれを胚盤胞(blastocyts)に組み込み、これを偽妊娠雌性マウスに移植することを含む。導入遺伝子の導入のための標的細胞の1つのタイプは胚性幹細胞(ES)である。ES細胞は、in vitroで培養した移植前の胚から得てもよい(Evansら, 1981, Nature 292:154−156;Bradleyら, 1984, Nature 309:255−258;Gosslerら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9065−9069;Robertsonら, 1986, Nature 322,445−448;Woodら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4582−4584)。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介トランスダクションなどの一般的な技法により、効率的にES細胞に導入できる。その後、得られた形質転換ES細胞はマウスからの胚盤胞と混ぜ合わせることができる。該胚盤胞を偽妊娠仮母親に移植した後、導入したES細胞は、該胚盤胞から発達する胚をコロニー化し、得られるキメラマウスの生殖系をもたらす(Jaenisch, 1988, Science 240:1468−1474)。
【0023】
本発明のノックアウトマウスを作製するのに用い得る別の方法は、導入遺伝子を受精卵の雄前核(male proinucleus)にマイクロインジェクションすることを含む(Brinsterら, 1981, Cell 27:223;Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5016;Sterwartら, 1982, Science 217:1046−1048;Townesら, 1985, EMBO J. 4:1715)。マイクロインジェクションした導入遺伝子は、該受精卵の雄前核のDNAに組み込まれる。次いで、該受精卵を、レシピエントである雌性マウスに移植し、発育させる。この手順がうまく行けば、得られる胚はその全細胞に該導入遺伝子を含むこととなる。場合によっては、該受精卵は、該導入遺伝子がゲノムに組み込まれる前に分割する。そのような場合、キメラ胚が生じる。そのようなキメラ胚は、それらの細胞の幾つか(全部ではない)に含まれる。
【0024】
本発明は、その細胞の少なくとも幾つかが、プロテインチロシンホスファターゼ−1B(PTP−1B)の変異形態をコードする改変遺伝子を含み、かつ該改変遺伝子がそのマウス内の野生型のPTP1B遺伝子を置換するようにターゲッティングされているマウスの作製方法であって、
(a) マウス胚性幹細胞のPTP−1B遺伝子をターゲッティングするように設計されたPTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を用意し;
(b) 該PTP−1Bの改変形態をコードする改変遺伝子をマウスES細胞に導入し;
(c) 該PTP−1Bの改変形態をコードする改変遺伝子が野生型PTP−1B遺伝子を破壊しているES細胞を選択し;
(d) ステップ(c)からの該ES細胞をマウス胚盤胞に注入し;
(e) ステップ(d)からの胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し;および
(f) 該胚盤胞を胚へと発達させ、該胚を産み月まで発達させて、その細胞の少なくとも幾つかがPTP−1の変異形態をコードする改変遺伝子を含むマウスを生産させる
ことを含む上記方法を提供する。
【0025】
上記の方法により作製されるマウスが、PTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を有する生殖細胞を含む場合、該マウスを交配させて、その体細胞ならびに生殖細胞の全てが該PTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を含んでいるマウスを生産させることが可能となる。PTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を含む生殖細胞を有するマウスは交配させて、それらのPTP−1B遺伝子の両コピーに破壊を含み、そのために検出可能なPTP−1B活性を全く有しないホモ接合型マウスすなわち「ヌル」マウスを得ることができる。
【0026】
本発明のノックアウトマウスは、野生型マウスと比較してブドウ糖代謝および脂肪代謝が改変されている。本発明のノックアウトマウスにおけるPTP−1B遺伝子破壊の効果は、PTP−1Bの活性の改変により、in vivo(すなわち生きている哺乳動物)におけるインスリンシグナリングがモジュレートされ得ることを実証している。本発明のノックアウトマウスはまた、PTP−1Bの活性の改変が体重増加に対しても効果を有することも実証している。これらの結果から、PTP−1Bの阻害がII型糖尿病(非インスリン依存性糖尿病、NIDDM)および肥満の治療に有益であることが示唆される。本発明により、生きている哺乳動物における食物代謝(fuel metabolism)の血中ブドウ糖およびトリグリセライドレベルまたは体重増加のような局面に対するPTP−1Bの効果が初めて実証された。本発明以前には、精製酵素調製物または組織培養細胞中でのPTP−1Bとインスリン受容体との相互作用により、生きている哺乳動物内でしか研究できないこれら作用を類推できるとは予想されなかった。したがって、本発明以前には、PTP−1Bとインスリン受容体との相互作用のインヒビターを用いて、生体哺乳動物内での血中ブドウ糖もしくはトリグリセライドレベルをモジュレートしたり肥満を調節できるとは、なかなか予想されなかった。何故ならば、哺乳動物における食物代謝の調節について組織培養物において行われた実験の妥当性が明らかでなかったからである。
【0027】
本明細書中で提示する研究以前には、PTP−1Bだけをノックアウトするというような簡単な変化により、本発明者らにより知見されたような飛躍的な効果が生ずるとは考えられていなかった。この理由は、インスリン受容体の作用が複合様式で調節されることが知られていたからである。この調節に関与する種々のクラスのタンパク質の中で、幾つかのプロテインチロシンホスファターゼ(PTPase)だけが関与することが知られていた。例えば、Kulasら, 1995, J. Biol. Chem. 270:2435−2438は、インスリン受容体の活性がPTPase LARによって負に調節されることを実証した。他にも、PTPase SH2−PTP(aka Syp)がインスリンの活性を正に調節することが実証されている(Xiaoら, 1994, J. Biol. Chem. 269:21244−21248;Milarskiら, 1994, J. Biol. Chem. 269:21239−21243;Yamauchiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:664−668;Noguchiら, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:6674−6682)。Hashimotoら, 1992, J. Biol. Chem. 257:13811−123814は、多くのプロテインチロシンホスファターゼがPTP−1Bと同じ位効率的にインスリン受容体をin vitroで脱リン酸化できることを実証している。多数の他の報告により、PTP−1B以外のPTPも活性化インスリン受容体を脱リン酸化し得ることが実証されている(Jacobら, 1998, J. Biol. Chem. 273:4800−4809;Chiarugiら, 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 238:676−682;Mollerら, 1995, J. Biol. Chem. 270:23126−23131)。
【0028】
インスリン受容体活性を調節するもののような複合調節機構が存在する場合、生体哺乳動物においてその機構の1成分をノックアウトするだけでは効果はほとんど期待薄と予期されたであろう。何故ならば、その1成分の量がそれ自体有意でなかったり、あるいは該調節機構の他の成分が該ノックアウト成分の欠如を補償して、インスリン受容体のバランスをその正常な状態へと回復させたと考えられたか、のいずれかであるからである。例えば、Ahmadら, 1995, J. Biol. Chem. 270:20503−20508、20508頁を参照されたい(彼らは、自分達の研究の結果を次のように要約している:インスリンのシグナリングは多くのPTPaseにより数段階で均衡をとっている…)。
【0029】
これらの予想に反して、本発明は、PTP−1B活性を変えることにより、生体哺乳動物においてインスリン受容体活性を調節することが可能であることを実証する。したがって、本発明のノックアウトマウスにより実証された結果に基づき、今や、生体哺乳動物内のインスリン受容体の活性をモジュレートするのに有用なPTP−1Bの酵素活性のインヒビター同定が実現可能である。そのようなインヒビターは、II型糖尿病および肥満の治療における利用性を有する。
【0030】
本発明の以前には、そのようなPTP−1Bのインヒビターは恐らくインスリン受容体に対して望ましい作用を有するかもしれないが、それらは薬理学的には有用ではないと考えられていた。何故ならば、PTP−1Bが、インスリン受容体の活性のモジュレーションにおけるその役割だけでなく、多くの必須の役割を有すると考えられていたからである。したがって、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターは、予想されるインスリン受容体に対する望ましい作用に加えて、あまりにも多くの有害な副作用を有し、薬理学的には有用ではないではと考えられていた。したがって、従来技術では、インスリン受容体へのPTP−1Bの結合のインヒビターは有用であるかもしれないが(何故ならば、そのようなインヒビターは、インスリン受容体に特異的な作用を有するからである)、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターは有用ではない(何故ならば、そのようなインヒビターは、より全般的な作用を有するからである)とされていた。例えば、国際特許出願WO97/32595、11頁、36行目〜12頁7行目:「ホスファターゼ活性は一般に細胞にとって必須なので、ホスファターゼ活性ではなく(インスリン受容体へのPTP−1Bの)結合を調節することが好ましい。」を参照されたい。従来技術がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターを用いるのを避けていた別の例は、米国特許第5,726,027号の請求項1に見ることができ、そこでは次のように書かれている:「ある組成物が、ホスファターゼ活性ではなく、リン酸化されたインスリン受容体に結合しているプロテインチロシンホスファターゼ1B(PTP1B)を阻害するか否かを判定する方法であって、該方法は………を含む」。
【0031】
PTP−1Bノックアウトマウスは、ブドウ糖およびトリグリセライド代謝が改変され、ならびに高脂肪高炭水化物食を与えた場合の改変された体重増加パターンが改変されていることを除けば、生理学的に正常である、という本発明による実証に鑑みれば、従来技術がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターには利用性がないとみなしたのは誤りであったことが明白である。本発明は、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターがII型糖尿病の治療および肥満の調節に利用性を有する可能性があることを明らかにした。したがって、本発明は、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法ならびにそのような方法により同定されたインヒビターを提供する。
【0032】
本発明は、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;および
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定すること;
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとする方法を提供する。
【0033】
もちろん、上記の方法は、ステップ(b)が、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質1種だけでなく、複数のPTP−1B酵素活性のインヒビターであると思われる物質を用いて行われるよう実施してもよい。この様式での該方法の実施の一例は、酵素的に活性なPTP−1Bの調製物に対する化合物のライブラリー(例えば、コンビナトリアルライブラリー)のスクリーニングである。そのような場合、典型的には、該ライブラリー中の物質のごく一部だけがPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることがわかる。該ライブラリーが大きい場合には、ステップ(b)での使用のために、それを便宜上化合物の小さな部分に分けてもよい。
【0034】
本発明は、PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;および
(c) 該PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定すること;
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質が該PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとする方法を提供する。
【0035】
上記の方法は、ステップ(c)が、PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる単独物質ではなく、PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる複数の物質を用いて行われるよう実施してもよい。この様式での方法の実施の一例は、化合物のライブラリー(例えば、コンビナトリアルライブラリー)のスクリーニングである。そのような場合、典型的には、該ライブラリー中の物質のごく一部だけがPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることがわかる。該ライブラリーが大きい場合には、ステップ(c)での使用のために、それを便宜上化合物の小さな部分に分けてもよい。
【0036】
ステップ(a)の細胞は、原核性もしくは真核性であってもよく、哺乳動物、両性類、細菌もしくは酵母のものであってもよい。好適であり市販されている哺乳動物種から誘導される細胞系としては、L細胞L−M(TK−)(ATCC CCL 1.3)、L細胞L−M(ATCC CCL 1.2)、293(ATCC CRL 1573)、ラジ(ATCC CCL 86)、CV−1(ATCC CCL 70)、COS−1(ATCC CRL 1650)、COS−7(ATCC CRL 1651)、CHO−K1(ATCC CCL 61)、3T3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(ATCC CRL 1658)、HeLa(ATCC CCL 2)、C127I(ATCC CRL 1616)、BS−C−1(ATCC CCL 26)およびMRC−5(ATCC CCL 171)が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、この細胞は、本発明のPTP−1Bヌルノックアウトマウスから誘導されている細胞である。
【0037】
トランスフェクションには、PTP−1Bタンパク質をコードするDNA配列を該細胞に導入するための当業界で公知の任意の方法を包含する。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、PTP−1Bタンパク質をコードするDNA配列を含むレトロウイルス構築物の感染、およびエレクトロポレーションが含まれる。
【0038】
PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定する方法は、当業界で公知の任意の方法により行うことができる。例えば、PTP−1Bによるインスリン受容体の脱リン酸化は、Maegawaら, 1995, J. Biol. Chem. 270:7724−7730のようにして測定できる。またHuyerら, 1997, J. Biol. Chem. 272:843−851を参照されたい。他の方法としては、例えばPTP−1Bを免疫沈降させることによる無傷の細胞内でのPTP−1Bの活性の測定、およびFDP、MUP、p−ニトロフェニルホスフェート、ホスホチロシルペプチドまたは32P/33P標識したリンペプチドもしくはリンタンパク質のような種々の人工基質を用いたその活性の測定が挙げられる。さらに、PTP−1Bの活性は、インスリン受容体だけでなくPTP−1Bの他の基質のホルホチロシル状態を追跡することにより測定できる。また、インスリン受容体が(肝臓においてのように)長期にわたってリン酸化されたままでいる場合、あるいはインスリン受容体が(筋肉においてのように)高リン酸化されている場合、インスリンカスケードに関与するタンパク質のリン酸化状態および該カスケードの生化学的作用は増大する。したがって、ブドウ糖の輸送、グリコーゲンの合成、アミノ酸の輸送、タンパク質の合成、インスリン受容体基質のリン酸化状態、P3Iキナーゼ活性、Aktキナーゼ活性などの因子を測定することにより、無傷の細胞中のPTP−1Bの活性を間接的に追跡することができる。
【0039】
上記の方法のステップ(c)において、トランスフェクトされた細胞はそのまま用いてもよいし、あるいはそれらをまず溶解させてもよく、該細胞の特定の画分または該細胞からのPTP−1Bタンパク質の部分精製または全精製した調製物を用いてもよい。
【0040】
上記の方法により同定された物質は、それら物質がPTP−1Bの酵素活性の特異的なインヒビターである場合、すなわちそれら物質が別のプロテインチロシンホスファターゼの活性を阻害しない場合に特に有用である。したがって、通常、上記の方法により同定されたインヒビターを取り出し、さらにLAR、syp、CD45等の他のプロテインチロシンホスファターゼに対してそれらをスクリーニングすることは意義がある。
【0041】
PTP−1B酵素活性のインヒビターを同定する上記の方法は、同法で同定された物質がII型糖尿病および関連する合併症の治療または肥満の調節に用い得るか否かを判定する方法となるように変更してもよい。これは、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターとして同定された物質を取り出し、それらの物質が哺乳動物(例えばマウス、ラットもしくはヒト)におけるブドウ糖レベルもしくはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否か、またはそれらの物質が高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物(例えばマウス、ラットもしくはヒト)における肥満を予防もしくは軽減するか否かを判定することを必要とする。
【0042】
したがって、本発明は、ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定し、それにより、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(c) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(d) ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする方法を提供する。
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
【0043】
本発明は、上記の方法により同定された物質を提供する。そのような物質は、ヒトのII型糖尿病および関連する合併症の治療における利用性を有することが期待される。
【0044】
本発明は、ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定し、それにより、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(c) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(d) ステップ(c)の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合のステップ(c)の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ(c)の哺乳動物の体重増加を、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする方法を提供する。
【0045】
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
本発明は、上記の方法により同定された物質を提供する。そのような物質は、ヒトの肥満の調節における利用性を有することが期待される。
【0046】
本発明は、ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;
(c) PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(d) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(e) ステップ(d)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ(d)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする方法を提供する。
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
【0047】
本発明は、ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;
(c) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(d) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(e) ステップ(d)の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合の該ステップ(c)の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ(d)の哺乳動物の体重増加を、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ(d)の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする方法を提供する。
【0048】
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
本発明は、上記の方法により同定されたPTP−1Bの酵素活性のインヒビターを包含する。そのようなインヒビターは多くの用途を有する。例えば、そのようなインヒビターは、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを肥満哺乳動物に投与することを含む肥満の治療方法において使用可能である。そのようなインヒビターはまた、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターをII型糖尿病に罹患しているヒトに投与する等、II型糖尿病および関連する合併症の治療方法においても使用可能である。
【0049】
そのようなインヒビターは、通常、使用前に製剤上許容される担体と混ぜ合わせる。そのような担体、ならびにインヒビターと担体とを含有する製薬上許容される組成物の配合方法は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesに見ることができる。有効な投与に適する製薬上許容される組成物を形成するためには、そのような組成物は有効量の該インヒビターを含有する。
【0050】
治療用または予防用組成物は、肥満またはII型糖尿病の治療または予防に有効な量で個体に投与される。この有効な量は、個体の症状、体重、性別および年齢のような種々の要因に応じて様々に異なり得る。他の要因としては、投与形態が挙げられる。適切な量は、習熟した医師であれば決定できる。
組成物は単独で適切な投与量にて用いることができる。あるいはまた、他の薬物の同時投与または連続投与も望ましいものであり得る。
【0051】
該組成物は、慣用の投与用ビヒクル中での多種多様な治療剤型で投与できる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤(それぞれ、間歇放出処方および持続的放出処方を含む)、丸剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳濁剤のような経口剤型で、または注射により投与可能である。同様に、それらはまた、静脈内(ボーラスまたは輸液の両者)、腹腔内、皮下、収蔵(occlusion)を伴うもしくは伴わない局所的、または筋肉内の形態(それらは全て、製剤技術分野の当業者には周知の形態を用いる)で投与してもよい。
【0052】
有利には、組成物は単回日用量で投与してもよく、または総日用量を1日2回、3回または4回の分割用量で投与してもよい。さらに、組成物は、適切な鼻腔内用ビヒクルの局所的使用により、または当業者に周知の経皮用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路により鼻腔内の形態で投与してもよい。経皮送達システムの形態で投与されるためには、用量の投与は、もちろん投与レジュメ全体を通して断続的ではなく連続的である。
【0053】
該組成物を用いる投与レジュメは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的症状;治療しようとする症状の重篤度;投与経路;患者の腎機能、肝機能および心臓血管機能;用いるその特定の組成;などの種々の要因に応じて選択される。熟練した医師または獣医師であれば、症状の進行を予防、抑制(counter)または阻止するのに必要な該組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。毒性を伴わずに効力をもたらす範囲内の組成物濃度を達成する上での最良の正確さには、標的部位への該組成物の利用可能性の動態に基づくレジュメが必要である。これには、組成物の分布、均衡および排除を考慮することが含まれる。
本発明をより良く説明するために、以下の非限定的実施例を示す。
【0054】
実施例1
ターゲッティングベクターの構築
ターゲッティングベクターを構築するために、マウスPTP−1B遺伝子を129/Svマウスゲノムライブラリーからクローニングし、特性決定した。このマウスPTP−1B遺伝子は、ヒト(GenBank受託番号M317324;Chernoffら, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2735−2739も参照されたい)およびマウス(GenBank受託番号M97590;Miyasakaら, 1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 185:818−825も参照されたい)のPTP−1B cDNAをプローブとして用いて、ラムダFIX II 129/SvJマウスのゲノムライブラリー(Stratagene, La Jolla, CA)をスクリーニングすることにより単離する。オーバーラップしている3つのλクローンを単離し、マウスPTP−1B遺伝子のゲノム構成およびエキソン配列を決定した。この3つのλクローンは、該cDNAの5′隣接領域および最初の190bpを除くPTP−1B遺伝子の大部分を含んでいた(図1A)。この遺伝子は、20kb以上にも及ぶ少なくとも9のエキソンからなる。ターゲッティングベクター(図1A)は、エキソン5およびエキソン6(これはチロシンホスファターゼ活性部位であるシステイン215を含む)を含むゲノム配列を欠失させ、この欠失配列をネオマイシン耐性遺伝子で置き換えて得た。これは、PGKプロモーターにより駆動されるneoマーカー遺伝子(PGK−neo)をpBluescript KS+(Stratagene, La Jolla, CA)のSmaI部位にクローニングすることにより達成した(pneoKS)。次に、この5.5kbのHindIII/EcoRIマウスPTP−1Bゲノム断片(エキソン5のすぐ5′側)を、HindIII/EcoRI消化pneoKSに挿入した。次に、このベクターをXbaIおよびNotIで消化し、1.6kbのXbaI/XhoIマウスPTP−1Bゲノム断片(エキソン6のすぐ3′側)およびPGKプロモーター断片により駆動されるXhoI/NotI HSV−tk遺伝子と連結させた。得られたターゲッティングベクター(pTARGET)はHindIII消化により線状にした。
【0055】
実施例2
ノックアウトマウスの作製
該ターゲッティングベクターを129/Sv胚性幹細胞(J1)にエレクトロポレーションし、先に記載(You−Tenら, 1997, J. Exp. Med. 186:683−693)のようにしてG418耐性コロニーを選択した。J1細胞は、単に説明のためのもので、例えばES−D3細胞(ATCCカタログ番号CRL−1934)のような他の胚性幹細胞系も適する。ゲノムDNAをBamHI消化した後でサザンブロッティングおよびプローブAを用いたハイブリダイゼーションにより、G418に耐性のコロニーを相同組換えについて分析した。プローブAは、図1Aで「3′プローブ」として示す800bpのXhoI/BamHI断片である。耐性コロニーの約2%が相同組換え事象を示す。次に、これらのG418耐性ES細胞クローンの2つを、先に記載(You−Tenら, 1997, J. Exp. Med. 186:683−693)のようなBalb/c胚盤胞へにマイクロインジェクションに用いた。各系統について生殖系の伝達(germline transmission)が得られ、F1ヘテロ接合体を交配させて、PTP−1B突然変異についてホモ接合型の動物(すなわちヌルマウス)を得た。サザンブロッティングにより遺伝子型決定を行った(図1B)。PTP−1Bヘテロ接合型マウスではマウス3.4kbおよび2.7kbの2本のバンドが見え、PTP−1Bヌルマウスでは1本の2.7bkのバンドが見える。肝臓ミクロソームのイムノブロット分析により、PTP−1BヌルマウスにはPTP−1Bタンパク質が存在しないことが明らかになった(図1C)。これらの結果から、PTPヌルマウスにはPTP−1B酵素が欠失していることが実証される。
【0056】
実施例3
普通食を与えたノックアウトマウスにおけるブドウ糖レベルおよびインスリンレベル
絶食させたマウスおよび普通の(すなわち非高脂肪で非高炭水化物の)食餌を与えたマウスにおいてブドウ糖レベルおよびインスリンレベルを測定した(図2)。給餌状態において、ヌルマウスは、血中ブドウ糖レベルにおいて野生型マウスと比較して有意な(P≦0.01)13%の低下があったが、ヘテロ接合体では野生型と比較した場合に8%の低下であった(図2A)。驚くべきことに、ヌルマウスはまた、循環インスリンレベルが野生型の給餌マウスの場合の約半分であった(図2B)。これらの結果から、給餌PTP−1B欠失マウスは、インスリンに対して一層感受性であり、その結果、非常に少ないインスリンに応答してブドウ糖が大きく低下することが示唆される。絶食状態では、野生型、ヌルおよびヘテロ接合型マウスの間ではブドウ糖レベルにもインスリンレベルにも有意な差はなかった。しかし、PTP−1Bヌルマウスおよびヘテロ接合型ノックアウトマウスでは、絶食状態において、野生型マウスと比較した場合にトリグリセライドレベルの実質的な低下があった。絶食させたヌルマウスにおけるトリグリセライドレベル(0.86±0.18mM/L)は、野生型マウスの場合(1.84±0.76mM/L)よりも約50%低く、ヘテロ接合体(1.43±0.44mM/L)では20%低かった。表1を参照されたい。
【0057】
【表1】
表1.普通食または高脂肪高炭水化物食を与えた雄性PTP−1B(−/−)、野生型およびヘテロ接合型の同腹子の空腹時ブドウ糖、トリグリセライドおよびインスリンレベル。値は平均±標準偏差として示す。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行い、野生型と比較した。ND、測定せず。†(P=0.1)、*(P<0.05)(n=6〜10)。
【0058】
給餌状態におけるトリグリセライドレベルは影響を受けなかった。これらのデータから、ノックアウトマウスではPTP−1Bの喪失がブドウ糖およびトリグリセライドのホメオスタシスに影響を及ぼすことが実証され、このことは初めて、無傷の哺乳動物のインスリンシグナリング経路においてPTP−1Bを強く関連付けた。
【0059】
普通食を与えたPTP−1Bヌルマウスおよび野生型マウスのインスリン感受性を、経口耐ブドウ糖能試験および腹腔内耐インスリン能試験を行うことによりさらに調べた。ブドウ糖のボーラスをPTP−1Bヌルマウスに投与したところ、野生型マウスで観察されたものよりも迅速なブドウ糖のクリアランスが起こった(図3A)。野生型動物では、PTP−1Bヌルマウスと比較した場合、胃管栄養法(gavage)後の全ての時点においてより顕著な高血糖があった。インスリンを注射した際には、インスリン感受性の増大も見られた(図3B)。ヌルマウスおよび野生型マウスのいずれでも、注射の30分後および60分後では低血糖が明らかになった。野生型のブドウ糖レベルは120分後に正常レベルに近づいたが、PTP−1Bヌルマウスは低血糖のままであった(P<0.02)。
【0060】
実施例4
ノックアウトマウスにおけるインスリン受容体およびインスリン受容体基質 −1 のチロシンリン酸化
PTP−1Bがin vivoでの(すなわち、哺乳動物生体内での)インスリン受容体のリン酸化に影響を及ぼすかを判定するため、インスリンチャレンジ後にノックアウトマウスおよび野生型マウスの両者につき、インスリン受容体のホスホチロシンレベルを測定した。インスリンはボーラスとして下大静脈に注射し、注射後の各時点で組織サンプルを採取して、インスリン受容体の脱リン酸化の経時的変化を測定した。次に、インスリン受容体β−サブユニットを組織ホモジネートの膜画分から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットして、インスリン受容体のリン酸化レベルを求めた。次に、該ブロットをストリップし、C末端β−サブユニット抗体で再プローブして該ブロット上の該β−サブユニットの量を求め、ホスホチロシンシグナルを該β−サブユニットの量に対して正規化した。ヌルマウスおよび野生型マウスの両者とも、肝臓または筋肉において、インスリン不在下でのインスリン受容体リン酸化のレベルは非常に低かった(図4AおよびB)。野生型マウスをインスリン処理したところ、肝臓におけるインスリン受容体のチロシンリン酸化レベルは飛躍的に増大し(図4A)、これは、注射後5分(図4A)までに1分の時点のレベルの約50%まで低下した(P<0.05)。肝臓におけるインスリン受容体リン酸化のこの経時的変化は、先にt1/2が6分のラットにおいて観察されていた(Rothenbergら, 1991, J. Biol. Chem. 266:8302−8311)。しかし、同様に処理したヌルマウスでは、肝臓におけるインスリン受容体リン酸化の動態は、野生型マウスにおいて見られるものとは有意に異なっていた。即ちインスリン受容体リン酸化のレベルは、注射1分後ではヌルマウスおよび野生型マウスの両者とも同じであったが、ヌルマウスにおいては注射5分後のチロシンリン酸化のレベルが野生型マウスとは違って低下せず、1分の時点のレベルと実質的に同じであった(P<0.05)。このヌルマウスにおけるインスリン受容体の高リン酸化持続から、これらのマウスではインスリン受容体もまた、より長期にわたって活性化されたままであったことが示唆される。しかし、インスリン受容体の高リン酸化に対する最も顕著な作用は、ヌルマウスの筋肉において見られた。インスリン処理したヌルマウスからの筋肉サンプ
ルにおけるインスリン受容体のホスホチロシンレベルの分析から、野生型の筋肉でのレベルと比較して、絶対的リン酸化レベルにおいて約40%の増大があったことが明らかになった(P<0.05)(図4B)。肝臓でのレベルと同様に、筋肉におけるインスリン受容体リン酸化のレベルは、ヌルマウスにおいても野生型マウスにおいても実験の経過時間にわたって低下しなかった。筋肉で見られるインスリン受容体の高リン酸化が、ヌルマウス内でのインスリン受容体の過剰発現によるものである、という可能性はほとんどない。何故ならば、全組織溶解物のイムノブロティングにより測定したところ、野生型マウスおよびヌルマウスのいずれにおいてもインスリン受容体の発現レベルに検出可能な差異は見られなかったからである。ヌルマウスにおける筋肉でのインスリン受容体リン酸化のこの実質的な増大および肝臓でのインスリン受容体の持続的リン酸化は、これらのマウスにおけるインスリン感受性増大の最も可能性の高い要因である。このことはまた、(特に筋肉における)in vivoでのPTP−1Bの基質が活性化されたインスリン受容体であることを示唆しているようでもある。
【0061】
インスリン処理したヌルマウスの筋肉におけるインスリン受容体の高リン酸化がキナーゼ活性の増大につながることを確認するために、注射2分後のサンプルにおいてインスリン受容体基質−1(IRS−1)のホスホチロシンレベルを調べた(図4C)。IRS−1は、インスリン処理したヌルマウスの筋肉では、野生型マウスと比較して、高リン酸化された(P<0.05)。さらに、肝臓におけるIRS−1脱リン酸化の経時変化はインスリン受容体よりもさらに迅速であり、わずか2〜3分以内でベースラインレベルまで回復することがわかっている(Rothenbergら, 1991, J. Biol. Chem. 266:8302−8311)。にもかかわらず、2分の時点でのレベルと同レベルのIRS−1の高リン酸化は、注射6分後のヌル筋肉サンプルにおいても明らかであった。
【0062】
実施例5
高脂肪高炭水化物食を与えた PTP−1B ノックアウトマウスにおける肥満抵抗性
高脂肪高炭水化物食を与えた野生型マウスは肥満になり、肥満誘導性のインスリン抵抗性を呈する(Uysalら, 1997, Nature, 389:610−614)。雄性および雌性PTP−1Bノックアウトマウス(ヘテロ接合体ならびにヌル)(7〜8週令)に高脂肪高炭水化物食(脂肪から50%のカロリー、5,286kcal kg−l、Bio−Serv F3282マウス餌料、Bioserv. Frenchtown, NJ)を与えた。対照として、野生型マウスに同じ食餌を与えた。この給餌の10週間後、雄性および雌性の野生型同腹子は共に肥満になったが、PTP−1B(−/−)マウスおよびPTP−1B(+/−)マウスは食餌誘導性肥満から有意に防御された(図5)。給餌した動物の出発時の体重には有意な差はなかったが(雄、+/+、27.6±1.4g;+/−、28.5±1.2g;−/−、26.3±1.2g;および雌、+/+、22.1±0.8g;+/−、22.2±0.8g;−/−、21.5±0.8g)、PTP−1Bヘテロ接合体およびヌル動物の両者と比較した場合の野生型マウスの最終体重(雄、+/+、41.4±1.3g;+/−、37.2±2.0g;−/−、33.5±1.6g;および雌、+/+、33.3±1.7g;+/−、27.3±1.3g;−/−、27.2±1.4g)は顕著な有意差を示した(ヘテロ接合型もしくはヌルに対する野生型ではP<0.05、但し、雌性のヘテロ接合体に対する野生型ではP=0.1であった)。給餌において全ての動物群で消費された食餌の量は異なっておらず、このことから、PTP−1Bの発現レベルの変化(ヘテロ接合体は野生型のPTP−1B発現レベルの約半分である、図1C)が食餌誘導肥満の発症に影響を及ぼし得ることが示唆される。
【0063】
高脂肪高炭水化物食がPTP−1B(+/+)マウス、PTP−1B(+/−)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスにおけるインスリン感受性に影響を及ぼすかを調べるために、全ての動物群について空腹時ブドウ糖およびインスリンレベル、ならびに耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験を行った(上記の表1および図6;雄の値だけが示してある、雌の値はほとんど同じ結果をもたらした。)。PTP−1B(+/+)マウスでは、高脂肪高炭水化物食により、空腹時ブドウ糖レベルは30%増大し、空腹時インスリンレベルは3倍増大した(表1)。これに対して、PTP−1B(−/−)動物は低いブドウ糖レベルおよびインスリンレベルを維持し、一方、高脂肪食では、普通食の場合の値と比較してレベルには有意な差異はない(表1)。これらの結果から、野生型同腹子では高脂肪食がインスリン抵抗性を引き起こすが、PTP−1B(−/−)マウスではそうではないことが示される。脂肪を給餌したPTP−1Bヘテロ接合体も高い空腹時インスリンレベルを示したが、野生型よりも低い空腹時ブドウ糖レベルを有していた(表1)。PTP−1B(−/−)マウスではまた、耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験の両者において、それらの野生型同腹子と比較してインスリン感受性の増大も見られ(図6AおよびB)、PTP−1B(+/−)マウスは中間の感受性を示すと思われる。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験により測定した場合のPTP−1B(−/−)マウスとPTP−1B(+/+)マウスとのインスリン感受性の差異は、高脂肪食においてさらに一層明らかになった(図3AおよびBを図6AおよびBと比較せよ)。このことはまた、高脂肪高炭水化物食を給餌したマウスにおいてインスリンチャレンジを行った後で筋肉内のインスリン受容体のチロシンリン酸化レベルを測定した場合にも同様であった(図6C)。高脂肪食が筋肉および脂肪組織において肥満に関連するインスリン受容体シグナリングの低下を引き起こすことが示されている(Uysalら, 1997, Nature, 389:610−614)。図4Bにおいて、普通食を与えたマウスのインスリン刺激により、PTP−1B(−/−)の筋肉では、PTP−1B(+/+)マウスと比較して約40%のインスリン受容体のホスホチロシンレベル増大が起こった。高脂肪食により、野生型マウスとPTP−1B(−/−)マウスとのインスリン感受性のこの差異は、PTP−1B(−/−)マウスが野生型よりも約4倍高いインスリン受容体リン酸化レベルを有し、一方PTP−1B(+/−)マウスが中間の(野生型よりも約2倍高い)レベルを示す程度まで拡大した(図6C)。高脂肪食を与えたPTP−1B(+/+)マウスでは、予想通りの表現型(つまり肥満およびインスリン抵抗性)が見られた。これに対して、PTP−1B(+/−)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスは、それらが肥満の発症に抵抗性であったという点で予想外の表現型を示した。PTP−1B(−/−)マウスではインスリン感受性は維持され、PTP−1B(+/−)マウスはPTP−1B野生型マウスおよびヌルマウスと比較して中間の感受性を示した。
【0064】
高脂肪高炭水化物食を与えたマウスにおける上記の結果から、PTP−1Bノックアウトマウスがこの食餌を与えた場合にインスリン感受性が維持されることが実証される。事実、それらはそれらの野生型同腹子よりもずっとインスリン感受性が高い。したがって、PTP−1Bノックアウトマウスは、高脂肪高炭水化物食を与えた場合に(野生型マウスよりも高くないとしても)少なくとも野生型マウスと同程度には肥満に罹り易いと予想された。何故ならば、それらのインスリン感受性の増大は、脂質生成の増大を誘発すると予期されたからである。しかし、下記の実験は、全く反対のことが起こったことを示している。
【0065】
高脂肪高炭水化物食を与えたPTP−1Bノックアウトマウスおよび野生型マウスの体重、ならびに該マウスが消費した食餌の量を各週毎に測定した。食餌の消費においては、野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ヌルマウスの間で本質的に差異はなかった。高脂肪高炭水化物食を与えた10週後、野生型マウスでは約50%体重増加し;ヘテロ接合型およびヌルマウスでは共に約25〜30%体重増加した。したがって、ノックアウトマウスでは、高脂肪高炭水化物食を与えた場合、野生型の体重増加の約半分であった。図5を参照のこと。これらの結果から、 PTP−1Bが肥満においてある役割を担うこと、およびPTP−1Bの酵素活性のインヒビターが肥満の調節において薬理学上有用であることが示される。
【0066】
実施例6
PTP−1B −/− マウスの白色脂肪組織における脱共役タンパク質の誘導
PTP−1B(−/−)マウスにおける肥満抵抗性の理由を調べるために、高脂肪食または普通食のいずれか一方を与えたマウスの空腹時トリグリセライドレベルを測定した。いずれの食餌を与えたPTP−1B(−/−)マウスも、野生型マウスおよびヘテロ接合型マウスよりも有意に低いトリグリセライドレベルを有していた。PTP−1B(+/−)マウスは、普通食を与えた場合は野生型マウスよりもわずかに低いトリグリセライドレベルを有していたが、高脂肪高炭水化物食を与えた場合は野生型と比較して差がなかった。この結果から、PTP−1Bの喪失が脂肪の代謝に影響を及ぼすことが示される。したがって、普通食または高脂肪食を与えた動物においてインスリンチャレンジを行った後で、脂肪組織内のインスリン受容体のホスホチロシンレベルを調べることとした。インスリン受容体の高リン酸化を示した肝臓および筋肉とは反対に、PTP−1B(−/−)マウスからの脂肪では、野生型と比較してインスリン受容体の低リン酸化があると思われ、このことは、PTP−1B(−/−)マウスの脂肪組織がある程度インスリン抵抗性であることを示唆している(図7A)。このことについての支持は、高脂肪食を与えた野生型マウス(インスリン抵抗性である)がここでは、脂肪組織において基本的にPTP−1B(−/−)マウスのものと同等のインスリン受容体リン酸化レベルを有している、という事実からくるものである(図7B)。したがって、PTP−1B欠失マウスは、組織特異的なインスリン感受性を示すと思われる。野生型マウスと比較して、肝臓および筋肉はより感受性が高いが、脂肪組織は抵抗性であると思われる。
【0067】
PTP−1B(−/−)マウスの脂肪組織における改変されたインスリンシグナリングは、これらの動物で見られる肥満抵抗性に関与する要因の1つであると思われる。脂肪細胞にインスリンが作用することにより、cAMPレベルの低下および脂質生成の刺激が起こる(Manganielloら, 1996, Curr. Top. Cell. Regul. 34:63−100)。PTP−1B欠失マウスにおいて、脂肪細胞はインスリン応答性の低下を有し、その結果、脂肪形成に対して抵抗性になる。βアドレナリン作用性受容体活性の作用によりcAMPレベルを増大させること、あるいは遺伝子ノックアウトによりプロテインキナーゼA(PKA)調節サブユニットを改変することのいずれかによるPKAの活性を増大させることが、脱共役タンパク質−1(UCP−1)の誘導により肥満抵抗性をもたらすことは十分に実証されている。UCP−1は、BATにおいて脂肪酸の酸化を脱共役(decouple)するミトコンドリアタンパク質トランスロケーターである。このことにより、ATP形成ではなく、脂肪酸の分解に由来するエネルギーが熱として放散され、したがって、身体の休止中の代謝速度を高める[Handbook of Obesity (Bray, G.A.編, Bouchard, C. & James, W.P.T.)のHimmis−Hagen & Ricquire, 1998, “Brown Adipose Tissue”, 415−441頁(Marcel Dekker Inc., New York;Cummingsら, 1996, Nature 382:622−626]。脂肪組織内の改変されたイスリン受容体活性のためにPTP−1B活性の喪失がPTP−1B(−/−)マウスの脂肪組織内のcAMPレベルに影響を及ぼしているならば、このことがPTP−1B(−/−)マウスにおいて見られた肥満抵抗性の表現型を説明できる。ノーザンブロット分析を行って、UCPがPTP−1B野生型マウスおよびヌルマウス(普通食)の白色脂肪組織(WAT)において誘導されるか否かを調べた。2匹の別個のPTP−1B(−/−)マウスの腹部WATにおけるUCP−1 mRNAの誘導が明らかになったが、それはPTP−1B(+/+)のWATでは検出不能であった(図8A)。UCP−2 mRNAレベルは、野生型マウスとPTP−1B(−/−)マウスとでは変わらなかった(図8A)。UCP−1 mRNAは、褐色脂肪細胞においてのみ発現され、白色脂肪デポーにおけるその発現は、この脂肪デポーにおいて褐色脂肪が誘導されたことを示す(Ghorbaniら, 1997, Biochem. Pharmacol. 54:121−131)。野生型マウスからの鼡径部WATの組織学的分析では、予想どおりの典型的な大きな単房性脂肪細胞が示された(図8B)。これに対して、PTP−1B(−/−)マウスからの鼡径部WATはより多数の小さな単房性脂肪細胞を含んでおり、そしてより重要なことに、通常この脂肪デポーでは見られない多数の多房性脂肪細胞が存在することが明らかになった(図8B)。この多房性脂肪細胞は褐色脂肪の特徴を示し、このことはPTP−1B(−/−)WATで見られたUCP−1 mRNAの発現と一致する。免疫学的染色により、PTP−1B(−/−)マウスからの鼡径部WAT内の多房性細胞は、UCPタンパク質について陽性に染色された。肩甲間のBAT(IBAT)を調べたところ、PTP−1B(+/+)マウスがPTP−1B(−/−)マウスにおいて見られるものよりも大きな脂質小滴を有する脂肪細胞を含むことが明らかになった(図8C)。
【0068】
実施例7
ブドウ糖およびインスリンの測定
麻酔したマウスの眼窩洞から血液を採取し、血清を調製した。Vitros250アナライザーを用いて血清中ブドウ糖レベルを測定し、およびラジオイムノアッセイ(Linco, St. Charles, Missouri)を用いてインスリンレベルを測定した。
【0069】
麻酔した雄性マウス(10〜14週令)において、一夜絶食させた後、胃管栄養法により1g/kgのブドウ糖を投与することにより耐ブドウ糖能を行い、t=0、30、60および120分の時点で血液を採取した。血漿を調製し、使用するまで凍結し、血清中ブドウ糖レベルを測定した。一夜絶食させた後で、0.75U/kgのレギュラーヒトインスリン(Eli Lilly, Indianapolis, IN)の腹腔内注射により耐インスリン能試験を行った。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験の両者のために、マウスの尾部から血液を採取し、1滴の血液をOne Touch Stripブドウ糖アッセイ装置にのせ、ブドウ糖レベルを対応するOne Touch Basic(Lifescan Canada Ltd., Burnaby, British Columbia, Canada)にモニターした。
【0070】
実施例8
インスリン受容体リン酸化の in vivo 分析
一夜絶食させた後、マウスを麻酔し、腹腔を暴露し、5単位のレギュラーヒトインスリン(Eli Lilly, Indianapolis, IN)または食塩水をボーラスとして下大動脈に注射した(Arakiら, 1994, Nature 372:186−190)。注射1分後、肝臓の小片を切り取り、直ちに液体窒素中で凍結した。注射の約2分後、四頭筋および腹部の脂肪の一片を切り取り、素早く凍結した。これを、肝臓、筋肉および脂肪についてそれぞれ注射の5、6および7分後にもう一度繰り返し、次いで該マウスを回復する前に犠牲にした。
【0071】
実施例9
免疫沈降およびイムノブロット分析
野生型、ヘテロ接合型およびヌルマウスの肝臓の膜画分(25μg/レーン)におけるPTP−1B発現のイムノブロット分析を、N末端特異的(アミノ酸43〜56)PTP−1Bウサギポリクローナル抗体(UBI)を用いて行った。増強化学発光(NEN)を用いてブロットを発色させた。インスリン受容体β−サブユニットの免疫沈降は次のようにして行った。肝臓、脂肪または筋肉のいずれかの組織を氷上で、50mM Tris pH 7.5、150mM NaCl、1mM ピロホスフェート、100μMパーバナデート(pervanadate)(強力なPTPaseインヒビター;Huyerら, 1997, J. Biol. Chem. 272:843−851)およびプロテアーゼインヒビター溶液(Boehringer Mannheim)中でホモジナイズした。膜画分は100,000×gで1時間遠心分離することより調製し、タンパク質濃度を求めた。200μgの肝臓もしくは筋肉膜タンパク質、または100μgの脂肪膜タンパク質を免疫沈降用緩衝液(RIPA)(150mM NaCl, 10mMリン酸緩衝液 pH 7.5、1%NP−40、1%Naデオキシコレート、0.1%SDS)中に溶解し、インスリン受容体β−サブユニットの免疫沈降を1μgの抗インスリン受容体抗体(C−19)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用いて4℃にて一夜行い、続いてプロテインGセファロース(Pharmacia Biotech)の50%スラリー50μlを60分間インキュベートした。該サンプルを1mlのRIPA緩衝液で3回洗浄し、サンプルを8%SDS PAGEにかけた。該サンプルをPVDF膜に移し、ホスホチロシンの免疫検出(immunodetection)を抗ホスホチロシン4G10西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体(Upstate Biotech)を用いて製造業者推奨手順に従って行った。同じブロットを62.5mMのTris pH 6.7、2%w/v SDS、100mM β−メルカプトエタノール中で55℃にて30分間ストリップし、洗浄し、抗インスリンβ−サブユニットRb(C−19、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)で再プローブした。次に、ホスホチロシンシグナルおよびβ−サブユニットレベルをデンシトメトリー(Molecular Dynamics)により定量し、ホスホチロシンレベルを各サンプル中に存在するβ−サブユニットの量について正規化した。IRS−1の免疫沈降は、2種のIRS−1ウサギポリクローナル抗体(C−20、C末端特異的;およびA−19、N末端特異的、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)を用い、インスリン処理マウスの筋肉からの細胞質ゾル画分を用いて上記のようにして行った。
【0072】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。事実、上記の記載から、本明細書に記載のものに加えて種々の本発明の変更が当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。種々の刊行物が本明細書中に引用されており、それらの開示内容は引用によりそれらの全文を本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、PTP−1B座の遺伝子ターゲッティングを示す。A)マウスPTP−1B遺伝子のゲノム構成およびターゲッティングベクターの設計。エキソンは枠で示し、活性部位システインを含むエキソン6は未充填である。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は次のように略す:B=BamHI;E=EcoRI;H=HindIII;Xb=XbaI;Xh=XhoI。下図は相同組換え事象のゲノム構造である。B)野生型(+/+)、ヘテロ接合型(+/−)およびホモ接合型(「ヌル」)(−/−)PTP−1B子孫を生じるヘテロ接合交雑からのBamHIで消化した尾部DNA上でPTP−1B 3′プローブを用いた代表的なゲノムサザンブロット。C)PTP−1B(+/+)、PTP−1B(+/−)およびPTP−1B(−/−)マウスからの肝臓膜サンプルのPTP−1Bイムノブロット分析。
【図2】
図2は、普通(すなわち、非高脂肪で非高炭水化物)の食餌を与えて自由に給餌させたPTP−1B(+/+)、PTP−1B(+/−)およびPTP−1B(−/−)マウス、および一夜絶食させたそれらマウスのブドウ糖レベルおよびインスリンレベル。A)のブドウ糖レベルおよびB)のインスリンレベルは、本明細書の実施例に記載のようにして測定した。マウスの数は、給餌群AおよびBでは(n=19〜21)であり、絶食群Aでは(n=8〜10)およびB群では(n=6)であった。値は平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行った。*、(P=0.06)、**、(P≦0.01)。
【図3】
図3は、普通(すなわち、非高脂肪で非高炭水化物)の食餌を与えたPTP−1B(+/+)(野生型)マウスおよびPTP−1B(−/−)(ヌル)マウスの耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験を示す。A)耐ブドウ糖能は10〜14週令の雄性マウス(n=11〜12)について行った;■=野生型;●=ヌル。B)耐インスリン能は10〜14週令の雄性マウス(n=5〜6)について行った;■=野生型;●=ヌル。データは平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行い、野生型と比較した。*、(P≦0.05)、**、(P≦0.02)。
【図4】
図4は、マウスPTP−1B遺伝子の破壊が普通(すなわち、非高脂肪で非高炭水化物)の食餌を与えたマウスにおけるインスリン受容体(IR)の過度で長期にわたるチロシンリン酸化を引き起こすことを示す。A)PTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスについて指示した時間にわたって肝臓においてインスリンチャレンジを行った後の、IR β−サブユニットについてのチロシンリン酸化の経時的変化を示す代表的なイムノブロット。イムノブロットからのインスリン受容体β−サブユニットホスホチロシンレベルの定量化はデンシトメトリーにより行った。データは、各動物について1分の時点でのホスホチロシンインスリン受容体β−サブユニットレベルを100%と設定し、同じ動物についてのその後5分の時点でのレべルをこの値と比較することにより表わす。結果は、3つの別個の実験から、それぞれ5匹のPTP−1B(−/−)マウスおよびPTP−1B(+/+)マウスからのものである。B)インスリン処理したPTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスからの筋肉におけるIR β−サブユニットのリン酸化レベルを示すイムノブロット。イムノブロット(n=3)からの定量データは、任意のデンシトメーター単位で、野生型マウスからの2分の時点のものを100と設定して示す。C)注射2分後の、インスリン処理したPTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウス(n=3)からの筋肉からのIRS−1イムノブロット。このイムノブロットに用いたSDSポリアクリルアミド(7.5%)ゲル(15cm×15cm)において、IRS−1は拡散した185kDのバンドとして移動した。データは平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントt検定を用いて統計的解析を行い、A)では1分の時点での値を5分の時点の値と比較し、B)ではPTP−1B(−/−)マウスの2分および6分の時点の値をPTP−1B(+/+)マウスのそれぞれの値と比較した、*(P≦0.05)。
【図5】
図5は、高脂肪高炭水化物食を与えたA)雄性およびB)雌性のヌルノックアウト、ヘテロ接合型ノックアウト、および野生型マウスの体重増加を示す。A)雄性マウス;◆=野生型、n=7;■=ヘテロ接合型、n=9;▲ヌル、n=8。B)雌性マウス;◆=野生型、n=9;■=ヘテロ接合型、n=9;▲ヌル、n=8。
【図6】
図6は、高脂肪高炭水化物食を与えたマウスにおけるブドウ糖およびインスリンチャレンジを示し、PTP−1B野生型マウスではインスリン抵抗性が生じ、PTP−1Bノックアウトマウスではインスリン抵抗性が相対的に欠如していることを実証している。高脂肪高炭水化物食を与えた雄性マウスにおけるA)耐ブドウ糖能試験およびB)耐インスリン能試験。◆=野生型、n=7;■=ヘテロ接合型、n=7(A)または8(B);▲ヌル、n=7。C)高脂肪高炭水化物食を与えたマウスの筋肉におけるインスリン刺激インスリン受容体チロシンリン酸化レベル[PTP−1B(−/−)およびPTP−1B(+/+)、n=2;PTP−1B(+/−)、n=3)。イムノブロットの定量化は図4に記載のようにして行った。*(P≦0.05)。
【図7】
図7は、PTP−1B(+/+)マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスにおけるインスリンチャレンジ後の脂肪中インスリン受容体のチロシンリン酸化レベルを示す。普通食を与えたマウスA)および高脂肪食を与えたマウスB)からの脂肪中のインスリン受容体ホスホチロシンのレベル。イムノブロットの定量化は、図4に記載のようにして、野生型マウスの3分の時点のものを100と設定した。データは、各群からの2匹のマウスの平均±標準偏差を表わす。
【図8】
図8は、PTP−1B(−/−)マウスの白色脂肪組織における脱共役タンパク質−1(uncoupling protein−1)および褐色脂肪細胞の誘導を示す。A)野生型マウス(n=2)およびPTP−1B(−/−)マウス(n=2)の腹部脂肪におけるUCP−1およびUCP−2 mRNA発現のノーザンブロット分析。B)野生型マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスからの鼡径部白色脂肪組織(IWAT)の組織学であり、PTP−1B(−/−)のIWATでは多房性脂肪細胞が誘導されることを示している。C)野生型マウスおよびPTP−1B(−/−)マウスからの肩甲間褐色脂肪組織(IBAT)の組織学。野生型のIBAT脂肪細胞ではPTP−1B(−/−)マウスのIBATと比較して大きな脂肪小滴が見られることに注目されたい。
Claims (23)
- 破壊されたPTP−1B遺伝子についてホモ接合性であるトランスジェニックマウスであって、野生型マウスと比較してインスリンに対する応答が改変された表現型を示す上記マウス。
- 前記PTP−1B遺伝子が、選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドの挿入により破壊されている、請求項1に記載のマウス。
- 前記PTP−1B遺伝子がpTARGETの挿入により破壊されている、請求項2に記載のマウス
- 高脂肪高炭水化物食を与えた場合の体重増加が、野生型マウスの約半分である、請求項1に記載のマウス。
- 野生型マウスと比較した場合に、前記の給餌状態における循環インスリンレベルが約半分である、請求項1に記載のマウス。
- 野生型マウスと比較した場合に、前記の給餌状態における血中ブドウ糖レベルが約13%である、請求項1に記載のマウス。
- 請求項1に記載のマウスから誘導される細胞系。
- その細胞の少なくとも幾つかが、プロテインチロシンホスファターゼ−1(PTP−1)の変異形態をコードする改変遺伝子を含み、かつ該改変遺伝子がそのマウス内の野生型のPTP1B遺伝子を置換するようにターゲッティングされているマウスの作製方法であって、
(a) マウス胚性幹(ES)細胞のPTP−1B遺伝子をターゲッティングするように設計されたPTP−1Bの変異形態をコードする改変遺伝子を用意し;
(b) PTP−1Bの改変形態をコードする該改変遺伝子をマウスES細胞に導入し;
(c) PTP−1Bの改変形態をコードする該改変遺伝子により野生型PTP−1B遺伝子が破壊されているES細胞を選択し;
(d) ステップ(c)からの該ES細胞をマウス胚盤胞に注入し;
(e) ステップ(d)からの胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し;および
(f) 該胚盤胞を胚へと発達させ、該胚を産み月まで発達させて、その細胞の少なくとも幾つかがPTP−1の変異形態をコードする改変遺伝子を含むマウスを生産させる;
ことを含む上記方法。 - PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;および
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定すること;
を含み、その結果、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとする、上記方法。 - 前記物質が化合物のライブラリーから得られる、請求項9に記載の方法。
- PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;および
(c) 該PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定すること;
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質が該PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとする、上記方法。 - 前記物質が化合物のライブラリーから得られる、請求項11に記載の方法。
- 請求項10に記載の方法により同定される、PTP−1Bの酵素活性のインヒビター。
- ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定し、それにより、PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を同定し;
その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(c) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(d) ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする、上記方法。 - 前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項14に記載の方法。
- ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
(a) PTP−1Bの酵素的に活性な調製物を用意し;
(b) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該PTP−1Bの酵素的に活性な調製物中のPTP−1Bの酵素活性を測定してPTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(c) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(d) ステップ(c)の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合のステップ(c)の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ(c)の哺乳動物の体重増加を、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする、上記方法。 - 前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項16に記載の方法。
- ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;
(c) PTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(d) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;
(e) ステップ(d)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ(d)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ(c)の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする;
上記方法。 - 前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項18に記載の方法。
- ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
(a) 細胞を、ヒトPTP−1Bタンパク質をコードするDNAでトランスフェクトし;
(b) ステップ(a)の細胞を、PTP−1Bタンパク質が産生されるような条件下で培養し;
(c) PTP−1Bの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該PTP−1Bタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのPTP−1Bの酵素活性が低下していれば、該物質がPTP−1Bタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし;
(d) 該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し;および
(e) ステップ(d)の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合の該ステップ(c)の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ(d)の哺乳動物の体重増加を、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること;
を含み、その際、該PTP−1Bの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ(d)の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする;
上記方法。 - 前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項20に記載の方法。
- PTP−1Bの酵素活性のインヒビターを肥満哺乳動物に投与することを含む、肥満の治療方法。
- PTP−1Bの酵素活性のインヒビターをII型糖尿病に罹患しているヒトに投与することを含む、II型糖尿病および関連する合併症の治療方法。
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