JP2004511457A - 高い細胞内カルシウム濃度の条件下で機能する選択的マキシ−ｋカリウムチャネル・オープナー、その方法および用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋチャネルを開ける機能を果し、かつ低いまたは生理的に正常な細胞内カルシウム濃度の条件下ではマキシ−Ｋチャネルたん白の開放に有意に作用しない、カルシウム感受性および選択性のマキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー／アクチベーター化合物、並びに該化合物の検定および使用方法を提供する。
本発明の全細胞電圧パッチ−クランプ研究によれば、フルオロ−オキシンドールおよびクロロ−オキシンドール化合物などのオープナー化合物の、マキシ−Ｋチャネルを開ける能力が細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）に対し敏感であり、すなわち、負電位が高くなると多くのチャネルが開放することが新たに証明される。特定のフルオロ−およびクロロ−オキシンドール化合物は、低い［Ｃａ２＋］ｉにおける効果と比べ、高い［Ｃａ２＋］ｉの細胞においてのみ、全細胞マキシ−Ｋカリウムチャネル−仲介外部電流の有意な増加をもたらす。かかる化合物は、［Ｃａ２＋］ｉ増加の条件下で最大効力を示すマキシ−ＫチャネルのＣａ２＋−感受性および選択性オープナーを提供し、かつそれ自体、細胞が高い細胞内カルシウム量に基づく外傷性ストレスをこうむったりあるいは該ストレスになりやすい疾患または障害、たとえば発作の治療薬となる。
本発明の全細胞電圧パッチ−クランプ研究によれば、フルオロ−オキシンドールおよびクロロ−オキシンドール化合物などのオープナー化合物の、マキシ−Ｋチャネルを開ける能力が細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）に対し敏感であり、すなわち、負電位が高くなると多くのチャネルが開放することが新たに証明される。特定のフルオロ−およびクロロ−オキシンドール化合物は、低い［Ｃａ２＋］ｉにおける効果と比べ、高い［Ｃａ２＋］ｉの細胞においてのみ、全細胞マキシ−Ｋカリウムチャネル−仲介外部電流の有意な増加をもたらす。かかる化合物は、［Ｃａ２＋］ｉ増加の条件下で最大効力を示すマキシ−ＫチャネルのＣａ２＋−感受性および選択性オープナーを提供し、かつそれ自体、細胞が高い細胞内カルシウム量に基づく外傷性ストレスをこうむったりあるいは該ストレスになりやすい疾患または障害、たとえば発作の治療薬となる。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、細胞内カルシウム濃度に対し非常に敏感で、かつ高い細胞内カルシウムの条件下でコンダクタンスの大きいカリウムチヤネル（マキシ（ｍａｘｉ）−Ｋ＋、マキシ−ＫまたはＢＫカリウムチヤネル）を選択的に開けることが新たにわかった、これらチャネルのモジュレーター、特にオープナーあるいはアクチベーターの同定に関する。かかるカルシウム−感受性オープナーは、高い細胞内カルシウム濃度の症状と関連する疾患および障害、特に神経学的病理もしくは神経変性病理、疾患および障害、たとえば虚血性発作の処置に特に有効となりうる。
【０００２】
（背景技術）
コンダクタンスの大きいカルシウム（Ｃａ２＋）−活性化カリウム（マキシ−Ｋ＋、マキシ−ＫまたはＢＫと称す）チャネルは、脳を含めほとんどの組織で見られる。マキシ−Ｋチャネルは、その大きなコンダクタンス並びに活性化のためのＣａ２＋および膜電位の存在に対する信頼に基づきユニークである。該チャネルは、細胞内のＣａ２＋量（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加、および／または膜脱分極に応じて自然に開き、このため、細胞からのカリウム（Ｋ＋）流出および細胞膜電位の調節を可能にする。この活性は、内因性フィードバック機構として役立ち、それによって、細胞はもとの興奮性の少ない、過分極電位の高い状態に戻ることにより、細胞へのさらなる電圧−依存Ｃａ２＋進入を限定する。
【０００３】
哺乳類のマキシ−Ｋチャネルは、７つの膜ドメイン含有たん白であって、Ｃａ２＋の結合に必要と思われる、大きなカルボキシ−末端領域を有する［Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒらの「Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２：４１６−４２１、１９９９年）；Ｐ．Ｍｅｅｒａらの「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」（９４：１４０６６−１４０７１、１９９７年）；Ｖ．Ｋ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（３７：３１９−３４７、１９９７年）］。ヒトニューロンや他の組織で発現されるマキシ−Ｋチャネルとしては、ｈＳｌｏ１遺伝子ファミリー・メンバーが包含される［Ｓ．Ｉ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．」（２７：１８９−１９３、１９９４年）；Ｄ．Ｐ．ＭｃＣｏｂｂらの「Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」（２６９：Ｈ７６７−Ｈ７７７、１９９５年）］。
【０００４】
ニューロンにおけるマキシ−Ｋチャネルは、選択的スプライシング［Ｊ．Ｔｓｅｎｇ−Ｃｒａｎｋらの「Ｎｅｕｒｏｎ」（１３：１３１５−１３３０、１９９４年）］、ベータ・サブユニット・アセンブリー［Ｓ．Ｉ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１６：４５４３−４５５０、１９９６年）およびＲ．Ｂｒｅｎｎｅｒらの「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」（２７５：６４５３−６４６１、２０００年）］および密に関係するファミリー・メンバー，ｈＳｌｏ２またはＳｌａｃｋとの可能なコアセンブリー［Ｗ．Ｊｏｉｎｅｒらの「Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１：４６２−４６９、１９９８年）］の結果として，重要な表現型変動を示す。
【０００５】
この変動に拘らず，全てのマキシ−Ｋチャネルは電圧−およびＣａ２＋−依存性を有し、従って、重要な脱分極の期間中および／またはニューロン内部のＣａ２＋量が高いときのみに、上記チャネルの活性化限界に到達する［Ｏ．ＭｃＭａｎｕｓの「Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．」（２３：５３７−５６０、１９９１年）およびＫ．Ｔ．ＷａｎｎおよびＣ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓの「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（６：６０７−６１７、１９９４年）］。従って、これらチャネルの薬理学的遮断は、正常なニューロン機能に対して非常に穏当な効果を持つ［Ｋ．Ｎ．Ｊｕｈｎｇらの「Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ．」（３４：１７７−１８６、１９９９年）］。しかしながら、これらのチャネルが開いているとき、それらは細胞膜電位の有効な調節器である。
【０００６】
発作は、世界中の非常に多くの人々に対して死や長期の廃疾をひき起こす神経学的症状のよく知られた具体例である。実際に、米国だけでも、毎年７０００００以上もの人々が発作に苦しんでいる［Ｇ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓらの「Ｓｔｒｏｋｅ」（３０：２５２３−２５２８、１９９９年）］。目下、たった１つの形態の療法、すなわち、血栓崩壊のみが、限られた患者母集団における急性発作の結果の改善に有効であることが知られている［Ｍ．Ｆｉｓｈｅｒの「Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ」（７：１６５−１６９、１９９９年）］。
【０００７】
最も一般的形態の疾患である、急性虚血性発作は、閉塞した管に対して遠位の、激しく損傷した組織の芯領域をもたらし、該芯領域は、芯への近接およびおそい脈管灌流のため死の危険状態の周縁部組織で取り巻かれている［Ｇ．Ｓｃｈｌａｕｇらの「Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ」（５３：１５２８−１５３７、１９９９年）］。エネルギー有効性の低下、過度の興奮性アミノ酸放出、高い細胞内カルシウムおよびニューロンの高興奮性によって起こる神経毒性生化学カスケードの結果、周縁部の虚血性ニューロンは死ぬ［Ｕ．Ｄｉｒｎａｇｌらの「Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２２：３９１−３９７、１９９９年）］。
【０００８】
神経保護化合物は、管閉塞後の危険なニューロン細胞に対しある程度の保護を付与するようになっているが、見込みのある臨床前の支持データにも拘らず、再三再四、臨床試験ではうまく行かなかった［Ｋ．Ｋ．Ｊａｉｎの「Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ」（９：６９５−７１１、２０００年）］。ヒトの臨床試験で神経保護化合物を用いる成功の欠如は、副作用が存在することに帰し、これによって、その有用性あるいは用量が制限される。他の作用物質について完全に試験したが、効きめを証明できなかった［Ｊ．Ｄｅ Ｋｅｙｓｅｒらの「Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２２：５３５−５４０、１９９９年）］。
【０００９】
マキシ−Ｋチャネルは、細胞機能において重大な調節の役目を演じることから、これらのチャネルは特に、発作中に影響されるニューロン細胞で、重要な治療標的を構成する。これらのチャネルの転形（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、高興奮性またはＣａ２＋の病原性量の条件にさらされる細胞、特にニューロン細胞、および／またはニューロン起点の細胞を保護する治療的選択を提供することができよう。マキシ−Ｋチャネルのオープナーが記載されているが、これらのオープナーは、十分な効力および治療剤として使用できるという特異性に欠くことがわかった［Ｖ．Ｋ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（５０：２０６−２１７、１９９６年）；Ｊ．Ｅ．Ｓｔａｒｒｅｔｔらの「Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ」（２：４１３−４２８、１９９６年）］。
【００１０】
当該分野で必要なのは、新しいモジュレーター、特に、特殊な条件下、たとえば高い細胞内カルシウム濃度下で細胞の標的にされるマキシ−Ｋチャネルたん白に対し選択的作用を示す、マキシ−Ｋチャネルのオープナーまたはアクチベーターである。かかるオープナー化合物は一般に、細胞内の環境がカルシウム濃度の高いものである疾患およびマキシ−Ｋチャネルがオープナー化合物によって標的にされる疾患の処置用に設計することができる。さらに詳しくは、かかるオープナー化合物は、ニューロン病理および疾患、たとえば発作（特に、虚血性発作）の処置用に設計できるが、これは、発作中の神経毒性によって破壊される細胞に起こる生理学的プロセスに基づく。
【００１１】
また当該分野において、マキシ−Ｋチャネルが活性である細胞、特に虚血性細胞に起こる条件（状態）、および条件に依存し、かつかかる条件下でその効果を発揮して、危険な細胞の標的を活性化する、薬物、化合物、小分子、治療剤等を包含するマキシ−Ｋオープナーまたはアゴニストの発見および設計の理解も必要とされ、かつ本発明によってその理解が得られる。
【００１２】
本発明は、有効で選択的なオープナー化合物、およびその使用方法を提供する。これらの化合物は、マキシ−Ｋチャネルに対するその作用において条件に依存するように設計されており、該オープナーは高い細胞内カルシウム条件下、たとえば虚血性細胞の条件下で有効に働くことにより、虚血保護を付与するが、正常な細胞、および／またはこのような高い細胞内カルシュウム条件を有さない細胞に対しては実質的に効果を有さないようになっている。これに対し、他のオープナー化合物は、細胞内カルシウム濃度に対する感受性に欠けるのが認められ、従って、その作用は細胞内カルシウムの濃度に依存しない。
【００１３】
本明細書で記載されるように、本発明は、高量の細胞内カルシウムではマキシ−Ｋチャネルの有力で特殊な開放機能を示すが、細胞内カルシウム量の低い細胞のこれらのチャネルに対してほとんど効果を有さない、マキシ−Ｋチャネルの新しいカルシウム−依存オープナー、またはカルシウム・コ−アゴニストを規定する。
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、哺乳類のマキシ−Ｋチャネルのオープン（開放）確率を増大し、かつ該チャネルの機能を増加する、新規なマキシ−Ｋチャネル・オープナーまたはアクチベーター化合物を提供する、かかるオープナーは、細胞の細胞内カルシウム濃度に対し敏感で、かつ高い細胞内カルシウム濃度、たとえばミクロモル範囲下で最も有効であるが、正常な、たとえば生理的下の、低い細胞内カルシウム濃度に対しては、効果が最小限であるか、もしくは少しも効果を有しないことが明らかである。
【００１５】
本発明は、特別な側面において、高い細胞内カルシウム量、たとえば神経変性疾患（発作など）中危険な状態のニューロンに存在する量の条件下で機能する、マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の形態の新規な神経保護剤に関係する。
【００１６】
また本発明の目的は、ニューロン興奮性と神経系の細胞中のＣａ２＋進入を限定する内因性系から成る、標的、すなわち、マキシ−Ｋチャネルたん白を転調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）、方法および化合物を提供することである。本発明によれば、新規化合物は、たとえば急性発作や関連症状中に、細胞内Ｃａ２＋量が正常より高く、たとえばミクロモル範囲になると、マキシ−Ｋチャネルを開けるように設計されている。
【００１７】
本発明の別の目的は、特に虚血性ニューロンを標的にして、マキシ−Ｋチャネルの機能の増加によりかかるニューロンのマキシ−Ｋチャネルたん白、特にヒトマキシ−Ｋチャネルの転調によって、虚血保護を付与し、これによって、医薬標的の条件−依存性活性化を可能ならしめ、かつ他の細胞や非虚血性細胞と比較して、細胞内Ｃａ２＋量の高い虚血性細胞への該化合物の作用を限定する、方法および化合物を提供することである。
【００１８】
本発明のまた別の目的は、本発明の選択的マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナーから成る医薬組成物を提供することであり、ここで、該組成物はさらに医薬的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤を含有する。
【００１９】
本発明のまた別の目的は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で選択的に機能して、マキシ−Ｋカリウムチャネルを開け、たとえばＫ＋流出を増加したり、電圧−依存Ｃａ２＋流入を縮小する、マキシ−Ｋチャネル・モジュレーター、作用物質（剤）または化合物を選別、同定または検出するアッセイおよび方法を提供することである。
【００２０】
好ましいオープナー化合物は、マキシ−Ｋカリウムチャネルたん白に影響を及ぼし、かつ高い細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋチャネルたん白に対しその活性を選択的に発揮するよう機能するが、正常なまたは低い細胞内カルシウム濃度の条件下ではマキシ−Ｋチャネルたん白にその活性を発揮しないものである。
【００２１】
かかる選別（スクリーニング）法としては、該モジュレーター、作用物質または化合物が高い細胞内Ｃａ２＋量の条件下でマキシ−Ｋチャネルを標的にしこれに作用する能力を、正常なまたは低い細胞内Ｃａ２＋量の条件下のマキシ−Ｋチャネルを標的にし作用する能力と比較して評価することが包含されうる。
【００２２】
本発明の他の目的は、特に記載の選別法によって得られるような、マキシ−Ｋチャネル・アゴニストまたはアクチベーターとしての新規なオープナー化合物およびマキシ−Ｋモジュレーターを提供することである。
【００２３】
また本発明の他の目的は、哺乳類、特にヒトの疾患で、被作用細胞が高量の細胞内カルシウムを有し、被作用細胞の高い細胞内カルシウム濃度の結果として、マキシ−Ｋチャネルたん白が明確に標的にされることを特徴とする疾患の処置または予防法を提供することである。かかる疾患の具体例としては、これらに限定されるものでないが、発作、全般脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、てんかん、片頭痛および慢性神経変性障害、たとえばアルツハイマー病が挙げられる。
【００２４】
さらに本発明の特別な他の目的は、哺乳類、好ましくはヒトの神経学的疾患、特に発作、さらに詳しくは急性虚血性発作の処置または予防法を提供することで、該方法において、高量の細胞内Ｃａ２＋を有する細胞（たとえば虚血性ニューロン）のマキシ−Ｋチャネルを標的にしかつ活性化する選択的能力を有するが、非虚血性または正常なニューロンを有意に標的とせずかつ活性化しない、マキシ−Ｋチャネルのオープナーを使用する。
【００２５】
また本発明の別の目的は、新しい種類のＣａ２＋−感受性および選択的マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物、およびその具体的メンバーを提供することである。
さらに本発明の別の目的は、本明細書で詳しく記載される、Ｃａ２＋−感受性および選択的マキシ−Ｋチャネル・オープナーであることが新たにわかったクロロ−オキシンドール（ｏｘｉｎｄｏｌｅ）化合物を提供することである。
【００２６】
なお、本発明のさらに他の目的、特徴および利点については、添付の図面を参照し、かつ発明の詳細な説明を読めば、容易に理解されるだろう。
【００２７】
図１Ａおよび１Ｂは、高量（１．０μＭ）の細胞内Ｃａ２＋を含有の培地で灌流した細胞中、ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞のピーク全細胞電流に関し、マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物，ＢＭＳ−２０４３５２（３−置換オキシンドール誘導体）の効果を証明する。図１Ａは、電流−電圧関係を示す（平均値±ＳＥ；ｎ＝５、但し、ウオッシュ（ｗａｓｈ），ｎ＝３）。図１Ｂは、図１Ａのデータの用量応答を示す。薬物の電流振幅は、＋３０ｍＶで測定し、＋３０ｍＶで測定した対照電流のパーセントで表示する。
【００２８】
図２Ａ−２Ｃは、ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の全細胞電流に関し、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２０４３５２化合物（５μＭ）の効果を証明する。図２Ａは、内部
［Ｃａ２＋］フリーを変えた条件下の全細胞外部電流のＩ−Ｖ関係を示す。（ｉ．），（オープン符号）は対照条件を示し、（ｉｉ．），（クローズド符号）は５μＭ−ＢＭＳ−２０４３５２を示す（平均値±ＳＥ；各データポイントｎ＝３〜２０；図１Ａおよび１Ｂのデータを１μＭ Ｃａ２＋グループに含ませる）。図２Ｂは、（薬物電流／対照電流）の比対電圧で示される、図２Ａの電流データを示す。図２Ｃは、１μＭ［Ｃａ２＋］ｉで実験した代表的電流を示す。図２Ａにおいても同様、（ｉ．）は対照を示し、（ｉｉ．）は５μＭのＢＭＳ−２０４３５２化合物の存在下で実施する。
【００２９】
図３Ａおよび３Ｂは、全細胞パッチ（ｐａｔｃｈ）−クランプ（ｃｌａｍｐ）技法を用い、クローン化ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の外部カリウム電流に関し、各種［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２２５１１３オープナー化合物（１０μＭ）の効果を示す。保持電位は、［Ｃａ２＋］ｉ＝２５０ｎＭおよび１μＭの場合で−８０ｍＶ、［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭの場合−１００ｍＶであった。［Ｃａ２＋］ｉに適する一連の１０ｍＶ脱分極電圧ステップを適用した。［Ｃａ２＋］ｉを２５０ｎＭから１．０μＭ、または２．５μＭに増加すると、ピーク電流−電圧関係が左へシフトし、このようにＶ１／２に見掛けの左方向のシフトが示される。図３Ａにおいて、ＢＭＳ−２２５１１３化合物（１０μＭ）は、［Ｃａ２＋］ｉが高くなればなる程その条件下でマキシ−Ｋ電流の増大をもたらした。図３Ｂにおいて、図３Ａのデータを、（薬物電流／対照電流）の比対電圧で表わす。（各データポイントは、３〜９細胞の平均値±ＳＥを示す）
【００３０】
図４Ａ−４Ｆは、発作に関連する数匹のラットモデルにＢＭＳ−２０４３５２オープナー化合物を投与したインビボ実験の結果を示す。図４Ａは、インビトロのラット海馬組織ウェッジ（ｗｅｄｇｅｓ）からの［３Ｈ］グルタメートのＢＭＳ−２０４３５２化合物による、電気刺激放出の転形（調整）を示す。該化合物は、放射性同位元素標識グルタメートの放出を穏当かつ有力に抑制した。＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【００３１】
図４Ｂは、麻酔をかけたラットにインビボでＢＭＳ−２０４３５２（ＩＶ巨丸剤）を投与し、薬物注射の２時間後に判断したところ、ＣＡ３領域の対側性交連線維系の刺激によって生じる、ＣＡ１領域に記録された電界電位の小さいが重要な縮小となることを示す。広い範囲の用量，５０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇがこのモデルに有効であった。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。挿入図は、（ｉ．）の前と１００ｎｇ／ｋｇのＢＭＳ−２０４３５２投与後（２時間；ｉｉ．）の誘電電位の一例を示す。これらの効果は常に、長く永続し、かつ最長実験の期間（４〜５時間）中持続した。
【００３２】
図４Ｃは、ＳＨＲラットにおいて永久片側ＭＣＡ閉塞の２時間後に化合物１を投与したことによる、磁気共鳴映像を用いて測定した皮質梗塞量の縮小を示す。ＭＲＩで見られるこれらの結果は、閉塞開始の２４時間後に組織学的技法で確認した。＊Ｐ＜０．０５。
【００３３】
図４Ｄは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットの皮質梗塞量に対するラセミ化合物１とＢＭＳ−２０４３５２（０．３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）の効果の比較を示す（永久片側ＭＣＡ閉塞、永久同側ＣＣＡ閉塞、一過性対側性ＣＣＡ閉塞の併用モデル；ＭＣＡ閉塞開始の２時間後にＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル、ＢＭＳ−２０４３５２を投与）。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３４】
図４Ｅは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラット（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル）において、ＭＣＡ閉塞開始の２時間後にＢＭＳ−２０４３５２を投与した場合の、用量−応答関係を示し、図４Ｂにおけるシナプス転形に見られるものに類する有効用量−応答関係を証明する。発作および誘発電位モデルにおける３ｍｇ／ｋｇ以上の用量での効きめの反転メカニズムは、不明である。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【００３５】
図４Ｆは、正常血圧Ｗｉｓｔａｒラット（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル）における皮質梗塞量の縮小に関し、閉塞開始後１または２時間のＢＭＳ−２０４３５２（１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）の投与効果の比較を示す。これら２つの閉塞後時間ポイントでは、マキシ−Ｋチャネル・オープナーの効果を統計的に区別できない。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。全てのデータは、閉塞開始後２４時間で収集した。
【００３６】
図５Ａ−５Ｄは、ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現させるＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関し、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）と、ＢＭＳ−Ａ化合物または公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロン化合物使用の効果を表わす。図５Ａは、２つの［Ｃａ２＋］ｉ条件（すなわち、５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉと２．５μＭの［Ｃａ２＋］ｉ）下の、対照（オープン符号）とＢＭＳ−Ａ（１μＭ）（クローズド符号）のマキシ−Ｋ電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。
【００３７】
図５Ｂは、図５Ａのデータに対し（薬物電流／対照電流）の比対電圧で示される、Ｉ−Ｖ電流データを示す。各データポイントは、４〜８細胞の平均値±標準誤差（ＳＥ）を示す。
【００３８】
図５Ｃは、［Ｃａ２＋］ｉが５０ｎＭおよび２．５μＭの条件下、公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロンで実験した場合のマキシ−Ｋ・Ｉ−Ｖ関係を示す。対照はオープン符号で示され、薬物はクローズド符号で示される。
【００３９】
図５Ｄは、図５Ｃのデータに対し比対電圧で示す、図５ＣのＩ−Ｖ電流データを示す。各データポイントは、９〜１１細胞の平均値±ＳＥを示す。注目として、ＢＭＳ−Ａ（図５Ａ、５Ｂ）は実際に、低［Ｃａ２＋］ｉ（たとえば５０μＭ）でマキシ−Ｋチャネル電流を縮小するが、ＮＳ−１６１９は両［Ｃａ２＋］ｉで、同量の電流増加をもたらす。
【００４０】
（発明の詳細）
本発明は、哺乳類マキシ−Ｋカリウムチャネル、特にヒトマキシ−Ｋチャネルの開放確率を増大し、かつ機能を増加する、新規なマキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物を提供する。かかるオープナーは新たに、細胞の細胞内カルシウム濃度に対し敏感であることを特徴とし、かつ高い細胞内カルシウム濃度（たとえばミクロモル範囲）の条件下で最も有効であるが、正常な、たとえば生理的下の、低い細胞内カルシウム濃度に対しては、効果が最小限であるか、もしくは少しも効果を有しないことが明らかである。すなわち、本明細書記載のオープナーは、細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルへの活性を発揮するためには、細胞内カルシウム濃度が増殖していない細胞内カルシウム濃度より高いことを必要とする。
【００４１】
本発明は、特別な側面において、高い細胞内カルシウム量、たとえば神経変性疾患（発作など）中危険な状態のニューロンに存在する量の条件下で機能する、マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の形態の新規な神経保護剤に関係する。
【００４２】
マキシ−Ｋイオンチャネルは、カリウム（Ｋ＋）流出を著しく増大し、膜を急速に過分極し、次いで電圧−依存Ｃａ２＋流入をさらに縮小することにより、細胞内Ｃａ２＋および膜脱分極の実質的な増加に反応するたん白である［Ｖ．Ｋ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（３７：３１９−３４８、１９９７年）］。本発明は、特定のマキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物が、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルに対し選択的に作用を発揮するが、正常な、適度のあるいは低い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルに対しては、最小限の作用しか、あるいは全く作用を発揮しないという発見に関連する。
【００４３】
すなわち、本発明に係る新規オープナー化合物（“オープナー”または“マキシ−Ｋオープナー”）は、細胞の細胞内カルシウム濃度に対し極めて敏感であり、かつカルシウム増加条件下で最も有効であるが、生理的に正常乃至低い細胞内カルシウム濃度下では、効果が最小限であるか、もしくは少しも効果を有しないことが証明されている。
【００４４】
このことは特に、細胞内カルシウムの増大または蓄積が、細胞に外傷性ストレスを起こし、および／または病理、細胞毒、アポプトシスまたは死に関係する疾患、症状または障害の場合に重要である。急性虚血性発作は、細胞内Ｃａ２＋の蓄積が、虚血性周縁部の細胞の最後の死の主要な近い原因と思われる、特別な疾患である［Ｄ．Ｗ．Ｃｈｏｉの「Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１８：５８−６０、１９９５年）；Ｔ．ＫｒｉｓｔｉａｎおよびＢ．Ｋ．Ｓｉｅｓｊｏの「Ｓｔｒｏｋｅ」（２９：７０５−７１８、１９９８年）］。
【００４５】
本発明のマキシ−Ｋオープナーは特に、高い細胞内カルシウム量の細胞、たとえば虚血性ニューロンを標的にするよう設計されている。すなわち、本発明が新たに提供する化合物の活性が、高濃度の内部カルシウムを有する細胞に対し限定的かつ選択的であるため、これらの化合物は本発明によって、副作用を有意に縮小、たとえば血圧を低下するよう規定される。
【００４６】
加えて、本発明に係る化合物およびその使用は、正常または低い内部カルシウム量を有する細胞を、実質上影響を及ぼさない状態にする。ガイダンスとして、高量の細胞内カルシウムの非制限的具体例は、概して高ナノモル（たとえば約２５０または３００ｎＭ以上）〜ミクロモル（たとえば約１〜１０μＭ）範囲にあると考えられ；正常または生理的量の細胞内カルシウムは概して、約５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲にあると考えられ；および低量の細胞内カルシウムは概して、約５〜５０ｎＭの範囲にあると考えられる。
【００４７】
本発明の化合物は、Ｃａ２＋感受性がマキシ−Ｋチャネルに対する該化合物作用と関連し、このため、疾患の危険な状態にある細胞への作用力を制限し、また発作などの神経変性疾患の場合にも、急性発作および関連症状中の、正常量より高いＣａ２＋を有する細胞には虚血保護を付与するように設計されている。
【００４８】
本発明は、マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の活性に、独特の高レベルのＣａ２＋感受性を組み入れることにより、非虚血性細胞への衝撃が最小限であるより有効な神経保護剤を提供する。神経学的障害および疾患の場合、これは、潜在的に病的量の細胞内Ｃａ２＋にさらされないニューロンや他の細胞のマキシ−Ｋチャネルに対する薬物作用を、大いに減少させる。
【００４９】
従って、本明細書記載の化合物および方法は、正常または影響を受けていないニューロンの、並びに潜在的に病的または致死量の細胞内Ｃａ２＋にさらされない他の細胞のマキシ−Ｋチャネルに対する薬物作用を、大いに減少させるように規定される。高量の細胞内Ｃａ２＋に対し独特に敏感なオープナー薬物／化合物の創造により、高い細胞内Ｃａ２＋量を有することが特徴でない、非虚血性細胞または他のタイプの細胞において、Ｃａ２＋およびＫ＋調節の混乱をほとんどなくすべきである。加えて、かかるオープナー薬物／化合物は、虚血性発作の回復においてマキシ−Ｋチャネル・オープナーに対し神経保護の役割を付与する。
【００５０】
マキシ−Ｋチャネル・オープナーとしての使用に好適な化合物は、高い細胞内カルシウム濃度の存在下で活性であるが、低いまたは正常な生理的細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋチャネルの開放に対しほとんど乃至全く有意な活性を有しないものである。神経保護剤として使用する場合、該化合物は脳に浸透しうることが好ましい。
【００５１】
高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞に対し選択的機能を有する化合物の１つの種類としては、Ｐ．ＨｅｗａｗａｓａｍらのＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５５６５４８３および５６０２１６９に記載の、３−フェニル置換オキシンドール誘導体が含まれる。フルオロ−オキシンドール化合物は、上記種類に属し、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞に対しマキシ−Ｋチャネル・オープナーとして選択的に作用することができ、かつ正常な、適度のまたは低い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを開けるのにはっきりと感知できる程度には作用しない。
【００５２】
フルオロ−オキシンドール化合物の１つのメンバーは、マキシ−Ｋオープナー化合物の（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン、または高い細胞内カルシウム濃度の条件下、ヒトの胎芽腎（ＨＥＫ−２９３）細胞で発現されるヒト脳マキシ−Ｋチャネル・α−サブユニット，ｈＳｌｏの選択的で有効なオープナーであることが［Ｓ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．」（２７：１８９−１９３、１９９４年）］、本発明に従って新たに判定されたＢＭＳ−２０４３５２である。
【００５３】
本発明によれば、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、低い、適度のまたは正常な細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を有する細胞とは対照的に、高い［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルに対し作用を発揮する、カルシウム感受性オープナーとして機能することがわかった。本明細書に記載の如く、本発明に係るＢＭＳ−２０４３５２化合物を用いる実験により、マキシ−Ｋチャネルを開けるＢＭＳ−２０４３５２の能力に関し異なる［Ｃａ２＋］ｉの効果を調べた。
【００５４】
さらに詳しくは、全細胞電圧−クランプ・電気生理学的技法に従って、異なる濃度のＣａ２＋（［Ｃａ２＋］フリー＝５０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭまたは２．５μＭ）含有のピペットを用い、ｈＳｌｏ−仲介外部電流を記録し、クランプ締めした細胞を５μＭのＢＭＳ−２０４３５２化合物にさらした（実施例１）。実施例１および２に記載の実験結果から、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、１μＭの内部［Ｃａ２＋］フリーを有する細胞において、濃度−依存および逆転方法で全細胞ｈＳｌｏ−仲介外部電流を増大した（図１Ａおよび１Ｂ；図２Ａおよび２Ｂ）。
【００５５】
“正常な”または生理的に正常な細胞に見られるような低細胞内カルシウム、たとえば約５０〜２５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉで、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、クローン化ヒトＳｌｏマキシ−Ｋチャネルの開放確率に関してほとんど効果を有さないことがわかった（実施例２）。しかしながら、細胞内カルシウムをμＭ範囲に上げると、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、これらのチャネルの有力で特殊なオープナーとなる（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００５６】
本発明に従って、ユニークな高［Ｃａ２＋］ｉ−選択的および感受的特性と、高［Ｃａ２＋］ｉに関連するオープナー機能を有する他の新規な化合物としては、クロロ−オキシンドール化合物が包含され、その中でＢＭＳ−２２５１１３（すなわち、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン）は、特別でかつ非制限的な具体例である。
【００５７】
ＢＭＳ−２０４３５２化合物と同様、ＢＭＳ−２２５１１３化合物も、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞マキシ−Ｋチャネルに対しその効果を発揮するが、低いまたは正常な細胞内カルシウム濃度の細胞のこれらのチャネルに対し最小限の効果しか発揮しない（図３Ａおよび３Ｂおよび実施例２）。
【００５８】
さらに、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５８６９５０９に記載の、化学名：３−［（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）メチル］−５−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−オンを有するＢＭＳ−Ａ化合物は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞マキシ−Ｋチャネルを開けることが証明された（実施例１２）。
【００５９】
本発明に係る化合物は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを活性化し、かつ低いまたは正常濃度の細胞内カルシウム下では細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを有意に活性化しない。かかる化合物は、本明細書記載の如く、高い細胞内カルシウム量を特徴とする疾患や障害で利用できるという点で有益である。実際に、本発明に係る化合物および方法は、以下に詳しく解明するように、当該分野の他のオープナー化合物に優る利点を付与する。
【００６０】
過度の細胞刺激の時間中のマキシ−Ｋチャネル開放の向上は、外傷性ストレスをこうむる細胞への保護、さらに詳しくは、Ｃａ２＋進入を減衰し、次いでＣａ２＋−仲介細胞事態（ｅｖｅｎｔｓ）を縮小することによる神経保護、特に神経変性に関連する神経保護を付与する潜在性を有する。細胞脱分極に応じるニューロン・マキシ−Ｋチャネルの開放と、［Ｃａ２＋］ｉの増大は、細胞を再分極し、Ｃａ２＋流入を縮小する有効な内因性メカニズム（機構）を構成する。
【００６１】
本発明に係る例示化合物の場合、マキシ−Ｋカリウムチャネル開放において最も根深い薬物−誘発増大がミクロモルの［Ｃａ２＋］ｉで観察され、これによって、本発明の化合物は、細胞を病原性レベルの興奮性インプットにさらし、［Ｃａ２＋］ｉを増大せしめ、たとえば虚血性発作の条件にあるときに最大効果を有しうることが示される。
【００６２】
本発明の化合物は、細胞内カルシウムの濃度に拘らずマキシ−Ｋチャネル活性を増大することが報告されている他のマキシ−Ｋチャネル・オープナーと対照をなす立場にあり、すなわち、上記他のオープナー化合物の活性は非選択的で、かつ細胞内カルシウム濃度に依存しないようになっている。これらの種類の化合物の具体例は、Ｄ．Ｓｔｒφｂａｅｋらの「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（３５：９０３−９１４、１９９６年）およびＭ．ＭｃＫａｙらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（７１：１８７３、１９９７年）に記載されている。
【００６３】
実際に、本明細書実施例１２に記載の結果によれば、上記種類の非選択的化合物は、内部カルシウム濃度に依存しない一般のチャネル開放活性を示すが、本発明の化合物のチャネル開放を行なう能力は、カルシウムの細胞内濃度に極めて敏感であることが明らかになる。
【００６４】
細胞内カルシウム濃度に依存せずに作用する他のマキシ−Ｋチャネル・オープナー／モジュレーターと異なり、本明細書記載の、高濃度の細胞内カルシウムに対し選択性および感受性を有するカルシウム−依存オープナーは、高い細胞内カルシウムを有する細胞、たとえば前虚血性ニューロン細胞のチャネルに有意に影響を及ぼす。
【００６５】
すなわち、本発明記載のかかるオープナーは、発作／虚血の場合や高い細胞内カルシウム量が特徴であるもしくは該量によって始まる他の障害、疾患もしくは症状の場合の処置あるいは療法に特に使用することができ、かつマキシ−Ｋカリウムチャネルのオープナーによる処置に敏感に反応し、応答する。
【００６６】
また、当業者にとって理解される点は、高い細胞内カルシウム量を有する細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルの開放確率を増大するが、生理的に正常または低い細胞内カルシウム量を有する細胞ではそのように増大しない、他のオープナー化合物、たとえばマキシ−Ｋチャネルの小分子アクチベーターも本発明によって包含されることである。
【００６７】
治療／処置
本発明の具体例において、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞環境のマキシ−Ｋチャネルへの作用に対し感受性および選択性を有するマキシ−Ｋオープナー化合物は、治療目的に使用しうる。かかる本発明に係るオープナー化合物を、他の適当な治療剤と組合せ、治療を必要とする個人（たとえば患者）に投与することができる。
【００６８】
組合せ療法に用いる適当な作用物質の選択は、従来の薬理的原理に従って当業者が適宜に成しうる。治療剤の組合せは、相乗的に作用して、本発明の高［Ｃａ２＋］−感受性マキシ−Ｋオープナー化合物による処置に敏感に反応し、応答する特定の疾患や障害、特に発作を含む神経学的疾患または障害の処置あるいは予防を行なうことができる。このアプローチを使用すれば、何人も各作用物質の低用量によって、治療的効きめを得ることができ、これによって、有害な副作用の可能性を縮小することができる。
【００６９】
本明細書記載のマキシ−Ｋチャネル・オープナーを必要とする治療法のいずれも、かかる療法が必要ないずれかの個々の哺乳類（たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラビット、サル、最も好ましくはヒトなどの哺乳類を含む）に適用することができる。高い細胞内カルシウム量が特徴である疾患または障害、たとえば急性虚血性発作の処置方法が本発明によって包含され、該方法において、高［Ｃａ２＋］ｉの細胞のマキシ−Ｋチャネルを開けるのに感受性および選択性を有するマキシ−Ｋオープナーの有効量を、該処置が必要な個人に投与して、上記疾患または障害を縮小、改善または緩和する。虚血性発作からの神経保護や、神経学的疾患または障害（これらに限定されないが、発作を含む）の処置を付与する方法が好ましい。
【００７０】
げ歯動物で行なったインビボ処置を評価する最初の実験において、ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物を用い、近位中大脳動脈（ＭＣＡ）の永久病巣閉塞に、遅延薬物適用を併用し、臨床出現（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の条件を再現する努力で、薬物を発作開始の多少時間後に頻繁に投与する。救うべきニューロンは低下した血流の領域、すなわち周縁部にあるので、ＢＭＳ−２０４３５２化合物が特に有利であり、何故なら、その他の全ての特性以外に、それが非常に高レベルで脳にはいるからである（図４Ａ−４Ｆ；実施例７）。
【００７１】
本発明の他の具体例において、高い細胞内カルシウム濃度の細胞環境のマキシ−Ｋチャネルへの作用に対し感受性および選択性を有するマキシ−Ｋオープナー化合物を、高い細胞内カルシウム量が特徴であるもしくは該量によって始まり、かつマキシ−Ｋチャネルのオープナーによる処置に敏感に反応し、応答する疾患、障害または症状の予防的処置のために、あるいはその開始を予防したりまたはその厳しさを軽減するための予備処置に使用することができる。予防目的のため、あるいは予備処置としての、本発明に係るオープナー化合物の投与は、治療のため上述したような他の作用物質と組合せて行なうことができる。
【００７２】
かかる予備処置用途の非制限的具体例は、上述の疾患または障害、たとえば神経変性疾患または障害、あるいは慢性神経変性疾患または障害、さらに詳しくは、発作、全般大脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、てんかん、片頭痛およびアルツハイマー病の危険な状態の、あるいはこれらの疾患または障害にかかりやすい個人への投与である。この具体例の１つの側面において、該疾患または障害の開始の前に、たとえば前に１以上の発作を持った患者のための予備処置として、すなわち、続いて起こる発作または関連症状の危険を減少、またはその厳しさもしくは程度を軽減できるように、本発明に係るオープナー化合物を投与することができる。
【００７３】
スクリーニング・アッセイおよび方法
本発明の具体例として、マキシ−Ｋオープナー化合物を同定、検出または選別するアッセイおよび方法が含まれ、上記マキシ−Ｋオープナー化合物は、高量の細胞内カルシウムを有する細胞のこれらタイプのカリウムチャネルを開けるよう機能するが、低いまたは正常な量の細胞内カルシウムを有する細胞のマキシ−Ｋチャネルに対しては有意な開放活性を有しない。
【００７４】
本発明の選別および検出法によって確定されるマキシ−Ｋオープナー化合物は、高い細胞内カルシウム濃度に関連する疾患および症状、好ましくは神経変性および神経学的疾患および障害、より好ましくは急性虚血性発作の処置の治療剤として使用できる。
【００７５】
候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ）作用物質は、合成もしくは天然化合物のパネルあるいはライブラリーを含む幅広い種々の源から、または単離した天然化合物、あるいは合成化合物もしくは薬物から得ることができる。
かかるアッセイ法の１つとして、細胞内カルシウム条件のコントロール下の細胞ベースアッセイでの、候補オープナー化合物のテストが必要である。マキシ−Ｋチャネルを発現する一次細胞を含む細胞、細胞系、または細胞培養物を使用する。かかる細胞は、機能しうるマキシ−Ｋチャネルを発現、または過発現する天然産出細胞であってよい。
【００７６】
別法として、細胞は商業上または他の方法で入手しうる定着した細胞系または培養物からのもの（たとえばＨＥＫ−２９３）であってよく、またクローン化マキシ−ＫチャネルＤＮＡ（たとえばｈＳｌｏ）でトランスフェクションされたもので、マキシ−Ｋチャネルを発現する。本発明に従って、潜在的マキシ−Ｋチャネル・オープナーをテストするアッセイで用いる細胞の場合、高い細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞と、低い、適度または生理的に正常な細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを有する他の細胞に対する条件を設定する。
【００７７】
候補化合物または試験化合物について、高［Ｃａ２＋］ｉたとえば約５００ｎＭ、または１、５もしくは１０μＭ［Ｃａ２＋］ｉの存在下のマキシ−Ｋチャネルのオープナーとして機能するが、低いまたは正常濃度の［Ｃａ２＋］ｉ、たとえば約５、５０、１００または２５０ｎＭ［Ｃａ２＋］ｉではマキシ−Ｋチャネルに対し有意なオープナー活性を有しない能力を検定する。
【００７８】
たとえば、標準パッチ（ｐａｔｃｈ）−クランプ（ｃｌａｍｐ）分析および記録技法を行なうことができ、たとえば実施例１および２に記載の、インサイドアウトおよびアウトサイドアウトの切除パッチ、細胞−貼付パッチおよび全細胞クランプにより、候補化合物または試験化合物の高［Ｃａ２＋］ｉの導入後に、マキシ−Ｋチャネル外部電流が増大もしくは賦活（活性化）するかどうかを判定し、低いまたは好ましくは正常な［Ｃａ２＋］ｉ、好ましくは漸進的によりネガチブな電圧でのマキシ−Ｋチャネル外部電流に対する候補化合物または試験化合物の効果と比較する。
【００７９】
候補化合物または試験化合物が、本発明に係るマキシ−ＫチャネルのＣａ２＋−感受性および選択的オープナーとして機能することが確定されれば、該化合物によって、マキシ−Ｋチャネルが仲介する全細胞電流のＩ−Ｖ関係は、細胞内カルシウム濃度の増大に伴って、左へシフトするが、該化合物は低［Ｃａ２＋］ｉ条件下では有意な効果を全く有さない。
【００８０】
アッセイまたはテストをうける化合物が、高い細胞内カルシウム濃度の条件下のアッセイで、細胞によって発現されるマキシ−Ｋチャネルを活発に開ければ、該化合物を同時に上述の試験に付して、正常乃至低い細胞内カルシウム濃度下の、マキシ−Ｋチャネル−発現細胞へのそのオープナー機能を判定する。
【００８１】
本発明に係る適当なマキシ−Ｋオープナー化合物が、このアッセイおよび方法を介して同定または検出されるが、それは、試験化合物が高［Ｃａ２＋］ｉの条件下の細胞のマキシ−Ｋチャネルを有効に開けるが、正常乃至低［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞のマキシ−Ｋチャネルを有効に開けない場合である。
【００８２】
非制限的具体例として、候補化合物または試験化合物の活性は、クローン化マキシ−Ｋカリウムチャネル（たとえばｈＳｌｏ）で形質導入されたもので、かつこれらのチャネルを発現するツメガエル属卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）に対し、検定または試験することができる。
【００８３】
かかるアッセイにおいて、全細胞マキシ−Ｋ電流の発現をもたらすのに十分なｈＳｌｏ ｃＲＮＡを、たとえば晩期（ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ）ツメガエル属卵母細胞に注入する。発現に２〜４日間の余裕をみて、二電極電圧−クランプ技法を採用して、マキシ−Ｋチャネル電流を記録することができ、そして、たとえば電流−電圧関係の変化を調べることにより、薬物への応答を評価することができる。
【００８４】
卵母細胞は内因性低量の細胞内カルシウムを有するので、本発明記載の新規マキシ−Ｋチャネル・オープナーの特性を有する試験化合物は、卵母細胞のこれらのチャネルを有意に開けず、しかし、本明細書記載の高量の［Ｃａ２＋］ｉの条件下で検定されるマキシ−Ｋチャネル−発現細胞のチャネルを開け、これによって、オープナー化合物のカルシウム感受性および選択性が証明される。
【００８５】
あらかじめ記載したマキシ−Ｋオープナーは、内因性低［Ｃａ２＋］ｉ条件下ツメガエル属卵母細胞で発現されるマキシ−Ｋ電流の増加に有効であったが、（Ｖ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（５０：２０６−２１７、１９９６年）］、これとは対照に、本発明の化合物は、これらの条件下ツメガエル属卵母細胞のマキシ−Ｋ電流において、矛盾がないあるいは有意な増加をもたらさない。
【００８６】
さらに、本発明に従って、高い［Ｃａ２＋］ｉ下の細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを明確に標的にし、開けるが、低い乃至正常な［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞に対してはその作用を発揮しない能力のスクリーニングをうける化合物は、必要に応じて、実施例３に記載の他のレセプタや酵素に対するその標的特異性の検定を行なうことができる。
【００８７】
医薬組成物
さらに本発明の具体例は、医薬組成物を上述の治療使用および効果のために、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と共に投与することを包含する。かかる医薬組成物は、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルのオープナーとしての活性が機能的で選択的である、オープナー化合物の１種以上を含有しうる。
【００８８】
該組成物は単独で、または安定化化合物などの他の作用物質の少なくとも１種と組合せて投与されてよく、またいずれかの無菌で生物学的適合性の医薬用担体（これらに限定されるものでないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノールなどの有機溶剤、および水が含まれる）中にて投与されてもよい。また該組成物は単独で、または他の作用物質、薬物、ホルモン、または生物学的応答変性剤と組合せて、患者に投与されてよい。
【００８９】
本発明で用いる医薬組成物は、これらに限定されるものでないが、静脈内、頭蓋内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または経口手段を含む幾らかの方法のいずれかで投与することができる。
【００９０】
かかる医薬組成物は、活性成分（すなわち、選択的オープナー化合物）以外に、適当な医薬的に許容しうる担体、希釈剤、または活性化合物を医薬的に使用できる製剤に加工するのを容易にする助剤を含む賦形剤を含有してもよい。なお、配合や投与に関する技法のさらなる詳細については、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新版（マーック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルバニア州イーストン）を参照。
【００９１】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適切な調剤において周知の医薬的に許容しうる担体を用いて配合することができる。かかる担体によれば、該医薬組成物を、患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖剤（糖衣錠）、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー剤、懸濁液などに配合するのが可能となる。
【００９２】
経口用の医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、必要に応じて得られる混合物を粉砕し、次いで要すれば、錠剤または糖剤コアを得るために適当な助剤を加えた後、顆粒混合物を加工することによって、得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物またはたん白フィラー、たとえばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含むシュガー；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物のスターチ；メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース・ナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムやトラガカントゴムを含むゴム；およびゼラチンやコラーゲンなどのたん白である。要すれば、崩壊剤もしくは可溶化剤を加えてもよく、たとえば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその医薬的に許容しうる塩（アルギン酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【００９３】
糖剤コアは、濃シュガー溶液などの生理的に適切なコーチング、ラッカー液、および適当な有機溶剤もしくは溶剤混合物と共に使用することができ、なお、上記シュガー溶液には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタンを含有させてもよい。製品識別のため、あるいは活性化合物の量（すなわち、投与量）を特徴づけるのに、錠剤または糖剤コーチングに染料もしくは顔料を加えてもよい。
【００９４】
経口使用できる医薬製剤としては、ゼラチンから作られるプッシュ嵌めカプセル剤、並びにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーチングから作られる軟質計量カプセル剤が挙げられる。プッシュ嵌めカプセル剤は、活性成分を、ラクトースまたはスターチなどのフィラーまたはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および必要に応じて安定化剤と混合して含有することができる。軟質カプセル剤において、活性化合物を、安定化剤を用いまたは用いずに、適当な液体、たとえば脂肪油、液体、または液状ポリエチレングリコールに溶解もしくは懸濁させてもよい。
【００９５】
非経口投与に好適な医薬配合物は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理的緩衝食塩水などの生理的に適合しうる緩衝液中に配合されてよい。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる物質、たとえばカルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油状注射懸濁液としても製造しうる。
【００９６】
適当な親油性溶剤またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。また懸濁液は、必要に応じて高濃度溶液の調製を可能ならしめるため、適当な安定化剤あるいは化合物の溶解性を高める作用物質、たとえばＤＭＳＯを含有してもよい。
【００９７】
局所または鼻腔投与の場合、浸透されるべき個々のバリヤに適切な浸透剤または透過剤を、配合物に用いる。このような浸透剤は一般に、当該分野で公知である。
本発明の医薬組成物は、公知の方法により、たとえば通常の混合、溶解、粒状化、糖剤製造、糊状化、乳化、カプセル化、閉じ込め（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または凍結乾燥法に従って製造しうる。
【００９８】
医薬組成物は、塩で供給されてよく、かつ多数の酸（これらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が含まれる）を用いて形成できる。塩は、水性溶剤、または対応する遊離塩基形状である、他のプロトン溶剤により溶解する傾向にある。
【００９９】
他の場合、好ましい製剤は、下記成分：ヒスチジン１〜５０ｍＭ、スクロース０．１〜２％、およびマンニトール２〜７％のいずれかまたは全てを含有してもよい凍結乾燥粉末であってよく、４．５〜５．５のｐＨ範囲にて使用前に緩衝液と混合される。医薬組成物を製造した後、適当な容器に入れ、次いで指示症状の処置のラベルを貼ることができる。オープナー化合物の投与の場合、ラベルの表示としては、量、投与回数および投与方法が挙げられる。
【０１００】
本発明での使用に好適な医薬組成物としては、意図した目的を達成するのに十分な量で活性成分を含有した組成物が含まれる。有効な用量の決定は、当業者の能力の十分範囲内である。いずれの化合物の場合も、治療上有効な用量は、たとえばマキシ−Ｋチャネルたん白を発現または含有する細胞を用いる細胞培養アッセイで、あるいは動物モデル、通常、これらに限定されないが、マウス、ラット、ラビット、イヌまたはブタにて、最初に見積もることができる。また動物モデルを用いて、適切な濃度範囲および投与の方法を決定することができる。次いでかかる情報を用い、これを基にして、ヒトにおける有用な用量と投与方法を決定しうる。
【０１０１】
治療上有効な用量とは、徴候もしくは症状を改善し、縮小しまたは排除する活性成分、たとえば本発明に係る新規Ｃａ２＋−感受性および選択性オープナーの１種以上の量を指称する。治療の効きめおよび毒性は、細胞培養または実験動物での標準医薬手順、たとえばＥＤ５０（母集団の５０％が治療上有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に及ぶ致死用量）で決定しうる。
【０１０２】
毒性対治療効果の用量比は、治療上のインデックスであって、ＥＤ５０／ＬＤ５０比で表示することができる。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトに使用する場合の用量範囲の決定に用いる。医薬組成物に含まれる好ましい用量は、毒性がほとんどもしくは全くないＥＤ５０を含む、流通（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）濃度の範囲内である。用量はこの範囲内で、使用する投与剤形、患者の感受性、および投与方法に応じて適宜変化する。
【０１０３】
正しい用量は、個々の要求処置に関連するファクターを考慮する開業医によって決定されるだろう。投与の用量および時間は、十分量の活性化合物／成分を付与したり、あるいは所望の効果を維持するよう調整される。考慮されうるファクターとしては、個人の病気状態の厳しさ、患者の一般的健康状態、患者の年令、体重および性別、食事療法、投与の時間および回数、薬物の組合せ、反応感受性、および療法に対する耐性／応答が含まれる。マキシ−Ｋオープナー化合物は、それ単独でまたは必要もしくは所望ならば、組合せて投与することができる。
【０１０４】
一般的指針として、予備処置または予防的療法用の医薬組成物は、その厳しさが縮小もしくは改善されつつある、またはその開始が防止もしくは排除されつつある疾患または障害が現われる前に投与される。理解すべき点は、マキシ−Ｋチャネル・オープナーの１種以上の同じ用量または異なる用量による、１回の予備処置あるいは繰返しの、たとえば継続した予備処置を採用できることである。
【０１０５】
さらに、本発明に係るマキシ−Ｋチャネル・オープナーはそれ単独、または別のマキシ−Ｋチャネル・オープナー、もしくは他の治療剤と組合せて、患者の疾患が現われるとき、たとえば疾患の出現時直ちにあるいは疾患の開始の一定時間後に投与することができる。また、本発明に係るマキシ−Ｋチャネル・オープナーを疾患開始の後に投与するときには、適当な時間にわたる繰返しまたは継続的投与も採用することができる。
【０１０６】
非制限的指針および非制限的具体例として、マキシ−Ｋチャネル・オープナーをその投与が必要な患者に対し、疾患出現時直ちに、および／または疾患開始もしくは出現の一定時間後に、たとえば疾患開始もしくは出現の後２・３分もしくは２・３時間以内に、および／または５・６時間または５・６日までに投与することができる。本発明のマキシ−Ｋチャネル・オープナーからなる長期作用性の医薬組成物は、処置される疾患または障害、個々の配合物の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、１週間毎に、または２週間に１回投与されてよい。
【０１０７】
標準の投与量は、投与方法に応じて、０．１〜１０００００ミクログラム（μｇ）で、トータル用量約１グラム（ｇ）以下で変化させてよい。個々の投与量やデリバリーの方法に関するガイダンスについては、文献に記載され、かつ一般的に当該分野の実務家（開業医）にとって入手しうる。当業者であれば、本発明に係る化合物のデリバリーが、個々の細胞、症状、位置等に対して特異性であることが理解されよう。たとえば、本明細書に記載の如く、親油性であるオープナー化合物は、有効な脳浸透剤であり、かつ脳−関連障害によって作用される細胞、たとえば発作中のニューロンのマキシ−Ｋカリウムチャネルに影響を及ぼすのに使用することができる。
【０１０８】
（実施例）
以下に挙げる実施例は、本発明の例示であって、本発明を限定するものではない。
実施例１
方法：
細胞調製
ＨＥＫ−２９３細胞を、製造のプロトコルに従って、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ）を用い、ｈＳｌｏ α−サブユニットｃＤＮＡ含有の１〜２μｇのｐｃＤＮＡ３発現プラスミド［Ｓ．Ｉ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．」（２７：１８９−１９３、１９９４年）］でトランスフェクションする。
【０１０９】
０．５ｍｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８、Ｓｉｇｍａ）を補給した培地で、ｈＳｌｏで安定してトランスフェクションされた細胞を選択する。ＣＯ２５％およびＯ２９５％の加湿雰囲気中３７℃の、１０％のウシ胎児血清およびＧ４１８を補給したミニマム・エセンシャル・メディアム（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、トランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を成長させる。３５ｍｍ培養皿中のフィブロネクチン−被覆ガラスカバースリップ上に、細胞を載せる。
【０１１０】
電気生理学的記録
標準全細胞パッチ−クランプ技法を用いて、外部Ｋ＋−仲介電流を調べる［Ｐ．Ｏ．Ｈａｍｉｌｌらの「Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．」（３９１：８５−１００、１９８１年）］。１０または２０ｋＨｚのデジタル化の前に、レコードを２ｋＨｚで濾過する（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。浴（ｂａｔｈｉｎｇ）溶液は、以下の成分：ＮａＣｌ １４５ｍＭ、ＫＣｌ ３ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭを含有する（ｐＨ７．４）。厚壁のあるホウ珪酸塩ガラスから記録ピペットを抜き（浴溶液中２〜４ＭΩ）、燃焼磨きをし、次いでＫＣｌ １４０ｍＭ、ＭＯＰＳ ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ １．０ｍＭ含有の、ＣａＣｌ２でｐＨ７．２に調整した溶液を満たして、要求される［Ｃａ２＋］フリーとする［Ａ．ＦａｂｉａｔｏおよびＦ．Ｆａｂｉａｔｏの「Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐａｒｉｓ．」（７５：４６３−５０５、１９９５年）に記載の方法を織り込んだＥＱＣＡＬプログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ケンブリッジ）を用いて測定］。
【０１１１】
Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００増幅器またはＥＰＣ９増幅器とＰｕｌｓｅプログラムで、刺激発生およびデータ取得をコントロールする。データを貯蔵し、オフライン分析する。細胞保持電位は、２．５μＭ［Ｃａ２＋］ｉで実験した場合は−１００ｍＶで、残りのＣａ２＋濃度（１μＭ、２５０ｎＭおよび５０ｎＭ）の場合−８０または−６ｍＶである。［Ｃａ２＋］ｉに適切な一連の１０ｍＶ脱分極電圧ステップ（１００〜２００ｍｓ）を適用して、一系列の外部電流を誘発する。直列抵抗は、８０％補償前で＜６ＭΩである。電圧パルスの終り付近で、定常状態の電流を測定する。
【０１１２】
薬物／オープナー化合物
ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物およびＢＭＳ−２２５１１３クロロ−オキシンドール化合物は、親油性であり、従って、ＤＭＦまたはＤＭＳＯを用いストック溶液を作ってから、浴溶液中の最終実験濃度に希釈した。必要ならば、超音波処理を用いて、可溶化を助成する。溶剤の濃度は、常に＜０．２％である。各実験で、注意を払って、化合物と表面（ガラスおよびプラスチックを含む）の接触を最小化にし、そして使用前に新たに溶液を調製する。
【０１１３】
実施例２
パッチ−クランプ：
全細胞電圧−クランプ技法［Ｒ．Ｐｅｎｎｅｒの「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ，２版」（Ｂ．ＳａｋｍａｎおよびＥ．Ｎｅｈｅｒ編、プレナム・プレス、ニューヨーク、３−３０頁、１９９５年），“パッチ・クランピングへの実用的ガイド”］を用い、異なった濃度のＣａ２＋（すなわち、［Ｃａ２＋］フリー＝５０ｎＭ、１μＭまたは２．５μＭ）を含有するピペットで、ｈＳｌｏ−仲介外部電流を記録する。クランプした細胞を、実施例１に記載の如く、５μＭのＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール・オープナー化合物またはＢＭＳ−２２５１１３クロロ−オキシンドール・オープナー化合物にさらす。
【０１１４】
これらの実験の結果から、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、全細胞ｈＳｌｏ−仲介外部電流を、濃度に依存および逆転して増大することが認められる（図１Ａおよび１Ｂ）。これらの実験の中部［Ｃａ２＋］フリーは１μＭであった。
【０１１５】
ＢＭＳ−２０４３５２およびＢＭＳ−２２５１１３化合物の場合共に、ピペット溶液中の［Ｃａ２＋］フリーの変化による細胞内Ｃａ２＋濃度の増大は、全細胞マキシ−Ｋ電流に漸進的によりネガチブな電圧で賦活せしめる。図２Ａおよび３Ａで示されるように、［Ｃａ２＋］ｉの５０ｎＭから２５０ｎＭ、１μＭまたは２．５μＭへの増大は、電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係（相関）を左にシフトし、これによって、半−最大賦活電圧（Ｖ１／２）の明らかな左方向シフトが見られる。
【０１１６】
ＢＭＳ−２０４３５２およびＢＭＳ−２２５１１３オープナー化合物（５μＭ）の添加は、全て４つのＣａ２＋濃度においてｈＳｌｏ−仲介電流を増大するが、該化合物は最高濃度のＣａ２＋（１μＭおよび２．５μＭ）のときしか、有意な増大をもたらさない（図２Ｂおよび３Ｂ）。
【０１１７】
これらの結果は、ＢＭＳ−２０４３５２およびＢＭＳ−２２５１１３化合物が、非常に高い細胞内カルシウム濃度の条件下のＨＥＫ−２９３細胞で発現された、ヒト脳マキシ−Ｋチャネル・α−サブユニット（ｈＳｌｏ）の有効で有力なオープナーであることを証明する。
【０１１８】
ｈＳｌｏで仲介される全細胞電流のＩ−Ｖ関係は、［Ｃａ２＋］ｉの増大に伴なって左にシフトし、これによって、半−最大賦活電圧はより高い［Ｃａ２＋］フリーに伴なってよりネガチブになることが示唆される。両化合物（５μＭ）は、１および２．５μＭ［Ｃａ２＋］ｉの条件下で記録した電流の最も根深い増大をもたらす。
【０１１９】
上記結果と対照的に、内因性の低い細胞内Ｃａ２＋の形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を記録する細胞−貼付パッチ−クランプにおいて、ＢＭＳ−２０４３５２化合物の効果は比較的に適度であり、そして該化合物をｈＳｌｏ１を発現するツメガエル属卵母細胞に適用すると、類似した適度で相反する効果が見られる。
【０１２０】
また本発明の新規マキシ−Ｋオープナーを用いて観察される結果は、たとえば内因性低［Ｃａ２＋］ｉの条件下のツメガエル属卵母細胞において、先に記載したマキシ−Ｋチャネル・オープナーの一貫した結果と対照的な立場にある［Ｖ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（５０：２０６−２１７、１９９６年）］。これら両方の系は、低くかつ可変量の細胞内Ｃａ２＋を有する。
【０１２１】
本発明に係るオープナー化合物の作用が、非常にＣａ２＋−感受性であることは、本実施例に記載の実験および結果によって確認される。すなわち、該オープナー化合物は低量の細胞内Ｃａ２＋（たとえば５０ｎＭ）では、マキシ−Ｋ電流に関してほとんど全く効果を有しないが、細胞内Ｃａ２＋が増大すると（たとえばミクロモル範囲に）、該オープナー化合物は、マキシ−Ｋチャネル−仲介電流の漸進的に大きな増大をもたらし、かつその増大は広範囲の賦活電圧に及ぶ（図２Ｂ、２Ｃおよび３Ｂ）。
【０１２２】
これらのデータによって、マキシ−Ｋチャネルの開放が、高い細胞内Ｃａ２＋および該化合物両方の存在下、生理的に適切な膜電圧で、有意に拡大されることが提案される。これは、外傷性ストレスを付随する疾患状態の期間中、たとえば虚血中の高［Ｃａ２＋］ｉの細胞において、膜電位、細胞興奮性およびＣａ２＋進入の有効なコントロールを可能ならしめることができる。
【０１２３】
アウトサイドアウトおよび全細胞パッチ分析の場合、使用する溶液は、いずれもｍＭ単位で、１４５のＮａＣｌ、３のＫＣｌ、２．５のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２、１０のＨＥＰＥＳ、１０の±グルコースを含有する規定の細胞外Ｎａ＋溶液（ｐＨ７．４）である。インサイドアウト・パッチ用の細胞内および細胞外培地、または全細胞パッチ用のピペット溶液は、いずれもｍＭ単位で、１４０のＫＣｌ、２０のＭＯＰＳ、１０のＥＧＴＡを含有し、ＣａＣｌ２でｐＨ７．２に調整され、要求される［Ｃａ２＋］フリーとなっている［ＥＱＣＡＬプログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ケンブリッジ）を用いて測定］。
【０１２４】
全細胞記録用の細胞保持電位は、−８０または−６０ｍＶであり、内部Ｃａ２＋濃度に適切な脱分極電圧ステップを適用する（高い細胞内Ｃａ２＋において、シール（ｓｅａｌｓ）は高いクランプ電圧で不安定となり、かつ短時間の低い電圧で安定である）。
【０１２５】
アウトサイドアウト切除パッチ実験の場合、パッチをＮａ＋溶液の浴に入れる。ピペット（細胞内パッチ面）は、概算［Ｃａ２＋］フリー１μＭのＫ＋溶液と、２００μＭのＡＴＰγ−Ｓを含有する。レコードは、５ｋＨｚのデジタル化の前に２ｋＨｚで濾過する。細胞保持電圧は−６０ｍＶで、−５０〜＋１３０ｍＶの１０ｍＶ脱分極電圧ステップを適用する。インサイドアウト切除パッチ実験の場合、浴およびピペットは、［Ｃａ２＋］フリー＝１０μＭのＫ＋溶液を含有する。
【０１２６】
レコードは、１０ｋＨｚのデジタル化の前に２ｋＨｚで濾過する。ピペット電位は、薬物適用前にシングルチャネルの分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を可能ならしめる電圧で保持する。１つ以上のチャネルが常に存在し、薬物の適用後に可視できるのみなので、平均オープン確率，ＮＰオープンを用いて、化合物の効果を判定する。細胞−貼付パッチ実験において、浴およびピペットはＮａ＋溶液を含有する。
【０１２７】
レコードは、２０ｋＨｚのデジタル化の前に２または５ｋＨｚで濾過する。ピペット電位は、電圧ランプ（ｒａｍｐ）の開始まで、あるいは定常状態記録のため−８０ｍＶへの変化まで、０ｍＶで保持する。ＮＰオープンを用いて、化合物効果を判定（確定）する。適用できる場合、コンダクタンス（Ｇ）／最大コンダクタンス（Ｇｍａｘ）対電圧（Ｖ）の関係を、ボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）関数，Ｇ／Ｇｍａｘ＝１／（１＋ｅ（Ｖ１／２−Ｖ）／ｋ）より算出する。ここで、Ｖ１／２は半−最大賦活時の膜電位で、ｋは勾配係数である。プロットは、カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈ）ソフトウェアを用いて行なう。Ｖ１／２対ＢＭＳ−２０４３５２濃度−応答関係のロジスティック・フィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｆｉｔ）を用い、ＥＣ５０概算を算出する。
【０１２８】
実施例３
Ｃａ２＋−感受性および選択性マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の標的特異性：
ＢＭＳ−２０４３５２を含むオープナー化合物の、マキシ−Ｋカリウムチャネルに対する効果の特異性を判定するため、ツメガエル属卵母細胞およびクローン細胞系で発現されるクローン化および生イオンチャネルの代表サンプルに対して、化合物を試験し、当業者に容易に知られかつ実施される標準電気生理学的技法を用いて検定する。
【０１２９】
これらは、電圧−依存カリウムチヤネル（Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ２．１）、Ｃａ２＋−賦活クロリド（Ｃｌ−）チャネル（生の卵母細胞チャネル）、のう胞性線維症膜内外コンダクタンス・レギュレーターＣｌ−チャネル（ＣＦＴＲ）およびＣａ２＋電流（生ＧＨ３細胞Ｃａ２＋電流）を包含する。化合物はＫｖ電流およびＣｌ−電流に対し有意の効果を全く有しないことが認められ、ＣＦＴＲを賦活せず（ｃＡＭＰおよびＣＦＴＲオープナーＮＳ００４と比較して）、かつ生Ｃａ２＋電流に対し濃度−依存効果を生じない（１および１０μＭのＢＭＳ−２０４３５２の場合に１５〜１６％縮小が見られ、電流減少に基づく同様な縮小が対照細胞で観察される）。
【０１３０】
また５０を超えるレセプタおよび酵素システム（ＰａｎＬａｂｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）およびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標））の結合スクリーン（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）に対しても、ＢＭＳ−２０４３５２を試験する。これらのシステムとしては、モーストＧ−たん白連結レセプタファミリー、リガンド−ゲート（ｇａｔｅｄ）イオンチャネルファミリーの見本、並びに幾つかの電圧−ゲートイオンチャネル結合部位、たとえばＬ型Ｃａ２＋チャネルのジヒドロピリジン・レセプタが挙げられる。
【０１３１】
初期テストで、ＢＭＳ−２０４３５２は、たった２つのリガンド：［３Ｈ］スピペロン，ドパミンＤ３リガンド（１０μＭで７４％抑制）、およびσ１リガンド［３Ｈ］（＋）ペンタゾシン（１０μＭで５４％抑制）の結合の有意な抑制をもたらした。しかしながら、後の再テストで、ヒトのドパミンＤ３レセプタとの有意な相互作用が全くないことを証明した。σ１リガンド結合の適度な抑制の有意性は、知られていない。
【０１３２】
実施例４
ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物の脳浸透度
虚血性周縁部は，低脈管灌流の領域である。神経保護剤が発作の開始後、治療用量で虚血性ニューロンに到達するには、それは非常に高い量で脳に入らなければならない。ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、その高度な親油性（ｃｌｏｇ Ｐ＝５．１）に基づき、神経保護剤として魅力がある。
【０１３３】
静脈内（ＩＶ）投与の後、ＢＭＳ−２０４３５２は素早くラットの脳へ高量で入り（Ｔｍａｘ＝１５分；５ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス用量の後の脳中Ｃｍａｘ＞１０μｇ／ｇ）、この場合、８時間にわたって検出されるトータル化合物の脳対プラズマの比は９．６である。プラズマ半減期は１．６時間で、脳半減期は１．９時間であった。これらのデータは、ＢＭＳ−２０４３５２が素早く高量で脳に入ることができ；脳対プラズマの高い比が、低灌流脳部分（たとえば虚血性周縁部）へ有効な量で分配される化合物の能力をサポートすることを証明する。
【０１３４】
実施例５
ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物の安全プロフィール：
ＢＭＳ−２０４３５２は、有望な前臨床安全プロフィールを有する。ＢＭＳ−２０４３５２のラット、麻酔をかけたイヌおよび意識のあるイヌへの投与は、１ｍｇ／ｋｇ・ＩＶの最も高い神経保護剤より少なくとも３倍高い用量の薬物によって、心拍数や平均動脈血圧が影響されないことを証明した。
【０１３５】
単一および数回−用量実験において（マウス、ラット、ラビットおよびイヌ）、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で１ケ月（ラット）および２０ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で１０日間（イヌ）ＩＶ投与した後に、ＢＭＳ−２０４３５２−関連細胞毒性標的器官の変化は全くなかった。加えて、ＢＭＳ−２０４３５２はインビトロおよびインビボで評価したが、遺伝子毒性はなく、かつラットおよびラビットにおいて奇形発生もない。
【０１３６】
実施例６
［３Ｈ］−グルタメート放出およびシナプス伝達を減衰させるマキシ−Ｋチャネルの開放：
マキシ−Ｋチャネルを、シナプス前に多くの脳部分に配置せしめ、該チャネルはシナプス前Ｃａ２＋進入の調節によって、神経伝達物質放出の転調に関与することができる［Ｈ．Ｇ．Ｋｎａｕｓらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１６：９５５−９６３、１９９６年）］。シナプス伝達は、末端への一過性高量のＣａ２＋流入によって起こるプロセスである。
【０１３７】
海馬のグルタメート・シナプスでのマキシ−Ｋカリウムチャネルのオープナーによるシナプス効力の縮小は、神経伝達物質レセプタ・アンタゴニストに関して適度であると予測されるが、Ｃａ２＋−感受性マキシ−Ｋチャネル・オープナーの存在の有用なニューロン指示薬であると思われる。ＢＭＳ−２０４３５２化合物の存在下インビトロの海馬組織の電界電気刺激は、０．５ｎＭ〜２０μＭの濃度に放射性同位元素標識グルタメートの放出において小さいが有意の縮小をもたらした。
【０１３８】
また電気生理学的実験も、インビボの麻酔をかけたラットで行なった。異なるグループのラットに、一定範囲の用量で投与したところ、５０ｎｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ・ＩＶの用量で、ＣＡ１領域の電気誘発の海馬電界電位に小さく、長期持続の、用量−依存の現象が観察され；ビヒクル並びに低および高用量は効果がなかった。これらの効果は確かに適度であるが、前臨床モデルを要する実験の用量決定に使用することができる。
【０１３９】
［ ３ Ｈ］−グルタメート放出
雄のスプラーグ（Ｓｐｒａｇｕｅ）−ダウレイ（Ｄａｗｌｅｙ）ラットからの海馬組織（３５０μＭウェッジ）を、それぞれｍＭ単位で、１２５のＮａＣｌ、３．０のＫＣｌ、１．２のＭｇＳＯ４、１．２のＣａＣｌ２、２２のＮａＨＣＯ３、１０のＮａＨ２ＰＯ４、１０のグルコース、１ｍＬ当り１ユニットのアデノシン・デアミナーゼを含有するクレブス（Ｋｒｅｂｓ）緩衝液で５回洗う。組織を、５μＣｉの［３Ｈ］グルタメート（ニュー・イングランド・ニュウクレア；比活性＝５０〜６０Ｃｉ／ｍモル）含有の緩衝液中、３７℃で３０分間培養する。組織を洗い流し室（Ｂｒａｎｄｅｌ装置）に移し、緩衝液で流速１ｍＬ／分にて６０分間洗う。ウォッシュ緩衝液を捨てた後、５分画分を流速０．５ｍＬ／分で集める。
【０１４０】
［３Ｈ］グルタメートの放出を、電界電気刺激（３５ｍＡ、１０Ｈｚ、パルス幅２ｍｓ、持続時間１分）で誘発する。組織は、画分３（Ｓ１）および１３（Ｓ２）の最初の瞬間の間に刺激する。ＢＭＳ−２０４３５２化合物をＳ２（画分７）の３０分前に導入し、画分１５の終りに除く。液体シンチレーション分光分析を用いて、放射能を定量し、ＢＭＳ−２０４３５２の濃度範囲にわたって、データをＳ２／Ｓ１比で表示する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）からなる統計的分析の後、テストを行なう（Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌｓ）。
【０１４１】
インビボの海馬における誘発電位の記録
雄のロング（Ｌｏｎｇ）−エバンス（Ｅｖａｎｓ）ラットに、１．２ｇ／ｋｇ腹腔内（ＩＰ）ウレタンで麻酔をかけ、該ラットを定位装置に入れる。海馬のＣＡ１錐体細胞層に、ステンレススチール記録電極を入れ、対側性海馬領域ＣＡ３に二極刺激電極を入れる。単一電気刺激（２〜１０Ｖ、０．５ｍｓ）を、０．１パルス／秒の割合で与える。得られる誘発電位を、差動増幅器で増幅し、次いでオフライン分析のためデジタル方式でサンプリングする。
【０１４２】
最低１時間の基線記録の後、ビヒクル注射液を投与し、その１時間後に、１回用量のＢＭＳ−２０４３５２化合物を投与する。化合物はＤＭＳＯに可溶化し、そして注射液は頸静脈カテーテルを介してＩＶ投与する。注射後４〜５時間のデータを集める。動物１匹当り、たった１回用量の単一化合物を試験した。実験の終りに、動物を灌流し、電極配置を組織学的に確かめる。計量を繰返してデータを分析し、ＡＮＯＶＡの後、薬物濃度の関数として個々の時間ポイントの有意差のＫｒｕｓｋａ−Ｗａｌｌｉｓテストを行なった。
【０１４３】
実施例７
急性発作のモデル：
近位中大脳動脈（ＭＣＡ）の永久病巣閉塞は、Ａ．タムラらが独創的に開発した方法［「Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．」（１：５３−６０、１９８１年）］を修正して行なう。永久片側ＭＣＡ、永久同側総頸動脈（ＣＣＡ）および一過性対側性ＣＣＡ（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル）において、正常血圧の雄Ｗｉｓｔａｒラットに、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｍ．）とキシラジン（４．５ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｍ．）の併用で麻酔をかける。
【０１４４】
側頭下接近（ｓｕｂｔｅｍｐｏｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）による左ＭＣの露出後、動脈の２ｍｍ切片を電気焼灼し、切断する。５分以内に、両ＣＣＡを露出し、閉塞する。左ＣＣＡを２つの縫合結紮で永久に閉塞し、右ＣＣＡをミクロ−動脈瘤クリップの使用で６０分間一時閉塞する。
【０１４５】
対側一過性ＣＣＡ閉塞は、一貫した大きな皮質梗塞を可能ならしめるのに十分に、副行流を縮小する［Ｓ．Ｂｒｉｎｔらの「Ｃｅｒｅｂｒ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．」（８：４７４−４８５、１９８８年）］。突発性高血圧ラット（ＳＨＲ）による実験において、同じＭＣＡ閉塞を行なうが、ＣＣＡ閉塞はせず。化合物を２％ＤＭＳＯ／９８％プロピレングリコールに溶解し、適当な時間ポイントにて（通常、閉塞の２時間後に）、尾の静脈に単一ＩＶボーラスで注射する。ビヒクル単独で処置したグループとの比較を行なう。
【０１４６】
各グループは、１２〜２４匹の動物を含有する。動物は終始３７℃に維持し、直腸プローブで監視する。閉塞の２４時間後、動物をいけにえにし、脳を取出し、梗塞の領域を判定するのに、染色する塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で評価する。脳のスライスの写真を撮り、コンピューター処理映像分析の援助で梗塞量を測定する。データは、ＡＮＯＶＡｓおよび適当なこのあとのテスト（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ）で分析する。
【０１４７】
ＭＲＩ ＭＣＡ閉塞実験［Ｆ．Ｌｉらの「Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．」（５４：６８９−６９６、２０００年）］において、成体雄ＳＨＲラット（３００〜３３０ｇ）に永久ＭＣＡ閉塞を行なう。上述の手術中、動物を３７℃に維持し、直腸温度を監視する。次いで動物を、磁気共鳴実験室に移動させる。
【０１４８】
ラットは最初に、３％イソフルランガスで麻酔をかけ、その後、ＭＲＩ測定中１％〜１．５％イソフルランガスで麻酔を維持する。１５ｃｍ勾配コイルを取付けた水平４．７Ｔマグネットを用い、２００ＭＨｚで画像化を行なう。拡散−加重画像（ＤＷＩ）は、閉塞の約１．５および５．５時間後に、６０ｍＴ／ｍの単一拡散勾配のＳＴＥＡＭシーケンスを用いて取得する。
【０１４９】
最初の時間ポイント後、ビヒクルまたはオープナー化合物（０．３ｍｇ／ｋｇ）をビヒクルに溶解したものを、閉塞の２時間後に投与する。ビヒクルまたは薬物の投与後５．５時間で、ＤＷＩ画像を取得する。また閉塞の２４時間後に、Ｔ２−加重脳画像も得る。１日当り２匹のラットを画像化し、ＴＴＣ染色を用いてＭＲＩ成果を組織学的に確認する。統計的分析は、他のＭＣＡ閉塞実験に一致する。
【０１５０】
実施例８
大きな永久血管閉塞のげ歯動物モデルにおいて、梗塞量を有効に縮小するマキシ−Ｋチャネルの開放：
急性病巣発作のげ歯動物モデルにおいて、３５２マキシ−Ｋチャネル・オープナーの活性を調べるため、ＭＣＡの永久閉塞の開始の２時間後に、該化合物を静脈内（ＩＶ）に投与する。一例として、閉塞の１または２時間後に、薬物投与の相対効果を比較した。
【０１５１】
神経保護効果の最初の特性決定は、ラセミ化合物，化合物１（化合物１：（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン）を用いて行なう。この実験で、ＭＣＡ閉塞後２４時間にわたる皮質梗塞進化の時間経過を、突発性高血圧ラット（ＳＨＲ）のグループにおいて、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）技法を用いて比較する。
【０１５２】
ラットに、永久ＭＣＡ閉塞開始の２時間後、ボーラスＩＶ用量０．３ｍｇ／ｋｇの化合物１またはビヒクルを投与する（図４Ａ）。この実験で、閉塞の５．５および２４時間後の化合物１−処置グループにおいて、皮質梗塞量の有意な縮小が見られる。
【０１５３】
次の永久ＭＣＡ閉塞のＳＨＲラットを用いる実験において、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇの数回の用量試験で、皮質梗塞量の有意な縮小をもたらす。非拮抗的ＮＭＤＡアンタゴニストのＭＫ−８０１（Ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ）およびＣＮＳ−１１０２（Ｃｅｒｅｓｔａｔ）は、早い時間ポイントで神経保護をもたらす用量にて、閉塞開始の２時間後に投与したが、効果はなかった。
【０１５４】
Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットにおいて、永久片側ＭＣＡ（ＰＵＭ）／永久同側総頸動脈（ＰＩＣ）閉塞と、対側性総頸動脈（ＴＣＣ）の一過性（１時間）閉塞の両方を組込んだモデルを用いたところ（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル：上記方法参照）、ＢＭＳ−２０４３５２およびラセミ化合物の化合物１は、同じレベルの神経保護をもたらす（図４Ｂ）。
【０１５５】
ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与すると、皮質梗塞の有意な縮小をもたらすが、３ｍｇ／ｋｇ用量では効果がない（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル；図４Ｃ）。
【０１５６】
他の実験において、薬物は０．００１μｇ／ｋｇの用量で有効でなく、かつ３ｍｇ／ｋｇ．ＩＶで効果のないことが確認され、これによって、誘発電位実験で見られるものに類似する広い有効用量範囲による、‘インバーテッド−Ｕ’用量−応答関係が示唆される（図４Ｄ参照）。ＢＭＳ−２０４３５２化合物を閉塞２時間後に投与した場合に４１％の最大縮小が見られるが、より典型的には２０〜３０％縮小である。
【０１５７】
ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、閉塞開始の１または２時間後に投与すれば、同じ程度に有効である（図４Ｅ）。これらの結果から、マキシ−Ｋチャネルの開放は、閉塞開始の少なくとも２時間後に投与すると、永久ＭＣＡ閉塞後に見られる皮質梗塞の程度を縮小する有効な戦略であることが示唆される。
【０１５８】
さらに、マキシ−Ｋチャネルの特性および該オープナーの新しいＣａ２＋−感受性を仮定すれば、ＢＭＳ−２０４３５２は非虚血性細胞の機能に関してほとんど効果を有しないと思われ、そして該化合物は、臨床試験において、特にニューロンカリウムチャネルを標的にする、ＣＮＳ用の有効な治療剤としての評価をサポートする前臨床安全プロフィールを有することが認められる。
【０１５９】
実施例９
（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン
ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン（０．５００ｇ、１．４ミリモル）［Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５６０２１６９の記載に準じ製造］およびトリエチルアミン（０．７２６ｍＬ、８．４ミリモル、６当量）の−７８℃溶液に、塩化チオニル（０．６１３ｍＬ、８．４ミリモル、６当量）を加える。
【０１６０】
冷却浴を取除き、反応混合物を室温まで加温せしめる。３時間後、得られる混合物を０℃に冷却し、０．１Ｎ塩化水素酸の水溶液（１０ｍＬ）を注意深く加えて、反応を抑える。内容物を水（１００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出する。
【０１６１】
コンバインした有機層を塩水（２５ｍＬ）で洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧濃縮する。粗残渣をシリカゲルカラム・クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４：１）で精製して、３２５ｍｇ（収率６２％）の所望生成物をオフホワイト固体で得る。固体を酢酸エチル／ヘキサンより再結晶して、分析上純粋な標記化合物を得る。
【０１６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．２４（１Ｈ、ｓ）、７．９１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．６）、７．５２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．６）、７．３０−７．２４（２Ｈ、ｍ）、７．１７（１Ｈ、ｓ）、７．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８）、３．３３（３Ｈ、ｓ）
ＭＳ，ＥＳＩ３９８（Ｍ−Ｈ）−
元素分析（Ｃ１６Ｈ１０Ｃｌ２Ｆ３ＮＯ２として）
計算値：Ｃ５１．０８、Ｈ２．６７、Ｎ３．７２
実測値：Ｃ５１．１１、Ｈ２．５３、Ｎ３．７２
【０１６３】
実施例１０
（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン
Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５６０２１６９に記載されるようなキラルＨＰＬＣカラムを用い、実施例９のラセミ化合物を、そのエナンチオマーに分離して、本例の標記化合物の単一（＋）エナンチオマーを得ることができる。
【０１６４】
実施例１１
（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン
Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５６０２１６９に記載されるようなキラルＨＰＬＣカラムを用い、実施例９のラセミ化合物を、そのエナンチオマーに分離して、本例の標記化合物の単一（−）エナンチオマーを得ることができる。
【０１６５】
実施例１２
ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現するＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関する、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）およびＢＭＳ−ＡまたはＮＳ−１６１９の効果：
本例は、ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現するよう遺伝子的に設計されたＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関し、ＮＳ−１６１９と呼ばれる公知ベンズイミダゾロン化合物［Ｄ．Ｓｔｒφｂａｅｋらの「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（３５：９０３−９１４、１９９６年）；およびＭ．ＭｃＫａｙらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（７１：１８７３、１９９７年）］に対する、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）およびＢＭＳ−Ａ化合物（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５８６９５０９の実施例８２参照）の使用の効果を判定するのに行った実験を記載する。
【０１６６】
これらの実験の場合、細胞保持電位は−８０または−１００ｍＶのいずれかであり、［Ｃａ２＋］ｉに適切な一連の１０ｍＶ脱分極電圧ステップを適用する。標準全細胞パッチ−クランプ技法は、ピペット中の［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭまたは５０ｎＭのいずれかで［Ａ．ＦａｂｉａｔｏおよびＦ．Ｆａｂｉａｔｏの「Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐａｒｉｓ」（７５：４６３−５０５、１９７５年）に記載の方法を織り込んだＥＱＣＡＬプログラムを用いて測定］、用いる。各［Ｃａ２＋］ｉの場合に用いる電圧の範囲は、細胞の［Ｃａ２＋］ｉおよびｈＳｌｏ発現レベルの小さな差異をなくすために変える。
【０１６７】
図５Ａは、２つの［Ｃａ２＋］ｉ条件（すなわち、５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉと２．５μＭの［Ｃａ２＋］ｉ）下の、対照（オープン符号）とＢＭＳ−Ａ（１μＭ）（クローズド符号）のマキシ−Ｋ電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。図５Ｂは、（薬物電流／対照電流）の比対電圧で示される、Ｉ−Ｖ電流データを示す。各データポイントは、４〜８細胞の平均値±標準誤差（ＳＥ）を示す。
【０１６８】
図５Ｃは、図５Ａで用いる同じ２つの［Ｃａ２＋］ｉの条件下、公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロンで実験した場合のマキシ−Ｋ・Ｉ−Ｖ関係を示す。図５Ｃにおいて、対照はオープン符号で示され、薬物はクローズド符号で示される（円）。図５Ｄは、比対電圧で示す、図５ＣのＩ−Ｖ電流データを示す。
【０１６９】
各データポイントは、９〜１１細胞の平均値±ＳＥを示す。かかる結果から観察されるように、高い細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭ）は、低濃度の細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ＝５０ｎＭ）を用いて生じる関係と比較して、よりネガチブな電圧に対するＩ−Ｖ関係をシフトし、これによって、半−最大賦活電圧（Ｖｍ）において明らかな左方向シフトが示される。
【０１７０】
ＮＳ−１６１９の効果は、各［Ｃａ２＋］ｉの場合同じで、高電圧でｈＳｌｏ−仲介電流振幅を増大する。
これに対し、ＢＭＳ−Ａは、［Ｃａ２＋］ｉに強く依存するチャネルに対して示差効果を明らかにする。特に、［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭの場合、ＢＭＳ−Ａは最高電圧でｈＳｌｏ−仲介電流振幅を増大する。
【０１７１】
［Ｃａ２＋］ｉ＝５０ｎＭの場合、ＢＭＳ−Ａは広範囲の電圧にわたって、実際に電流振幅を減少させる。これらのデータは、ＮＳ−１６１９化合物の場合、［Ｃａ２＋］ｉに依存しない、一般的で非特異的なチャネル開放活性を示す。しかしながら、ＢＭＳ−Ａのチャネル開放を行なう能力は、［Ｃａ２＋］ｉに対して感受性であることが証明される。
【０１７２】
本発明で引用する全ての特許、特許出願、公開ＰＣＴ出願並びに記事、書物、文献、参考マニュアルおよびアブストラクトの内容をそっくりそのまま、参考までにここに導入して、本発明が関係する技術の現状をより詳しく説明する。
【０１７３】
上述の主題事項において、本発明の技術的範囲および精神から逸脱せずに種々の変更を成すことができるので、意図される点は、上記説明に含まれる、あるいは特許請求の範囲で規定される全ての主題事項が本発明の記述的および例示的事項であると解釈されることである。かかる教えに鑑み、本発明の数多くの修正および変化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】高量（１．０μＭ）の細胞内Ｃａ２＋を含有の培地で灌流した細胞中、ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞のピーク全細胞電流に関し、ＢＭＳ−２０４３５２オープナー化合物の効果を明らかにし、図１Ａは電流と電圧の関係を示すグラフ、図１Ｂは図１Ａのデータの用量応答を示すグラフである。
【図２】ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の全細胞電流に関し、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２０４３５２化合物（５μＭ）の効果を明らかにし、図２Ａは、内部［Ｃａ２＋］フリーを変えた条件下の全細胞外部電流のＩ−Ｖ関係を示すグラフ、図２Ｂは、薬物電流／対照電流の比と電圧の関係を示すグラフであり、図２Ｃは、１μＭ［Ｃａ２＋］ｉで実験した代表的電流を示す。
【図３】全細胞パッチ−クランプ技法を用い、クローン化ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の外部カリウム電流に関し、各種［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２２５１１３オープナー化合物（１０μＭ）の効果を示し、図３Ａは電流と電圧の関係を示すグラフ、図３Ｂは薬物Ｉ／対照Ｉの比と電圧の関係を示すグラフである。
【図４】発作を持つラットモデルにＢＭＳ−２０４３５２オープナー化合物を投与したインビボ実験の結果を示し、図４Ａは、インビトロのラット海馬組織ウェッジからの［３Ｈ］グルタメートのＢＭＳ−２０４３５２化合物による、電気刺激放出の転形を示すグラフ、図４Ｂは、麻酔ラットにＢＭＳ−２０４３５２をインビボ投与し、ＣＡ３領域の対側性交連線維系の刺激によって生じる、ＣＡ１領域に記録された電界電位の縮小を示すグラフ、図４Ｃは、ＳＨＲラットにおいて永久片側ＭＣＡ閉塞の２時間後に化合物１を投与したことによる、磁気共鳴映像を用いて測定した皮質梗塞量の縮小を示すグラフ、図４Ｄは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットの皮質梗塞量に対するラセミ化合物１とＢＭＳ−２０４３５２（０．３ｍｇ／ｋｇＩＶ）の効果の比較を示すグラフ、図４Ｅは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットにおいて、ＭＣＡ閉塞開始の２時間後にＢＭＳ−２０４３５２を投与した場合の、用量−応答関係を示すグラフ、図４Ｆは、正常血圧Ｗｉｓｔａｒラットにおける皮質梗塞量の縮小に関し、閉塞開始後１または２時間のＢＭＳ−２０４３５２（１ｍｇ／ｋｇＩＶ）の投与効果の比較を示すグラフである。
【図５】ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現させるＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関し、細胞内Ｃａ２＋濃度と、ＢＭＳ−Ａ化合物または公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロン化合物の効果を示し、図５Ａは、５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉと２．５μＭの［Ｃａ２＋］ｉ下の、対照とＢＭＳ−Ａ（１μＭ）のマキシ−Ｋ電流−電圧関係を示すグラフ、図５Ｂは、薬物電流／対照電流の比と電圧の関係を示すグラフ、図５Ｃは、ＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロンで実験した場合のマキシ−Ｋ・Ｉ−Ｖ関係を示すグラフ、図５Ｄは、上記比と電圧の関係を示すグラフである。
（技術分野）
本発明は、細胞内カルシウム濃度に対し非常に敏感で、かつ高い細胞内カルシウムの条件下でコンダクタンスの大きいカリウムチヤネル（マキシ（ｍａｘｉ）−Ｋ＋、マキシ−ＫまたはＢＫカリウムチヤネル）を選択的に開けることが新たにわかった、これらチャネルのモジュレーター、特にオープナーあるいはアクチベーターの同定に関する。かかるカルシウム−感受性オープナーは、高い細胞内カルシウム濃度の症状と関連する疾患および障害、特に神経学的病理もしくは神経変性病理、疾患および障害、たとえば虚血性発作の処置に特に有効となりうる。
【０００２】
（背景技術）
コンダクタンスの大きいカルシウム（Ｃａ２＋）−活性化カリウム（マキシ−Ｋ＋、マキシ−ＫまたはＢＫと称す）チャネルは、脳を含めほとんどの組織で見られる。マキシ−Ｋチャネルは、その大きなコンダクタンス並びに活性化のためのＣａ２＋および膜電位の存在に対する信頼に基づきユニークである。該チャネルは、細胞内のＣａ２＋量（［Ｃａ２＋］ｉ）の増加、および／または膜脱分極に応じて自然に開き、このため、細胞からのカリウム（Ｋ＋）流出および細胞膜電位の調節を可能にする。この活性は、内因性フィードバック機構として役立ち、それによって、細胞はもとの興奮性の少ない、過分極電位の高い状態に戻ることにより、細胞へのさらなる電圧−依存Ｃａ２＋進入を限定する。
【０００３】
哺乳類のマキシ−Ｋチャネルは、７つの膜ドメイン含有たん白であって、Ｃａ２＋の結合に必要と思われる、大きなカルボキシ−末端領域を有する［Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒらの「Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２：４１６−４２１、１９９９年）；Ｐ．Ｍｅｅｒａらの「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」（９４：１４０６６−１４０７１、１９９７年）；Ｖ．Ｋ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（３７：３１９−３４７、１９９７年）］。ヒトニューロンや他の組織で発現されるマキシ−Ｋチャネルとしては、ｈＳｌｏ１遺伝子ファミリー・メンバーが包含される［Ｓ．Ｉ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．」（２７：１８９−１９３、１９９４年）；Ｄ．Ｐ．ＭｃＣｏｂｂらの「Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」（２６９：Ｈ７６７−Ｈ７７７、１９９５年）］。
【０００４】
ニューロンにおけるマキシ−Ｋチャネルは、選択的スプライシング［Ｊ．Ｔｓｅｎｇ−Ｃｒａｎｋらの「Ｎｅｕｒｏｎ」（１３：１３１５−１３３０、１９９４年）］、ベータ・サブユニット・アセンブリー［Ｓ．Ｉ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１６：４５４３−４５５０、１９９６年）およびＲ．Ｂｒｅｎｎｅｒらの「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」（２７５：６４５３−６４６１、２０００年）］および密に関係するファミリー・メンバー，ｈＳｌｏ２またはＳｌａｃｋとの可能なコアセンブリー［Ｗ．Ｊｏｉｎｅｒらの「Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１：４６２−４６９、１９９８年）］の結果として，重要な表現型変動を示す。
【０００５】
この変動に拘らず，全てのマキシ−Ｋチャネルは電圧−およびＣａ２＋−依存性を有し、従って、重要な脱分極の期間中および／またはニューロン内部のＣａ２＋量が高いときのみに、上記チャネルの活性化限界に到達する［Ｏ．ＭｃＭａｎｕｓの「Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．」（２３：５３７−５６０、１９９１年）およびＫ．Ｔ．ＷａｎｎおよびＣ．Ｄ．Ｒｉｃｈａｒｄｓの「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（６：６０７−６１７、１９９４年）］。従って、これらチャネルの薬理学的遮断は、正常なニューロン機能に対して非常に穏当な効果を持つ［Ｋ．Ｎ．Ｊｕｈｎｇらの「Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｒｅｓ．」（３４：１７７−１８６、１９９９年）］。しかしながら、これらのチャネルが開いているとき、それらは細胞膜電位の有効な調節器である。
【０００６】
発作は、世界中の非常に多くの人々に対して死や長期の廃疾をひき起こす神経学的症状のよく知られた具体例である。実際に、米国だけでも、毎年７０００００以上もの人々が発作に苦しんでいる［Ｇ．Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓらの「Ｓｔｒｏｋｅ」（３０：２５２３−２５２８、１９９９年）］。目下、たった１つの形態の療法、すなわち、血栓崩壊のみが、限られた患者母集団における急性発作の結果の改善に有効であることが知られている［Ｍ．Ｆｉｓｈｅｒの「Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ」（７：１６５−１６９、１９９９年）］。
【０００７】
最も一般的形態の疾患である、急性虚血性発作は、閉塞した管に対して遠位の、激しく損傷した組織の芯領域をもたらし、該芯領域は、芯への近接およびおそい脈管灌流のため死の危険状態の周縁部組織で取り巻かれている［Ｇ．Ｓｃｈｌａｕｇらの「Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ」（５３：１５２８−１５３７、１９９９年）］。エネルギー有効性の低下、過度の興奮性アミノ酸放出、高い細胞内カルシウムおよびニューロンの高興奮性によって起こる神経毒性生化学カスケードの結果、周縁部の虚血性ニューロンは死ぬ［Ｕ．Ｄｉｒｎａｇｌらの「Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２２：３９１−３９７、１９９９年）］。
【０００８】
神経保護化合物は、管閉塞後の危険なニューロン細胞に対しある程度の保護を付与するようになっているが、見込みのある臨床前の支持データにも拘らず、再三再四、臨床試験ではうまく行かなかった［Ｋ．Ｋ．Ｊａｉｎの「Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ」（９：６９５−７１１、２０００年）］。ヒトの臨床試験で神経保護化合物を用いる成功の欠如は、副作用が存在することに帰し、これによって、その有用性あるいは用量が制限される。他の作用物質について完全に試験したが、効きめを証明できなかった［Ｊ．Ｄｅ Ｋｅｙｓｅｒらの「Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（２２：５３５−５４０、１９９９年）］。
【０００９】
マキシ−Ｋチャネルは、細胞機能において重大な調節の役目を演じることから、これらのチャネルは特に、発作中に影響されるニューロン細胞で、重要な治療標的を構成する。これらのチャネルの転形（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）は、高興奮性またはＣａ２＋の病原性量の条件にさらされる細胞、特にニューロン細胞、および／またはニューロン起点の細胞を保護する治療的選択を提供することができよう。マキシ−Ｋチャネルのオープナーが記載されているが、これらのオープナーは、十分な効力および治療剤として使用できるという特異性に欠くことがわかった［Ｖ．Ｋ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（５０：２０６−２１７、１９９６年）；Ｊ．Ｅ．Ｓｔａｒｒｅｔｔらの「Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ」（２：４１３−４２８、１９９６年）］。
【００１０】
当該分野で必要なのは、新しいモジュレーター、特に、特殊な条件下、たとえば高い細胞内カルシウム濃度下で細胞の標的にされるマキシ−Ｋチャネルたん白に対し選択的作用を示す、マキシ−Ｋチャネルのオープナーまたはアクチベーターである。かかるオープナー化合物は一般に、細胞内の環境がカルシウム濃度の高いものである疾患およびマキシ−Ｋチャネルがオープナー化合物によって標的にされる疾患の処置用に設計することができる。さらに詳しくは、かかるオープナー化合物は、ニューロン病理および疾患、たとえば発作（特に、虚血性発作）の処置用に設計できるが、これは、発作中の神経毒性によって破壊される細胞に起こる生理学的プロセスに基づく。
【００１１】
また当該分野において、マキシ−Ｋチャネルが活性である細胞、特に虚血性細胞に起こる条件（状態）、および条件に依存し、かつかかる条件下でその効果を発揮して、危険な細胞の標的を活性化する、薬物、化合物、小分子、治療剤等を包含するマキシ−Ｋオープナーまたはアゴニストの発見および設計の理解も必要とされ、かつ本発明によってその理解が得られる。
【００１２】
本発明は、有効で選択的なオープナー化合物、およびその使用方法を提供する。これらの化合物は、マキシ−Ｋチャネルに対するその作用において条件に依存するように設計されており、該オープナーは高い細胞内カルシウム条件下、たとえば虚血性細胞の条件下で有効に働くことにより、虚血保護を付与するが、正常な細胞、および／またはこのような高い細胞内カルシュウム条件を有さない細胞に対しては実質的に効果を有さないようになっている。これに対し、他のオープナー化合物は、細胞内カルシウム濃度に対する感受性に欠けるのが認められ、従って、その作用は細胞内カルシウムの濃度に依存しない。
【００１３】
本明細書で記載されるように、本発明は、高量の細胞内カルシウムではマキシ−Ｋチャネルの有力で特殊な開放機能を示すが、細胞内カルシウム量の低い細胞のこれらのチャネルに対してほとんど効果を有さない、マキシ−Ｋチャネルの新しいカルシウム−依存オープナー、またはカルシウム・コ−アゴニストを規定する。
【００１４】
（発明の概要）
本発明は、哺乳類のマキシ−Ｋチャネルのオープン（開放）確率を増大し、かつ該チャネルの機能を増加する、新規なマキシ−Ｋチャネル・オープナーまたはアクチベーター化合物を提供する、かかるオープナーは、細胞の細胞内カルシウム濃度に対し敏感で、かつ高い細胞内カルシウム濃度、たとえばミクロモル範囲下で最も有効であるが、正常な、たとえば生理的下の、低い細胞内カルシウム濃度に対しては、効果が最小限であるか、もしくは少しも効果を有しないことが明らかである。
【００１５】
本発明は、特別な側面において、高い細胞内カルシウム量、たとえば神経変性疾患（発作など）中危険な状態のニューロンに存在する量の条件下で機能する、マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の形態の新規な神経保護剤に関係する。
【００１６】
また本発明の目的は、ニューロン興奮性と神経系の細胞中のＣａ２＋進入を限定する内因性系から成る、標的、すなわち、マキシ−Ｋチャネルたん白を転調する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）、方法および化合物を提供することである。本発明によれば、新規化合物は、たとえば急性発作や関連症状中に、細胞内Ｃａ２＋量が正常より高く、たとえばミクロモル範囲になると、マキシ−Ｋチャネルを開けるように設計されている。
【００１７】
本発明の別の目的は、特に虚血性ニューロンを標的にして、マキシ−Ｋチャネルの機能の増加によりかかるニューロンのマキシ−Ｋチャネルたん白、特にヒトマキシ−Ｋチャネルの転調によって、虚血保護を付与し、これによって、医薬標的の条件−依存性活性化を可能ならしめ、かつ他の細胞や非虚血性細胞と比較して、細胞内Ｃａ２＋量の高い虚血性細胞への該化合物の作用を限定する、方法および化合物を提供することである。
【００１８】
本発明のまた別の目的は、本発明の選択的マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナーから成る医薬組成物を提供することであり、ここで、該組成物はさらに医薬的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤を含有する。
【００１９】
本発明のまた別の目的は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で選択的に機能して、マキシ−Ｋカリウムチャネルを開け、たとえばＫ＋流出を増加したり、電圧−依存Ｃａ２＋流入を縮小する、マキシ−Ｋチャネル・モジュレーター、作用物質（剤）または化合物を選別、同定または検出するアッセイおよび方法を提供することである。
【００２０】
好ましいオープナー化合物は、マキシ−Ｋカリウムチャネルたん白に影響を及ぼし、かつ高い細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋチャネルたん白に対しその活性を選択的に発揮するよう機能するが、正常なまたは低い細胞内カルシウム濃度の条件下ではマキシ−Ｋチャネルたん白にその活性を発揮しないものである。
【００２１】
かかる選別（スクリーニング）法としては、該モジュレーター、作用物質または化合物が高い細胞内Ｃａ２＋量の条件下でマキシ−Ｋチャネルを標的にしこれに作用する能力を、正常なまたは低い細胞内Ｃａ２＋量の条件下のマキシ−Ｋチャネルを標的にし作用する能力と比較して評価することが包含されうる。
【００２２】
本発明の他の目的は、特に記載の選別法によって得られるような、マキシ−Ｋチャネル・アゴニストまたはアクチベーターとしての新規なオープナー化合物およびマキシ−Ｋモジュレーターを提供することである。
【００２３】
また本発明の他の目的は、哺乳類、特にヒトの疾患で、被作用細胞が高量の細胞内カルシウムを有し、被作用細胞の高い細胞内カルシウム濃度の結果として、マキシ−Ｋチャネルたん白が明確に標的にされることを特徴とする疾患の処置または予防法を提供することである。かかる疾患の具体例としては、これらに限定されるものでないが、発作、全般脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、てんかん、片頭痛および慢性神経変性障害、たとえばアルツハイマー病が挙げられる。
【００２４】
さらに本発明の特別な他の目的は、哺乳類、好ましくはヒトの神経学的疾患、特に発作、さらに詳しくは急性虚血性発作の処置または予防法を提供することで、該方法において、高量の細胞内Ｃａ２＋を有する細胞（たとえば虚血性ニューロン）のマキシ−Ｋチャネルを標的にしかつ活性化する選択的能力を有するが、非虚血性または正常なニューロンを有意に標的とせずかつ活性化しない、マキシ−Ｋチャネルのオープナーを使用する。
【００２５】
また本発明の別の目的は、新しい種類のＣａ２＋−感受性および選択的マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物、およびその具体的メンバーを提供することである。
さらに本発明の別の目的は、本明細書で詳しく記載される、Ｃａ２＋−感受性および選択的マキシ−Ｋチャネル・オープナーであることが新たにわかったクロロ−オキシンドール（ｏｘｉｎｄｏｌｅ）化合物を提供することである。
【００２６】
なお、本発明のさらに他の目的、特徴および利点については、添付の図面を参照し、かつ発明の詳細な説明を読めば、容易に理解されるだろう。
【００２７】
図１Ａおよび１Ｂは、高量（１．０μＭ）の細胞内Ｃａ２＋を含有の培地で灌流した細胞中、ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞のピーク全細胞電流に関し、マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物，ＢＭＳ−２０４３５２（３−置換オキシンドール誘導体）の効果を証明する。図１Ａは、電流−電圧関係を示す（平均値±ＳＥ；ｎ＝５、但し、ウオッシュ（ｗａｓｈ），ｎ＝３）。図１Ｂは、図１Ａのデータの用量応答を示す。薬物の電流振幅は、＋３０ｍＶで測定し、＋３０ｍＶで測定した対照電流のパーセントで表示する。
【００２８】
図２Ａ−２Ｃは、ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の全細胞電流に関し、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２０４３５２化合物（５μＭ）の効果を証明する。図２Ａは、内部
［Ｃａ２＋］フリーを変えた条件下の全細胞外部電流のＩ−Ｖ関係を示す。（ｉ．），（オープン符号）は対照条件を示し、（ｉｉ．），（クローズド符号）は５μＭ−ＢＭＳ−２０４３５２を示す（平均値±ＳＥ；各データポイントｎ＝３〜２０；図１Ａおよび１Ｂのデータを１μＭ Ｃａ２＋グループに含ませる）。図２Ｂは、（薬物電流／対照電流）の比対電圧で示される、図２Ａの電流データを示す。図２Ｃは、１μＭ［Ｃａ２＋］ｉで実験した代表的電流を示す。図２Ａにおいても同様、（ｉ．）は対照を示し、（ｉｉ．）は５μＭのＢＭＳ−２０４３５２化合物の存在下で実施する。
【００２９】
図３Ａおよび３Ｂは、全細胞パッチ（ｐａｔｃｈ）−クランプ（ｃｌａｍｐ）技法を用い、クローン化ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の外部カリウム電流に関し、各種［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２２５１１３オープナー化合物（１０μＭ）の効果を示す。保持電位は、［Ｃａ２＋］ｉ＝２５０ｎＭおよび１μＭの場合で−８０ｍＶ、［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭの場合−１００ｍＶであった。［Ｃａ２＋］ｉに適する一連の１０ｍＶ脱分極電圧ステップを適用した。［Ｃａ２＋］ｉを２５０ｎＭから１．０μＭ、または２．５μＭに増加すると、ピーク電流−電圧関係が左へシフトし、このようにＶ１／２に見掛けの左方向のシフトが示される。図３Ａにおいて、ＢＭＳ−２２５１１３化合物（１０μＭ）は、［Ｃａ２＋］ｉが高くなればなる程その条件下でマキシ−Ｋ電流の増大をもたらした。図３Ｂにおいて、図３Ａのデータを、（薬物電流／対照電流）の比対電圧で表わす。（各データポイントは、３〜９細胞の平均値±ＳＥを示す）
【００３０】
図４Ａ−４Ｆは、発作に関連する数匹のラットモデルにＢＭＳ−２０４３５２オープナー化合物を投与したインビボ実験の結果を示す。図４Ａは、インビトロのラット海馬組織ウェッジ（ｗｅｄｇｅｓ）からの［３Ｈ］グルタメートのＢＭＳ−２０４３５２化合物による、電気刺激放出の転形（調整）を示す。該化合物は、放射性同位元素標識グルタメートの放出を穏当かつ有力に抑制した。＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【００３１】
図４Ｂは、麻酔をかけたラットにインビボでＢＭＳ−２０４３５２（ＩＶ巨丸剤）を投与し、薬物注射の２時間後に判断したところ、ＣＡ３領域の対側性交連線維系の刺激によって生じる、ＣＡ１領域に記録された電界電位の小さいが重要な縮小となることを示す。広い範囲の用量，５０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇがこのモデルに有効であった。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。挿入図は、（ｉ．）の前と１００ｎｇ／ｋｇのＢＭＳ−２０４３５２投与後（２時間；ｉｉ．）の誘電電位の一例を示す。これらの効果は常に、長く永続し、かつ最長実験の期間（４〜５時間）中持続した。
【００３２】
図４Ｃは、ＳＨＲラットにおいて永久片側ＭＣＡ閉塞の２時間後に化合物１を投与したことによる、磁気共鳴映像を用いて測定した皮質梗塞量の縮小を示す。ＭＲＩで見られるこれらの結果は、閉塞開始の２４時間後に組織学的技法で確認した。＊Ｐ＜０．０５。
【００３３】
図４Ｄは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットの皮質梗塞量に対するラセミ化合物１とＢＭＳ−２０４３５２（０．３ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）の効果の比較を示す（永久片側ＭＣＡ閉塞、永久同側ＣＣＡ閉塞、一過性対側性ＣＣＡ閉塞の併用モデル；ＭＣＡ閉塞開始の２時間後にＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル、ＢＭＳ−２０４３５２を投与）。＊＊Ｐ＜０．０１。
【００３４】
図４Ｅは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラット（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル）において、ＭＣＡ閉塞開始の２時間後にＢＭＳ−２０４３５２を投与した場合の、用量−応答関係を示し、図４Ｂにおけるシナプス転形に見られるものに類する有効用量−応答関係を証明する。発作および誘発電位モデルにおける３ｍｇ／ｋｇ以上の用量での効きめの反転メカニズムは、不明である。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。
【００３５】
図４Ｆは、正常血圧Ｗｉｓｔａｒラット（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル）における皮質梗塞量の縮小に関し、閉塞開始後１または２時間のＢＭＳ−２０４３５２（１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ）の投与効果の比較を示す。これら２つの閉塞後時間ポイントでは、マキシ−Ｋチャネル・オープナーの効果を統計的に区別できない。＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５。全てのデータは、閉塞開始後２４時間で収集した。
【００３６】
図５Ａ−５Ｄは、ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現させるＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関し、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）と、ＢＭＳ−Ａ化合物または公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロン化合物使用の効果を表わす。図５Ａは、２つの［Ｃａ２＋］ｉ条件（すなわち、５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉと２．５μＭの［Ｃａ２＋］ｉ）下の、対照（オープン符号）とＢＭＳ−Ａ（１μＭ）（クローズド符号）のマキシ−Ｋ電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。
【００３７】
図５Ｂは、図５Ａのデータに対し（薬物電流／対照電流）の比対電圧で示される、Ｉ−Ｖ電流データを示す。各データポイントは、４〜８細胞の平均値±標準誤差（ＳＥ）を示す。
【００３８】
図５Ｃは、［Ｃａ２＋］ｉが５０ｎＭおよび２．５μＭの条件下、公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロンで実験した場合のマキシ−Ｋ・Ｉ−Ｖ関係を示す。対照はオープン符号で示され、薬物はクローズド符号で示される。
【００３９】
図５Ｄは、図５Ｃのデータに対し比対電圧で示す、図５ＣのＩ−Ｖ電流データを示す。各データポイントは、９〜１１細胞の平均値±ＳＥを示す。注目として、ＢＭＳ−Ａ（図５Ａ、５Ｂ）は実際に、低［Ｃａ２＋］ｉ（たとえば５０μＭ）でマキシ−Ｋチャネル電流を縮小するが、ＮＳ−１６１９は両［Ｃａ２＋］ｉで、同量の電流増加をもたらす。
【００４０】
（発明の詳細）
本発明は、哺乳類マキシ−Ｋカリウムチャネル、特にヒトマキシ−Ｋチャネルの開放確率を増大し、かつ機能を増加する、新規なマキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物を提供する。かかるオープナーは新たに、細胞の細胞内カルシウム濃度に対し敏感であることを特徴とし、かつ高い細胞内カルシウム濃度（たとえばミクロモル範囲）の条件下で最も有効であるが、正常な、たとえば生理的下の、低い細胞内カルシウム濃度に対しては、効果が最小限であるか、もしくは少しも効果を有しないことが明らかである。すなわち、本明細書記載のオープナーは、細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルへの活性を発揮するためには、細胞内カルシウム濃度が増殖していない細胞内カルシウム濃度より高いことを必要とする。
【００４１】
本発明は、特別な側面において、高い細胞内カルシウム量、たとえば神経変性疾患（発作など）中危険な状態のニューロンに存在する量の条件下で機能する、マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の形態の新規な神経保護剤に関係する。
【００４２】
マキシ−Ｋイオンチャネルは、カリウム（Ｋ＋）流出を著しく増大し、膜を急速に過分極し、次いで電圧−依存Ｃａ２＋流入をさらに縮小することにより、細胞内Ｃａ２＋および膜脱分極の実質的な増加に反応するたん白である［Ｖ．Ｋ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（３７：３１９−３４８、１９９７年）］。本発明は、特定のマキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物が、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルに対し選択的に作用を発揮するが、正常な、適度のあるいは低い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルに対しては、最小限の作用しか、あるいは全く作用を発揮しないという発見に関連する。
【００４３】
すなわち、本発明に係る新規オープナー化合物（“オープナー”または“マキシ−Ｋオープナー”）は、細胞の細胞内カルシウム濃度に対し極めて敏感であり、かつカルシウム増加条件下で最も有効であるが、生理的に正常乃至低い細胞内カルシウム濃度下では、効果が最小限であるか、もしくは少しも効果を有しないことが証明されている。
【００４４】
このことは特に、細胞内カルシウムの増大または蓄積が、細胞に外傷性ストレスを起こし、および／または病理、細胞毒、アポプトシスまたは死に関係する疾患、症状または障害の場合に重要である。急性虚血性発作は、細胞内Ｃａ２＋の蓄積が、虚血性周縁部の細胞の最後の死の主要な近い原因と思われる、特別な疾患である［Ｄ．Ｗ．Ｃｈｏｉの「Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１８：５８−６０、１９９５年）；Ｔ．ＫｒｉｓｔｉａｎおよびＢ．Ｋ．Ｓｉｅｓｊｏの「Ｓｔｒｏｋｅ」（２９：７０５−７１８、１９９８年）］。
【００４５】
本発明のマキシ−Ｋオープナーは特に、高い細胞内カルシウム量の細胞、たとえば虚血性ニューロンを標的にするよう設計されている。すなわち、本発明が新たに提供する化合物の活性が、高濃度の内部カルシウムを有する細胞に対し限定的かつ選択的であるため、これらの化合物は本発明によって、副作用を有意に縮小、たとえば血圧を低下するよう規定される。
【００４６】
加えて、本発明に係る化合物およびその使用は、正常または低い内部カルシウム量を有する細胞を、実質上影響を及ぼさない状態にする。ガイダンスとして、高量の細胞内カルシウムの非制限的具体例は、概して高ナノモル（たとえば約２５０または３００ｎＭ以上）〜ミクロモル（たとえば約１〜１０μＭ）範囲にあると考えられ；正常または生理的量の細胞内カルシウムは概して、約５０ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲にあると考えられ；および低量の細胞内カルシウムは概して、約５〜５０ｎＭの範囲にあると考えられる。
【００４７】
本発明の化合物は、Ｃａ２＋感受性がマキシ−Ｋチャネルに対する該化合物作用と関連し、このため、疾患の危険な状態にある細胞への作用力を制限し、また発作などの神経変性疾患の場合にも、急性発作および関連症状中の、正常量より高いＣａ２＋を有する細胞には虚血保護を付与するように設計されている。
【００４８】
本発明は、マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の活性に、独特の高レベルのＣａ２＋感受性を組み入れることにより、非虚血性細胞への衝撃が最小限であるより有効な神経保護剤を提供する。神経学的障害および疾患の場合、これは、潜在的に病的量の細胞内Ｃａ２＋にさらされないニューロンや他の細胞のマキシ−Ｋチャネルに対する薬物作用を、大いに減少させる。
【００４９】
従って、本明細書記載の化合物および方法は、正常または影響を受けていないニューロンの、並びに潜在的に病的または致死量の細胞内Ｃａ２＋にさらされない他の細胞のマキシ−Ｋチャネルに対する薬物作用を、大いに減少させるように規定される。高量の細胞内Ｃａ２＋に対し独特に敏感なオープナー薬物／化合物の創造により、高い細胞内Ｃａ２＋量を有することが特徴でない、非虚血性細胞または他のタイプの細胞において、Ｃａ２＋およびＫ＋調節の混乱をほとんどなくすべきである。加えて、かかるオープナー薬物／化合物は、虚血性発作の回復においてマキシ−Ｋチャネル・オープナーに対し神経保護の役割を付与する。
【００５０】
マキシ−Ｋチャネル・オープナーとしての使用に好適な化合物は、高い細胞内カルシウム濃度の存在下で活性であるが、低いまたは正常な生理的細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋチャネルの開放に対しほとんど乃至全く有意な活性を有しないものである。神経保護剤として使用する場合、該化合物は脳に浸透しうることが好ましい。
【００５１】
高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞に対し選択的機能を有する化合物の１つの種類としては、Ｐ．ＨｅｗａｗａｓａｍらのＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５５６５４８３および５６０２１６９に記載の、３−フェニル置換オキシンドール誘導体が含まれる。フルオロ−オキシンドール化合物は、上記種類に属し、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞に対しマキシ−Ｋチャネル・オープナーとして選択的に作用することができ、かつ正常な、適度のまたは低い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを開けるのにはっきりと感知できる程度には作用しない。
【００５２】
フルオロ−オキシンドール化合物の１つのメンバーは、マキシ−Ｋオープナー化合物の（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン、または高い細胞内カルシウム濃度の条件下、ヒトの胎芽腎（ＨＥＫ−２９３）細胞で発現されるヒト脳マキシ−Ｋチャネル・α−サブユニット，ｈＳｌｏの選択的で有効なオープナーであることが［Ｓ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．」（２７：１８９−１９３、１９９４年）］、本発明に従って新たに判定されたＢＭＳ−２０４３５２である。
【００５３】
本発明によれば、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、低い、適度のまたは正常な細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）を有する細胞とは対照的に、高い［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルに対し作用を発揮する、カルシウム感受性オープナーとして機能することがわかった。本明細書に記載の如く、本発明に係るＢＭＳ−２０４３５２化合物を用いる実験により、マキシ−Ｋチャネルを開けるＢＭＳ−２０４３５２の能力に関し異なる［Ｃａ２＋］ｉの効果を調べた。
【００５４】
さらに詳しくは、全細胞電圧−クランプ・電気生理学的技法に従って、異なる濃度のＣａ２＋（［Ｃａ２＋］フリー＝５０ｎＭ、２５０ｎＭ、１μＭまたは２．５μＭ）含有のピペットを用い、ｈＳｌｏ−仲介外部電流を記録し、クランプ締めした細胞を５μＭのＢＭＳ−２０４３５２化合物にさらした（実施例１）。実施例１および２に記載の実験結果から、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、１μＭの内部［Ｃａ２＋］フリーを有する細胞において、濃度−依存および逆転方法で全細胞ｈＳｌｏ−仲介外部電流を増大した（図１Ａおよび１Ｂ；図２Ａおよび２Ｂ）。
【００５５】
“正常な”または生理的に正常な細胞に見られるような低細胞内カルシウム、たとえば約５０〜２５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉで、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、クローン化ヒトＳｌｏマキシ−Ｋチャネルの開放確率に関してほとんど効果を有さないことがわかった（実施例２）。しかしながら、細胞内カルシウムをμＭ範囲に上げると、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、これらのチャネルの有力で特殊なオープナーとなる（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００５６】
本発明に従って、ユニークな高［Ｃａ２＋］ｉ−選択的および感受的特性と、高［Ｃａ２＋］ｉに関連するオープナー機能を有する他の新規な化合物としては、クロロ−オキシンドール化合物が包含され、その中でＢＭＳ−２２５１１３（すなわち、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン）は、特別でかつ非制限的な具体例である。
【００５７】
ＢＭＳ−２０４３５２化合物と同様、ＢＭＳ−２２５１１３化合物も、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞マキシ−Ｋチャネルに対しその効果を発揮するが、低いまたは正常な細胞内カルシウム濃度の細胞のこれらのチャネルに対し最小限の効果しか発揮しない（図３Ａおよび３Ｂおよび実施例２）。
【００５８】
さらに、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５８６９５０９に記載の、化学名：３−［（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）メチル］−５−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２（３Ｈ）−オンを有するＢＭＳ−Ａ化合物は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞マキシ−Ｋチャネルを開けることが証明された（実施例１２）。
【００５９】
本発明に係る化合物は、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを活性化し、かつ低いまたは正常濃度の細胞内カルシウム下では細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを有意に活性化しない。かかる化合物は、本明細書記載の如く、高い細胞内カルシウム量を特徴とする疾患や障害で利用できるという点で有益である。実際に、本発明に係る化合物および方法は、以下に詳しく解明するように、当該分野の他のオープナー化合物に優る利点を付与する。
【００６０】
過度の細胞刺激の時間中のマキシ−Ｋチャネル開放の向上は、外傷性ストレスをこうむる細胞への保護、さらに詳しくは、Ｃａ２＋進入を減衰し、次いでＣａ２＋−仲介細胞事態（ｅｖｅｎｔｓ）を縮小することによる神経保護、特に神経変性に関連する神経保護を付与する潜在性を有する。細胞脱分極に応じるニューロン・マキシ−Ｋチャネルの開放と、［Ｃａ２＋］ｉの増大は、細胞を再分極し、Ｃａ２＋流入を縮小する有効な内因性メカニズム（機構）を構成する。
【００６１】
本発明に係る例示化合物の場合、マキシ−Ｋカリウムチャネル開放において最も根深い薬物−誘発増大がミクロモルの［Ｃａ２＋］ｉで観察され、これによって、本発明の化合物は、細胞を病原性レベルの興奮性インプットにさらし、［Ｃａ２＋］ｉを増大せしめ、たとえば虚血性発作の条件にあるときに最大効果を有しうることが示される。
【００６２】
本発明の化合物は、細胞内カルシウムの濃度に拘らずマキシ−Ｋチャネル活性を増大することが報告されている他のマキシ−Ｋチャネル・オープナーと対照をなす立場にあり、すなわち、上記他のオープナー化合物の活性は非選択的で、かつ細胞内カルシウム濃度に依存しないようになっている。これらの種類の化合物の具体例は、Ｄ．Ｓｔｒφｂａｅｋらの「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（３５：９０３−９１４、１９９６年）およびＭ．ＭｃＫａｙらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（７１：１８７３、１９９７年）に記載されている。
【００６３】
実際に、本明細書実施例１２に記載の結果によれば、上記種類の非選択的化合物は、内部カルシウム濃度に依存しない一般のチャネル開放活性を示すが、本発明の化合物のチャネル開放を行なう能力は、カルシウムの細胞内濃度に極めて敏感であることが明らかになる。
【００６４】
細胞内カルシウム濃度に依存せずに作用する他のマキシ−Ｋチャネル・オープナー／モジュレーターと異なり、本明細書記載の、高濃度の細胞内カルシウムに対し選択性および感受性を有するカルシウム−依存オープナーは、高い細胞内カルシウムを有する細胞、たとえば前虚血性ニューロン細胞のチャネルに有意に影響を及ぼす。
【００６５】
すなわち、本発明記載のかかるオープナーは、発作／虚血の場合や高い細胞内カルシウム量が特徴であるもしくは該量によって始まる他の障害、疾患もしくは症状の場合の処置あるいは療法に特に使用することができ、かつマキシ−Ｋカリウムチャネルのオープナーによる処置に敏感に反応し、応答する。
【００６６】
また、当業者にとって理解される点は、高い細胞内カルシウム量を有する細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルの開放確率を増大するが、生理的に正常または低い細胞内カルシウム量を有する細胞ではそのように増大しない、他のオープナー化合物、たとえばマキシ−Ｋチャネルの小分子アクチベーターも本発明によって包含されることである。
【００６７】
治療／処置
本発明の具体例において、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞環境のマキシ−Ｋチャネルへの作用に対し感受性および選択性を有するマキシ−Ｋオープナー化合物は、治療目的に使用しうる。かかる本発明に係るオープナー化合物を、他の適当な治療剤と組合せ、治療を必要とする個人（たとえば患者）に投与することができる。
【００６８】
組合せ療法に用いる適当な作用物質の選択は、従来の薬理的原理に従って当業者が適宜に成しうる。治療剤の組合せは、相乗的に作用して、本発明の高［Ｃａ２＋］−感受性マキシ−Ｋオープナー化合物による処置に敏感に反応し、応答する特定の疾患や障害、特に発作を含む神経学的疾患または障害の処置あるいは予防を行なうことができる。このアプローチを使用すれば、何人も各作用物質の低用量によって、治療的効きめを得ることができ、これによって、有害な副作用の可能性を縮小することができる。
【００６９】
本明細書記載のマキシ−Ｋチャネル・オープナーを必要とする治療法のいずれも、かかる療法が必要ないずれかの個々の哺乳類（たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ラビット、サル、最も好ましくはヒトなどの哺乳類を含む）に適用することができる。高い細胞内カルシウム量が特徴である疾患または障害、たとえば急性虚血性発作の処置方法が本発明によって包含され、該方法において、高［Ｃａ２＋］ｉの細胞のマキシ−Ｋチャネルを開けるのに感受性および選択性を有するマキシ−Ｋオープナーの有効量を、該処置が必要な個人に投与して、上記疾患または障害を縮小、改善または緩和する。虚血性発作からの神経保護や、神経学的疾患または障害（これらに限定されないが、発作を含む）の処置を付与する方法が好ましい。
【００７０】
げ歯動物で行なったインビボ処置を評価する最初の実験において、ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物を用い、近位中大脳動脈（ＭＣＡ）の永久病巣閉塞に、遅延薬物適用を併用し、臨床出現（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の条件を再現する努力で、薬物を発作開始の多少時間後に頻繁に投与する。救うべきニューロンは低下した血流の領域、すなわち周縁部にあるので、ＢＭＳ−２０４３５２化合物が特に有利であり、何故なら、その他の全ての特性以外に、それが非常に高レベルで脳にはいるからである（図４Ａ−４Ｆ；実施例７）。
【００７１】
本発明の他の具体例において、高い細胞内カルシウム濃度の細胞環境のマキシ−Ｋチャネルへの作用に対し感受性および選択性を有するマキシ−Ｋオープナー化合物を、高い細胞内カルシウム量が特徴であるもしくは該量によって始まり、かつマキシ−Ｋチャネルのオープナーによる処置に敏感に反応し、応答する疾患、障害または症状の予防的処置のために、あるいはその開始を予防したりまたはその厳しさを軽減するための予備処置に使用することができる。予防目的のため、あるいは予備処置としての、本発明に係るオープナー化合物の投与は、治療のため上述したような他の作用物質と組合せて行なうことができる。
【００７２】
かかる予備処置用途の非制限的具体例は、上述の疾患または障害、たとえば神経変性疾患または障害、あるいは慢性神経変性疾患または障害、さらに詳しくは、発作、全般大脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、てんかん、片頭痛およびアルツハイマー病の危険な状態の、あるいはこれらの疾患または障害にかかりやすい個人への投与である。この具体例の１つの側面において、該疾患または障害の開始の前に、たとえば前に１以上の発作を持った患者のための予備処置として、すなわち、続いて起こる発作または関連症状の危険を減少、またはその厳しさもしくは程度を軽減できるように、本発明に係るオープナー化合物を投与することができる。
【００７３】
スクリーニング・アッセイおよび方法
本発明の具体例として、マキシ−Ｋオープナー化合物を同定、検出または選別するアッセイおよび方法が含まれ、上記マキシ−Ｋオープナー化合物は、高量の細胞内カルシウムを有する細胞のこれらタイプのカリウムチャネルを開けるよう機能するが、低いまたは正常な量の細胞内カルシウムを有する細胞のマキシ−Ｋチャネルに対しては有意な開放活性を有しない。
【００７４】
本発明の選別および検出法によって確定されるマキシ−Ｋオープナー化合物は、高い細胞内カルシウム濃度に関連する疾患および症状、好ましくは神経変性および神経学的疾患および障害、より好ましくは急性虚血性発作の処置の治療剤として使用できる。
【００７５】
候補（ｃａｎｄｉｄａｔｅ）作用物質は、合成もしくは天然化合物のパネルあるいはライブラリーを含む幅広い種々の源から、または単離した天然化合物、あるいは合成化合物もしくは薬物から得ることができる。
かかるアッセイ法の１つとして、細胞内カルシウム条件のコントロール下の細胞ベースアッセイでの、候補オープナー化合物のテストが必要である。マキシ−Ｋチャネルを発現する一次細胞を含む細胞、細胞系、または細胞培養物を使用する。かかる細胞は、機能しうるマキシ−Ｋチャネルを発現、または過発現する天然産出細胞であってよい。
【００７６】
別法として、細胞は商業上または他の方法で入手しうる定着した細胞系または培養物からのもの（たとえばＨＥＫ−２９３）であってよく、またクローン化マキシ−ＫチャネルＤＮＡ（たとえばｈＳｌｏ）でトランスフェクションされたもので、マキシ−Ｋチャネルを発現する。本発明に従って、潜在的マキシ−Ｋチャネル・オープナーをテストするアッセイで用いる細胞の場合、高い細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞と、低い、適度または生理的に正常な細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉを有する他の細胞に対する条件を設定する。
【００７７】
候補化合物または試験化合物について、高［Ｃａ２＋］ｉたとえば約５００ｎＭ、または１、５もしくは１０μＭ［Ｃａ２＋］ｉの存在下のマキシ−Ｋチャネルのオープナーとして機能するが、低いまたは正常濃度の［Ｃａ２＋］ｉ、たとえば約５、５０、１００または２５０ｎＭ［Ｃａ２＋］ｉではマキシ−Ｋチャネルに対し有意なオープナー活性を有しない能力を検定する。
【００７８】
たとえば、標準パッチ（ｐａｔｃｈ）−クランプ（ｃｌａｍｐ）分析および記録技法を行なうことができ、たとえば実施例１および２に記載の、インサイドアウトおよびアウトサイドアウトの切除パッチ、細胞−貼付パッチおよび全細胞クランプにより、候補化合物または試験化合物の高［Ｃａ２＋］ｉの導入後に、マキシ−Ｋチャネル外部電流が増大もしくは賦活（活性化）するかどうかを判定し、低いまたは好ましくは正常な［Ｃａ２＋］ｉ、好ましくは漸進的によりネガチブな電圧でのマキシ−Ｋチャネル外部電流に対する候補化合物または試験化合物の効果と比較する。
【００７９】
候補化合物または試験化合物が、本発明に係るマキシ−ＫチャネルのＣａ２＋−感受性および選択的オープナーとして機能することが確定されれば、該化合物によって、マキシ−Ｋチャネルが仲介する全細胞電流のＩ−Ｖ関係は、細胞内カルシウム濃度の増大に伴って、左へシフトするが、該化合物は低［Ｃａ２＋］ｉ条件下では有意な効果を全く有さない。
【００８０】
アッセイまたはテストをうける化合物が、高い細胞内カルシウム濃度の条件下のアッセイで、細胞によって発現されるマキシ−Ｋチャネルを活発に開ければ、該化合物を同時に上述の試験に付して、正常乃至低い細胞内カルシウム濃度下の、マキシ−Ｋチャネル−発現細胞へのそのオープナー機能を判定する。
【００８１】
本発明に係る適当なマキシ−Ｋオープナー化合物が、このアッセイおよび方法を介して同定または検出されるが、それは、試験化合物が高［Ｃａ２＋］ｉの条件下の細胞のマキシ−Ｋチャネルを有効に開けるが、正常乃至低［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞のマキシ−Ｋチャネルを有効に開けない場合である。
【００８２】
非制限的具体例として、候補化合物または試験化合物の活性は、クローン化マキシ−Ｋカリウムチャネル（たとえばｈＳｌｏ）で形質導入されたもので、かつこれらのチャネルを発現するツメガエル属卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）に対し、検定または試験することができる。
【００８３】
かかるアッセイにおいて、全細胞マキシ−Ｋ電流の発現をもたらすのに十分なｈＳｌｏ ｃＲＮＡを、たとえば晩期（ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ）ツメガエル属卵母細胞に注入する。発現に２〜４日間の余裕をみて、二電極電圧−クランプ技法を採用して、マキシ−Ｋチャネル電流を記録することができ、そして、たとえば電流−電圧関係の変化を調べることにより、薬物への応答を評価することができる。
【００８４】
卵母細胞は内因性低量の細胞内カルシウムを有するので、本発明記載の新規マキシ−Ｋチャネル・オープナーの特性を有する試験化合物は、卵母細胞のこれらのチャネルを有意に開けず、しかし、本明細書記載の高量の［Ｃａ２＋］ｉの条件下で検定されるマキシ−Ｋチャネル−発現細胞のチャネルを開け、これによって、オープナー化合物のカルシウム感受性および選択性が証明される。
【００８５】
あらかじめ記載したマキシ−Ｋオープナーは、内因性低［Ｃａ２＋］ｉ条件下ツメガエル属卵母細胞で発現されるマキシ−Ｋ電流の増加に有効であったが、（Ｖ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（５０：２０６−２１７、１９９６年）］、これとは対照に、本発明の化合物は、これらの条件下ツメガエル属卵母細胞のマキシ−Ｋ電流において、矛盾がないあるいは有意な増加をもたらさない。
【００８６】
さらに、本発明に従って、高い［Ｃａ２＋］ｉ下の細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを明確に標的にし、開けるが、低い乃至正常な［Ｃａ２＋］ｉを有する細胞に対してはその作用を発揮しない能力のスクリーニングをうける化合物は、必要に応じて、実施例３に記載の他のレセプタや酵素に対するその標的特異性の検定を行なうことができる。
【００８７】
医薬組成物
さらに本発明の具体例は、医薬組成物を上述の治療使用および効果のために、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤と共に投与することを包含する。かかる医薬組成物は、高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルのオープナーとしての活性が機能的で選択的である、オープナー化合物の１種以上を含有しうる。
【００８８】
該組成物は単独で、または安定化化合物などの他の作用物質の少なくとも１種と組合せて投与されてよく、またいずれかの無菌で生物学的適合性の医薬用担体（これらに限定されるものでないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノールなどの有機溶剤、および水が含まれる）中にて投与されてもよい。また該組成物は単独で、または他の作用物質、薬物、ホルモン、または生物学的応答変性剤と組合せて、患者に投与されてよい。
【００８９】
本発明で用いる医薬組成物は、これらに限定されるものでないが、静脈内、頭蓋内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または経口手段を含む幾らかの方法のいずれかで投与することができる。
【００９０】
かかる医薬組成物は、活性成分（すなわち、選択的オープナー化合物）以外に、適当な医薬的に許容しうる担体、希釈剤、または活性化合物を医薬的に使用できる製剤に加工するのを容易にする助剤を含む賦形剤を含有してもよい。なお、配合や投与に関する技法のさらなる詳細については、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新版（マーック・パブリッシング・カンパニー、ペンシルバニア州イーストン）を参照。
【００９１】
経口投与用の医薬組成物は、経口投与に適切な調剤において周知の医薬的に許容しうる担体を用いて配合することができる。かかる担体によれば、該医薬組成物を、患者が摂取するための錠剤、丸剤、糖剤（糖衣錠）、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ、スラリー剤、懸濁液などに配合するのが可能となる。
【００９２】
経口用の医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、必要に応じて得られる混合物を粉砕し、次いで要すれば、錠剤または糖剤コアを得るために適当な助剤を加えた後、顆粒混合物を加工することによって、得ることができる。適当な賦形剤は、炭水化物またはたん白フィラー、たとえばラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含むシュガー；トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物のスターチ；メチルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロース・ナトリウムなどのセルロース；アラビアゴムやトラガカントゴムを含むゴム；およびゼラチンやコラーゲンなどのたん白である。要すれば、崩壊剤もしくは可溶化剤を加えてもよく、たとえば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその医薬的に許容しうる塩（アルギン酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【００９３】
糖剤コアは、濃シュガー溶液などの生理的に適切なコーチング、ラッカー液、および適当な有機溶剤もしくは溶剤混合物と共に使用することができ、なお、上記シュガー溶液には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタンを含有させてもよい。製品識別のため、あるいは活性化合物の量（すなわち、投与量）を特徴づけるのに、錠剤または糖剤コーチングに染料もしくは顔料を加えてもよい。
【００９４】
経口使用できる医薬製剤としては、ゼラチンから作られるプッシュ嵌めカプセル剤、並びにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどのコーチングから作られる軟質計量カプセル剤が挙げられる。プッシュ嵌めカプセル剤は、活性成分を、ラクトースまたはスターチなどのフィラーまたはバインダー、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および必要に応じて安定化剤と混合して含有することができる。軟質カプセル剤において、活性化合物を、安定化剤を用いまたは用いずに、適当な液体、たとえば脂肪油、液体、または液状ポリエチレングリコールに溶解もしくは懸濁させてもよい。
【００９５】
非経口投与に好適な医薬配合物は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液または生理的緩衝食塩水などの生理的に適合しうる緩衝液中に配合されてよい。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を上げる物質、たとえばカルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含有してもよい。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油状注射懸濁液としても製造しうる。
【００９６】
適当な親油性溶剤またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセライドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。また懸濁液は、必要に応じて高濃度溶液の調製を可能ならしめるため、適当な安定化剤あるいは化合物の溶解性を高める作用物質、たとえばＤＭＳＯを含有してもよい。
【００９７】
局所または鼻腔投与の場合、浸透されるべき個々のバリヤに適切な浸透剤または透過剤を、配合物に用いる。このような浸透剤は一般に、当該分野で公知である。
本発明の医薬組成物は、公知の方法により、たとえば通常の混合、溶解、粒状化、糖剤製造、糊状化、乳化、カプセル化、閉じ込め（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）または凍結乾燥法に従って製造しうる。
【００９８】
医薬組成物は、塩で供給されてよく、かつ多数の酸（これらに限定されないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等が含まれる）を用いて形成できる。塩は、水性溶剤、または対応する遊離塩基形状である、他のプロトン溶剤により溶解する傾向にある。
【００９９】
他の場合、好ましい製剤は、下記成分：ヒスチジン１〜５０ｍＭ、スクロース０．１〜２％、およびマンニトール２〜７％のいずれかまたは全てを含有してもよい凍結乾燥粉末であってよく、４．５〜５．５のｐＨ範囲にて使用前に緩衝液と混合される。医薬組成物を製造した後、適当な容器に入れ、次いで指示症状の処置のラベルを貼ることができる。オープナー化合物の投与の場合、ラベルの表示としては、量、投与回数および投与方法が挙げられる。
【０１００】
本発明での使用に好適な医薬組成物としては、意図した目的を達成するのに十分な量で活性成分を含有した組成物が含まれる。有効な用量の決定は、当業者の能力の十分範囲内である。いずれの化合物の場合も、治療上有効な用量は、たとえばマキシ−Ｋチャネルたん白を発現または含有する細胞を用いる細胞培養アッセイで、あるいは動物モデル、通常、これらに限定されないが、マウス、ラット、ラビット、イヌまたはブタにて、最初に見積もることができる。また動物モデルを用いて、適切な濃度範囲および投与の方法を決定することができる。次いでかかる情報を用い、これを基にして、ヒトにおける有用な用量と投与方法を決定しうる。
【０１０１】
治療上有効な用量とは、徴候もしくは症状を改善し、縮小しまたは排除する活性成分、たとえば本発明に係る新規Ｃａ２＋−感受性および選択性オープナーの１種以上の量を指称する。治療の効きめおよび毒性は、細胞培養または実験動物での標準医薬手順、たとえばＥＤ５０（母集団の５０％が治療上有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に及ぶ致死用量）で決定しうる。
【０１０２】
毒性対治療効果の用量比は、治療上のインデックスであって、ＥＤ５０／ＬＤ５０比で表示することができる。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトに使用する場合の用量範囲の決定に用いる。医薬組成物に含まれる好ましい用量は、毒性がほとんどもしくは全くないＥＤ５０を含む、流通（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）濃度の範囲内である。用量はこの範囲内で、使用する投与剤形、患者の感受性、および投与方法に応じて適宜変化する。
【０１０３】
正しい用量は、個々の要求処置に関連するファクターを考慮する開業医によって決定されるだろう。投与の用量および時間は、十分量の活性化合物／成分を付与したり、あるいは所望の効果を維持するよう調整される。考慮されうるファクターとしては、個人の病気状態の厳しさ、患者の一般的健康状態、患者の年令、体重および性別、食事療法、投与の時間および回数、薬物の組合せ、反応感受性、および療法に対する耐性／応答が含まれる。マキシ−Ｋオープナー化合物は、それ単独でまたは必要もしくは所望ならば、組合せて投与することができる。
【０１０４】
一般的指針として、予備処置または予防的療法用の医薬組成物は、その厳しさが縮小もしくは改善されつつある、またはその開始が防止もしくは排除されつつある疾患または障害が現われる前に投与される。理解すべき点は、マキシ−Ｋチャネル・オープナーの１種以上の同じ用量または異なる用量による、１回の予備処置あるいは繰返しの、たとえば継続した予備処置を採用できることである。
【０１０５】
さらに、本発明に係るマキシ−Ｋチャネル・オープナーはそれ単独、または別のマキシ−Ｋチャネル・オープナー、もしくは他の治療剤と組合せて、患者の疾患が現われるとき、たとえば疾患の出現時直ちにあるいは疾患の開始の一定時間後に投与することができる。また、本発明に係るマキシ−Ｋチャネル・オープナーを疾患開始の後に投与するときには、適当な時間にわたる繰返しまたは継続的投与も採用することができる。
【０１０６】
非制限的指針および非制限的具体例として、マキシ−Ｋチャネル・オープナーをその投与が必要な患者に対し、疾患出現時直ちに、および／または疾患開始もしくは出現の一定時間後に、たとえば疾患開始もしくは出現の後２・３分もしくは２・３時間以内に、および／または５・６時間または５・６日までに投与することができる。本発明のマキシ−Ｋチャネル・オープナーからなる長期作用性の医薬組成物は、処置される疾患または障害、個々の配合物の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日毎、１週間毎に、または２週間に１回投与されてよい。
【０１０７】
標準の投与量は、投与方法に応じて、０．１〜１０００００ミクログラム（μｇ）で、トータル用量約１グラム（ｇ）以下で変化させてよい。個々の投与量やデリバリーの方法に関するガイダンスについては、文献に記載され、かつ一般的に当該分野の実務家（開業医）にとって入手しうる。当業者であれば、本発明に係る化合物のデリバリーが、個々の細胞、症状、位置等に対して特異性であることが理解されよう。たとえば、本明細書に記載の如く、親油性であるオープナー化合物は、有効な脳浸透剤であり、かつ脳−関連障害によって作用される細胞、たとえば発作中のニューロンのマキシ−Ｋカリウムチャネルに影響を及ぼすのに使用することができる。
【０１０８】
（実施例）
以下に挙げる実施例は、本発明の例示であって、本発明を限定するものではない。
実施例１
方法：
細胞調製
ＨＥＫ−２９３細胞を、製造のプロトコルに従って、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ）を用い、ｈＳｌｏ α−サブユニットｃＤＮＡ含有の１〜２μｇのｐｃＤＮＡ３発現プラスミド［Ｓ．Ｉ．Ｄｗｏｒｅｔｚｋｙらの「Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．」（２７：１８９−１９３、１９９４年）］でトランスフェクションする。
【０１０９】
０．５ｍｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８、Ｓｉｇｍａ）を補給した培地で、ｈＳｌｏで安定してトランスフェクションされた細胞を選択する。ＣＯ２５％およびＯ２９５％の加湿雰囲気中３７℃の、１０％のウシ胎児血清およびＧ４１８を補給したミニマム・エセンシャル・メディアム（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で、トランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を成長させる。３５ｍｍ培養皿中のフィブロネクチン−被覆ガラスカバースリップ上に、細胞を載せる。
【０１１０】
電気生理学的記録
標準全細胞パッチ−クランプ技法を用いて、外部Ｋ＋−仲介電流を調べる［Ｐ．Ｏ．Ｈａｍｉｌｌらの「Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．」（３９１：８５−１００、１９８１年）］。１０または２０ｋＨｚのデジタル化の前に、レコードを２ｋＨｚで濾過する（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。浴（ｂａｔｈｉｎｇ）溶液は、以下の成分：ＮａＣｌ １４５ｍＭ、ＫＣｌ ３ｍＭ、ＣａＣｌ２ ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭを含有する（ｐＨ７．４）。厚壁のあるホウ珪酸塩ガラスから記録ピペットを抜き（浴溶液中２〜４ＭΩ）、燃焼磨きをし、次いでＫＣｌ １４０ｍＭ、ＭＯＰＳ ２０ｍＭ、ＥＧＴＡ １．０ｍＭ含有の、ＣａＣｌ２でｐＨ７．２に調整した溶液を満たして、要求される［Ｃａ２＋］フリーとする［Ａ．ＦａｂｉａｔｏおよびＦ．Ｆａｂｉａｔｏの「Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐａｒｉｓ．」（７５：４６３−５０５、１９９５年）に記載の方法を織り込んだＥＱＣＡＬプログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ケンブリッジ）を用いて測定］。
【０１１１】
Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００増幅器またはＥＰＣ９増幅器とＰｕｌｓｅプログラムで、刺激発生およびデータ取得をコントロールする。データを貯蔵し、オフライン分析する。細胞保持電位は、２．５μＭ［Ｃａ２＋］ｉで実験した場合は−１００ｍＶで、残りのＣａ２＋濃度（１μＭ、２５０ｎＭおよび５０ｎＭ）の場合−８０または−６ｍＶである。［Ｃａ２＋］ｉに適切な一連の１０ｍＶ脱分極電圧ステップ（１００〜２００ｍｓ）を適用して、一系列の外部電流を誘発する。直列抵抗は、８０％補償前で＜６ＭΩである。電圧パルスの終り付近で、定常状態の電流を測定する。
【０１１２】
薬物／オープナー化合物
ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物およびＢＭＳ−２２５１１３クロロ−オキシンドール化合物は、親油性であり、従って、ＤＭＦまたはＤＭＳＯを用いストック溶液を作ってから、浴溶液中の最終実験濃度に希釈した。必要ならば、超音波処理を用いて、可溶化を助成する。溶剤の濃度は、常に＜０．２％である。各実験で、注意を払って、化合物と表面（ガラスおよびプラスチックを含む）の接触を最小化にし、そして使用前に新たに溶液を調製する。
【０１１３】
実施例２
パッチ−クランプ：
全細胞電圧−クランプ技法［Ｒ．Ｐｅｎｎｅｒの「Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ，２版」（Ｂ．ＳａｋｍａｎおよびＥ．Ｎｅｈｅｒ編、プレナム・プレス、ニューヨーク、３−３０頁、１９９５年），“パッチ・クランピングへの実用的ガイド”］を用い、異なった濃度のＣａ２＋（すなわち、［Ｃａ２＋］フリー＝５０ｎＭ、１μＭまたは２．５μＭ）を含有するピペットで、ｈＳｌｏ−仲介外部電流を記録する。クランプした細胞を、実施例１に記載の如く、５μＭのＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール・オープナー化合物またはＢＭＳ−２２５１１３クロロ−オキシンドール・オープナー化合物にさらす。
【０１１４】
これらの実験の結果から、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、全細胞ｈＳｌｏ−仲介外部電流を、濃度に依存および逆転して増大することが認められる（図１Ａおよび１Ｂ）。これらの実験の中部［Ｃａ２＋］フリーは１μＭであった。
【０１１５】
ＢＭＳ−２０４３５２およびＢＭＳ−２２５１１３化合物の場合共に、ピペット溶液中の［Ｃａ２＋］フリーの変化による細胞内Ｃａ２＋濃度の増大は、全細胞マキシ−Ｋ電流に漸進的によりネガチブな電圧で賦活せしめる。図２Ａおよび３Ａで示されるように、［Ｃａ２＋］ｉの５０ｎＭから２５０ｎＭ、１μＭまたは２．５μＭへの増大は、電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係（相関）を左にシフトし、これによって、半−最大賦活電圧（Ｖ１／２）の明らかな左方向シフトが見られる。
【０１１６】
ＢＭＳ−２０４３５２およびＢＭＳ−２２５１１３オープナー化合物（５μＭ）の添加は、全て４つのＣａ２＋濃度においてｈＳｌｏ−仲介電流を増大するが、該化合物は最高濃度のＣａ２＋（１μＭおよび２．５μＭ）のときしか、有意な増大をもたらさない（図２Ｂおよび３Ｂ）。
【０１１７】
これらの結果は、ＢＭＳ−２０４３５２およびＢＭＳ−２２５１１３化合物が、非常に高い細胞内カルシウム濃度の条件下のＨＥＫ−２９３細胞で発現された、ヒト脳マキシ−Ｋチャネル・α−サブユニット（ｈＳｌｏ）の有効で有力なオープナーであることを証明する。
【０１１８】
ｈＳｌｏで仲介される全細胞電流のＩ−Ｖ関係は、［Ｃａ２＋］ｉの増大に伴なって左にシフトし、これによって、半−最大賦活電圧はより高い［Ｃａ２＋］フリーに伴なってよりネガチブになることが示唆される。両化合物（５μＭ）は、１および２．５μＭ［Ｃａ２＋］ｉの条件下で記録した電流の最も根深い増大をもたらす。
【０１１９】
上記結果と対照的に、内因性の低い細胞内Ｃａ２＋の形状（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を記録する細胞−貼付パッチ−クランプにおいて、ＢＭＳ−２０４３５２化合物の効果は比較的に適度であり、そして該化合物をｈＳｌｏ１を発現するツメガエル属卵母細胞に適用すると、類似した適度で相反する効果が見られる。
【０１２０】
また本発明の新規マキシ−Ｋオープナーを用いて観察される結果は、たとえば内因性低［Ｃａ２＋］ｉの条件下のツメガエル属卵母細胞において、先に記載したマキシ−Ｋチャネル・オープナーの一貫した結果と対照的な立場にある［Ｖ．Ｇｒｉｂｋｏｆｆらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（５０：２０６−２１７、１９９６年）］。これら両方の系は、低くかつ可変量の細胞内Ｃａ２＋を有する。
【０１２１】
本発明に係るオープナー化合物の作用が、非常にＣａ２＋−感受性であることは、本実施例に記載の実験および結果によって確認される。すなわち、該オープナー化合物は低量の細胞内Ｃａ２＋（たとえば５０ｎＭ）では、マキシ−Ｋ電流に関してほとんど全く効果を有しないが、細胞内Ｃａ２＋が増大すると（たとえばミクロモル範囲に）、該オープナー化合物は、マキシ−Ｋチャネル−仲介電流の漸進的に大きな増大をもたらし、かつその増大は広範囲の賦活電圧に及ぶ（図２Ｂ、２Ｃおよび３Ｂ）。
【０１２２】
これらのデータによって、マキシ−Ｋチャネルの開放が、高い細胞内Ｃａ２＋および該化合物両方の存在下、生理的に適切な膜電圧で、有意に拡大されることが提案される。これは、外傷性ストレスを付随する疾患状態の期間中、たとえば虚血中の高［Ｃａ２＋］ｉの細胞において、膜電位、細胞興奮性およびＣａ２＋進入の有効なコントロールを可能ならしめることができる。
【０１２３】
アウトサイドアウトおよび全細胞パッチ分析の場合、使用する溶液は、いずれもｍＭ単位で、１４５のＮａＣｌ、３のＫＣｌ、２．５のＣａＣｌ２、１のＭｇＣｌ２、１０のＨＥＰＥＳ、１０の±グルコースを含有する規定の細胞外Ｎａ＋溶液（ｐＨ７．４）である。インサイドアウト・パッチ用の細胞内および細胞外培地、または全細胞パッチ用のピペット溶液は、いずれもｍＭ単位で、１４０のＫＣｌ、２０のＭＯＰＳ、１０のＥＧＴＡを含有し、ＣａＣｌ２でｐＨ７．２に調整され、要求される［Ｃａ２＋］フリーとなっている［ＥＱＣＡＬプログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ、ケンブリッジ）を用いて測定］。
【０１２４】
全細胞記録用の細胞保持電位は、−８０または−６０ｍＶであり、内部Ｃａ２＋濃度に適切な脱分極電圧ステップを適用する（高い細胞内Ｃａ２＋において、シール（ｓｅａｌｓ）は高いクランプ電圧で不安定となり、かつ短時間の低い電圧で安定である）。
【０１２５】
アウトサイドアウト切除パッチ実験の場合、パッチをＮａ＋溶液の浴に入れる。ピペット（細胞内パッチ面）は、概算［Ｃａ２＋］フリー１μＭのＫ＋溶液と、２００μＭのＡＴＰγ−Ｓを含有する。レコードは、５ｋＨｚのデジタル化の前に２ｋＨｚで濾過する。細胞保持電圧は−６０ｍＶで、−５０〜＋１３０ｍＶの１０ｍＶ脱分極電圧ステップを適用する。インサイドアウト切除パッチ実験の場合、浴およびピペットは、［Ｃａ２＋］フリー＝１０μＭのＫ＋溶液を含有する。
【０１２６】
レコードは、１０ｋＨｚのデジタル化の前に２ｋＨｚで濾過する。ピペット電位は、薬物適用前にシングルチャネルの分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を可能ならしめる電圧で保持する。１つ以上のチャネルが常に存在し、薬物の適用後に可視できるのみなので、平均オープン確率，ＮＰオープンを用いて、化合物の効果を判定する。細胞−貼付パッチ実験において、浴およびピペットはＮａ＋溶液を含有する。
【０１２７】
レコードは、２０ｋＨｚのデジタル化の前に２または５ｋＨｚで濾過する。ピペット電位は、電圧ランプ（ｒａｍｐ）の開始まで、あるいは定常状態記録のため−８０ｍＶへの変化まで、０ｍＶで保持する。ＮＰオープンを用いて、化合物効果を判定（確定）する。適用できる場合、コンダクタンス（Ｇ）／最大コンダクタンス（Ｇｍａｘ）対電圧（Ｖ）の関係を、ボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）関数，Ｇ／Ｇｍａｘ＝１／（１＋ｅ（Ｖ１／２−Ｖ）／ｋ）より算出する。ここで、Ｖ１／２は半−最大賦活時の膜電位で、ｋは勾配係数である。プロットは、カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａ Ｇｒａｐｈ）ソフトウェアを用いて行なう。Ｖ１／２対ＢＭＳ−２０４３５２濃度−応答関係のロジスティック・フィット（ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｆｉｔ）を用い、ＥＣ５０概算を算出する。
【０１２８】
実施例３
Ｃａ２＋−感受性および選択性マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物の標的特異性：
ＢＭＳ−２０４３５２を含むオープナー化合物の、マキシ−Ｋカリウムチャネルに対する効果の特異性を判定するため、ツメガエル属卵母細胞およびクローン細胞系で発現されるクローン化および生イオンチャネルの代表サンプルに対して、化合物を試験し、当業者に容易に知られかつ実施される標準電気生理学的技法を用いて検定する。
【０１２９】
これらは、電圧−依存カリウムチヤネル（Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ２．１）、Ｃａ２＋−賦活クロリド（Ｃｌ−）チャネル（生の卵母細胞チャネル）、のう胞性線維症膜内外コンダクタンス・レギュレーターＣｌ−チャネル（ＣＦＴＲ）およびＣａ２＋電流（生ＧＨ３細胞Ｃａ２＋電流）を包含する。化合物はＫｖ電流およびＣｌ−電流に対し有意の効果を全く有しないことが認められ、ＣＦＴＲを賦活せず（ｃＡＭＰおよびＣＦＴＲオープナーＮＳ００４と比較して）、かつ生Ｃａ２＋電流に対し濃度−依存効果を生じない（１および１０μＭのＢＭＳ−２０４３５２の場合に１５〜１６％縮小が見られ、電流減少に基づく同様な縮小が対照細胞で観察される）。
【０１３０】
また５０を超えるレセプタおよび酵素システム（ＰａｎＬａｂｓ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）およびＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｃｒｅｅｎ（登録商標））の結合スクリーン（ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎ）に対しても、ＢＭＳ−２０４３５２を試験する。これらのシステムとしては、モーストＧ−たん白連結レセプタファミリー、リガンド−ゲート（ｇａｔｅｄ）イオンチャネルファミリーの見本、並びに幾つかの電圧−ゲートイオンチャネル結合部位、たとえばＬ型Ｃａ２＋チャネルのジヒドロピリジン・レセプタが挙げられる。
【０１３１】
初期テストで、ＢＭＳ−２０４３５２は、たった２つのリガンド：［３Ｈ］スピペロン，ドパミンＤ３リガンド（１０μＭで７４％抑制）、およびσ１リガンド［３Ｈ］（＋）ペンタゾシン（１０μＭで５４％抑制）の結合の有意な抑制をもたらした。しかしながら、後の再テストで、ヒトのドパミンＤ３レセプタとの有意な相互作用が全くないことを証明した。σ１リガンド結合の適度な抑制の有意性は、知られていない。
【０１３２】
実施例４
ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物の脳浸透度
虚血性周縁部は，低脈管灌流の領域である。神経保護剤が発作の開始後、治療用量で虚血性ニューロンに到達するには、それは非常に高い量で脳に入らなければならない。ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、その高度な親油性（ｃｌｏｇ Ｐ＝５．１）に基づき、神経保護剤として魅力がある。
【０１３３】
静脈内（ＩＶ）投与の後、ＢＭＳ−２０４３５２は素早くラットの脳へ高量で入り（Ｔｍａｘ＝１５分；５ｍｇ／ｋｇのＩＶボーラス用量の後の脳中Ｃｍａｘ＞１０μｇ／ｇ）、この場合、８時間にわたって検出されるトータル化合物の脳対プラズマの比は９．６である。プラズマ半減期は１．６時間で、脳半減期は１．９時間であった。これらのデータは、ＢＭＳ−２０４３５２が素早く高量で脳に入ることができ；脳対プラズマの高い比が、低灌流脳部分（たとえば虚血性周縁部）へ有効な量で分配される化合物の能力をサポートすることを証明する。
【０１３４】
実施例５
ＢＭＳ−２０４３５２フルオロ−オキシンドール化合物の安全プロフィール：
ＢＭＳ−２０４３５２は、有望な前臨床安全プロフィールを有する。ＢＭＳ−２０４３５２のラット、麻酔をかけたイヌおよび意識のあるイヌへの投与は、１ｍｇ／ｋｇ・ＩＶの最も高い神経保護剤より少なくとも３倍高い用量の薬物によって、心拍数や平均動脈血圧が影響されないことを証明した。
【０１３５】
単一および数回−用量実験において（マウス、ラット、ラビットおよびイヌ）、１０ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で１ケ月（ラット）および２０ｍｇ／ｋｇ／日以下の用量で１０日間（イヌ）ＩＶ投与した後に、ＢＭＳ−２０４３５２−関連細胞毒性標的器官の変化は全くなかった。加えて、ＢＭＳ−２０４３５２はインビトロおよびインビボで評価したが、遺伝子毒性はなく、かつラットおよびラビットにおいて奇形発生もない。
【０１３６】
実施例６
［３Ｈ］−グルタメート放出およびシナプス伝達を減衰させるマキシ−Ｋチャネルの開放：
マキシ−Ｋチャネルを、シナプス前に多くの脳部分に配置せしめ、該チャネルはシナプス前Ｃａ２＋進入の調節によって、神経伝達物質放出の転調に関与することができる［Ｈ．Ｇ．Ｋｎａｕｓらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．」（１６：９５５−９６３、１９９６年）］。シナプス伝達は、末端への一過性高量のＣａ２＋流入によって起こるプロセスである。
【０１３７】
海馬のグルタメート・シナプスでのマキシ−Ｋカリウムチャネルのオープナーによるシナプス効力の縮小は、神経伝達物質レセプタ・アンタゴニストに関して適度であると予測されるが、Ｃａ２＋−感受性マキシ−Ｋチャネル・オープナーの存在の有用なニューロン指示薬であると思われる。ＢＭＳ−２０４３５２化合物の存在下インビトロの海馬組織の電界電気刺激は、０．５ｎＭ〜２０μＭの濃度に放射性同位元素標識グルタメートの放出において小さいが有意の縮小をもたらした。
【０１３８】
また電気生理学的実験も、インビボの麻酔をかけたラットで行なった。異なるグループのラットに、一定範囲の用量で投与したところ、５０ｎｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇ・ＩＶの用量で、ＣＡ１領域の電気誘発の海馬電界電位に小さく、長期持続の、用量−依存の現象が観察され；ビヒクル並びに低および高用量は効果がなかった。これらの効果は確かに適度であるが、前臨床モデルを要する実験の用量決定に使用することができる。
【０１３９】
［ ３ Ｈ］−グルタメート放出
雄のスプラーグ（Ｓｐｒａｇｕｅ）−ダウレイ（Ｄａｗｌｅｙ）ラットからの海馬組織（３５０μＭウェッジ）を、それぞれｍＭ単位で、１２５のＮａＣｌ、３．０のＫＣｌ、１．２のＭｇＳＯ４、１．２のＣａＣｌ２、２２のＮａＨＣＯ３、１０のＮａＨ２ＰＯ４、１０のグルコース、１ｍＬ当り１ユニットのアデノシン・デアミナーゼを含有するクレブス（Ｋｒｅｂｓ）緩衝液で５回洗う。組織を、５μＣｉの［３Ｈ］グルタメート（ニュー・イングランド・ニュウクレア；比活性＝５０〜６０Ｃｉ／ｍモル）含有の緩衝液中、３７℃で３０分間培養する。組織を洗い流し室（Ｂｒａｎｄｅｌ装置）に移し、緩衝液で流速１ｍＬ／分にて６０分間洗う。ウォッシュ緩衝液を捨てた後、５分画分を流速０．５ｍＬ／分で集める。
【０１４０】
［３Ｈ］グルタメートの放出を、電界電気刺激（３５ｍＡ、１０Ｈｚ、パルス幅２ｍｓ、持続時間１分）で誘発する。組織は、画分３（Ｓ１）および１３（Ｓ２）の最初の瞬間の間に刺激する。ＢＭＳ−２０４３５２化合物をＳ２（画分７）の３０分前に導入し、画分１５の終りに除く。液体シンチレーション分光分析を用いて、放射能を定量し、ＢＭＳ−２０４３５２の濃度範囲にわたって、データをＳ２／Ｓ１比で表示する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）からなる統計的分析の後、テストを行なう（Ｎｅｗｍａｎｎ−Ｋｅｕｌｓ）。
【０１４１】
インビボの海馬における誘発電位の記録
雄のロング（Ｌｏｎｇ）−エバンス（Ｅｖａｎｓ）ラットに、１．２ｇ／ｋｇ腹腔内（ＩＰ）ウレタンで麻酔をかけ、該ラットを定位装置に入れる。海馬のＣＡ１錐体細胞層に、ステンレススチール記録電極を入れ、対側性海馬領域ＣＡ３に二極刺激電極を入れる。単一電気刺激（２〜１０Ｖ、０．５ｍｓ）を、０．１パルス／秒の割合で与える。得られる誘発電位を、差動増幅器で増幅し、次いでオフライン分析のためデジタル方式でサンプリングする。
【０１４２】
最低１時間の基線記録の後、ビヒクル注射液を投与し、その１時間後に、１回用量のＢＭＳ−２０４３５２化合物を投与する。化合物はＤＭＳＯに可溶化し、そして注射液は頸静脈カテーテルを介してＩＶ投与する。注射後４〜５時間のデータを集める。動物１匹当り、たった１回用量の単一化合物を試験した。実験の終りに、動物を灌流し、電極配置を組織学的に確かめる。計量を繰返してデータを分析し、ＡＮＯＶＡの後、薬物濃度の関数として個々の時間ポイントの有意差のＫｒｕｓｋａ−Ｗａｌｌｉｓテストを行なった。
【０１４３】
実施例７
急性発作のモデル：
近位中大脳動脈（ＭＣＡ）の永久病巣閉塞は、Ａ．タムラらが独創的に開発した方法［「Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．」（１：５３−６０、１９８１年）］を修正して行なう。永久片側ＭＣＡ、永久同側総頸動脈（ＣＣＡ）および一過性対側性ＣＣＡ（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル）において、正常血圧の雄Ｗｉｓｔａｒラットに、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｍ．）とキシラジン（４．５ｍｇ／ｋｇ．ｉ．ｍ．）の併用で麻酔をかける。
【０１４４】
側頭下接近（ｓｕｂｔｅｍｐｏｒａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）による左ＭＣの露出後、動脈の２ｍｍ切片を電気焼灼し、切断する。５分以内に、両ＣＣＡを露出し、閉塞する。左ＣＣＡを２つの縫合結紮で永久に閉塞し、右ＣＣＡをミクロ−動脈瘤クリップの使用で６０分間一時閉塞する。
【０１４５】
対側一過性ＣＣＡ閉塞は、一貫した大きな皮質梗塞を可能ならしめるのに十分に、副行流を縮小する［Ｓ．Ｂｒｉｎｔらの「Ｃｅｒｅｂｒ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．」（８：４７４−４８５、１９８８年）］。突発性高血圧ラット（ＳＨＲ）による実験において、同じＭＣＡ閉塞を行なうが、ＣＣＡ閉塞はせず。化合物を２％ＤＭＳＯ／９８％プロピレングリコールに溶解し、適当な時間ポイントにて（通常、閉塞の２時間後に）、尾の静脈に単一ＩＶボーラスで注射する。ビヒクル単独で処置したグループとの比較を行なう。
【０１４６】
各グループは、１２〜２４匹の動物を含有する。動物は終始３７℃に維持し、直腸プローブで監視する。閉塞の２４時間後、動物をいけにえにし、脳を取出し、梗塞の領域を判定するのに、染色する塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で評価する。脳のスライスの写真を撮り、コンピューター処理映像分析の援助で梗塞量を測定する。データは、ＡＮＯＶＡｓおよび適当なこのあとのテスト（Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ）で分析する。
【０１４７】
ＭＲＩ ＭＣＡ閉塞実験［Ｆ．Ｌｉらの「Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．」（５４：６８９−６９６、２０００年）］において、成体雄ＳＨＲラット（３００〜３３０ｇ）に永久ＭＣＡ閉塞を行なう。上述の手術中、動物を３７℃に維持し、直腸温度を監視する。次いで動物を、磁気共鳴実験室に移動させる。
【０１４８】
ラットは最初に、３％イソフルランガスで麻酔をかけ、その後、ＭＲＩ測定中１％〜１．５％イソフルランガスで麻酔を維持する。１５ｃｍ勾配コイルを取付けた水平４．７Ｔマグネットを用い、２００ＭＨｚで画像化を行なう。拡散−加重画像（ＤＷＩ）は、閉塞の約１．５および５．５時間後に、６０ｍＴ／ｍの単一拡散勾配のＳＴＥＡＭシーケンスを用いて取得する。
【０１４９】
最初の時間ポイント後、ビヒクルまたはオープナー化合物（０．３ｍｇ／ｋｇ）をビヒクルに溶解したものを、閉塞の２時間後に投与する。ビヒクルまたは薬物の投与後５．５時間で、ＤＷＩ画像を取得する。また閉塞の２４時間後に、Ｔ２−加重脳画像も得る。１日当り２匹のラットを画像化し、ＴＴＣ染色を用いてＭＲＩ成果を組織学的に確認する。統計的分析は、他のＭＣＡ閉塞実験に一致する。
【０１５０】
実施例８
大きな永久血管閉塞のげ歯動物モデルにおいて、梗塞量を有効に縮小するマキシ−Ｋチャネルの開放：
急性病巣発作のげ歯動物モデルにおいて、３５２マキシ−Ｋチャネル・オープナーの活性を調べるため、ＭＣＡの永久閉塞の開始の２時間後に、該化合物を静脈内（ＩＶ）に投与する。一例として、閉塞の１または２時間後に、薬物投与の相対効果を比較した。
【０１５１】
神経保護効果の最初の特性決定は、ラセミ化合物，化合物１（化合物１：（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン）を用いて行なう。この実験で、ＭＣＡ閉塞後２４時間にわたる皮質梗塞進化の時間経過を、突発性高血圧ラット（ＳＨＲ）のグループにおいて、磁気共鳴映像（ＭＲＩ）技法を用いて比較する。
【０１５２】
ラットに、永久ＭＣＡ閉塞開始の２時間後、ボーラスＩＶ用量０．３ｍｇ／ｋｇの化合物１またはビヒクルを投与する（図４Ａ）。この実験で、閉塞の５．５および２４時間後の化合物１−処置グループにおいて、皮質梗塞量の有意な縮小が見られる。
【０１５３】
次の永久ＭＣＡ閉塞のＳＨＲラットを用いる実験において、ＢＭＳ−２０４３５２化合物は０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇの数回の用量試験で、皮質梗塞量の有意な縮小をもたらす。非拮抗的ＮＭＤＡアンタゴニストのＭＫ−８０１（Ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ）およびＣＮＳ−１１０２（Ｃｅｒｅｓｔａｔ）は、早い時間ポイントで神経保護をもたらす用量にて、閉塞開始の２時間後に投与したが、効果はなかった。
【０１５４】
Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットにおいて、永久片側ＭＣＡ（ＰＵＭ）／永久同側総頸動脈（ＰＩＣ）閉塞と、対側性総頸動脈（ＴＣＣ）の一過性（１時間）閉塞の両方を組込んだモデルを用いたところ（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル：上記方法参照）、ＢＭＳ−２０４３５２およびラセミ化合物の化合物１は、同じレベルの神経保護をもたらす（図４Ｂ）。
【０１５５】
ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、０．００１〜１ｍｇ／ｋｇの用量で投与すると、皮質梗塞の有意な縮小をもたらすが、３ｍｇ／ｋｇ用量では効果がない（ＰＵＭ、ＰＩＣ、ＴＣＣモデル；図４Ｃ）。
【０１５６】
他の実験において、薬物は０．００１μｇ／ｋｇの用量で有効でなく、かつ３ｍｇ／ｋｇ．ＩＶで効果のないことが確認され、これによって、誘発電位実験で見られるものに類似する広い有効用量範囲による、‘インバーテッド−Ｕ’用量−応答関係が示唆される（図４Ｄ参照）。ＢＭＳ−２０４３５２化合物を閉塞２時間後に投与した場合に４１％の最大縮小が見られるが、より典型的には２０〜３０％縮小である。
【０１５７】
ＢＭＳ−２０４３５２化合物は、閉塞開始の１または２時間後に投与すれば、同じ程度に有効である（図４Ｅ）。これらの結果から、マキシ−Ｋチャネルの開放は、閉塞開始の少なくとも２時間後に投与すると、永久ＭＣＡ閉塞後に見られる皮質梗塞の程度を縮小する有効な戦略であることが示唆される。
【０１５８】
さらに、マキシ−Ｋチャネルの特性および該オープナーの新しいＣａ２＋−感受性を仮定すれば、ＢＭＳ−２０４３５２は非虚血性細胞の機能に関してほとんど効果を有しないと思われ、そして該化合物は、臨床試験において、特にニューロンカリウムチャネルを標的にする、ＣＮＳ用の有効な治療剤としての評価をサポートする前臨床安全プロフィールを有することが認められる。
【０１５９】
実施例９
（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン
ジクロロメタン（２５ｍＬ）中の（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン（０．５００ｇ、１．４ミリモル）［Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５６０２１６９の記載に準じ製造］およびトリエチルアミン（０．７２６ｍＬ、８．４ミリモル、６当量）の−７８℃溶液に、塩化チオニル（０．６１３ｍＬ、８．４ミリモル、６当量）を加える。
【０１６０】
冷却浴を取除き、反応混合物を室温まで加温せしめる。３時間後、得られる混合物を０℃に冷却し、０．１Ｎ塩化水素酸の水溶液（１０ｍＬ）を注意深く加えて、反応を抑える。内容物を水（１００ｍＬ）に注ぎ、酢酸エチル（５０ｍＬ×３）で抽出する。
【０１６１】
コンバインした有機層を塩水（２５ｍＬ）で洗い、乾燥し（ＭｇＳＯ４）、濾過し、減圧濃縮する。粗残渣をシリカゲルカラム・クロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝４：１）で精製して、３２５ｍｇ（収率６２％）の所望生成物をオフホワイト固体で得る。固体を酢酸エチル／ヘキサンより再結晶して、分析上純粋な標記化合物を得る。
【０１６２】
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．２４（１Ｈ、ｓ）、７．９１（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝２．６）、７．５２（１Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝８．８、２．６）、７．３０−７．２４（２Ｈ、ｍ）、７．１７（１Ｈ、ｓ）、７．０７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．８）、３．３３（３Ｈ、ｓ）
ＭＳ，ＥＳＩ３９８（Ｍ−Ｈ）−
元素分析（Ｃ１６Ｈ１０Ｃｌ２Ｆ３ＮＯ２として）
計算値：Ｃ５１．０８、Ｈ２．６７、Ｎ３．７２
実測値：Ｃ５１．１１、Ｈ２．５３、Ｎ３．７２
【０１６３】
実施例１０
（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン
Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５６０２１６９に記載されるようなキラルＨＰＬＣカラムを用い、実施例９のラセミ化合物を、そのエナンチオマーに分離して、本例の標記化合物の単一（＋）エナンチオマーを得ることができる。
【０１６４】
実施例１１
（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン
Ｕ．Ｓ特許Ｎｏ．５６０２１６９に記載されるようなキラルＨＰＬＣカラムを用い、実施例９のラセミ化合物を、そのエナンチオマーに分離して、本例の標記化合物の単一（−）エナンチオマーを得ることができる。
【０１６５】
実施例１２
ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現するＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関する、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）およびＢＭＳ−ＡまたはＮＳ−１６１９の効果：
本例は、ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現するよう遺伝子的に設計されたＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関し、ＮＳ−１６１９と呼ばれる公知ベンズイミダゾロン化合物［Ｄ．Ｓｔｒφｂａｅｋらの「Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」（３５：９０３−９１４、１９９６年）；およびＭ．ＭｃＫａｙらの「Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ」（７１：１８７３、１９９７年）］に対する、細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）およびＢＭＳ−Ａ化合物（Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５８６９５０９の実施例８２参照）の使用の効果を判定するのに行った実験を記載する。
【０１６６】
これらの実験の場合、細胞保持電位は−８０または−１００ｍＶのいずれかであり、［Ｃａ２＋］ｉに適切な一連の１０ｍＶ脱分極電圧ステップを適用する。標準全細胞パッチ−クランプ技法は、ピペット中の［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭまたは５０ｎＭのいずれかで［Ａ．ＦａｂｉａｔｏおよびＦ．Ｆａｂｉａｔｏの「Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｐａｒｉｓ」（７５：４６３−５０５、１９７５年）に記載の方法を織り込んだＥＱＣＡＬプログラムを用いて測定］、用いる。各［Ｃａ２＋］ｉの場合に用いる電圧の範囲は、細胞の［Ｃａ２＋］ｉおよびｈＳｌｏ発現レベルの小さな差異をなくすために変える。
【０１６７】
図５Ａは、２つの［Ｃａ２＋］ｉ条件（すなわち、５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉと２．５μＭの［Ｃａ２＋］ｉ）下の、対照（オープン符号）とＢＭＳ−Ａ（１μＭ）（クローズド符号）のマキシ−Ｋ電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。図５Ｂは、（薬物電流／対照電流）の比対電圧で示される、Ｉ−Ｖ電流データを示す。各データポイントは、４〜８細胞の平均値±標準誤差（ＳＥ）を示す。
【０１６８】
図５Ｃは、図５Ａで用いる同じ２つの［Ｃａ２＋］ｉの条件下、公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロンで実験した場合のマキシ−Ｋ・Ｉ−Ｖ関係を示す。図５Ｃにおいて、対照はオープン符号で示され、薬物はクローズド符号で示される（円）。図５Ｄは、比対電圧で示す、図５ＣのＩ−Ｖ電流データを示す。
【０１６９】
各データポイントは、９〜１１細胞の平均値±ＳＥを示す。かかる結果から観察されるように、高い細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭ）は、低濃度の細胞内カルシウム（［Ｃａ２＋］ｉ＝５０ｎＭ）を用いて生じる関係と比較して、よりネガチブな電圧に対するＩ−Ｖ関係をシフトし、これによって、半−最大賦活電圧（Ｖｍ）において明らかな左方向シフトが示される。
【０１７０】
ＮＳ−１６１９の効果は、各［Ｃａ２＋］ｉの場合同じで、高電圧でｈＳｌｏ−仲介電流振幅を増大する。
これに対し、ＢＭＳ−Ａは、［Ｃａ２＋］ｉに強く依存するチャネルに対して示差効果を明らかにする。特に、［Ｃａ２＋］ｉ＝２．５μＭの場合、ＢＭＳ−Ａは最高電圧でｈＳｌｏ−仲介電流振幅を増大する。
【０１７１】
［Ｃａ２＋］ｉ＝５０ｎＭの場合、ＢＭＳ−Ａは広範囲の電圧にわたって、実際に電流振幅を減少させる。これらのデータは、ＮＳ−１６１９化合物の場合、［Ｃａ２＋］ｉに依存しない、一般的で非特異的なチャネル開放活性を示す。しかしながら、ＢＭＳ−Ａのチャネル開放を行なう能力は、［Ｃａ２＋］ｉに対して感受性であることが証明される。
【０１７２】
本発明で引用する全ての特許、特許出願、公開ＰＣＴ出願並びに記事、書物、文献、参考マニュアルおよびアブストラクトの内容をそっくりそのまま、参考までにここに導入して、本発明が関係する技術の現状をより詳しく説明する。
【０１７３】
上述の主題事項において、本発明の技術的範囲および精神から逸脱せずに種々の変更を成すことができるので、意図される点は、上記説明に含まれる、あるいは特許請求の範囲で規定される全ての主題事項が本発明の記述的および例示的事項であると解釈されることである。かかる教えに鑑み、本発明の数多くの修正および変化が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】高量（１．０μＭ）の細胞内Ｃａ２＋を含有の培地で灌流した細胞中、ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞のピーク全細胞電流に関し、ＢＭＳ−２０４３５２オープナー化合物の効果を明らかにし、図１Ａは電流と電圧の関係を示すグラフ、図１Ｂは図１Ａのデータの用量応答を示すグラフである。
【図２】ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の全細胞電流に関し、細胞内カルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２０４３５２化合物（５μＭ）の効果を明らかにし、図２Ａは、内部［Ｃａ２＋］フリーを変えた条件下の全細胞外部電流のＩ−Ｖ関係を示すグラフ、図２Ｂは、薬物電流／対照電流の比と電圧の関係を示すグラフであり、図２Ｃは、１μＭ［Ｃａ２＋］ｉで実験した代表的電流を示す。
【図３】全細胞パッチ−クランプ技法を用い、クローン化ｈＳｌｏ α−サブユニットでトランスフェクションされたＨＥＫ−２９３細胞の外部カリウム電流に関し、各種［Ｃａ２＋］ｉおよびＢＭＳ−２２５１１３オープナー化合物（１０μＭ）の効果を示し、図３Ａは電流と電圧の関係を示すグラフ、図３Ｂは薬物Ｉ／対照Ｉの比と電圧の関係を示すグラフである。
【図４】発作を持つラットモデルにＢＭＳ−２０４３５２オープナー化合物を投与したインビボ実験の結果を示し、図４Ａは、インビトロのラット海馬組織ウェッジからの［３Ｈ］グルタメートのＢＭＳ−２０４３５２化合物による、電気刺激放出の転形を示すグラフ、図４Ｂは、麻酔ラットにＢＭＳ−２０４３５２をインビボ投与し、ＣＡ３領域の対側性交連線維系の刺激によって生じる、ＣＡ１領域に記録された電界電位の縮小を示すグラフ、図４Ｃは、ＳＨＲラットにおいて永久片側ＭＣＡ閉塞の２時間後に化合物１を投与したことによる、磁気共鳴映像を用いて測定した皮質梗塞量の縮小を示すグラフ、図４Ｄは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットの皮質梗塞量に対するラセミ化合物１とＢＭＳ−２０４３５２（０．３ｍｇ／ｋｇＩＶ）の効果の比較を示すグラフ、図４Ｅは、Ｗｉｓｔａｒ正常血圧ラットにおいて、ＭＣＡ閉塞開始の２時間後にＢＭＳ−２０４３５２を投与した場合の、用量−応答関係を示すグラフ、図４Ｆは、正常血圧Ｗｉｓｔａｒラットにおける皮質梗塞量の縮小に関し、閉塞開始後１または２時間のＢＭＳ−２０４３５２（１ｍｇ／ｋｇＩＶ）の投与効果の比較を示すグラフである。
【図５】ヒト脳ｈＳｌｏ α−サブユニットを発現させるＨＥＫ−２９３細胞における全細胞電流に関し、細胞内Ｃａ２＋濃度と、ＢＭＳ−Ａ化合物または公知のＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロン化合物の効果を示し、図５Ａは、５０ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉと２．５μＭの［Ｃａ２＋］ｉ下の、対照とＢＭＳ−Ａ（１μＭ）のマキシ−Ｋ電流−電圧関係を示すグラフ、図５Ｂは、薬物電流／対照電流の比と電圧の関係を示すグラフ、図５Ｃは、ＮＳ−１６１９ベンズイミダゾロンで実験した場合のマキシ−Ｋ・Ｉ−Ｖ関係を示すグラフ、図５Ｄは、上記比と電圧の関係を示すグラフである。
Claims (65)
- 下記処置を必要とする個人の高い細胞内カルシウム量が特徴である疾患または障害を処置する方法であって、
マキシ−Ｋカリウムチャネルのオープナーの有効量を上記個人に供給することから成り、該オープナーは、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを活性化するが、細胞内カルシウムの低いまたは正常な濃度下では細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを有意に活性化しないことを特徴とする処置法。 - さらに、高い細胞内カルシウム濃度の細胞への追加カルシウムの流入もしくは導入を制限または縮小する請求項１に記載の処置法。
- 疾患または障害が、神経変性疾患または障害である請求項１に記載の処置法。
- 神経変性疾患または障害が、発作、全般脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、てんかん、片頭痛およびアルツハイマー病からなる群から選ばれる請求項３に記載の処置法。
- 神経変性疾患が発作である請求項４に記載の処置法。
- 神経変性疾患が、虚血性発作または急性虚血性発作である請求項５に記載の処置法。
- 高い細胞内カルシウム濃度の細胞が、前虚血性または虚血性ニューロンである請求項６に記載の処置法。
- マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナーが、フルオロ−オキシンドール化合物およびクロロ−オキシンドール化合物からなる群から選ばれる請求項１に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項８に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである請求項９に記載の処置法。
- クロロ−オキシンドール化合物が、（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項８に記載の処置法。
- マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナーを、疾患または障害の開始の前または後に投与する請求項１に記載の処置法。
- マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナーを、発作、虚血性発作または急性虚血性発作の開始の前または後に投与する請求項５または６に記載の処置法。
- 下記処置を必要とする個人の発作を処置する方法であって、
マキシ−Ｋチャネル・オープナーの有効量を上記個人に投与することから成り、該オープナーは、高い細胞内カルシウム濃度のニューロン細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白に対してオープナー活性を有するが、細胞内カルシウム濃度が正常または低いニューロン細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白に対し有意なオープナー活性を全く有しないことを特徴とする処置法。 - マキシ−Ｋチャネル・オープナーが、フルオロ−オキシンドール化合物およびクロロ−オキシンドール化合物からなる群から選ばれる請求項１４に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項１５に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである請求項１６に記載の処置法。
- クロロ−オキシンドール化合物が、（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項１５に記載の処置法。
- 虚血性発作または急性虚血性発作を処置する請求項１４に記載の処置法。
- マキシ−Ｋチャネル・オープナーを、発作、虚血性発作または急性虚血性発作の開始の前または後に投与する請求項１４または１９に記載の処置法。
- マキシ−Ｋチャネル・オープナーが、毒性量のカルシウムにさらされるニューロン細胞へのカルシウムの進入を制限することにより、皮質神経保護を付与する請求項１４に記載の処置法。
- 下記処置を必要とする個人の高い細胞内カルシウム量が特徴である疾患または障害を処置する方法であって、
ａ）マキシ−Ｋチャネルのオープナーを上記個人に供給し、該オープナーは、高い細胞内カルシウム濃度に対し敏感で、かつ該疾患または障害と関連しおよび高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞のマキシ−Ｋチャネルを標的にするが、低いまたは正常な細胞内カルシウム濃度を有する細胞を有意に標的とせず；次いで
ｂ）該疾患または障害と関連する細胞への追加カルシウムの流入を縮小または制限し、カリウム流出を増加しおよび膜電位を調節することにより、該疾患または障害と関連する細胞を毒性または死から保護する
ことから成る処置法。 - マキシ−Ｋチャネル・オープナーが、フルオロ−オキシンドール化合物またはクロロ−オキシンドール化合物である請求項２２に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項２３に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである請求項２４に記載の処置法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである請求項２４に記載の処置法。
- クロロ−オキシンドール化合物が、（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項２３に記載の処置法。
- 疾患または障害が、神経変性疾患または障害である請求項２２に記載の処置法。
- 神経変性疾患または障害が、発作、全般脳虚血、外傷性脳損傷、パーキンソン病、てんかん、片頭痛およびアルツハイマー病からなる群から選ばれる請求項２８に記載の処置法。
- 神経変性疾患または障害が発作である請求項２９に記載の処置法。
- 神経変性疾患または障害が、虚血性発作または急性虚血性発作である請求項３０に記載の処置法。
- 該疾患または障害と関連しおよび高い細胞内カルシウム濃度を有する細胞が、危険な状態の前虚血性または虚血性ニューロンである請求項２２に記載の処置法。
- 神経変性疾患または障害が、外傷性脳損傷である請求項２９に記載の処置法。
- マキシ−Ｋチャネル・オープナーを、疾患または障害の開始の前または後に投与する請求項２２に記載の処置法。
- 下記付与を必要とする個人の発作から神経保護を付与する方法であって、
高い細胞内カルシウム濃度のニューロンのマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を活性化するが、細胞内カルシウム濃度が低いまたは正常なニューロンのマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白に対し有意なオープナー活性を全く有しないマキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物の有効量を投与する
ことから成る付与法。 - 下記付与を必要とする個人の発作から神経保護を付与する方法であって、
フルオロ−オキシンドールまたはクロロ−オキシンドール化合物の有効量を上記個人に投与することから成り、該化合物は、高い細胞内カルシウム濃度のニューロンのマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を活性化するが、細胞内カルシウム濃度が低いまたは正常なニューロンのマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白に対し有意なオープナー活性を全く有さず、これによって、神経毒性または死の危険な状態のニューロンへのカルシウムの進入を制限することにより、皮質神経保護を付与するマキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物であることを特徴とする付与法。 - マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物が、フルオロ−オキシンドール化合物である請求項３５または３６に記載の付与法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項３７に記載の付与法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである請求項３８に記載の付与法。
- フルオロ−オキシンドール化合物が、（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである請求項３８に記載の付与法。
- マキシ−Ｋチャネル・オープナー化合物が、クロロ−オキシンドール化合物である請求項３５または３６に記載の付与法。
- クロロ−オキシンドール化合物が、（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれる請求項４１に記載の付与法。
- マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物を、発作の開始の前または後に投与する請求項３５または３６に記載の付与法。
- 神経保護が、虚血性発作または急性虚血性発作のためである請求項３５または３６に記載の付与法。
- 高い細胞内カルシウム濃度のニューロンが、前虚血性および／または虚血性ニューロンである請求項３５または３６に記載の付与法。
- 高い細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を活性化しうるが、正常な生理的または低い細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋチャネルたん白を有意に活性化しないオープナーまたはアゴニスト化合物を選別または同定する方法であって、
ａ）試験化合物を、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で、マキシ−Ｋカリウムチャネルたん白−発現細胞と接触させ；次いで
ｂ）高い細胞内カルシウム濃度の条件下の細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を活性化し、および低いまたは正常な生理的細胞内カルシウム濃度下の細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を有意に活性化しない試験化合物を、上記オープナーまたはアゴニスト化合物として選択する
ことを特徴とする方法。 - 高い細胞内カルシウム濃度の細胞が、クローン化マキシ−Ｋカリウムチャネルたん白−コード化ＤＮＡでトランスフェクションされた哺乳類細胞であり、マキシ−Ｋチャネルたん白を発現する請求項４６に記載の方法。
- 高い細胞内カルシウム濃度の条件が、約２５０ナノモル以上から約１０ミクロモル範囲のカルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉからなる請求項４６に記載の方法。
- 低いまたは正常な生理的細胞内カルシウム濃度下の細胞が、マキシ−Ｋチャネルたん白−コード化ＤＮＡでトランスフェクションされたツメガエル属の卵母細胞であり、該トランスフェクションされた卵母細胞がマキシ−Ｋチャネルたん白を発現する請求項４６に記載の方法。
- 低いまたは正常な生理的細胞内カルシウム濃度の条件が、約５〜２５０ナノモル範囲のカルシウム濃度［Ｃａ２＋］ｉからなる請求項４６に記載の方法。
- 細胞中のマキシ−Ｋチャネルの試験化合物による活性化を、パッチ−クランプ分析で測定する請求項４６に記載の方法。
- パッチ−クランプ分析が、インサイドアウト切除パッチ、アウトサイドアウト切除パッチ、細胞−貼付切除パッチおよび全細胞クランプパッチからなる群から選ばれる請求項５１に記載の方法。
- パッチ−クランプ分析が、全細胞クランプパッチである請求項５２に記載の方法。
- マキシ−Ｋチャネルたん白の活性化が、試験化合物の導入後のマキシ−Ｋチャネル外部電流の増加または活性化である請求項４６に記載の方法。
- 高い細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を選択的に活性化し、および低い細胞内カルシウム濃度または正常な細胞内カルシウム濃度の条件下でマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を有意に活性化しないカルシウム−感受性オープナー化合物を同定する化合物の検定法であって、
（ａ）マキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を、高い細胞内カルシウム濃度の条件下で、試験化合物と接触させ；次いで
（ｂ）オープナー化合物が、高い細胞内カルシウム濃度の存在下でマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を選択的に活性化し、かつ低いまたは生理的に正常な細胞内カルシウム濃度の存在下でマキシ−Ｋカリウムチャネルたん白を有意に活性化しないかどうかを測定する
ことを特徴とする検定法。 - 高い細胞内カルシウム濃度に対し敏感であるという特徴を有し、かつ高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを選択的に標的にするマキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物であるポジティブ対照をさらに包含する請求項５５に記載の検定法。
- ポジティブ対照が、フルオロ−オキシンドールまたはクロロ−オキシンドール・マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物である請求項５６に記載の検定法。
- ポジティブ対照が、（±）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｓ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル−１，３−ジヒドロ−３−フルオロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれるフルオロ−オキシンドール・マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物である請求項５７に記載の検定法。
- ポジティブ対照が、（±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；（３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オン；および（３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンからなる群から選ばれるクロロ−オキシンドール・マキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物である請求項５７に記載の検定法。
- 請求項４６または５５に記載の方法に従って選択または同定されるマキシ−Ｋオープナー化合物。
- 高い細胞内カルシウム濃度の条件下で細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを開けまたは活性化し、かつ細胞内カルシウムの低いまたは正常な濃度下では細胞のマキシ−Ｋカリウムチャネルを有意に開けまたは活性化しないことが特徴であり、かつ高い細胞内カルシウム濃度の条件下の細胞への追加カルシウムの流入もしくは導入を縮小または制限するマキシ−Ｋカリウムチャネル・オープナー化合物。
- （±）−３−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである化合物。
- （３Ｓ）−（＋）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである化合物。
- （３Ｒ）−（−）−（５−クロロ−２−メトキシフェニル）−１，３−ジヒドロ−３−クロロ−６−（トリフルオロメチル）−２Ｈ−インドール−２−オンである化合物。
- 請求項６２〜６４のいずれか１つに記載の化合物、および生理的に許容しうる希釈剤、担体または賦形剤から成る医薬組成物。
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